CN109575113B

CN109575113B - 水稻OsPEX1基因在木质素代谢调控中的应用

Info

Publication number: CN109575113B
Application number: CN201910080374.1A
Authority: CN
Inventors: 张向前; 柯善文; 栾鑫; 钟天秀; 陈曙; 解新明; 刘树春; 代航
Original assignee: South China Agricultural University
Current assignee: South China Agricultural University
Priority date: 2019-01-28
Filing date: 2019-01-28
Publication date: 2021-07-23
Anticipated expiration: 2039-01-28
Also published as: CN109575113A

Abstract

本发明公开一种水稻OsPEX1基因在木质素代谢调控中的应用，属于植物基因工程领域。本发明的OsPEX1基因，其具有如SEQ ID NO：1所示的DNA序列；并通过突变体表型分析及反义抑制转基因后代株系分析证明了OsPEX1基因在水稻木质素代谢调控中的重要作用。OsPEX1基因的克隆不仅丰富了水稻木质素代谢调控的分子机制，也为水稻抗倒伏遗传改良提供了新的基因资源，为水稻分子设计育种提供了新的材料选择。在水稻中提高OsPEX1的表达可以培育木质素含量增加、抗倒伏性状改良的水稻品种，且具有很强的可操作性，为拓宽现有的抗倒伏品种的遗传基础开辟了新途径。

Description

水稻OsPEX1基因在木质素代谢调控中的应用

技术领域

本发明属于植物基因工程领域，具体涉及一种水稻类伸展蛋白基因OsPEX1的应用。本发明对一个水稻OsPEX1基因的生物学功能进行研究与验证。本发明还涉及利用所述载体转化植物细胞以改变水稻木质素含量以及获得抗倒伏性强的水稻的应用方法。

背景技术

木质素是植物细胞壁的重要组成部分之一，仅次于纤维素，是维管植物次生细胞壁增厚过程中所形成的主要物质。木质素与植物的生长分化和细胞壁的发育紧密相关，在植物的木质化代谢过程中，木质素主要聚集在导管细胞壁与维管束间的纤维细胞中，具有增强植物细胞壁硬度、机械支持力与抗压能力，从而增加植物体的机械强度(Sattler S E,Funnell-Harris D L.Modifying lignin to improve bioenergy feedstocks:strengthening the barrier against pathogens？.Frontiers in Plant Science,2013,4:7.)。此外，由于木质素难降解与疏水的特性，使得植物细胞不易透水，有利于水分与矿物质等营养成分在植物体内进行长距离的运输，也有效的阻止了外界病原菌类微生物的入侵，在植物细胞发育与抗病方面具有重要作用(Verma S R,Dwivedi U N.Lignin geneticengineering for improvement of wood quality:Applications in paper and textileindustries,fodder and bioenergy production.South African Journal of Botany,2014,91(3):107-125.)。

木质素的合成是一个非常复杂的过程，其合成途径主要是以苯丙氨酸为底物，经过一系列生化反应形成不同类型的木质素单体，再通过这些木质素单体聚合形成最终的木质素多聚物(Baucher M,Halpin C,Petit-Conil M,et al.Lignin:genetic engineeringand impact on pulping.CRC Critical Reviews in Biochemistry,2003,38(4):46.)。随着基因组学以及正向遗传学与反向遗传学等研究方法的快速发展，对植物木质素的生物合成途径的研究也有了较大的进展，多个木质素合成相关的重要基因相继被克隆，如COMT(咖啡酸-O-甲基转移酶)、CCOMT(咖啡酰辅酶A-3-O-甲基转移酶)、CCR(肉桂酰-辅酶A还原酶)、F5H(阿魏酸-5-羟基化酶)、CAD(肉桂醇脱氢酶)、PAL(苯丙氨酸解氨酶)等，借助基因工程等研究技术手段，这些基因在植物木质素代谢中的功能也已被验证(赵华燕,魏建华,宋艳茹.木质素生物合成及其基因工程研究进展.植物生理与分子生物学学报,2004,30(4):361-370.)。尽管对木质素合成代谢已经有了较为深入的研究，但其研究对象主要集中在拟南芥(Arabidopsis thaliana)、烟草(Nicotiana tabacum)、苜蓿(Medicago Sativa)、玉米(Zeamays)等植物，对水稻木质素合成代谢调控的研究报道还较少。水稻是是我国乃至世界上最主要的粮食作物，也是重要的单子叶模式植物。木质素是水稻生长发育过程中的重要代谢产物，对水稻营养物质与水分的运输有重要作用，还直接影响水稻的抗倒伏性与抗病性，因此，对水稻木质素代谢调控的研究有着重要的意义。

类伸展蛋白(Extensin-like proteins，ELPs)是一类在结构和功能上与伸展蛋白(Extensin)相似的蛋白，除了含有伸展蛋白结构域，还富含亮氨酸重复序列(LRR)，广泛存在于高等植物的细胞壁中，参与多项生理活动(Showalter AM,Keppler B,Lichtenberg J,et al.A bioinformatics approach to the identification,classification,andanalysis of hydroxyproline-rich glycoproteins.Plant Physiology,2010,153(2):485-513.)。在拟南芥中，类伸展蛋白参与了细胞壁的形态形成(Hijazi M,Roujol D,Nguyenkim H,et al.Arabinogalactan protein 31(AGP31),aputative network-formingprotein in Arabidopsis thaliana cell walls？.Ann Bot,2014,114(6):1087-1097.)。木质素是细胞壁的重要组成部分，类伸展蛋白在水稻细胞壁合成中的研究还相对较少。

发明内容

为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的目的在于提供一种水稻OsPEX1基因在木质素代谢调控中的应用。

本发明以一个调控水稻株高发育的类伸展蛋白基因OsPEX1突变体为材料(水稻类伸展蛋白OsPEX1及其应用，专利号：ZL201110410931.5)，研究了类伸展蛋白基因OsPEX1对木质素代谢的影响。研究发现OsPEX1基因的高表达会导致突变体木质素含量显著增加，因而进一步详细研究了该基因在水稻木质素代谢调控中的应用，并为水稻抗倒伏性的研究开辟了新的方向。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

本发明提供一种水稻OsPEX1基因在水稻木质素代谢调控中的应用。

本发明提供一种水稻OsPEX1基因在水稻抗倒伏方面的应用。

本发明提供一种水稻OsPEX1基因在水稻育种中的应用。

本发明提供一种水稻OsPEX1基因在培育转基因水稻中的应用。

本发明的一个重要目的是水稻木质素代谢调控基因OsPEX1的转基因作物在作物育种特别是在水稻抗倒伏方面的应用。具体的说就是将OsPEX1作为目标基因，构建相关重组表达载体，通过各种方法途径转化到水稻使该基因超量表达或下调表达，影响转基因植株体内木质素代谢，获得木质素含量显著变化的转基因植株。也可利用木质素含量显著增加或降低的转OsPEX1基因的植物与需要改良木质素含量的水稻品种进行杂交，然后再与亲本进行回交的方法来获得木质素含量增加或降低的植株。

所述的水稻OsPEX1基因，来源于水稻，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，或者是如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列中通过替换、插入、缺失一个或多个氨基酸而得到的仍具有调控木质素代谢的类似物。

所述的水稻OsPEX1基因的序列为下列A、B、C三种核苷酸序列之一：

A、如SEQ ID NO:1所示的DNA序列；

B、编码与A编码蛋白质相同的蛋白质的DNA序列；

C、以上A或B经过碱基替换、插入、缺失一个或多个核苷酸而衍生得到的仍具有调控木质素代谢的核苷酸序列。

含有上述的OsPEX1基因全长或任一片段的引物属于本发明的保护范围，以及含有上述水稻木质素代谢调控基因的重组表达载体、转基因细胞系、重组菌也属于本发明的保护范围。

所述的OsPEX1基因的重组表达载体可通过现有的植物表达载体构建；所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体，如pCAMBIA1300、pCAMBIA2300、pCUbi1390等；含有OsPEX1基因的重组表达载体可通过基因枪、显微注射、原生质体介导、花粉管通道、农杆菌介导等各种物理、化学及生物学方法导入到宿主植物细胞或组织中；被导入的宿主植物优选为水稻。

在构建OsPEX1基因的重组表达载体时，在OsPEX1基因的转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型、组成型、组织特异性或诱导型启动子，如35S启动子、Ubi启动子等。

为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行改造后再使用，包括加入GUS、GTP等报告基因、抗生素抗性基因或其它标记基因等。

因此，1)在以粳稻ZH11为遗传背景的前提下，本发明利用一个已有的水稻Ds转座子插入造成OsPEX1基因突变的矮秆突变体为材料，对杂合突变体与纯合突变体进行表型分析发现，突变体与ZH11之间不仅是在株高上有差异，其木质素含量也存在显著差异(图1)。

2)本发明还构建了OsPEX1的RNAi表达载体pRNAi-OsPEX1，将该表达载体转入ZH11，获得了OsPEX1表达显著下调的转基因株系(KD-1、KD-2)。对野生型、突变体与转基因植株进行木质素含量测定及木质素合成相关基因表达分析，结果发现，OsPEX1高表达时，木质素含量增加，木质素合成相关基因也上调表达。反之，在OsPEX1低表达的KD-1与KD-2中，木质素含量较低，木质素合成相关基因的表达也下降(图1和图2)。

3)在自然条件下，为了进一步验证OsPEX1的表达水平与木质素含量之间的关系，对同一水稻茎节的不同部分进行木质素特异性染色，并完成了相应节段部分OsPEX1的表达分析。结果表明，在同一茎节的不同节段中随着木质素含量的增加，OsPEX1的表达也逐渐升高(图3)。说明编码水稻类伸展蛋白的OsPEX1基因调控水稻木质素代谢。

4)本发明还通过转基因技术，将含OsPEX1的超表达重组载体pCUbi1390-OsPEX1导入不含有“绿色革命”基因的高杆水稻品种南洋占(记为W10)、Basmati 370(记为W11)中，获得了OsPEX1过量表达的较矮杆转基因植株(W10-T、W11-T)，并且发现转基因植株茎秆的木质素含量显著增加，抗倒伏性也显著增强(图4)。

本发明证实了OsPEX1基因在水稻木质素代谢调控的重要作用不仅丰富了植物木质素代谢调控的分子机制，也为水稻抗倒伏性育种提供了新的途径。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

本发明的OsPEX1基因，其具有如SEQ ID NO：1所示的DNA序列；并通过突变体表型分析及反义抑制转基因后代株系分析证明了OsPEX1基因在水稻木质素代谢调控中的重要作用。OsPEX1基因的克隆不仅丰富了水稻木质素代谢调控的分子机制，也为水稻抗倒伏遗传改良提供了新的基因资源，为水稻分子设计育种提供了新的材料选择。在水稻中提高OsPEX1的表达可以培育木质素含量增加、抗倒伏性状改良的水稻品种，且具有很强的可操作性，为拓宽现有的抗倒伏品种的遗传基础开辟了新途径。

附图说明

图1是水稻OsPEX1突变体与野生型的表型比较。(a)紫外光条件下，野生型与突变体茎节第三节横切面木质素自发荧光的显微图片；(b)灌浆后20天，野生型与突变体茎节第三节横切面的木质素Wiesner染色；(c)野生型与突变体木质素含量；(d)野生型与突变体第二茎节中木质素合成相关基因的相对表达量。WT：野生型中花11；pex1/+：杂合突变体；pex1/pex1：纯合突变体。

图2是水稻OsPEX1基因反义抑制转基因植株表型。(a)转基因植株单株表型，标尺：10cm，从左至右依次为WT、KD-1、KD-2；(b)OsPEX1基因在野生型与反义抑制转基因植株中的相对表达量；(c)野生型与反义抑制转基因植株木质素含量；(d)野生型与反义抑制转基因植株第二茎节中木质素合成相关基因的相对表达量。WT：野生型中花11；KD-1：阳性转基因植株1；KD-2：阳性转基因植株2。

图3是水稻OsPEX1基因的表达对木质素含量的影响。(a)水稻第二茎节分节示意图，标尺：1cm；(b)不同节段的木质素Wiesner染色，标尺：100μm；(c)OsPEX1基因在不同节段的相对表达量；(d)不同节段的木质素含量。

图4是水稻OsPEX1基因过量表达对水稻抗倒伏性的影响。(a)转基因植株表型；(b)转基因植株第四茎节横切面；(c)OsPEX1基因在转基因植株第四茎节的相对表达量；(d)转基因植株第四茎节木质素含量；(e)转基因植株第四茎节抗折力。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

下列实施例中未注明具体实验条件的试验方法，通常按照常规实验条件或按照制造厂所建议的实验条件。所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为从商业途径得到的试剂和材料。

实施例中pCUbi1390载体为常用的超表达载体，大肠杆菌Top10和农杆菌EHA105为常用的菌株，多数分子生物学实验室均有保存；水稻品种中花11为野生型粳稻中花11(公开使用的水稻品种，市售)。

实施例1 OsPEX1突变体的表型鉴定

1.OsPEX1突变体的细胞学观察

本发明对野生型中花11和OsPEX1突变体的茎节第三节进行徒手横切，并通过荧光显微镜在紫外光环境下进行细胞学观察。结果表明，pex1杂合突变体及纯合突变体与野生型相比较，木质素的自发荧光明显增强，细胞壁也明显增厚，趋势为pex1纯合突变体＞pex1杂合突变体＞野生型，此外，OsPEX1突变体的木质部细胞也相对较小，排列也更为紧密(图1(a))。这些结果说明可能是因为OsPEX1突变体细胞壁中的木质素含量增加，引起细胞壁增厚，并限制了细胞的正常松弛生长，从而导致OsPEX1突变体细胞形态变小。上述结果说明OsPEX1的突变不仅导致了水稻木质素含量的改变，还影响了木质化细胞的形态与分布。

2.OsPEX1突变体的木质素特异性染色

植物木质素含量的不同，还可通过木质素的特异性染色来验证，为了进一步对野生型与OsPEX1突变体进行木质素含量进行定性比较，本发明通过茎秆横切面切片染色来观察木质素的差异情况。木质素在间苯三酚与盐酸的作用下会呈现显色反应，选取同一生长期的茎秆，利用Wiesner染色法进行木质素染色。从图1(b)可看出，pex1杂合突变体与纯合突变体木质部都被染成较深的红色，而野生型则着色较浅，进一步证明OsPEX1突变体中木质素含量比野生型要高。

具体实验操作步骤如下

2.1溶液配制：

2％(W/V)间苯三酚溶液：称取间苯三酚0.4g溶解定容于20mL无水乙醇中，常温避光保存备用。20％(V/V)盐酸溶液：量取10mL盐酸，加入至40mLddH₂O中，混匀。

2.2 Wiesner染色

(1)对水稻茎秆进行徒手切片；

(2)将切片置于2％(W/V)间苯三酚溶液中，浸泡5～10min；

(3)将切片转入20％(V/V)盐酸溶液中，浸泡5～10min；

(4)取出切片，清水洗净，对其进行拍照。

3.OsPEX1突变体的木质素含量测定

为了对OsPEX1突变体与野生型之间木质素含量差异进行定量分析，按照乙酰溴的改良测定方法分别对其茎秆木质素含量进行测定。结果如图1(c)所示，与野生型相比，OsPEX1突变体木质素含量显著增加。基因表达分析后也发现，木质素合成相关基因在OsPEX1突变体中高表达(图1(d))。因此，进一步证实了OsPEX1在水稻的木质素代谢中的调控作用。具体步骤如下：

3.1乙酰溴法测定木质素

3.1.1标准曲线的绘制：

(1)称取100mg标准木质素样品，溶于100mL 1％(W/V)NaOH中，配成1,000mg/L标准木质素溶液；

(2)将标准木质素溶液用1％NaOH溶液梯度稀释，配成10mg/L、20mg/L、40mg/L、60mg/L、80mg/L、100mg/L、120mg/L的木质素溶液；

(3)在280nm处测定木质素溶液的吸光度，利用不同浓度的木质素溶液吸光度进行木质素标准曲线绘制及回归方程。

3.1.2样品测定

(1)精确称取20mg烘干样品放入小锥形瓶中，加入5mL 25％(V/V)AcBr(溶于冰醋酸中)提取液；

(2)将锥形瓶置于恒温水浴锅中，用保鲜膜封住瓶口，70℃振动孵育30min；

(3)取1mL液体转入10mL离心管中，加入1mL 25％(V/V)AcBr，0.45mL 2mol/LNaOH，2.5mL冰醋酸，0.05mL 7.5mol/L盐酸羟胺，定容至5mL；

(4)3000r/min离心7min，吸取上清，测定OD₂₈₀的吸光值；

(5)根据样品的OD₂₈₀，利用木质素标准曲线回归方程求得样品木质素的浓度(mg/L)，再求得5mL样品木质素提取溶液中所含木质素的重量。

木质素标准品(Sigma)、乙酰溴(Sigma)、冰醋酸、正己烷、盐酸羟胺、乙醇、氢氧化钠购自广州华奇盛生物科技有限公司。

3.2木质素合成相关基因的表达分析

3.2.1水稻总RNA的提取

用北京全式金生物技术有限公司的TransZol Up试剂盒提取水稻总RNA，具体提取方法如下：

(1)将超低温冻结的水稻叶片迅速转移至用液氮冷却的研钵中，用研杵充分研磨成粉末状，将研磨成粉末状的样品转移至离心管中，没50～100mg样品加入1mL TransZolUp，充分混匀；

(2)每使用1mL TransZol Up，加0.2mL氯仿，剧烈振荡30s，室温孵育3min，然后在10,000×g与4℃条件下离心15min，此时样品分为三层，无色的水相(上层)，中间层和粉色有机层(下层)。RNA主要在水相中，水相体积约为所用TransZol Up试剂的50％；

(3)转移无色的水相于新的离心管中，没使用1mL TransZol Up加入0.5mL异丙醇，颠倒混匀，室温孵育10min；

(4)10,000×g 4℃离心10min，去上清，加1mL 75％乙醇(DEPC处理的水配制)，剧烈涡旋(每使用1mL TransZol Up至少加75％乙醇1mL)后，7,500×g 4℃离心5min；

(5)弃上清(为了更好地控制RNA中的盐离子含量，应尽量除净乙醇)，室温晾干沉淀(大约5min左右)，将沉淀溶于50～100μL RNA溶解液中，并于55℃～60℃孵育10min，保存样品于-70℃以备长期使用。

3.2.2 cDNA第一链的合成

cDNA第一链的合成利用全式金

One-Step gDNA Removal and cDNASynthesis SuperMix的反转录试剂盒进行，反转录反应体系如下：

根据相应的体积加入以下组分：

将Toal RNA模板、引物Oligo(dT)₁₈与RNase-free Water混匀后，65℃孵育5min后，冰浴2min，再加入其它反应组分，然后42℃孵育15min，最后85℃加热5s失活

RT/RI与gDNA Remover。

3.2.3 qPCR分析

(1)Real Time PCR引物设计

根据目的基因和内参基因的序列，采用Primer 3.0设计Real Time PCR引物，引物序列经NCBI Blast比对无非特异性扩增，可用于qRT-PCR实验。具体引物序列如下：

OsSWN1F：5′-ATGAGCATATCGGTGAACGGG-3′；

OsSWN1R：5′-GCACCTCTCTTGGATGTCCCA-3′；

OsSWN3F：5′-GATGAGGAAGACGCTGGTGTT-3′；

OsSWN3R：5′-CAAGCTGTAGTTGTCGGGGAC-3′；

OsSWN7F：5′-AGG TTCCTCCTGGATTTCGTTT-3′；

OsSWN7R：5′-TTCTTGTCCTTGTGGCGGGTAC-3′；

OsPAL6F：5′-AGCAGCCTGTGCGTGGCTAA-3′；

OsPAL6R：5′-GCCGTTCATCATGCTGTTCATG-3′；

OsPAL7F：5′-GGTGGTCTCTGCATGGAGGT-3′；

OsPAL7R：5′-CCATGCTGTTCATCACCCAGTC-3′；

OsCCRF：5′-AAGGGGGCAAAATGGTATGTG-3′；

OsCCRR：5′-CCTTCAACAGCAACAGGCACA-3′；

OsCAD2F：5′-TCACCCCCTACAACTACACCCT-3′；

OsCAD2R：5′-AGTACTGCTCCACATTGGCCTT-3′；

PRX1F：5′-TTGGTCAGCAAGGCGCGTCA-3′；

PRX1R：5′-CGAAGCAGTCGTGGAAGAAGAG-3′；

PRX2F：5′-ACTTCGTCAGCAAGGTGTTCCC-3′；

PRX2R：5′-AAGCAGTCGTGGAAGAAGAGGC-3′；

25sRNAF：5′-AAGGCCGAAGAGGAGAAAGGT-3′；

25sRNAR：5′-TTGGCGGGCCGTTAAGCAGAAAAGA-3′。

OsSWN1：次生细胞壁合成相关转录因子基因1；OsSWN3：次生细胞壁合成相关转录因子基因3；OsSWN7：次生细胞壁合成相关转录因子基因7；OsPAL6：苯丙氨酸脱氨酶基因6；OsPAL7：苯丙氨酸脱氨酶基因7；OsCCR：肉桂酰辅酶A还原酶；OsCAD2：肉桂醇脱氢酶基因2；PRX1：过氧化物酶基因1；PRX2：过氧化物酶基因2；25sRNA：基因表达分析使用的内参基因。

(2)Real Time PCR反应体系

采用TaKaRa SYBR Primer Ex Taq II(Perfect Real Time)试剂盒进行Real-time PCR扩增。在冰上配制以下Real-time PCR的反应体系，重复3次。反应体系如下：

(3)Real Time PCR扩增程序

扩增程序为：

95℃30s(20℃/s)1cycle

95℃5s(20℃/s)；60℃20s(20℃/s)45cycles

95℃0s(20℃/s)；60℃15s(20℃/s)；95℃0s(0.1℃/s)1cycle

(4)Real Time PCR数据分析

反应结束后，通过Bio-RAD的Real-time PCR System获得扩增曲线和溶解曲线，运用仪器配套的Bio-Rad CFX Manager Software 1.6进行数据分析，分析方法为2^^-ΔΔCt，25sRNA基因作为内参基因。

结果表明，与野生型相比在OsPEX1突变体中OsPEX1基因高表达，木质素含量增加，与此相符木质素合成相关基因的表达量也显著增加。

实施例2反义抑制载体转化验证OsPEX1基因功能

为了进一步验证OsPEX1基因对水稻木质素代谢的调控作用，本实施例还构建了OsPEX1基因的反义抑制(antisense suppression)载体pRNAi-OsPEX1，采用农杆菌介导的转化方法导入到中花11(简称ZH11)中，并对转基因植株进行表型观察与分析。具体步骤如下：

2.1反义抑制载体pRNAi-OsPEX1的构建

根据OsPEX1基因的序列结构，设计一对带有酶切位点的RNAi引物OsPEX1-RNAiF/OsPEX1-RNAiR，引物序列如下：

OsPEX1-RNAiF：5′-GGATCCAGGAGTCACCTGAGGAACCA-3′(下划线为BamHI酶切位点)；

OsPEX1-RNAiR：5′-CTGCAGAAGCTTATTCTTCTGGAGTCGGTGGA-3′(下划线为PstI酶切位点)。

提取水稻ZH11叶片总RNA，用反转录试剂盒(TransGen Biotech，AT301-2)以所提取的总RNA为模板反转录合成第一链cDNA，再以此cDNA为模板，用引物OsPEX1-RNAiF/OsPEX1-RNAiR进行PCR扩增，将得到的PCR产物用胶回收试剂盒(Biomed，DH101-02)进行回收纯化，用限制性内切酶BamHI与PstI分别对回收的PCR产物与载体pCUbi1390进行双酶切(酶切体系为50μL：1μL BamHI，1μL Pst I，5μL NEBuffer，20μL酶切模板，23μL ddH₂O；酶切温度：37℃；酶切时间：5～15min)，分别对酶切产物进行切胶回收，将回收的PCR酶切产物连接到酶切后的载体pCUbi1390上(连接体系为10μL：0.5μL DNA ligase，1μL 10×DNAligase Buffer，1μL质粒，7.5μL DNA片段，16℃过夜连接)，得到重组质粒，命名为pRNAi-OsPEX1。将重组质粒转入大肠杆菌Top10感受态细胞，挑取阳性克隆菌落并进行菌落PCR鉴定，再用质粒提取试剂盒(康为世纪，CW0500A)提取阳性克隆的质粒，将质粒送往睿博兴科生物技术有限公司进行测序验证，选取测序正确的质粒为构建成功的RNAi载体。

2.2遗传转化

将上述构建成功的重组质粒pRNAi-OsPEX1转化农杆菌EHA105，其中，农杆菌感受态制备及转化具体操作步骤如下：

(1)将农杆菌EHA105菌液在YEB平板(含Rif 20mg/L)上划线，28℃倒置暗培养36～48h。将划线后长出的单菌落挑入5mL YEB(含Rif 20mg/L)液体培养基中，28℃，200r/min摇菌16h；

(2)取2mL过夜培养的种质液加入到100mL YEB(含Rif 20mg/L)液体培养基中，28℃，22r/min快速摇菌5～7h，至OD600＝0.4～0.6，将菌液分装到50mL预冷离心管中，冰浴30min，使菌液降到0℃后，4℃，5,000r/min离心10min，收集菌体，尽可能去除上清；

(3)加入10mL预冷无菌的0.15M NaCl温和重悬菌体，冰浴15min后，4℃，5,000r/min离心5min，收集菌体，尽可能去除上清，再加入1mL预冷无菌的20mM CaCl₂(含15％甘油)，温和重悬菌体。每1.5mL离心管分装100μL，液氮速冻后-80℃保存或直接用于转化。

(4)向100μL感受态中加入5μL质粒，轻轻混匀，冰浴30min，然后将装有感受态细胞的离心管在液氮中速冻3min，37℃水浴5min，融化细胞，冰上放置2min；

(5)向感受态细胞中加入500μL YEB液体培养基(含Rif 20mg/L)，28℃200r/min摇菌3～4h。6,000r/min离心2min，收集菌体，在超净工作台中吸去400μL上清液，重悬剩余培养基及菌体。将菌液均匀涂布在含相应筛选压抗生素的YEB平板上，28℃倒置暗培养36～48h。菌落PCR鉴定阳性菌落。

再将含重组质粒pRNAi-OsPEX1的农杆菌EHA105菌种转化到ZH11的愈伤组织，农杆菌侵染后的愈伤组织经选择培养、分化、生根、移栽后，得到阳性转基因植株，选取2株阳性转基因植株，记为KD-1，KD-2。然后测定转基因植株木质素含量，同时分析木质素合成相关基因在转基因植株中的表达。农杆菌介导的水稻快速转化方法及相关试剂的配制参照崔莹等(崔莹,蔡朝霞,林拥军,陈浩.2018.农杆菌介导水稻快速转化.Bio-101:e1010176.DOI:10.21769/BioProtoc.1010176.)在Bio-protocol旗下的Bio-101平台(https://bio-protocol.org/bio101/Special_Issue.aspx？siid＝16)发布的方法。

实验结果如图2所示，其中，(a)图为转基因植株的表型，呈现矮化表型，(b)图为转基因植株中OsPEX1基因的表达验证。对转基因植株进行木质素含量测定，发现通过RNAi技术抑制野生型水稻中内源OsPEX1基因的表达后，植株木质素含量明显下降(图2(c))，木质素合成相关基因的表达也随之下降(图2(d))，进一步说明了OsPEX1是调控木质素代谢的基因。

实施例3 OsPEX1基因的表达与木质素含量呈正相关

将野生型水稻ZH11茎秆分为5个节段，分别对每个节段进行木质素特异性染色与含量测定，并分析每个节段中OsPEX1基因的相对表达量。其中，木质素染色与含量测定及OsPEX1基因表达分析的具体步骤参照实施例2，用到的引物序列为：RT-OsPEX1F：5′-GAGATGGGCTACCTGCAGAACA-3′；RT-OsPEX1R：5′-GTAGGCGAAGCTGAAGTTGACG-3′。结果表明，在同一茎节的不同节段中，随着OsPEX1基因表达量的增加，木质素含量也增加，木质素合成相关基因的表达上调(图3)。

综合上述结果表明，OsPEX1突变体木质素含量高的表型，是因为OsPEX1基因的高表达所致，下调OsPEX1的表达则会降低木质素含量。由此可见，OsPEX1基因在木质素代谢中具有正向调控作用。

实施例4 OsPEX1基因可通过增加茎秆木质素含量提高水稻抗倒伏性

植物木质素含量直接影响其抗倒伏性，OsPEX1基因是调控木质素代谢的重要基因。因此推测，通过基因工程手段使OsPEX1基因高表达进而提高水稻茎秆木质素含量有望改良水稻的抗倒伏性状。为此，本发明利用pCUbi1390载体构建了玉米Ubi(Ubiquitin)启动子驱动的OsPEX1超表达载体，命名为pCUbi1390-OsPEX1，通过农杆菌(EHA105)介导，导入高杆水稻品种南洋占(记为W10)与Basmati 370(记为W11)[所用水稻品种均为常规市售品种]中，并对转基因后代植株进行了抗倒伏性状测定，步骤如下：

(1)以OsPEX1基因序列(SEQ ID NO：1)为模板，设计如下引物：

LRX-1BF：5′-GGATCCATGGACCTCCGGCTCCTCCT-3′(下划线为BamHI酶切位点)；

LRX-4200SR：5′-ACTAGTTTAGTATCCTTGGAACTGAG-3′(下划线为SpeI酶切位点)。

(2)利用引物对进行PCR扩增OsPEX1基因，获得的目标基因片段用BamHI和SpeI双酶切、回收，用DNA Ligation KitVer.2.0试剂盒连接到用同样酶酶切后回收的线性化pCUbi1390载体上，形成pCUbi1390-OsPEX1载体，测序。

(3)将测序正确的pCUbi1390-OsPEX1载体转化农杆菌EHA105。

(4)将含重组质粒pCUbi1390-OsPEX1的农杆菌EHA105菌种分别转化到高杆水稻品种W10与W11的愈伤，经过预培养、浸染、共培养，筛选具有潮霉素抗性的愈伤、分化、生根、炼苗移栽到大田得到转基因植株，分别记为W10-T、W11-T。

农杆菌介导的遗传转化、木质素含量测定与OsPEX1的表达分析等操作步骤参照实施例1与实施例2。水稻茎秆抗折力测定方法在魏凤珍等(魏凤珍，李金才，王成雨，等.氮肥运筹模式对小麦萃巧抗倒性能的影响.作物学报,2008,34(6):1080-1085.)的方法上略有改进，具体操作步骤为：取水稻成熟期第三茎节用于测定茎秆抗折力，用植物茎秆强度测定仪(HDE-500N)进行测定，调整工作台两端直杆与底座垂直，将茎节剥除叶鞘，固定于工作台上，待测材料与感应杆保持垂直，中间的平衡支点与两端固定处距离5cm，读取压下致使茎秆折断时的数值，重复10次，取平均值为该材料的茎秆抗折力。

实验结果如图4所示，转基因植株均表现出矮秆表型，木质素含量明显增加，茎秆抗折力也显著升高，表明OsPEX1的过量表达能提高水稻抗倒伏性。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 华南农业大学

<120> 水稻OsPEX1基因在木质素代谢调控中的应用

<160> 28

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 4200

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atggacctcc ggctcctcct cgcccccggc gggcgccgcg ccgccatggc actgattctc 60

gccgtcctcg ccgcctgcct ctcctccgcc gccaacgtcg gcgcggtgac cagcgccgag 120

gtgtcgtaca tcgcgcaccg gcagctgctg gcgatgaagg aggccggcgt gagcgaggag 180

ggcgacctgc cgtccgatga cttcgacttc gacgaccgcg tcggagtcgc cgtcggcgac 240

ttcccgaacc cgcggctccg caaggcgtac atcgcgctcc aggcgtggcg gcgcgcgttc 300

tactcggacc ccaaggggta caccaacaac tggacgggca acgacgtgtg ctcctacaac 360

ggcgtcatct gctacgccgc catcgacgac cccaagatca tggtggtcgc cggcatcgac 420

ctcaacggcg ccgacatcgc cgggtacctc ccgccggagc tcggcctcct caccgacctc 480

gccttcttcc acatcaacac caaccgcttc tgcggcatca tccccaagag catgtcgagg 540

ctgtcgctgc tgcacgagtt cgacgtcagc cacaaccgct tcgtcggcgt cttcccccac 600

gtctgcctcg agatggccgt gctcaagtac ctcgacatcc gcttcaacga cttcgagggc 660

gagctgccgc cggcgctgtt cgacaaggag ctcgacgcca tcttcgtcaa cagcaaccga 720

ttcgtcggct acatcccggg caacctcggc aactccaccg cctccgtcat cgtcttcgcc 780

aacaacgcct tcgtcggctg catccccaag agcatcggct gcatggccaa aacgctcgac 840

gagatcagct tcatgaacaa caagctcgac ggctgcgtgc ccatggagat gggctacctg 900

cagaacacct acgtcatcga catcagcggc aacgtcctcg tcggcacgct gcccacctcg 960

ctctccaact gcagcaagct ggagcagctg gacgtgtcca ggaacgtctt caccggcatc 1020

gtccacgagt ccatctgcga gctccccgtg ctcgtcaact tcagcttcgc ctacaacttc 1080

ttcaactccg agtcggcgcc gtgcatgccg tcggagagca gcaaggtcaa cctcgacgac 1140

aaggacaact gcctcggcgc gctccgaccg gcgcagaaga cgacgctgca gtgcgccccc 1200

gtgctcgccc gccccgtcga ctgcagcaag cacgtctgcc ccggacaccc gacgcccggg 1260

aagccgtcgg agccgccgga gaagccgccg ctcatcccgg tgccggtggg gccgccggag 1320

aaatcgccgg cttacgagga accaccggcc gcgccttcca ccccgacgtc gcacggcccg 1380

ccacctccag aggaggagtc acctgaggaa ccacccgagg aaccaacacc gtcgccgaca 1440

ccaagcagcc cagagtcacc ggccaagatg gcgccgcctc cggcacccgc catcaaggga 1500

gtgacatcgc cgccggcaga gtatggtgct ccaccgccac caagttcggg ttggctcccc 1560

aagagtcccg agcgcaagaa ggcacctccg ccacaagcgg agcctcctac tgagtactcc 1620

ccacctgcaa ctccagagag ctcgccacca cctgaaggga agtcccctcc tacgccgacg 1680

gcctcgcact cgccaccacc ggtaccagag ggccacacac cttccccacc aaagtcggga 1740

ccacctgctg gggagtctcc tcctacacct gagtcaaaag cctcgcctcc accgactcca 1800

gaagaataca caccttcccc gccaaaatcg acaccaccag ctgagaagtc tcctcctaca 1860

cctgagtcga aagcctcatc tccaccacca cccgctccag agggccacac accttccccg 1920

ccagagtcga caccaccatc tgagaaatct cctcctacac ccgagtcgaa agcctcatct 1980

ccaccaccac ccactccaga gggccacaca ccttccccgc caaagtcgac accgccaact 2040

gagaagtctc ctcctacacc tgagtcggaa tcctcctctc caccaccacc cgctccagag 2100

ggccacatgc cttccccgcc aaagtcgacg ccaccagttg agaagtctcc tcccacgcct 2160

gagtcggaag cctcatctcc accaccaccc gctccggagg gccacacacc ttccccacca 2220

aagtcatcac caccagaaga gaagtctcct cctataccgc cgacctcgca tacatcacct 2280

ccaactccag aggaatacac accttcccca ccaaagtcat cgccaccaga agagaagtct 2340

cctccaccac attccccaga aaagtcacca ccatcagagg ctcacccaac ttctccacct 2400

ccctcggaga agtcacctcc aacaccagct gaagagagtt ctccgccaac tccggaaaaa 2460

tctccatcac caccatcggg tcatgaaggc actccaccat ccccagtgaa atcttcctca 2520

ccaccaccag aagctcatgt tagctcacca ccaccagaaa aatcttcctc gccaccacca 2580

gaagctcatg ttagttcacc accaccacct gaaaagtctc caccaccacc agagacaaag 2640

tctccaccaa cgctaacacc ggagatctct ccacctccgg aagggaagtc cccaccatca 2700

catactccgg agagctcatc cccaccatct aaggagtcag aaccaccacc gacaccaaca 2760

ccaaagagct ctccaccatc tcacgaggag tacgttcctc catctccggc aaaatcaact 2820

ccacctccag aagagaagtc cccaccatca catactccgg agagctcatc cccaccatct 2880

gaggagtcag aaccaccacc gtcaccaaca ccaaagagct ctccaccatc tcacgaggag 2940

tacgttcctc catctccggc gaaatcaact ccacctccag aaaagccact accaccacac 3000

acaccaacaa taaatagttc tccaccatcg gaagaagagt acatgcctcc atctccagtg 3060

aaatcaagtc caccaccagc cgagaagtcc cagccaccgc catctccagt tgagtcagta 3120

cttccaccag tgaagtcttc accaccacac gcaccggtta tctcagaacc accaccaaca 3180

aagtcttcac cgccgcaagt gccagtgacc tcggaaccac cgccagcaaa gtcttcacct 3240

ccacatgaac caattagccc gccagaaaca ccagagaagt cttacccgcc atcaactcct 3300

gaggaatcat ctcctccctc agtccccaag gcttcatctc caccaactga gaagtctctt 3360

cctccaccgg ctacagtgag cttgccgcct ccaacagtta agcctttgcc cccaccggtt 3420

cctgtgagct caccgccacc tccggagaag tctccacccc cgccagctcc ggtgatcttg 3480

ccgcctcctc caattaaatc tcctccccca ccggctccag tcatctcgcc acctcctcca 3540

gttaagtccc caccaccacc agcaccagtt atcttgccac ctcctcctgt gaagtctcca 3600

ccaccaccag caccggtcat ctcgccaccc ccacctgtga agtctccacc tcctcccgca 3660

ccagtcatct tgccaccccc acctgtgaag tctccacctc cacctgcacc ggtcatctcg 3720

ccaccacctc cagagaagtc accaccacca gcagcacctg tgatcttgtc accaccagcg 3780

gtgaagtctc ttcccccacc ggcaccggtc agcctaccac caccaccggt gaagtcgctt 3840

cccccaccag caccggtcag cctaccacca cccgtcgtga agtcacttcc cccaccagca 3900

ccagtcagcc taccaccacc agcggtgaag cctcttcccc caccagcacc agtcagccta 3960

ccaccaccag cggtgaagcc tcttccccca ccagttccgc aggtctccct ccccccaccg 4020

aaacaggagt cattgccgcc accagcaaag gaagctgaag ctccacctgc aaaggaatct 4080

aaacctccac cagcaatgga agctgaagct ccaccggcgt tcgacactac tgtactctta 4140

ccgccggtga tggcgcacca gtacgcctca cctccaccac ctcagttcca aggatactaa 4200

<210> 2

<211> 1399

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Asp Leu Arg Leu Leu Leu Ala Pro Gly Gly Arg Arg Ala Ala Met

1 5 10 15

Ala Leu Ile Leu Ala Val Leu Ala Ala Cys Leu Ser Ser Ala Ala Asn

20 25 30

Val Gly Ala Val Thr Ser Ala Glu Val Ser Tyr Ile Ala His Arg Gln

35 40 45

Leu Leu Ala Met Lys Glu Ala Gly Val Ser Glu Glu Gly Asp Leu Pro

50 55 60

Ser Asp Asp Phe Asp Phe Asp Asp Arg Val Gly Val Ala Val Gly Asp

65 70 75 80

Phe Pro Asn Pro Arg Leu Arg Lys Ala Tyr Ile Ala Leu Gln Ala Trp

85 90 95

Arg Arg Ala Phe Tyr Ser Asp Pro Lys Gly Tyr Thr Asn Asn Trp Thr

100 105 110

Gly Asn Asp Val Cys Ser Tyr Asn Gly Val Ile Cys Tyr Ala Ala Ile

115 120 125

Asp Asp Pro Lys Ile Met Val Val Ala Gly Ile Asp Leu Asn Gly Ala

130 135 140

Asp Ile Ala Gly Tyr Leu Pro Pro Glu Leu Gly Leu Leu Thr Asp Leu

145 150 155 160

Ala Phe Phe His Ile Asn Thr Asn Arg Phe Cys Gly Ile Ile Pro Lys

165 170 175

Ser Met Ser Arg Leu Ser Leu Leu His Glu Phe Asp Val Ser His Asn

180 185 190

Arg Phe Val Gly Val Phe Pro His Val Cys Leu Glu Met Ala Val Leu

195 200 205

Lys Tyr Leu Asp Ile Arg Phe Asn Asp Phe Glu Gly Glu Leu Pro Pro

210 215 220

Ala Leu Phe Asp Lys Glu Leu Asp Ala Ile Phe Val Asn Ser Asn Arg

225 230 235 240

Phe Val Gly Tyr Ile Pro Gly Asn Leu Gly Asn Ser Thr Ala Ser Val

245 250 255

Ile Val Phe Ala Asn Asn Ala Phe Val Gly Cys Ile Pro Lys Ser Ile

260 265 270

Gly Cys Met Ala Lys Thr Leu Asp Glu Ile Ser Phe Met Asn Asn Lys

275 280 285

Leu Asp Gly Cys Val Pro Met Glu Met Gly Tyr Leu Gln Asn Thr Tyr

290 295 300

Val Ile Asp Ile Ser Gly Asn Val Leu Val Gly Thr Leu Pro Thr Ser

305 310 315 320

Leu Ser Asn Cys Ser Lys Leu Glu Gln Leu Asp Val Ser Arg Asn Val

325 330 335

Phe Thr Gly Ile Val His Glu Ser Ile Cys Glu Leu Pro Val Leu Val

340 345 350

Asn Phe Ser Phe Ala Tyr Asn Phe Phe Asn Ser Glu Ser Ala Pro Cys

355 360 365

Met Pro Ser Glu Ser Ser Lys Val Asn Leu Asp Asp Lys Asp Asn Cys

370 375 380

Leu Gly Ala Leu Arg Pro Ala Gln Lys Thr Thr Leu Gln Cys Ala Pro

385 390 395 400

Val Leu Ala Arg Pro Val Asp Cys Ser Lys His Val Cys Pro Gly His

405 410 415

Pro Thr Pro Gly Lys Pro Ser Glu Pro Pro Glu Lys Pro Pro Leu Ile

420 425 430

Pro Val Pro Val Gly Pro Pro Glu Lys Ser Pro Ala Tyr Glu Glu Pro

435 440 445

Pro Ala Ala Pro Ser Thr Pro Thr Ser His Gly Pro Pro Pro Pro Glu

450 455 460

Glu Glu Ser Pro Glu Glu Pro Pro Glu Glu Pro Thr Pro Ser Pro Thr

465 470 475 480

Pro Ser Ser Pro Glu Ser Pro Ala Lys Met Ala Pro Pro Pro Ala Pro

485 490 495

Ala Ile Lys Gly Val Thr Ser Pro Pro Ala Glu Tyr Gly Ala Pro Pro

500 505 510

Pro Pro Ser Ser Gly Trp Leu Pro Lys Ser Pro Glu Arg Lys Lys Ala

515 520 525

Pro Pro Pro Gln Ala Glu Pro Pro Thr Glu Tyr Ser Pro Pro Ala Thr

530 535 540

Pro Glu Ser Ser Pro Pro Pro Glu Gly Lys Ser Pro Pro Thr Pro Thr

545 550 555 560

Ala Ser His Ser Pro Pro Pro Val Pro Glu Gly His Thr Pro Ser Pro

565 570 575

Pro Lys Ser Gly Pro Pro Ala Gly Glu Ser Pro Pro Thr Pro Glu Ser

580 585 590

Lys Ala Ser Pro Pro Pro Thr Pro Glu Glu Tyr Thr Pro Ser Pro Pro

595 600 605

Lys Ser Thr Pro Pro Ala Glu Lys Ser Pro Pro Thr Pro Glu Ser Lys

610 615 620

Ala Ser Ser Pro Pro Pro Pro Ala Pro Glu Gly His Thr Pro Ser Pro

625 630 635 640

Pro Glu Ser Thr Pro Pro Ser Glu Lys Ser Pro Pro Thr Pro Glu Ser

645 650 655

Lys Ala Ser Ser Pro Pro Pro Pro Thr Pro Glu Gly His Thr Pro Ser

660 665 670

Pro Pro Lys Ser Thr Pro Pro Thr Glu Lys Ser Pro Pro Thr Pro Glu

675 680 685

Ser Glu Ser Ser Ser Pro Pro Pro Pro Ala Pro Glu Gly His Met Pro

690 695 700

Ser Pro Pro Lys Ser Thr Pro Pro Val Glu Lys Ser Pro Pro Thr Pro

705 710 715 720

Glu Ser Glu Ala Ser Ser Pro Pro Pro Pro Ala Pro Glu Gly His Thr

725 730 735

Pro Ser Pro Pro Lys Ser Ser Pro Pro Glu Glu Lys Ser Pro Pro Ile

740 745 750

Pro Pro Thr Ser His Thr Ser Pro Pro Thr Pro Glu Glu Tyr Thr Pro

755 760 765

Ser Pro Pro Lys Ser Ser Pro Pro Glu Glu Lys Ser Pro Pro Pro His

770 775 780

Ser Pro Glu Lys Ser Pro Pro Ser Glu Ala His Pro Thr Ser Pro Pro

785 790 795 800

Pro Ser Glu Lys Ser Pro Pro Thr Pro Ala Glu Glu Ser Ser Pro Pro

805 810 815

Thr Pro Glu Lys Ser Pro Ser Pro Pro Ser Gly His Glu Gly Thr Pro

820 825 830

Pro Ser Pro Val Lys Ser Ser Ser Pro Pro Pro Glu Ala His Val Ser

835 840 845

Ser Pro Pro Pro Glu Lys Ser Ser Ser Pro Pro Pro Glu Ala His Val

850 855 860

Ser Ser Pro Pro Pro Pro Glu Lys Ser Pro Pro Pro Pro Glu Thr Lys

865 870 875 880

Ser Pro Pro Thr Leu Thr Pro Glu Ile Ser Pro Pro Pro Glu Gly Lys

885 890 895

Ser Pro Pro Ser His Thr Pro Glu Ser Ser Ser Pro Pro Ser Lys Glu

900 905 910

Ser Glu Pro Pro Pro Thr Pro Thr Pro Lys Ser Ser Pro Pro Ser His

915 920 925

Glu Glu Tyr Val Pro Pro Ser Pro Ala Lys Ser Thr Pro Pro Pro Glu

930 935 940

Glu Lys Ser Pro Pro Ser His Thr Pro Glu Ser Ser Ser Pro Pro Ser

945 950 955 960

Glu Glu Ser Glu Pro Pro Pro Ser Pro Thr Pro Lys Ser Ser Pro Pro

965 970 975

Ser His Glu Glu Tyr Val Pro Pro Ser Pro Ala Lys Ser Thr Pro Pro

980 985 990

Pro Glu Lys Pro Leu Pro Pro His Thr Pro Thr Ile Asn Ser Ser Pro

995 1000 1005

Pro Ser Glu Glu Glu Tyr Met Pro Pro Ser Pro Val Lys Ser Ser Pro

1010 1015 1020

Pro Pro Ala Glu Lys Ser Gln Pro Pro Pro Ser Pro Val Glu Ser Val

1025 1030 1035 1040

Leu Pro Pro Val Lys Ser Ser Pro Pro His Ala Pro Val Ile Ser Glu

1045 1050 1055

Pro Pro Pro Thr Lys Ser Ser Pro Pro Gln Val Pro Val Thr Ser Glu

1060 1065 1070

Pro Pro Pro Ala Lys Ser Ser Pro Pro His Glu Pro Ile Ser Pro Pro

1075 1080 1085

Glu Thr Pro Glu Lys Ser Tyr Pro Pro Ser Thr Pro Glu Glu Ser Ser

1090 1095 1100

Pro Pro Ser Val Pro Lys Ala Ser Ser Pro Pro Thr Glu Lys Ser Leu

1105 1110 1115 1120

Pro Pro Pro Ala Thr Val Ser Leu Pro Pro Pro Thr Val Lys Pro Leu

1125 1130 1135

Pro Pro Pro Val Pro Val Ser Ser Pro Pro Pro Pro Glu Lys Ser Pro

1140 1145 1150

Pro Pro Pro Ala Pro Val Ile Leu Pro Pro Pro Pro Ile Lys Ser Pro

1155 1160 1165

Pro Pro Pro Ala Pro Val Ile Ser Pro Pro Pro Pro Val Lys Ser Pro

1170 1175 1180

Pro Pro Pro Ala Pro Val Ile Leu Pro Pro Pro Pro Val Lys Ser Pro

1185 1190 1195 1200

Pro Pro Pro Ala Pro Val Ile Ser Pro Pro Pro Pro Val Lys Ser Pro

1205 1210 1215

Pro Pro Pro Ala Pro Val Ile Leu Pro Pro Pro Pro Val Lys Ser Pro

1220 1225 1230

Pro Pro Pro Ala Pro Val Ile Ser Pro Pro Pro Pro Glu Lys Ser Pro

1235 1240 1245

Pro Pro Ala Ala Pro Val Ile Leu Ser Pro Pro Ala Val Lys Ser Leu

1250 1255 1260

Pro Pro Pro Ala Pro Val Ser Leu Pro Pro Pro Pro Val Lys Ser Leu

1265 1270 1275 1280

Pro Pro Pro Ala Pro Val Ser Leu Pro Pro Pro Val Val Lys Ser Leu

1285 1290 1295

Pro Pro Pro Ala Pro Val Ser Leu Pro Pro Pro Ala Val Lys Pro Leu

1300 1305 1310

Pro Pro Pro Ala Pro Val Ser Leu Pro Pro Pro Ala Val Lys Pro Leu

1315 1320 1325

Pro Pro Pro Val Pro Gln Val Ser Leu Pro Pro Pro Lys Gln Glu Ser

1330 1335 1340

Leu Pro Pro Pro Ala Lys Glu Ala Glu Ala Pro Pro Ala Lys Glu Ser

1345 1350 1355 1360

Lys Pro Pro Pro Ala Met Glu Ala Glu Ala Pro Pro Ala Phe Asp Thr

1365 1370 1375

Thr Val Leu Leu Pro Pro Val Met Ala His Gln Tyr Ala Ser Pro Pro

1380 1385 1390

Pro Pro Gln Phe Gln Gly Tyr

1395

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> OsSWN1F

<400> 3

atgagcatat cggtgaacgg g 21

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> OsSWN1R

<400> 4

gcacctctct tggatgtccc a 21

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> OsSWN3F

<400> 5

gatgaggaag acgctggtgt t 21

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> OsSWN3R

<400> 6

caagctgtag ttgtcgggga c 21

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> OsSWN7F

<400> 7

aggttcctcc tggatttcgt tt 22

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> OsSWN7R

<400> 8

ttcttgtcct tgtggcgggt ac 22

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> OsPAL6F

<400> 9

agcagcctgt gcgtggctaa 20

<210> 10

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> OsPAL6R

<400> 10

gccgttcatc atgctgttca tg 22

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> OsPAL7F

<400> 11

ggtggtctct gcatggaggt 20

<210> 12

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> OsPAL7R

<400> 12

ccatgctgtt catcacccag tc 22

<210> 13

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> OsCCRF

<400> 13

aagggggcaa aatggtatgt g 21

<210> 14

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> OsCCRR

<400> 14

ccttcaacag caacaggcac a 21

<210> 15

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> OsCAD2F

<400> 15

tcacccccta caactacacc ct 22

<210> 16

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> OsCAD2R

<400> 16

agtactgctc cacattggcc tt 22

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> PRX1F

<400> 17

ttggtcagca aggcgcgtca 20

<210> 18

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> PRX1R

<400> 18

cgaagcagtc gtggaagaag ag 22

<210> 19

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> PRX2F

<400> 19

acttcgtcag caaggtgttc cc 22

<210> 20

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> PRX2R

<400> 20

aagcagtcgt ggaagaagag gc 22

<210> 21

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 25sRNAF

<400> 21

aaggccgaag aggagaaagg t 21

<210> 22

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 25sRNAR

<400> 22

ttggcgggcc gttaagcaga aaaga 25

<210> 23

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> OsPEX1-RNAiF

<400> 23

ggatccagga gtcacctgag gaacca 26

<210> 24

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> OsPEX1-RNAiR

<400> 24

ctgcagaagc ttattcttct ggagtcggtg ga 32

<210> 25

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> RT-OsPEX1F

<400> 25

gagatgggct acctgcagaa ca 22

<210> 26

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> RT-OsPEX1R

<400> 26

gtaggcgaag ctgaagttga cg 22

<210> 27

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> LRX-1BF

<400> 27

ggatccatgg acctccggct cctcct 26

<210> 28

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> LRX-4200SR

<400> 28

actagtttag tatccttgga actgag 26

Claims

1.水稻OsPEX1基因在水稻木质素代谢调控中的应用，其特征在于：

所述的水稻OsPEX1基因，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：水稻OsPEX1基因在水稻木质素代谢正向调控中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：水稻OsPEX1基因通过正向调控木质素代谢来实现在水稻抗倒伏方面的应用。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：将OsPEX1作为目标基因，构建相关重组表达载体，转化到水稻使该基因超量表达或下调表达，获得木质素含量显著变化的转基因植株；或者，利用上述木质素含量显著变化的转基因植株与需要改良木质素含量的水稻品种进行杂交，然后再与亲本进行回交的方法来获得木质素含量增加或降低的植株；

所述的重组表达载体是用现有的植物表达载体构建。

5.根据权利要求1～4任一项所述的应用，其特征在于：

所述的水稻OsPEX1基因的序列为下列A、B核苷酸序列之一：

A、如SEQ ID NO:1所示的DNA序列；

B、编码与A编码蛋白质相同的蛋白质的DNA序列。

6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：

在构建所述的重组表达载体时，在OsPEX1基因的转录起始核苷酸前加上任何一种增强型、组成型、组织特异性或诱导型启动子。

7.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：

对所述的植物表达载体进行改造后再使用，包括加入报告基因或抗生素抗性基因，所述的报告基因为GUS或GTP。

8.含有水稻OsPEX1基因的重组表达载体、转基因细胞系或重组菌在水稻木质素代谢调控中的应用，其特征在于：

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：

含有水稻OsPEX1基因的重组表达载体、转基因细胞系或重组菌通过正向调控木质素代谢来实现在水稻抗倒伏方面的应用。