CN115011618B

CN115011618B - 一种提高水稻水分运输效率和/或促进水稻木质部增长的方法

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Publication number: CN115011618B
Application number: CN202210652598.7A
Authority: CN
Inventors: 刘慧丽; 梁玮; 董孟格
Original assignee: South China Agricultural University
Current assignee: South China Agricultural University
Priority date: 2022-06-09
Filing date: 2022-06-09
Publication date: 2023-06-02
Anticipated expiration: 2042-06-09
Also published as: CN115011618A

Abstract

本发明公开了一种提高水稻水分运输效率和/或促进水稻木质部增长的方法，所述方法通过CRISPR‑Cas9技术敲除和/或沉默RNA甲基转移酶基因OsEVB或RNA甲基转移酶OsEVB，从而使得到的转基因水稻植株茎秆维管束增大、木质部增大、木质细胞增多。利用该方法可以提高水稻水分运输能力和/或提高水稻水分运输效率。解决了目前人们对单子叶模式植物水稻的维管发育调控机制研究较少的问题，为创新水稻高效水分运输提供新的方法和思路。

Description

一种提高水稻水分运输效率和/或促进水稻木质部增长的方法

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体地，涉及一种提高水稻水分运输效率和/或促进水稻木质部增长的方法。

背景技术

水稻(Oryza sativa L.)是一年生禾本科植物。水稻作为世界上主要的粮食作物之一，人们研究的热点一直是如何提高水稻的产量。水稻的产量不仅受到遗传因素的影响，还受到各种环境因素的影响。在众多环境因素中，水分是决定水稻产量的最主要因素之一。在水稻的各个生长发育时期都需要消耗大量的水分，特别是孕穗期是决定水稻是否穗大、粒多的关键时期，此时期也是水稻生长发育过程中对水分最敏感的时期，此时期进行不同程度水分胁迫均会导致产量、品质降低。此时期是水稻建立库容的关键时期，对产量高低的影响至关重要，所以水稻孕穗期必须保持水分。因此，研究并揭示水稻水分运输的分子机理进而提高水稻水分运输的效率对知道生产育种和产量具有重要研究意义。

水稻植株体中存在的维管束系统是输导组织，维管束的主要组件因子是木质部和韧皮部：木质部的主要构成元素是导管，能够保障水分和溶解于水的无机盐保持长期的长途运输；韧皮部的主要构成元素是筛管和伴胞，能够保障溶解状态的同化物从植株体根部运输至每个细胞。植物的维管系统向光合器官长距离运输水分，木质部水分运输对气孔运动、光合碳同化、蒸腾等生理过程有协调和调控作用，被称为植物生理学的支柱。在较长距离的水分运输中，木质部中的导管是主要的通道，而导管是由一系列已死亡的、中空的细胞组成。并且木质部的水分运输能力对植物有着重要的生理与生态学意义，水分运输能力高可以满足更大的蒸发量，进而可以有效提高光合效率，植株生长更快、产量更高。

目前人们对单子叶模式植物水稻的维管发育调控机制知之甚少，水稻有关水分疏导效率影响水稻生长发育及产量的相关研究仍然不多，水稻中水分输导影响产量的因素仍需进一步探究。有关水稻水分运输的研究主要集中在水分运输的水力学机制和叶片结构对水力导度的影响，对水稻茎秆维管组织发育分子机理和水分运输效率的创新方面研究不多。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术的上述不足，提供一种提高水稻水分运输效率和/或促进水稻木质部增长的方法，本发明利用基因靶向编辑水稻中的一个RNA甲基转移酶基因OsEVB，调控水稻的维管束的表达模式，使水稻维管束木质部增多，实现水分运输效率提高。

本发明的第一目的是提供一种提高水稻水分运输效率和/或促进水稻木质部增长的方法。

本发明的第二目的是提供一种重组载体和/或重组菌株在制备RNA甲基转移酶基因OsEVB的抑制剂或RNA甲基转移酶OsEVB的抑制剂中的应用。

本发明的第三目的是提供一种重组载体和/或重组菌株在提高水稻水分运输效率和/或促进水稻木质部增长中的应用。

为了实现上述目的，本发明是通过以下方案予以实现的：

一种提高水稻水分运输效率和/或促进水稻木质部增长的方法，其通过敲除和/或沉默RNA甲基转移酶基因OsEVB或RNA甲基转移酶OsEVB，所述RNA甲基转移酶基因OsEVB的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述RNA甲基转移酶OsEVB的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示；所述促进水稻木质部增长为促进木质部细胞增多。

优选地，所述敲除和/或沉默RNA甲基转移酶基因OsEVB或RNA甲基转移酶OsEVB为利用CRISPR-Cas9技术敲除RNA甲基转移酶基因OsEVB。

优选地，所述利用CRISPR-Cas9技术敲除RNA甲基转移酶基因OsEVB或RNA甲基转移酶OsEVB的具体方法为利用含有重组有靶点的pYLCRISPR/Cas9-MH载体的重组菌株遗传转化水稻植株。

优选地，所述重组靶点为核苷酸序列如SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5和/或SEQ ID NO：6所示的重组靶点。

优选地，所述pYLCRISPR/Cas9-MH载体为U6a或U3启动子启动的pYLCRISPR/Cas9-MH载体。

优选地，将所述pYLCRISPR/Cas9-MH载体转入大肠杆菌中进行扩增繁殖，得到阳性重组菌，提取阳性重组菌中的重组质粒，转入农杆菌中，得到含有重组质粒的农杆菌。

更优选地，所述大肠杆菌为大肠杆菌菌株DH5α。

更优选地，所述农杆菌为农杆菌菌株EHA105。

优选地，所述遗传转化的方法为通过农杆菌介导的遗传转化体系将重组质粒导入水稻植株中。

更优选地，所述将重组质粒导入水稻植株中的具体方法为：用含有重组质粒的农杆菌侵染水稻植株的愈伤组织共培养，在含潮霉素的筛选培养基上筛选抗性愈伤，筛选一次后转到预分化、分化培养基中培养。

本发明还要求保护核苷酸序列如SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5和/或SEQ ID NO：6所示的重组靶点在敲除和/或沉默RNA甲基转移酶基因OsEVB或RNA甲基转移酶OsEVB中的应用。

本发明还要求保护核苷酸序列如SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5和/或SEQ ID NO：6所示的重组靶点在提高水稻水分运输效率和/或促进水稻木质部增长中的应用。

本发明还要求保护一种重组载体和/或重组菌株在制备RNA甲基转移酶基因OsEVB的抑制剂或RNA甲基转移酶OsEVB的抑制剂中的应用。

本发明还要求保护一种重组载体和/或重组菌株在提高水稻水分运输效率和/或促进水稻木质部增长中的应用。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明提供了一种提高水稻水分运输效率和/或促进木质部增长的方法，利用CRISPR-Cas9技术敲除和/或沉默水稻中RNA甲基转移酶基因OsEVB或RNA甲基转移酶OsEVB，得到的转基因植株的茎秆维管束增大、木质部增大、木质化细胞增多。利用该方法可以提高水稻水分运输能力和/或提高水稻水分运输效率。解决了目前人们对单子叶模式植物水稻的维管发育调控机制研究较少的问题，为创新水稻高效水分运输提供新的方法和思路。

附图说明

图1为水稻RNA甲基转移酶基因OsEVB的基因结构图及突变体的基因编辑情况图；A：选取图示的4个位于RNA甲基转移酶基因OsEVB上的靶点进行打靶；B：最终获得4个株系，V1T1株系为氨基酸替换，无表型；V2T1株系致死。

图2为取孕穗期水稻植株倒二节茎石蜡切片后进行Fasga染色，ZH11为野生型水稻植株中花11；A：ZH11植株茎的大维管束组织切片图；B：Cas9-V1植株茎的大维管束组织切片图；C：Cas9-V2植株茎的大维管束组织切片图；D：实验植株的大维管束面积统计图；E：实验植株的后生木质面积统计图；F：实验植株的韧皮部面积统计图；G：实验植株的木质化细胞统计图。误差为SD，样本数为N＝12.用t检验进行统计分析(****p＜0.0001)。标尺：A～C：100μm；图2B、2C中的星号为增多的木质化细胞。

图3为水分运输实验结果图。A：染色2h后，突变体颜色较ZH11深；B：突变体叶舌颜色比ZH11红；C：随机选取3片叶子，突变体颜色比ZH11红；

图4为本发明实施例所用序列信息图。

具体实施方式

下面结合说明书附图及具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

以下实施例使用的PYLgRNA-OsU3质粒、PYLgRNA-OsU6a质粒和pYLCRISPR/Cas9-MH质粒来源于现有技术，PYLgRNA-OsU3质粒和PYLgRNA-OsU6a质粒来源于现有技术如CN2019113388450所示；其中pYLCRISPR/Cas9-MH即为现有技术(A robust CRISPR/Cas9vector system for multiplex targeting of genomic sites in monocot and dicotplants)中的pYLCRISPR/Cas9-MTmono。

实施例1重组载体的构建、转化和质粒的提取

根据粳稻品种中花11(Oryza Sativa L.subsp.Japonica zhonghua 11，ZH11)的参考序列在RNA甲基转移酶基因OsEVB的外显子中设计4个靶点，分别为：V1T1(靶点1)、V1T2(靶点2)、V2T1(靶点3)和V2T2(靶点4)，4个靶点序列如表1所示。

表1靶点序列

靶点名称	靶点序列(5’→3’)
		V1T1(SEQ ID NO：3)	ATTGGATGGGGATCGTTCAA
V1T2(SEQ ID NO：4)	GGAATTGTATTGGGGCTATA
		V2T1(SEQ ID NO：5)	AATGAACTCCGGAGACGCCG
V2T2(SEQ ID NO：6)	GAAGAGAGTAACTATTGCCA

运用CRISPR-Cas9系统，将设计的靶点序列连入由U6a或U3启动子启动的Cas9载体中，获得重组载体。具体步骤如下：

(1)靶点引物设计

用基因座位号LOC4335294在NCBI数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)或RAPDB数据库(https://rapdb.dna.affrc.go.jp/)下载基因序列，并标注非编码区(UTR)、外显子和内含子。

首先寻找靶点并确定启动子：本发明中VIT1靶点选用U3启动子，V1T2靶点选用U6a启动子，V2T1靶点选用U3启动子，V2T2靶点选用U6a启动子。U3启动子的核苷酸序列如SEQIN NO：24所示，U6a启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO：25所示。

根据每个靶点连接的启动子设计靶点接头正反向引物。其中，靶点1的正反向引物核苷酸序列如SEQ ID NO：7～8所示；靶点2的正反向引物核苷酸序列如SEQ ID NO：9～10所示；靶点3的正反向引物核苷酸序列如SEQ ID NO：11～12所示；靶点4的正反向引物核苷酸序列如SEQ ID NO：13～14所示。

(2)制备靶点接头

用1×TE(pH 8.0)溶液将步骤(1)得到的靶点接头正反向游引物溶解成100μM母液，各取0.5μL接头正反向游引物母液加入49μL 0.5×TE溶液混匀，90℃变性30s(使用PCR仪或水浴锅)，室温冷却退火，产物即为制备好的带有接头的靶点。

(3)带有接头的靶点与gRNA表达盒连接

针对步骤(2)制备好的4个带有接头的靶点，分别将每个靶点与含有PYLgRNA-OsU3质粒或PYLgRNA-OsU6a质粒的gRNA表达盒进行酶切连接：靶点接头选用U3启动子则选择PYLgRNA-OsU3质粒；靶点接头选用U6a启动子则选择PYLgRNA-OsU6a质粒；gRNA核苷酸序列如SEQ ID NO：15所示。PCR反应体系如表2所示，

表2边切边连PCR反应体系

PCR程序：37℃,5min；20℃,5min,5循环。

PCR反应后得到每个带有接头的靶点与gRNA表达盒的连接产物，即带有U3启动子接头的V1T1靶点与gRNA表达盒的连接产物(表达盒1)、带有U6a启动子接头的V1T2靶点与gRNA表达盒的连接产物(表达盒2)、带有U3启动子接头的V2T1靶点与gRNA表达盒的连接产物(表达盒3)和带有U6a启动子接头的V2T2靶点与gRNA表达盒的连接产物(表达盒4)。

(4)第一轮扩增

对步骤3得到的每一个表达盒进分别进行两个扩增反应。

扩增反应1：用U-F引物和每个表达盒中靶点对应的接头反向引物对带有靶点接头的启动子进行扩增；

扩增反应2：用gRNA-R引物和每个表达盒中靶点对应的接头正向引物对gRNA表达盒连接产物进行扩增。

其中，扩增反应1的PCR体系如表3所示，扩增反应2的PCR体系如表4所示。

表3反应1的PCR反应体系

表4反应2的PCR反应体系

扩增反应1和扩增反应2的PCR程序均为：95℃预变性1min，95℃变性15s、60℃退火15s、72℃延伸15s，PCR扩增共32个循环，72℃再次延伸3min，然后16℃保持，得到扩增反应1的产物：PCR产物1和扩增反应2的产物：PCR产物2。

分别取每个表达盒两次扩增反应的产物(PCR产物1和PCR产物2)4～5μL进行琼脂糖凝胶电泳，PCR产物1目的条带长度为启动子序列长度和靶点序列长度相加：选用U3启动子的靶点扩增反应1得到的产物长度即为：448bp+20bp＝468bp，选用U6a启动子的靶点扩增反应2得到的产物长度即为：474bp+20bp＝494bp；PCR产物2目的条带长度为靶点序列长度、gRNA序列长度和gRNA-R引物序列长度相加，检测条带大小正确后，说明步骤(3)中带有接头的靶点与gRNA表达盒连接成功，即可进行第二轮扩增。

所述U-F引物和gRNA-R引物的核苷酸信息如表5所示。

表5引物信息

引物	引物序列(5’→3’)
		U-F引物序列(SEQ ID NO：16)	CTCCGTTTTACCTGTGGAATCG
gRNA-R引物序列(SEQ ID NO：17)	CGGAGGAAAATTCCATCCAC

(5)第二轮扩增

将步骤(4)由同一表达盒扩增得到的扩增反应1的PCR产物1和扩增反应2的PCR产物2混合后分别进行扩增，其中表达盒1和表达盒3得到的PCR产物1和PCR产物2对应的引物为Pps-GGL和Pgs-GG2，表达盒2和表达盒4得到的PCR产物1和PCR产物2对应的引物为Pps-GG2和Pgs-GGR，每个表达盒扩增得到的产物进行一个PCR反应。

表达盒1和表达盒3的PCR体系如表6所示，表达盒2和表达盒4的PCR体系如表7所示，

表6表达盒1和表达盒3的PCR反应体系

表7表达盒2和表达盒4的PCR反应体系

PCR程序：95℃预变性1min，95℃变性15s、60℃退火15s、72℃延伸50s，PCR扩增共28个循环，72℃再次延伸3min，然后16℃保持，得到扩增后的表达盒1：PCR产物3、扩增后的表达盒2：PCR产物4、扩增后的表达盒3：PCR产物5和扩增后的表达盒4：PCR产物6。

PCR产物3～6分别取4～5μL进行琼脂糖凝胶电泳检测，PCR产物3和PCR产物5的目的条带大小为U3启动子序列长度、靶点序列长度和gRNA长度相加，PCR产物4和PCR产物6的目的条带大小为U6a启动子序列长度、靶点序列长度和gRNA长度相加，条带大小符合后，PCR产物3、PCR产物4、PCR产物5和PCR产物6分别回收。

所述引物的核苷酸信息如表8所示。

(6)双表达盒与Cas9载体连接

用边切边连的方法，将步骤(5)得到的PCR产物3和PCR产物4连接到一个pYLCRISPR/Cas9-MH载体(Cas9载体)上；将步骤(5)得到的PCR产物5和PCR产物6连接到一个pYLCRISPR/Cas9-MH载体(Cas9载体上)上。

PCR产物3、PCR产物4和Cas9载体连接反应体系如表9所示；

PCR产物5、PCR产物6和Cas9载体连接反应体系如表10所示，

表9PCR产物3、PCR产物4与Cas9载体连接反应体系

表10PCR产物5、PCR产物6与Cas9载体连接反应体系

PCR程序：37℃,5min；10℃,5min；20℃,5min，进行12个循环。

得到PCR产物3、PCR产物4和Cas9载体的连接产物：V1T1-Cas9-V1T2；以及PCR产物5、PCR产物6和Cas9载体的连接产物：V2T1-Cas9-V2T2。

(7)转化大肠杆菌与鉴定

使用热激法将步骤(6)制备得到的V1T1-Cas9-V1T2和V2T1-Cas9-V2T2分别用于转化大肠杆菌感受态细胞，挑取单克隆菌落到500μL Km抗性LB液体培养基，37℃摇床(220rpm)培养约4h，待菌液浑浊后进行菌落PCR鉴定，反应体系如表11所示：

表11菌落PCR鉴定反应体系

PCR程序：98℃预变性1min，98℃变性10s、58℃退火10s、72℃延伸15s，PCR扩增共32个循环，72℃再次延伸3min，然后16℃保持。

得到V1T1-Cas9-V1T2转化的大肠杆菌感受态细胞的PCR产物7以及V2T1-Cas9-V2T2转化的大肠杆菌感受态细胞的PCR产物8。

取PCR产物7和PCR产物8进行琼脂糖凝胶电泳，条带约为U3启动子序列长度、两个gRNA序列长度、两个靶点序列长度和U6a启动子序列长度相加的大小，条带正确后送菌液去生物公司进行测序，测序载体引物选用SP-ML和SP-R，测序结果与目的序列(即4个靶点核苷酸序列如SEQ ID NO：3～SEQ ID NO：6所示)比对无误后，将V1T1-Cas9-V1T2和V2T1-Cas9-V2T2转化的大肠杆菌菌液与80％甘油等体积混合保存于-80℃冰箱，分别对V1T1-Cas9-V1T2和V2T1-Cas9-V2T2转化的大肠杆菌菌液进行抽提得到用于敲除水稻中RNA甲基转移酶基因OsEVB的质粒1和质粒2，并保存在-20℃冰箱。

所述引物的核苷酸信息如表12所示。

表12引物信息

实施例2转基因水稻植株的培育及鉴定

1、实验方法

(1)农杆菌转化法获得转基因水稻植株

将实施例1中抽提得到的用于敲除水稻中RNA甲基转移酶基因OsEVB的质粒1和质粒2分别转入农杆菌菌株EHA105中。用农杆菌菌株EHA105侵染野生型水稻ZH11植株的愈伤组织共培养，在含潮霉素的筛选培养及上筛选抗性愈伤，筛选一次后转到预分化、分化培养基中培养，直至成苗。成苗后在生根壮苗培养基中培养炼苗，种植于网室。

(2)鉴定转基因水稻植株

用CTAB法提取转基因水稻植株基因组DNA，利用引物序列如表13所示的引物V1T2-F、V1T2-R、V2T2-F、V2T2-R对转基因植株DNA进行PCR扩增然后测序鉴定，反应体系如表14所示，

表13引物序列

表14 PCR反应体系

PCR程序：将PCR反应体系放入PCR仪内，98℃预变性3min，98℃变性10s、58℃退火10s、72℃延伸20s，PCR扩增共35个循环，72℃再次延伸5min，然后16℃保持，得到PCR产物9。

将得到的PCR产物9送生工公司进行测序，然后进行序列比对。

2、实验结果

农杆菌转化法获得转基因水稻植株四个株系，利用实施例1得到的质粒1侵染得到V1T1植株和V1T2植株；利用实施例1得到的质粒2侵染得到V2T1植株和V2T2植株。

V1T1植株为氨基酸替换，无表型；V2T1植株致死。最终选取V1T2、V2T2植株进行实验，分别将其命名为Cas9-V1和Cas9-V2。

测序鉴定结果如图1B所示，所示基因编辑情况表中存在碱基的缺失、替换或插入即重组成功。

实施例3实验植株的石蜡切片和Fasga染色实验

1、实验方法

(1)石蜡切片

先取处于孕穗期的ZH11水稻植株的倒数第二节嫰茎，再取处于孕穗期的由实施例2得到的Cas9-V1植株和Cas9-V2植株的倒数第二节嫰茎，用含有体积比为50％的无水乙醇的FAA固定液固定样品，在冰上抽真空15～20分钟直至固定液下沉，抽真空后置于4℃环境中过夜固定。首先用体积分数为50％的酒精洗掉固定液，重复三次，每次30min。然后在4℃冰箱进行梯度乙醇脱水，所述梯度乙醇脱水是用体积分数为70％的乙醇脱水1h后，接着用体积分数为85％的乙醇脱水1h，再用体积分数为95％的乙醇脱水1h。然后在室温下继续脱水透明，具体为：用无水乙醇脱水1h，倒掉溶液；再用无水乙醇脱水1h，倒掉溶液；再用体积比为1：1的无水乙醇：二甲苯混合液脱水1.5h，倒掉溶液；再用二甲苯脱水1h，倒掉溶液；再用二甲苯脱水1h，倒掉溶液。然后进行浸蜡，具体为：在二甲苯+尽量多的碎蜡中42℃反应过夜；接着用体积比为1：1的二甲苯：碎蜡混合液在48℃的环境下反应2h后；用体积比为1：3的二甲苯：碎蜡混合液在50℃的环境下反应2h；接着用纯蜡在60℃的环境中连续反应两天，早中晚各换一次纯蜡。将已浸蜡的样品放入热融的包埋石蜡中进行包埋，对包埋好的样品进行切片并脱蜡。

(2)Fasga染色

用Fasga染液对处理好的切片样品在4℃的环境下，避光染色1小时，接着用双蒸水洗去多余染液、晾干，用树脂进行封片后拍照观察。

2、实验结果

切片染色的结果如图2所示，其中转基因植株样品Cas9-V1(图2B)和Cas9-V2(图2C)植株中茎的大维管束的横截面面积明显大于野生型水稻植株ZH11(图2A)。转基因植株样品Cas9-V1和Cas9-V2植株的大维管束横截面面积(图2D)、后生木质部横截面面积(图2E)、韧皮部横截面面积(图2F)均比野生型水稻植株ZH11大。且转基因植株样品Cas9-V1和Cas9-V2植株的后生木质部上方都分化出一个木质部细胞。转基因植株的原生木质部导管也存在增多的情况(图2G)。

上述实验结果可以看出敲除RNA甲基转移酶基因OsEVB后的水稻植株的维管束部横截面面积、木质部横截面面积和韧皮部横截面面积均增大，说明RNA甲基转移酶基因OsEVB参与了水稻维管束的发育，并且改变维管细胞命运的分化，从而提高水分输导效率。

实施例4水分运输效率实验

1、实验方法

分别取处于孕穗期的ZH11水稻植株以及处于孕穗期的由实施例2得到的Cas9-V1和Cas9-V2植株，去掉实验植株的根。将处理后的植株放进质量比为0.5％的酸性品红中，2h后拍照并观察，随机选取3片叶子，进行颜色比较。

2、实验结果

实验结果如图3所示，在2h时，Cas9-V1和Cas9-V2植株比野生型水稻植株ZH11能吸收更多的染色液，使得Cas9-V1和Cas9-V2植株比野生型水稻植物ZH11颜色更红(图3A)。Cas9-V1和Cas9-V2植株的叶舌相较于ZH11植株更红(图3B)。随机选取的3片叶子中，的叶舌相较于ZH11植株更红(图3C)。

上述实验结果说明Cas9-V1和Cas9-V2植株因为维管束面积增大，木质化细胞增多，使植株拥有更强大的水分运输能力。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。

序列表

<110> 华南农业大学

<120> 一种提高水稻水分运输效率和/或促进水稻木质部增长的方法

<160> 25

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1077

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atgaactccg gagacgccga ggcagcagcg gcctccaaga aggcccggtg caagaaggag 60

aagaaaaaga agcgaaagga cgactgcgga gccgcagagg cttcagcggc tgacgaagaa 120

atcgtccacg acaagaagag gaagaagcag ctgcaacaga agaagaacgg agatgacgtg 180

gcggttccga atcggaagac cacggtgagc atcgccgtcg ccggatccat catcgacaac 240

gcccagtccc tcgagctcgc caccctcctg gcaggacaaa tcgcccgcgc ggcgaccgtc 300

ttccgcatcg acgaggttgt ggtcttcgac agcaattcct cagtggagaa cagcggcgat 360

gacgtagaga gtggcgcgcg cttccttgtt cgcatcctac agtatctgga gactccacaa 420

tacctgcgcc gacgcctttt cccgatgcac aacaacttga agtttgtggg gttgctgccc 480

ccactcgatg caccacacca tttgcgcaag catgagtggt ctgaatttcg tgaaggcgta 540

acattggatg gggatcgttc aatggggaca tttgttgatg tcggattgag taagaatgtt 600

ctggttgagc aaatgctaga accagggaag agagtaacta ttgccatggg taccaatcgt 660

gacattacaa cagcttgcaa aaggaaaatt gtttcccctt cctctcccag ggatgaaatg 720

gaattgtatt ggggctataa ggtccggtat gcttcaaatt tgggtggagt tttcagtgat 780

tcaccataca aggaaggata tgattatatc attggtactt cagagcatgg aaagatcatt 840

agttcatctg agctgatctt accttccttt aggcaccttt taattgcatt tggtggattg 900

gctggtctag aagaatgcat tgaagaagat agaaatttga agggtaaagg tgtagatgat 960

gtatttaata cctatttgaa tacatgtccc agtcaaggga gcagaacaat aagaacggag 1020

gaagcacttc tcatctctct ccaatacttc caagacccca ttaggcgagc tggatag 1077

<210> 2

<211> 358

<212> PRT

<213> 氨基酸

<400> 2

Met Asn Ser Gly Asp Ala Glu Ala Ala Ala Ala Ser Lys Lys Ala Arg

1 5 10 15

Cys Lys Lys Glu Lys Lys Lys Lys Arg Lys Asp Asp Cys Gly Ala Ala

20 25 30

Glu Ala Ser Ala Ala Asp Glu Glu Ile Val His Asp Lys Lys Arg Lys

35 40 45

Lys Gln Leu Gln Gln Lys Lys Asn Gly Asp Asp Val Ala Val Pro Asn

50 55 60

Arg Lys Thr Thr Val Ser Ile Ala Val Ala Gly Ser Ile Ile Asp Asn

65 70 75 80

Ala Gln Ser Leu Glu Leu Ala Thr Leu Leu Ala Gly Gln Ile Ala Arg

85 90 95

Ala Ala Thr Val Phe Arg Ile Asp Glu Val Val Val Phe Asp Ser Asn

100 105 110

Ser Ser Val Glu Asn Ser Gly Asp Asp Val Glu Ser Gly Ala Arg Phe

115 120 125

Leu Val Arg Ile Leu Gln Tyr Leu Glu Thr Pro Gln Tyr Leu Arg Arg

130 135 140

Arg Leu Phe Pro Met His Asn Asn Leu Lys Phe Val Gly Leu Leu Pro

145 150 155 160

Pro Leu Asp Ala Pro His His Leu Arg Lys His Glu Trp Ser Glu Phe

165 170 175

Arg Glu Gly Val Thr Leu Asp Gly Asp Arg Ser Met Gly Thr Phe Val

180 185 190

Asp Val Gly Leu Ser Lys Asn Val Leu Val Glu Gln Met Leu Glu Pro

195 200 205

Gly Lys Arg Val Thr Ile Ala Met Gly Thr Asn Arg Asp Ile Thr Thr

210 215 220

Ala Cys Lys Arg Lys Ile Val Ser Pro Ser Ser Pro Arg Asp Glu Met

225 230 235 240

Glu Leu Tyr Trp Gly Tyr Lys Val Arg Tyr Ala Ser Asn Leu Gly Gly

245 250 255

Val Phe Ser Asp Ser Pro Tyr Lys Glu Gly Tyr Asp Tyr Ile Ile Gly

260 265 270

Thr Ser Glu His Gly Lys Ile Ile Ser Ser Ser Glu Leu Ile Leu Pro

275 280 285

Ser Phe Arg His Leu Leu Ile Ala Phe Gly Gly Leu Ala Gly Leu Glu

290 295 300

Glu Cys Ile Glu Glu Asp Arg Asn Leu Lys Gly Lys Gly Val Asp Asp

305 310 315 320

Val Phe Asn Thr Tyr Leu Asn Thr Cys Pro Ser Gln Gly Ser Arg Thr

325 330 335

Ile Arg Thr Glu Glu Ala Leu Leu Ile Ser Leu Gln Tyr Phe Gln Asp

340 345 350

Pro Ile Arg Arg Ala Gly

355

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

attggatggg gatcgttcaa 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ggaattgtat tggggctata 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

aatgaactcc ggagacgccg 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

gaagagagta actattgcca 20

<210> 7

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

ggcattggat ggggatcgtt caa 23

<210> 8

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

aaacttgaac gatccccatc caat 24

<210> 9

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

gccggaattg tattggggct ata 23

<210> 10

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

aaactatagc cccaatacaa ttcc 24

<210> 11

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

ggcaatgaac tccggagacg ccg 23

<210> 12

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

aaaccggcgt ctccggagtt catt 24

<210> 13

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

gccgaagaga gtaactattg cca 23

<210> 14

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

aaactggcaa tagttactct cttc 24

<210> 15

<211> 81

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aaggctagtc cgttatcaac ttgaaaaagt 60

ggcaccgagt cggtgctttt t 81

<210> 16

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

ctccgtttta cctgtggaat cg 22

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

cggaggaaaa ttccatccac 20

<210> 18

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

gcggtgtcat ctatgttact a 21

<210> 19

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

cccgacatag atgcaataac ttc 23

<210> 20

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

ttcagaggtc tctctcgact agtatggaat cggcagcaaa gg 42

<210> 21

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 21

agcgtgggtc tcgtcagggt ccatccactc caagctc 37

<210> 22

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 22

ttcagaggtc tctctgacac tggaatcggc agcaaagg 38

<210> 23

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 23

agcgtgggtc tcgaccgacg cgtatccatc cactccaagc tc 42

<210> 24

<211> 448

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 24

tnnnnctctg gaatcggcag caaaggacgc gttgacattg taggactata ttgctctaat 60

aaaggaagga atctttaaac atacgaacag atcacttaaa gttcttctga agcaacttaa 120

agttatcagg catgcatgga tcttggagga atcagatgtg cagtcaggga ccatagcaca 180

agacaggcgt cttctactgg tgctaccagc aaatgctgga agccgggaac actgggtacg 240

ttggaaacca cgtgtgatgt gaaggagtaa gataaactgt aggagaaaag catttcgtag 300

tgggccatga agcctttcag gacatgtatt gcagtatggg ccggcccatt acgcaattgg 360

acgacaacaa agactagtat tagtaccacc tcggctatcc acatagatca aagctggttt 420

aaaagagttg tgcagatgat ccgtggca 448

<210> 25

<211> 474

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 25

tnnnnctctg gaatcggcag caaaggattt tttcctgtag ttttcccaca accatttttt 60

accatccgaa tgataggata ggaaaaatat ccaagtgaac agtattccta taaaattccc 120

gtaaaaagcc tgcaatccga atgagccctg aagtctgaac tagccggtca cctgtacagg 180

ctatcgagat gccatacaag agacggtagt aggaactagg aagacgatgg ttgattcgtc 240

aggcgaaatc gtcgtcctgc agtcgcatct atgggcctgg acggaatagg ggaaaaagtt 300

ggccggatag gagggaaagg cccaggtgct tacgtgcgag gtaggcctgg gctctcagca 360

cttcgattcg ttggcaccgg ggtaggatgc aatagagagc aacgtttagt accacctcgc 420

ttagctagag caaactggac tgccttatat gcgcgggtgc tggcttggct gccg 474

Claims

1.一种提高水稻水分运输效率和/或促进水稻木质部增长的方法，其特征在于，所述方法为敲除和/或沉默RNA甲基转移酶基因OsEVB或RNA甲基转移酶OsEVB，所述RNA甲基转移酶基因OsEVB的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述RNA甲基转移酶OsEVB的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，利用CRISPR-Cas9技术敲除和/或沉默RNA甲基转移酶基因OsEVB或RNA甲基转移酶OsEVB。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述利用CRISPR-Cas9技术敲除和/或沉默RNA甲基转移酶基因OsEVB或RNA甲基转移酶OsEVB的具体方法为利用含有重组靶点的pYLCRISPR/Cas9-MH体的重组菌株遗传转化水稻植株。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述重组靶点为核苷酸序列如SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6所示的重组靶点。

5.权利要求4所述的重组靶点在敲除RNA甲基转移酶基因OsEVB或RNA甲基转移酶OsEVB中的应用。

6.一种重组载体在提高水稻水分运输效率和/或促进水稻木质部增长中的应用，所述重组载体为包含如SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6所示核苷酸序列的重组靶点的载体。

7.一种重组菌株，其特征在于，含有权利要求6所述的重组载体。

8.核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示的RNA甲基转移酶基因OsEVB的抑制剂或氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示的RNA甲基转移酶OsEVB的抑制剂在提高水稻水分运输效率和/或促进水稻木质部增长中的应用；

所述抑制剂为权利要求6中所述的重组载体和/或权利要求7所述的重组菌株。