JP2006507819A - Ｔ−ｄｎａ挿入変異を利用した稲器官優先遺伝子同定方法及び前記方法で同定された遺伝子 - Google Patents

Ｔ−ｄｎａ挿入変異を利用した稲器官優先遺伝子同定方法及び前記方法で同定された遺伝子 Download PDF

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Abstract

本発明はT-DNA挿入変異を利用した稲器官優先遺伝子同定方法及び前記方法で同定された遺伝子に関する。特に本発明は、T-DNA／GUS挿入変異体に変形された遺伝子を有する稲細胞株生産方法を提供する。前記挿入体のGUS部分はプロモータがなく、したがって、GUS遺伝子は活性遺伝子に挿入された場合にのみ発現される。このような方法で、多様な稲遺伝子の器官優先的発現を確認することができる。本発明はまた、T-DNA／GUS挿入変異体誘発法で確認した器官-優先的遺伝子及びこれから暗号化される蛋白質に関する。また、本発明は稲植物に対する情報、例えば挿入体を有する遺伝子、暗号化された蛋白質、変異体株の表現型特徴及び標識遺伝子のプロモータ活性のような情報があるダイタベースに関する。

Description

本発明はT-DNA挿入変異を利用した稲器官優先遺伝子同定方法及び前記方法で同定された遺伝子に関し、より詳しくは異種のマーカー遺伝子が器官特異的に発現されるプロモータの下部に挿入された稲株と、前記挿入変異株で確認された天然型遺伝子と、これらによって暗号化されたポリペプチドに関するものである。
最近、植物遺伝子の機能を明らかにするための戦略らである開発されている。戦略開発は大部分変異体同定及び地図を根幹にした遺伝子分離のような遺伝学的接近に基づいている（reviewed in Martin，1998）。トランスポゾン挿入による遺伝子不活性化は、多様な植物種の機能研究に利用されている。アラビドプシスではトランスファDNA（T-DNA）を突然変異源として使用し標識遺伝子を研究した（Babiychuk外, 1997, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 12722-12727; Feldmann, 1991, Plant Jour. 1:71-82; and Krysan外, 1999, Plant Cell 11:2283-2290; the disclosures of which are hereby incorporated by reference in their entireties）。T-DNA挿入は無作為的に発生し、挿入された遺伝子は複数継代を通じて安定化される（reviewed in Azpiroz-Leehan and Feldmann, 1997, Trends Genet. 13:152-156 the disclosure of which is hereby incorporated by reference in its entirety ）。
挿入変異は公知遺伝子にT-DNAまたはトランスポゾン挿入を検索し、挿入体のフランキング序列を発見するための多様な戦略開発に有用な機能的分析法である（Cooley外, 1996, Mol. Gen. Genet. 152:184-194; Couteau外, 1999, Plant Cell 11:1623-1634; Frey外, 1998, Plant Jour.13:717-721; Koes外, 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:8149-8153; Krysan外, 1999, supra; Liu and Whittier, 1995, Genomics, 25, 674-681, the disclosures of which are hereby incorporated by reference in their entireties）。挿入因子に隣接したPCR-増幅切片の序列を分析し、アラビドプシスのフランキング序列データベースを構築した（Parinov外, 1999, Plant Cell 11:2263-2270; Tissier外, 1999, Plant Cell 11:1841-1852, the disclosures of which are hereby incorporated by reference in their entireties）。
リポーター遺伝子は挿入因子として機能性遺伝子内挿入体同定に使用される（Campisi外, 1999, Plant Jour. 17:699-707; Kertbundit外, 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:5212-5216; Kertbundit外, 1998, Plant Mol. Biol. 36:205-217; Sundaresan外, 1995, Genes Dev. 9:1797-1810; Topping外, 1991, Development 112:1009-1019, the disclosures of which are hereby incorporated by reference in their entireties）。エンハンサートラップは弱い最少プロモータにリポーター遺伝子が融合された形態に含み、遺伝子トラップはリポーター遺伝子に融合された複数スプライシング部位を含んでいる。GUS遺伝子は前記遺伝子産物の検出正確性及びその酵素活性でN-末端翻訳融合体に対する耐性によって、リポーター遺伝子として非常に頻繁に使用される（Jefferson外, 1987, EMBO J. 6:3901-3907, the disclosure of which is hereby incorporated by reference in its entirety ）。
稲は比較的に遺伝体の大きさが小さく、植物形質転換に効率的で、物理的地図が構築されているだけでなく、EST（expressed sequence tag）の大規模分析、国際的なゲノム分析プロジェクト及び経済的重要性によって、穀物植物種研究のモデルとして提供される。したがって、挿入変異体株開発は稲の機能遺伝体研究に非常に有用である。
稲の形質転換方法は公知文献の特許文献１と特許文献２に記載されている。また、その他の単子葉植物の形質転換方法は、例えば、特許文献３及び特許文献４に記載されている。
欧州特許第EP０５３９５６３号明細書 米国特許第６，２１５，０５１号明細書 米国特許第６，０３７，５２２号明細書 米国特許第５，５９１，６１６号明細書
そこで、本発明は、このような問題に鑑みてなされたもので、その目的とするところは、稲の器官-優先的（または特異的）に発現される遺伝子を同定する方法を提供することにある。
また、本発明は稲で器官-優先的に発現される遺伝子を提供することを目的とする。
また、本発明は稲で器官-優先的に発現される蛋白質を提供することを目的とする。
また、本発明は稲の各遺伝子発現が破壊された稲変異体プールを提供することを目的とする。
また、本発明は稲のT-DNA挿入変異株を複数提供することを目的とする。
上記課題を解決するために、本発明は、序列番号１８〜３４及び序列番号１８〜３４に相補的なヌクレオチド序列からなる群より選択された１種のヌクレオチド序列、または前記序列の少なくとも１０，１５，２０，２５，３０，３５，４０，５０，７５，１００，１５０，２００，３００，４００，５００，７５０，１０００，１２５０または１５００以上の連続ヌクレオチドを含む切片を含む分離または精製された核酸を提供する。また、本発明は序列番号１８〜３４及び序列番号１８〜３４に相補的なヌクレオチド序列からなる群より選択された１種のヌクレオチド序列、または前記序列の少なくとも１０，１５，２０，２５，３０，３５，４０，５０，７５，１００，１５０，２００，３００，４００，５００，７５０，１０００，１２５０または１５００以上の連続ヌクレオチドを含む切片と、少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％または９７％以上の相同性を有する１種のヌクレオチド序列を含む分離または精製された核酸を提供する。
また、本発明は序列番号３５〜５１及び序列番号３５〜５１に相補的なヌクレオチド序列からなる群より選択された１種のヌクレオチド序列、または序列の少なくとも１０，１５，２０，２５，３０，３５，４０，５０，７５，１００，１５０，２００，３００，４００，５００，７５０，１０００，１２５０または１５００以上の連続ヌクレオチドを含む切片を含む分離または精製された核酸に関する。また、本発明は序列番号３５〜５１及び序列番号３５〜５１に相補的なヌクレオチド序列からなる群より選択された１種のヌクレオチド序列、または前記序列の少なくとも１０，１５，２０，２５，３０，３５，４０，５０，７５，１００，１５０，２００，３００，４００，５００，７５０，１０００，１２５０または１５００以上の連続ヌクレオチドを含む切片と、少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％または９７％以上の相同性を有する１種のヌクレオチド序列を含む分離または精製された核酸を提供する。
また、本発明は序列番号５２〜６８からなる群より選択された１種のアミノ酸序列、または前記序列の少なくとも５，１０，１５，２０，２５，３０，３５，４０，５０，７５，１００，２００，４００，６００，８００または１０００以上の連続アミノ酸を含む切片を含む１種のポリペプチドを暗号化する分離または精製された核酸を提供する。また、本発明は序列番号５２〜６８からなる群より選択された１種のアミノ酸序列、または前記序列の少なくとも５，１０，１５，２０，２５，３０，３５，４０，５０，７５，１００，２００，４００，６００，８００または１０００以上の連続アミノ酸を含む切片と、少なくとも２５％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはor９９％以上のアミノ酸相同性を有する１種のポリペプチドを暗号化する分離または精製された核酸を提供する。
また、本発明は序列番号５２〜６８からなる群より選択された１種のアミノ酸序列、または前記序列の少なくとも５，１０，１５，２０，２５，３０，３５，４０，５０，７５，１００，２００，４００，６００，８００または１０００以上の連続アミノ酸を含む切片を含む分離または精製されたポリペプチドを提供する。また、本発明は序列番号５２〜６８からなる群より選択された１種のアミノ酸序列、または前記序列の少なくとも５，１０，１５，２０，２５，３０，３５，４０，５０，７５，１００，２００，４００，６００，８００または１０００以上の連続アミノ酸を含む切片と、少なくとも２５％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９５％または９９％以上のアミノ酸相同性（デフォルト媒介変数を有するBLASTP、BLASTXまたはTBLASTNで測定）を有する分離または精製されたポリペプチドを提供する。
また、本発明は序列番号５２〜６８からなる群より選択される１種のアミノ酸序列を含むポリペプチドを暗号化するヌクレオチド序列を含み、及び前記ヌクレオチド序列はプロモータに作動可能に連結されたものである再組合核酸を提供する。
また、本発明はゲルミン-類似蛋白質、代替オキシダーゼ（AOX1a）蛋白質、XA２１-類似蛋白質キナーゼ遺伝子、受容体-類似蛋白質キナーゼ、メチルマロネートセミ-アルデヒドデヒドロゲナーゼ（MMSDH１）、RNA-結合蛋白質LAH１相同体、液胞ATP合成酵素サブユニットC、ケイ皮酸４-ヒドロキシラーゼ、H-蛋白質プロモータ結合因子-２a、フラップエンドヌクレアーゼ（FEN-１）、熱衝撃蛋白質Hsp70、アンモニウム輸送体、ATP-依存性RNAヘリカーゼ、グルコース-６-ホスフェート／ホスフェート輸送体、RNAメチル基転移酵素、アクチンデポリマライジング因子５及び、ベータ-グルコシダーゼからなる群より選択された遺伝子が破壊された、遺伝学的に変形された稲植物を提供する。
また、本発明は序列番号１８〜３４からなる群より選択された１種のヌクレオチド序列を含む遺伝子が破壊された、遺伝学的に変形された稲植物を提供する。
また、本発明は序列番号５２〜６８からなる群より選択された１種のアミノ酸序列を含むポリペプチドを暗号化する遺伝子が破壊された、遺伝学的に変形された稲植物を提供する。より具体的には本発明は、１b-１１５-２２、１b-１６４-４３、１b-１９２-４０，１b-２０７-２７、１b-１３８-０７、１d-０５９-１２、１c-０８７-４０，１c-０１７-１４、１c-０３８-５６、１c-０４１-４７、１c-０６４-２０，１c-１０９-３５，１c-１０９-５１、１c-０５６-０７、１c-１００-３２、１c-１４２-２７、及び１c-１４０-０４からなる群より選択された、遺伝学的に変形された稲植物を提供する。また、本発明は序列番号５２〜６８からなる群より選択された１種のアミノ酸序列を含むポリペプチドが過発現または未発現された、遺伝工学的に変形された稲植物を提供する。
本発明は序列番号１８〜３４からなる群より選択された１種の遺伝子が破壊された稲植物を収得し、前記稲植物を、同定された好ましい特性を持つ植物が許容される条件に露出させることを含む特性を有する稲植物検索方法を提供する。前記同定された好ましい特性は、光合成力変異、生物学的ストレスに対する反応変異、遠隔作用、無生物学的ストレスに対する反応変異、形態学的変異、穀物収率変異、穀物内栄養物含量変異、成長速度変異、二次代謝産物代謝経路変異、殺虫剤抵抗性変異、穀物模様及び味のような穀物の特性変異、調理品質、収穫物品質変異、最適成長温度変異、除草剤抵抗性変異、開花時期変異、種子充填物特性変異、ホルモン生合成／分解経路変異またはホルモン反応変異からなる群より選択することができる。
また、本発明は植物細胞を序列番号５２〜６８からなる群より選択された１種のアミノ酸序列を含む蛋白質の発現または活性が、天然型植物に比べて増加または減少する核酸序列に接触させて形質転換植物細胞を収得し、前記形質転換植物細胞から植物を生産し、及び前記蛋白質を発現する植物を選別することを含む、天然型に比べて変異された表現型を有する遺伝学的に変形された植物の生産方法を提供する。前記接触は物理的な手段または化学的手段によるものであっても良い。具体的に、植物細胞は原形質体、生殖細胞、生産細胞または全植物で再生される細胞であっても良い。具体的に、核酸序列は構成性プロモータ、組織特異的プロモータ、器官特異的プロモータ、発生学的特異プロモータまたは誘導性プロモータに連結することができ、前記プロモータは内因性または異種のものであっても良い。具体的には、前記アミノ酸は序列番号５２〜６８からなる群より選択されたアミノ酸序列を含む１種のポリペプチドと、少なくとも９０％以上、さらに好ましくは９５％以上のアミノ酸相同性を有するものであっても良い。具体的には、前記蛋白質を暗号化する核酸序列は序列番号１８〜３４及び序列番号３５〜５１からなる群より選択される。
本発明は序列番号５２〜６８からなる群より選択された１種のアミノ酸序列を、デフォルト媒介変数を有するBLASTP、BLASTXまたはTBLASTNで評価し、少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％以上のアミノ酸相同性を有するポリペプチドを暗号化する核酸序列が導入された、遺伝学的に変形された種子を提供する。
本発明は序列番号５２〜６８からなる群より選択された１種のアミノ酸序列に対する抗体を提供する。
本発明は序列番号１８〜３４からなる群より選択された１種の序列の転写させるプロモータを収得し、前記プロモータに遺伝子を作動可能に連結させ、及び前記遺伝子が作動可能に連結された前記プロモータを稲植物に導入することを含む稲の特定組織または組織における遺伝子発現方法を提供する。
本発明は序列番号１８〜３４及び序列番号１８〜３４に相補的なヌクレオチド序列からなる群より選択された１種のヌクレオチド序列、または前記序列の少なくとも１０，１５，２０，２５，３０，３５，４０，５０，７５，１００，１５０，２００，３００，４００，５００，７５０，１０００，１２５０または１５００以上の連続ヌクレオチドを含む切片を含むヌクレオチド序列が保存されたコンピュータ認識可能な媒体を提供する。前記コンピュータ認識可能な媒体はまた、核酸序列が転写される組織または器官に対する情報を含むことができる。
本発明は序列番号３５〜５１及び序列番号３５〜５１に相補的なヌクレオチド序列からなる群より選択された１種のヌクレオチド序列を、または前記序列の少なくとも１０，１５，２０，２５，３０，３５，４０，５０，７５，１００，１５０，２００，３００，４００，５００，７５０，１０００，１２５０または１５００以上の連続ヌクレオチドを含む切片を含むヌクレオチド序列が保存されたコンピュータ認識可能な媒体を提供する。前記コンピュータ認識可能な媒体はまた、暗号化序列であるmRNAが発現される組織または器官に対する情報をさらに含むことができる。
本発明は序列番号５２〜６８、序列番号５２〜６８に相補的なヌクレオチド序列からなる群より選択された１種のアミノ酸序列、または前記序列の少なくとも５，１０，１５，２０，２５，３０，３５，４０，５０，７５，１００，２００，４００，６００，８００または１０００以上の連続アミノ酸を含む切片を含むアミノ酸序列が保存されたコンピュータ認識可能な媒体を提供する。前記コンピュータ認識可能な媒体はまた、アミノ酸序列が存在する組織または器官に対する情報をさらに含むことができる
（序列目録の説明）
序列番号１〜１７:各々表示した稲細胞株で、挿入されたT-DNA序列と稲遺伝子序列が連結された連結部を示す。稲遺伝子の断片はT-DNA断片と共に存在する。T-DNA断片を含むヌクレオチドの位置は序列目録“多様な特徴”項目に示している。
序列番号１８〜３４:各々表示した稲細胞株で、T-DNAが挿入された遺伝子のゲノムDNA序列を示している。
序列番号３５〜５１:各々表示した稲細胞株で、T-DNA挿入で発現変異された蛋白質のアミノ酸序列を暗号化する核酸を示している。
序列番号５２〜６８:各々表示した稲細胞株で、T-DNA挿入で発現が変異された蛋白質のアミノ酸序列を示している。
序列番号６９:バイナリーベクターであるpGA２７０７から由来したT-DNA挿入体のDNA序列を示している。
序列番号７０〜８３:実施例１乃至１４で記載したPCRプライマーとして使用される合成オリゴヌクレオチド序列を示している。
本発明は稲の各遺伝子がT-DNA／GUS挿入で変異された株を提供することによって、稲器官特異的発現遺伝子及びこれから暗号化される蛋白質を同定することができるだけでなく、各々の機能を把握することができる。
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明は組織優先的様相で発現される稲遺伝子、前記遺伝子内にT-DNA挿入体を含む稲細胞株及び前記細胞株及び遺伝子に対する情報が含まれたデータベースを提供する。前記遺伝子はT-DNAによる遺伝子トラップシステムで標識された稲細胞株の巨大個体群をスクリーニングして検索した。
ゲノムDNAゲル-ブロットとPCR分析において、約６５％の個体はT-DNA挿入体を１複写本以上含むと確認された。ハイグロマイシン抵抗性テストで、形質転換植物は平均１．４lociのT-DNAを含むと確認された。したがって、約２５，７００標識物が生産されると推算することができる。挿入に使用したバイナリーベクターはプロモータ含有しないベータ-グルコニダーゼ（GUS）リポーター遺伝子と、イントロン及び複数個のスプライシング供与体及び受容体を右側ボーダーのすぐ隣りに含む。したがって、このような遺伝子トラップベクターはGUSとT-DNAによって標識された内在性遺伝子間の遺伝子融合を検出するのに有用である。組織化学的GUS分析を５３５３株の葉と根、７０２６株の成体花と、１９４８株の発生中の種子を対象として実施した。その結果、実験対象器官の１．６乃至２．１％はGUS陽性を示し、これらのGUS発現パターンは器官または組織特異的であるか、植物全体に偏在されていた。T-DNA標識株の巨大群は多様な遺伝子の挿入変異体を同定し、新たな稲遺伝子を発見するのに有用である。
稲ゲノム飽和に要求されるT-DNA標識株の数は、クリサン（Krysan外, 1999, supra）が提案した式を利用して推算することができ、次の３つの因子が数を決める。第一に、稲遺伝子の平均大きさはDDBJ／EMBL／GenBankデータベース（AB０２３４８２、AB０２６２９５，AP０００３９１、AP０００３９９、AP０００４９２、AP０００５５９、AP０００６１６、AP１５７９０３、AP０００８１５，AP０００８１６、AP０００８３６、AP０００８３７）で公開された１７６６７５４ bpのゲノム序列から導出することができる。前記報告された序列には３３１個の推定遺伝子があり、これは機能的にまたはエキソン予測アルゴリズムによって同定される。稲ゲノムDNAの平均大きさはイントロンを含んで開始コードンから停止コードンまで２．６kbである。開始コードンと停止コードンの側面に位置した上部及び下部序列は含まなかったので、稲遺伝子の平均長さは少なくとも３．０kb以上である。第二に、形質転換稲個体群に分布されたT-DNA lociの平均数は１．４である。第三に、稲の半数体ゲノムの大きさは４．３×１０８bpである（Arumuganathan and Earle, 1991, Plant Mol. Biol. Rep. 9:208-218）。T-DNAが与えられた遺伝子内に位置する可能性を９９％にすれば、ほぼ６６００００挿入体または４７１０００標識株が必要である。つまり、全ての遺伝子が変異された形質転換稲個体群を製造するのは難しいことである。可能性が低くなるほど、形質転換植物の数は幾何級数的に減少する（Krysan外, 1999, Plant Cell 11:2283-2290，本明細書に参照として言及される）。本発明に記載された標識株は３kbの遺伝子内にT-DNA挿入体を捜す可能性は２０％に推算することができる。
GUS活性化頻度は多様な器官によって１．６乃至２．１％の範囲を有する。GUS活性は複数株で１種以上の器官で確認されるので、T-DNA標識された細胞株におけるGUS活性化頻度は各器官における全頻度より低い。約７％の形質転換されたカリでGUS染色が観察された。GUS活性は特定環境条件または成長物質のような化合物に誘導した後、測定したものでないので、全GUS標識効率は実際より高い。報告された１７６６７５bpゲノム序列分析はゲノムDNA５０％以上理由電子内にあることをを示した。挿入が両方向に行われた場合を考慮する時、最大GUS標識効率は全個体群に２５％でなければならない。
特異的なGUS染色様相を示す挿入株は、植物発生で空間及び時間的に調節される遺伝子を容易に同定することができる。例えば、外側根発生に重要な役割を果たすかもしれないアラビドプシスLRP１遺伝子は、標識植物でのプロモータ欠乏性GUSの発現で同定した（Smith and Fedoroff, 1995, Plant Cell, 7:735-745）。アラビドプシスPROLIFERA遺伝子は酵母のMCM２-３-５系遺伝子と関連があるもので、遺伝子トラップトランスポゾン変異を通じてまたクロニングされた（Springer外, 1995, Science, 268:877-880）。
本発明の重要な側面は、T-DNA／GUS挿入変異体に形質転換された変異体種子を収集（例、ライブラリー）し、直接スクリーンのような他の目的として繰り返して利用することができる。このような観点で、T２種子をT１植物から収集し、索引（例、バーコード）を付けた保存容器に保存し、電子データベースに記録された植物同定番号で種子を同定する。前記種子ライブラリーは種子を長期間使用することができ、種子からT２植物再生が可能な条件で保管する。前記“長期間”は少なくとも１年以上であり、好ましくは少なくとも２年以上、さらに好ましくは少なくとも５年以上、最も好ましくは１０年以上である。種子を長期間保管するための通常の条件は約４℃の温度及び低湿度である。ライブラリーから各時期別種子を分析し、例えばスクリーン、形質転換植物で観察される新たな変異特性はデータベースに記録して植物同定番号と連結させる。
好ましい実施例において、索引されたライブラリーの種子が植物遺伝体の全ての遺伝子に対する変異（例、飽和された遺伝体）、好ましくは９０％以上の遺伝子に対する変異、さらに好ましくは９５％以上、最も好ましくは９９％以上の遺伝子に対する変異を総括的に示すライブラリーでT２種子生産を繰り返す。飽和されたゲノムを総括する種子収集物は、直接スクリーンに利用してゲノム各遺伝子が特別な変異体特性に寄与することを評価可能にする。
稲のゲノム序列分析は近い未来に完了すると予測される。また、機能が確認されていない遺伝子が複数個確認されるとも予測されている。遺伝子機能に対する情報を把握するための最も効果的な方法のうちの一つは、機能喪失変異体を製造して変異体の表現型を研究することである。巨大変異植物群を活用することができれば、目的遺伝子内にある挿入体は挿入要素及び目的遺伝子から由来したオリゴヌクレオチドプライマーを使用したPCRで検出することができる（Couteau外, 1999, supra; Krysan外, 1999, supra; Sato外, 1999, EMBO J.18:992-1002;参照文献の内容は本発明に併合される）。目的とした変異体の同定はクリサンなど（Krysan外, 1999, supra ）が提案した初-収穫戦略を利用して効果的に行うことができる。特定T-DNA挿入体及び全鋳型DNA量を検出するための敏感性を基礎とした時、アラビドプシスで最大利用可能なプールの大きさは２３５０株である。本発明者らは稲の標識株のDNAプールの上限大きさを決めるための実験を実施した。
［稲細胞株の特徴分析］
幾世帯にわたる変異特徴を確認するために、形質転換された稲細胞株を一般的に分析した。記載された“TO”という形質転換された植物組織の世帯を示す。“T１”はTO植物の種子から由来した植物世帯で、TO植物で選別剤に対する遺伝子を含む形質転換植物を選別剤（例、抗生剤または除草剤）で一次選別したものである。“T２”は形質転換されたもので、既に確認されたT１植物花の自家受精によって発生した世帯を意味する。実験実施において、複数のTO植物または植物細胞にT-DNA／GUS挿入変異体を無作為的にゲノム挿入させる方法で形質転換させ、挿入切片によって暗号化されるマーカー遺伝子を発現させた。植物細胞は、形質転換されていない植物細胞に毒性を示す選別剤が適正量存在する条件で成長させて選別し、成体植物に再生させた。
一実施例において、T１植物は標準値によって、例えば、一ケ月に二回ずつ綿密に観察し、観察結果はノートブックに入力し、及び／または観察結果及び／または測定結果は好ましくはコンピュータデータベースに記録した。T１植物から全体または各々の葉組織を収集することができた。観察結果は全体及び関心のある個別植物はデジタルカメラを利用して写真で記録できる。変異体株の特徴同定はT２世帯で実施することができ、これは下記でさらに説明する。天然型遺伝子発現が変形された植物分画は肉眼で検定可能な変異的特徴を示す。本発明の実験で、T２種子は選別されたT１植物から収集し、種子を植えてT２植物を生成させる。T２から全体または各々の葉組織を収得することができ、追加分析を実施することもできる。一般に、変異特徴を示したT２植物は種子を生産するまで生長させ、T３種子を採集してT３植物を生産する。その後、T２植物と同一な過程を実施する。
本発明はT-DNA／GUSの挿入変異によって変形された遺伝子を有する稲株を生産する方法に関する。挿入体でGUS部分はプロモータを含まないために活性を有する遺伝子に挿入される場合にのみ発現される。このような方法で、多様な稲遺伝子の器官優先的発現を決めることができる。本発明はまた、T-DNA／GUS挿入変異方法によって確認された器官-優先的遺伝子と、これらから暗号化される蛋白質に関する。T３植物を観察して記録し、組織を採集した。このようなサイクルは複数回繰り返すことができる。本発明はまた、稲株に関する情報、つまり、挿入体を有する遺伝子、暗号化された蛋白質、変異株の特徴的表現型及び標識された遺伝子のプロモータ活性が記載されたデータベースに関する。
本発明の一実施例は序列番号１８乃至３４で記載したゲノム序列のうちの１種または序列番号３５乃至５１に記載したコーディング序列のうちの１種が破壊された稲株に関する。序列番号１８乃至３４のゲノム序列または序列番号３５乃至５１のコーディング序列はT-DNA挿入や他の好ましい方法によって破壊できる。
本発明の他の実施例は序列番号５２乃至６８で記載されたポリペプチドのうちの１種が破壊された稲株に関する。序列番号５２乃至６８のポリペプチドの発現はT-DNA挿入や他の好ましい方法によって破壊できる。
本発明の他の実施例は１b-１１５-２２、１b-１６４-４３、１b-１９２-４０，１b-２０７-２７、１b-１３８-０７、１d-０５９-１２、１c-０８７-４０，１c-０１７-１４、１c-０３８-５６、１c-０４１-４７、１c-０６４-２０，１c-１０９-３５，１c-１０９-５１、１c-０５６-０７、１c-１００-３２、１c-１４２-２７、及び１c-１４０-０４からなる群より選択された稲株である。
本発明は形質転換された稲株の変異特徴を評価し、特定化するための方法を提供する。表現型を評価する方法の例としては、形態学、生化学的分析、除草剤耐性実験、除草剤標的同定、真菌抵抗性実験、細菌抵抗性実験、昆虫抵抗性実験及び乾燥増加、塩、温度またはその他の環境ストレスに対する耐性検索があるが、これらに限られるわけではない。前記のように、植物は標準に基づいて肉眼で綿密に、たとえば毎月２回ずつ形態学的特徴を観察してノートブックに入力したり、または／及び手作動可能な電子データ入力機器を利用して記録する。全植物または植物組織は生化学的組成変異と、病原性、ストレス及び抗生剤抵抗性を分析することができる。本発明は変異特徴の分析からデータを導出し、処理（管理）する方法を提供する。変異特徴の分析結果は電子データベースに入力し、植物または実験植物群の特定同定番号と連結させる。
本発明の稲株は好ましい組織または器官で転写するプロモータを収得し、好ましい組織または器官で好ましい活性を有するプロモータを同定し（GUS発現を定量化することによって）、好ましい特性を有する植物を同定し、及び特定遺伝子で機能喪失変異効果を決めるのに有用であり、例えば、序列番号１８乃至３４と序列番号３５乃至５１の序列によって暗号化された蛋白質が関与する生化学的代謝経路を明らかにするのに有用である。例えば、本発明の稲株は殺虫剤抵抗性を有する細胞株を同定したりまたは抵抗性スクリーニングに使用することができる。
本発明の稲細胞株は好ましい特性、例えば光合成力変異、生物学的ストレスに対する反応変異、遠隔作用、無生物学的ストレスに対する反応変異、形態学的変異、穀物収率変異、穀物内栄養物含量変異、成長速度変異、二次代謝産物代謝経路変異、殺虫剤抵抗性変異、穀物模様及び味のような穀物の特性変異、調理品質、収穫物品質変異、最適成長温度変異、除草剤抵抗性変異、開花時期変異、種子充填物特性変異、ホルモン生合成／分解経路変異またはホルモン反応変異を選別する検索過程の基礎として使用しても良い。
前記株は２次変異体（例、機能獲得変異体）の開示部としてまた使用して過剰発現、発現抑制または発現変形に関係された遺伝子を稲またはその他の植物種（例、穀物植物、薬学的関心植物など）で発見したり、または植物成長で多様な側面を調節する遺伝子（例、転写因子、信号物質及びこれらの作用位置を決めること）を発見することができる。
T-DNA／GUS挿入体を含む変異株をスクリーニングして適した特徴を有する細胞株をスクリーニングすることができる。適した特徴としては、これに限定されたしないが、光合成力変異、生物学的ストレス（例、昆虫、線虫、真菌、細菌、ウイルス）に対する反応変異、雑草植物種からの保護（例、遠隔作用）、無生物学的ストレス（寒さ、熱、塩または低酸素）に対する反応変異、形態学的変異、穀物収率変異、穀物内栄養物含量変異、成長速度変異、二次代謝産物代謝経路変異、殺虫剤抵抗性変異、穀物模様及び味のような穀物の特性変異、調理品質、収穫物品質変異（例、早期収穫または保存性向上）、最適成長温度変異、除草剤抵抗性変異（穀物の雑草混入は窮極的に稲穀物の消失比率を増加させる）、開花時期変異、種子充填物特性変異、ホルモン生合成／分解経路変異またはホルモン反応（例、ABA、SAなど）変異がある。
［スクリーニング方法の種類］
（形態的特徴を利用した検索）
形質転換稲株は形態学的変異特徴のために検索できる。形態的特徴は正常な成長条件で拡大機を使用したり、使用せずに肉眼観察で観察できる。形態的特徴の例としては、植物の大きさ、器官の大きさ、葉数、葉の色素形成、葉形状、種子の大きさ、種子形態、葉または花のパターンあるいは分布、花の数または整列、開花時期（早くまたは遅く）、小さいまたは大きい伸張、幹節間の距離、根の重量及び根の発生的特徴が含まれる。
（直接検索）
本発明の他の目的で、直接検索は形質転換稲細胞株の変異体特徴を分析するために使用される。“直接検索”には特定装備、分析機及び／または単一の変異特徴または変異特徴群を同定するための条件が適用される。直接検索の例としては、植物組織の生化学的組成及び病原菌、除草剤及びストレスに対する抵抗性の変化を分析することである。
（生化学的分析）
本発明の形質転換株は生化学的または物質代謝特性上変異に対して検索することができる。興味深い物質代謝特性はビタミン、ミネラル、オイル、元素、アミノ酸、炭水化物、脂質、窒素ベース、イソプレノイド、フェニルプロパノイドまたはアルカロイドの濃度変化を起こす葉、種子、果実及び根、花及び苗木の生化学的組成変化を含む。
物質代謝特性はこれに限定されないが、ビタミン、ミネラル、オイル、元素、アミノ酸、炭水化物、ポリマー、脂質、ワックス、窒素ベース、イソプレノイド、フェニルプロパノイドまたはアルカロイドの濃度変化を起こす無性組織（例、葉、幹、根）及び生殖組織（例、種子、果実及び花）の生化学的組成変異を含む。興味深い物質代謝特徴はまた、多様な代謝産物群（例、高段白質、低炭水化物）の相対的豊度と、収穫指数、生重量、乾燥中比率、種子重量及び種子密度のような量的生理記述子を含む。
多様な技術はこのような物質代謝（例、国際特許出願番号PCT／US０１／１３８８６）を分析するのに使用することができる。適切な通常技術はこれに限定されないが、酵素学的方法、クロマトグラフィ（高性能液体クロマトグラフィHPLC、ガス-クロマトグラフィGC、薄膜クロマトグラフィ）、電気泳動（例、毛細管、PAGE、活性ゲル）、分光器（例、UV-visible、質量分光器MS、赤外線及び近-赤外線IR／NIR、原子吸光AA、核定規気共鳴NMR）及びハイブリッド方法（例、HPLC-MS、GC-MS、CE-MS）を含む。
商業的に利用可能な化合物分析ソフトウェアは化合物データ蓄積及び解釈に使用することができ、前記から由来した結果は物質代謝変化とその他に観察された表現型間の相互作用を確認することができるデータベースに記載することができる。このような化合物分析ソフトウェアパッケージの一例として、ウォータースミレニアムソフトウェアがあり（Waters Corp., Millford, MA）、脂質成分分析法としてはブロウスなどの方法がある（(Biochem. J.235:25-3l, 1986,本発明の内容に含まれる)。タウンボドヒッタム及び同僚（Food Chemistry 63,4:577-584, 1998、本発明の内容に含まれる）は果物及び野菜からカロチノイドの抽出及び分析方法を最適化した。その他の研究者は植物組織から多様な色素成分を同時分析できる分析条件を報告したことがある（Barua and Olsen, Journal of Chromatography 707:69-79, 1998; Siefermann-Hanns, J. of Chromatography 448:411-416. 1988、本発明の内容に含まれる）。一般的な種子成分の分析は複数の参考文献に記載されている（e.g. Approved Methods of the American Association of Cereal Chemists 10th Edition, 2000, ISBN 1-891127-12-8. American Assoc. of Cereal Chem.,本発明の内容に含まれる）。
（除草剤耐性標的物）
雑草防除は穀物生産を最適化するという点で経済的に重要である。除草剤抵抗性変異を同定するために、直接スクリーニングで除草剤の遺伝子標的（新規除草剤物質の開発に有用な）と除草剤に対して向上した抵抗性（耐性）を有する植物を生産するように変異可能な植物遺伝子を同定することができる。除草剤活性／抵抗性分析は、ペトリ皿分析、土壌分析及び全植物分析を含む。除草剤活性を示す表示子としては種子発芽阻害、根発育、土壌から出ない非正常的な苗木開発、主根及び外側根阻害、遅い毛状体、黄色（白化性）または褐色（壊死性）の新たな葉組織、色素不足葉組織、末端分裂組織部の奇形または壊死、幹ねじれ及び上偏生長、下部に向かった初期葉柄、非正常的な成長反応、例えば非正常的な葉、花または種子形成及び粗いまたはもろい葉がある。
除草剤標的としてはこれに限定されないが、野生燕麦、緑色エノコログサ、ハコベ、ヤエムグラ、箒草、ラムズクォーターズ、カノラ、広葉トウダイグサ、カナダアザミ、セイヨウヒルガオ及びロシアンヤグルマギク、メヒシバ、オヒシバ、スズメノカタビラ、ハコベ、タデ、野生蕎麦、ホトケノザ、オナモミ、コムスピードウェル、アルファルファ、ツメクサ、タンポポ、ギシギシ、チドメグサ、カタバニ、カッコウソウ、ヒナギク、ナズナ、アザミ、ヤグルマギク、ソラマメ、バイオレッド、ヤロウアンドワイルドマスタードがある。
（植物病原菌抵抗性実験）
植物病原菌の感染防除は植物の病原菌感染が種子、葉及び花の生産を阻害し、また、収穫物の品質と量を減少させる原因として作用するという点で経済的に非常に重要である。大部分の穀物は農業用抗真菌剤、抗細菌剤または／及び殺虫剤で処理される。しかし、病原菌による感染の損害は農業産業の輸入減少をもたらす。さらに、感染または侵入などを防除するための目的として使用される複数の製剤は植物または／及び環境に副作用を起こす。向上した感染抵抗性植物は化学的抗真菌、抗細菌及び／または殺虫剤の処理を減少または省略させることができる。植物で昆虫抵抗性位置を同定するために、引用文献（Yencho GC外, Annu Rev Entomol., 45:393-422, 2000, 本発明の内容に併合される。）を参照することができる。
（真菌抵抗性）
形質転換植物株は向上した真菌抵抗性を検索するためにスクリーニングすることができる。真菌抵抗性に対する例示的検索として下記真菌性病原菌による感染抵抗性を測定することがある:アルブゴカンジダ、アルタナリアブラシシコラ、ボツリチスシネレア、エリシフェシコラセアルム、フェロノスポラパラシチカ、フザリウムオキシスポルム、プラスモジオフォラブラシカエ、リゾクトニアソラニ、ピチウム属、コレクトトリクムココド、及びピトプトラインフェスタンス。多様な真菌によって攻撃を受けやすい真菌としてはスクレロチニア、アスペルギラス、ペニシリウム、ウスチラゴ及びチレチア種があるが、これらに限定されない。
（細菌抵抗性）
本発明の形質転換された稲細胞株は向上された細菌抵抗性に対して検索できる。細菌抵抗性に対する検索の例としては下記細菌性病原菌の感染に対する抵抗性を検査することである:アグロバクテリウムチュメファシエンス（根頭癌腫病）;エルウィニアトラチェイフィラ（キュウリ胴枯病）；エルウィニアｓテワルチ（トウモロコシ胴枯病）;サントモナスファセオリ（一般豆胴枯病）;エルウィニアアミロボラ（火傷病）;エルウィニアカロトボラ（野菜軟腐病）、シュドモナスシリンガエ（潰よう病）;ペラゴニウム属 、シュドモナスシチョリ（黒葉斑点）;サントモナスフラガリアエ（イチゴ角斑細菌病）;シュドモナスシリンガエ（キュウリ、小さいキュウリ、マスクメロン、カボチャ、スカッシュ、ペポカボチャ及び西瓜での角斑細菌病）;及びシュドモナスモルスプルノルム（石果の潰よう病）;サントモナスカムペストリス（桃、ネクタリン、プルーン、スモモ、あんず、サクランボまたはアーモンドの細菌性斑点、細菌性発育阻止、ショットホールまたは黒色斑点）。植物は簡便症状測定（抵抗性対敏感性表現型）によって評価し、各個別植物の結果、例えばデジタルイメージを記録した。
（ウイルス抵抗性）
本発明の形質転換された稲細胞株は向上したウイルス抵抗性に対して検索できる。ウイルス病原菌は農業に深刻な問題である。ウイルス抵抗性に対する接近は標的、感染確立、ウイルス増殖、及び／またはウイルス移動を含む。ウイルス抵抗性に対するスクリーニング方法としては稲ウイルス攻撃に対する敏感性を測定することがある。
（昆虫／線虫抵抗性）
一般に、殆どの穀物に害虫防除に効果的な化学農薬及び殺虫剤を処理している。しかし、昆虫侵入による損失は依然として問題点として残っており、農業産業に輸入減少をもたらす。また、大部分の殺虫剤は値段が高く、効果的な防除のために反復的処理が要求されるだけでなく、植物または／及び環境に副作用を引き起こす。したがって、防除に使用される化合物に対して抵抗性を有したり、有する昆虫に関心を傾けなければならない。向上した昆虫抵抗性を有する植物は化学農薬のような処理を減少させたり省略することができる。
昆虫に対する抵抗性を有する植物検索の例としてはリンシ目、カメムシ目、直翅目、甲虫目、チャタテムシ目、シロアリ目、アザミウマ目及びセミ目に属する標的昆虫を分析することである。一般に、このような分析は昆虫死滅、昆虫成長及び発生を阻止して成熟を鈍化または防止し（例、摂食阻害活性）、及び／または昆虫卵のオバポジションまたは孵化防止を検出するための用途として使用される。
昆虫抵抗性検索方法の例としては、植物の他の部位、つまり、幹、葉または根を攻撃する多様な昆虫種に対する攻撃感受性を実験することである。
多くの抵抗性変異体が機能消失（劣性）であると予想されるので、形質転換植物（選別剤処理時に生存する）この相同性変異体であることが確認できるように十分に検査しなければならない。各個別的な生存植物を各々テストし、昆虫／線虫抵抗性が検出される場合、各々の植物は種子収得のために維持させた。各実験において、昆虫または線虫の変異体植物との相互作用は同一種の昆虫または線虫の天然型植物との相互作用と比較する。
（ストレス抵抗性）
形質転換された稲細胞株は向上したストレス抵抗性に対して検索できる。変異されたストレス抵抗性（例、日照り、塩、寒さ、トキシン、金属、熱またはその他の環境及び生物学的ストレス）を同定するための直接検索であって、向上したストレス抵抗性（耐性）を有する植物を生産するように変異可能な稲遺伝子を同定することができる。このような発見は広範囲な地域で稲穀物が裁培できるようにする。ストレス反応に関与する遺伝子を同定するための直接検索は、特定ストレス、つまり、水不足または高塩濃度を設定する実験室条件で実施する。
また、本発明は稲細胞株に対する情報、例えば挿入体を有する遺伝子、前記暗号化された蛋白質、前記変異株の表現型特徴及び標識遺伝子のプロモータ活性が含まれたデータベースに関する。
（稲株、遺伝子、ポリペプチド、表現型及びその他の特徴と関係ある情報を保存及び操作するためのデータベース）
核酸序列、アミノ酸序列、発現パターン、蛋白質機能、染色体位置及びその他の関連された情報は保存及び操作のためのデータベースに入力することができる。本発明が属する分野の当業者であれば、前記データはコンピュータで認識及び接続可能ないずれの形態の媒体でも保存及び操作できることが分かる。コンピュータ認識可能な媒体は定規気認識媒体、最適化された認識媒体または電気認識媒体がある。その例としては、ハードディスク、フロッピー（登録商標）ディスク、定規気テープ、CD-ROM、RMAまたはROWがあり、また、当業界に公知されたいずれの形態の媒体であっても良い。
また、データは多様なデータ処理プログラムで多様な形態に保存及び操作することができる。その例として、序列データはワード処理ファイル、つまり、マイクロソフトワードまたはワードパーフェクトに文字にまたはASCIIファイルで保存することができ、当業界に公知された多様なデータベースプログラム、つまり、DB２、SYBASEまたはORACLEを利用することができる。
序列情報及びその他の情報を含んでいるコンピュータ認識可能な媒体は個人用コンピュータ、ネットワーク、サーバーまたは本発明が属する技術分野の当業者に知られたその他のコンピュータシステムに保存することができる。コンピュータまたはその他のシステムは、好ましくは前記で記載した保存媒体と、序列データを接続して操作できる処理装置を含む。序列データを保存すれば、目的とした核酸序列を含む序列、特定機能のドメインを有する蛋白質を暗号化する序列、または目的とした特徴、例えば、発現様相、染色体内位置などを有する序列が保存された位置を操作及び検索することができる。その例として、保存された序列情報は公知の序列と比較して相同性、生物学的機能に影響を与えるモチーフまたは構造モチーフを同定することができる。
保存された核酸またはアミノ酸序列を検索または比較するための用途として使用できるプログラムは、MacPattern（EMBL）、BLAST及びBLAST２プログラムシリーズ（NCBI）、ヌクレオチド（BLASTN）及びペプチド（BLASTX）比較用基本位置整列検索道具（Altschul外, J. Mol. Biol. 215: 403 (1990)) and FASTA (Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 2444 (1988) 、本発明に併合される）がある。BLASTプログラムはその後制限された一致及び非一致基準に基づいて整列を延長する。
序列番号１８〜３４のゲノム序列、序列番号３５〜５１のcDNA序列または序列番号５２〜６８のポリペプチドコードは多様なデータ処理プログラムを通じて多様な形態に保存及び操作することができる。例えば、序列番号１８〜３４のゲノム序列、序列番号３５〜５１のcDNA序列または序列番号５２〜６８のポリペプチドコードはマイクロソフトワードまたはワードパーフェクトのようなワードプロセシングファイルで文字、またはDB２、SYBASE、またはORACLEのように本発明に属する技術分野の当業界に公知された複数のデータベースプログラムを通じてASCIIファイルで保存することができる。また、多くのコンピュータプログラム及びデータベースは序列比較、同定または引用されたされたヌクレオチドまたはポリペプチド序列の出処として使用され、序列番号１８〜３４のゲノム序列、序列番号３５〜５１のcDNA序列または序列番号５２〜６８のポリペプチドコードを比較することができる。
下記目録は本発明を限定するためのものでなく、序列番号１８〜３４のゲノム序列、序列番号３５〜５１のcDNA序列または序列番号５２〜６８のポリペプチドコードに有用なプログラム及びデータベースについての説明を提供するためのものである。前記使用されるプログラムとデータベースはこれに限定されないが、下記を含む:MACPATTERN (EMBL), DISCOVERY BASE (Molecular Applications Group), GENEMINE (Molecular Applications Group), LOOK (Molecular Applications Group), MACLOOK (Molecular Applications Group), BLAST and BLAST2 (NCBI), BLASTN and BLASTX (Altschul外, J. Mol. Biol. 215: 403 (1990)), FASTA (Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 2444 (1988)), FASTDB (Brutlag外 Comp. App. Biosci. 6:237-245, 1990), CATALYST (Molecular Simulations Inc.), CATALYST／SHAPE (Molecular Simulations Inc.), CERIUS2.DBACCESS (Molecular Simulations Inc.), HYPOGEN (Molecular Simulations Inc.), INSIGHT II, (Molecular Simulations Inc.), DISCOVER (Molecular Simulations Inc.), CHARMm (Molecular Simulations Inc.), FELIX (Molecular Simulations Inc.), DELPHI, (Molecular Simulations Inc.), QUANTEMM, (Molecular Simulations Inc.), HOMOLOGY (Molecular Simulations Inc.), MODELER (Molecular Simulations Inc.), ISIS (Molecular Simulations Inc.), Quanta／Protein Design (Molecular Simulations Inc.), WEBLAB (Molecular Simulations Inc.), WEBLAB DIVERSITY EXPLORER (Molecular Simulations Inc.), GENE EXPLORER (Molecular Simulations Inc.), SEQFOLD (Molecular Simulations Inc.), 及びEMBL／SWISSPROTEIN database。
前記プログラムを利用して検出可能なモチーフは、ロイシンジッパー、螺旋-回転-螺旋モチーフ、糖鎖形成部位、ユビキチン化部位、アルファ-螺旋、ベータシート、暗号化された蛋白質を分泌させる信号ペプチドを暗号化する信号序列、ホメオボックスのような転写調節に関する序列、酸性ストレッチ、酵素活性部位、基質結合部位及び酵素的切断部位を暗号化する序列を含む。
表現型観察／測定は核酸序列情報と共にまたは単独にコンピュータデータベースに入力して変異特徴及び／または核酸序列を根幹に情報を検索することができ、コンピュータデータベースはコンピューターネットワーク（PCT／US０１／１３８８６）と共有できる。幾多の商業的なデータベース、例えばFILEMAKER PROとオラクルデータベースは、本発明を行うための目的として提供できる。
ネットワークは本発明の他の目的において、使用者が植物記録データベースを含む関係型データベースで情報を接続及び検索し、閲覧きるように許与するための目的として使用することができる。前記ネットワークはネットワークサーバーと代表的クライアントが連結された通信経路を含む。簡単に説明すれば、単に代表的なクライアントのみ参与されるが、幾多のクライアントもやはり連結することができることは本発明が属する技術分野の当業者であれば容易に分かる。ネットワーククライアントは植物記録に対するデータベースとネットワークサーバーで提供する関連されたリソースに接続するためにネットワークを利用する。ネットワーククライアントとネットワークサーバーの間に連結された通信経路の性格は本発明の実施に重要なものではない。このような経路は私的なまたは公的な設備を利用してスイッチ式経路及び／または非スイッチ式経路に提供することができる。これ類似に、ネットワーク網の形態は重要なものではなく、階層型及びピアツーピアネットワークを含む多様な方式に提供することができる。前記ネットワークはイーサネット（登録商標）または類似モデルを利用する近距離ネットワーク（LAN）または長距離ネットワーク（WAN）を含む複数の通常のネットワークシステムのうちのいずれも可能である。前記ネットワークは標準形式（例、URL）にクライアント呼出しを媒介変数情報と共にサーバー伝達用通信経路を横断して伝送するのに適した形式にパッケージする機能性を含む。前記ネットワークサーバーはハイパーテキストトランスファープロトコル（HTTP）に適するように調節されたハイパーメディアサーバーであり得る。サーバーはハードウェアと実行ソフトウェアに必須の運営体系を含み、実行ソフトウェアは（i）使用者要請に対する反応で植物データベースの記録に接続し、及び（ii）クライアントコンピュータに情報を示すためのものである。このようなソフトウェアは、例えば運営体系で実行する関係型データベース管理体系がある。前記サーバーはまた、通常ワールドワイドウェッブサーバーとワールドワイドウェッブ応用を含む。前記ワールドワイドウェッブ応用はデータベース言語文（例、Standard Query Language（SQL）statements）生成に必須的な実行コードを含む。前記応用はまた、サーバーの多様なソフトウェアモジュールだけでなく、使用者要請によって提供されるデータベースに対する指示子及び住所を含む構成ファイルを含むことができる。クライアントコンピュータはハードウェアと、接続、閲覧及びサーバーで提供した情報との相互交流に使用される標準ウェッブブラウザーを実行する適切なソフトウェアを含む。たとえば、前記クライアントコンピュータは通常のネットワーク連結されたコンピュータ、例えば、 ネットスケープナビゲータまたはインターネットエクスプレーラーを実行するPC、 マッキントッシュまたはユニックスワークステーションであり得る。
一般的なコンピュータで確認されるハードウェアはネットワークサーバー及び／またはネットワーククライアントを実現するのに使用することができ、これは当業界に公知されたことである。前記データベースは植物記録に含まれた情報を関係書式に保存されるように整列し、配列することが好ましい。このような関係型データベースは関係対数によって定義された演算セットを支援し、行と列からなる情報で構成された表を含む。前記データベースは比較的に整列され、検索された表現型特徴は関心のある他の表現型特徴を有する植物または関心のある候補遺伝子序列を有する植物と関連することができ、また、検索されたDNA序列は関心のある表現型特徴を有する植物を結びつけることができる。
（グラフィック使用者インターフェース（GUI））
ウェッブブラウザーを通じて、使用者は複数個の窓（e.g.，HTML pages）と検索要請を構成及び伝送し、データベースから検索されたデータを選択的に羅列する機能シュートを含むグラフィック使用者インターフェースで示す。前記機能はボタン、プルダウンメニュー、スクロールバー、文字ボックスなどのように画面に表示される標準GUI素子が好ましい。前記GUIは多様な照会回線に後続される主メニューページを含む。主メニューから使用者はデータベース検索エンジン機能を含む画面を運営することができる。このような画面はデータベースを検索するために使用者によって定義された検索要請、つまり、変異特徴またはDNA序列を受容することができる文字ボックスを含む。前記検索要請はサーバーに伝送され、サーバーのウェッブ応用構成によってSQL照会に転換される。前記照会はその後、サーバーの関係型データベース管理体系構成に使用され、データベースから関連性のある資料を検索及び抽出して適切な形態にサーバーに資料を提供する。前記サーバーはその後に検索された情報をクライアントが実行中であるウェッブブラウザー上に新たなHTML窓で表示する。
一実施例において、検索された情報は初期にデータベースから検索された植物記録を個別的に同定するハイパー連結目録で表示される。その後、使用者はハイパー同定子のうちの一つをクリックして新たなHTMLページで特定植物記録が記載された情報を閲覧し、前記新たなHTMLページは関連性のあるデータが連結された植物イメージを含んでいる。一実施例において、このような情報は植物同定番号、植物イメージまたは視覚的表示、植物に関する追加的な表現型及び／または遺伝子型情報を示したハイパー連結目録を含む。、例えば、前記目録は前記植物と関係ある生化学的及び生物学的変異特徴情報と連結されていても良い。少なくとも一部の記録において、前記目録は候補遺伝子序列連結（例、候補遺伝子の発現が変更する）を追加的に含む。本発明のGUIは使用者が検索した変異特徴を、他の変異特徴を有する植物または候補遺伝子序列の変形された発現を有する植物と容易に組合可能にするという点で有益である。使用者はまた、検索したDNA序列を特定変異特徴を有する植物と組合することもできる。
好ましい実施例において、稲株は特定染色体に対するマーカーとして使用することができる。これは稲株で多様な遺伝子の染色体内位置を決めるのに有用である。例えば、稲ゲノム公知の染色体上に挿入体が各々存在する複数個の稲株を利用することによって、新たな表現型遺伝子の染色体内位置は前記遺伝子の表現型が稲株で既存挿入体とどのように差別されているかを観察することによって決めることができる。その例として、表現型が無作為分離に予想したことに比べてより顕著な頻度で挿入体と分離される場合、前記表現型を示す遺伝子は挿入体が位置した染色体上に存在する。本発明の遺伝子の染色体内位置予測は下記表１に示した。染色体位置は本発明の序列とその染色体内位置が確認された稲序列データベースと比較して予測したことである。一部は１種以上の染色体が本発明の序列と有意な相同性を示す序列を含んでいる。このような目的遺伝子の位置を把握する能力は植物ゲノムで非常に重要なことである。多くの植物ことがそれらのゲノム内に多量の複製物を含むために、伝統的な序列分析方法とショットガン序列分析のような技術を使用する場合、疑問の余地が多い。遺伝子が位置した染色体を同定することによって、目的遺伝子の好ましい表現型が偽陽性である可能性を顕著に下げることができる。
生物ゲノム序列分析が特定活性遺伝子の位置を自動的に知らせることはない。特定遺伝子が生物ゲノム上に複数複製本に発見されることはあるが、全ての遺伝子が表現型を形成させるかどうかについては別個のことである。機能性を決める一つの方法は、目的遺伝子を削除または変異させ、生物の生理学的変化を確認することである。しかし、このような技術は非常に破壊的であれば、致死を引き起こすことがある。他の方法として、本発明の好ましい実施例の稲株を利用して特定染色体上に特定遺伝子が一定の表現型に寄与するかどうかのを確認することができる。つまり、好ましい実施例において、本発明の稲株は目的遺伝子の表現型が染色体上の遺伝子によるものであるか、そうでなければ他の染色体上の前記遺伝子同一複製本によるものであるかを決めるのに使用することができる。
他の好ましい実施例の稲株は稲の染色体重複を観察するのに利用することができる。染色体重複は稲の遺伝学的多様性機会を増加させる方法のうちの一つである。倍数性植物は商業的に好まれ、染色体重複に関与する。したがって、重複された染色体または染色体を同定する必要がある。好ましい実施例の稲株は独特な挿入体を有することができるので、染色体内天然マーカーがゲノム複数染色体に既に重複され得る危険性を排除し、前記株を染色体重複を同定することができる手段として提供可能である。
本発明の他の好ましい実施例の稲細胞株はバックグラウンド対照群マーカーとして利用し、稲の根源を正確に同定可能にする。一例として、好ましい実施例の稲株に存在する挿入体は科学的及び商業的に利用可能な稲の根源を同定するのに使用することができる。一実施例において、遺伝子挿入体を分子的同定子の一種類として利用し、稲株がどのように使用されているかを取締まり可能にする。その他に、人工挿入体を含む株は実験に有用なバックグラウンドである。その例として、好ましい実施例の細胞株で実験する場合、実験が終結した時、初期細胞から由来した最終細胞株を確認することができる。これは汚染可能性の非常に高い場合（室外作業）だけでなく、特定因子の抵抗性に対して相当な潜在性を有する候補物質を検索したり、外部刺激を通じて遺伝学的変化を誘導しようとする場合に非常に有用である。このような全ての場合において、最終稲細胞株が初期稲細胞株と同一であるかどうかまたはこれから由来したものであるかどうかを非常に正確に検証することができる長所がある。
本発明の稲細胞株は多くの用途を有し、これは本発明の属する技術分野の当業者であれば当然に分かる。その例を下記に記述する。
（稲株の染色体マーカーとしての用途）
本発明の各稲株には多様な目的遺伝子が位置している。本発明の稲株は目的遺伝子を挿入体で示される特定染色体と結びつけるのに使用することができる。本発明の稲株の利用は、目的とした新規遺伝子を含む染色体を容易に同定することができる。
好ましい実施例の挿入体のうちの一つを含む稲株は、前記で記載したように最初開発した。複数個の株は解決しなければならない問題の複雑性に相応したものであるが、各染色体に対する１種の株を生産することが好ましく、ある場合、単一株のみでも充分である。簡単な例として、単一挿入体が単一染色体に添加されれば、単一稲細胞株が生成される。その後、変異またはその他の遺伝学的変形が公知の通常の方法で稲細胞株に適用される。関心のある表現型を示す稲株は天然型株（同一な公知挿入体を含まない）と交配してF１後代株を生産させる。F１後代は適した表現型と既存挿入体またはマーカーを確認して検証する。
挿入体またはマーカー実験は幾多の他の方法で実施することができる。そのうちの一つは特定染色体上の目的物の序列を分子検出することで、その例としては序列分析、PCR、相補的核酸混成化または抗体がある。既存挿入体を検出したり、追うためのPCRを根幹にする方法を利用するために、一例として合成PCRプライマーオリゴヌクレオチドを考案する。前方向プライマーは挿入された稲遺伝子の内在的部分に対して設計される。稲遺伝子の内在的序列は序列番号１８乃至３４に示している。逆方向プライマーはT-DNA挿入体序列から設計される。逆方向プライマーはまた、T-DNA挿入体序列の断片と挿入体を有する稲遺伝子断片のスパニング部分から設計することができる。前記スパニング部位の核酸序列の例としては序列番号１乃至１７がある。
一方、化学的産物または挿入体の副産物を視覚化するマーカーを、本発明の挿入体に添加することができる。このようなマーカーは直接的に見られる分子（例、GFP）または二次化学的反応を利用して容易に検出できる分子（例、GUS）または植物自体の分子的影響を含む。目的遺伝子が好ましい実施例の挿入体のように同一な染色体上に存在する場合、目的する表現型と目的挿入体を全て含むF１子孫の発生頻度は表現型と挿入体が無作為的に分離された場合、予想される頻度に比べて顕著に高い。反面、挿入体が表現型に関与する遺伝子と同一染色体上に位置しない場合、表現型発現と挿入体存在上の連関性がなく、挿入体及び表現型全てを含むF１子孫の頻度は無作為分離時に予想できる。さらに多くの場合を設定する時、目的遺伝子の位置を把握することがさらに正確になり得ることは当業者であれば誰でも分かる。このように、その後の世帯、F２、F３… を確認して結果の正確性を高めることができる。
このような技術はその他の可能な技術以上の長所を有する。簡単な序列比較は構造的に類似しているが、機能上関係ない複数の序列を確認することに対して、このような技術は遺伝子位置、前記遺伝子の点変異体または前記遺伝子の非暗号部位差によって特定染色体の表現型に関する遺伝子を位置させることができる。
また、このような技術を染色体から由来したライブラリークロニングに集中させることによって、表現型に関する遺伝子クローニングを促進させたることができる。
（染色体重複）
一実施例の稲株は、植物で染色体重複を探知するために使用することができる。商業的に有益な重複形態は倍数性状態の誘導であり得る。倍数化は多様な刺激を通じて誘導することができる。一実施例において、コルヒチンまたは抗-細胞分裂剤のような化合物は、好ましい実施例の稲株のうちの一つに倍数性状態を誘導するための用途として使用することができる。倍数性状態が１回誘導されれば、稲株の挿入体またはマーカーは多様な技術で実験して染色体が重複されたかどうかを立証したり、染色体または染色体が重複されたかどうかを決めるのに使用することができる。このように過程が染色体または染色体切片重複を観察するための用途として使用されることは当業者であれば予測できる。
（表示された稲株）
好ましい実施例の稲株は植物実験の内部調節子として使用することができる。稲株は公知の挿入体を含み、他の稲ゲノムと独特な相関性がある挿入体を含む。このような稲株は特定プロジェクト実験にバックグラウンドとして使用することができる。実験の最後段階で、マーカーの存在は多様な種類の技術、つまり、序列または挿入体の構造を通じて直接的に、または挿入体の影響を通じて間接的な方法で検証される。実験の最後時点で収得した植物は初期細胞株から由来したものであるかが確認できる。
また、本発明に記載された方法によって発見された稲遺伝子は、遺伝子発現増加、遺伝子発現減少または天然型植物に比べて発現パターンの変異を有するように植物を形質転換するのに使用することができる。過発現、未発現または変異された発現様相を有する植物は農耕学に非常に重要である。例えば、このような植物は環境的ストレス防止、変異された二次代謝経路、穀物の栄養学的品質増加、収穫物の特性増加、穀物の保存性増加、穀物の嗜好性品質増加（模様、味、調理品質、粘着性など）、農業性殺虫剤または除草剤の使用減少、肥料処理効率性増加、生産性増加、種子充填品質変異（例、着手時期、種子充填率、栄養物利用可能性及び光などのような環境特性が種子充填にあたえる影響）及び発芽速度変異を含むことができる。
［本発明の器官優先性ポリヌクレオチド］
本発明の実施例は序列番号１８〜３４または序列番号３５〜５１の分離または精製された核酸序列を提供する。本発明の実施例はまた、序列番号５２〜６８のアミノ酸序列を有するポリペプチドを暗号化する分離されたポリヌクレオチド序列を提供する。“分離された”は他に核酸、蛋白質、脂質、炭水化物または自然に結合可能な物質が含まれないポリヌクレオチドを含む。
以下、“分離された”という用語は天然環境に近いことでなく、“バックボーン”核酸に近い核酸序列を意味する。また、核酸序列が“集積される”は、核酸バックボーン分子群に核酸挿入体の数が５％以上であることを示す。本発明によるバックボーン分子は発現ベクター、自家-複製性核酸、ウイルス、統合性核酸及びその他の核酸挿入体を維持または操作するのに使用されるベクターまたは核酸を含む。好ましくは、集積化された核酸序列は再組合バックボーン分子群で核酸挿入体数が１５％以上である。さらに好ましくは前記集積化された核酸序列は再組合バックボーン分子群の核酸挿入体数が５０％以上である。最も好ましい実施例では集積化された核酸序列は核酸挿入体数が９０％以上の再組合バックボーン分子群である。
ここで、“分離された”は最初環境（例えば、自然に発生した場合、自然環境）から物質が移送される必要がある。たとえば、生きている動物に存在する自然に発生したポリヌクレオチドは分離されず、自然系で共に存在する全ての物質または一部から隔離された同一ポリヌクレオチドは分離される。
ここで、“精製された”は絶対純度と言うよりは相対的明確性（定義）を示すためのことである。ライブラリーから分離された個別的な核酸クローンは一般に電気泳動の同質性で精製される。このようなクローンから収得した序列はライブラリーまたは全ゲノムDNAからも直接的に収得することができない。開始物質または自然物質は少なくとも１次以上の精製、好ましくは２次または３次、さらに好ましくは４次または５次精製することができる。
本発明のポリヌクレオチド序列は序列番号５２〜６８を暗号化するDNA、cDNA及びRNA序列を含む。序列番号５２〜６８の全ての部分または多様な一部を暗号化し、同時に酵素的または機能的活性を有するポリペプチドを暗号化する長さを有するポリヌクレオチドが含まれる。このようなポリヌクレオチドは自然的発生、合成または意図的に操作されたポリヌクレオチドであるか、またはスプライスバリアントである。その例として、mRNA序列の一部はRNAスプライシングパターンが変更したり、またはRNA転写に代替性プロモータが使用されることによって変異することができる。ここで、“ポリヌクレオチド”及び“核酸序列”はDNA、RNA及びcDNAを意味する。
本発明のポリヌクレオチドは序列番号１８〜３４または序列番号３５〜５１を必須に含むポリヌクレオチドである。前記“必須に含む”は前記核酸によって暗号化された蛋白質が下記表２のように活性または機能を有することを必要とする。
本発明のポリヌクレオチドは序列番号１８〜３４または序列番号３５〜５１の核酸序列で変異を有するポリヌクレオチドを含む。このようなポリヌクレオチドは天然型遺伝子産物の一般的な機能を有するポリペプチドを暗号化する。本発明が範囲に属する序列番号１８〜３４または序列番号３５〜５１の核酸に対する変異はこれに限定されないが、点変異体、ナンセンス（停止）変異体、アンチセンス、スプライス部位及びフレームシフト変異体のような遺伝子内変異体だけでなく、異種接合または同種接合性削除を含む。このような変異は本発明の技術分野で公知された標準方法で検出することができ、序列分析、サザンブロット分析、PCRに基づいく分析（例、マルチプレックスPCR、序列標識された部位（STSs）及び細胞内ハイブリダイゼイションを含む。本発明の実施例はまた、アンチセンスポリヌクレオチド序列を含み、前記アンチセンス序列は全序列またはその一部に相同性を有することができる。
記載されたポリヌクレオチドは遺伝子コードの結果で変性した序列を含む。２０個の天然アミノ酸があり、ほとんどは１種以上のコードンで示される。したがって、変性ヌクレオチド序列はヌクレオチド序列によって暗号化されるポリペプチドが酵素的または機能的活性を維持する長さである。“機能的ポリヌクレオチド”はここで記載されたように、機能的ポリペプチドを暗号化するポリヌクレオチドを意味する。本発明の実施例は、序列番号５２〜６８で記載されたアミノ酸序列を有し、生物学的活性を示すポリペプチドを暗号化するポリヌクレオチド、または序列番号５２〜６８に抗体免疫反応性を有する１種以上のエピトープ有するポリペプチドを暗号化はポリヌクレオチドを含む。
一実施例において、本発明のポリペプチドを暗号化するポリヌクレオチドは序列番号１８〜３４または序列番号３５〜５１のヌクレオチド序列と、これらに相補的な核酸序列を含む。相補的な序列はアンチセンスヌクレオチドを含むことができる。RNA序列は序列番号１８〜３４または序列番号３５〜５１のデオキシリボヌクレオチドA、G、C及びTが各々リボヌクレオチドA、G、C及びUに置換されたものである。本発明の実施例は前記記載した核酸序列の切片または“プローブ”を含み、前記切片またはプローブは少なくとも１０，１５，２０，２５，３０，３５，４０，５０，７５，１００，１５０，２００，３００，４００，５００，７５０，１０００，１２５０，または１５００ベース以上の長さを有し、前記プローブは本発明の蛋白質を暗号化するDNAを選別的にハイブリッドする。
本発明の実施例は相同のゲノム核酸である。“相同のゲノム核酸”は序列番号１８〜３４からなる群より選択された１種の核酸またはこれらの一部に相同性を有する核酸を意味する。実施例において、相同のゲノム核酸は序列番号１８〜３４及び前記序列の少なくとも１０，１５，２０，２５，３０，３５，４０，５０，７５，１００，１５０，２００，３００，４００，５００，７５０，１０００，１２５０または１５００以上の連続ヌクレオチドを含む切片からなる群より選択された１種のヌクレオチド序列に、少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％または９７％以上の相同性を有することができる。他の実施例において、相同のゲノム核酸は、序列番号１８〜３４及び前記序列の少なくとも１０，１５，２０，２５，３０，３５，４０，５０，７５，１００，１５０，２００，３００，４００，５００，７５０，１０００，１２５０または１５００以上の連続ヌクレオチドを含む切片のうちのいずれか一つに相補的なヌクレオチド序列からなる群より選択された１種のヌクレオチドに、少なくとも９７％、少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％または少なくとも７０％以上の相同性を有することができる。相同性はデフォルト媒介変数としてBLASTNバージョン２．０またはデフォルト媒介変数としてtBLASTXを利用して測定することができる（Altschul, S.F.外 Gapped BLAST and PSI-BLAST: A New Generation of Protein Database Search Programs, Nucleic Acid Res. 25: 3389-3402 (1997)、本発明に併合される）。
“相同のゲノム核酸”はまた、序列番号５２〜６８またはこれらの５，１０，１５，２０，２５，３０，３５，４０，５０，７５，１００，２００，４００，６００，８００，または１０００個以上の連続されたアミノ酸を含む切片のうちの１種のアミノ酸序列を含むポリペプチドに、少なくとも９９％、少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７０％、少なくとも６０％、少なくとも５０％少なくとも４０％または少なくとも２５％以上のアミノ酸相同性または類似性を有するポリペプチドを暗号化するヌクレオチド序列を含む核酸であり、これはデフォルト媒介変数を使用したFASTAバージョン３．０t７８アルゴリズムを利用して決められる。一方、蛋白質相同性または類似性はデフォルト媒介変数上のBLASTP、デフォルト媒介変数上のBLASTX、デフォルト媒介変数上のTBLASTN、またはデフォルト媒介変数上のtBLASTXを利用して確認することができる（Altschul, S.F.外 Gapped BLAST and PSI-BLAST: A New Generation of Protein Database Search Programs, Nucleic Acid Res. 25: 3389-3402 (1997)、本発明に併合される）。
“相同のゲノム核酸”はまた、序列番号１８〜３４のうちの１種に相補的なヌクレオチド序列からなる群より選択された核酸に厳格条件下でハイブリッドされる核酸と、序列番号１８〜３４のうちの１種に相補的な序列のうちの少なくとも１０，１５，２０，２５，３０，３５，４０，５０，７５，１００，１５０，２００，３００，４００，５００，７５０，１０００，１２５０，または１５００以上の連続的なヌクレオチドを含む切片に厳格条件下でハイブリッドされる核酸序列を含むコーディング核酸である。前記“厳格条件”とはフィルター-結合された核酸を約４５℃、6x SSCでハイブリダイゼイションし、その後、約６８℃、０．１x SSC／０．２％SDSで１回以上洗浄することを意味する。他の厳格条件の例としては、使用する特異プローブによって３７℃、４８℃、５５℃、及び６０℃で、６x SSC／０．０５％ピロリン酸ナトリウムで洗浄することである。
“相同のゲノム核酸”はまた、序列番号１８〜３４のうちの１種に相補的な序列からなる群より選択されたヌクレオチド序列に温和な条件でハイブリッドされる核酸と、序列番号１８〜３４のうちの１種に相補的な序列のうちの少なくとも１０，１５，２０，２５，３０，３５，４０，５０，７５，１００，１５０，２００，３００，４００，５００，７５０，１０００，１２５０，または１５００以上の連続的なヌクレオチドを含む切片に温和な条件でハイブリッドされるヌクレオチド序列を含む核酸序列である。前記“温和な条件”とはフィルター-結合されたDNAを約４５℃、６x塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（SSC）でハイブリダイゼイションし、その後、約４２-６５℃で０．２x SSC／０．１％SDSで１回以上洗浄することを意味する。
前記“相同のゲノム核酸”は遺伝子産物を暗号化するヌクレオチド序列を含む核酸であって、前記遺伝子産物は序列番号１８〜３４からなる群より選択された１種のヌクレオチド序列を含む核酸によって遺伝子産物の活性を補完することができる。実施例において、相同のゲノム核酸は遺伝子産物を暗号することができ、前記遺伝子産物の活性は、序列番号３５〜５１及びゲノム序列からなる群より選択された１種のヌクレオチド序列を含む核酸に対する暗号化された遺伝子産物によって補完される。
本発明のポリヌクレオチド序列は多様方法で収得することができる。その例として、ポリヌクレオチドはハイブリダイゼイションまたは本発明技術分野の公知の技術である、コンピュータを根幹とした技術を利用して分離することができ、これに限定されないが、下記を含む:１）相同のヌクレオチド序列を検出することができるプローブを使用してゲノムまたはcDNAライブラリーをハイブリダイゼイション２）構造的特徴が共有されたポリペプチドを暗号化するクローンDNA切片を検出するために、発現ライブラリーを抗体で検索する３）目的DNA序列にアニーリングできるプライマーを利用してゲノムDNAまたはcDNAをPCRする４）序列データベースで類似序列をコンピュータで検索する及び５）控除されたDNAライブラリーに対する特異スクリーニング。
本発明の実施例で、本発明の蛋白質（序列番号５２〜６８）を暗号化する完全cDNA序列（序列番号３５〜５１）を提供する。また、本発明の実施例で、序列番号３５〜５１の序列と７０％以上の相同性を有し、植物で酵素的活性または機能的活性を維持するヌクレオチド序列を提供する。本発明の他の実施例において、序列番号３５〜５１の序列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％または９５％以上の相同性を有し、植物で酵素的活性または機能的活性を維持するヌクレオチド序列を提供する。
本発明のポリヌクレオチドは序列番号３５〜５１を必須に含むポリヌクレオチドである。前記“必須に含む”はコーディング核酸によって暗号化された蛋白質が下記表２のように活性または機能を有することを必要とする。
本発明は相同のコーディング核酸序列と相同のポリペプチド序列を含む。“相同のコーディング核酸”は序列番号３５〜５１及びこれらの１０，１５，２０，２５，３０，３５，４０，５０，７５，１００，１５０，２００，３００，４００，５００，７５０，１０００，１２５０，または１５００個以上の連続されたヌクレオチドを含む切片からなる群より選択された１種のヌクレオチドに、少なくとも９７％、少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％または少なくとも７０％以上の相同性を有する核酸に相同的な核酸を意味する。他の実施例において、相同のコーディング核酸は序列番号３５〜５１及びこれらの１０，１５，２０，２５，３０，３５，４０，５０，７５，１００，１５０，２００，３００，４００，５００，７５０，１０００，１２５０，または１５００個以上の連続されたヌクレオチド切片のうちの１種に相補的なヌクレオチド序列からなる群より選択されたヌクレオチドに、少なくとも９７％、少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％または少なくとも７０％以上の相同性を有することができる。相同性はデフォルト媒介変数としてBLASTNバージョン２．０またはデフォルト媒介変数としてtBLASTXを利用して測定できる（Altschul, S.F.外 Gapped BLAST and PSI-BLAST: A New Generation of Protein Database Search Programs, Nucleic Acid Res. 25: 3389-3402 (1997)、本発明に併合される）。
“相同のコーディングゲノム核酸”はまた、序列番号５２〜６８またはこれらの５，１０，１５，２０，２５，３０，３５，４０，５０，７５，１００，２００，４００，６００，８００，または１０００個以上の連続されたアミノ酸を含む切片のうちの１種のアミノ酸序列を含むポリペプチドに少なくとも９９％、少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７０％、少なくとも６０％、少なくとも５０％少なくとも４０％または少なくとも２５％以上のアミノ酸相同性または類似性を有するポリペプチドを暗号化するヌクレオチド序列を含む核酸であり、これはデフォルト媒介変数を使用したFASTAバージョン３．０t７８アルゴリズムを利用して決められる。また、蛋白質相同性または類似性はデフォルト媒介変数上のBLASTP、デフォルト媒介変数上のBLASTX、デフォルト媒介変数上のTBLASTN、またはデフォルト媒介変数上のtBLASTXを利用して確認することができる（Altschul, S.F.外 Gapped BLAST and PSI-BLAST: A New Generation of Protein Database Search Programs, Nucleic Acid Res. 25: 3389-3402 (1997)、本発明に含まれる）。
“相同のコーディングゲノム核酸”はまた、序列番号３５〜５１のうちの１種に相補的なヌクレオチド序列からなる群より選択された核酸に、厳格条件でハイブリッドされるコーディング核酸を含み、序列番号３５〜５１の１種の相補的な序列で少なくとも１０，１５，２０，２５，３０，３５，４０，５０，７５，１００，１５０，２００，３００，４００，５００，７５０，１０００，１２５０，または１５００以上の連続的なヌクレオチドを含む切片に、厳格条件でハイブリッドされる核酸序列を含むコーディング核酸を含む。前記“厳格条件”とはフィルター-結合された核酸を約４５℃、６x SSCでハイブリダイゼイションし、その後、約６８℃で０．１x SSC／０．２％SDSで１回以上洗浄することを意味する。他の厳格条件の例としては使用する特定プローブによって３７℃、４８℃、５５℃、及び６０℃で６x SSC／０．０５％ピロリン酸ナトリウムで洗浄することである。
“相同のコーディングゲノム核酸”はまた、序列番号３５〜５１のうちの１種に相補的な序列からなる群より選択されたヌクレオチド序列に温和な条件でハイブリッドされるヌクレオチド序列を含むコーディング核酸を含み、序列番号３５〜５１のうちの１種の相補的な序列のうちの少なくとも１０，１５，２０，２５，３０，３５，４０，５０，７５，１００，１５０，２００，３００，４００，５００，７５０，１０００，１２５０，または１５００以上の連続的なヌクレオチドを含む切片に温和な条件でハイブリッドされるヌクレオチド序列を含むコーディング核酸を含む。前記“温和な条件”とはフィルター-結合されたDNAを約４５℃、６x塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（SSC）でハイブリダイゼイションし、その後、約４２-６５℃、０．２x SSC／０．１％SDSで１回以上洗浄することを意味する。
前記“相同のコーディングゲノム核酸”はまた、遺伝子産物を暗号化するヌクレオチド序列を含む核酸であり、前記遺伝子産物の活性は序列番号５２〜６８からなる群より選択されたアミノ酸序列を含むポリペプチドを暗号化する遺伝子によって補完することができる。実施例において、相同のコーディングゲノム核酸は遺伝子産物を暗号化することができ、前記遺伝子産物の活性は序列番号３５〜５１及びゲノム序列からなる群より選択されたヌクレオチド序列を含む核酸によって暗号化された遺伝子産物によって補完することができる。
（ハイブリダイゼイション方法）
本発明はまた、ポリヌクレオチド、好ましくは序列番号１８〜３４、序列番号３５〜５１、これらの１０，１５，２０，２５，３０，３５，４０，５０，７５，１００，１５０，２００，３００，４００，５００，７５０，１０００，１２５０または１５００以上連続的なヌクレオチドを含む切片または前記核酸のうちの１種に対する相補体のうちの１種に、厳格条件または温和条件でハイブリッドされるDNA分子を含む。前記“ハイブリダイゼイション”は核酸鎖に相補的な鎖を塩基対を通じて結合させる過程を意味する。ハイブリダイゼイション反応は敏感で選別的であり得るので、特定目的序列が試料に低濃度で存在する場合にも確認することができる。適した厳格条件は、例えば、フリーハイブリダイゼイション及びハイブリダイゼイション溶液内の塩またはホルムアミドの濃度またはハイブリダイゼイション温度によって限定することができ、本発明が属する技術分で公知されてことである。特に、塩濃度減少、ホルムアミド濃度増加またはハイブリダイゼイション温度増加で厳格性を強化させることができる。
核酸ハイブリダイゼイションによるスクリーニング過程は、利用可能な適したプローブを提供して生物体から遺伝子を分離することができる。オリゴヌクレオチドプローブは化学的に合成することができ、前記オリゴヌクレオチドプローブは序列番号５２〜６８からなる群より選択されたアミノ酸序列を含む蛋白質を暗号化するヌクレオチド序列の一部と一致する。前記蛋白質を暗号化するDNA序列は遺伝子コードから導出することができ、コードの縮重はプローブ設計する時に計算した。序列が変性されれば、変性された二本鎖のDNA混合物で混合添加反応を行うことができる。スクリーニング過程において、ハイブリダイゼイションは一本鎖DNAまたは変性された二本鎖DNAに実施することが好ましい。ハイブリダイゼイションEN特にcDNAクローン検出に有用であり、前記cDNAクローンは目的としたポリペプチドに関連されたmRNA序列が非常に少なく存在する原料から収得したものである。一例として、非特異的結合を避けるための厳格なハイブリダイゼイション条件で目的DNAに相補的な単一プローブを使用してハイブリダイゼイションすることによって、特定cDNAクローンを自動放射線写真で視覚化することができる（Wallace,外, Nucl. Acid Res., 9:879, 1981）。また、サブトラックチブライブラリーは非特異的cDNAクローンを除去するのに有用である。
ハイブリダイゼイションは記載した厳格または温和な条件や、または特異的ハイブリダイゼイションが可能なその他の条件で実施することができる。本発明のこのようなDNAにハイブリッドする核酸分子は、非常に厳格または温和な条件で目的遺伝子にハイブリッドすることができるオリゴジオキシヌクレオチド（“オリゴス”）である。一般に１４乃至７０個のヌクレオチドを有するオリゴスの場合、融解温度（Tm）は下記式で計算される:
Tm (°C) = 81.5 + 16.6(log[monovalent cations (molar)] + 0.41 (% G+C) - (500／N)
前記式において、Nはプローブの長さであり、ハイブリダイゼイションをホルムアミドが含まれた溶液で実施する場合、融解温度は下記式で計算できる:
Tm(°C) = 81.5 + 16.6(log[monovalent cations (molar)] + 0.41(% G+C) - (0.61) (% formamide) - (500／N)
前記式において、Nはプローブの長さである。一般にハイブリダイゼイションはTmより２０乃至２５度低いか（DNA-DNAハイブリッド）、１０乃至１５度低い温度（RNA-DNAハイブリッド）で実施する。
その他のハイブリダイゼイション条件は本発明が属する技術分野の当業者であれば、容易に分かることである（Ausubel, F.M.外, eds., 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. I, Green Publishing Associates, Inc. and John Wiley & Sons, Inc., New York, at pp. 6.3.1-6.3.6 and 2.10.3、本発明に併合される）。
高強度の厳格条件下のハイブリダイゼイションは、たとえば、約３７℃乃至４２℃で約５０％ホルムアミド上で行うことができる。また、ハイブリダイゼイションは３０℃乃至３５℃温度と３５％乃至２５％ホルムアミド条件である低強度厳格条件下で行うことができる。特に、ハイブリダイゼイションは４２℃で５０％ホルムアミド、５X SSPE、０．３％SDS、２００n／mlシャード及び変性されたサケの精子DNAを使用して、高強度の厳格条件で実施することができる。ハイブリダイゼイションは前記記載した低い厳格条件で実施することができ、この時、３５％ホルムアミド上で３５℃の条件である。厳格性の決められた水準に応じて対応する温度範囲は核酸内プリン対ピリミジン比率を計算し、それに基づいて温度を調節してさらに狭めることができる。前記範囲と条件の変形は本発明が属する技術分野では公知のことである。
“選択的ハイブリダイゼイション”は低強度厳格または高強度厳格の生理条件で実施するハイブリダイゼイションを意味し（the techniques described in Maniatis外, 1989, Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y., incorporated herein by reference ）、無関係のヌクレオチド序列から分離される。
cDNA序列を分離する標準過程に、遺伝子発現の高い供与体のmRNAの逆転写から由来したcDNAライブラリーを運搬するプラスミドまたはバクテリオファージの形成がある。重合酵素連鎖反応技術と組合して使用する場合、低い水準で発現される産物をクローンすることができる。ポリペプチドのアミノ酸序列のうちの重要な部分が公知された場合、標識された単一または二本鎖DNA、または標的cDNAに存在すると推定される序列を複製するRNAプローブ序列を製造し、一本鎖cDNAのハイブリダイゼイションに利用することができる（Jay,外, Nucl. Acid Res., 11:2325, 1983、本発明に併合される）。
（相同遺伝子のライブラリー検索）
相同のゲノム序列または相同のコーディングゲノム序列は稲以外生物体のゲノムまたはcDNAライブラリーをスクリーニングして同定することができる。一般的な分子生物学的技術を多様な細胞または微生物からゲノムまたはcDNAライブラリーを製造するのに使用することができる。つまり、前記ライブラリーは製造し、ニトロセルロース紙に付着させる。本発明において、同定した外在的核酸序列は相同の序列を検索するためのプローブとして使用することができる。
例えば、ライブラリーは厳格条件で核酸にハイブリッドされるヌクレオチド序列を含む相同のコーディング核酸または相同がゲノム核酸を同定するための用途としてスクリーニングすることができ、前記核酸は序列番号１８〜３４及び序列番号３５〜５１からなる群より選択された核酸、序列番号１８〜３４及び序列番号３５〜５１のうちの１種の連続されたヌクレオチドを１０，１５，２０，２５，３０，３５，４０，５０，７５，１００，１５０，２００，３００，４００，５００，７５０，１０００，１２５０，または１５００以上で含む切片、序列番号１８〜３４及び序列番号３５〜５１の１種に相補的な核酸または序列番号１８〜３４及び序列番号３５〜５１のうちの１種に相補的な序列の連続されたヌクレオチドを１０，１５，２０，２５，３０，３５，４０，５０，７５，１００，１５０，２００，３００，４００，５００，７５０，１０００，１２５０，または１５００以上含む切片である。
また、ライブラリーは温和された条件で核酸にハイブリッドされるヌクレオチド序列を含む相同のコーディング核酸または相同がゲノム核酸を同定するための用途としてスクリーニングすることができ、前記核酸は序列番号１８〜３４及び序列番号３５〜５１からなる群より選択された核酸、序列番号１８〜３４及び序列番号３５〜５１のうちの１種の連続されたヌクレオチドを１０，１５，２０，２５，３０，３５，４０，５０，７５，１００，１５０，２００，３００，４００，５００，７５０，１０００，１２５０，または１５００以上含む切片、序列番号１８〜３４及び序列番号３５〜５１の１種に相補的な核酸または序列番号１８〜３４及び序列番号３５〜５１のうちの１種に相補的な序列の連続されたヌクレオチドを１０，１５，２０，２５，３０，３５，４０，５０，７５，１００，１５０，２００，３００，４００，５００，７５０，１０００，１２５０，または１５００以上含む切片である。
前記方法を実施し、序列番号１８〜３４、序列番号３５〜５１、これらの連続的なヌクレオチドを１０，１５，２０，２５，３０，３５，４０，５０，７５，１００，１５０，２００，３００，４００，５００，７５０，１０００，１２５０，または１５００以上含む切片及びこれらの相補的な序列からなる群より選択された１種のヌクレオチド序列に、少なくとも９７、９５，９０，８５，８０または７０％以上の相同性を有するヌクレオチド序列を含む、相同のコーディング核酸または相同のゲノム核酸を分離することができる。
相同性はデフォルト媒介変数のBLASTNバージョン２．０で測定することができる（Altschul, S.F.外 Gapped BLAST and PSI-BLAST: A New Generation of Protein Database Search Programs, Nucleic Acid Res. 25: 3389-3402 (1997), the disclosure of which is incorporated herein by reference in its entirety）。その例として、相同のポリヌクレオチドは記載した１種の序列に対する自然的な対立遺伝子の変異体序列を含むことができる。このような対立遺伝子の変異体は序列番号１８〜３４または序列番号３５〜５１またはこれらの相補的なヌクレオチド序列と比較した時、１種以上のヌクレオチドを代替、削除または追加して含むことができる。
追加的に、前記過程は序列番号５２〜６８のうちの１種の序列またはこれらの連続されたアミノ酸を５，１０，１５，２０，２５，３０，３５，４０，５０，７５，１００，２００，４００，６００，８００，または１０００個以上含む切片を含むポリペプチドと、少なくとも９９％、少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７０％、少なくとも６０％、少なくとも５０％少なくとも４０％または少なくとも２５％以上のアミノ酸相同性または類似性を有するポリペプチドを暗号化する相同のコーディング核酸序列を分離するのに使用することができ、これはデフォルト媒介変数を使用したFASTAバージョン３．０t７８アルゴリズムを利用して決められる。また、蛋白質相同性または類似性はデフォルト媒介変数上のBLASTP、デフォルト媒介変数上のBLASTXまたはデフォルト媒介変数上のTBLASTNを利用して確認することができる（Altschul, S.F.外 Gapped BLAST and PSI-BLAST: A New Generation of Protein Database Search Programs, Nucleic Acid Res. 25: 3389-3402 (1997), the disclosure of which is incorporated herein by reference in its entirety）。
（遺伝子発現アレイ及びマイクロアレイ）
本発明の他の実施例において、遺伝子発現アレイ及びマイクロアレイは、序列番号１８〜３４及び序列番号３５〜５１の核酸の転写様相または転写水準を確認するために使用することができる。遺伝子発現アレイはガラスチップ、ナイロン膜または類似物の特定位置にDNA試料をおいた高密度アレイである。このようなアレイは研究者らが使用して他の条件または他の組織または器官で相対的な遺伝子発現を定量化する。遺伝子発現アレイは薬物の最適標的同定、新たな化合物分析及び疾病経路確認を助けることができる。このような技術の例は未国特許出願第５８０７５２２号に記載されており、その内容は本発明に含まれる。
単一アレイを利用して複数の遺伝子発現を研究することができる。その例として、アレイは特定複数遺伝子のORFまたはORF切片に対応したPCR産物が含まれた１２x２４cmナイロンフィルターで構成することができ、序列番号１８〜３４及び序列番号３５〜５１の核酸を含んでいる。一般的なアレイには、PCR産物が各々１０ngずつ１．５mmでフィルターに点滴されている。標識した一本鎖cDNAを準備し（二次鎖合成及び増幅段階無い）、フィルターに接触させる。前記標識したcDNAは“アンチセンス”方向である。定量分析はフォスフォロイメージャで実施した。
細胞の全RNA試料に対するcDNAハイブリダイゼイションは、１種以上の公知された技術で結合を検出することができ、ハイブリッドされたcDNAは信号を通じてアレイでの位置を表示する。各位置で確認されたハイブリダイゼイション信号の強度は、試料に含まれている特定遺伝子に対するRNAの量を示す。互い異なる条件で培養した植物から分離したmRNAに対する結果を比較し、各遺伝子の相対的な発現率を比較することができる。つまり、他の組織または器官から分離したmRNAから確認された結果を比較することによって、器官または組織別発現率を比較することができる。アレイに集積された核酸の原料とアレイにハイブリッド反応させる核酸の原料が互いに異なる生物体から由来した場合、遺伝子発現アレイを通じて二つの生物体間の核酸相同性を確認することができる。
本発明はまた、本発明で言及した稲遺伝子と関連性のある他の植物種由来遺伝子を検索する方法に関する。たとえば、特定稲遺伝子に対する相同の核酸が、他の植物種で発現できる。類似性のある核酸序列検索に利用できる単子葉植物の例としては、アスパラガス、トウモロコシ、スイートコーン、大麦、小麦、稲、モロコシ、玉ネギ、竹、ナツメヤシ、トウジンヒエ、ライ麦及び燕麦のような単子葉植物種に属する植物、モロコシ、パイナップル及びバナナがあるが、これに限定されない。類似性のある核酸序列検索に利用できる双子葉植物の例としては、トマト、タバコ、木化、菜種、葡萄、ソラマメ、大豆、オレガノ、バジル、ペッパー、レタス、エンドウ、アルファルファ、ツメクサ、コールクロップまたはブラシカオレラセア（例、キャベツ、ブロッコリー、カリフラワー、芽キャベツ、大根、ニンジン、ビット、ナス、ホウレンソウ、キュウリ、かぼちゃ、ジャガイモ、メロン、マスクメロン、ひまわり及び多様な観賞植物があるが、これに限られるわけではない。有用な樹木及び穀物としてはアボカド、リンゴ、柑橘類、西洋スモモ、サクランボウ、アーモンド、桃、梨、パパイヤ及びマンゴがあるが、これに限定されない。木本植物の例としては、ポプラ、松、セコイア、杉及びオークがあるが、これに限られるわけではない。
（アンチセンスヌクレオチド）:
本発明の実施例において、細胞は細胞または細胞で再生された植物のポリペプチド発現比率及び活性を減少させるアンチセンス核酸の転写やまたは“相同のアンチセンス核酸”の転写を容易にするベクターに形質転換できる。“相同のアンチセンス核酸”は序列番号１８〜３４及び序列番号３５〜５１の序列及び前記序列の連続的なヌクレオチドを１０，１５，２０，２５，３０，３５，４０，５０，７５，１００，１５０，２００，３００，４００，５００，７５０，１０００，１２５０，または１５００個含む切片からなる群より選択された１種のヌクレオチド序列と、９７、９５，９０，８５，８０または７０％以上の相同性を有するヌクレオチド序列を含む核酸である。前記核酸相同性は前述したように確認することができる。
“相同のアンチセンス核酸”は序列番号１８〜３４及び序列番号３５〜５１に相補的な１種のヌクレオチド序列に厳格条件でハイブリッドされるヌクレオチド序列を含むアンチセンス核酸であり、また、序列番号１８〜３４及び序列番号３５〜５１のうちの１種に相補的なヌクレオチドを１０，１５，２０，２５，３０，３５，４０，５０，７５，１００，１５０，２００，３００，４００，５００，７５０，１０００，１２５０，または１５００に含む切片に、厳格条件でハイブリッドされるヌクレオチド序列を含むアンチセンス核酸である。
“相同のアンチセンス核酸”はまた、序列番号１８〜３４及び序列番号３５〜５１に相補的な１種のヌクレオチド序列に温和な条件でハイブリッドされるヌクレオチド序列を含むアンチセンス核酸であり、また、序列番号１８〜３４及び序列番号３５〜５１のうちの１種に相補的なヌクレオチドを１０，１５，２０，２５，３０，３５，４０，５０，７５，１００，１５０，２００，３００，４００，５００，７５０，１０００，１２５０，または１５００個含む切片に、温和な条件でハイブリッドされるヌクレオチド序列を含むアンチセンス核酸である。本発明の実施例で、細胞は序列番号５２〜６８からなる群より選択されたアミノ酸序列を含むポリペプチドを暗号化する核酸、序列番号５２〜６８からなる群より選択されたポリペプチドの少なくとも５，１０，１５，２０，２５，３０，３５，４０，５０，７５，１００，２００，４００，６００，８００，または１０００個以上連続されたアミノ酸を暗号化する核酸、相同のコーディング核酸の少なくとも１０，１５，２０，２５，３０，３５，４０，５０，７５，１００，１５０，２００，３００，４００，５００，７５０，１０００，１２５０または１５００以上連続されたヌクレオチドに相補的な核酸、相同のポリペプチドの少なくとも５，１０，１５，２０，２５，３０，３５，４０，５０，７５，１００，２００，４００，６００，８００，または１０００個以上連続されたアミノ酸を暗号化する核酸に相補的な核酸に形質転換できる。
（PCR）
本発明は重合酵素連鎖反応のような技術を活用することができる。前記“重合酵素連鎖反応”（“PCR”）はK.B.Mullisの未国特許出願第４６８３１９５号及び４６８３２０２の方法で前記引用参証の内容は本発明に含まれ、重合酵素連鎖反応はクロニングまたは精製過程なくゲノムDNA混合物内で鋳型序列の濃度を増加させる方法を意味する。鋳型序列を増幅する方法は、目的鋳型序列が含まれたDNA混合物に二つのオリゴヌクレオチドプライマーを多量入れた後、DNA重合酵素が存在する状態で熱サイクルを正確な順に実施することである。二つのプライマーは鋳型序列の二本鎖各々に相補的である。増幅する時、混合物は変性させた後、プライマーを鋳型分子の相補的な序列にアニーリングさせる。アニーリングの後、プライマーは重合酵素で延長させ、新たな対の相補的な鎖を製造する。目的鋳型序列に対する増幅された断片は、高濃度に収得するために変性、プライマーアニーリング及び重合酵素延長段階を数回繰り返すことができる（例、変性、アニーリング及び延長は一つのサイクルをなし、サイクル回数を増加させることができる）。増幅断片の長さは各々のプライマー位置によって決められ、したがって、前記長さは調節可能である。前記過程の反復によってこれを‘重合酵素連鎖反応’（以下、“PCR”）と言う。鋳型序列に対する増幅された断片は混合物内で優勢に（濃度面で）存在するので、これを“PCR増幅される”という。
PCR技術はゲノムDNA内特異的鋳型序列を多様な他の方法（例、標識されたプローブでハイブリダイゼイション、ビオチン接合されたプライマーを結合させた後、アビジン-酵素接合体を使用して検出、３２Pに標識されたジオキシヌクレオチドトリホスフェート、つまり、dCTPまたはdATPを増幅された断片に結合させる）で検出可能な水準に増幅させる。また、ヌクレオチド序列は適したプライマー細胞に増幅することができる。特に、PCRによって製造された増幅断片は引続いたPCR増幅に対する鋳型に提供される。
前記“プライマー”はオリゴヌクレオチドであり、これは核酸に相補的なプライマー延長産物合成を誘導する条件（ヌクレオチド及びDNA重合酵素のような誘導剤が適した温度及びpHで存在する場合）で合成開始点として作用することができる。前記プライマーは増幅時に最大効率性を有する一本鎖が好ましく、ある場合には二本鎖であっても良い。二本鎖である場合、プライマーは延長産物を製造するために使用される前の段階で各鎖を分離させる。好ましくはプライマーはオリゴデオキシリボヌクレオチドである。正確なプライマー長さは多様な因子、つまり、温度、プライマー原料及び使用方法によって決められる。
プライマーは鋳型の特定序列鎖に“実質的に”相補的に選択される。プライマー延長のために、プライマーは鋳型鎖にハイブリッドするように十分に相補的でなければならない。プライマー序列は鋳型の正確な序列を示す必要はない。たとえば、実質的に相補的なプライマー序列は残存しているが、非-相補的なヌクレオチド切片はプライマーの５’末端に付着されるかもしれない。非-相補的な塩基または長い序列をプライマーに散在させ、鋳型序列にハイブリッドできる十分に相補的なプライマー序列を提供することによって、プライマーの延長産物が合成できるプライマー複合体を形成することができる。
前述した“鋳型”は重合酵素と共に混合される核酸に作用される核酸である。ある場合には“鋳型”が他の核酸序列と区分される。“実質的一本鎖鋳型”は完全に一本鎖（二本鎖部位が無い）であるか、二本鎖核酸の狭い部位（ハイブリダイゼイションされたプライマーに限定された部位や、分子内結合で限定された部位など）を除いた一本鎖核酸である。“実質的二本鎖鋳型”は完全に二本鎖であるか（一本鎖部位が無い）、または一本鎖核酸（末端のテロマーDNA部位）の狭い部位を除いた二本鎖核酸である。
“増幅”は特異的鋳型が関与された核酸複製の場合である。非特異的鋳型複製（例、特異的鋳型に対する鋳型-依存的複製であり、非依存的複製でない）とは対比される。鋳型特異性は複製適合度及びヌクレオチド（リボ-またはデオキシリボ-）特異性とは差別される。鋳型特異性は“標的”特異性と言及することもある。標的序列は他の核酸と表示される意味として“標的物”という。増幅技術は最初にこのような区分設定のためのものであった。
前述した“増幅可能な核酸”はPCRに限定されず、全ての増幅方法によって増幅できる核酸を言及する時に使用される。
前述した“PCR産物”、”PCR切片”及び”増幅産物”は変性、アニーリング及び延長からなるPCR過程を２回以上実施した時、構成混合物の結果物のことを言う。このような用語は１種以上の標的序列に対して１種以上の断片が増幅される場合を含む。
前述した“増幅反応制”はプライマー、核酸鋳型及び証幅酵素を除いた増幅に必要な反応剤（デオキシリボヌクレオチドトリホスフェート、緩衝液など）を意味する。一般に増幅反応剤はその他の反応構成要素と共に一つの反応槽（実験管、マイクロウェルなど）におく。
［ポリペプチド］
本発明は分離または精製されたポリペプチドに関し、前記ポリペプチドは序列番号５２〜６８のアミノ酸序列またはこれらを連続的に５，１０，１５，２０，２５，３０，３５，４０，５０，７５，１００，２００，３００，４００，５００，７５０，１０００，１２５０または１５００個以上のアミノ酸を含む切片を含む。本発明はまた、序列番号５２〜６８序列と実質的に同一なアミノ酸序列に関する。“実質的に同一”は下記表２に示したように、蛋白質の活性を維持したアミノ酸序列を意味する。前記“蛋白質活性”は天然蛋白質またはその相同物のように類似な機能を有することを意味する。蛋白質活性の例としては、酵素活性、DNA結合活性、RNA結合活性、蛋白質結合活性、生化学的代謝経路上の活性、信号機作での活性、細胞内輸送機作での活性及び細胞のスカフォルディング機作での活性があるが、これに限定されない。本発明のポリペプチドはポリペプチド序列の保守的な変異体を含み、前記ポリペプチド序列は序列番号５２〜６８の序列と実質的に同一序列を生産する。前記“保守的変異体”とはアミノ酸を生物学的に類似な残基に置換することを意味する。保守的変異体の例としては、イソロイシン、バリン、ロイシンまたはメチオニンのような疎水性残基の置換、または極性残基の置換があり、つまり、リシンをアルギニン酸に置換、アスパラギン酸をグルタミン酸に置換、アスパラギンをグルタミンに置換などがある。前記“保守的変異体”は置換されたアミノ酸を、置換されたアミノ酸を置換されたポリペプチドだけでなく、置換されていないポリペプチドに対して免疫反応を誘導する抗体を提供する非置換された親アミノ酸の代りに使用されることを含む。
本願で“実質的に純粋な”という用語は自然に結合されたその他の蛋白質、脂質、炭水化物などの物質がないことを意味する。したがって、“実質的に純粋な” という用語は相当量のその他の蛋白質と共に電気泳動分離媒質上に存在するポリペプチドを含まない。当業者は蛋白質精製のための標準技術を利用してポリペプチドを精製することができる。ポリペプチドの純度はまた、アミノ-末端アミノ酸序列分析によって決めることができる。
本発明のポリペプチドは序列番号５２〜６８で必須に構成されるポリペプチドを含み、ここで用語“必須に構成される”とは前記アミノ酸序列によって形成される蛋白質が表２に記載したような活性または機能を有することを必要とする。
本発明の実施例はまた、序列番号:５２〜６８と相同のポリペプチドを含む。用語“相同ポリペプチド”とは序列番号５２〜６８のアミノ酸序列のうちの一つを含むポリペプチドと少なくとも９９％、少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７０％、少なくとも６０％、少なくとも５０％、少なくとも４０％、または少なくとも２５％アミノ酸同一性または類似性を有するポリペプチド、または、序列番号５２〜６８のアミノ酸序列のうちの一つを含むポリペプチドの少なくとも５，１０，１５，２０，２５，３０，３５，４０，５０，７５，１００，２００，４００，６００，８００または１０００連続アミノ酸を含む断片と少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７０％、少なくとも６０％、少なくとも５０％、少なくとも４０％または少なくとも２５％アミノ酸同一性または類似性を有するポリペプチドを含む。同一性または類似性はデフォルトパラメターを有するFASTAバージョン３．０t７８アルゴリズムを利用して決めることができる。代案として、蛋白質同一上または類似性はデフォルトパラメターを有するBLASTP、デフォルトパラメターを有するBLASTX、またはデフォルトパラメターを有するTBLASTNを利用して同定することができる（Altschul, S.F.外 Gapped BLAST and PSI-BLAST: A New Generation of Protein Database Search Programs, Nucleic Acid Res. 25: 3389-3402 (1997)、本願にその全体が参考として統合される）。
本発明の実施例はまた、機能的ポリペプチド及びその断片を含む。本願で用語“機能的ポリペプチド”とは定義された機能的分析を通じて同定され、細胞内で特定生物学的、形態学的または表現型変更と関連のある生物学的機能または活性を有するポリペプチドを意味する。用語“ポリペプチドの機能的断片”とはこれに制限されないが、表２に記載された機能を含む活性を保有したポリペプチドの全ての断片を意味する。例えば、生物学的機能断片は抗体分子に結合できるエピトープEだけ少ないポリペプチド断片から細胞内で表現型的変化の特徴的誘導またはプログラミングに参与できる大きなポリペプチドで、その大きさにおいて多様である。
ポリペプチドの生合成または生物学的経路における役割だけでなく、活性はまた、生分析に利用されてポリペプチドの生物学的活性断片、変異体及び変種及び関連ポリペプチドを同定することができる。分析を行ってポリペプチドの酵素学的活性を検定することができる。
一次アミノ酸序列の少ない変形によって、本願で序列番号５２〜６８で記載されたポリペプチドと実質的に同等な活性を有する蛋白質が生成される。そのような変形は例えば、部位指定変異体によって故意的であるか、または自発的であり得る。このような変形によって生成された表２に記載されたような生物学的活性を有する変形ポリペプチドが本願に含まれる。また、一つ以上のアミノ酸の結実もまた、その活性を非常に変更させずに結果分子の構造を変形させる。これによってより広い有用性を有するより少ない活性分子を開発することができる。
本発明のポリペプチドはこれに制限されないが、免疫沈殿法、SDS-PAGE、免疫ブロッティング及びクロマトグラフィを含む標準分析方法によって分析することができる。また、本願実施例に記述したような生体内で合成された（IVS）蛋白質分析を利用して蛋白質産物を分析することができる。
本発明は他の側面で、序列番号５２〜６８のポリペプチド、これと実質的に同一な序列、または少なくとも５，１０，１５，２０，２５，３０，３５，４０，５０，７５，１００，１５０，２００，３００，４００，５００，６００またはそれ以上の連続アミノ酸を含むその断片のうちの一つと少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または約９５％以上の相同性を有するポリペプチドまたはその断片を含む。相同性は、比較されるポリペプチドまたは断片を整列させ、それらの間のアミノ酸同一性または類似性程度を決める本願に記述された方法のうちの一つを利用して決めることができる。
代案として、相同ポリペプチドまたは断片は生化学的強化または精製過程を通じて得ることができる。潜在的に相同のポリペプチドまたは断片の序列は蛋白分解消化、ゲル電気泳動及び／またはマイクロ序列分析によって決めることができる。前述されたプログラムのうちのいずれか一つを利用して、序列番号５２〜６８及びこれと実質的に同一な序列のポリペプチド、または少なくとも約５，１０，１５，２０，２５，３０，３５，４０，５０，７５，１００，１５０，２００，３００，４００，５００，６００またはそれ以上の連続アミノ酸を含むその断片のうちの一つと潜在相同ポリペプチドまたは断片の序列を比較することができる。
本発明の相同アミノ酸または核酸序列は好ましくは十分なポリペプチドのアミノ酸序列または遺伝子の核酸序列を含み、当業者が序列の受動的評価、またはBLAST （Altschul,外, Meth Enzymol. 266:460, 1996; and Altschul,外, Nature Genet. 6:119, 1994、それ全体が本願に参照として統合される）のようなアルゴリズムを利用したコンピュータ自動化序列比較及び同定によってポリペプチドまたは遺伝子を同定することができるようにする。BLASTはKarlinとAltschulの統計学的方法を利用するblastp、blastn、blastx、tblastn、andtblastxプログラムで利用される発見的検索アルゴリズムdlek.（www.ncbi.nih.gov／BLASTから使用可能、Altschul,外, J. Mol. Biol. 215:403, 1990）。前記BLASTプログラムは、例えば対象序列との相同を同定するための序列類似性サーチのために調整することができる。前記BLASTページは検索のためのいくつかの相異なるデータベースを提供する。これらデータベースのうちの一部、例えばecoli、dbEST及びmonthはNCBI（National Center for Biotechnology Information）データベースのサブセットである反面、他の物、例えばSwissProt、PDB及びKabatは外部ソースから編集されたものである。蛋白質BLASTによって蛋白質序列を投入し、これらを他の蛋白質序列と比較することができる。
インターネットウェッブサイトwww.ncbi.nlm.nih.govで利用可能な５個のBLASTプログラムで次の作業を行った:
blastp-蛋白質序列データベースと入力で与えられたアミノ酸序列の比較
blastn-ヌクレオチド序列データベースと入力で与えられたヌクレオチド序列の比較
blastx-蛋白質序列データベースと入力で与えられたヌクレオチド序列（両側鎖）の６-フレームで翻訳した概念的翻訳生成物の比較
blastn-６個の全てのリーディングフレーム（両側鎖）でダイナミックに翻訳されたヌクレオチド序列と入力で与えられた蛋白質序列の比較
tblastx-ヌクレオチド序列データベースの６-フレーム翻訳物と入力で与えられた序列の６-フレーム翻訳水の比較
二つの序列の間に相同成果類似性を決める他のコンピュータプログラムとしてはGCGプログラムパッケージ（Devereux,外, Nucl. Acids Res. 12:387, 1984、本明細書に参照する）及びFASTA（Atschul,外, J Molec. Biol. 215:403, 1990、本明細書に参照する）などがあり、これに限られるわけではない。“相同性”とは二つの比較された蛋白質の間で同一なアミノ酸の％を意味する。“類似性（％類似性）”とは二つの比較された蛋白質の間で類似なアミノ酸の百分率を意味する。
［抗体］
本発明はまた、いかなるポリペプチドまたはその抗原性断片と免疫反応する抗体を提供する。一実施例において、抗体は多クローン性抗体、互いに異なるエピトープ特異性を有する集団化された単クローン性抗体で必須的に構成されていることがあり、互いに区別される単クローン性抗体の製法も提供する。単クローン性抗体はこの分野でよく知られた蛋白質の断片を含む抗原で作ることができる（Kohler,外, Nature, 256:495, 1975、本明細書に参照として記載される）。
本発明で“抗体”とはポリペプチドに存在するエピトープ決定因子に結合できる完全な分子及びFab、F（ab’）２、及びFvのような断片を含む。そのような抗体断片はその抗原または受容体に選択的に結合することができる。
これら断片を製造する方法はこの分野においてよく知られている。（Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1988)、本明細書に参照として記載される）。
本発明で“エピトープ”とは抗体のパラトープが結合する抗原での抗原決定因子を意味する。エピトープ決定因子は、頻繁にアミノ酸または唐の外側枝鎖のような化学的に活性を有する表面グループからなっており、特異的電荷特性だけでなく、特異的３次元構造特性を有する。
本発明のポリペプチドに結合する抗体は免疫抗原として小さいペプチドを含む完全なポリペプチドまたは断片を使用して製造することができる。例えば、ポリペプチドのN-またはC-末端ドメインに特異的に結合する抗体を製造することが好ましい。動物を免疫化するために使用されるポリペプチドまたはペプチドは翻訳されたcDNAから誘導されたり、化学的に合成されたりまたはさらに好ましくはキャリア蛋白質に共役することができる。免疫化ペプチドと化学的に結合されるキャリアのうち、現在主に使用されているものとしては、キーホール リンペットヘモシニアン（KLH）、サイログロブリン、ウシ血清アルブミン（BSA）、及び破傷風トキソイドがある。
多クローン性または単クローン性抗体はさらに精製することができ、例えば、抗体が生成されるポリペプチドまたはペプチドに結合される基質に結合した後、分離させることができる。単クローン性抗体だけでなく、多クローン性抗体の精製及び／または濃縮に対する免疫分野で通常の多様な技術はこの分野の通常の知識を有する者であればよく分かる。（Coligan,外, Unit 9, Current Protocols in Immunology, Wiley Interscience, 1994、本明細書に参照される）。
エピトープの類似体である多クローン性抗体を生成させるための抗-イディオタイプ技術を使用することもやはり可能である。例えば、第１多クローン性抗体で作られる抗-イディオタイプ多クローン性抗体は変異性領域に結合ドメインを有するが、これは第１単クローン性抗体によって結合されるエピトープの“イメージ”である。
ラムダ gt１１のようなcDNA発現ライブラリーで本発明のポリペプチドのエピトープの特異的抗体を使用するポリペプチドを間接的に検索することができる。そのような抗体は多クローン性または単クローン性で誘導することができ、本発明のcDNA序列の存在を示す発現生成物を検出するのに使用しても良い。
［本発明の遺伝子またはポリペプチドと反応したり結合する分子の検出］
本発明の他の実施例は遺伝子及び蛋白質の発現を誘導したり阻害することができる蛋白質、小さい分子または他の化合物を検出したり同定する方法を提供する。前記分析法は形質転換されたり形質転換されない細胞、不滅化された細胞株を使用して実験管内または形質転換された植物モデルを使用する生体内で実施することができる。特に、前記分析法は増加したり減少したmRNA発現、増加したり減少した蛋白質生成物の水準、または再組合生成物で５’調節領域に結合されたマーカー遺伝子（例えばベータ-ガラクトシダーゼ、緑色蛍光蛋白質、アルカリ性ホスファターゼまたはルシフェラーゼ）の増加したり減少した発現水準に基づいて遺伝子や蛋白質の増加したり減少した発現を検出することができる。特定ポリペプチドを発現する細胞または特定ポリペプチドを発現するように形質転換された細胞は培養され、一つまたはそれ以上の実験用化合物を培地に添加する。前記化合物が遺伝子の発現を誘導したり阻害するための十分な時間、例えば０〜７２時間またはそれ以上の時間が経過した後、確立された基礎水準で発現水準の変化を前述された技術を利用して検出することができる。
本発明の他の実施例では、本発明の序列と結合したり、他の方法で間接的に反応する蛋白質及び他の化合物を同定するための方法を提供する。前記蛋白質及び化合物は結合力を有して植物生長調節子になれる再組合、合成及び他の外因的化合物だけでなく、生体内で本発明の序列と反応して農業生成物に対し新たなターゲットを提供する内人の細胞性成分を含む。したがって一連の実施例において、HTS蛋白質またはDNAチップ、細胞溶出物または組織均質物は正常であるか突然変異遺伝子のうちの一つに結合する蛋白質または他の化合物で検出することができる。または多様な外部化合物の中で自然的生成及び／または合成物（例えば、小さい分子及びポリペプチドのライブラリー）が本発明の序列に結合力を有するかどうかを調査することができる。
多様な実施例において、序列番号５２〜６８からなる群より選択されるポリペプチドが他の結合部分に結合しているかどうかを検出するために分析をすることができる。これらの分析で、ポリペプチドは機能的ドメインまたは抗原性決定因子を含む正常であるか突然変異である蛋白質を含んだり、これから誘導することができる。結合の有無は非特異的方法（例えば、転写調節、変形されたクロマチン構造、特異的ディスプレイ、２次元ゲル電気泳動、特異性ハイブリダイゼーションまたはSAGE法によって検出できる他のダウンストリーム遺伝子でのペプチド生成または変化（ peptide production or changes in the expression of other downstream genes which can be monitored by differential display, 2D gel electrophoresis, differential hybridization, or SAGE methods ）または免疫沈降法、分子生物学的相互作用分析（BIAcore））または蛋白質ゲル電気泳動の変形法のような間接的な方法で検出することができる。好ましい方法は下記に記述する変形された方法を含む:（１）親和性クロマトグラフィによる間接的な抽出（２）免疫沈降法によるポリペプチド成分及び結合された蛋白質または他の化合物の分離（３）BIAcore分析及び（４）イーストツー-ハイブリッドシステム。
本発明の他の実施例では正常なまたは突然変異ポリペプチドを調節することができる蛋白質、小さい分子及びその他の化合物を同定する方法を提供する。
本発明の他の実施例によれば、本発明の遺伝子序列の発現、本発明のポリペプチドの活性、本発明のポリペプチドによって調節される他の遺伝子の活性、正常なまたは突然変異蛋白質と相互反応する蛋白質の活性、本発明のポリペプチド細胞内位置確認、本発明のポリペプチド転写活性、存在または水準の変化、または植物及び動物で正常な、そして変形された活性を有する細胞を区分する他の分子化学、組織学または生理学的マーカーの細胞内位置確認、ポリペプチドの転写活性、存在または水準の変化に対する影響力に基づいて化合物を検出する方法を提供する。遺伝子または蛋白質に対する活性を有する化合物を同定する方法は、正常細胞または植物、本発明の形質転換された細胞及び植物モデルまたは正常であるか突然変異遺伝子を含む対象から得られる細胞を使用して実施することができる。
本発明の他の特徴によれば、本発明の蛋白質はリガンドまたは他の形態の小さい化学分子を提供するための理論化学デザインに対する始発点として利用することができる。または前記記載された分析方法によって同定された小さい分子または他の化合物は植物の生物学的調節者をデザインする時“先導的な化合物”として提供することができる。
［遺伝子発現及び蛋白質生成に対する発現ベクター及びその用途］
本発明の序列は遺伝子序列を適当な宿主細胞に移して転移させることによって実験管内で発現することができる。“宿主細胞”はコーディング領域を含むベクターが成長し、そのDNAが発現できる細胞を意味する。前記用語は、例えば下部宿主細胞であるある子孫または移植物質を含む。全ての子孫は複製中に突然変異が起こり得るので母細胞と同一でないことがある。しかし、そのような子孫は宿主細胞に含まれても良い。外来遺伝子が持続的に維持されることを意味する安定な転移方法はこの分野でよく知られている。
本発明によるポリペプチド序列は再組合発現ベクターに挿入することができる。“再造合計発現ベクター”または”発現ベクター”はプラスミド、ウイルスまたは遺伝子序列の挿入または統合によって操作される、この分野で知られた他の運搬体のことを意味する。そのような発現ベクターは挿入された序列の効率的な転写を促進するプロモータ序列を含む。発現ベクターはまた、一般に複製開始点、プロモータ、及び形質転換細胞の表現型選別を可能にする一つまたはそれ以上の遺伝子を含む。
コーディング序列及び適当な転写／翻訳調節信号を含む発現ベクターを製作するのに使用できる方法は、この分野でよく知られている。これらの方法は実験管内再組合DNA技術、合成技術及び生体内再組合／遺伝子技術を含む。
多様な宿主-発現ベクターシステムは複数形態の有機体でコーディング序列を発現させるのに使用することができる。これらはコーディング序列を含む再組合バクテリオファージDNA、プラスミドDNAまたはコスミドDNA発現ベクターに形質転換されたバクテリアのような微生物コーディング序列を含む再組合イースト発現ベクターに形質転換されたイースト再組合ウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス（CaMV）タバコモザイクウイルス（TMV））に感染された植物細胞システムまたはコーディング序列を含む再組合プラスミド発現ベクター（例えば、Tiプラスミド）に形質転換された植物細胞システムコーディング序列を含む再組合ウイルス発現ベクター（例えば、かん状ウイルス）に感染された昆虫細胞システムまたはコーディング序列を含む再組合ウイルス発現ベクター（例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、ワクシニアウイルス）に感染された動物細胞システムまたは安定な発現のための形質転換された動物細胞システムを含むが、これに限られるわけではない。
構成性及び誘導性プロモータ、転写エンハンサー要素、及び／または転写終結因子を含む複数の適した転写及び翻訳要素のいずれも発現ベクターに使用することができる。（Bitter,外, Methods in Enzymology 153:516, 1987、本明細書に参照として言及される）。これら要素の選択は使用された宿主／ベクターシステムによって多様になり得る。選択された特定プロモータは十分な発現を誘発させることができ、効果的な量の遺伝子生成物を得ることができる。本発明のベクター構成に使用されたプロモータは変更されてその特性調節に影響を与えることができる。
例えば、バクテリアシステムにクロニングする時、バクテリオファージのpL、plac、ptrp、ptac（ptrp-lacハイブリッドプロモータ）などのような誘導性プロモータを使用することができる。哺乳類細胞システムにクロニングする時、哺乳類細胞のゲノムから誘導されたプロモータ（例えば、メタロチオネインプロモータ）または哺乳類ウイルスから誘導されたプロモータ（例えば、レトロウイルスの長い末端リピートアデノウイルスの後期プロモータワクシニアウイルス７．５Kプロモータ）を使用することができる。植物宿主細胞に使用できる適したプロモータは、例えば、目的遺伝子の本来のプロモータだけでなく、CaMV 35Sプロモータ、the Agrobacterium-誘導プロモータノパリン合成酵素（NOS）及びオクトピン合成酵素（OCS）、ライスチューブリンOsTubA１プロモータ、大豆hsp１７．５-Eまたはhsp１７．３-Bのような熱衝撃プロモータ、誘導性または組織-特異的プロモータを含む。再組合DNAにまたは合成技術によって生成されたプロモータがまた、挿入されたコーディング序列の転写に提供されても良い。
前述された方法によって同定された外来核酸によって暗号化される蛋白質の発現後に前記蛋白質を精製することができ、前述された方法、例えば、構造特性研究、蛋白質-蛋白質相互作用研究、蛋白質-核酸相互作用研究などのような方法を使用することができる。再組合で発現されたポリペプチド、またはその断片の分離及び精製は小規模のクロマトグラフィ及び単クローン性または多クローン性抗体を含む免疫学的分離を含む種来の方法によって実施することができる。適した方法の例を下記に記載する。
蛋白質精製技術はこの分野でよく知られている。同定された外来核酸で暗号化され、発現された蛋白質はポリエチレングリコールを利用した沈降法のような方法で部分的に精製することができる。また、蛋白質のエピトープ標識は蛋白質の単純な一つの段階を通じた精製が可能にする。また、イオン交換クロマトグラフィ、ゲル透過、ヒドロキシアパタイトコラム、固定化反応性染料、クロマトフォーカシングの使用及び高速液体クロマトグラフィのようなクロマトグラフィ法が蛋白質精製に利用できる。１次元ゲル電気泳動、高解像度の２次元ポリアクリールアミド電気泳動、等電点電気泳動のような電気泳動法及び他の方法が精製方法として考慮できる。また、抗体コラム、リガンド提示コラム及び他の親和性クロマトグラフィマトリックスを含む親和性クロマトグラフィ法も本発明の精製方法として考慮することができる。
序列番号５２〜６８のうちの一つ及びこれと実質的に同一な序列のポリペプチドを暗号化する遺伝子から生成された精製された蛋白質または少なくとも５，１０，１５，２０，２５，３０，３５，４０，５０，７５，１００，１５０，２００，３００，４００，５００，６００またはそれ以上の連続的なアミノ酸を含む切片は有用な反応試薬を作りだすための多様な方法に使用することができる。本発明の一実施例におけるベクターで発現された蛋白質に対する抗体を生成させることができる。発現された蛋白質に対する単クローン性及び多クローン性抗体を作ることもできる。単クローン性または多クローン性抗体を生成させるための方法はこの分野でよく知られている。また、前述した抗体から製造された抗体断片の製造も考慮することができる。
本発明の精製された蛋白質の他の適用例は、本発明の多様な標的蛋白質に対して活性を有する候補化合物で小さい分子ライブラリーをスクリーンすることである。この分野においてよく知られた組合化学での発展は標的蛋白質に結合したりまたは阻害活性を有し得る複数の候補化合物を生成させるための方法を提供する。したがって、同定された遺伝子から生成される標的蛋白質に対して親和性または阻害活性を有する化合物に対して小さい分子ライブラリーをスクリーニングすることが本発明で考慮できる。
［本発明の遺伝子を利用した遺伝子変形に対するベクター］
植物細胞の形質転換に使用されるベクターは序列番号５２〜６８のアミノ酸序列のうちの一つを含む蛋白質の活性または水準を減少させる序列を暗号化する核酸序列を含む。例えば、序列番号５２〜６８のアミノ酸序列のうちの一つを含む蛋白質の活性または水準は前述されたようにアンチセンス核酸、相同性アンチセンス核酸、リボザイム（Welch外, (1998) Curr Opin. Biotechnol. 9:486-496; Samarsky,外, (2000), Curr. Issues Mol. Biol. 2:87-93）;またはプロモータと作動可能に連結された二本鎖RNA（Sharp, (1999), Genes Dev. 13:139-141、本明細書に参照として言及される）であっても良い。本発明による形質転換を開始するために、まず、適当なベクターを製造し、植物細胞に導入することが必要である。ここで利用されたベクターの製造の詳細な事項は植物遺伝子操作技術分野でよく知られている。
本発明の誘電的変形された植物は序列番号５２〜６８のアミノ酸序列のうちの一つを暗号化する少なくとも一つの核酸を含むベクターと植物細胞を接触させることによって生成することができる。植物細胞に一応導入された後、効果を増大させるために核酸序列は遺伝子の転写を誘発させるのに植物細胞で効果的な核酸と作動可能に連結されなければならない。また、植物細胞で認識されるポリアデニル化序列または転写調節序列を利用することができる。挿入された核酸序列を有するベクターが一つまたはそれ以上の選択可能なマーカー遺伝子を含んで培地で形質転換されない細胞で形質転換された細胞が選別できるようにすることが好ましい。
この分野の技術者は相対的に損傷されていない状態で好ましい核酸序列を導入するために必要な適当なベクターを選択することができる。したがって、導入されたDNA序列を運搬する植物を生成させることができるいかなるベクターでも充分である。DNAそのままの一部を使用しても低い効率でありながら本発明の特性を提供すると期待される。ベクターの選択またはベクターを使用するかどうかのことは一般に選択された形質転換方法によって左右される。
植物で遺伝子発現のためのベクターは植物で機能的な複数のプロモータのうちのいずれも含むことができる。多くの形態の植物で誘導されたプロモータだけでなく、植物で機能的な他の供給源から誘導されたプロモータも現在よく知られている。いくつかの形態の植物-誘導されたプロモータは常に活性を有することができる。他のものは特定環境または細胞形態でのみ活性を有することができる。後者の例としては組織特異的、発生学的に特異的な、ストレス-特異的または環境的に特異的なプロモータがある。また、発生学的、組織-特異的及び環境的に誘導可能なプロモータは遺伝子序列の上位調節領域で結合されて好ましい植物表現型を生成するために空間的及び時間的生産を調節することができる。
“作動可能に結合された”とはプロモータ序列とプロモータによって調節される核酸序列の間の機能的連結を意味する。作動可能に連結されたプロモータは核酸序列の発現を調節する。
序列番号５２〜６８のアミノ酸序列のうちの一つを含む蛋白質の発現は複数のプロモータによって開始することができる。注目される構造遺伝子の生来のまたは本来のプロモータは遺伝子の転写調節に使用されたり、外来調節序列になり得る。植物発現ベクターに対して適当なウイルスプロモータはCaMVの３５S RNA及び１９S RNAプロモータ（Brisson,外, 1984, Nature, 310:511, 1984; Odell,外, Nature, 313:810, 1985); Figwort Mosaic Virus (FMV)の全長転写プロモータ（Gowda,外, J. Cell Biochem.,13D: 301, 1989）及びTMVに対するコート蛋白質プロモータ（Takamatsu,外, EMBO J.6:307, 1987）を含み、前記文献は本明細書に参照として言及されている。また、リブロースビスホスフェートカルボキシラーゼ（ssRUBISCO）の小さいサブユニットの光-誘導性プロモータ（Coruzzi,外, EMBO J., 3:1671, 1984; Broglie,外, Science, 224:838, 1984）;マノピン合成プロモータ（Velten,外, EMBO J., 3:2723, 1984）ノパリン合成酵素（NOS）及びオクトピン合成酵素（OCS）プロモータ（Agrobacterium tumefaciensの腫よう-誘導性プラスミドによって運搬される）または大豆hsp１７．５-Eまたはhsp１７．３-Bの熱衝撃プロモータ（Gurley,外, Mol. Cell. Biol., 6:559, 1986; Severin,外, Plant Mol. Biol., 15:827, 1990）のような植物プロモータを使用することができ、前記文献は本明細書に参照として言及されている。
本発明に有用なプロモータは設計されたプロモータだけでなく、本来の構成性及び誘導性プロモータを全て含む。CaMVプロモータは構成性プロモータの一例である。最も好ましくは、誘導性プロモータは１）誘導物質のない状態で低い発現を提供し２）誘導物質が存在する状態で高い発現を提供し３）植物の正常な生理を阻害しない誘導設計を利用し４）他の遺伝子の発現に影響を与えてはならない。植物で有用な誘導性プロモータの例としては、銅イオンによって活性化するイーストメタロチオネインのような化学的手段によって誘導されたプロモータ（Mett,外, Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 90:4567, 1993）;例えば、除草剤緩和剤のように置換されたベンゼンスルフォンアミドによって活性化されるIn２-１及びIn２-２調節序列（Hershey,外, Plant Mol. Biol., 17:679, 1991）;及び糖質コルチコイドによって誘導されるGRE調節序列（Schena,外, Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 88:10421, 1991）があり、本明細書に参照として言及されている。恒常性及び誘導性の他のプロモータはこの分野でよく知られている。
選択された特定プロモータは十分な発現を誘導して効果的な量の蛋白質または序列番号５２〜６８のアミノ酸序列を含む蛋白質の活性または水準を減少させる十分な量の転写体を生成しなければならない。本発明のベクター構造物で使用されたプロモータは調節特性に影響を与えるように変更されることが好ましい。
組織特異的プロモータもまた、本発明に使用することができる。組織特異的プロモータの例としては芽分裂組織で活性を有するプロモータ（Atanassova,外, Plant J., 2:291, 1992）があり、前記文献は本明細書に参照として言及されている。cdc２aプロモータ及びcyc０７プロモータのような形質転換植物に有用な他の組織特異的プロモータはこの分野でよく知られており（Plant Mol. Biol., 24:863, 1994; Martinez,外, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:7360, 1992; Medford,外, Plant Cell, 3:359, 1991; Terada,外, Plant Journal., 3:241, 1993; Wissenbach,外, Plant Journal, 4:411, 1993）、前記文献は本明細書に参照として記載されている。
多くの形態の誘導性プロモータが知られており、乾燥、寒さ、塩ストレス、熱、または栄養ストレスのような環境的条件によって誘導されるものを含む。化合物の外的な適用によって誘導されるプロモータはまた、遺伝子に作動可能に連結することができる。変形しようとする穀物の特定の環境的または発生学的必要を充足するように、他の変形を加えることができる。これらの中でいずれも形質転換植物で好ましい発現特性を有する植物を生成する注目される核酸に連結することができる。
前記注目される核酸は組織-特異的及び環境的に誘導可能なプロモータに全て作動可能に連結されて環境的条件によって調節される作物特性を有する穀物を生成することができる。例えば、注目される核酸は寒さに特異性を有するプロモータ及び種子特異的プロモータに連結することができる。また、注目される核酸は根-特異的プロモータ及び乾燥-特異的プロモータに連結されて水に対しストレスを受ける場合、水の吸入を増加させるために根をさらに多く成長させる。これは悪い環境条件でさらに生存できるようにする。
注目される遺伝子の核酸の転写を調節するための上部領域は一つ以上のプロモータを含むことができ、また、一つ以上のエンハンサーエレメントをさらに含むことができる。例えば、そのような領域は活性-標識付けベクターに存在することができ（Weigel,外, Plant Physiol. 122:1003, 2000）、本明細書に参照として記載される）、カリフラワーモザイクウイルス（CaMV）３５S遺伝子から多量体化された転写エンハンサーを含む。この方法において、前記活性標識付け序列は挿入位置のダウンストリームである内因性遺伝子を上向き調節するために提供される。
択一的に選択できるマーカーは挿入された核酸序列に結合することができる。前記“マーカー”とはマーカーを含む植物または植物細胞の選択またはスクリーニングを可能にする特徴または表現型を符号化する遺伝子を意味する。前記マーカー遺伝子は抗生物質耐性遺伝子であっても良く、これで適当な抗生物質は形質転換されていない細胞の中で形質転換された細胞を選択するのに使用することができる。適した選択可能なマーカーの例としては、アデノシンデアミナーゼ、ジヒドロ葉酸還元酵素、ハイグロマイシン-B-燐酸転移酵素、チミジンキナーゼ、キサンチン-グアニン燐酸-リボース転移酵素及びアミノ-グリコシド３’-O-燐酸転移酵素II（カナマイシン、ネオマイシン及びG４１８抵抗性）がある。他の適したマーカーはこの分野でよく知られている。
前述したように植物に遺伝子転移に適したベクターの成分には多様な選択事項がある。植物形質転換に使用されたベクターは特定適用例に好ましい追加の序列をさらに含むことができる。この分野の技術で植物に所望の遺伝子を運搬する適したベクターを設計することが可能であろう。所望の遺伝子を含む好ましいベクターが製造されれば、ベクター構造物は多様な方法で植物細胞に導入することができ、下記の方法に限定されない。
［本発明の遺伝子を利用した植物形質転換］
“遺伝子変形”という用語は、一つ以上の異種核酸序列、例えば蛋白質-符号化序列または序列番号５２〜６８のアミノ酸序列のうちの一つを含む蛋白質の活性または水準を減少させる序列を一つ以上の植物細胞に導入し、前記植物細胞は完全で、生殖的に競争力を有し、生存可能な植物を生成するのに使用されることを意味する。“遺伝的に変形された”という用語は、前述した過程を通じて生成された植物のことを意味する。本発明の遺伝的に変形された植物は自家授粉または同一種の他の植物と交差授粉することができ、生殖ラインに導入された外部遺伝子が農業的に有用な植物種に挿入されて育種することもできる。“植物細胞”とは原形質体、生殖体-生成細胞及び全体的な植物に再生される細胞を意味する。したがって、全体的な植物に再生できる多重植物細胞を含む種子も植物細胞に含むことができる。
“植物”は全体的な植物、植物部分、植物細胞または、例えば植物組織のような一つのグループの植物細胞のうちのいずれか一つを意味する。苗木も植物に含まれ得る。本発明における植物とは、気を遣って植物、裸子植物、単子葉植物及び双子葉植物のような形質転換技術が適用できるいかなる植物を含む。
単子葉植物の例としては、アスパラガス、トウモロコシ及びあめトウモロコシ、大麦、小麦、米、モロコシ、玉ネギ、竹、ナツメヤシ、トウジンヒエ、ライ麦とオート麦、砂糖キビ、パイナップル及びバナナなどがあり、これに限られるわけではない。双子葉植物の例としては、アラビドプシス、トマト、タバコ、木化、菜種、葡萄、飼料用ソラマメ、大豆、オレガノ、バジル、ペッパー、レタス、エンドウ、アルファルファ、ツメクサ、平地農作物またはブラシカオレラセア（例、キャベツ、ブロッコリー、カリフラワー、キャベツ、大根、ニンジン、砂糖大根、ナス、ホウレンソウ、キュウリ、かぼちゃ、ジャガイモ、メロン、マスクメロン、ひまわり及び多様な観賞植物があるが、これに限られるわけではない。有用な樹木作物の例としては、アボカド、リンゴ、柑橘類、西洋スモモ、サクランボウ、アーモンド、桃、梨、パパイヤ及びマンゴなどがあり、これに限られるわけではない。草本植物種の例としては、ポプラ、松、セコイア、ヒマラヤ杉、及びオークなどがあり、これに限られるわけではない。
“異種の核酸序列”という用語は受容体植物宿主に対して外来種である核酸または本来の核酸が元来の形態から実質的に変更されれば、宿主に対して先天的な核酸を意味する。例えば、前記用語は天然または野生型プロモータとは異なるプロモータに作動的に連結された宿主から由来する核酸を含む。本発明の方法で本発明のポリペプチドを符号化する少なくとも一つの核酸序列はプロモータと作動的に連結できる。ポリヌクレオチドの一つ以上の複写本が遺伝子発現が増加するように植物に導入されることが好ましい。例えば、遺伝子の多くの複写本が植物で遺伝子発現及び／または暗号化されたポリペプチドの生成を増加させる効果を持ってくる。
植物で遺伝子発現の水準を減少させることもまた好ましい。遺伝子発現を減少させるいかなる方法も使用することができるが、一般的な方法としては、アンチセンス技術、抑制、RNA阻害（RNAi）、及びリボザイム阻害などの方法がある。前記アンチセンス方法で、例えばアンチセンス分子が一定遺伝子を含み、細胞に導入されてポリペプチド生成量を減少させる機能をすることができたり、他のメカニズムによって機能することができる。本発明に有用なアンチセンスポリヌクレオチドは相当する標的mRNAの特定領域に対して相補的である。アンチセンスポリヌクレオチドはポリヌクレオチドをコードする核酸分節を含む発現可能な構造物を導入することによって細胞に導入することができる。本明細書でアンチセンスポリヌクレオチドは主に１０〜５０塩基を有するオリゴヌクレオチドだけでなく、遺伝子序列それ自体の長さを超えられる核酸の長い序列も含むことができる。
本発明に使用される核酸序列はAgrobacterium tumefaciensのTiプラスミド、根-誘導性（Ri）プラスミド及び植物ウイルスベクターを使用して植物細胞に導入することができる。（前記技術は下記文献に記載されており、本明細書に参照として記載されている Weissbach & Weissbach, 1988, Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, NY, Section VIII, pp. 421-463; and Grierson & Corey, 1988, Plant Molecular Biology, 2d Ed., Blackie, London, Ch. 7-9, and Horsch,外, Science, 227:1229, 1985）。AgrobacteriumのTiまたは根-誘導性（Ri）プラスミドから誘導された植物形質転換ベクターの他に、リポソーム、エレクトロポレーション、free DNA捕捉を増加させる化学物質、ウイルスまたは花粉を利用した形質転換及びマイクロプロジェクター映写を使用する他の方法を利用することができる。
本発明による植物の形質転換は植物分子生物学分野における通常の技術者に知られた多様な方法で実施することができる。（例えば下記文献参照、Methods of Enzymology, Vol. 153, 1987, Wu and Grossman, eds., Academic Press 、前記文献は本明細書に参照として記載される）。“形質転換”とは核酸序列の導入によって宿主植物の遺伝子型を変形させることを意味する。
例えば、前述したようにTiプラスミドを含むAgrobacterium tumefaciensを利用して植物細胞に核酸序列を導入することができる。形質転換ビヒクルとしてAgrobacterium tumefaciens培養を使用する場合、ベクター運搬体としてアグロバクテリウムの非-腫よう誘発性菌株を使用して形質転換された組織の正常な非-腫よう誘発性分化が可能にすることが有利である。また、アグロバクテリウムは２成分のTiプラスミドシステムを含むことが好ましい。そのような２成分システムは１）トランスファDNA（T-DNA）の植物への導入に必須的異な毒性領域を有する第１Tiプラスミド、及び２）キメラプラスミドを含む。後者は転写された核酸にフランキングする野生型TiプラスミドのT-DNA領域の少なくとも一つの広い領域を含む。２成分のTiプラスミドシステムは植物細胞を形質転換させるのに効果的に見られる（De Framond, Biotechnology, 1: 262, 1983; Hoekema,外, Nature, 303:179, 1983、本明細書に参照として言及される）。
本発明による形質転換でアグロバクテリウムを使用する方法は１）培養且つ分離された原形質体をアグロバクテリウムと共存培養２）アグロバクテリウムで植物細胞や組織を形質転換または３）種子、apicesまたは分裂組織をアグロバクテリウムで形質転換する方法を含む。
また、遺伝子トランスファはBechtold（C. R. Acad. Sci. Paris, 316:1194, 1993、本明細書に参照として言及される）に記載されたようにアグロバクテリウムによる植物形質転換によって行うことができ、本明細書に実施例として例示されている。このような方法はアグロバクテリウム細胞懸濁液の真空ろ過に基づく。
植物細胞に核酸を導入させる好ましい方法は細胞、外植片、分裂組織または種子のような植物細胞を前述した形質転換されたAgrobacterium tumefaciensで感染させる方法である。この分野で知られた適当な条件下で形質転換された植物細胞は幹、根を形成するように成長し、植物にさらに成長する。
また、本発明による核酸序列は機械的または化学的手段によって植物細胞に導入することができる。例えば、核酸はマイクロピペットを使用する顕微注射によって植物細胞に機械的に転写することができる。他の方法として、核酸は細胞によって受け入れられる遺伝子物質と沈降錯体を形成するポリエチレングリコールを使用することによって植物細胞に転写することができる。
核酸序列はまた、エレクトロポレーション法によって植物細胞に導入することができる。（Fromm,外, Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 82:5824, 1985、本明細書に参照として言及される）。この方法で植物原形質体は関連された核酸序列を含むベクターまたは核酸の存在下でエレクトロポレーションすることができる。高い電界強度の電気インパルスは可逆的に膜を透過して核酸を導入させる。エレクトロポレーションされた植物原形質体は細胞壁を形成し、分割されて植物仮骨を形成する。形質転換された遺伝子を有する形質転換された植物細胞の選別は表現型マーカーを使用して行うことができる。
植物細胞に核酸を導入させる他の方法は、導入される核酸が粒子のマトリックス内または表面上に含まれている、核酸を含む小さい粒子を利用する高速弾道浸透手段を利用することができる（Klein外、Nature 327:70, 1987、本明細書に参照として言及される）。Sanford外（Techniques 3:3, 1991）及びKlein 外（Bio／Techniques 10:286, 1992）に記載されたように、衝撃形質転換法を利用することができ、本明細書に参照として言及されている。一般に新たな核酸序列のみを導入することが必要であり、このような方法は特に多重導入を提供する。
カリフラワーモザイクウイルス（CaMV）は植物細胞に核酸を導入するためのベクターとして使用することができる。（米国特許出願第4,407,956号、本明細書に参照として言及される）。CaMVウイルスDNAゲノムはバクテリアで成長できる再組合DNA分子を生成させる親バクテリアのプラスミドに挿入される。クロニング後に再組合プラスミドは再びクローンされて好ましい核酸序列の導入によってさらに変更することができる。その後、前記再組合プラスミドの変形されたウイルス部分は親バクテリアプラスミドで切断されて植物細胞または植物を接種させるのに使用することができる。
本明細書において“接触”とは、前述された化学的及び物理的手段を含むことで、核酸を植物細胞に導入する手段を意味する。好ましくは、接触とは前述したように核酸またはベクターを植物細胞（外植片、分裂組織、または種子を含む）に核酸で形質転換されたAgrobacterium tumefaciens を通じて導入することを意味する。
［植物再生］
一般に、植物細胞は形質転換過程から完全な植物に再生される。形質転換の中間産物を“トランスゲノート”という。本明細書で使用された用語“成長”、または”再生”は植物細胞から完全な植物、一部の植物細胞（種子を含む）、植物の部分、または（例えば、原形質体または組織部分から得られる）植物切れへの成長を意味する。
原形質体からの再生は植物種ごとに多様であるが、一般に原形質体の懸濁液を先に製造する。ある種では、その後、原形質体懸濁液から倍発生が誘導され、天然倍として成熟及び倍発生段階へ進むことができる。培養培地は一般に成長と再生に必要な、多様なアミノ酸とホルモンを含むある。利用されるホルモンの例としては、オーキシン類及びシトキニンを含む。頻繁に培地にプロリンとグルタミン酸を添加すれば有利なことがあり、特に、トウモロコシとアルファルファのような植物種において有利である。有用な再生は培地、遺伝子型及び培養過程に依存的である。これら変数が調節されれば、再生過程は再現可能なことである。
また、再生は植物仮骨、移植片、組織または一部からも可能である。形質転換は組織または植物一部再生でも行うことができる（Methods in Enzymology, Vol. 118, and Klee, et al., Annu. Rev. Plant Physiol., 38:467, 1987、これら文献はその全体が本明細書の参考文献として併合されている）。Horschなどの葉ディスク形質転換-再生方法（Horsch外、Science, 227:1229, 1985参照、これら文献はその全体が本明細書の参考文献として併合されている。）を利用する場合に、選択培地でディスクを培養し、次いで約２〜４週間シュートを形成する。発生したシュートを仮骨から切断し、適した根誘導性選択培地に移植する。根が形成されるやいなや、根が出た小さい苗木を土壌に移植する。必要であれば、成熟するまで前記小さい苗木を他の花粉に移し植える。
無性的に繁殖する作物においては、切断または組織培養技術を利用して複数の同一植物体を生産し、成熟した形質転換植物を繁殖させる。所望の形質転換植物を選択し、商業的用途のために新たな品種を得て、無性的に繁殖させる。
有性的に繁殖される作物においては、成熟した形質転換植物を自家交配して同種繁殖植物を得ることができる。前記同種繁殖植物は新たに導入された外来遺伝子を含む種子を生産する。これら種子を成長させて選択された表現型を生産する植物体を生産することができる。一つ以上の再生された植物の部分、例えば、花、種子、葉、枝、根、実などもこれらの部分が前記のように形質転換された細胞を含んでおり、本発明に含まれる。前記再生された植物の子孫、変形体及び突然変異が導入された核酸序列を含んでいれば、また、前記子孫、変形体及び突然変異も本発明に含まれる。本発明は植物組織及び種子の他にも本発明の方法によって生産された植物も含む。
他の具体的な例において、本発明は遺伝的に変形された植物細胞を生産する方法を提供し、前記植物細胞から再生された植物は野生型植物と比較する時、変形された表現型を示す。前記方法は植物細胞と核酸序列を接触させて形質転換された植物細胞を得て、前記形質転換された植物細胞を再生に適した条件下に成長させ、変形された表現型を有する植物を得ることを含む。前記核酸を含む再生された植物の無性繁殖、アポミクシス生殖、または有性生殖によって子孫を生産することもできる。環境及びプロモータ-誘導性条件のような条件は種ごとに多様であり、本技術分野における通常の知識を有する者が任意の条件を決めることができる。
本発明の他の様相において、植物細胞または植物で本発明による遺伝子の発現増加によって植物害虫または植物病源体に対する植物細胞または植物の抵抗性を増加させる。また、本発明による遺伝子の発現増加は殺虫剤に対する植物の抵抗性を増加させることによって除草剤毒性緩和剤として作用することもできる。“毒性緩和剤”という用語は天然植物代謝経路を活性化することによって特定化学剤（例、殺虫剤）に反応する遺伝子のことを意味する。
図３乃至１７は優先的に発現されるGUS-標識遺伝子１７個の具体的例を示す。T-DNAの位置、例えばGUS-陽性発現を詳細に示している。以下では本発明の方法を利用して発見した数個の遺伝子と、これらが暗号化したポリペプチド列挙している。
［本発明による遺伝子とポリペプチド、これらの稲でGUS-標識発現特性、及び潜在的な農耕用途を記述している。］
１b-１１５-２２:（ゲノム序列を含む序列番号１８、挿入序列の一部とゲノム序列の一部を含む序列番号１、暗号化序列を含む序列番号３５，アミノ酸序列を含む序列番号５２）前記遺伝子はゲルミンに相同性を有する蛋白質を暗号化する。ゲルミン発芽過程中に発現される穀類糖蛋白質であり、これは発芽成長の間に細胞壁特性を変化させるのに重要な役割を果たすこともできる。したがって、いくつかの具体的な例において、前記遺伝子を使用して糖蛋白質水準を変化させたり、稲粒からカビ病源体に対する抵抗性を増加させることもできる。図３にはT-DNA／GUS挿入部位を示す図表と標識遺伝子の発現特性を示している。
いくつかのゲルミンはシュウ酸オキシダーゼ活性を示すと知られている（Lane外、1993, J. Biol. Chem. 268: 12239-12242、この文献はその全体が本明細書の参考文献として併合される）。前記シュウ酸オキシダーゼ活性はシュウ酸塩を酸化的に分解してH２O２を発生させる。ゲルミンは倍発生、発芽、塩ストレス、病源体誘導または重金属ストレスの間に蓄積されると知られた。
ゲルミンによるH２O２生成は病源体に対する植物防御反応に役割を果たすと考えられる（Patnaik and Khurana, 2001, Indian Jour. Exp. Biol. 39:191-200、この文献はその全体が本明細書の参考文献として併合される）。シュウ酸オキシダーゼ活性を有するゲルミンを暗号化する遺伝子に形質転換された作物はシュウ酸を毒素として使用するカビ病源体に対する抵抗性が増加すると現れた（Thompsonetal外、1995, Euphytica, 85, 169-172、この文献はその全体が本明細書の参考文献として併合される）。他の報告によれば、生物的及び非生物的ストレス全てに対し植物の反応にゲルミンが関することを提示している（Woo外、2000, Nature Structural Biology, 7: 1036-1040、この文献はその全体が本明細書の参考文献として併合される）。
本発明による遺伝子が暗号化する蛋白質は“ゲルミン-類似”アミノ酸序列を有するので、ゲルミンとその特性が類似している。本発明でGUS位置研究によれば、稲のゲルミン-類似蛋白質を暗号化する遺伝子は複数の類型のトリコム（例えば、葉、小花梗、花軸、内花頴及び外花頴）で発現され、これは前記特別な蛋白質が環境攻撃に対して稲を保護するのに重要な役割を有していることを追加的に示す。したがって、本発明による遺伝子を過発現する稲または他の植物類は数個の植物ストレスに対する抵抗水準を増加させることができる。
本発明の一例において、構成的にまたは誘導される条件のうちのいずれか一つで本発明による遺伝子を高い水準に発現することを遺伝的に加工された植物を製造するのに利用することもできる。植物のトリコムで蛋白質を常に高い水準に発現する植物は病源体の攻撃にさらに高い抵抗性を有することができる。あるいは、いくつかの条件において、病源体の攻撃だけでなく、前記遺伝子を高い水準に発現する植物を製造するのに有用である。
ゲルミン-類似シュウ酸オキシダーゼの役割に対して提案されたひとつは、これらが細胞死滅機作に関するということである（Lane, 2000, Biochem Jour. 349:309-321、この文献は本明細書にその全体が引用文献で併合される）。したがって、植物で前記蛋白質の発現のための遺伝的変形によって細胞死滅機作が変化することがある。例えば、病源体特異的誘導プロモータに関する遺伝子が過発現されることによって、問題になる病源体が感染される場合、死滅されるようにプログラム化された器官または領域を有する植物を生産し、恐らくこれは植物に対して感染剤の移動を阻害する。
１b-１６４-４３:（ゲノム序列を含む序列番号１９、挿入序列の一部とゲノム序列の一部を含む序列番号２、暗号化序列を含む序列番号３６、アミノ酸序列を含む序列番号５３）前記遺伝子は他のオキシダーゼ（AOX1a）蛋白質に相同性を有する蛋白質を暗号化し、いくつの一例で発生する花粉グレーンに増加した保護力を提供する。図４には、T-DNA／GUS挿入体の挿入部位を示す図表と標識遺伝子の特性を示す写真を示している。前記遺伝子のGUS-陽性発現は花粉粒で発見される。
他のオキシダーゼはミトコンドリアから２番目ターミナルオキシダーゼとして使用され、これは標準電子伝達鎖から電子を迂回させる。前記電子は還元されたユビキノールから直接酸素に伝達されて水を生成する。AOX経路を通じた電子の移動過程で遊離される自由エネルギーは熱としてなくなる。したがって、前記経路は熱生産機作として見なされることができる。面白いことには、低温に反応して稲の他のオキシダーゼ転写体の発現が増加する。
標準電子伝達鎖に比べて他のオキシダーゼ経路を使用することは活性酸素中間体の生成を減少させるのに有利である。（Seidow and Day, (2000), in Biochemistry and Molecular Biology of Plants, American Society of Plant Physiologists, B. Buchanan, Ed., pp 696-706、この文献はその全体が参考文献として本明細書に併合される）、したがって、ある生理的状態または環境条件下では、前記AOX経路が標準経路より優先時できる。前記遺伝子の発現水準または誘導特性を変化させる誘電変異は農業経済的に利用することができる。例えば、花粉粒発生過程で前記遺伝子の発現が増加することによって、花粉穀物の発達に保護効果が増加する。他の例としては、前記遺伝子が変化して花粉粒だけでなく、他の植物組織で生産することもできる。AOXが熱生成機作として作用するという可能性は、例えば、組織の温度を少し増加させることによって花粉穀物の発生を低温損傷から保護することができる。遺伝的操作を通じて、花粉粒組織発生中の低温ストレス下でAOX遺伝子発現を増加させることができる。これは低温ストレス下で花粉粒組織の温度を増加させ、恐らく低温関連損傷から花粉穀物の発生を保護することができる。
１b-１９２-４０:（ゲノム序列を含む序列番号２０，挿入序列の一部とゲノム序列の一部を含む序列番号３、暗号化序列を含む序列番号３７、アミノ酸序列を含む序列番号５４）前記遺伝子はXA２１-類似蛋白質キナーゼを暗号化し、いくつかの例の稲で疾病抵抗性を増加させるのに使用される。類似な蛋白質が病源体防御過程に関与すると明らかになったために、類似Xa２１蛋白質は疾病抵抗性機作に関与されると見なされる。図５は、T-DNA／GUS挿入体の挿入部位を示す図表と標識遺伝子の発現特性を示す図面である。
病源体に対する抵抗性遺伝子は一群の抵抗性遺伝子または“R”遺伝子と言い、これらのうちのいくつかはキナーゼを暗号化する。稲の細菌性胴枯病に対する抵抗性遺伝子、Xa２１は細菌性胴枯病に対する抵抗性に関するキナーゼを暗号化する。前記遺伝子によって暗号化された蛋白質はキナーゼドメインだけでなく、ロイシン-リッチ反復領域を含む（Liu外、JBC Papers in press, pub date: April 1, 2002, as Manuscript #、文献全体が参考文献として本明細書に併合される）。Xa２１のキナーゼドメインは複数のセリンとスレオニン残基を自家リン酸化するということが確認された。
本発明による遺伝子によって暗号化された蛋白質はXa２１に相同性を有するので、バクテリア病源体に対する類似な抵抗性を提供することができる。したがって、細菌性胴枯病が特に問題となる地域で成長する稲で前記蛋白質を過発現させることを利用する。前記遺伝子を操作して病源体の攻撃に反応して誘導させたり、病源体の攻撃に先行して頻繁に存在する条件（例えば、温度変化、栄養ストレス）下で発現可能にすることができる。
最後に、本発明による前記遺伝子は稲の発生中の花の内花頴及び外花頴に位置する。前記蛋白質が病源体抵抗性に関与するとすれば、これらトランス遺伝子の発現を調節して病源体に感染される可能性の高い組織で優先的に高い水準に発現させ、感染される可能性のない組織で発現させないことが好ましい。
１b-２０７-２７:（ゲノム序列を含む序列番号２１、挿入序列の一部とゲノム序列の一部を含む序列番号４、暗号化序列を含む序列番号３８、アミノ酸序列を含む序列番号５５）前記遺伝子は受容体-類似蛋白質キナーゼと相同性を有する蛋白質を暗号化し、いくつかの例で稲粒の発生を変化させることができる。前記遺伝子は子房と鱗被で発現される。前記キナーゼドメインは前記蛋白質のC-末端半分に位置する。
図６には、T-DNA／GUS挿入体の挿入部位を示す図表と標識遺伝子の発現特性を示す写真を示す。前記遺伝子は子房と鱗被だけでなく、花の内花頴／外花頴領域で発現された。前記蛋白質は多様な環境的及び発生的刺激の受容体として機能することもできる。前記キナーゼは子房に存在するために、前記遺伝子の変異は実発生または種子発生のような事件に影響を与える信号機作を変化させることによって、変化した表現型を有する植物を得ることができる。
１b-１３８-０７:（ゲノム序列を含む序列番号２２、挿入序列の一部とゲノム序列の一部を含む序列番号５，暗号化序列を含む序列番号３９、アミノ酸序列を含む序列番号５６）前記遺伝子はアミノ酸分解経路に関与するメチルマロネートセミ-アルデヒド脱水素化酵素（MMSDH１）を暗号化し、いくつかの例で低温ストレスに対して保護したり、例えば、穀物成熟期に栄養分配をを助けることができる。本発明の方法によって、前記遺伝子の発現を稲の葉、花粉粒及び花軸に位置させることができる。図７はT-DNA／GUS挿入体の挿入位置を示す図表と標識遺伝子の発現特性を示す写真である。
MMSDH１は広範囲なクラスの酸化還元酵素に属する。MMSDH１は供与分子のアルデヒド基またはオキソ基として作用する。受容分子はNAD+またはNADP+である。MMSDHはマロン酸塩及びメチルマロネートセミアルデヒドを不可逆的に酸化的脱カルボキシル化してアセチル-及びプロピオニル-CoAを生成する触媒として機能すると見なされる。MMSDHはCoAを必要とする唯一のアルデヒド脱水素化酵素である。これらグループの酵素[EC:１．２．１．２７]は代謝過程、例えば、炭化水素代謝；イノシトール代謝及びプロパノエート代謝に重要であると見なされる。さらに具体的には、前記酵素はアミノ酸、バリンの分解（バリン、ロイシン及びイソロイシン分解経路の一部）に関与すると見なされる。
小麦で低温ストレスによって前記酵素が誘導されるというのは、前記酵素が低温ストレスに対する保護に関与することができるということを示す。前記酵素はバリンのようなあるアミノ酸の分解に関与すると見なされるために、これら酵素水準の遺伝的変異はアミノ酸組成または代謝経路の変化を起こす。前記蛋白質は低温ストレス下で誘導されるために、前記蛋白質は植物体ストレス保護経路の一部であり得る。前記遺伝子の過発現によって、低温条件下でさらによく生存する植物を生産する。
また、アミノ酸分解経路にMMSDHが関与することは、前述した低温誘導発見と結合して考えてみれば、これは老衰過程中栄養に関与することもできる。もしそうであれば、寒さまたは日照りストレス下で老衰化される組織で前記蛋白質の発現が増加するように稲を変形することによって、種子のように生存する植物の部分で窒素及び他の重要な元素をさらに効率的に再活用することができる。
１d-０５９-１２:（ゲノム序列を含む序列番号２３、挿入序列の一部とゲノム序列の一部を含む序列番号６、暗号化序列を含む序列番号４０，アミノ酸序列を含む序列番号７）前記遺伝子はRNA-結合蛋白質LAH１（La蛋白質上同性１）（またはLHP１、YLA１とも言う）と相同性を有する蛋白質を暗号化する。いくつかの例において、前記遺伝子は細胞過程を変化させて蛋白質生産を変化させることができる。）
真核細胞において、前記La蛋白質はRNA転写体の３’末端に結合する。酵母では、前記La蛋白質LHP１はtRNAの成熟化のための加工に関与する（Yoo and Wolin, 1997, Cell 89:393-402、この文献はその全体が本明細書の参考文献として併合される）。LAH１はRNAポリメラーゼIII転写体の３’末端に結合し、分解から保護する（Xue外、2000, EMBO J., 19:1650-1660、この文献はその全体が参考文献として本明細書に併合される）。前記酵母のLa蛋白質は天然RNAポリメラーゼIII転写体の分子シャペロンで作用すると見なされる（Pannone外、1998, EMBO J., 17:7442-7453）。前記酵母La蛋白質はまた、RNAフォールディング、RNA安定化及び他の蛋白質とRNAの相互作用を助けることによってsnRNP組合に関与すると知られている（Xue、２０００，前記文献）。
図８はT-DNA／GUS挿入への挿入部位を示す図表と標識遺伝子の発現特性を示す写真を示している。GUS-標識遺伝子が子房で発現されるということが確認された。したがって、内在性暗号化された蛋白質が子房の発生に関与する。これを鑑みれば、この遺伝子の子房で特異的発現を増加させたり、変化させて変化した特性、例えば、好ましい穀物特性を有する植物体を製造することを農経済的に有用する。
稲で類似な蛋白質を暗号化する遺伝子の確認もまた、農経済的に有用である。例えば、これら蛋白質の高い水準に発現される植物は安定性が増加されたRNA転写体を有することができる。また、温度変化または他のストレス条件下でRNA転写体の安定性を維持するように機能する変化した蛋白質を暗号化する遺伝子に植物を形質転換させることもできる。
或いは、LAH１蛋白質の生産が一時的に、発生的にまたは構成的に減少するように植物を遺伝的に変形させることも有用である。LAH１蛋白質が減少した植物は恐らく転写特性が変化して成長特性が変化したり形態が変化することがある。例えば、本発明にLAH１遺伝子のアンチセンス構造物を植物に形質転換させて転写過程が変形された植物を得ることができる。
１c-０８７-４０:（ゲノム序列を含む序列番号２４、挿入序列の一部とゲノム序列の一部を含む序列番号７、暗号化序列を含む序列番号４１、アミノ酸序列を含む序列番号５８）前記遺伝子は液胞のATP合成酵素サブユニットC（v-類型ATPaseサブユニットCと言う）と相同性を有する蛋白質を暗号化し、いくつかの例では稲の成長及び発生を変化させるのに使用することができる。
液胞ATPaseは液胞の膜に位置し、ATP加水分解から由来したエネルギーを使用してプロトンを液胞に移動させる。液胞pHは低く維持される（一般にpH３．０〜５．０の間である）。大部分の液胞蛋白質はこのような低いpHで最適に作用する。液胞のATPase複合体は他の膜ATPaseと多少類似しており、挿入された膜領域（F０）、及び細胞質領域（F１）を有している。これら複合体の“C”サブユニットは挿入された膜ポリペプチドである。数個の“C”サブユニットは多重体として挿入された膜蛋白質複合体を形成する。
前記DET３遺伝子はアラビドプシスに存在する類似な蛋白質を暗号化する。アラビドプシスにおいて、前記蛋白質は細胞膨脹及び分裂組織成長に役割を果たすことが確認された。det３変異体は暗い条件下で成長させても光-成長表現型を示し、細胞延長欠損を示し、ブラシノステロイドに多少無感覚であることが確認された（Schumacher外、1999, Genes Dev. 13:3259-3270、この文献はその全体が参考文献として本明細書に併合する）。したがって、前記遺伝子は植物成長及び発生に関与する。
図９はT-DNA／GUS挿入体の挿入部位を示す図表と標識遺伝子の発現特性を示す写真を示している。本発明による前記GUS-標識遺伝子は子房で発現されることが明らかになった。このような事実は本発明による遺伝子が植物全体の成長に関与すると言うよりは、子房の発生に関与するとみなされる。このような点を考慮すれば、前記遺伝子の子房-特異的発現を増加させたり変化させることを農経済的に利用することができる。例えば、前記遺伝子は発生及び細胞延長に関与すると確認され（参照Schumacher、1999、前記文献）、また、本発明による遺伝子が子房-特異的方式で発現されるものであるために、前記遺伝子の発現を変化させることによって穀物の大きさ及び形態が変化したり、加工特性が変化した稲を製造することが可能であり得る。例えば、子房は稲穀物の褐色外部層（“糠”とも言う）に成熟されるので、前記遺伝子の子房-組織特異的過発現は変化した糠特性を有する穀物またはさらに大きいかより速く育つ穀物を製造することができる。
前記遺伝子は子房組織で発現されるために、前記遺伝子の子房-特異的発現分布によって子房成熟過程に欠陥がある植物が得られる。これは、例えば、実または種子が好ましくないか（例えば、バジルのように早期成熟する傾向のある植物）、及びその形成遅延を測定するのに有用である。前記遺伝子のアンチセンス序列に同定された遺伝子の５’プロモータを連結し、植物形質転換をさせることによって、前記遺伝子の子房-特異的分布を研究することができる。
稲において、子房で前記遺伝子発現のアンチセンス-基材分布は子房壁ではあまり優れていない。穀物が成熟する場合に、前記子房壁は稲穀物の“糠”（外部褐色層）を形成する。褐色稲から白い稲に進められる過程で、前記糠は頻繁に穀物の白い部分から剥がれる。したがって、前記遺伝子の子房-特異的発現を少なく調節することによって、あまり優れていない子房壁／糠組織を有する稲粒を製造することは農経済的に有用である。
１c-０１７-１４:（ゲノム序列を含む序列番号２５，挿入序列の一部とゲノム序列の一部を含む序列番号８、暗号化序列を含む序列番号４２、アミノ酸序列を含む序列番号５９）前記遺伝子はフェニルプロパノイド経路の調節で核心的な役割を果たせる桂皮酸４-ヒドロキシと諸に相同性を有する蛋白質を暗号化する。図１０では、T-DNA／GLUS挿入体の挿入部位を示す図表と標識遺伝子の発現特性を示す写真を示している。いくつかの例において、前記遺伝子は病源体の攻撃に増加された抵抗性を有する植物を加工するために使用することができる。
フェニルプロパノイド経路の初期段階において、フェニルアラニンがPAL（フェニルアラニンアンモニアリアーゼ）によって桂皮酸に転換される。次に、桂皮酸４-ヒドロキシルと第酵素が桂皮酸にヒドロキシ基を添加してp-クマル酸を生成する。その後の段階及び枝経路によって植物に重要ないくつの群のフェノール化合物を生成する。桂皮酸４-ヒドロキシルと第酵素は一般的なフェニルプロパノイド経路の初期一員であるために、多くの類型の植物過程に核心的な役割を果たす。例えば、フェニルプロパノイド経路はリグニン合成、花染料、信号伝達分子及び病源体及びUV光に対する植物防御機作関連広範囲スペクトルの化合物のような多様な植物機能を提供している。
本発明による前記桂皮酸４-ヒドロキシルと第遺伝子は花粉に位置される。それは多様な化合物の前駆体であるために、花粉穀物において多くの役割を果たす。事実上、前述した機能のうちの全てのものが花粉発生及び生存に非常に重要である。UV光損傷から花粉穀物を保護することがフェニルプロパノイド経路産物の特に重要な機能であり得る。追加的に、前記酵素は外部花粉壁成分を製造するのに関与することができる。
前記遺伝子がそれ自体のプロモータに結合して発現が増加することによって発生する花粉で発現水準が増加するということは特に農経済的に有用である。前記酵素水準の増加はUV保護能を増加させ、花粉壁の強度を増加させる（つまり、これは特に最適でない環境条件下で花粉穀物の生存力を増加させることができる）。
いくつかの状況では、花粉で前記遺伝子発現を下向調節することが有用であり得る。例えば、最初には生存可能であるが、UV光に露出される時、野生型よりさらに容易に分解される花粉を有する形質転換稲を製造することを所望すれば、形質転換花粉が形質転換作物と多少離れた位置に存在する非形質転換作物を授粉させるのに十分なだけ生存状態を維持することはさらに難しい。花粉は恐らく近距離授粉のために生存を維持するが、太陽光または極端の環境下で長期間生存することは難しい。このような類型のシステムは他の形質転換植物安定系と結合して使用のための追加的な安定化機能を提供する。
また、本発明の遺伝子を内在性花粉-特異的プロモータの他に、他の組織-特異的プロモータと連結することもできる。例えば、前記遺伝子を稲の内花頴／外花頴特異的プロモータまたは子房-特異的プロモータ、または種子-特異的プロモータに連結することによって疾病、損傷または他の良くない条件に対するさらに大きな抵抗性を有する稲穀物を生産する。
１c-０３８-５６:（ゲノム序列を含む序列番号２６、挿入序列の一部とゲノム序列の一部を含む序列番号９、暗号化序列を含む序列番号４３、アミノ酸序列を含む序列番号６０）。前記遺伝子はH-蛋白質プロモータ結合因子-２aに相同性を有する蛋白質を暗号化する。図９ではT-DNA／GUS挿入体の挿入部位を示す図表と標識遺伝子の発現特性を示す写真を示している。前記遺伝子のGUS-標識発現は花粉組織に位置すると確認された。前記蛋白質は転写に関与してミトコンドリアの光呼吸に影響を与えるH-蛋白質プロモータ結合因子-２aであるgi／１５４５１５５３と７９％の序列同一性を有する。したがって、稲で前記遺伝子の変形によって転写活性を変化させることができる。前記遺伝子が花粉組織で優先的に発現されるために、例えば、発芽率、花粉発達または花粉管成長などのような花粉特性を変化させることができる。
１c-０４１-４７:（ゲノム序列を含む序列番号２７、挿入序列の一部とゲノム序列の一部を含む序列番号１０，暗号化序列を含む序列番号４４、アミノ酸序列を含む序列番号６１）前記遺伝子はフラップエンドヌクレアーゼ（FEN-１）と相同性を有する蛋白質を暗号化し、いくつかの場合には環境的変異制に対する植物の抵抗性を増加させるのに使用することもできる。図１２では、T-DNA／GUS挿入体の挿入部位を示す図表と標識遺伝子の発現特性を示す写真を示している。
FEN-１はDNA複製及びDNA修復過程全てで核心的な酵素である。FEN-１はDNA複製中に遅延鎖の岡崎フラグメント の５’末端を除去する機能を果たし（Lewin, (2000), Genes VII, Oxford University Press, Inc., New York, p. 393、この文献はその全体が本明細書に参考文献として併合される）、また、DNA修復中に５’オバーハングイングフラップを除去する。FEN-１はDNA修復中にエンドヌクレアーゼとして作用するが、DNA複製中にはエキソヌクレアーゼとして作用すると見なされる。FEN-１は哺乳動物のDNA複製過程で岡崎フラグメントの加工で他の蛋白質、例えばDNAポリメラーゼ、増殖細胞核抗原（PCNA）、及び複製蛋白質A（RP-A）と協力して作用する（Maga外、2001, Proc. Natl. Acad. Sci. 98: 14298-14303、この文献はその全体が本明細書に参考文献として併合される）。Fen-１蛋白質はDNA合成のS-上で核に位置し、また、DNA損傷反応でも同一である（Qiu外、2001, J. Biol. Chem. 276: 4901-4908、この文献はその全体が参考文献として本明細書に併合される）。
FEN-１機能を喪失した酵母細胞は化学的または他の変異剤に対する敏感性が増加して変異率が増加する。追加的に、FEN-１はDNA複製に必須であるために、その機能が完全になくなれば哺乳動物細胞は生存することができない（Qiu外、2002, Jour. Biol. Chem. (published May 1, 2002, as Manuscript # M111941200、この文献はその全体が参考文献として本明細書に併合される)。
本発明の方法によってFEN-１の発現を花粉に位置させた。このような植物細胞類型で多くの可能な機能を予想することができる。例えば、花粉穀物がUV光に露出されるために潜在的なDNA損傷があり得る。FEN-１が花粉に存在する場合、数分前にあった環境露出によって起こり得るDNA損傷から花粉穀物を保護することができる。他の可能性としては、DNA複製過程を花粉に存在するFEN-１が補助することができる。他の方式としては、その自体の花粉特異的プロモータと関連してFEN-１遺伝子が過発現されることによって、UV光のような過度な環境条件に露出された後にもDNA損傷を少なく受けることができ、さらに生存力が強いことがある。
或いは、花粉で前記遺伝子発現はダウンレギュレーションにも有用であり得る。例えば、いくつかの場合に頻繁に使用される化学的変異剤、例えばエタンメチルスルホネート（EMS）に対して容易に変異できる植物を得ることは有用である。植物研究で変異誘導方法を遺伝子の機能を決めて新しくて有用な表現型を開発するために使用することができる。したがって、スクリーニング目的のためにさらに多くの数の変異体植物を生成するためには容易に変異される植物株が特に有用である。
追加的に、本発明の遺伝子を構成的プロモータと連結することによって前記構造物に形質転換された植物は全体DNA修復システムが増加するために細胞DNAに対するUV損傷から保護することができる。例えば、これは自発的変異やUV光に特に敏感な作物には特に重要である。
１c-０６４-２０:（ゲノム序列を含む序列番号２８、挿入序列の一部とゲノム序列の一部を含む序列番号１１、暗号化序列を含む序列番号４５，アミノ酸序列を含む序列番号６２）前記遺伝子は熱衝撃蛋白質HSP70に相同性を有する蛋白質を暗号化し、いくつの例で熱ストレスまたは他のストレスから増加された保護能を有する植物を加工するのに使用することができる。HSP70蛋白質は分子シャペロンとして作用して新しく合成されたポリペプチド鎖がリボソーム上で伸びる時、新規鎖を安定化させることによって適した配向に折りたたむ（参照、Hartl and Hayer-Hartl, 2002, Science 295:1852-1858、この文献はその全体が参考文献として本明細書に併合される）。Hsp70蛋白質はポリペプチドの結合と放出の段階を循環することによって、ATP-依存方式で新規ポリペプチド鎖に作用する。ポリペプチドが放出されることによって天然状態に折りたたむ。HSP70はまた、追加過程のために蛋白質をシャペロン複合体に移動させるのに関与する。追加的に、HSP70のバクテリアにおける相同性を有するDnaKはペプチド結合異性化酵素活性を有すると確認された（Schiene-Fischer外、Nat. Struct. Biol., 2002, published online May 20, 2002、この文献はその全体が参考文献として本明細書に併合される）。真核HSP70蛋白質もこのような特性を有することが明らかになれば、この蛋白質は蛋白質加工過程でさらに重要で複雑な機能を行うすることもできる。したがって、蛋白質複合体各成分の適した折りたたみは複合体全体として機能に必須であるために、Hsp70蛋白質は複雑な多重体蛋白質複合体だけでなく、１次単一ポリペプチドユニットの適した折りたたみと機能に重要である。HSP70蛋白質はまた、植物倍発生過程中の核の構成分に対する一般的な保護にも関与する。（Testillano外、2000, J. Struct. Biol., 129:223-232、この文献はその全体が参考文献として本明細書に併合される）。他の類型のHSP70段白質はミトコンドリア及び色素体への蛋白質輸送に関与すると確認された（Rial外、2000, Eur. J. Biochem. 267:6239-6248; Zhang and Glaser, 2002, Trends Plant Sci. 7:14-21、この文献はその全体が参考文献として本明細書に併合される）。
熱衝撃蛋白質は頻繁に多様な類型の生命体で熱衝撃または他のストレスによって上向き調節される。HSP蓄積を測定して一つの生命体が以前まで露出されたストレス水準を決めるのに使用することもできる（参照、US. Patent No. 5,232,833 to Sanders 、この文献はその全体が参考文献として併合される）。したがって、本発明による遺伝子の一つの有用性は稲花粉または他の植物組織のストレス水準を決める探針として使用することができるということである。
図１３には、T-DNA／GUS挿入体の挿入部位を示す図表と表遺伝子の発現を示す写真を示している。本発明によるGUS-標識方法によって前記遺伝子の発現を花粉に位置させることができる。花粉でHSP70が存在することはリボソームで合成中である新規蛋白質の保護に関連する。もしそうであれば、HSP70水準が増加された形質転換植物体は熱や他のストレスから保護能が増加する。
本発明によるHSP70をそれ自体のプロモータに連結して植物を形質転換することによって花粉穀物で合成過程中である新規蛋白質が保護及び／またはストレスに対する保護を向上させる。花粉穀物が成熟されながら水分がなくなる過程で、花粉特異的HSP70は細胞蛋白質の凝集から保護に関与する。したがって、恐らく前記遺伝子が花粉で特異的方式に過発現されることによって、花粉穀物の生存期間を延長させることができる。他の例において、構成的プロモータと連結された本発明によるHSP70遺伝子に植物を形質転換させ、ストレスによる現象が起こる前に高い水準に前記遺伝子を発現させることを有用する。これはストレス関連細胞損傷から保護能を有する植物を提供することである。例えば、ストレス-抵抗性緑藻類から由来した熱衝撃蛋白質を使用して植物を形質転換させることによって、ストレスに対する保護を増加させることができる（Japanese patent application JP2001078603A2、この文献はその全体が本明細書の参考文献として併合される）
いくつかの状況において、HSP70活性を減少または変化させるように植物を形質転換させることが好ましい。例えば、それ自体の花粉-特異的プロモータが連結された本発明によるHSP70遺伝子のアンチセンス構造物に植物を形質転換させることによって、花粉でのみHSP70発現が欠如された植物を得ることができる。このような植物は生存力が減少し得る。形質転換作物の耕作者はこのような植物を生産して目的とするトランス遺伝子が近くの作物または関連雑草に拡散しないことを望むこともできる。
１c-１０９-３５:（ゲノム序列を含む序列番号２９、挿入序列の一部とゲノム序列の一部を含む序列番号１２、暗号化序列を含む序列番号４６、アミノ酸序列を含む序列番号６３）。前記遺伝子はアンモニウム輸送体と相同性を有する蛋白質を暗号化し、稲の花粉組織で発現されることが明らかになった。図１４は、T-DNA／GUS挿入体の挿入部位を示す図表と標識遺伝子の発現特性を示す写真を示している。いくつかの例では、花粉発芽中にアンモニア摂取を増加させるために前記遺伝子を使用することができる。
窒素は植物成長に重要な栄養素であり、全てのアミノ酸及び他の多くの植物分子の成分である。窒素が核心栄養素ではあるが、常に土壌に利用可能な形態に存在しないこともある。窒素同化に関与する酵素だけでなく窒素輸送体を上向調節または下向調節することによって土壌に存在する窒素の有無に反応する機作を発達させた。膜輸送機作を使用してNO３及びNH４ +の摂取を調節する（Wirenetal外、1997, Plant Soil 196: 191-199、この文献はその全体が参考文献として本明細書に併合される）。土壌に硝酸塩が存在する場合には、硝酸塩還元酵素及び亜窒酸塩還元酵素（及び他の多くの）窒素同化酵素を上向き調節する。しかし、アンモニウムが存在する場合には、細胞膜を横切ってアンモニウムを輸送することができる膜蛋白質を下向調節することができる。アラビドプシスのアンモニウム輸送体AMT１:１は窒素欠乏によって誘導されるものであることが明らかになった。（Gazzarrini外、1999, Plant Cell 11:937-947、この文献はその全体が参考文献として本明細書に併合される）。逆に、マイクロアレイ分析によれば、高い窒素濃度の下では前記AMT１:１遺伝子が強く下向調節されると現れた（Wang外、2000, Plant Cell 12:1491-1509、この文献はその全体が参考文献として本明細書に併合される）。
根毛ではアンモニウム輸送体が優先的に発現される（Lauter外、1996, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 93:8139-8144、この文献はその全体が参考文献として本明細書に併合される）。アラビドプシスで、数個のアンモニウム輸送自が発現されており、各々は他の窒素条件下で反応するものである。AtAMT１;２mRNA発現は構成的である反面、AtAMT１;１mRNA水準は窒素欠乏によって誘導され、また、アンモニウム輸送体であるAtAMT１;３は窒素同化及び炭素利用性と関連しているという仮説がある（Gazzarrini外、１９９９、前記文献）。他のアラビドプシスアンモニウム輸送体であるAtAMT２は根よりはシュートでさらに発現が高い（Sohlenkamp外、2000, FEBS Lett. 467:273-278、この文献はその全体が参考文献として本明細書に併合される）。
本発明による遺伝子が花粉組織で優先的に発現されるという発見は、土壌から窒素の摂取とは異なる機能を有することを示す。前記輸送体は標的子房の周囲柱頭及び花柱標的から窒素を摂取する機能を果たすこともできる。或いは、アンモニウム輸送体は花粉穀物が発達することによって周囲の花粉粒組織から窒素を入手することができる。花粉で前記遺伝子の発現変化は農経済的に有用であり得る。例えば、それ自体の花粉-特異的プロモータと連結されたアンモニウム輸送体遺伝子のアンチセンス構造物に植物を形質転換させることによって、前記アンモニウム輸送体遺伝子の花粉-特異的ノック-アウトを達成することもできる。これは例えば、外部形質転換作物の安全性に重要な雄性-断種植物を製造するのに有用である。
これと対照的に、前記遺伝子の花粉-特異的発現は、例えば、花粉穀物の発達中にまたは花粉発芽中に窒素摂取を増加させて結局成長及び発達を増加させるのに有用である。スペルミンのようなポリアミン類を発芽花粉管に添加した場合に花粉管成長が増加することが明らかになった（Cetin外、2000, Can. Jour. Plant Sci., 80:241-245、この文献はその全体が参考文献として本明細書に併合される）。したがって、それ自体のプロモータ及び上流エンハンサー序列と連結されたアンモニウム輸送体遺伝子に植物を形質転換させることによって花粉管のアンモニウム輸送体のような窒素輸送体を増加させて花粉成長率を増加させることができる。
１c-１０９-５１:（ゲノム序列を含む序列番号３０，挿入序列の一部とゲノム序列の一部を含む序列番号１３、暗号化序列を含む序列番号４７、アミノ酸序列を含む序列番号６４）前記遺伝子はATP-依存性RNAヘリカーゼに相同性を有する蛋白質を暗号化し、いくつかの例では花粉発達効率性を変化させるのに使用することができる。
図１５はT-DNA／GUS挿入体の挿入部位を示す図表と標識遺伝子の発現を示す写真を示している。ATP-依存性RNAヘリカーゼ群の蛋白質は真核細胞で翻訳初期に関与する。これらの酵素はmRNAの５’末端に存在する二重鎖RNAの構造を解いてリボソームサブユニットが結合可能でmRNAの翻訳を可能にすると知られた。他のRNA-依存性ヘリカーゼはRNA代謝、pre-mRNAスプライシング、リボソーム生合成、及び細胞質と核酸輸送に関連することが明らかになった。
RNA-依存性ヘリカーゼは細胞発達過程に重要である。前記遺伝子の花粉-特異的発現はRNAヘリカーゼKA花粉成熟及び生存に核心的な役割を果たすことを示す。したがって、それ自体の花粉特異的プロモータに前記遺伝子のアンチセンス構造物を連結する植物で発現することによって有性的に繁殖不可能な植物を製造する方式で花粉穀物で前記遺伝子の花粉特異的ノックアウトを行うことができ、これは農経済的に有用である。前記植物の花粉は生存することができないか生存力が減少する。前述したように、これはトランス遺伝子が近くの作物や関連雑草に拡散しないようにするのに有用である。
或いは、前記遺伝子を変化させて前記遺伝子の花粉特異的発現を野生型に比べて増加させることが有用であり得る。前記遺伝子の花粉特異的調節領域は他の調節領域（例えば、ホルモン反応性プロモータ、環境ストレス特異的プロモータ）に連結して追加発現変形が可能である。
１C-０５６-０７:（ゲノム序列を含む序列番号３１、挿入序列の一部とゲノム序列の一部を含む序列番号１４、暗号化序列を含む序列番号４８、アミノ酸序列を含む序列番号６５）前記遺伝子はグルコース６-ホスフェート／ホスフェート輸送体に相同性を有する蛋白質を暗号化する。いくつかの場合に、前記遺伝子は穀物収穫量を増加させるのに使用することができる。図１６はT-DNA／GUS挿入体の挿入部位を示す図表と標識遺伝子の発現特性を示す写真を示している。前記遺伝子は葉、フィラメント及び子房組織で発現される。
グルコース-６-ホスフェートは炭水化物代謝に重要な役割を果たす。ある色素体、例えば澱粉形成体及び白色体は色素体の二重膜システムを横切ってグルコース-６-ホスフェートを輸送する。前記内部膜に位置した輸送体蛋白質はPiが反対方向に輸送される時、一方向にグルコース-６-ホスフェートを輸送する（参照、Dennis and Blakeley, p 632, in Biochemistry and Molecular Biology of Plants, 2000、前記文献）。前記数種者は種子及び澱粉保存器官の発達に特に重要である。
前記遺伝子の子房-特異的発現を増加させる遺伝的変形によって、稲穀物へグルコース-６-ホスフェートの輸送が増加する。その結果、穀物収穫量が増加し、種子成熟速度が速くなる。日照りまたは低温のような環境ストレス下で前記遺伝子の子房特異的発現を上向き調節するように前記遺伝子の発現を変形させることができる。これは環境変化条件に反応して種子充電機作を植物が開始するようにすることもできる。例えば、低温耐性のない植物は冬が始まる低温で死滅する。寒い天気が最初に始まれば、植物を栄養成長段階で種子充填段階に再速く変換させ、グルコース-６-ホスフェートを暗号化する遺伝子の発現を増加させることによって植物の栄養部分から種子部分に代謝を転換するように、植物を変形することもできる。これは種子充填速度を増加させて穀物収穫量を増加させ、特に低温敏感性種の場合にそうする。
１c-１００-３２:（ゲノム序列を含む序列番号:３２、挿入序列の一部とゲノム序列の一部を含む序列番号１５，コーディング序列を含む序列番号４９、アミノ酸序列を含む序列番号６６）前記遺伝子は子房組織と花粉に優先的に発現される。蛋白質はアミノホスホナート代謝に作用することができる。図１７は、T-DNA／GUS挿入体の挿入部位を示す図表と標識遺伝子の発現特性を示す写真を示している。
このような遺伝子はRNAメチル基転移酵素に相同性を有する蛋白質を暗号化し、具体化されたいくつの場合では、穀物発生を誘導する蛋白質の生産を変更させるのに利用することができる。RNAメチル基転移酵素は特定リボ核酸にメチル基を転移させる。RNAに対するメチル化機能はまだ確認されていないが、rRNA安定性に影響を与えたり、蛋白質翻訳過程を変異させるかもしれない。RNAメチル基転移酵素として作用する酵母の核蛋白質であるNop２pは、rRNAプロセシングと６０ Sリボゾームサブユニットの生合成に作用すると知られている（Hong外、2001, Nuc. Acids Res., 29:2927-2937）。RNAメチル化はリボース糖の２’-O-ヒドロキシ位置で発生され、２７Sプレ-rRNAが５．８S及び２５SrRNAに転移される段階の一部で、結局６０ Sサブユニットの一部となる。酵母のnop２対立遺伝子で温度敏感性変異体は２５SrRNA合成と６０ Sサブユニット結合が不完全であると確認された（Hong外、supra）。その他、RNAメチル基転移酵素としては酵母Trm１pとE.coli.のFmuがあり、前記２種の蛋白質は特定のシトシンをメチル化させる。
E.coli FtsJ／RrmJ熱衝撃蛋白質は２３SリボゾームRNAメチル基転移酵素であると報告された。前記蛋白質はプレ-リボゾームリボ核蛋白質粒子または細菌の５０Sリボゾームサブユニットとして作用する
本発明で確認されたRNAメチル基転移酵素はrRNAプロセシングとリボソーム組合に関与するかもしれない。その場合、遺伝学的に変形された植物は自己プロモータまたは子房特異的プロモータに連結された遺伝子の発現が増加して子房組織でリボソーム合成が増加し得る。増加されたリボソーム組合は蛋白質合成比率の増加を示すことができる。蛋白質合成比率が稲の子房組織で増加すれば、稲粒の大きさまたは収率増加または稲粒の蛋白質含量またはこれをめぐった組織増加のような利点であり得る。
一方、蛋白質合成を特定器官で阻害するのに有用であり得る。その例として、穀物の価値は生殖組織よりは無性組織で評価されるいくつかの穀物種において、本発明の子房または花粉組織-特異的プロモータに連結されたRNAメチル基転移酵素に対しアンチセンス構造体を植物に形質転換させることによって、子房及び花粉発生を減少または中止させることができる。植物は無性状態に正常に成長し、生殖組織を形成することができない。これはホウレンソウ、レタス及びセージ、バジル及びタイムのようなハブなどの特定植物の“ブロッティング”を防止するのに非常に有用であるかもしれない。
rRNAメチル化は抗生剤に対するリボソーム感受性を変異させると確認された（Cundiffe, 1990, in The Ribosome: structure, Function, and Evolution（Hill外、Am Soc. Microbiol; Washington, D.C.） 182, pp 479-490）。したがって、RNAメチル基転移酵素発現が変異された植物は抗生剤に対する抵抗性が変異できる。これを利用して与えられた選別マーカーに抵抗性の高い形質転換植物を製造でき、したがって、潜在形質転換植物プールから容易に選別することができる。
１c-１４２-２７:（ゲノム序列を含む序列番号:３２、挿入序列の一部とゲノム序列の一部を含む序列番号５０はコーディング序列を含み、アミノ酸序列を含む序列番号６７）前記遺伝子はアクチンジポリマーザイジング因子５に対する相同性蛋白質を暗号化し、具体化された場合、稲粒の大きさを変異させるのに使用することができる。蛋白質は迅速F-アクチンターンオーバーに必須のものであると見なされ、既に存在するF-アクチン各構造を安定化させる。図１８に、T-DNA／GUS挿入体の挿入部位を示す図表と標識遺伝子の発現特性を示す写真を示している。前記遺伝子は稲子房と花粉組織で発現される。
主な細胞骨格因子のうちの一つはアクチンフィラメントである。アクチンフィラメントはアクチンモノマーを重合させた長い形態単位である。フィラメントは極性であり、遅い-成長の（-）末端と速い-成長の（+）末端を有している。細胞は典型的に自由アクチンと重合されたアクチンフィラメントを全て含む。前記自由アクチン単位はADPまたはATPを結合している。自由アクチンがATPに結合され、アクチンフィラメントの（+）末端で重合することができ、この時、ATPはADPに加水分解される。
アクチンは頻繁に多様抗種類のアクチン結合またはアクチン交差結合する蛋白質と組合される。アクチンに組合される蛋白質の種類としてはアクチンデポリマライジング因子（ADF）があり、これはアクチンフィラメントの組合を解体するのに関与する。ADF蛋白質はアクチンサブユニットの角度で大きなチルトを誘導し、フィラメントを切断し、また、アクチンモノマーに結合させることによって、F-アクチンをジポリーライズさせる（Galkin外、2001, Jour. Cell Biol., 153:75-86）。
植物でアクチン細胞骨格は細胞分割、細胞伸張、花粉管発生、根毛成長、トリコム成長及び気孔のガイド細胞作用に重要な役割を果たすと見なされる。トウモロコシで花粉発生の間に、アクチンネットワークの組織化は発生された花粉粒を発生させることに変化し、花粉管を形成する。アクチンネットワークは発芽中に花粉孔の周囲に微細繊維性ネットワークを形成させ、液胞を移動させる花粉管端に存在する。アクチンジポリマーライジング蛋白質はフィラメント型アクチン（F-アクチン）またはG-アクチンに結合してアクチンフィラメントをジポリマーライジングさせることができ、必要な位置に分布され得る。例えば、トウモロコシZmADF３は伸張される根毛成長の端を再分配する（Jiang外、1997, Plant Jour., 12:1035-1043）。ADFは休止期の花粉粒でジポリマーライジングされたアクチン、恐らく発芽時に利用されるアクチンの保存形態に結合すると確認された（Smertenko外、2001, Plant Jour., 25:203-212）。
アラビドプシスにおいて、ADF-暗号遺伝子の構成性過剰発現は細胞及び器官成長を減少させ、不規則な細胞形態形成を起こす。これとは対照的に、前記遺伝子のアンチセンス発現は細胞拡張増加、器官成長増加及び開花遅延を示す（Dong外2001, Plant Cell, 13:1333-1346）。
植物でADF遺伝子の遺伝子的変形は多様な形態の形態的変異、例えば、開花変異、成長速度変異、発芽変異及び器官成長変異と変異を有する植物を生産することができる。トウモロコシでADFの下位調節は器官成長の増加を引き起こすために、子房発生の間にADF遺伝子発現を下位調節することによって稲粒の大きさを増加させることができる。これは子房-特異的プロモータに遺伝子のアンチセンス構造体を連結させることによって実施することができ、その結果子房発育を増加させることができる。これは稲粒大きさ増加または稲粒の全収率を増加させる結果を示す。
一方、ADF遺伝子発現での花粉-特異的変異は花粉粒休止基と花粉粒生成特徴を変異させることができる。さらに、ADF蛋白質は細胞拡張に関連するので、特定器官で遺伝子を上位または下位調節することによって特定植物器官の成長変異を可能にするかもしれない。
１C-１４０-０４:（ゲノム序列を含む序列番号３４、挿入序列の一部とゲノム序列の一部を含む序列番号１７、コーディング序列を含む序列番号５，アミノ酸序列を含む序列番号６８）前記遺伝子はベータ-グルコシダーゼ遺伝子を暗号化し、具体化された場合、昆虫攻撃に抵抗性を増加させるのに利用することができる。ベータ-グルコシダーゼは多様な細胞機作、例えば防御反応、細胞壁生態及び共酵素の活性に関与するグリコシドハイドロールレイズグループのうちの一つである。
前記遺伝子は子房、柱頭、花柱または付加的には他の所及び鱗被で発現される。図１９にT-DNA／GUS挿入体の挿入位置及び標識遺伝子の発現特徴を示す。
植物におけるベータ-グルコシダーゼ酵素の作用はホルモンまたは他の信号物質の保存形態を活性化するものである。アブシシン酸（ABA）またはサリチル酸（SA）のような植物ホルモンは不活性の接合体形態に植物に保存または輸送され、グルコシダーゼのような酵素によって活性化することができる。大麦はグルコース接合体である輸送形態のホルモンABAを加水分解させることができる細胞外でベータ-グルコシダーゼ活性を有すると確認された（Dietz外、2000, Jour. Exp. Bot., 51:937-944）。
ベータ-グルコシダーゼは昆虫攻撃に対する反応で蓄積され、植物防御反応に重要な役割を果たす。植物は昆虫またはその他の捕食者から保護するための多様な毒性化合物を保存している。このような化合物は一般にグルコシダーゼとは分離された液胞に接合体として保管されている。害虫被害に細胞破壊が誘発されれば、保存された接合体はグルコシダーゼと接触して毒素が放出されて捕食者を死滅させる。毒素の例としては、チオシアン酸塩、ニトリル、アルカロイド、サポニン、ベンズアルデヒド及びシアン化物がある。したがって、このような遺伝子発現を上位調節する形質転換植物は稲の昆虫抵抗性を増加させるのに有用であり得る。発現は選択したプロモータによって、組織特異的（生殖組織で稲粒発生を保護するために）発現または傷-誘発性発現であり得る。
本発明のベータ-グルコシダーゼは食品加工用途の添加剤として有用に使用することができる。前記遺伝子は植物または植物組織で発現することができ、収穫及び分離して天然植物由来酵素（現在利用される細菌性または真菌性由来酵母ではない）として特定食品製造過程に添加することができる。一方、前記遺伝子は細菌または酵母に形質転換して培養物で発現及び分離することができる。
ベータ-グルコシダーゼはグルコース-接合されたホルモンを自由、活性型に加水分解させることができる。本発明のベータ-グルコシダーゼ遺伝子は自己プロモータと連結された遺伝子を前記プロモータの上位エンハンサー序列と共に植物に形質転換させることによって、同一組織で過発現させることができる。したがって、篩管部から到達するABA-接合体信号に対して高い敏感性を有する生殖組織のような変異された表現型を形成することができる。乾燥-誘発性ABA信号に容易に反応する子房組織は、種子充填／種子成熟段階が天然型植物に比べてより急速に転換される。さらに、ABA-誘導性プロモータに連結された遺伝子発現は植物に高いABA反応性を示すことができる。
植物と関係された真菌また、ベータ-グルコシダーゼ活性を有すると確認されており、植物から栄養物を得るために植物壁を攻撃すると考えられる。このような観点で見れば、ベータ-グルコシダーゼに対するアンチセンス遺伝子発現が真菌が攻撃しやすい組織で組織-特異的、細胞質または細胞壁-位置的に発現される稲植物を生産するのに有用であり得る。前記アンチセンス遺伝子は真菌由来センス転写体と相互作用して真菌のグルコシダーゼ生産を阻害することができる。前述したことは発明の内容に含まれる。
以下、本発明の実施例を記載する。下記の実施例は本発明を例示するためのものに過ぎず、本発明が下記の実施例に限られるわけではない。
［実施例１］
（挿入変異体稲製造用ベクター構築）
T-DNA挿入変異体稲製造用バイナリーベクター３種、pGA１６３３、pGA２１４４、及びpGA２７０７を構築した（図１）。前記pGA１６３３は右側ボーダー及びCaMV３５Sプロモータ-ハイグロマイシン燐酸転移酵素（hph）キメラ遺伝子の側面に選別マーカーとしてプロモータのないGUSを含む。前記pGA１６３３ベクターはpB１１０１．１のGUS遺伝子をpGA１６０５のBamHI部位に挿入して製造し（Lee外、1999、それ全体が本願に参照として統合される）、BamHI、HindIII、XbaI、SacI、HpaI、Asp７１８及びClaIの多クローン部位と３５S-hphを含む。pGA１６３３でT-DNA及びBamHI部位の間に翻訳開始または停止コードンは存在しない。
二次プラスミドpGA２１４４は遺伝子トラップ効率を向上させるために構築した。前記プラスミドで、３種のスプライシング供与者及び受容者推定物を含むイントロン（the modified イントロン3 of OsTubA1, accession number AF18252）をGUS遺伝子の５’末端に挿入した。また、選別マーカー遺伝子であるhphはCaMV３５Sプロモータをα-チューブリン遺伝子（OsTubA１）の強力なプロモータに置換して授粉した
前記OsTubA１イントロン３は鋳型として使用した。PCRプライマーは5'GGGTCGACGAGG-TACAAGGTACAAGGTACAGACTTGTATCCTT3'（序列番号７０）と5'-CGGGTACCACCTGCATATAACCTGCATATAACCTGCACATTA-GCAATAAA3'（序列番号７１）を使用した。前記アンダーライン表示はSalI及びAsp７１８部位である。前記プライマーは公知文献（Sundaresan外、1995, Genes Dev. 9: 1797-1810，それ全体が本発明の参照として開始される）のスプライシング供与者及び受容者によって製作した。増幅された切片はSalI及びAsp７１８で切断し、pGA１９４２のGUS前面のXhoIとAsp７１８との間にクロニングしてマルチクロニング部位（SacI, XhoI, Asp718 and ClaI ）と０．５のOsTubA１プロモータ-OsTubA１イントロン１-hphを含めてpGA２０２０を製造した。pGA２０２０で０．５kbのOsTubA１プロモータ切片を１．０kbのOsTubA１プロモータに置換してGA２１４４を製造した。
前記pGA２７０７はhph遺伝子及びそのプロモータはGUS遺伝子の逆方向に挿入した。授粉したOsTubA１イントロン２はUSG遺伝子の前方に挿入した。授粉は鋳型として遺伝子を使用し、３種のスプライシング供与者または受容者序列を含むプライマーを使用してPCRした。PCRプライマーは5’-GGATCCGAGGTACCAGGTACCAGGTG-AGTTCCATTCTTAC-3’（序列番号７２）と5’-CCCGGGACCTGCATA-TAACCTGCATATAACCTGTAAAGATTTAGCAC-3’（序列番号７３）である。アンダーラインを付けた序列はBamHIとSmaI部位である。増幅された切片はgus遺伝子の前方であるBamHIとSmaIとの間にクロニングした。製造したプラスミドはpGA２６６５と命名した。キメラhph遺伝子の転写終結者としてはOsTubA１転写終結者を使用した。OsTubA１の転写終結者はプライマー5’-GAAGATCTAGAGGAGTCGTCGTCGTCT-3’（序列番号７４）及び5’-CCATCGATAGGCTAGTCATGGTGA-3’（序列番号７５）にPCRして増幅した。前記アンダーライン部分の序列は各々BglIIとClaI部位である。PCR産物はpGA２６６５のClaIとBglIIとの間にクロニングした。pGA２６７５はpGA２６６７のEcoRI部位を除去して製造した。pGA２６７５のSphIとBglIIとの間の３kbをマルチクロニング部位を含むバイナリーベクターpGA２６７０のSphIとBglIIとの間にクロニングした。製造したベクターはpGA２６８２と命名した。pGA８８３で収得したhph遺伝子を含む１kbのBamHI切片をpGA２６８２のBglIIに挿入した。製造したプラスミドはpGA２６８６と命名した。最終に、pGA２６８６の切断部であるhph遺伝子の５’部位（０．３kb）をpGA２１４４の２．６kbに置換してpGA２７０７を製造し、したがって、pGA２７０７は遺伝子の５’末端部-OsTubA１イントロン１-OsTubA１プロモータを含む。pGA２７０７のT-DNA部分は序列番号６９に示した。
［実施例２］
（T-DNA標識された形質転換稲植物生産）
稲形質転換は公知の方法である（Jeon外、1999、その全体が本発明の参照として開示される）アグロバクテリウム-媒介共同培養法で実施した。胚盤由来胎児基カリはバイナリ標識ベクターを含むAgrobacterium tumefaciensをBA４４０４と共同培養した。約２０〜４０％の共同培養したカリはハイグロマイシン抵抗性を示した。前記カリから植物再行頻度は５０〜８５％であった。アグロバクテリウム媒介稲形質転換過程はpTiBo５４２の病毒性部位を含んでいるスーパー-毒性菌株及びスーパー-バイナリーベクターを根幹とするシステムを利用して開発された（Hiei外、1997、それ全体が本発明の参照として開示される）。前記システムの形質転換効率はスーパー-バイナリーベクターシステムがより優れているので、アグロバクテリウム菌数LBA４４０４と一般的なバイナリーベクターは効果的な稲形質転換に利用することができる。前記システムでpGA１６３３に形質転換された１５９０形質転換植物及びpGA２１４４に形質転換された２０５００形質転換植物を生産した。前記内容は表２に記載されている。
［実施例３］
（ハイグロマイシン抵抗性を有する後代選別及び検定）
形質転換稲植物はハイグロマイシンBを４０mg／L含む培地で再生して選別マーカー遺伝子が存在する種を選別した。再生された植物は温室で昼間は３０℃に、夜間は２０℃におき、昼／夜の周期は１２／１０時間とした。
形質転換体の後代は選別時に使用されたハイグロマイシン濃度に比べて高い濃度を使用しハイグロマイシン抵抗性を検定した。滅菌した種子は７０mg／LのハイグロマイシンBを含むMS培地に植えた後、培養した。発芽されて１４日後、ハイグロマイシン抵抗性を測定した。
［実施例４］
（形態学的評価及びデータ収集）
形態学調査は植物発生の多様な段階で実施した。T１植物は４〜５週（生長段階）、６〜７週（開花）及び８〜９週（結実）に観察した。植物のT２後代は４週後、週ごとに観察して記録した。
観察は自動データ収集手段、例えば、バーコードスキャナーを有する“パルムピロット”を利用して記録した。パルムピロットに入力する情報の例として、植物フラット（８個を含み、バーコードで認識される）、収集情報、フラットした移植時期、種子収集時期、種子の起源及び保存場所（植物ID／バーコード）及び適用可能な時期、組織収集時期、形態（葉または全植物）及び保管場所根源を含む。
パルムピロットをパルムピロットのHotSync適用を利用したコンピュータに連結してデータをコンピュータにダウンロードすることによってデータを一致させた。写真はデジタルカメラ（e.g., a, Kodak DC 260 or 265 digital camera ）で撮影し、全植物のイメージは発芽後、４〜５週に製作したフラットにこれらの位置に記録し、イメージをコンピュータデータベースに移送して各段階における変異体特徴を有する植物写真を獲得した。
成熟植物の長角を手で擦って放出された種子を収集し、篩を利用してチャッフを除去した後、乾燥剤、たとえばドライアライトチップが添加された保存管に漏斗を利用して清潔な種子を注いだ。
一般に、観察、測定及び組合日、組織収集日、種子収集日などを記録及びデータベースに入力することによって、個別的な植物は入力された多様な情報を利用して同定または相関関係を把握することができる。
［実施例５］
（１次形質転換体の多産性定量）
１次形質転換体の種子多産性は完全不能から十分な多産性に至るまで非常に多様な範囲を示す。２２０９０の１次形質転換植物、PGA１６３３の１３３８株（８４％）及びPGA２１４４の１７０２０株（８３％）は多産の種子を生産した。個体の１７％は不能であり、１３％は１０個以下の種子を生産した。約半分の個体は１００個以上の種子を生産し、８％は５０乃至１００個の種子を生産した。残り植物は１０〜５０個の種子を生産した。pGA１６３３細胞株を増幅させ、形質転換植物の大部分は次の世代で多産性を示した。しかし、１次形質転換で部分的な不能を示したものは依然として部分的な不能（５０個以上の種子生産）を示した。このような低い多産性はT-DNAによる遺伝子的変異やその他の変異体によるものであると考えられる。pGA２１４４株は増幅させてその後の実験に使用できるように十分な量の種子を収集した。
［実施例６］
（形態的スクリーン及び変異体特徴を有する稲植物増殖）
本発明の適用の例として、T１種子はフラットに植え、フラットは３日または４日間冷蔵保管した後、発芽及び生長する間に温室または成長室においた。T１成長植物は一定の間隔、つまり、週ごとに観察し、これをノートブックに記録したりまたはパルムピロットを利用して記録し、観察及び／または測定した植物のイメージもデータベースに記録した。形態的に変異特徴を有する“注目する”T１細胞株比率は観察結果に基づいて確認した。注目するT１植物が種子を生成しない場合、組織からDNAを抽出して遺伝子を分離した。そうでない場合、注目する細胞株からT２種子を生産させ、T１植物から収集したT２種子からT２植物を再生させた後、観察及び分析し、T３種子を生成させた。T３種子からT３植物を再生させて変異体特徴を確認した。DNAをその後抽出して遺伝子分離に使用した。また、変異体特徴を観察した後、T２植物生産のためにT２種子を植えることができる。T２植物はDNA抽出及びその後の遺伝子分離のための組織原料として使用したりまたは天然型植物と交配した場合、F１種子のハイブリッドを製造するのに使用することができる。交配は各々の選別植物の４〜５個の花を取り、T２植物を雄蘂母体として、天然型花を雌蘂母体として使用して実施した。結果物であるF１種子を集めて植えた後、選別した。分離を記録し表現型を観察した。F１ハイブリッド種子からF２種子を生成させた後、F２個体を生長させて分離を記録し表現型を観察した。前記個体はDNA抽出と遺伝子分離のための植物組織として提供することができる。
［実施例７］
（真菌、細菌、ウイルス及び昆虫抵抗性を有する形質転換された稲細胞株の検索）
バクテリア抵抗性検索の一例はT２種子と天然型対照群種子から健康な植物を生長させた。形質転換されていない植物はバクテリアに感染されやすい対照群として使用した。苗木は一定の発生段階に生長させた後、天然型稲苗木に接種物（陽性対照群）を散布し、残りには摸造接種物（陰性対照群）を散布した。
一般に、バクテリア接種物は５０％のグリセリンに保管された伝染性または非伝染性病原菌原液として準備して-８０℃においた。前記原液を冷凍庫で取ってリファムピシン（１００mg／L）が含まれた選別培地に滅菌接種ループを利用して接種し、２８℃で３日間培養した。前記開始培養物は大量液体培養物の接種源として使用した。一夜培養した培養物１mLはOD６００nmで吸光度を測定し、OD ０．５〜０．８の培養物を大量培養用種菌として使用した。大量培養した後、培養物は１０８cfu／mLに希釈して接種物を準備した。
摸造接種物（陰性対照群）は実験対象植物各々の葉表面に濡れる程度に加えた。細菌接種と培養は前記のように一定の接種物希釈液を植物葉の表面に濡れるように加えて実施した。
接種２４時間後、細菌性疾患症状を判断して細菌抵抗性を示す植物数を測定した。抵抗性と感染性に分別される“表現型窓”が確認された。抵抗性検索の目的は疾病周期後期に現れる疾患性（感染性）表現型とは対照的で、抵抗性表現型（感染後、比較的に速く）を示す各個体を確認することである。実験対象である各病原菌／植物組合間の表現型差は区別可能である。
一般に、植物病原性細菌と抵抗性植物間の相互作用は比較的に速かに行われるので（接種後、１６〜２８時間、“hpi”）、接種後（２４時間）比較的に速く植物の感染性を判断する。抵抗性植物の葉は過敏反応（“HR”）を示す。２４hpiに、少ない部位損傷が接種された葉の表面に現れ、これは細菌侵入部位を囲んでいる細胞の衰弱によるものである。抵抗性（または非両立性）条件は７日の評価期間内に維持させた。HRは細胞壊死部位にのみ厳格に限められ、壊死部位は非常に乾燥された状態であり、青い光の健康な組織と壊死部位の間に境界が形成されている。壊死部位の周縁以外には白化部分がなかった。抵抗性（非両立性）及び感染性（両立性）の相互表現型は２種類の側面で差がある:（１）症状出現時期及び（２）症状形態表現。通常抵抗性植物は２４hpiで接種部を囲んだ形態の制限的な細胞壊死（HR）を示すが、その反面感染性植物はこの時期にいかなる症状も示さない。両立的相互作用（感染性）表現型は約７２hpiで現れ始める。乾いた細胞壊死組織を囲んでいる水気のある白化性周縁特性を示す。実験期間が７日以上過ぎれば、白化性周縁が拡張されて中間部位まで壊死を示す。
形質転換された稲細胞株と天然型稲細胞株は接種２４時間後に生長室で観察し、非病原性細菌-接種した天然型植物で表現される症状と比較されるHR症状を観察し、過敏反応を示す植物を肉眼で確認した。感染性植物はこの時期にいかなる症状も示さない。観察結果はパルムピロット携帯型スキャナーを利用して記録した。
抵抗性植物は萎れ、抵抗性植物として推定される植物はHR条件で実験期間の間に観察して検証した。
観察段階は接種後、約４８及び７５時間に繰り返し、観察は植物のある生長室で実施した。疾病症状が萎れたT２植物で現れる場合、萎れた葉はフラットで除去した。天然型植物は病原性病原菌（陽性対照群）で接種し、疾病症状を確認するための可視化された参考基準として使用した。
接種７２時間（３日）に、全てのフラットは温室に移し、培養し続けた。初期に抵抗性株と推定されたT２株はさらに観察し、実験期間が７日以上であるHR条件が維持される場合（例、抵抗性表現型（厳格に限定された乾いた壊死部位）が接種７日にも依然として維持される）、T２株は抵抗性と記録した。観察結果はパルムピロット携帯型スキャナーを利用して記録し、抵抗性と判断されたT２株の各々はコダックDC２６５カメラで写真を撮影した。また、前記のように収集した種子の開花を促進させる温室で長期間生長させた抵抗性推定植物から組織を収得した。最少抵抗性検査を通過した植物は疾病抵抗性確証実験で再び検索し、遺伝子分離及び同定をさらに実施するだけでなく、F２植物を引き続き再検索するために天然型植物と交配させた。
具体的な細菌検索は検索対象である細菌／植物組合によって非常に変わることがあり、前記実施例は細菌検索の通常の記載を提供するものである。このような細菌検索の追加的な実施例は本発明の技術分野で公知のことである。
［実施例８］
（環境ストレス抵抗性を有する形質転換株検索）
本発明の稲株は好ましい特性を確認するために直接検索で分析することができる。本実施例において、直接検索はストレス抵抗性に関与する遺伝子を同定するために実施された。
乾燥抵抗性のT２を検索した。形質転換株及び対照群植物の各々の種子を適した方法で植えた。水と肥料処理は注意深く記録し、処理したポート、株またはフラットは残余体とは区別して表示した。温度、光及び湿度もやはりパルムピロットに記録した。植物はフラットと実験に関係なく可能な限り均一に維持した。発芽後、一定の時期に水供給を中断した（天然型対照群の半分は正常に水を与えた）。水供給を中断した時点で植物の形態を確認した。何日後、または“水供給中断”した天然型植物が顕著に萎れた時、株に対する乾燥抵抗性を評価し、抵抗性株を表示した。表示した株の各植物葉を収集して２mｌの冷凍-バイアルに入れ、表記した後、-８０℃の冷凍庫に放置した。表示した株の各植物葉DEを収集し、葉はバーコードが記載された５０mｌのファルコン管に入れた。このように収集した葉（“試料”）は分析秤で重量を測定し、各株のID及び“生体重量”（FW）をパルムピロットの記録した。試料は５０mlの管に入れ、２５mlのDI水を各管に添加した後、前記管を５℃に放置した。１８〜２４時間後、管を冷蔵状態から取り出した。各葉は注意深く水から取り出し、表面を弱く握って乾燥させた。試料の重量を測定し、これを“膨脹重量”（DW）で記録した。相対的な水の含量（RWC）は次の式で計算した:RWC=（FW-DW）／（TW-DW）×１００。
植物は乾燥条件で回復させた。３〜５日後、回復程度を評価した。これは新規成長、老いた葉の色相回復で決め、RWCまたはその他の分析値を活用して決めた。通常の形態または乾燥寛容／復元のうちのいずれか一つで天然型と差のない株は進行せず、前記分析後に廃棄した。
回復した後、関心株は種子を収集し再検索するために表示した。表示された株の種子を個別的にまたはT３種子で収集した。ほとんど特徴的な表現型を示す株の組織と種子は各々個別的にまたは同じ子孫で採集した。T３種子が利用できない場合、T２種子を回収した。目的株各々の種子は天然型種子と平行に植えた。乾燥抵抗性検索は前記再検索と同一に繰り返した。
［実施例９］
（形質転換稲細胞の塩耐性程度変異検索のための発芽分析）
塩耐性検索は塩を付与する遺伝子を同定及び分離するために実施した。１次検索はT１植物を対象として発芽分析で実施した。T１種子は好ましい量のNaClが添加された適切な培地に植えた。陽性及び陰性対照群として、天然型種子をNaCl補充または補充しない各条件で植えた。種子は一般的な稲成長条件下で発芽させた。表現型程度と多様な効果が発芽分析で観察されると期待された。塩耐性発芽は５段階に分けた:１）吸収、小根出現２）子葉伸張及び緑化３）根伸張４）根伸張及び根毛形成５）真葉発生。高い水準の強力な緊縮検索には５段階を全て通過することができる植物が要求される。このような変異体が観察されなければ、低い水準の緊縮基準が使用される。低い水準の緊縮検索時に全ての基準が満足される必要はなく、陽性と推定されるものを二次検索に使用する。塩耐性は耐性分離比率で計算した。
［実施例１０］
（DNAゲル-ブロット分析）
ゲノムDNAは公知のように（Dellaporta外、1983）ヘッディング段階の成体葉から分離し、それ全体が本願内容に含まれる。ゲノムDNA（５μg）はEcoRIで切断し、０．７％のアガロースゲルから分離した後、ナイロン膜に転移させて３２p-標識されたプローブにハイドリードさせた。GUSプローブは１．８kbのBamHI-EcoRI切片で準備し、hphプローブは０．７kbのEcoRI切片で準備した。全てのブロット分析過程は公知のように（Kang外、1998）に実施し、その内容は本発明に含まれる。
［実施例１１］
（形質転換稲植物でT-DNA統合パターンの分子的特徴）
統合されたT-DNAは無作為的に選別した１次形質転換体から調査した（表２）。表２はGUSまたはhphコーディング部位をプローブとして利用したゲノムDNAゲル-ブロット分析を要約したものである。形質転換株３４株を実験し、１１株はGUS遺伝子の単一コピーを１３株はhph遺伝子の単一コピーを含んでいた。残りの株はGUSまたはhphを１コピー以上含んでいた。このような結果は形質転換株の約３５％が単一T-DNA挿入体を含んでいることを意味する。いくつの株において、GUS及びhph遺伝子の数が互いに異なっており、恐らくこれは形質転換過程中T-DNA裁培列によるものであり（Ohba外、1995）、前述した参照論文の内容は本発明に含まれる。
T-DNA挿入体の位置は１次形質転換植物（T１）のハイグロマイシン-抵抗性後代（T２）の数を測定して分析した。３４株のうちの２４株は一つの位置でT-DNAを含んでおり、残りの１０株は連結されていないT-DNA挿入体を含んでいた（表２）。これは形質転換植物がT-DNA挿入体を平均１．４loci含んでいることを示す。このような結果はT-DNA標識された植物が平均１．４挿入体を含んでいるというアラビドプシスにおける結果と非常に類似なことであり（Feldmann、1991）、前記文献の内容は本発明に含まれる。ハイグロマイシン耐性で推算された挿入体位置数はDNAゲル-ブロット分析で推算したT-DNAコピー数に比べて多少低かった（表２）。これは単一染色体に２つ以上のT-DNAコピーが平行に統合されたためであると推定され、これは既存に双子葉植物で観察されたことがあり（Krizkova and Hrouda、1998）、前記文献の内容は本発明に含まれる。PCRは単一染色体に複数個のT-DNAを含んでいる株のT-DNA配列を調査するために使用した。その結果、T-DNAコピーは正方向または逆方向に反復配列されることが確認できた。単一位置に複数個のT-DNAコピーを含んでいる６株のT-DNAボーダーの間の序列を分析した。その結果、２細胞株はT-DNAの間にDNAを含んでいなかった。残りの４細胞株はフィラーDNAを６-４８８bp含んでいた。８１５５８株の場合にはGUS遺伝子部位に４８８bp以上のフィラーDNA長さが発見された。DNAゲル-ブロット分析でB１５５８株の場合、hphよりGUSコピーを１回以上さらに含んでいることを確認した（表２）。このような部分的T-DNAはタバコのような単子葉植物で既に報告されたことがあり（Krizkova and Hrouda、1998）、その内容は本発明に含まれる。反復的なT-DNAコピー形成は標的部位１ケ所に複数回共同-統合されたことによる結果であり得る。
T-DNA挿入体の大部分が特定位置の右側ボーダー内にあることが確認されたことがあり（reviewed in Tinland、1996）、前記文献の内容は本発明に含まれる。本発明の標識された株でも同一であるかどうかを確認するために、稲ゲノムDNAとT-DNA右側ボーダー間の連結部位を序列分析した（図１c）。分析した結果、大部分の稲細胞株の境界がアラビドプシスとタバコ形質転換植物で確認されたT-DNAニッキング位置と同一でなかった。双子葉種において、大部分のT-DNAは右側ボーダーの１番目または２番目塩基後にニッキングされた。本発明の標識された細胞株の場合、５種の株がアラビドプシス及びタバコと類似していた。しかし、大部分の頻繁な連結部（３２株のうちの１１株）は右側ボーダーの３番目塩基後であった。７種の細胞株では、T-DNAと右側オーダー間の境界が連結されていた。残り９種はTDNAの１-１２塩基が削除されたと確認された。これは形質転換稲植物で３個のうちの２個が、形質転換トウモロコシ植物では１０個のうちの４個が右側ボーダーから起源した３個の塩基を含んでいるという事実が報告されたことがある。（Hiei外、1994;Ishida外、1996）
［実施例１２］
（GUSの組織化学的染色法及び鏡検）
GUSの組織化学的染色は染色溶液に２０％メタノールを添加することを除いてはダイなどの方法によって実施し（Dai、1996）、前記引用文献の内容は本発明に含まれる。染色後、組織は５０％のエタノール、５％の酢酸及び３．７％のホルムアルデヒドを含む溶液で固定し、パラプラスト（Sigma）で封した。試料は１０μｍの厚さに切り、暗-視野照明で顕微鏡で観察した。
［実施例１３］
（形質転換稲植物でGUS遺伝子発現が優先的な器官評価）
遺伝子トラップシステムの効率性を評価するためにGUS発現様相をpGA２１４４に形質転換した１次形質転換植物の多様な器官を対象として実験した。GUS活性は５３５３株の葉と根で分析し、７０２６株は成体花で、１９４８株は発生した種子を対象として分析した。その結果、GUS効率は葉で２．０％（１０６／５３５３）、根で２．１％（１１３／５３５３）、花で１．９％（１３３／７０２６）及び未成熟種子で１．６％（３１／１９４８）と確認された（表２）。葉でのGUS陽性株１０６株のうちの１５（１４．２％）株が葉特異的であった。これと類似に、根で陽性を示した１１３株のうちの２５（２２．１％）細胞株のみ根特異的であった。また、pGA１６３３株でのGUS発現効率もやはり葉は１．１％（８／７５０）で、根は０．９％（７／７５０）であった。このような数値はpGA２１４４より低いものに変形されたOsTubA１イントロンがGUS標識効率を増加させることを意味する。
葉でのGUS活性を示した１０６株の染色様相を詳細に観察した（図３-１９）。葉脈-優先的GUS染色様相が大部分観察され（４３．４％）、１４（１３．２％）株は葉脈の間の葉肉に優先的に染色された。大部分の試料で、GUS染色は切断で露出された端部で強く観察された。稲葉の高濃度セルロース、リグニン、シリカ細胞及びワックスがGUS基質透過を遮断することができると考えられる。株の大部分は細胞分化部位でGUS染色を示し、株の半分以上は細胞伸張または細胞分裂部位でGUS染色を示した。形質転換花でもまたGUS染色様相が特徴的に現れた。花でGUS活性を示した１３３株のうち、５０（３７．６％）株は外花穎と外花頴で強いGUS染色を優先的に示した。１株は苞穎でGUS活性を示し、８株は単に鱗被でのみ、４株は単に心皮でのみGUS活性を示した。雄蘂特異的にGUS活性を示す１１株のうち、７株は花粉に特異的であった。発生中の種子もまた開花後、５〜１０日にGUS染色を実施した。前記株のうちの大部分が組織優先的発現様相を示した。一例として、G９３０７２６株は糊粉層-優先的GUS染色様相を示し、トラップ遺伝子が糊粉層形成や組織で特異機能に関与できることを示唆した。
［実施例１４］
（T-DNAフランキング序列及び二つの統合されたT-DNA間の接合序列分離）
T-DNA／GUSイントロンを含んでいる内在性遺伝子を同定するためにPCRを基本とした方法を使用した。T-DNAフランキング序列は熱非対称的に織り交ぜられたPCRを公知と同一に使用して分離した（Liu and Whittier、1995，それ全体が本発明の参照として開示される）。１次サイクルに使用した特異プライマーは5'GCCGTAATGAGTGACCGCATCG3'（Gus１）（序列番号７６）であり、２次時には5'ATCTGCATCGGCGAACTGATCG3' （Gus２）（序列番号７７）を、そして３次では5'CACGGGTTGGGGTTTCTACAGG3'（Gus３）（序列番号７８）を使用した。二つの統合されたT-DNA間の接合はプライマーGus３と5'GCTTGGACTATAATACCTGAC3'（T７）（序列番号７９）を使用したPCRで増幅させた。PCR産物は BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit（PE Applied Biosystems, Foster City, CA ,USA ）で分析した。
［実施例１５］
（本発明遺伝子の上部調節序列を決めるための逆方向PCR）
本発明の遺伝子は器官特異的様相に発現される。したがって、このような遺伝子の発現を調節する５’上部調節序列を同定して変異された表現型の植物を遺伝学的に製造するのに有用に使用することができる。その例として、分離された５’調節部は植物に異種の遺伝子を作動可能に連結及び形質転換させた時、異種遺伝子の同一な器官特異的発現を付与することができる。遺伝子の５’調節序列を決めるために逆方向PCR技術を下記のように使用することができる。
逆方向PCRは本願に記載されたように公知の核酸序列を延長させるのに使用することができる。逆方向PCR反応はオクマンなど（Ochman外、in Ch. 10 of PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification, (Henry A. Erlich, Ed.) W.H. Freeman and Co. (1992)）の文献に記述されており、前記文献の内容は本発明に含まれる。伝統的なPCRはDNAの相補的な序列を合成するのに二つのプライマーを必要とする。逆方向PCRでは単に核序列のみが必要である。
このような技術の実施で、稲ゲノムDNAを分離しPstIで切断してT-DNAだけでなく、未知のT-DNAフランキング序列を含んでいる核酸切片を製造した。前記切片は自家-接合して円形分子を形成させ、PCR反応の鋳型になった。PCRプライマーは目的遺伝子に相応するもので、５’調節部方向に向かい、公知の下部序列に基づいて製作した。他のプライマー、つまり、未知の序列の上部であり、フランキングプラスミドDNAに存在している序列に基づいて製作したプライマーを準備した。前記プライマーは公知序列とは離れて円形鋳型内に含まれた未知の序列方向に核酸を合成する。PCR反応が終わった後、PCR産物は序列分析して外因的核酸序列の核心序列が通過した遺伝子序列を同定し、遺伝子序列確認部分を拡大させる。このような方法で各新規遺伝子序列全体を同定することができる。また、隣接したコーディングまたはノンコーディング部位序列を確認することができる。プロモータはダイタベースを利用したり下記のようなプロモータリポーターベクターを利用して同定することができる。
５’調節部位プライマー：
1st 5’-TTGGGGTTTCTACAGGACGTAAC-3’ (23mer) （序列番号８０）
2nd 5’-CAAGTTAGTCATGTAATTAGCCAC-3’ (24mer)（序列番号８１）
その他のプライマー：
1st 5’-CCATGTAGTGTATTGACCGATTC-3’(23mer)（序列番号８２）
2nd 5’-TCGTCTGGCTAAGATCGGCCGCA-3’(23mer)（序列番号８３）
また、他のPCR方法を使用して本発明の遺伝子フランキング序列を決めることができる。下記例示的な過程はゲノムDNAの上部序列を決める通常の方法を記載したことである。本発明の標識された遺伝子序列から由来した序列を使用することによって、染色体歩行技術によって相応する遺伝子のプロモータを分離することができる。染色体歩行技術はクローンテック社のGenomeWalkerキットを利用することができ、前記キットは５個の全体ゲノムDNA試料が互いに異なる制限酵素、６個の塩基を認識し、平滑断端で切断する酵素に各々切断されている。その後、切断してオリゴヌクレオチドアダプタを切断されたゲノムDNA切片の各末端に挿入させる。
５個のゲノムDNAライブラリー各々に対して、製造社の指示（本発明の参照として含む）によってキットで提供する外部アダプタプライマーと外部遺伝子特異的プライマーを利用して１次PCR反応を実施した。遺伝子特異プライマーは目的遺伝子に特異的に選別し、融解温度、長さ及び位置がPCR反応で一貫的でなければ成らない。各１次PCR反応はゲノムDNA５ng、１０X Tth反応緩衝液５l、各dNTP０．２mM、外部アダプタプライマーと外部遺伝子特異的プライマー０．２M及び５０X Tth重合酵素混合物１μlを全５０μlで実施した。１次PCR反応の反応周期は次の通りである:１分、９４℃／２秒９４℃、３分７２℃（７回）／２秒９４℃、３分６７℃（３２HOI）／５分６７℃。
１次PCR産物は希釈して２次PCRの鋳型として使用し、２次PCRは製造社の指示によって１次PCR産物の内部に位置するネストプライマー一対を利用して進めた。一例として、１次PCR産物５μlを１８０倍に希釈することができる。反応はネストプライマー以外には１次PCR反応と同一な組成物５０μlで進めた。１次ネストプライマーはアダプタに特異的であり、GenomeWalkerキットに含まれたものである。２次ネストプライマーはクローンするプライマーに対する特定遺伝子に特異的であり、PCR反応時に一貫的な融解温度、長さ及び位置を示す。２次PCR反応での反応変数は次の通りである:１分９４℃／２秒９４℃、３分７２℃（６回）／２秒９４℃、３分６７℃（２５回）／５分６７℃。
２次PCR産物は基本的な方法で精製、クロニング及び序列分析した。代案として、２種以上の稲ゲノムDNAライブラリーは２種以上の制限酵素を利用して構築することができる。切断されたゲノムDNAは一本鎖、円形または直線型DNAに転換可能なベクターにクローンした。ビオチン接合されたオリゴヌクレオチドは遺伝子序列のうちの少なくとも１５個以上のヌクレオチドを含み、一本鎖DNAとハイブリッドされる。ビオチン接合されたオリゴヌクレオチドと遺伝子序列を含む一本鎖DNA間のハイブリッドを分離する。その後、遺伝子序列を含む一本鎖DNAをビーズから落とした後、遺伝子序列に特異的プライマーやまたはクロニングベクターに含まれた序列に対応するプライマーを利用して二本鎖DNAを製造する。製造された二本鎖NDAは細菌に形質転換させる。遺伝子序列を含んでいるDNAはコロニーPCRやコロニーハイブリダイゼイションで同定する。
前記のように上部ゲノム序列をクロニングして序列分析した後、上部序列内プロモータと転写開始部と予想される部分は遺伝子の上部序列を公知の転写開始部、転写因子結合部またはプロモータ序列のあるダイタベースと比較して確認することができる。
また、上部序列内プロモータは下記の実施例１８に記載された方法のようにプロモータリポーターベクターを利用して確認することができるかもしれない。
［実施例１６］
（クローン一つの上部序列内調節部位確認）
遺伝子の５’調節序列を確認した後、これらを分離することができ、GUS５’部位またはその他のリポーター遺伝子に連結して組織-特異的発現特性を確認し、プロモータ調節部を分析して調節部の境界面を決めることができる。遺伝子の上部ゲノム序列は好ましいプロモータリポーターベクター、例えば、クローンテック社のpSEAP-Basic、pSEAP-Enhancer、pβgal-Basic、pβgal-EnhancerまたはpEGFP-１でクロニングした。簡略に説明すれば、このようなプロモータリポーターベクターの各々は分泌性アルカリ性ホスファターゼ、ベータ-ガラクトシダーゼまたは青い蛍光蛋白質のような簡略分析用蛋白質を暗号化するリポーター遺伝子上部に多クローン部位がある。遺伝子の上部序列またはその切片はリポーター遺伝子上部の多クローン部位の両方向に挿入し、これを植物細胞を形質転換させる。形質転換体から全植物を再生させ、器官-特異的発現を確認することができる。リポーター蛋白質発現率を分析し、クロニング部位に挿入体を含まないベクターでの発現率と比較した。対照群ベクターと挿入体を含むベクターの発現増加は挿入体にプロモータが存在することを示す。必要である場合、上部序列は弱いプロモータ序列による転写水準を増加させるエンハンサーを含むベクターにクロニングすることができる。プロモータリポーターベクターに対する適切な宿主細胞は、前述した遺伝子発現様相の確認結果によって選択することができる。挿入体のないベクターで留意する程度の発現が観察されるのは、挿入された上部序列にプロモータ序列が存在することを示す。
上部ゲノムDNA内のプロモータ序列はエキソヌクレアーゼのIII処理のような通常の技術で上部DNAのネスト削除を実施しさらに明確にすることができる。削除した切片産物はプロモータリポーターベクターに挿入して前記削除がプロモータ活性を減少または抹消させるものであるかどうかを確認することができる。このような方法で、プロモータの境界面を確認することができる。好ましくは、プロモータ内潜在的個別調節部は指定部位変異体誘発またはリンカースキャニングで同定して、プロモータ内潜在的転写因子結合部位を削除することができる。前記変異体の器官-優先的転写率に与える影響は変異体をプロモータリポーターベクターのクロニング部位に挿入して確認することができる。下記の実施例１７に記載したように、プロモータと作用する例示的な蛋白質を利用してプロモータ序列を同定することができる。
［実施例１７］
（プロモータ序列と作用する蛋白質、上部調節序列またはmRNAの同定）
プロモータ部位内の序列は転写因子と結合することができ、これらは公知の転写因子結合部位と相同性を利用したり、通常の変異体誘発またはプロモータ序列を含んでいるリポータープラスミドの欠損分析を通じて同定することができる。その例として、欠損は分析可能なリポーター遺伝子に作動可能に連結された目的プロモータ序列を含むリポータープラスミド上で行うことができる。リポータープラスミドはプロモータ部位内に多様な欠損体を有しているもので、適した宿主細胞に形質転換させた後、発現率を確認して欠損体の作用を分析する。欠損時、発現率が減少する部位内に位置した転写因子結合部位は直接変異体誘発、リンカースキャニング分析または当業者に公知されたその他の技術を利用して確認することができる。プロモータ序列と相互作用する蛋白質を暗号化する核酸はワン-ハイブリッドシステム、例えば、クローンテック社のthe Matchmakerワン-ハイブリッドシステムキット（Catalog No. K1603-1）に同封されたマニュアルに記載されたように、を利用して同定することができる。簡略には、Matchmakerワン-ハイブリッドシステムは次の通りに利用することができる。その結合蛋白質を同定する標的序列は選択的リポーター遺伝子の上位にクロニングし、酵母ゲノムに統合させた。好ましくは、標的序列複数個を平行にリポータープラスミドに挿入させる。
ライブラリーはプロモータ及びGAL４のような酵母転写因子の活性ドメインに対する結合力を評価するために、cDNA間の融合で構成されたもので、統合されたリポーター序列を含む酵母菌株に形質転換される。酵母は選別培地に接種してプロモータ序列に連結された選別マーカーを発現する細胞を選択した。選別培地で生育するコロニーは標的序列に結合する蛋白質を暗号化している遺伝子を含む。融合蛋白質を暗号化する遺伝子内挿入体は序列分析で特性化することができる。また、挿入体は発現ベクターまたは生体内電子ベクターに挿入することができる。挿入体によって暗号化されるポリペプチドとプロモータDNAの結合は当業者に公知された方法、例えば、ゲル移動上分析またはDNase保護分析で確認することができる。
［実施例１８］
（異種の遺伝子コーディング序列に作動可能に連結された器官-優先的プロモータを有するキメラ遺伝子に形質転換された植物）
プロモータと遺伝子の上位に位置したその他の調節序列は挿入された遺伝子を器官-優先的、時期的、発生学的及び定量的方式で発現することができる発現ベクターを製作するのに使用することができる。好ましい器官-優先的、時期的、発生学的及び定量的様相を誘導することができるプロモータは発現分析研究の結果を利用して選択することができる。例えば、雄蘂で高い発現を提供するプロモータを所望する場合、雄蘂で高い発現を示す遺伝子上部のプロモータ序列を発現ベクターに使用することができる。
目的とした遺伝子は前述した器官-優先的プロモータの下部に挿入することができる。好ましくは、目的プロモータを複数個の制限酵素認識部位に位置させてプロモータ下部に目的挿入体を容易にクロニングすることができ、したがって、プロモータは挿入された遺伝子の発現を誘導することができる。前記ベクターは発現ベクターに挿入された遺伝子からポリアデニル化されたmRNAを転写するために、マルチ制限酵素認識部位の下位にポリA信号をまた含むことができる。前記ベクターは植物細胞に形質転換させ、植物を再生させる。目的遺伝子の器官-優先的発現を確認し、変異された表現型、例えば器官大きさの増加または減少、生存性変異、疾病抵抗性変化及びストレスに対する反応変化を確認することができる。
［実施例１９］
（稲蛋白質の発現及び精製）
下記に本発明の稲蛋白質発現方法を例として提供する。本発明の稲蛋白質は稲またはその他の植物で過剰発現させることによって生産することができる。目的遺伝子を有する形質転換植物は小規模装置（例、実験室または温室）、大規模装置、例えば大規模装置の穀物システムで生長させることができる。このような方法は、蛋白質発現を容易に分離することができる組織、例えば稲粒に行われるように設定するのに有益であり得る。前記蛋白質はその他の植物種または植物細胞培養物で発現することができる。前記蛋白質はその後の植物組織から分離及び精製され得る。
一方、稲蛋白質は他の生物、つまり、細菌、酵母、昆虫、哺乳類システムまたはその他の公知のシステムで発現することができる。具体的には、同定したヌクレオチド序列で暗号化された蛋白質（序列番号１８〜３４または序列番号３５〜５１の遺伝子のうちの１種によって暗号化された序列番号５２〜６８のポリペプチド１種を含む）は全長を有したり破裂されたものであり得る。序列番号１８〜３４の核酸によって暗号化される序列番号３５〜５１の核酸は適した発現システムを利用して発現することができる。第一に、遺伝子の開始及び終結コードンを同定する。好ましくは、蛋白質の翻訳または発現を向上させる方法は公知されたことである。例えば、発現されたポリペプチドを暗号化する核酸が開始部位として提供されるメチオニンコードン、強力なシン-デルガーノ序列または停止コードンが欠乏した場合、前記序列を添加することができる。これと類似に、同定した核酸が転写終結信号がない場合、前記構造体に、例えば適切な供与者序列から序列がスプライシングアウトされた構造体にこのようなヌクレオチド序列を添加させることができる。さらに、コーディング序列は強力な構成性プロモータまたは所望する場合、誘導性プロモータに作動可能に連結することができる。発現されるポリペプチドを暗号化する前記同定した核酸またはそれらの一部は、例えば、前記同定した核酸またはそれらの一部に相補的なオリゴヌクレオチドプライマーで細菌性発現ベクターまたは稲ゲノムをPCRして収得することができ、コーディング序列をベクターに挿入するのに適するように制限エンドヌクレアーゼ序列を含んで暗号序列をベクタープロモータによって発現させることができる。一方、その他の通常のクロニング技術を利用してコーディング序列をプロモータ調節下に位置させることができる。具体的に、終結信号はコーディング序列の下位に位置させてコーディング序列の転写を適切な位置で終結させることができる。
E.coliで蛋白質を発現させるためのいくつの類発現ベクターシステムは本発明が属する技術分野の当業者には公知のことで、容易に実施することができる。コーディング序列はこのようなベクターのうちのいずれにも挿入してプロモータ調節下に位置させることができる。発現ベクターはその後の蛋白質過剰発現に適したDH５αまたはその他のE.coli菌株に形質転換させることができる。発現された蛋白質は変更して差別された細胞標的性、例えば、グラム陰性または陽性発現宿主の周辺細胞質空間または細胞の外部（例、培養培地外に）に対する標的性を付与する蛋白質標識を含むことができる。具体化された場合には、分子生物学の１６枚の現行プロトコルに記載された浸透圧衝撃による細胞溶解方法（Molecular Biology, Vol. 2, (Ausubel, et al., Eds.) John Wiley & Sons, Inc. (1997)）を使用するために細胞からポリペプチドを流離させることができる。他の具体化では、蛋白質標識はまた、親水性クロマトグラフィを利用して分画された細胞または培養培地から蛋白質精製を容易にすることができる。このような方法は本発明が稲蛋白質を発現させるのに利用することができる。発現された稲蛋白質はその後通常の方法、つまり、アンモニウムスルフェート沈殿、標準クロマトグラフィ、免疫沈殿、免疫クロマトグラフィ、大きさ除外クロマトグラフィ、イオン交換クロマトグラフィ及びHPLCに精製される。他の方法で、ポリペプチドは宿主細胞で上層または宿主細胞の成長培地に十分に濃縮されたり純粋な状態に分泌されて、その後の濃縮過程なく計画された用途として使用することができる。前記収得した蛋白質の純度は当業界に広く知られた蛋白質解離方法であるSDS PAGEのような方法で分析することができる。クマシー、銀染色または抗体染色は目的蛋白質を視覚化するために使用することができる一般的な方法である。
同定された目的核酸またはその一部によって暗号化される蛋白質は標準免疫クロマトグラフィ技術を利用して精製することができる。その方法において、分泌された蛋白質、例えば培養培地または細胞抽出物を含む溶液を、前記分泌された蛋白質に対する抗体をクロマトグラフィ基質に固定させたコラムに適用させる。前記分泌された蛋白質は免疫クロマトグラフィコラムに付着される。その後、コラムは洗浄して非特異的結合蛋白質を除去する。特異的に結合した分泌蛋白質はその後コラムから遊離させ、標準方法で回収する。このような過程は当業界に公知されたことである。
他の蛋白質精製方法で、前記同定した目的核酸またはその一部をキメラポリペプチドを使用した精製方法を利用するために考案した発現ベクターに統合させることができる。このような戦略で、前記同定した目的核酸またはその一部のコーディング序列は、キメラの残り半分を暗号化する遺伝子のフレーム内に挿入した。キメラの残り半分は麦芽糖結合蛋白質（MBP）またはニッケル結合ポリペプチドを暗号化する序列であり得る。麦芽糖またはニッケルが固定されたクロマトグラフィ基質はキメラ蛋白質精製にその後使用される。プロテアーゼ切断部位はMBP遺伝子またはニッケル結合ポリペプチドと、前記同定した目的遺伝子またはその一部の間に設計することができる。
麦芽糖結合蛋白質の融合蛋白質製造に有用な発現ベクターはpMALで、malE遺伝子を暗号化している。pMal蛋白質融合システムにおいて、クローンした遺伝子はpMalベクターのmalE遺伝子下位に挿入させる。その結果、MBP-融合蛋白質が発現される。前記融合蛋白質は親水性クロマトグラフィで分離される。このような方法は分子生物学分野に属する当業者には広く公知されたことである。
［実施例２０］
（分離した蛋白質に対する抗体生産）
抗体は目的蛋白質を特異的に認知できるもので、当業界の公知の方法で合成ペプチドから製造することができる。参照としてAntibodies:A Laboratory Manual、（Harlow and Lane，Eds.）Cold Spring Harbor Laboratory（1988）がある。例えば、前記同定した目的遺伝子序列またはその一部によって暗号化されるアミノ酸序列を有する１５merペプチドは化学的に合成することができる。前記合成ペプチドはマウスに注入して抗体を製造する。または、前述した発現ベクターから発現された蛋白質試料を精製し、アミノ酸序列分析して再組合蛋白質の相同性を確認し、その後抗体製造に使用することができる。実際に純粋な蛋白質またはポリペプチド（序列番号５２〜６８のポリペプチドのうちの一つを含む）を実施例１９に記載されたように形質転換細胞から分離する。最終準備物内の蛋白質濃度は、例えば、１０，０００分子量カット-オフフィルター（AMICON filter device (Millipore, Bedford, MA ）を利用してmicrograms／mlに濃縮させる。単クローン性または多クローン性抗体は下記方法によって準備することができる。
本発明ポリペプチドのエピトープに対する単クローン性抗体は古典的な方法（Kohler, G. and Milstein, C., Nature 256:495 (1975）やこれから由来した公知の方法によってマウスとのハイブリドーマから準備することができる。簡略に説明すれば、マウスに前記選択した蛋白質またはこれから由来したペプチド少量（μｇ）を数週間繰り返して接種した。マウスを致死させ、抗体を生産する脾臓細胞を分離した。前記脾臓細胞はポリエチレングリコールを利用してマウス骨髄腫細胞と融合させ、融合されなかった細胞はアミノプテリンを含む選別培地（HAT medium）で培養して除去した。融合された細胞は希釈した後、ミクロタイタープレートのウォールに希釈物を分割して培養し続けた。抗体-生産性クローンは免疫分析方法、例えばをISA（Engvall, E., “Enzyme immunoassay ELISA and EMIT,” Meth. Enzymol. 70:419 (1980）)及びこれから由来した方法を通じて、前記ウォール上澄み液で抗体を検出して同定した。選別した陽性クローンは増殖させることができ、その単クローン性抗体を利用するために収得することができる。単クローン性抗体生産に対する詳細な過程は公知の文献（Davis，L.外、Basic Methods in Molecular Biology Elsevier, New York. Section 21-2;その全体が参照として本発明に開示される）に記載されている。
多クローン性抗血清は単一蛋白質またはペプチドの異種エピトープに対する抗体を含むもので、適切な動物を前記で記載した現された蛋白質またはペプチドに免疫化させて製造することができ、前記蛋白質またはペプチドは変形させないことがあり、または変形させて免疫原性を強化させることができる。効果的な多クローン性抗体生産は抗体と宿主種と関連する複数の因子によって影響を受ける。その例として、小さい分子は大きい分子に比べて免疫原性が低い傾向があり、運搬体または補強剤の使用が要求され得る。また、宿主動物は接種部位及び投与量によって反応が多様であって、抗体の投与量が不充分であるかまたは過剰な場合、低い力価の抗血清が生成される。抗体を少量（ng level）に多様な所に皮内投与することが最も確実である。ウサギに効果的な免疫形成実験方法は公知文献に記載されている（Vaitukaitis，J.外、J. Clin. Endocrinol. Metab. 33:988-991 (1971）、その全体が参照として本発明に開示される)。
追加抗原接種は一定の間隔で実施することができ、伴-定量的に、例えばゲル上での定量された抗体濃度に対する免疫拡散法で確認し、抗血清の抗体力価が減少し始めれば抗血清を収得した（Ouchterlony, O. 外Chap. 19 in: Handbook of Experimental Immunology D. Wier (ed) Blackwell (1973)、それ全体が参照として本発明に開示される）。抗体の平坦濃度は一般に０．１乃至０．２mg／ml（役１２uM）である。抗体に対する抗血清親水性は競争的結合曲線を作って決めることができる（Fisher, D., Chap. 42 in: Manual of Clinical Immunology, 2d Ed. (Rose and Friedman, Eds.) Amer. Soc. For Microbiol., Washington, D.C. (1980)、それ全体が参照として本発明に開示される。）。
公知の方法によって準備した抗体は生物学的試料で抗原性物質の濃度を決める定量的な免疫分析に有用であり、また、これらを使用して生物学的試料内抗原の存在を伴-定量的にまたは性質的にに同定することができる。
［実施例２１］
（cDNAを利用した変形された植物製造）
コーディング部位の断片を含むcDNAクローンを植物用形質転換ベクターにクロニングする。前記植物用形質転換ベクターはカリフラワーモザイクウイルス３５Sプロモータとポリアデニル化部位を含んで植物で遺伝子の発現が可能である（Schardl, C.L.外1987, “Design and construction of a versatile system for the expression of foreign genes in plants,” Gene, 61:1-11、それ全体が本発明の参照として開示される）。前記プラスミドはその後電気泳動でAgrobacterium tumefaciens 細胞に導入し、細菌性形質転換体をカナマイシン選別マーカーを利用して選別した。相補的なDNAを含んでいるアグロバクテリウム細胞はその後公知の葉ディスク形質転換方法で実施して植物に感染させる（Horsch外 、Science, 1985, 227:1229、それ全体が参照として本発明に開示される）。前記DNAのない同一プラスミドは対照群として利用した。ディスクはカナマイシンが含まれた培地で培養し、その後若枝を形成させる。前記若枝は根-誘導用選別培地に移植し、根が形成された苗木は土壌に植える。
相補的なDNAクローンが形質転換植物の表現型に与える影響を研究するために、形質転換苗木を表現型変形可能性を確認するための実験に使用する。関心植物はその後選別し、成体に生長させて、変異された表現型を有する植物を収得する。
［実施例２２］
（植物で目的遺伝子の過剰発現）
CaMV ３５Sプロモータ下部に遺伝子コーディング序列を入れて稲植物に形質転換した時、挿入した遺伝子が過剰発現されるプラスミドを製作する。前記プラスミドは実施例２１に記載したように、Agrobacterium tumefaciensで形質転換させる。目的遺伝子のコーディング序列を含むアグロバクテリア細胞は葉ディスク方法で稲植物に転移させる。目的遺伝子のコーディング序列が欠乏した同一プラスミドを対照群として利用する。
形質転換された稲苗木は表現型変異検査に使用し、目的とした表現型を示す植物はその後実験のために選別する。稲植物株は対照群稲植物と比較して変異された表現型を示すものを収得する。一方、全植物に本発明の稲遺伝子を形質転換して発現が増加された蛋白質を生産することができ、変異された表現型を示すようにすることもできる。
［実施例２３］
（共同抑制を利用した目的遺伝子発現が欠乏した植物生産）
目的遺伝子のコーディング部位断片に対応する切断されたDNA切片は植物用形質転換ベクターにクロニングする。前記植物用形質転換ベクターはカリフラワーモザイクウイルス３５Sプロモータポリアデニル化サイトを含んで実施例８で記載したように植物で遺伝子発現が可能である。前記プラスミドはその後電気泳動でAgrobacterium tumefaciens 細胞に導入し、細菌性形質転換体をカナマイシン選別マーカーを利用して選別した。所望の切片を含んでいるアグロバクテリウム細胞はその後前記に記載された、葉ディスク形質転換方法で実施して植物に感染させる。前記DNAのない同一プラスミドは対照群として利用する。前記形質転換された苗木は所望の表現型を確認する実験に使用される。
［実施例２４］
（アンチセンス技術を利用した目的遺伝子発現が欠乏した植物生産）
目的遺伝子のcDNAまたはその一部は植物用形質転換ベクターに逆方向にクロニングした。前記植物用形質転換ベクターはカリフラワーモザイクウイルス３５Sプロモータポリアデニル化サイトを含む。前記プラスミドは電気泳動でAgrobacterium tumefaciens 細胞に導入する。胚盤から由来した稲胚芽カリは前記植物用形質転換ベクターを含有したAgrobacterium tumefaciens と共同培養する。前記胚芽カリから苗木を生長させ、陽性形質転換体をカナマイシン処理でする。前記カナマイシン-抵抗性植物は所望の表現型を確認実験に使用する。
［実施例２５］
（変異表現型を有する形質転換植物検索）
本発明の遺伝子に形質転換された植物は温室環境で成体に生長させる。形質転換されていない植物と、目的遺伝子が欠乏した植物用形質転換ベクターに形質転換された植物は対照群として利用する。植物大きさに対する特異的表現型は肉眼で観察することができ、定規で測定することができる。一方、全植物または植物器官は収穫され、生体重量を確認した後、乾燥して乾燥重量を確認することができる。また、蛋白質を分析して蛋白質品質または蛋白質量の変化を確認することができるだけでなく、形質転換された植物の二次代謝産物の差異点を分析することができる。特定ストレスに対する反応検査で、植物は一定時間の間に特定ストレスに露出させ、その後形態学的特徴、植物大きさ、生体重量などを前述したように測定する。
図１は、遺伝子トラップベクターとして使用されたT-DNA挿入体の図式図である。３種の挿入体はベータ-グルコニダーゼ酵素を暗号化するGUSリポーター遺伝子をプロモータ無しに含んでいる。GUSは内在的活性プロモータ部位の下部に挿入された時に発現される。前記T-DNAまたは選択マーカーであるハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（HPH）を暗号化する遺伝子を含み、抗生剤ハイグロマイシンに対して抵抗性を示す。pGA１６３３とpGA２７０７はまた、３個のスプライシング受容体及び供与体推定部位をGUS遺伝子の５’末端隣接部に含んでいる。このような交代スプライシング部位は遺伝子挿入部とは独立的にGUS遺伝子が正確な解読構造に翻訳できるようにする。pGA２７０７のT-DNA序列は序列番号６９に示す。 図２は、本発明によるGUS遺伝子の発現頻度を示すグラフである。GUS発現率（形質転換させた全植物、花または種子に対する比率で決定）は葉、根、花及び種子で１．６乃至４．０％である。５，３５３個の苗木のうち、GUS陽性反応は１０６個の葉及び１１３個の根で確認され、２０，０００個の花のうちの８００株がGUS陽性を示し、発生中である種子５，４００個体重８６個がGUS陽性であった。 図３Ａ−３Ｅは、１b-１１５-２２株の発現特徴（A-D）とT-DNA挿入部（E）を示した図面である。ゲルミン（シュウ酸オキシダーゼ）-類似蛋白質は発生、ストレス反応及び病原菌に対する防御作用をする。 図４Ａ−４Ｂは、１b-１６４-４３株の発現特徴（A）とT-DNA挿入部（B）を示した図面である。 図５Ａ−５Ｂは、１b-１９２-４０株の発現特徴（A）とT-DNA挿入部（B）を示した図面である。 図６Ａ−６Ｃは、１b-２０７-２７株の発現特徴（A、B）とT-DNA挿入部（C）を示した図面である。 図７Ａ−７Ｂは、１b-１３８-０７株の発現特徴（A）とT-DNA挿入部（B）を示した図面である。 図８Ａ−８Ｂは、１d-０５９-１２株の発現特徴（A）とT-DNA挿入部（B）を示した図面である。挿入序列はRNA-結合蛋白質の２番目エクソンに位置し、RNA結合に関与する。 図９Ａ−９Ｂは、１c-０８７-４０株の発現特徴（A）とT-DNA挿入部（B）を示した図面である。挿入序列は液胞排卵及び胚形成に関与するH+-ATPaseサブユニットCの８番目イントロンに位置する。 図１０Ａ−１０Ｂは、１c-０１７-１４株の発現特徴（A）とT-DNA挿入部（B）を示した図面である。挿入序列は桂皮酸４-ヒドロキシラーゼの２番目イントロンに位置する。 図１１Ａ−１１Ｂは、１c-０３８-５６株の発現特徴（A）とT-DNA挿入部（B）を示した図面である。挿入序列はミトコンドリアの光呼吸に影響を与える転写に関与するH-蛋白質プロモータ結合因子-２aの最後イントロンに位置する。 図１２Ａ−１２Ｃは、１c-０４１-４７株の発現特徴（A、B）とT-DNA挿入部（C）を示した図面である。挿入序列は外部損傷に対する反応でDNA修復に関与するフラップエンドヌクレアーゼの６番目イントロンに存在する。 図１３Ａ−１３Ｂは、１c-０６４-２０株の発現特徴（A）とT-DNA挿入部（B）を示した図面である。挿入序列は高温またはその他のストレス状態で発現される分子的シャペロンである、熱衝撃蛋白質７０の３番目エクソンに位置する。 図１４Ａ−１４Ｂは、１c-１０９-３５株の発現特徴（A）とT-DNA挿入部（B）を示した図面である。挿入序列は栄養分輸送に関与するアンモニウム輸送体の２番目イントロンに位置する。 図１５Ａ−１５Ｂは、１c-１０９-５１株の発現特徴（A）とT-DNA挿入部（B）を示した図面である。挿入序列はATP-依存性RNAヘリカーゼの４番目エクソンに位置する。前記ATP-依存性RNAヘリカーゼはRNA物質代謝経路及びリボソーム生合成に関与し、細胞生存に必須であるだけでなく、初期組合段階に重要な因子として作用した６０ Sリボソームサブユニットを形成する。 図１６Ａ−１６Ｂは、１c-０５６-０７株の発現特徴（A）とT-DNA挿入部（B）を示した図面である。挿入序列はグルコース６-ホスフェート／ホスフェート輸送体の第１イントロンに位置する。 図１７Ａ−１７Ｂは、１c-１００-３２株の発現特徴（A）とT-DNA挿入部（B）を示した図面である。挿入序列はRNAメチル基転移酵素の９番目エクソンに存在する。 図１８Ａ−１８Ｂは、１c-１４２-２７株の発現特徴（A）とT-DNA挿入部（B）を示した図面である。挿入序列はアクチンデポリマライジング因子５の３番目エクソンに位置する。 図１９Ａ−１９Ｂは、１c-１４０-０４株の発現特徴（A）とT-DNA挿入部（B）を示した図面である。挿入序列はベータ-グルコシダーゼの２番目イントロンに位置する。

Claims (66)

  1. 序列番号１８〜３４及び序列番号１８〜３４に相補的なヌクレオチド序列からなる群より選択される１種のヌクレオチド序列、または前記序列の少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、７５、１００、１５０、２００、３００、４００、５００、７５０、１０００、１２５０または１５００以上の連続ヌクレオチドを含む切片と、デフォルト媒介変数を有するBLASTNバージョン２．０セットで少なくとも７０％以上の相同性を有する１種のヌクレオチド序列を含む核酸。
  2. 前記相同性は少なくとも８０％以上である、請求項１に記載の核酸。
  3. 前記相同性は少なくとも８５％以上である、請求項１に記載の核酸。
  4. 前記相同性は少なくとも９０％以上である、請求項１に記載の核酸。
  5. 前記相同性は少なくとも９５％以上である、請求項１に記載の核酸。
  6. 前記相同性は少なくとも９７％以上である、請求項１に記載の核酸。
  7. 前記相同性は１００％である、請求項１に記載の核酸。
  8. 序列番号３５〜５１及び序列番号３５〜５１に相補的なヌクレオチド序列からなる群より選択された１種のヌクレオチド序列、または前記序列の少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、７５、１００、１５０、２００、３００、４００、５００、７５０、１０００、１２５０または１５００以上の連続ヌクレオチドを含む切片と、デフォルト媒介変数を有するBLASTNバージョン２．０セットで少なくとも７０％以上の相同性を有する１種のヌクレオチド序列を含む核酸。
  9. 前記相同性は少なくとも８０％以上である、請求項８に記載の核酸。
  10. 前記相同性は少なくとも８５％以上である、請求項８に記載の核酸。
  11. 前記相同性は少なくとも９０％以上である、請求項８に記載の核酸。
  12. 前記相同性は少なくとも９５％以上である、請求項８に記載の核酸。
  13. 前記相同性は少なくとも９７％以上である、請求項８に記載の核酸。
  14. 前記相同性は１００％である、請求項８に記載の核酸。
  15. 序列番号５２〜６８からなる群より選択される１種のアミノ酸序列、または前記序列の少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、７５、１００、２００、４００、６００、８００または１０００以上の連続アミノ酸を含む切片と、デフォルト媒介変数を有するBLASTP、BLASTXまたはTBLASTNで少なくとも２５％以上のアミノ酸相同性を有する１種のポリペプチドを暗号化する核酸。
  16. 前記アミノ酸相同性は少なくとも４０％以上である、請求項１５に記載の核酸。
  17. 前記アミノ酸相同性は少なくとも５０％以上である、請求項１５に記載の核酸。
  18. 前記アミノ酸相同性は少なくとも６０％以上である、請求項１５に記載の核酸。
  19. 前記アミノ酸相同性は少なくとも７０％以上である、請求項１５に記載の核酸。
  20. 前記アミノ酸相同性は少なくとも８０％以上である、請求項１５に記載の核酸。
  21. 前記アミノ酸相同性は少なくとも８５％以上である、請求項１５に記載の核酸。
  22. 前記アミノ酸相同性は少なくとも９０％以上である、請求項１５に記載の核酸。
  23. 前記アミノ酸相同性は少なくとも９５％以上である、請求項１５に記載の核酸。
  24. 前記アミノ酸相同性は少なくとも９９％以上である、請求項１５に記載の核酸。
  25. 前記アミノ酸相同性は１００％である、請求項１５に記載の核酸。
  26. 序列番号５２〜６８からなる群より選択される１種のアミノ酸序列、または前記序列の少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、７５、１００、２００、４００、６００、８００または１０００以上の連続アミノ酸を含む切片と、デフォルト媒介変数を有するBLASTP、BLASTXまたはTBLASTNで少なくとも２５％以上のアミノ酸相同性を有するポリペプチド。
  27. 前記アミノ酸相同性は少なくとも４０％以上である、請求項２６に記載のポリペプチド。
  28. 前記アミノ酸相同性は少なくとも５０％以上である、請求項２６に記載のポリペプチド。
  29. 前記アミノ酸相同性は少なくとも６０％以上である、請求項２６に記載のポリペプチド。
  30. 前記アミノ酸相同性は少なくとも７０％以上である、請求項２６に記載のポリペプチド。
  31. 前記アミノ酸相同性は少なくとも８０％以上である、請求項２６に記載のポリペプチド。
  32. 前記アミノ酸相同性は少なくとも９０％以上である、請求項２６に記載のポリペプチド。
  33. 前記アミノ酸相同性は少なくとも９５％以上である、請求項２６に記載のポリペプチド。
  34. 前記アミノ酸相同性は少なくとも９９％以上である、請求項２６に記載のポリペプチド。
  35. 前記アミノ酸相同性は１００％である、請求項２６に記載のポリペプチド。
  36. 序列番号５２〜６８からなる群より選択される１種のアミノ酸序列を含むポリペプチドを暗号化するヌクレオチド序列を含み、
    前記ヌクレオチド序列はプロモータに作動可能に連結されたものである再組合核酸。
  37. ゲルミン-類似蛋白質、代替オキシダーゼ蛋白質、XA２１-類似蛋白質キナーゼ遺伝子、受容体-類似蛋白質キナーゼ、メチルマロネートセミ-アルデヒドデヒドロゲナーゼ、RNA-結合蛋白質LAH１相同体、液胞ATP合成酵素サブユニットC、ケイ皮酸４-ヒドロキシラーゼ、H-蛋白質プロモータ結合因子-２a、フラップエンドヌクレアーゼ、熱衝撃蛋白質Hsp70、アンモニウム輸送体、ATP-依存性RNAヘリカーゼ、グルコース-６-ホスフェート／ホスフェート輸送体、RNAメチル基転移酵素、アクチンデポリマライジング因子５及びベータ-グルコシダーゼからなる群より選択される遺伝子が破壊された、遺伝学的に変形された稲植物。
  38. 序列番号１８〜３４からなる群より選択された１種のヌクレオチド序列を含む遺伝子が破壊された、遺伝学的に変形された稲植物。
  39. 序列番号５２〜６８からなる群より選択された１種のアミノ酸序列を含むポリペプチドを暗号化する遺伝子が破壊された、遺伝学的に変形された稲植物。
  40. １b-１１５-２２、１b-１６４-４３、１b-１９２-４０、１b-２０７-２７、１b-１３８-０７、１d-０５９-１２、１c-０８７-４０、１c-０１７-１４、１c-０３８-５６、１c-０４１-４７、１c-０６４-２０、１c-１０９-３５、１c-１０９-５１、１c-０５６-０７、１c-１００-３２、１c-１４２-２７、及び１c-１４０-０４からなる群より選択された、遺伝学的に変形された稲植物。
  41. 序列番号５２〜６８からなる群より選択された１種のアミノ酸序列を含むポリペプチドが過発現または未発現された、遺伝学的に変形された稲植物。
  42. a）序列番号１８〜３４からなる群より選択された１種の遺伝子が破壊された稲植物を収得し、及び
    b）前記稲植物を、同定された好ましい特性を持つ植物が許容される条件に露出させることを含む特性を有する稲植物検索方法。
  43. 前記同定された好ましい特性は、光合成力変異、生物学的ストレスに対する反応変異、遠隔作用、無生物学的ストレスに対する反応変異、形態学的変異、穀物収率変異、穀物内栄養物含量変異、成長速度変異、二次代謝産物代謝経路変異、殺虫剤抵抗性変異、穀物模様及び味のような穀物の特性変異、調理品質、収穫物品質変異、最適成長温度変異、除草剤抵抗性変異、開花時期変異、種子充填物特性変異、ホルモン生合成／分解経路変異またはホルモン反応変異からなる群から選択される、請求項４２に記載の検索方法。
  44. （a）植物細胞を序列番号５２〜６８からなる群より選択された１種のアミノ酸序列を含む蛋白質の発現または活性が、天然型植物に比べて増加または減少する核酸序列に接触させて形質転換植物細胞を収得し、
    （b）前記形質転換植物細胞から植物を生産し、
    （c）前記蛋白質を発現する植物を選別することを含む、
    天然型に比べて変異された表現型を有する遺伝学的に変形された植物の生産方法。
  45. 前記接触は物理的な手段によるものである、請求項４４に記載の方法。
  46. 前記接触は化学的な手段によるものである、請求項４４に記載の方法。
  47. 前記植物細胞は全植物で再生される、原形質体、生殖細胞生産細胞及び全植物からなる群より選択される、請求項４４に記載の方法。
  48. 前記核酸序列は構成性プロモータ、組織特異的プロモータ、器官特異的プロモータ、発生学的特異プロモータ及び誘導性プロモータからなる群より選択された１種のプロモータに作動可能に連結されたものである、請求項４４に記載の方法。
  49. 前記プロモータは内因性プロモータ及び異種プロモータからなる群より選択されたプロモータである、請求項４４に記載の方法。
  50. 前記アミノ酸は序列番号５２〜６８からなる群より選択されたアミノ酸序列を含む１種のポリペプチドと、デフォルト媒介変数を有するBLASTP、BLASTXまたはTBLASTNで少なくとも９０％以上のアミノ酸相同性を有することを含むアミノ酸である、請求項４４に記載の方法。
  51. 前記アミノ酸は序列番号５２〜６８からなる群より選択されたアミノ酸序列を含む１種のポリペプチドと、デフォルト媒介変数を有するBLASTP、BLASTXまたはTBLASTNで少なくとも９５％以上のアミノ酸相同性を有することを含むアミノ酸である、請求項４４に記載の方法。
  52. 前記蛋白質を暗号化する核酸序列は序列番号１８〜３４及び序列番号３５〜５１からなる群より選択される１種のヌクレオチド序列を含む、請求項４４に記載の方法。
  53. 前記植物は双子葉植物である、請求項４４に記載の方法。
  54. 前記植物は単子葉植物である、請求項４４に記載の方法。
  55. 序列番号５２〜６８からなる群より選択された１種のアミノ酸序列を、デフォルト媒介変数を有するBLASTP、BLASTXまたはTBLASTNで評価し、少なくとも８０％以上のアミノ酸相同性を有するポリペプチドを暗号化する核酸序列が導入された、遺伝学的に変形された種子。
  56. 前記核酸は序列番号５２〜６８からなる群より選択された１種のアミノ酸序列を、デフォルト媒介変数を有するBLASTP、BLASTXまたはTBLASTNで評価し、少なくとも８５％以上のアミノ酸相同性を有するポリペプチドを暗号化するものである、請求項５５に記載の遺伝学的に変形された種子。
  57. 前記核酸は序列番号５２〜６８からなる群より選択された１種のアミノ酸序列を、デフォルト媒介変数を有するBLASTP、BLASTXまたはTBLASTNで評価し、少なくとも９０％以上のアミノ酸相同性を有するポリペプチドを暗号化するものである、請求項５５に記載の遺伝学的に変形された種子。
  58. 前記核酸は序列番号５２〜６８からなる群より選択された１種のアミノ酸序列を、デフォルト媒介変数を有するBLASTP、BLASTXまたはTBLASTNで評価し、少なくとも９５％以上のアミノ酸相同性を有するポリペプチドを暗号化するものである、請求項５５に記載の遺伝学的に変形された種子。
  59. 序列番号５２〜６８またはこれらの切片からなる群より選択された１種のアミノ酸序列を含む分離されたポリペプチドに結合する抗体。
  60. （a）序列番号１８〜３４からなる群より選択された１種の序列の転写させるプロモータを収得し、
    （b）前記プロモータに遺伝子を作動可能に連結させ、
    （c）前記遺伝子が作動可能に連結された前記プロモータを稲植物に導入することを含む稲の特定組織または組織における遺伝子発現方法。
  61. 序列番号１８〜３４及び序列番号１８〜３４に相補的なヌクレオチド序列からなる群より選択された１種のヌクレオチド序列、または前記序列の少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、７５、１００、１５０、２００、３００、４００、５００、７５０、１０００、１２５０または１５００以上の連続ヌクレオチドを含む切片を含むヌクレオチド序列が保存されたコンピュータ認識可能な媒体。
  62. 前記コンピュータ認識可能な媒体は前記核酸序列が転写される組織または器官を示すデータがさらに含まれた、請求項６１に記載の媒体。
  63. 序列番号３５〜５１及び序列番号３５〜５１に相補的なヌクレオチド序列からなる群より選択された１種のヌクレオチド序列を、または前記序列の少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、７５、１００、１５０、２００、３００、４００、５００、７５０、１０００、１２５０または１５００以上の連続ヌクレオチドを含む切片を含むヌクレオチド序列が保存されたコンピュータ認識可能な媒体。
  64. 前記コンピュータ認識可能な媒体は前記コーディング序列を有するmRNAが発現される組織または器官を示すデータがさらに含まれた、請求項６３に記載の媒体。
  65. 序列番号５２〜６８、序列番号５２〜６８に相補的なヌクレオチド序列からなる群より選択された１種のアミノ酸序列、または前記序列の少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、７５、１００、２００、４００、６００、８００または１０００以上の連続アミノ酸を含む切片を含むアミノ酸序列が保存されたコンピュータ認識可能な媒体。
  66. 前記コンピュータ認識可能な媒体は前記アミノ酸序列が存在する組織または器官を示すデータがさらに含まれた、請求項６５に記載の媒体。
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