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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von
transgenen Pflanzen und/oder Pflanzenzellen mit einer erhöhten Pathogenresistenz,
wobei die transgenen Pflanzen bzw. Pflanzenzellen einen im Vergleich
zum Wildtyp veränderten
Gehalt und/oder eine veränderte
Aktivität
an mindestens einem Actin-depolymerisierenden Faktor (ADF) aufweisen.
Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls die Verwendung von
Nukleinsäuren,
die für
mindestens einen ADF kodieren, zur Herstellung von transgenen Pflanzen
bzw. Pflanzenzellen mit einer erhöhten Pathogenresistenz. Weiterhin
betrifft die vorliegende Erfindung Nukleinsäuresequenzen, die für einen
ADF kodieren.
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Pflanzenkrankheiten,
die durch verschiedene Pathogene wie z.B. Viren, Bakterien und Pilze
verursacht werden, können
zu erheblichen Ausbeuteverlusten beim Anbau von Kulturpflanzen führen. Heutzutage werden
zur Kontrolle von Pilzerkrankungen Fungizide bei der landwirtschaftlichen
Herstellung intensiv benutzt. Trotz solcher Kontrollmöglichkeiten
geht ein beträchtlicher
Anteil der möglichen
Ausbeute infolge von Erkrankungen verloren. Um zum einen diese Ausbeuteverluste
und zum anderen die Verwendung von Fungiziden im Allgemeinen zu
reduzieren, gibt es seit längerem
Bestrebungen, Kulturpflanzen mit einer natürlichen Resistenz gegen wichtige
pilzliche Pathogene im Rahmen eines integrierten Pflanzenschutzes
zu verwenden. Neben den klassischen Züchtungsverfahren zur Herstellung
von Pflanzen mit einer natürlichen
Resistenz spielen in den letzten Jahren verstärkt gentechnologische Ansätze eine
große
Rolle, bei denen z.B. durch Einführen
externer Resistenzgene oder durch die Manipulation der endogenen
Genexpression in den Pflanzen gezielt Resistenzen in wichtige Kulturpflanzen
eingeführt
werden sollen.
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Bei
den natürlicherweise
auftretenden Resistenzen können
verschiedene Resistenzmechanismen unterschieden werden. Die so genannte
vorgeformte "Nicht-Wirt"-Resistenz beschreibt
die Beobachtung, dass eine ganze Pflanzenart gegenüber einem
spezifischen Erreger resistent ist. Dieses bisher nicht verstandene Phänomen beruht
wahrscheinlich auf strukturellen oder chemischen Eigenschaften der
Pflanzenart. Dabei kann es sich z.B. um die Dicke des Kotikels,
das Vorhandensein von inhibitorischen Substanzen oder die begrenzte
Verfügbarkeit
von Nährstoffen
handeln.
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Aktive
Resistenzmechanismen umfassen dagegen solche Reaktionen und Mechanismen,
die in der Wirtspflanze durch das angreifende Pathogen ausgelöst werden.
In der Regel ist letzterer Resistenzmechanismus wichtiger, auch
wenn betont werden muss, dass eine klare Trennung zwischen den aktiven
Resistenzmechanismen und der vorgeformten Resistenz nicht immer
möglich
ist (Heitefuss, R. (2001), Naturwissenschaften, 88, 273–283).
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Außerdem müssen Unterschiede
hinsichtlich der Wirt-Pathogen-Interaktion berücksichtigt werden. Zum Beispiel
benötigen
obligat biotrophe Pathogene lebendes Wirtsgewebe. Daher kann der
schnelle Zelltod im Wirt, wie er durch die so genannte hypersensitive
Reaktion (HR) ausgelöst
wird, eine wichtige Komponente in der Resistenz gegen biotrophe
Pathogene sein. Im Gegensatz dazu bewirken pertothrophe Pathogene
einen Zelltod im Wirt, der für
eine weitere Entwicklung des Pathogens auf dem zerstörten Gewebe
notwendig ist.
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Es
muss betont werden, dass Pflanzen gegen die große Mehrheit potentieller Pathogene
resistent sind, d.h. eine bestimmte Pflanzenart kann nur durch eine
begrenzte Anzahl an Pathogenen erfolgreich angegriffen werden. Das
Scheitern eines erfolgreichen Angriffs durch ein Nicht-Pathogen
ist die Folge der oben erwähnten "Nicht-Wirt"-Resistenz.
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Die
Voraussetzung für
einen erfolgreichen Angriff einer Pflanzenart durch ein Pathogen
ist in der so genannten Basiskompatibilität zu sehen, die sich wahrscheinlich
infolge einer Koevolution von Pflanzenwirt und den möglichen
Pathogenen entwickelt hat. Ein Angriff wird nur erfolgreich sein,
wenn das Pathogen über Faktoren
verfügt,
die es erlauben, die Basisresistenz der Pflanzenart zu überwinden.
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Entsprechend
werden bestimmte Pflanzenarten bzw. verschiedene Kultivare einer
Art gegenüber
einem bestimmten Pathogen abhängig
von ihrem Genotyp resistent oder empfänglich sein. Die unterschiedlichen
Resistenzmechanismen, die für
die Resistenz oder Empfänglichkeit
einer Pflanzenart bzw. deren Kultivaren gegenüber bestimmten Pathogenen verantwortlich
sind, sollen beispielhaft für
den Mehltauerreger (Blumeria graminis), der mehrere unterschiedliche
Gräserarten
befällt,
dargestellt werden.
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Der
Mehltaupilz als Art umfasst mehrere formae speciales abhängig davon,
ob der jeweilige Mehltaupilz z.B. Weizen oder Gerste befällt. Im
Falle des Befalls von Gerste handelt es sich um Blumeria graminis
f. sp. hordei, während
es sich beim Befall von Weizen um Blumeria graminis f. sp. tritici
handelt. Darüber
hinaus können
innerhalb der verschiedenen formae speciales unterschiedliche Rassen
oder Pathotypen identifiziert werden, denen gegenüber unterschiedliche
Kultivare der Wirtsarten eine unterschiedliche Resistenz aufweisen.
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Im
Folgenden werden die unterschiedlichen Resistenzmechanismen der
Gerste gegenüber
Mehltauerregern dargestellt, da dieses Wirts-Pathogen-System am
besten untersucht ist. Die daraus gewonnenen Erkenntnisse können jedoch
auch auf andere Mehltau-Wirt-Systeme wie z.B. den oben erwähnten Befall
von Weizen durch Mehltauerreger übertragen
werden. Andere Pflanzenarten, die durch Mehltauerreger befallen werden,
umfassen z.B. Arabidopsis thaliana, Hordeum vulgare (Gerste), Triticum
aestivum und T. durum (Weizen), Secale cereale (Roggen), Avena sativa
(Hafer), Lycopersicon spp. (Tomate), Vitis spp. (Wein), Cucumis spp.
(Gurke), Cucurbita spp. (Kürbis),
Pisum spp. (Erbse), Prunus spp. (Pfirsich), Solanum tuberosum (Kartoffel),
Rosa spp. (Rose), Fragaria ananassa (Erdbeere), Rhododendron spp.
(Azalee), Malus domestica (Apfel) und Nicotiana tabacum (Tabak).
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Blumeria
graminis f. sp. hordei befällt
ausschließlich
die Epidermiszellschicht von Gersteblättern. Der Pilz dringt in die
Pflanzenzelle mechanisch und enzymatisch durch die Zellwand mittels
eines Penetrationspflocks ein, bei dem es sich um Konidien, d.h.
asexuell gebildete Sporen handelt. Der erfolgreiche Befall von Gerstenblättern ist
erreicht, wenn sich das Haustorium, bei dem es sich um das pilzliche
Ernährungsorgan
handelt, gebildet hat.
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Man
kann zwei verschiedene genetische Mechanismen unterscheiden, die
Gerste gegenüber
Mehltau Resistenz verleihen. Der erste Mechanismus basiert auf dem
so genannten "Gen
für Gen"-Konzept. Bei diesem
Mechanismus wird die Resistenz dadurch erreicht, dass ein dominant
agierendes Resistenzgen die Pflanzen nur gegenüber solchen Pilzisolaten resistent
macht, die das entsprechende Avirulenzgen tragen. In den meisten
Fällen
ist diese so genannte Rassen-spezifische Resistenz, bei der ein
Gerstekultivar nur gegenüber ausgewählten Mehltauisolaten
resistent ist, durch die hypersensitive Reaktion (HR) gekennzeichnet,
d.h. die Wirtszellen der Infektionsstelle sterben ab (Heitefuss,
R., vide supra).
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Im
Gegensatz hierzu verleiht der zweite Mechanismus eine Breitbandresistenz
gegen alle bekannten Isolate einer formae specialis des Mehltaupilzes
und wird durch die Abwesenheit des so genannten Mlo-Wildtypgens
gekennzeichnet. Bei Mlo handelt es sich um einen vermutlich negativen
Regulator der Pathogenverteidigung (Devoto, A. et al (1999), J.
Biol. Chem., 274, 34993–35004).
Die Funktion dieses Mechanismus hängt auch von mindestens zwei
weiteren Genen, Ror1 und Ror2 ab (Freialdenhoven, A. et al. (1996),
Plant Cell, 8, 5–14).
Die Resistenz bzw. Inkompatibilität, wie sie durch rezessive
mlo-Resistenzallele vermittelt wird, ist im Allgemeinen nicht durch
das Auftreten einer HR gekennzeichnet. Vielmehr ist der einzige
sichtbare zelluläre Effekt,
der während
der Verteidigung der Pflanze gegen den angreifenden Pilz sichtbar
wird, die Bildung einer subzellulären Zellwandapposition, die
als Papille bezeichnet wird und sich direkt unterhalb des pilzlichen
Penetrationspflocks, dem so genannten Appresorium, bildet. Bei dieser
Art der Rasse-unspezifischen
Resistenz, die durch rezessive mlo-Allele vermittelt wird, werden
die Penetrationsversuche des Pilzes auf der Stufe der Papillenbildung
inhibiert, d.h. es kommt nicht zur Ausbildung eines Haustoriums,
was für
die Etablierung eines effizienten Befalls essentiell ist.
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Die
Pathogen-induzierte Papillenbildung wird auch bei anderen Gramineae-Arten
beobachtet, was darauf hindeutet, dass die Rasse-unspezifische Resistenz,
wie sie für
das Gerste-Mehltau-System
bekannt ist, auch bei anderen Pflanzenarten auftaucht. Dafür spricht
auch, dass Mlo-Proteine
bei anderen Arten wie z.B. Arabidopsis thaliana oder Oryza sativa
auftreten.
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Da
bei der Rasse-unspezifischen Resistenz ein Gerstekultivar gegenüber verschiedensten
Mehltauisolaten resistent ist bzw. mehrere Gerstekultivare gegenüber verschiedensten
Mehltauisolaten vom Blumeria graminis f. sp. hordei resistent sind
(und dies, wegen der funktionellen Äquivalenz der Mlo-Proteine
in den verschiedenen Pflanzenarten, in denen diese auftreten, auch
wahrscheinlich für
diese Pflanzen gilt), haben diese Pflanzen gegenüber Pflanzen, die nur eine
Rasse-spezifische Resistenz besitzen, erhebliche Vorteile und sind von
besonderem Interesse. Es besteht daher ein Bedarf an weiteren Pflanzen
bzw. Pflanzenzellen, die eine solche Rasse-unspezifische Resistenz
gegenüber
pilzlichen Erregern wie z.B. Mehltau zeigen.
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Es
ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, transgene Pflanzen
bzw. Pflanzenzellen zur Verfügung
zu stellen, die eine erhöhte
Resistenz gegenüber
verschiedenen pflanzlichen Pathogenen aufweisen. Es ist weiterhin
eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Pflanzen bzw. Pflanzenzellen
mit einer Rasse-unspezifischen Resistenz gegenüber verschiedenen pilzlichen
Pathogenen wie z.B. Mehltau zur Verfügung zu stellen. Es ist ebenfalls
eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, transgene Gerstepflanzen
bzw. Gerstepflanzenzellen zur Verfügung zu stellen, die eine Rasse-unspezifische
Sequenz gegenüber
pilzlichen Pathogenen, wie z.B. dem Mehltau-Erreger aufweisen. Darüber hinaus
ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Verfahren zur Verfügung zu
stellen, die die Herstellung der oben genannten transgenen Pflanzen
bzw. Pflanzenzellen mit einer erhöhten (Rasse-unspezifischen)
Resistenz gegenüber
pflanzlichen Pathogenen, wie z.B. Mehltau, ermöglichen
Zur Lösung dieser
und weiterer Aufgaben, wie sie sich aus der Beschreibung ergeben,
dienen die Merkmale der unabhängigen
Ansprüche.
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Bevorzugte
Ausführungsformen
der Erfindung sind durch die Merkmale der Unteransprüche definiert.
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Die
genannten Aufgaben der vorliegenden Erfindung werden im Wesentlichen
dadurch gelöst,
dass ein Verfahren zur Herstellung von transgenen Pflanzen mit erhöhter Pathogenresistenz
zur Verfügung
gestellt wird, das dadurch gekennzeichnet ist, dass der Gehalt und/oder
die Aktivität
von mindestens einem Actin-depolymerisierenden Faktor (ADF) gegenüber dem
entsprechenden Wildtyp verändert
ist.
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Wie
oben dargestellt wurde, wird die Rasse-unspezifische Resistenz bei
Gerste und anderen Gramineaen durch rezessive mlo-Allele vermittelt.
Es sind daher seit längerem
Anstrengungen unternommen worden, andere Gene zu identifizieren,
die mit dem Mlo-Gen interagieren. Durch einen Mutagenese-Screen
konnten dabei mit Ror1 und Ror2 weitere Gene identifiziert werden,
die mit dem Mlo-Gen genetisch interagieren (Freialdenhoven et al,
vide supra). Ein generelles Problem bei der Identifizierung weiterer
Gene, die mit dem Mlo-Gen interagieren und damit ebenfalls durch
entsprechende Manipulation zur Herstellung einer Rasse-unspezifischen
Resistenz verwendet werden könnten,
besteht darin, dass, abhängig
von dem Screeningverfahren, mit dem modifizierte Infektionstypen
nachgewiesen werden, und angesichts der genomischen Redundanz der
Gerste die verwendeten Mutagenese-Screeningverfahren nicht immer sensitiv
genug sind, um weitere Gene des durch mlo-vermittelten Resistenzmechanismus zu
identifizieren.
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In
der vorliegenden Erfindung ist es durch einen neuen Screeningansatz,
bei dem durch RNA-Interferenz
(RNAi) epidermal exprimierte Gene gesilenct werden, erstmals gelungen,
neben den bereits erwähnten Ror1
und Ror2 ein weiteres Gen zu identifizieren, das genetisch mit Mlo
interagiert. Dabei handelt es sich um den Actin-depolymerisierenden
Faktor 3 (ADF3) aus Gerste, dessen Aminosäuresequenz mit der SEQ ID No. 1
angegeben ist.
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Überraschenderweise
konnte im Rahmen der vorliegenden Erfindung ebenfalls gezeigt werden,
dass die Überexpression
oder Repression dieses Actin-depolymerisierenden Faktors eine Rasse-unspezifische Breitbandresistenz
der Gerste gegen Mehltau vermittelt.
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Die
transgenen Pflanzen bzw. Pflanzenzellen aus Gerste, bei denen der
Gehalt und/oder die Aktivität von
ADF3 im Vergleich zum Wildtyp verändert ist, weisen somit eine
erhöhte
Rasse-unspezifische Resistenz gegenüber dem Mehltauerreger auf.
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Es
kann daher davon ausgegangen werden, dass durch Veränderung
des Gehalts und/oder der Aktivität
von ADFs im Vergleich zum Wildtyp transgene Pflanzen bzw. Pflanzenzellen
verschiedener Pflanzenarten hergestellt werden können, die sich durch eine erhöhte Resistenz
gegenüber
pflanzlichen Pathogenen und insbesondere pilzlichen Pathogenen wie
Mehltau auszeichnen. Dies sollte insbesondere dann gelten, wenn
die pflanzlichen Pathogene zur Etablierung einer effizienten Infektion
eine funktionell relevante Interaktion mit dem Actin-Cytoskelett eingehen
müssen
(siehe unten).
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Gegenstand
der vorliegenden Erfindung ist daher ein isoliertes Nukleinsäuremolekül, das für den ADF3
aus Gerste mit der SEQ ID No. 1 kodiert. Ebenso Gegenstand der vorliegenden
Erfindung sind Nukleinsäuremoleküle, die
für funktionell äquivalente
Teile des ADF3 aus Gerste mit der SEQ ID No. 1 kodieren, die für Mutanten
des ADF3 aus Gerste mit der SEQ ID No. 1 kodieren oder Nukleinsäuremoleküle, die
zu den vorgenannten Nukleinsäuremolekülen unter
stringenten Bedingungen hybridisieren.
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Ein
weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind Proteine oder
Proteinfragmente, die durch die vorhergehend genannten Nukleinsäuremoleküle kodiert
werden.
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Gegenstand
der vorliegenden Erfindung ist auch ein Verfahren zur Herstellung
von transgenen Pflanzen bzw. Pflanzenzellen mit im Vergleich zum
Wildtyp erhöhter
Pathogenresistenz und einem veränderten
Gehalt und/oder einer veränderten
Aktivität
von mindestens einem ADF.
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Ebenfalls
Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von transgenen
Pflanzen bzw. Pflanzenzellen mit erhöhter Pathogenresistenz, bei
denen die Expression von mindestens einem ADF durch Übertragung
der oben genannten Nukleinsäuresequenzen
oder solcher Nukleinsäuresequenzen,
die zu ADF3 aus Gerste mit der SEQ ID No. 1 homolog sind, auf Pflanzen
bzw. Pflanzenzellen bewirkt wird.
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Ein
weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind Verfahren zur
Herstellung von transgenen Pflanzen bzw. Pflanzenzellen mit erhöhter Pathogenresistenz,
bei denen der Gehalt und/oder die Aktivität von mindestens einem endogenen
ADF hoch- oder herunterreguliert wird.
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Ein
weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung
von transgenen Pflanzen bzw. Pflanzenzellen mit erhöhter Pathogenresistenz,
bei denen die Aktivität
von mindestens einem endogenen ADF durch Übertragung von Nukleinsäuremolekülen, die
für nicht-funktionelle
Homologe bzw. Teile davon des ADF3 aus Gerste mit der SEQ ID No.
1 kodieren, erniedrigt wird.
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Ein
weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung
von transgenen Pflanzen bzw. Pflanzenzellen mit erhöhter Pathogenresistenz,
bei denen Antikörper,
die für
ADFs spezifisch sind und möglicherweise
deren Funktion hemmen, in der Zelle exprimiert werden.
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Ein
weiterer Gegenstand der Erfindung sind Verfahren zur Herstellung
von transgenen Pflanzen bzw. Pflanzenzellen mit erhöhter Pathogenresistenz,
bei denen der posttranslationale Modifikationsstatus von mindestens
einem überexprimierten
und/oder endogenen ADF verändert
wird.
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Ebenfalls
ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind Verfahren zur Herstellung
von transgenen Pflanzen bzw. Pflanzenzellen mit erhöhter Pathogenresistenz,
bei denen die Expression von mindestens einem ADF durch Verfahren
wie z.B. antisense-Verfahren, posttranscriptional gene silencing
(PTGS), virus-induced gene silencing (VIGS), RNA interference (RNAi),
Ribonuklease P-Konstrukte, Hammerhead-Ribozym-Konstrukte oder homologe
Rekombination gesilenct wird.
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Gegenstand
der Erfindung sind ebenfalls transgene Pflanzen bzw. Pflanzenzellen
mit einer erhöhten Pathogenresistenz,
die über
einen im Vergleich zum Wildtyp veränderten Gehalt und/oder eine
veränderte
Aktivität
von mindestens einem ADF verfügen.
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Gegenstand
der vorliegenden Erfindung sind ebenfalls transgene Pflanzen bzw.
Pflanzenzellen, die nach einem der erfindungsgemäßen Verfahren hergestellt wurden
und über
im Vergleich zum Wildtyp erhöhte Pathogenresistenzen
verfügen.
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Ein
weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung
von Nukleinsäuren,
die für funktionelle
oder nicht-funktionelle ADFs bzw. Teile davon aus verschiedenen
Organismen kodieren, zur Herstellung von transgenen Pflanzen bzw.
Pflanzenzellen mit erhöhter
Pathogenresistenz.
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Die
Verwendung der in der Erfindung beschriebenen Nukleinsäuresequenzen
für die
beschriebenen Verfahren bzw. zur Herstellung der genannten transgenen
Pflanzen und Pflanzenzellen ist ebenfalls ein Gegenstand der vorliegenden
Erfindung.
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"Pathogenresistenz" meint das Vermindern
oder Abschwächen
von Krankheitssymptomen einer Pflanze infolge eines Befalls durch
ein Pathogen. Die Symptome können
vielfältiger
Art sein, umfassen aber bevorzugt solche, die direkt oder indirekt
zu einer Beeinträchtigung
der Qualität
der Pflanze, der Quantität
des Ertrags, der Eignung zur Verwendung als Futter- oder Nahrungsmittel
führen
oder aber auch Aussaat, Anbau, Ernte oder Prozessierung des Ernteguts
erschweren
Unter dem Begriff "erhöhte
Pathogenresistenz" wird
erfindungsgemäß verstanden,
dass die erfindungsgemäßen transgenen
Pflanzen bzw. Pflanzenzellen durch pflanzliche Pathogene weniger
stark und/oder weniger häufig
befallen werden. Der Begriff "erhöhte Pathogenresistenz" beinhalt dabei auch
eine so genannte transiente Pathogenresistenz, d.h. dass die erfindungsgemäßen transgenen
Pflanzen bzw. Pflanzenzellen nur für einen bestimmten Zeitraum
eine gegenüber
dem entsprechenden Wildtyp erhöhte
Pathogenresistenz aufweisen.
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Die
reduzierte Häufigkeit
bzw. das reduzierte Ausmaß des
Pathogenbefalls bei den erfindungsgemäßen transgenen Pflanzen bzw.
Pflanzenzellen wird dabei im Vergleich zum entsprechenden Wildtyp
bestimmt. Erfindungsgemäß bevorzugt
ist eine Erhöhung
der Resistenz in dem Sinne, dass ein Befall der Pflanze mit dem
Pathogen um mindestens 5%, bevozugt mindestens 20%, ebenfalls bevorzugt
um mindestens 50%, 60% oder 70%, besonders bevorzugt um mindestens
80%, 90% oder 100%, ebenfalls besonders bevorzugt um den Faktor
5, insbesondere bevorzugt um mindestens den Faktor 10, ebenfalls
insbesondere bevorzugt um mindestens den Faktor 50, noch bevorzugter
um mindestens den Faktor 100 und am meisten bevorzugt um mindestens
den Faktor 1000 seltener bzw. weniger stark im Vergleich zum Wildtyp
ist.
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Unter
dem Begriff "pflanzliche
Pathogene" werden
erfindungsgemäß solche
Pflanzenpathogene verstanden, die zur Etablierung einer effizienten
Infektion mit dem pflanzlichen Actin-Cytoskelett interagieren müssen. Bevorzugt
umfasst der Begriff "pflanzliche
Pathogene" pilzliche
Erreger.
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Pilzpathogene
oder pilz-ähnliche
Pathogene (wie z.B. Chromista) stammen vorzugsweise aus der Gruppe
umfassend Plasmodiophoramycota, Oomycota, Ascomycota, Chytridiomyceten,
Zygomyceten, Basidiomycota und Deuteromyceten (Fungi imperfecti).
Beispielhaft jedoch nicht einschränkend seien die in Tabelle
1 und 2 genannten Pathogene und die mit ihnen in Zusammenhang gebrachten
Erkrankungen zu nennen.
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Tabelle
1: Pflanzliche Pilzerkrankungen
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Besonders
bevorzugt sind
- – Plasmodiophoromycota wie
Plasmodiophora brassicae (Kohlhernie, clubroot of crucifers), Spongospora subterranea
(powdery scab of potato tubers), Polymyxa graminis (root disease
of cereals and grasses),
- – Oomycota
wie Bremia lactucae (Falscher Mehltau an Salat), Peronospora (Falscher
Mehltau) bei snapdragon (P. antirrhini), Zwiebel (P. destructor),
Spinat (P. effusa), Sojabohne (P. manchurica), Tabak ("blue mold" = Blauschimmel;
P. tabacina) Alfalfa und Klee (P. trifolium), Pseudoperonospora
humuli (Falscher Mehltau an Hopfen), Plasmopara (Falscher Mehltau
bei Trauben) (P. viticola) und Sonnenblume (P. halstedii), Sclerophtohra
macrospora (Falscher Mehltau bei Cerealien und Gäsern), Pythium (seed rot, seedling damping-off,
and root rot and all types of plants, z.B. Wurzelbrand an Beta-Rübe durch
P. debaryanum), Phytophthora infestans (Kraut- und Knollenfäule bei
Kartoffel, Braunfäule
bei Tomate etc.), Albugo spec. (white rust on cruciferous plants.
- – Ascomycota
wie Microdochium nivale (Schneeschimmel an Roggen und Weizen), Fusarium
graminearum, Fusarium culmorum (Ährenfäule v.a.
bei Weizen), Fusarium oxysporum (Fusarium-Welke an Tomate), Blumeria
graminis (Echter Mehltau an Gerste (f.sp. hordei) und Weizen (f.sp.
tritici)), Erysiphe pisi (Erbsenmehltau), Nectria galligena (Obstbaumkrebs),
Unicnula necator (Echter Mehltau der Weinrebe), Pseudopeziza tracheiphila
(Roter Brenner der Weinrebe), Claviceps purpurea (Mutterkorn an
z.B. Roggen und Gräsern),
Gaeumannomyces graminis (Schwarzbeinigkeit an Weizen, Roggen u.a.
Gräsern),
Magnaporthe grisea (rice blast disease), Pyrenophora graminea (Streifenkrankheit
an Gerste), Pyrenophora teres (Netzfleckenkrankheit an Gerste),
Pyrenophora tritici-repentis (Blattfleckenkrankheit (Blattdürre) an
Weizen), Venturia inaequalis (Apfelschorf), Sclerotinia sclerotium
(Weißstengeligkeit,
Rapskrebs), Pseudopeziza medicaginis (Klappenschorf an Luzerne,
Weiß-
und Rotklee).
- – Basidiomyceten
wie Typhula incarnata (Typhula-Fäule
an Gerste, Roggen, Weizen), Ustilago maydis (Beulenbrand an Mais),
Ustilago nuda (Flugbrand an Gerste), Ustilago tritici (Flugbrand
an Weizen, Dinkel), Ustilago avenae (Flugbrand an Hafer), Rhizoctonia
solani (Wurzeltöter
an Kartoffeln), Sphacelotheca spp. (head smut of sorghum), Melampsora
lini (rust of flax), Puccinia graminis (Schwarzrost an Weizen, Gerste, Roggen,
Hafer), Puccinia recondita (Braunrost an Weizen), Puccinia dispersa
(Braunrost an Roggen), Puccinia hordei (Braunrost an Gerste), Puccinia
coronata (Kronenrost an Hafer), Puccinia striiformis (Gelbrost an
Weizen, Gerste, Roggen sowie zahlreichen Gräsern), Uromyces appendiculatus
(Bohnenrost), Sclerotium rolfsii (root and stem rots of many plants).
- – Deuteromyceten
(Fungi imperfecti) wie Septoria nodorum (Spelzenbräune) an
Weizen (Septoria tritici), Pseudocercosporella herpotrichoides (Halmbruchkrankheit
an Weizen, Gerste, Roggen), Rynchosporium secalis (Blattfleckenkrankheit
an Roggen und Gerste), Alternaria solani (Dürrfleckenkrankheit an Kartoffel, Tomate),
Phoma betae (Wurzelbrand an Beta-Rübe), Cercospora beticola (Cercospora-Blattfleckenkrankheit
an Beta-Rübe),
(Alternaria brassicae (Rapsschwärze
an Raps, Kohl u.a. Kreuzblütlern),
Verticillium dahliae (Rapswelke und -stengelfäule), Colletotrichum lindemuthianum (Brennfleckenkrankheit
an Bohne), Phoma lingam – Umfallkrankheit
(Schwarzbeinigkeit an Kohl; Wurzelhals- oder Stengelfäule an Raps),
Botrytis cinerea (Grauschimmel an Weinrebe, Erdbeere, Tomate, Hopfen
etc.).
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Ebenfalls
bevorzugt sind Phytophthora infestans (Kraut- und Knollenfäule, Braunfäule bei
Tomate etc.), Microdochium nivale (vormals Fusarium nivale; Schneeschimmel
an Roggen und Weizen), Fusarium graminearum, Fusarium culmorum (Ährenfäule an Weizen),
Fusarium oxysporum (Fusarium-Welke an Tomate), Blumeria graminis
(Echter Mehltau an Gerste (f. sp. hordei) und Weizen (f. sp. tritici)),
Magnaporthe grisea (rice blast disease), Sclerotinia sclerotium
(Weißstengeligkeit,
Rapskrebs), Septoria nodorum und Septoria tritici (Spelzenbräune an Weizen),
Alternaria brassicae (Rapsschwärze
an Raps, Kohl u.a. Kreuzblütlern),
Phoma lingam (Umfallkrankheit, Schwarzbeinigkeit an Kohl; Wurzelhals- oder Stengelfäule an Raps).
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Beispielhaft,
jedoch nicht einschränkend,
für bakterielle
Pathogene seien die in Tabelle 2 aufgeführten Pathogene und die mit
ihnen in Zusammenhang gebrachten Erkrankungen zu nennen.
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Tabelle
2: Bakterielle Erkrankungen
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Besonders
bevorzugt sind die erfindungsgemäß hergestellten
transgenen Pflanzen resistent gegen nachfolgende pathogene Bakterien:
Corynebacterium
sepedonicum (Bakterienringfäule
an Kartoffel), Erwinia carotovora (Schwarzbeinigkeit an Kartoffel),
Erwinia amylovora (Feuerbrand an Birne, Apfel, Quitte), Streptomyces
scabies (Kartoffelschorf), Pseudomonas syringae pv. tabaci (Wildfeuer
an Tabak), Pseudomonas syringae pv. phaseolicola (Fettfleckenkrankheit
an Buschbohne), Pseudomonas syringae pv. tomato ("bacterial speck" an Tomate), Xanthomonas campestris
pv. malvacearum (Blattfleckenkrankheit an Baumwolle) und Xanthomonas
campestris pv. oryzae (Bakterienfäule an Reis und anderen Gräsern).
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Der
Begriff "virale
Pathogene" schließt sämtliche
Pflanzenviren ein wie beispielsweise Tabak- oder oder Cucumber-Mosaiv
Virus, Ringspot-Virus, Nekrose-Virus, Mais Dwarf-Mosaic Virus etc.
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Beispielhaft,
jedoch nicht einschränkend,
für virale
Pathogene seien die in Tabelle 3 aufgeführten Pathogene und die mit
ihnen in Zusammenhang gebrachten Erkrankungen zu nennen.
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Tabelle
3: Virale Erkrankungen
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Auch
gegen tierische Schädlinge
wie Insekten und Nematoden können
die erfindungsgemäßen Pflanzen
und Pflanzenzellen resistent sein. Beispielhaft, jedoch nicht einschränkend, seien
Insekten wie beispielsweise Käfer,
Raupen, Läuse
oder Milben zu nennen.
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Bevorzugt
sind die erfindungsgemäßen Pflanzen
resistent gegen gegen Insekten der Gattungen Coleoptera, Diptera,
Hymenoptera, Lepidoptera, Mallophaga, Homoptera, Hemiptera, Orthoptera,
Thysanoptera. Dermaptera, Isoptera, Anoplura, Siphonaptera, Trichoptera,
etc. Besonders bevorzugt sind Insekten der Gattungen Coleoptera
and Lepidoptera, wie beispielsweise der Maiszünsler (European Corn Borer
(ECB)), Diabrotica barberi ("northern
corn rootworm"),
Diabrotica undecimpunctata ("southern
corn rootworm"),
Diabrotica virgifera ("Western
corn rootworm"),
Agrotis ipsilon ("black
cutworm"), Crymodes
devastator ("glassy
cutworm"), Feltia
ducens ("dingy cutworm"), Agrotis gladiaria
("claybacked cutworm"), Melanotus spp.,
Aeolus mellillus ("wireworm"), Aeolus mancus
("wheat wireworm"), Horistonotus uhlerii
("sand wireworm"), Sphenophorus maidis
("maize billbug"), Sphenophorus zeae
("timothy billbug"), Sphenophorus parvulus
("bluegrass billbug"), Sphenophorus callosus
("southern corn
billbug"), Phyllogphaga
spp.("white grubs"), Anuraphis maidiradicis
("corn root aphid"), Delia platura
("seedcorn maggot"), Colaspis brunnea
("grape colaspis"), Stenolophus lecontei
("seedcorn beetle") und Clivinia impressifrons
("lender seedcorn
beetle").
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Ferner
sind zu nennen: Das Getreidehähnchen
(Oulema melanopus), die Fritfliege (Oscinella frit), Drahtwürmer (Agrotis
lineatus) und Blattläuse
(wie z.B. Haferblattlaus Rhopalosiphum padi, Grosse Getreideblattlaus
Sitobion avenae).
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Beispielhaft,
jedoch nicht einschränkend,
für Nematodenschädlinge seien
die in Tabelle 4 aufgeführten Pathogene
und die mit ihnen in Zusammenhang gebrachten Erkrankungen zu nennen.
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Tabelle
4: Parasitäre
Nematoden
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Ganz
besonders bevorzugt sind die erfindungsgemäß hergestellten transgenen
Pflanzen resistent gegen Globodera rostochiensis und G. pallida
(Zystenälchen
an Kartoffel, Tomate u.a. Nachtschattengewächsen), Heterodera schachtii
(Rübenzystenälchen an
Zucker- und Futterrübe,
Raps, Kohl etc.), Heterodera avenae (Haferzystenälchen an Hafer u.a. Getreidearten),
Ditylenchus dipsaci (Stengel- oder Stockälchen, Rübenkopfälchen an Roggen, Hafer, Mais,
Klee, Tabak, Rübe),
Anguina tritici (Weizenälchen,
Radekrankheit an Weizen (Dinkel, Roggen), Meloidogyne hapla (Wurzelgallenälchen an
Möhre,
Gurke, salat, tomate, Kartoffel, Zuckerrübe, Luzerne).
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Bei
einzelnen landwirtschaftlich besonders bedeutenden Sorten sind die
erfindungsgemäßen Pflanzen
bevorzugt gegen die folgenden Pathogene resistent:
Bei Gerste
gegen die Pilz-, bakteriellen und viralen Pathogene Puccinia graminis
f.sp. hordei (barley stem rust), Blumeria (Erysiphe) graminis f.sp.
hordei (Barley Powdery Mildew), barley yellow dwarf virus (BYDV),
und die pathogenen Insekten/Nematoden Ostrinia nubilalis (European
corn borer); Agrotis ipsilon (black cutworm); Schizaphis graminum
(greenbug); Blissus leucopterus leucopterus (chinch bug); Acrosternum
hilare (green stink bug); Euschistus servus (brown stink bug); Deliaplatura
(seedcorn maggot); Mayetiola destructor (Hessian fly); Petrobia
latens (brown wheat mite).
-
Bei
der Sojabohne gegen die Pilz-, bakteriellen oder viralen Pathogene
Phytophthora megasperma fsp.glycinea, Macrophomina phaseolina, Rhizoctonia
solani, Sclerotinia sclerotiorum, Fusarium oxysporum, Diaporthe
phaseolorum var. sojae (Phomopsis sojae), Diaporthe phaseolorum
var. caulivora, Sclerotium rolfsii, Cercospora kikuchii, Cercospora
sojina, Peronospora manshurica, Colletotrichum dematium (Colletotrichum truncatum),
Corynespora cassiicola, Septoria glycines, Phyllosticta sojicola,
Alternaria alternata, Pseudomonas syringae p.v. glycinea, Xanthomonas
campestris p.v. phaseoli, Microsphaera diffussa, Fusarium semitectum,
Phialophora gregata, Sojabohnen Mosaikvirus, Glomerella glycines,
Tobacco Ring spot virus, Tobacco Streak virus, Phakopsorapachyrhizi,
Pythium aphanidermatum, Pythium ultimum, Pythium debaryanum, Tomato
spotted wilt virus, Heterodera glycines, Fusarium solani und die
pathogenen Insekten/Nematoden Pseudoplusia includens (soybean looper);
Anticarsia gemmatalis (velvetbean caterpillar); Plathypena scabra
(green cloverworm); Ostrinia nubilalis (European corn borer); Agrotis
ipsilon (black cutworm); Spodoptera exigua (beet armyworm); Heliothis
virescens (cotton budworm); Helicoverpa zea (cotton bollworm); Epilachna
varivestis (Mexican bean beetle); Myzus persicae (green peach aphid);
Empoasca fabae (potato leaf hopper); Acrosternum hilare (green stink
bug); Melanoplus femurrubrum (redlegged grasshopper); Melanoplus
differentialis (differential grasshopper); Hylemya platura (seedcom
maggot); Sericothrips variabilis (soybean thrips); Thrips tabaci
(onion thrips); Tetranychus turkestani (strawberry spider mite);
Tetranychus urticae (twospotted spider mite).
-
Bei
Canola gegen die Pilz-, bakteriellen oder viralen Pathogene Albugo
candida, Alternaria brassicae, Leptosphaeria maculans, Rhizoctonia
solani, Sclerotinia sclerotiorum, Mycosphaerella brassiccola, Pythium ultimum,
Peronospora parasitica, Fusarium roseum, Alternaria alternata.
-
Bei
Alfalfa gegen die Pilz-, bakteriellen oder viralen Pathogene Clavibater
michiganese subsp. insidiosum, Pythium ultimum, Pythium irregulare,
Pythium splendens, Pythium debaryanum, Pythium aphanidermatum, Phytophthora
megasperma, Peronospora trifoliorum, Phoma medicaginis var. medicaginis,
Cercospora medicaginis, Pseudopeziza medicaginis, Leptotrochila
medicaginis, Fusarium, Xanthomonas campestris p.v. alfalfae, Aphanomyces
euteiches, Stemphylium herbarum, Stemphylium alfalfae.
-
Bei
Weizen gegen die Pilz-, bakterielle oder virale Pathogene Pseudomonas
syringae p.v. atrofaciens, Urocystis agropyri, Xanthomonas campestris
p.v. translucens, Pseudomonas syringae p.v. syringae, Alternaria alternata,
Cladosporium herbarum, Fusarium graminearum, Fusarium avenaceum,
Fusarium culmorum, Ustilago tritici, Ascochyta tritici, Cephalosporium
gramineum, Collotetrichum graminicola, Erysiphe graminis f.sp. tritici,
Puccinia graminis f.sp. tritici, Puccinia recondita f.sp. tritici,
Puccinia striiformis, Pyrenophora tritici-repentis, Septoria nodorum,
Septoria tritici, Septoria avenae, Pseudocercosporella herpotrichoides,
Rhizoctonia solani, Rhizoctonia cerealis, Gaeumannomyces graminis
var. tritici, Pythium aphanidermatum, Pythium arrhenomanes, Pythium
ultimum, Bipolaris sorokiniana, Barley Yellow Dwarf Virus, Brome
Mosaic Virus, Soil Borne Wheat Mosaic Virus, Wheat Streak Mosaic
Virus, Wheat Spindle Streak Virus, American Wheat Striate Virus, Claviceps
purpurea, Tilletia tritici, Tilletia laevis, Ustilago tritici, Tilletia
indica, Rhizoctonia solani, Pythium arrhenomannes, Pythium gramicola,
Pythium aphanidermatum, High Plains Virus, European wheat striate
virus, Puccinia graminis f.sp. tritici (Wheat stem rust), Blumeria
(Erysiphe) graminis f.sp. tritici (Wheat Powdery Mildew) und die
pathogenen Insekten/Nematoden Pseudaletia unipunctata (army worm);
Spodoptera, frugiperda (fall armyworm); Elasmopalpus lignosellus
(lesser cornstalk borer); Agrotis orthogonia (western cutworm); Elasmopalpus
Zignosellus (lesser cornstalk borer); Oulema melanopus (cereal leaf
beetle); Hypera punctata (clover leaf weevil); Diabrotica undecimpunctata
howardi (southern corn rootworm); Russian wheat aphid; Schizaphis
graminum (greenbug); Macrosiphum avenae (English grain aphid); Melanoplus
femurrubrum (redlegged grasshopper); Melanoplus differentialis (differential
grasshopper); Melanoplus sanguinipes (migratory grasshopper); Mayetiola
destructor (Hessian fly); Sitodiplosis mosellana (wheat midge);
Meromyza americana (wheat stem maggot); Hylemya coarctata (wheat
bulb fly); Frankliniella fusca (tobacco thrips); Cephus cinctus (wheat
stem sawfly); Aceria tulipae (wheat curl mite).
-
Bei
der Sonnenblume gegen die Pilz-, bakteriellen oder viralen Pathogene
Plasmophora halstedii, Sclerotinia sclerotiorum, Aster Yellows,
Septoria helianthi, Phomopsis helianthi, Alternaria helianthi, Alternaria zinniae,
Botrytis cinerea, Phoma macdonaldii, Macrophomina phaseolina, Erysiphe
cichoracearum, Rhizopus oryzae, Rhizopus arrhizus, Rhizopus stolonifer,
Puccinia helianthi, Verticillium dahliae, Erwinia carotovorum p.v.
Carotovora, Cephalosporium acremonium, Phytophthora cryptogea, Albugo
tragopogonis und die pathogenen Insekten/Nematoden Suleima helianthana
(sunflower bud moth); Homoeosoma electellum (sunflower moth); zygogramma
exclamationis (sunflower beetle); Bothyrus gibbosus (carrot beetle);
Neolasioptera murtfeldtiana (sunflower seed midge).
-
Bei
Mais gegen die Pilz-, bakteriellen oder viralen Pathogene Fusarium
moniliforme var. subglutinans, Erwinia stewartii, Fusarium moniliforme,
Gibberella zeae (Fusarium graminearum), Stenocarpella maydi (Diplodia
maydis), Pythium irregulare, Pythium debaryanum, Pythium graminicola,
Pythium splendens, Pythium ultimum, Pythium aphanidermatum, Aspergillus
flavus, Bipolaris maydis 0, T (Cochliobolus heterostrophus), Helminthosporium
carbonum I, II & III
(Cochliobolus carbonum), Exserohilum turcicum I, II & III, Helminthosporium
pedicellatum, Physoderma maydis, Phyllosticta maydis, Kabatiella
maydis, Cercospora sorghi, Ustilago maydis, Puccinia sorghi, Puccinia
polysora, Macrophomina phaseolina, Penicillium oxalicum, Nigrospora
oryzae, Cladosporium herbarum, Curvularia lunata, Curvularia inaequalis,
Curvularia pallescens, Clavibacter michiganese subsp. nebraskense,
Trichoderma viride, Maize Dwarf Mosaic Virus A & B, Wheat Streak Mosaic Virus, Maize
Chlorotic Dwarf Virus, Claviceps sorghi, Pseudonomas avenae, Erwinia
chrysanthemi p.v. Zea, Erwinia corotovora, Cornstunt spiroplasma,
Diplodia macrospora, Sclerophthora macrospora, Peronosclerospora
sorghi, Peronosclerospora philippinesis, Peronosclerospora maydis,
Peronosclerospora sacchari, Spacelotheca reiliana, Physopella zeae,
Cephalosporium maydis, Caphalosporium acremonium, Maize Chlorotic Mottle
Virus, High Plains Virus, Maize Mosaic Virus, Maize Rayado Fino
Virus, Maize Streak Virus (MSV, Maisstrichel-Virus), Maize Stripe
Virus, Maize Rough Dwarf Virus und die pathogenen Insekten/Nematoden Ostrinia
nubilalis (European corn borer); Agrotis ipsilon (black cutworm);
Helicoverpa zea (corn earworm); Spodoptera frugiperda. (fall armyworm);
Diatraea grandiosella (southwestern corn borer); Elasmopalpus lignosellus
(lesser cornstalk borer); Diatraea saccharalis (surgarcane borer);
Diabrotica virgifera (western corn rootworm); Diabrotica longicornis
barberi (northern corn rootworm); Diabrotica undecimpunctata howardi
(southern corn rootworm); Melanotus spp. (wireworms); Cyclocephala
borealis (northern masked chafer; white grub); Cyclocephala immaculata
(southern masked chafer; white grub); Popillia japonica (Japanese
beetle); Chaetocnema pulicaria (corn flea beetle); Sphenophorus
maidis (maize billbug); Rhopalosiphum maidis (corn leaf aphid);
Anuraphis maidiradicis (corn root aphid); Blissus leucopterus leucopterus
(chinch bug); Melanoplus femurrubrum (redlegged grasshopper); Melanoplus
sanguinipes (migratory grasshopper); Hylemva platura (seedcom maggot);
Agromyza parvicornis (corn blot leafminer); Anaphothrips obscrurus
(grass thrips); Solenopsis milesta (thief ant); Tetranychus urticae
(twospotted spider mite).
-
Bei
Sorghum gegen die Pilz-, bakteriellen oder viralen Pathogene Exserohilum
turcicum, Colletotrichum graminicola (Glomerella graminicola), Cercospora
sorghi, Gloeocercospora sorghi, Ascochyta sorghina, Pseudomonas
syringae p.v. syringae, Xanthomonas campestris p.v. holcicola, Pseudomonas
andropogonis, Puccinia purpurea, Macrophomina phaseolina, Perconia
circinata, Fusarium monilifonne, Alternaria alternate, Bipolaris
sorghicola, Helminthosporium sorghicola, Curvularia lunata, Phoma
insidiosa, Pseudomonas avenae (Pseudomonas alboprecipitans), Ramulispora
sorghi, Ramulispora sorghicola, Phyllachara sacchari, Sporisorium
reilianum (Sphacelotheca reiliana), Sphacelotheca cruenta, Sporisorium
sorghi, Sugarcane mosaic H, Maize Dwarf Mosaic Virus A & B, Claviceps
sorghi, Rhizoctonia solani, Acremonium strictum, Sclerophthona macrospora,
Peronosclerospora sorghi, Peronosclerospora philippinensis, Sclerospora
graminicola, Fusarium graminearum, Fusarium oxysporum, Pythium arrhenomanes,
Pythium graminicola und die pathogenen Insekten/Nematoden Chilo
partellus (sorghum borer); Spodoptera frugiperda (fall armyworm);
Helicoverpa zea (corn ear-worm); Elasmopalpus lignosellus (lesser
cornstalk borer); Feltia subterranea (granulate cutworm); Phvllophaga
crinita (white grub); Eleodes, Conoderus und Aeolus spp. (wireworm);
Oulema melanopus (cereal leaf beetle); Chaetocnema pulicaria (corn
flea beetle); Sphenophorus maidis (maize billbug); Rhopalosiphum
maidis (corn leaf aphid); Siphaflava (yellow sugarcane aphid); Blissus
leucopterus leucopterus (chinch bug); Contarinia sorghicola (sorghummidge);
Tetranychus cinnabarinus (carmine spider mite); Tetranychus urticae
(two spotted spider mite).
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Bei
Baumwolle gegen die pathogenen Insekten/Nematoden: Heliothis virescens
(cotton budworm); Helicoverpa zea (cotton bollworm); Spodoptera
exigua (beet armyworm); Pectinophora gossypiella (pink bollworm);
Anthonomus grandis grandis (boll weevil); Aphis gossypii (cotton
aphid); Pseudatomoscelis seriatus (cotton fleahopper); Trialeurodes
abutilonea (bandedwinged whitefly); Lygus lineolaris (tarnished
plant bug); Melanoplus femurrubrum (redlegged grasshopper); Melanoplus
differentialis (differential grasshopper); Thrips tabaci (onion
thrips); Franklinkiella fusca (tobacco thrips); Tetranychus cinnabarinus
(carmine spider mite); Tetranychus urticae (twospotted spider mite);
Bei Reis gegen die pathogenen Insekten/Nematoden Diatraea saccharalis
(sugarcane borer); Spodoptera frugiperda (fall armyworm); Helicoverpa
zea (corn earworm); Colaspis brunnea (grape colaspis); Lissorhoptrus
oryzophilus (rice water weevil); Sitophilus oryzae (rice weevil);
Nephotettix nigropictus (rice leafhopper); Blissus Ieucopterus leucopterus
(chinch bug); Acrosternum hilare (green stink bug);
Bei Raps
gegen die pathogenen Insekten/Nematoden Brevicoryne brassicae (cabbage
aphid); Phyilotreta cruciferae (Flea beetle); Mamestra conjgurata
(Bertha armyworm); Plutella xylostella (Diamond-back moth); Delia ssp.
(Root maggots).
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Insbesondere
bevorzugt umfasst der Begriff "pflanzliches
Pathogen" Pathogene
der Gruppe Blumeria graminis f. sp. hordei, tritici, avenae, secalis,
lycopersici, vitis, cucumis, cucurbitae, pisi, pruni, solani, rosae, fragariae,
rhododendri, mali und nicotianae.
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Unter "Actin-depolymerisierender
Faktor 3 (ADF3) aus Gerste" wird
ein Protein mit der SEQ ID No. 1 erfindungsgemäß verstanden.
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Unter "Actin-depolymerisierenden
Faktoren (ADFs)" werden
erfindungsgemäß solche
Proteine verstanden, deren Sequenz eine signifikante Homologie zu
dem oben genannten ADF3 aus Gerste aufweist.
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Wenn
im Folgenden von ADF3 gesprochen wird, ist damit der ADF3 aus Gerste
mit der SEQ ID No. 1 gemeint, wohingegen bei Verwendung des Begriffs "ADFs" der ADF3 aus Gerste
und/oder solche Proteine gemeint sind, die eine signifikante oder
wesentliche Homologie zu dem ADF3 aus Gerste aufweisen.
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Unter
dem "Gehalt" an ADF3 aus Gerste
bzw. ADFs im Allgemeinen wird erfindungsgemäß die Menge an ADF3 bzw. einem
bestimmten ADF verstanden, wie er für den Wildtyp einer Pflanze
bzw. Pflanzenzelle bestimmt werden kann.
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Unter
der "Aktivität" von ADF3 bzw. ADFs
im Allgemeinen wird deren Fähigkeit
verstanden, mit globulärem
Actin (G-Actin) oder filamentösem
Actin (F-Actin) bzw. anderen physiologischen Bindungspartnern zu interagieren.
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Unter
einem "gegenüber dem
Wildtyp veränderten
Gehalt" an ADFs
wird erfindungsgemäß daher
eine gegenüber
im Vergleich zum Wildtyp erhöhte
oder erniedrigte Menge an ADFs verstanden. Die Erhöhung des Gehalts
an ADFs kann dabei durch eine Erhöhung der Menge an endogenen
ADFs oder durch Zuführen
einer zusätzlichen
Menge an exogenen ADFs erzielt werden. Die Erniedrigung der Menge
an ADFs in den erfindungsgemäßen transgenen
Pflanzen bzw. Pflanzenzellen wird im Allgemeinen durch eine Erniedrigung
des Gehalts an endogenen ADFs erzielt.
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Unter
einem "Wildtyp" wird erfindungsgemäß der entsprechende
nicht genetisch veränderte
Ausgangsorganismus verstanden.
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Die
Erhöhung
der Aktivität
an ADFs kann durch eine Erhöhung
der Aktivität
der endogenen ADFs und/oder durch Zufuhr einer zusätzlichen
Menge an funktionellen ADFs erreicht werden. Eine Erniedrigung der Aktivität an ADFs
kann durch eine Erniedrigung der Aktivität der endogenen ADFs erzielt
werden. Gleichermaßen
wird erfindungsgemäß unter
einer Erniedrigung der Aktivität
an ADFs verstanden, dass die Aktivität an endogenem ADF3 bzw. endogenen
ADFs unverändert
bleibt, die Interaktion der ADFs mit ihren physiologischen Bindungspartnern
durch z.B. die Expression nicht-funktioneller Formen der ADFs oder
Antikörpern
aber signifikant inhibiert wird.
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Vorzugsweise
beträgt
die durch ein erfindungsgemäßes Verfahren
bewirkte Erhöhung
des Gehalts und/oder der Aktivität
an ADFs in einer transgenen Pflanze bzw. Pflanzenzelle mindestens
5%, bevorzugt mindestens 20%, ebenfalls bevorzugt mindestens 50%,
besonders bevorzugt mindestens 100%, ebenfalls besonders bevorzugt
mindestens den Faktor 5, insbesondere bevorzugt mindestens den Faktor
10, ebenfalls insbesondere bevorzugt mindestens den Faktor 50, noch
bevorzugter mindestens den Faktor 100 und am meisten bevorzugt mindestens
den Faktor 1000. Die erfindungsgemäßen transgenen Pflanzen weisen
vergleichbare Erhöhungen
des Gehalts und/oder der Aktivität
an ADFs in einer transgenen Pflanze bzw. Pflanzenzelle auf.
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Vorzugsweise
beträgt
die durch ein erfindungsgemäßes Verfahren
bewirkte Erniedrigung des Gehalts und/oder der Aktivität an ADFs
in einer transgenen Pflanzenzelle bzw. Pflanze mindestens 5%, bevorzugt
mindesten 10%, besonders bevorzugt mindestens 20%, ebenfalls besonders
bevorzugt mindestens 40%, ebenfalls besonders bevorzugt mindestens
60%, insbesondere bevorzugt mindestens 80%, ebenfalls insbesondere bevorzugt
mindestens 90% und am meisten bevorzugt mindestens 98%.
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Wie
bereits oben erwähnt
wurde, betrifft ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung ein isoliertes
Nukleinsäuremolekül, das für den ADF3
aus Gerste mit der SEQ ID No. 1 kodiert. Ein weiterer Gegenstand
der vorliegenden Erfindung betrifft Nukleinsäuremoleküle, die für funktionell äquivalente
Teile des ADF3 aus Gerste mit der SEQ ID No. 1 kodieren.
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Wenn
im Rahmen der Erfindung von "funktionell äquivalenten
Teilen von ADF3" gesprochen
wird, dann sind damit Fragmente der Nukleinsäuresequenzen, wie sie für den ADF3
mit der SEQ ID No. 1 kodieren, gemeint, deren Expression noch zu
Proteinen mit den Bindungseigenschaften und strukturellen Eigenschafen des
ADF3 führen.
Gleichermaßen
ist der Begriff "funktionell äquivalente
Teile" zu verstehen,
wenn er sich auf Proteinfragmente im Allgemeinen bezieht. Besonders
bevorzugt handelt es sich dabei um Nukleinsäuresequenzen, die zu ADF3-Fragmenten
führen,
die Deletionen von mehreren Aminosäuren am N- und/oder C-Terminus
aufweisen, ohne dass es zu einer Veränderung der strukturellen Eigenschaften
bzw. der Bindungseigenschaften des ADF3 kommt. Mit Bindungseigenschaften
von ADF3 ist insbesondere das Bindungsverhalten des ADF3 an G-Actin
und/oder F-Actin gemeint.
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Ein
weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind Nukleinsäuremoleküle, die
für Mutanten
des ADF3 kodieren. Unter "Mutanten
von ADF3" werden
sowohl funktionelle als auch nicht-funktionelle Mutanten des ADF3
verstanden. Bei funktionellen Mutanten handelt es sich um Formen
von ADF3, die Punktmutation(en), Insertion(en) und/oder Deletion(en) aufweisen,
ohne dass es dadurch zu einem wesentlichen Verlust der strukturellen
Eigenschaften bzw. der Bindungseigenschaften des ADF3 kommt.
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Die
Bindungseigenschaften von ADF3 aus Zea mays sind ebenso wie dessen
strukturelle Eigenschaften beschrieben worden (Jiang et al. (1997),
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, 9973–9978). Da es sich bei dem ADF3
aus Mais um einen ADF handelt, der im Sinne der vorliegenden Erfindung
im Wesentlichen homolog zu ADF3 aus Gerste ist, können die
in der genannten Publikation beschriebenen Erkenntnisse bezüglich des
Bindungsverhaltens von ADFs an G-Actin und F-Actin auch bei der
Herstellung von funktionellen und nicht-funktionellen Mutanten des erfindungsgemäßen ADF3
aus Gerste verwendet werden (siehe unten).
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Funktionelle
Punktmutanten wird man in der Regel dann erhalten, wenn ein so genannter
konservativer Aminosäureaustausch
vorgenommen wird, d.h. Aminosäuren
mit vergleichbaren physiko-chemischen Eigenschaften werden gegeneinander
ausgetauscht. Dabei werden hydrophobe für hydrophobe Aminosäuren, hydrophile
für hydrophile
Aminosäuren,
positiv geladene für
positiv geladene Aminosäuren,
etc. ausgetauscht. Ein Beispiel für einen konservativen Aminosäureaustausch
ist ein Austausch von einem Valin für ein Alanin. Dabei wird der
Fachmann beachten, ob sich der konservative Aminosäureaustausch
in einer Region von ADF3 befindet, die für dessen Bindungsverhalten
an F-Actin oder G-Actin essentiell ist. Anhaltspunkte darüber, ob eine
bestimmte Region für
das Bindungsverhalten von ADF3 essentiell ist, kann sich durch ein
so genanntes Sequenz-Alignment
mit bereits bekannten ADFs ergeben, für die die Bindungseigenschaften
und strukturellen Eigenschaften bereits ermittelt wurden (siehe
Jiang et al., vide supra). Im Gegensatz zu einer konservativen Mutation
wird der Fachmann eher nicht davon ausgehen, dass bei einem Austausch
von z.B. einem Lysin gegen ein Glutamat, d.h. einem positiv geladenen
Rest gegen einen negativ geladenen Rest, es nicht zu einer funktionellen
bzw. strukturellen Änderung
des ADF kommt. Die gleichen Überlegungen,
die bei der Herstellung von funktionellen Punktmutanten von ADF3
angestellt werden, gelten auch bei der Herstellung von funktionellen
Insertions- und/oder Deletionsmutanten von ADF3 mit der Maßgabe, dass
der Fachmann in diesem Fall besonders darauf achten wird, ob die
hinzugefügten
bzw. entfernten Aminosäuresequenzbereiche
sich in einem Bereich befinden, der für die Bindung an Actin essentiell
ist oder nicht.
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Ein
Beispiel für
eine funktionelle Mutante ist ein S6A-Aminosäureaustausch,
der verhindert, dass das Protein am N-Terminus phosphoryliert wird.
Durch den Austausch von Serin gegen Alanin in der Aminosäureposition
6 ist eine solche Mutante von ADF3 (SEQ ID No. 2) permanent aktiv
und nicht mehr posttranslational regulierbar.
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Die
mutierte Aminosäure
befindet sich an Position 6 der Aminosäuresequenz, wobei das Wildtyp
Serin (S) gegen ein Alanin (A) getauscht wurde (Smertenko, A.P.
et al. (1998) Plant J 14, 187–193).
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Wie
bereits oben erwähnt,
sind ein Gegenstand der Erfindung ebenfalls Nukleinsäuremoleküle, die
für nicht-funktionelle
Mutanten des ADF3 aus Gerste kodieren. Bei solchen nicht-funktionellen
Mutanten des ADF3 handelt es sich um Formen von ADF3, die nicht
mehr oder zumindest nur noch sehr beschränkt in der Lage sind, mit G-Actin
und/oder F-Actin
bzw. anderen physiologischen Bindungspartnern von ADF3 zu interagieren.
Solche nicht-funktionellen Mutanten von ADF3 können wiederum Punktmutation(en),
Insertion(en) und/oder Deletion(en) umfassen. Solche nicht-funktionellen
Mutanten von ADF3 sind z.B. bei der Herstellung von transgenen Pflanzen
bzw. Pflanzenzellen nützlich,
bei denen der Gehalt an endogenem ADF3 in der Gerste nicht verändert wird,
die Aktivität
an endogenem ADF3 durch Überexpression
der genannten nicht-funktionellen Mutanten aber blockiert wird.
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Nicht-funktionelle
Mutanten von ADF3 verfügen
erfindungsgemäß über im Wesentlichen
gleiche Nukleinsäure-
bzw. Aminosäuresequenzen
wie funktionelle Mutanten von ADF3. Sie weisen jedoch an einigen Stellen
Punktmutation(en), Insertion(en) oder Deletion(en) von Nukleotiden
oder Aminosäuren
auf, die im Gegensatz zu funktionellen Mutanten von ADF3 bewirken,
dass die nicht-funktionellen Mutanten von ADF3 nicht oder nur sehr
begrenzt in der Lage sind, mit F-Actin, G-Actin und/oder anderen
physiologischen Bindungspartnern zu interagieren. Solche erfindungsgemäßen funktionellen
bzw. nicht-funktionellen Mutanten von ADF3 können vom Fachmann in einfacher
Weiser identifiziert werden. Dem Fachmann stehen eine Reihe von
Techniken zur Verfügung,
mit denen es möglich
ist, Punktmutation(en), Insertion(en) oder Deletion(en) in die Nukleinsäuresequenzen,
die für
funktionelle bzw. nicht-funktionelle Mutanten von ADF3 kodieren,
einzufügen (Sambrook
(2001), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd edition, Coldspring
Harbour Laboratory Press). Nach Einführung der Punktmutation/Insertion
und/oder Deletion, die auch allgemein als Mutation bezeichnet werden,
kann der Fachmann durch entsprechende Bindungstests, wie sie in
den Beispielen dargestellt oder aus dem Stand der Technik bekannt
sind, feststellen, ob die mutagenisierten ADF3 noch über ihre normalen
Bindungseigenschaften bezüglich
G-Actin, F-Actin und/oder anderen physiologischen Bindungspartnern
verfügen.
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Nicht-funktionelle
Mutanten von ADF3 verfügen über eine
im Vergleich zum nicht-mutagenisierten ADF3
bzw. zur funktionellen Mutante von ADF3 erniedrigte Bindungsspezifität, bevorzugt
gegenüber
G-Actin und/oder F-Actin. Erfindungsgemäß verfügt eine nicht-funktionelle
Mutante von ADF3 über
1 bis 90%, bevorzugt über
1 bis 70%, besonders bevorzugt über
1 bis 50%, ebenfalls besonders bevorzugt über 1 bis 30%, insbesondere
bevorzugt über
1 bis 15% und am meisten bevorzugt über 1 bis 10% der Bindungseffizienz
von ADF3 bzw. der entsprechenden funktionellen Mutanten von ADF3
gegenüber
dem jeweiligen pathogenen und/oder physiologischen Bindungspartner,
hierbei bevorzugt gegenüber
G-Actin und/oder F-Actin.
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Beispiele
für Aminosäurepositionen,
die für
die Interaktion mit G-Actin und/oder F-Actin wichtig sind, sind
die Aminosäurepositionen
in ADF3 aus Gerste, die den Positionen Tyrosin-67 und Tyrosin-70 im ADF3 aus Mais entsprechen.
Dabei handelt es sich um die Positionen Phenylalanin-66 und Phenylalanin-69
in HvADF3.
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Erfindungsgemäß umfasst
der Begriff "nicht-funktioneller
ADF3" nicht solche
Proteine, die keine wesentliche Sequenzhomologie auf Aminosäure- bzw.
Nukleinsäureebene
zu funktionellem ADFF3 aufweisen. Proteine, die nicht in der Lage
sind, an G-Actin und/oder F-Actin zu binden und keine wesentliche
Sequenzhomologie zu ADF3 aufweisen, sind daher definitionsgemäß mit dem
erfindungsgemäßen Begriff "nicht-funktionelle
Mutante von ADF3" nicht
gemeint. Nicht-funktionelle Mutanten von ADF3 werden im Rahmen der
Erfindung auch als inaktivierte oder inaktive ADF3 bezeichnet.
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Somit
zeichnen sich die erfindungsgemäßen funktionellen
und/oder nicht-funktionellen Mutanten von ADF3, die die oben genannte
Punktmutation(en), Insertion(en) und/oder Deletion(en) tragen, oder
die funktionell äquivalenten
Teile durch eine wesentliche Sequenzhomologie zu ADF3 aus.
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Unter "wesentlicher Sequenzhomologie" wird erfindungsgemäß allgemein
verstanden, dass die Nukleinsäure-
bzw. Aminosäuresequenz
eines DNA-Moleküls
bzw. eines Proteins zu mindestens 40%, bevorzugt zu mindestens 50%,
weiter bevorzugt zu mindestens 60%, ebenfalls bevorzugt zu mindestens
70%, 80% oder 85%, besonders bevorzugt zu mindestens 90%, insbesondere
bevorzugt zu mindestens 95% und am meisten bevorzugt zu mindestens
98% zu den Nukleinsäure-
bzw. Aminosäuresequenzen
von ADF3 oder dessen funktionell äquivalenten Teilen identisch
ist. Vorzugsweise wird die Homologie über die gesamte Sequenzlänge von ADF3
bestimmt.
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Unter "Identität zwischen
zwei Proteinen" wird
die Identität
der Aminosäuren über einen
bestimmten Proteinbereich verstanden, vorzugsweise die gesamte Proteinlänge, insbesondere
die Identität,
die durch Vergleich mit Hilfe der Lasergene-Software der Firma DNA
Star Inc., Madison, Wisconsin (USA) unter Anwendung der CLUSTAL-Methode
(Higgins et al., 1989), Comput. Appl. Biosci., 5 (2), 151) berechnet
wird.
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Bevorzugt
wird die Homologie also über
den gesamten Aminosäure-
bzw. Nukleinsäuresequenzbereich
berechnet. Neben den oben genannten Programmen stehen dem Fachmann
für den
Vergleich verschiedener Sequenzen noch weitere Programme zur Verfügung, die
auf verschiedenen Algorithmen beruhen. Dabei liefern die Algorithmen
von Needleman und Wunsch oder Smith und Waterman besonders zuverlässige Ergebnisse.
Für die
Sequenzvergleiche kann z.B. auch das Programm Pile Aupa verwendet
werden (J. Mol. Evolution. (1987), 25, 351–360; Higgins et al., (1989),
Cabgos, 5, 151–153)
oder die Programme Gap und Best Fit (Needleman und Wunsch, (1970),
J. Mol. Biol., 48, 443–453
sowie Smith und Waterman (1981), Adv., Appl. Math., 2, 482–489), die
im GCG-Software-Paket
der Genetics Computer Group (575 Science Drive, Madison, Wisconsin,
USA 53711) enthalten sind.
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Für die im
Rahmen der vorliegenden Erfindung durchgeführten Sequenz-Alignments wurde
das Clustal-W-Programm verwendet, wie es über http://www.ebi.ac.uk/clustalw
aufgerufen werden kann. Die Parameter der genannten Startseite blieben
für die
Alignments unverändert.
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Ein
weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind Nukleinsäuremoleküle, die
mit den Nukleinsäuremolekülen, die
für ADF3,
funktionell äquivalente
Teile davon bzw. funktionelle oder nicht-funktionelle Mutanten von
ADF3 kodieren, unter stringenten Bedingungen hybridisieren bzw.
zu diesen im Wesentlichen komplementär sind. Mit dem Begriff "Komplementarität" wird die Fähigkeit
eines Nukleinsäuremoleküls beschrieben,
mit einem anderen Nukleinsäuremolekül aufgrund
von Wasserstoffbrücken
zwischen komplementären Basen
zu hybridisieren. Der Fachmann weiß, dass zwei Nukleinsäuremoleküle nicht über eine
100%ige Komplementarität
verfügen
müssen,
um miteinander hybridisieren zu können. Bevorzugt ist eine Nukleinsäuresequenz,
die mit einer anderen Nukleinsäuresequenz
hybridisieren soll, zu dieser zu mindestens 40%, zu mindestens 50%,
zu mindestens 60%, bevorzugt zu mindestens 70%, besonders bevorzugt
zu mindestens 80%, ebenfalls besonders bevorzugt zu mindestens 90%,
insbesondere bevorzugt zu mindestens 95% und am meisten bevorzugt
zu mindestens 98% bzw. 100% komplementär.
-
Bevorzugt
sind Homologie-, Komplementaritäts-
und Identitätsgrade über die
gesamte Protein- bzw. Nukleinsäurelänge zu bestimmen.
-
Nukleinsäuremoleküle sind
identisch, wenn sie gleiche Nukleotide in gleicher 5'-3'-Reihenfolge aufweisen.
-
Stringente
in vitro Hybridisierungsbedingungen sind dem Fachmann bekannt und
können
der Literatur entnommen werden (siehe z.B. Sambrook et al., vide
supra). Der Begriff "spezifische
Hybridisierung" bezieht sich
auf den Umstand, dass ein Molekül
unter stringenten Bedingungen präferentiell
an eine bestimmte Nukleinsäuresequenz
bindet, wenn diese Nukleinsäuresequenz
Teil einer komplexen Mischung von z.B. DNA- oder RNA-Molekülen ist.
-
Der
Begriff "stringente
Bedingungen" bezieht
sich damit auf Bedingungen, unter denen eine Nukleinsäuresequenz
präferentiell
an eine Zielsequenz bindet, aber nicht oder zumindest wesentlich
reduziert an andere Sequenzen.
-
Stringente
Bedingungen sind von den Umständen
abhängig.
Längere
Sequenzen hybridisieren spezifisch bei höheren Temperaturen. Generell
werden stringente Bedingungen so gewählt, dass die Hybridisierungstemperatur
circa 5°C
unter dem Schmelzpunkt (Tm) für
die spezifische Sequenz bei einer definierten ionischen Stärke und
einem definierten pH-Wert liegt. Tm ist die Temperatur (bei einem
definierten pH-Wert, einer definierten ionischen Stärke und
einer definierten Nukleinsäurekonzentration),
bei der 50% der Moleküle, die
zu einer Zielsequenz komplementär
sind, mit dieser Zielsequenz hybridisieren. Typischerweise umfassen stringente
Bedingungen Salzkonzentrationen zwischen 0,01 und 1,0 M Natriumionen
(oder eines anderen Salzes) und einen pH zwischen 7,0 und 8,3. Die
Temperatur ist mindestens 30°C
für kurze
Moleküle
(z.B. für
solche, die zwischen 10 bis 50 Nukleotiden umfassen). Zusätzlich können stringente
Bedingungen die Zugabe von destabilisierenden Agenzien wie z.B.
Formamid umfassen. Typische Hybridisierungs- und Waschpuffer haben
folgende Zusammensetzung.
Prähybridisierungslösung: | |
| 0,5%
SDS |
| 5 × SSC |
| 50
mM NaPO4, pH 6,8 |
| 0,1%
Na-Pyrophosphat |
| 5 × Denhardt's Reagenz |
| 100 μg/ml Lachssperm |
Hybridisierungslösung: | Prähybridisierungslsg. |
| 1 × 106 cpm/ml Sonde (5–10 min 95°C) |
20 × SSC: | 3
M NaCl |
| 0,3
M Natriumcitrat |
| ad
pH 7 mit HCl |
50 × Denhardt's Reagenz: | 5
g Ficoll |
| 5
g Polyvinylpyrrolidon |
5 g
Bovine Serum Albumine | ad
500 ml A. dest. |
-
Eine
typische Verfahrensweise für
die Hybridisierung sieht folgendermaßen aus:
-
Wie
bereits oben erwähnt
wurde, können
die oben genannten Nukleinsäuresequenzen,
die für
ADF3 aus Gerste, funktionell äquivalente
Teile davon bzw. funktionelle oder nicht-funktionelle Mutanten davon kodieren,
benutzt werden, um transgene Pflanzen mit einem veränderten
Gehalt und/oder einer veränderten
Aktivität
an ADF3 herzustellen, was zur Folge hat, dass diese Pflanzen über eine
erhöhte
Pathogenresistenz gegenüber
dem Mehltauerreger Blumeria graminis f. sp. hordei verfügen.
-
Die
vorliegende Erfindung ist jedoch nicht auf Verfahren zur Herstellung
von transgenen Gerstepflanzen bzw. Gerstepflanzenzellen, die aufgrund
eines veränderten
Gehalts und/oder veränderten
Aktivität
von ADF3 aus Gerste eine erhöhte
Resistenz gegenüber
Blumeria graminis f. sp. hordei zeigen, beschränkt.
-
Es
wird davon ausgegangen, dass (i) durch die Veränderung des Gehalts und/oder
der Aktivität
von Homologen von ADF3 in anderen Pflanzen ebenfalls transgene Pflanzen
bzw. Pflanzenzellen hergestellt werden können, die über eine erhöhte Pathogenresistenz
im Sinne der vorliegenden Erfindung verfügen und (ii), dass zur Herstellung
von transgenen Pflanzen bzw. Pflanzenzellen mit einer erhöhten Pathogenresistenz
auch auf Homologe von ADF3 aus Gerste zurückgegriffen werden kann.
-
Die
vorliegende Erfindung betrifft damit generell Verfahren zur Herstellung
von transgenen Pflanzen bzw. Pflanzenzellen mit einer erhöhten Pathogenresistenz,
bei denen im Vergleich zum Wildtyp der Gehalt und/oder die Aktivität von mindestens
einem ADF verändert
ist. Bei den im Folgenden beschriebenen Verfahren zur Herstellung
von transgenen Pflanzen mit erhöhter
Pathogenresistenz und Änderung
des Gehalts und/oder der Aktivität
von mindestens einem ADF können
daher neben den oben erwähnten
Nukleinsäuresequenzen
auch solche Nukleinsäuresequenzen
zum Einsatz kommen, die für
ADFs kodieren, die im Wesentlichen homolog zu dem ADF3 mit der SEQ
ID No. 1 aus Gerste sind.
-
Unter
wesentlicher Sequenzhomologie von ADFs zu dem ADF3 mit der SEQ ID
No. 1 aus Gerste wird dabei erfindungsgemäß verstanden, dass die Nukleinsäure- bzw.
Aminosäuresequenz
eines solchen ADFs zu mindestens 40%, bevorzugt zu mindestens 50%,
weiter bevorzugt zu mindestens 60%, ebenfalls bevorzugt zu mindestens
70%, 80% oder 85%, besonders bevorzugt zu mindestens 90%, insbesondere
bevorzugt zu mindestens 95% und am meisten bevorzugt zu mindestens
98% zu den Nukleinsäure-
bzw. Aminosäuresequenzen
des ADF3 aus Gerste sind. Die Sequenzhomologie kann dabei nach den
oben genannten Methoden festgestellt werden.
-
Bei
den erfindungsgemäßen Verfahren
können
neben den genannten Nukleinsäuresequenzen,
die für ADFs,
die im Wesentlichen homolog zu ADF3 aus Gerste sind, kodieren, auch
solche Nukleinsäuren
verwendet werden, die für
funktionell äquivalente
Teile der ADFs bzw. funktionelle oder nicht-funktionelle Mutanten der
ADFs kodieren, vorausgesetzt, dass es sich um ADFs handelt, die
im Wesentlichen homolog zu dem ADF3 aus Gerste sind. Die oben beschriebenen
Definitionen für
funktionell äquivalente
Teile bzw. funktionelle oder nicht-funktionelle Mutanten gelten dabei auch
für die
ADFs im Allgemeinen.
-
Beispiele
für solche
ADFs, die für
die erfindungsgemäßen Verfahren
verwendet werden können,
sind die in Tabelle 5 angegebenen ADFs aus Arabidopsis thaliana,
Zea mays, Hordeum vulgare, Oryza sativa und Triticum aestivum. Geeignete
Nukleotid- und Aminosäure-Sequenzen
für die
ADFs kann der Fachmann sowohl den in der Tabelle angegebenen Datenbankeinträgen als
auch dem Sequenzprotokoll entnehmen.
-
-
-
-
Die
GenBank-Datenbank kann über
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez aufgerufen werden. Die TIGR-Datenbank
kann über
http://www.tigr.org aufgerufen werden.
-
Es
sind somit eine Vielzahl von DNA-Sequenzen, die für im Wesentlichen
Homologe von ADF3 aus Gerste kodieren, bereits bekannt. Darüber hinaus
können
im Rahmen der vorliegenden Erfindung auch die Sequenzen von ADFs
verwendet werden, die im Moment noch nicht in den öffentlichen
Datenbanken zur Verfügung
stehen.
-
Dem
Fachmann ist bekannt, wie er entsprechende korrespondierende DNA-Sequenzen
von anderen Organismen isolieren kann. Typischerweise wird der Fachmann
zunächst
durch Homologie-Vergleiche in den etablierten Datenbanken wie z.B.
der GenBank-Datenbank am NCBI versuchen, entsprechende homologe
Sequenzen zu identifizieren. Solche Datenbanken können auf
der NCBI-Homepage beim NIH unter http://www.ncbi.nlm.nih.gov gefunden
werden.
-
DNA-Sequenzen
mit einer hohen Homologie, d.h. einer hohen Ähnlichkeit oder Identität sind bona
fide Kandidaten für
DNA-Sequenzen, die den erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen, d.h. ADF3
entsprechen. Diese Gensequenzen können durch Standardmethoden,
wie z.B. PCR und Hybridisierung isoliert werden, und ihre Funktion
durch entsprechende Enzymaktivitätstests
und andere Experimente durch den Fachmann bestimmt werden. Homologievergleiche
mit DNA-Sequenzen können
erfindungsgemäß auch verwendet
werden, um PCR-Primer zu designen, indem zunächst die Regionen identifiziert
werden, die zwischen den DNA-Sequenzen
von verschiedenen Organismen am meisten konserviert sind. Solche
PCR-Primer können
dann benutzt werden, um in einem ersten Schritt DNA-Fragmente zu
isolieren, die Bestandteile von DNA-Sequenzen sind, die zu den DNA-Sequenzen
der Erfindung homolog sind.
-
Es
gibt eine Reihe von Suchmaschinen, die für solche Homologievergleiche
bzw. -suchen verwendet werden können.
Diese Suchmaschinen umfassen z.B. die CLUSTAL-Programmgruppe des
BLAST-Programms, das durch das NCBI zur Verfügung gestellt wird.
-
Darüber hinaus
sind dem Fachmann eine Reihe von experimentellen Methoden bekannt,
mit denen DNA-Sequenzen aus verschiedensten Organismen isoliert
werden können,
die zu den erfindungsgemäßen ADFs
homolog sind. Dazu gehört
z.B. das Anfertigen und Screenen von cDNA-Bibliotheken mit entsprechend degenerierten
Sonden (siehe auch Sambrook et al., vide supra).
-
Erfindungsgemäß weisen
der ADF3 aus Gerste und die ADFs im Allgemeinen eine so genannte
Konsensusregion auf. In 1 findet sich ein so genanntes
Sequenz-Alignment von verschiedenen ADF-Sequenzen aus A. thaliana
mit ADF3 aus Gerste.
-
Aus
diesem Sequenz-Alignment können
verschiedene Konsensussequenzen abgeleitet werden, die für die erfindungsgemäßen ADFs
charakteristisch sind. Die Konsensussequenz I umfasst die folgende
Sequenz:
X1PX2X3X4CR5X6X7X8DX9X10X11 (SEQ
ID No. 89)
-
Dabei
kann X1 jede beliebige Aminosäure, bevorzugt
L oder I, umfassen. X2 kann jede Aminosäure umfassen.
X3 kann jede Aminosäure, bevorzugt N oder D umfassen.
X4 kann jede beliebige Aminosäure, bevorzugt
D oder E umfassen. X5 kann jede Aminosäure, bevorzugt
Y oder F umfassen, X6 kann jede Aminosäure, bevorzugt
A oder C umfassen. X7 kann jede Aminosäure, bevorzugt
V oder I umfassen. X8 kann jede Aminosäure umfassen.
X9 kann jede Aminosäure umfassen. X10 kann
jede Aminosäure,
bevorzugt D oder E umfassen. X11 kann jede
Aminosäure,
bevorzugt F oder Y, umfassen. Die Aminosäuren sind dabei nach dem üblichen
Einbuchstabencode angegeben.
-
Daneben
sind die ADFs, die zur Verwendung in den erfindungsgemäßen Verfahren
eingesetzt werden können,
durch das Vorhandensein einer zweiten Konsensussequenz gekennzeichnet.
-
Diese
zweite Konsensussequenz II umfasst folgende Sequenz:
Y1IY2Y3Y4Y5WY6PY7Y8Y9Y10Y11RY12Y13Y14Y15 (SEQ
ID No. 90)
-
Dabei
kann Y1 jede Aminosäure, bevorzugt K oder R, sein.
Y2 kann jede Aminosäure sein. Y3 kann jede
Aminosäure,
bevorzugt F oder Y sein. Y4 kann jede Aminosäure, bevorzugt
F, I oder V sein. Y5 kann jede Aminosäure sein.
Y6 kann jede Aminosäure, bevorzugt S oder C sein.
Y7 kann jede Aminosäure, bevorzugt S, E oder D,
sein. Y8 kann jede Aminosäure sein.
Y9 kann jede Aminosäure, bevorzugt S oder A sein.
Y10 kann jede Aminosäure sein. Y11 kann
jede Aminosäure,
bevorzugt I, V oder M sein. Y12 kann jede
Aminosäure
sein. Y13 kann jede Aminosäure, bevorzugt
I, V oder M sein. Y14 kann jede Aminosäure sein.
Y15 kann jede Aminosäure, bevorzugt S oder A sein.
Auch hier sind die Aminosäuren
im Einbuchstabencode angegeben.
-
Weiterhin
sind die ADFs, die zur Verwendung in einem der erfindungsgemäßen Verfahren
geeignet sind, durch folgende Konsensussequenz charakterisiert.
-
Die
Konsensussequenz III umfasst die folgende Sequenz:
RZ1Z2Z3GZ4Z5Z6EZ7Z8ATDZ9Z10Z11Z12 (SEQ
ID No. 91)
-
Z1 kann jede Aminosäure, bevorzugt E, V oder T
sein. Z2 kann jede Aminosäure, bevorzugt
L oder M sein. Z3 kann jede Aminosäure, bevorzugt
Q, E oder D sein. Z4 kann jede Aminosäure, bevorzugt
I oder V sein. Z5 kann jede Aminosäure, bevorzugt
H oder Q sein. Z6 kann jede Aminosäure sein.
Z7 kann jede Aminosäure, bevorzugt I, L, M oder
F sein. Z8 kann jede Aminosäure, bevorzugt
Q oder H sein. Z9 kann jede Aminosäure sein.
Z10 kann jede Aminosäure, bevorzugt T oder S sein.
Z11 kann jede Aminosäure, bevorzugt E oder D sein. Z12 kann jede Aminosäure, bevorzugt V, M oder I
sein. Die Aminosäuren
sind wiederum im Einbuchstabencode angegeben.
-
Die
erfindungsgemäßen ADF-Sequenzen
bzw. die ADFs, die für
die erfindungsgemäßen Verfahren verwendet
werden können,
können
die vorgenannten drei Konsensussequenzen I, II und III auch in Kombination
enthalten.
-
Die
vorliegende Erfindung bezieht sich somit auch auf Nukleinsäuresequenzen,
die u.a. für
die oben dargestellte Konsensus-Sequenz mit der SEQ ID No. 89, 90
und/oder 91 kodieren sowie deren Verwendung in den erfindungsgemäßen Verfahren
zur Herstellung von transgenen Pflanzen mit einer erhöhten Pathogenresistenz
durch Änderung
des Gehalts und/oder der Aktivität
von mindestens einem ADF.
-
Wie
bereits erwähnt,
kann die Änderung
des Gehalts und/oder der Aktivität
von ADFs bzw. ADF3 auf verschiedene Weise erfolgen. Wenn im Folgenden
auf ADFs im Allgemeinen Bezug genommen wird, schließt dies
den ADF3 aus Gerste immer mit ein. Die Erhöhung der ADF-Aktivität und des
ADF-Gehalts kann z.B. durch Ausschalten von hemmenden Regulationsmechanismen
auf Transkriptions-, Translations- und Proteinebene oder durch Erhöhung der
Genexpression einer Nukleinsäure
kodierend für
mindestens einen ADF bzw. funktionellen Homologen, Teilen oder Mutanten
davon gegenüber
dem Wildtyp erfolgen. Dies kann beispielsweise durch Induzierung
des/der jeweiligen endogenen ADF-Gen(e) oder durch Einbringen von
Nukleinsäuren kodierend
für ADFs
bzw. funktionellen Homologen, Teilen oder Mutanten davon erfolgen.
-
In
einer bevorzugten Ausführungsform
erfolgt die Erhöhung
der ADF-Aktivität
bzw. des ADF-Gehalts gegenüber
dem Wildtyp durch eine Erhöhung
der Genexpression einer Nukleinsäure
kodierend für
einen ADF. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Erhöhung der
Genexpression einer Nukleinsäure kodierend
für einen
ADF durch Einbringen von Nukleinsäuren, kodierend für mindestens
ein ADF, in die jeweilige Pflanze bzw. Pflanzenzelle. Dazu können prinzipiell
die ADF-Gene verschiedenster Organismen, also jede Nukleinsäure, die
für einen
ADF mit wesentlicher Homologie zu ADF3 aus Gerste bzw. funktionellen
Homologen, Teilen oder Mutanten davon kodiert, verwendet werden.
Bei genomischen ADF-Nukleinsäuresequenzen aus
eukaryontischen Quellen, die Introns enthalten, sind für den Fall,
dass der Wirtsorganismus nicht in der Lage ist oder nicht in die
Lage versetzt werden kann, die entsprechenden ADF-Sequenzen zu spleißen, bevorzugt
bereits prozessierte Nukleinsäuresequenzen
wie entsprechende cDNAs zu verwenden. Alle in der Beschreibung erwähnten Nukleinsäuren können z.B.
eine RNA-, DNA- oder cDNA-Sequenz
sein.
-
Bei
einem bevorzugten erfindungsgemäßen Verfahren
zur Herstellung von transgenen Pflanzen bzw. Pflanzenzellen mit
erhöhter
Pathogenresistenz wird eine Nukleinsäuresequenz, die für mindestens
einen ADF kodiert, auf eine Pflanze bzw. Pflanzenzelle übertragen.
Diese Übertragung
führt zu
einer Erhöhung
der Expression bzw. der Aktivität
an ADF im Vergleich zum Wildtyp und entsprechend zu einer Erhöhung der
Pathogenresistenz in den transgenen Pflanzen bzw. Pflanzenzellen.
Ein solches Verfahren kann verwendet werden, um die Expression von
DNA-Sequenzen, die für
ADFs oder deren funktionell äquivalente
Homologe, Teile bzw. funktionelle Mutanten kodieren, zu erhöhen und
damit die Pathogenresistenz in den transgenen Pflanzen bzw. Pflanzenzellen
ebenfalls zu erhöhen.
Die Verwendung von Vektoren, die diese Sequenzen und regulatorische Sequenzen,
wie Promotor- und Terminationssequenzen, umfassen, ist dem Fachmann
bekannt.
-
Ein
solches Verfahren umfasst erfindungsgemäß typischerweise die folgenden
Schritte:
- a) Herstellung eines Vektors umfassend
folgende Nukleinsäuresequenzen
in 5'-3'-Orientierung:
– eine in Pflanzen funktionelle
Promotersequenz,
– operativ
damit verknüpft
eine DNA-Sequenz, die für
mindestens einen ADF oder funktionell äquivalente Homologe, Teile
oder Mutanten davon kodiert,
– operativ damit verknüpft eine
in Pflanzen funktionelle Terminationssequenz
- b) Übertragung
des Vektors aus Schritt a) auf eine Pflanzenzelle und gegebenenfalls
Integration in das pflanzliche Genom.
-
Der
Fachmann weiß,
wie ein Vektor aus Schritt a) auf Pflanzenzellen übertragen
werden kann und welche Merkmale ein Vektor besitzen muss, um ins
pflanzliche Genom integriert werden zu können.
-
Ein
Beispiel für
die Überexpression
einer funktionellen Mutante eines ADFs ist die Überexpression von HvADF3-S6A (SEQ ID No. 2, siehe Beispiele). Durch
den Aminosäureaustausch
von Serin gegen Alanin kann der ADF3 nicht mehr in der Position
6 phosphoryliert werden. Dies führt
zu einer konstitutiv aktiven Form von ADF3. So führt die Überexpression dieser Mutante
sowohl zu einer Erhöhung
des Gehalts an ADF3 in den transgenen Pflanzen als auch zu einer
erhöhten
Aktivität
an ADF3.
-
Wenn
der ADF-Gehalt in transgenen Pflanzen bzw. Pflanzenzellen durch Übertragen
einer Nukleinsäure
erhöht
wird, die für
eine ADF aus einem anderen Organismus wie z.B. Dicryostelium discoideum
kodiert, dann ist es empfehlenswert, die durch die Nukleinsäuresequenz
z.B. aus Dicryostelium discoideum kodierte Aminosäuresequenz
durch Rückübersetzung
der Polypeptidsequenz gemäß dem genetischen
Code in eine Nukleinsäuresequenz
zu überführen, die
vor allem solche Codons umfasst, die aufgrund der Organismus-spezifischen
Codon-Usage häufiger
verwendet werden. Die Codon-Usage lässt sich anhand von Computerauswertungen
anderer bekannter Gene der betreffenden Organismen leicht ermitteln.
-
Unter
Erhöhung
der Genexpression bzw. der Aktivität einer Nukleinsäure kodierend
einen ADF wird erfindungsgemäß auch die
Manipulation der Expression der Organismus- und insbesondere der
Pflanzen-eigenen endogenen ADFs verstanden. Dies kann beispielsweise
durch Veränderung
der Promotor-DNA-Sequenz für
ADF kodierende Gene erreicht werden. Eine solche Veränderung,
die eine veränderte,
vorzugsweise erhöhte
Expressionsrate mindestens eines endogenen ADF-Gens zur Folge hat,
kann durch Deletion oder Insertion von DNA-Sequenzen erfolgen.
-
Eine
Veränderung
der Promotor-Sequenz von endogenen ADF-Genen führt in der Regel zu einer Veränderung
der exprimierten Menge des ADF-Gens und damit auch zu einer Änderung
der in der Zelle bzw. der Pflanzen nachweisbaren ADF-Aktivität.
-
Des
Weiteren kann eine veränderte
bzw. erhöhte
Expression mindestens eines endogenen ADF-Gens dadurch erzielt werden,
dass ein im nicht transformierten Organismus nicht vorkommendes
Regulatorprotein mit dem Promotor dieser Gene in Wechselwirkung
tritt. Solch ein Regulator kann ein chimäres Protein darstellen, welches
aus einer DNA-Binde domäne
und einer Transkriptionsaktivator-Domäne besteht, wie beispielsweise
in WO 96/06166 beschrieben.
-
Eine
weitere Möglichkeit
zur Erhöhung
der Aktivität
und des Gehalts von endogenen ADFs besteht darin, Transkriptionsfaktoren,
die in die Transkription der endogenen ADF-Gene involviert sind,
z.B. durch Überexpression
hochzuregulieren. Die Maßnahmen
zur Überexpression
von Transkriptionsfaktoren sind dem Fachmann bekannt und werden
ebenfalls im Rahmen der vorliegenden Erfindung für ADFs offenbart.
-
Darüber hinaus
kann eine Veränderung
der Aktivität
von endogenen ADFs durch gezielte Mutagenese der endogenen Genkopien
erreicht werden.
-
Eine
Veränderung
der endogenen ADFs kann ebenfalls durch Beeinflussung der post-translationalen Modifikationen
von ADFs erreicht werden. Dies kann z.B. dadurch geschehen, dass
die Aktivität
von Enzymen wie Kinasen oder Phosphatasen, die in die post-translationale
Modifikation von ADFs involviert sind, durch entsprechende Maßnahmen
wie Überexpression
oder "gene silencing" reguliert wird.
-
Die
Expression von endogenen ADFs kann auch über die Expression von Aptameren,
die spezifisch an die Promotorsequenzen von ADFs binden, reguliert
werden. Je nachdem, ob die Aptamere an stimulierende oder reprimierende
Promotorbereiche binden, wird die Menge und in diesem Fall damit
die Aktivität
an endogenem ADF erhöht.
-
Bei
den erfindungsgemäßen Verfahren
zur Herstellung von transgenen Pflanzen bzw. Pflanzenzellen mit
erhöhter
Pathogenresistenz kann die Erniedrigung des Gehalts und/oder der
Aktivität
von mindestens einem ADF durch unterschiedliche Strategien erreicht
werden. Zum Beispiel kann die Expression von mindestens einem ADF
in transgenen Pflanzen durch "Silencing" erniedrigt werden.
-
Beim
Silencing wird z.B. eine Nukleinsäure, die für mindestens einen ADF oder
Teile davon kodiert und/oder dazu komplementär ist, auf die Pflanze übertragen.
Um sicherzustellen, dass die Pflanzen für die übertragenen Nukleinsäuren transgen
sind, wird die zu übertragende
Nukleinsäure
in der Regel durch einen Vektor, wie z.B. ein Plasmid auf die Pflanze übertragen,
der in der Lage ist, sich innerhalb der Pflanzenzelle stabil zu
replizieren oder die übertragene
Nukleinsäure
in das pflanzliche Genom zu integrieren.
-
Bevorzugt
kann für
das Silencing von ADFs das RNAi-Verfahren verwendet werden. Dabei
wird z.B. ein Vektor auf die Pflanzenzelle übertragen, der in 5'-3'-Richtung die folgenden
Elemente umfasst: Einen in Pflanzen funktionsfähigen Promotor; operativ daran
gebunden eine DNA-Sequenz, die die antisense-Sequenz der für den ADF
oder Teile davon kodierenden Sequenz umfasst und an ihrem 3'-Ende vom Spleißosom erkennbare
3'-Exonsequenzen
aufweist; ein Intron; eine DNA-Sequenz, die die sense-Sequenz der
für den
ADF oder Teile davon kodierenden DNA-Sequenz umfasst und an ihrem
5'-Ende vom Spleißosom erkennbare 5'-Exon-Sequenzen aufweist;
sowie eine Terminationssequenz. Ein solcher Vektor ist in 2 dargestellt.
Die Position der antisense und sense-Sequenzen kann natürlich vertauscht
werden. Dem Fachmann ist dabei klar, dass die jeweiligen 5'- und 3'-Splice sites entsprechend
angepasst werden müssen.
-
Werden
solche Vektoren stabil auf Pflanzenzellen übertragen, entsteht bei der
Transkription dieser Vektoren zunächst eine prä-mRNA, die
aus einem ersten Exon, das die antisense-Sequenz der für den ADF oder Teile davon
kodierenden Sequenz umfasst, einem Intron und einem zweiten Exon,
das die sense-Sequenz der für
den ADF oder Teile davon kodierenden DNA-Sequenz umfasst, besteht.
Da durch den Spleiß-Vorgang
das Intron entfernt wird, entsteht ein kontinuierliches RNA-Molekül mit Bereichen,
die zueinander komplementär
sind. Ein solches RNA-Molekül
wird eine doppelsträngige
Struktur ausbilden (Smith et al., 2000, Nature, 407: 319–320).
-
Solche
doppelsträngigen
RNA-Moleküle
sind in der Lage, durch Induktion des PTGS-Systems spezifisch die mRNA von ADFs
zu silencen, so dass als Folge ADFs nicht mehr exprimiert werden.
Welche ADFs nicht mehr exprimiert werden, kann dabei durch die entsprechende
Wahl der antisense- und sense-Sequenzen bestimmt werden. Das Auffinden
von Protein-charakteristischen Sequenzen gehört dabei zum üblichen
Wissen eines Fachmanns. Der Fachmann weiß, dass eine Vielzahl von ADFs
auch durch die mehrfache Verwendung von jeweils charakteristischen
Sequenzen gesilenct werden können.
-
Ein
solches Verfahren kann z.B. folgende Schritte umfassen:
- a) Herstellung eines Vektors, umfassend folgende Nukleinsäuresequenzen
in 5'-3'-Orientierung:
– eine in Pflanzen funktionelle
Promotersequenz
– operativ
daran gebunden die identische oder homologe antisense-Sequenz der
für den
mindestens einen ADF oder Teilen davon kodierenden Sequenz, wobei
die Sequenz an ihrem 3'-Ende
vom Spleißosom
erkennbare 3'-Exon-Sequenzen
aufweist
– operativ
daran gebunden ein Intron
– operativ
daran gebunden die identische oder homologe sense-Sequenz der für den mindestens
einen ADF oder Teilen davon kodierenden Sequenz, wobei die Sequenz
an ihrem 5'-Ende
vom Spleißosom
erkennbare 5'-Exon-Sequenzen
aufweist
– operativ
daran gebunden eine in Pflanzen funktionelle Terminationssequenz
- b) Übertragen
des Vektors aus a) auf Pflanzenzellen und gegebenenfalls Integration
ins pflanzliche Genom.
-
Der
Fachmann weiß ebenfalls,
dass neben den genannten Vektoren auch andere Vektoren für das RNAi-Verfahren
bzw. PTGS eingesetzt werden können.
Solche Vektoren können
z.B. so gebaut sein, dass die sense- und antisense-Sequenzen jeweils
von einem U6-Promotor ausgehend transkribiert werden, in der Zelle hybridisieren
und das PTGS-System induzieren (Tuschl, 2002, Nat. Biotechnol. 20,
446–448;
Miyagishi et al., 2002, Nat. Biotechnol., 20, 497–500; Lee
et al., 2002, Nat. Biotechnol., 20, 500–505). Bei anderen Vektoren sind
die sense- und antisense-Sequenzen durch eine "loop"-Sequenz
verbunden und werden von einem humanen RNAse P RNA H1-Promotor transkribiert.
Durch Rückfaltung
des "loop" können die
sense- und antisense-Sequenzen hybridisieren, doppelsträngige RNA
ausbilden und das PTGS-System induzieren (Tuschl, 2002, vide supra;
Paul et al., 2002, Nat. Biotechnol., 20, 505–508; Paddison et al., 2002,
Genes Dev., 16, in press, Brummelkamp et al., 2002, Science, 296,
550–553).
Bei einer weiteren Ausführungsform
des RNAi-Verfahrens werden keine Vektoren verwendet, sondern vorsynthetisierte
doppelsträngige
RNA-Moleküle,
die über die
oben beschriebenen Sense- bzw. Antisense-Sequenzen verfügen z.B.
duch biolistische Methoden direkt in die zu transfizierenden Zelle
eingebracht.
-
In
einer weiteren Ausführungsform
umfassen die Vektoren, die zur Übertragung
der Nukleinsäuren verwendet
werden, in 5'-3'-Orientierung einen
Promotor, operativ daran gebunden eine DNA-Sequenz, die die für ADFs oder
Teile davon kodierende Sequenz umfasst und zu sich selbst komplementäre Abschnitte
enthält, sowie
eine Terminationssequenz. Bei der Transkription dieser Vektoren
in der Pflanzenzelle entstehen RNA-Moleküle, die über Sequenzbereiche verfügen, die
mit sich selbst hybridisieren können.
Dadurch können in
der Zelle doppelsträngige
RNA-Moleküle
auftreten, die das PTGS-Systems induzieren, was dann dazu führt, dass
die mRNA von ADFs spezifisch abgebaut wird. Dieses auch als Co-Suppression bezeichnete
Verfahren zum Silencing von pflanzlichen Proteinen setzt voraus,
dass die mRNA des (der) zu supprimierenden ADF(s) über Abschnitte
verfügt,
die zueinander komplementär
sind. Solche Abschnitte können
vom Fachmann durch einfache visuelle Inspektion der für das jeweilige
Protein kodierenden DNA-Sequenz oder durch entsprechende Sequenzprogramme
wie z.B. DNAStar der DNASTAR Inc., Madison, USA, identifiziert werden.
-
Ein
solches Verfahren kann z.B. die folgenden Schritte umfassen:
- a) Herstellung eines Vektors, umfassend folgende
Nukleinsäuresequenzen
in 5'-3'-Orientierung:
– eine in Pflanzen funktionelle
Promotersequenz,
– operativ
daran gebunden die identische oder homologe sense-Sequenz der für den/die
endogenen ADF(s) oder Teilen davon kodierenden Sequenz, wobei die
Sequenz über
selbst-komplementäre
Bereiche verfügt,
– operativ
daran gebunden eine ein Pflanzen funktionelle Terminationssequenz,
- b) Übertragen
des Vektors aus a) auf Pflanzenzellen und gegebenenfalls Integration
ins pflanzliche Genom.
-
Bei
einer anderen Ausführungsform
der Erfindung umfassen die zur Übertragung
der Nukleinsäuren verwendeten
Vektoren in 5'-3'-Orientierung einen
Promotor, operativ daran gebunden eine DNA-Sequenz, die die antisense-Sequenz
der für
ADFs oder Teile davon kodierenden Sequenz umfasst, sowie eine Terminationssequenz.
Bei der Transkription solcher Vektoren in Pflanzenzellen entsteht
ein RNA-Molekül,
dessen Sequenz komplementär
zu der für
ADFs oder Teilen davon kodierenden mRNA-Sequenz ist. Durch Hybridisierung
der antisense-Sequenz mit endogenen mRNA-Sequenzen von ADFs in vivo
kann daher die Expression von ADFs in Pflanzenzellen unterdrückt werden.
-
Ein
solches Verfahren kann z.B. die folgenden Schritte umfassen:
- a) Herstellung eines Vektors, umfassend folgende
Nukleinsäuresequenzen
in 5'-3'-Orientierung:
– eine in Pflanzen funktionelle
Promotersequenz,
– operativ
daran gebunden die identische oder homologe antisense-Sequenz der
für den/die
endogenen ADF(s) oder Teilen davon kodierenden Sequenz,
– operativ
daran gebunden eine ein Pflanzen funktionelle Terminationssequenz,
- b) Übertragen
des Vektors aus a) auf Pflanzenzellen und gegebenenfalls Integration
ins pflanzliche Genom.
-
Bei
einer anderen Ausführungsform
des erfindungsgemäßen Verfahrens
werden zur Übertragung
der Nukleinsäuren
auf die Pflanzenzellen Vektoren verwendet, die in 5'-3'-Orientierung einen in Pflanzen funktionsfähigen Promotor,
operativ daran gebunden eine DNA-Sequenz, die für ein Ribozym kodiert, das
spezifisch die mRNA von mindestens einem ADF erkennt, sowie eine
Terminationssequenz umfassen. Dem Fachmann ist bekannt, wie Ribozyme,
die eine gegen eine bestimmte mRNA gerichtete Endonuklease-Aktivität besitzen, hergestellt
werden können.
Im Detail ist dies z.B. in Steinecke et al. beschrieben (1992, EMBO
J., 11: 1525). Im Rahmen dieser Erfindung sind mit dem Begriff "Ribozymen" auch solche RNA-Sequenzen
gemeint, die neben dem eigentlichen Ribozym noch Führungssequenzen
umfassen, die zu der mRNA der ADFs oder Teilen davon komplementär sind und
so das mRNA-spezifische Ribozym noch gezielter zum mRNA-Substrat
des Ribozyms führen.
-
Ein
solches Verfahren umfasst z.B. die folgenden Schritte:
- a) Herstellung eines Vektors, umfassend folgende Nukleinsäuresequenzen:
– eine in
Pflanzen funktionelle Promotersequenz,
– operativ daran gebunden eine
DNA-Sequenz, die für
ein Ribozym kodiert, das spezifisch die mRNA des/der endogenen ADF(s)
erkennt,
– operativ
daran gebunden eine ein Pflanzen funktionelle Terminationssequenz,
- b) Übertragen
des Vektors aus a) auf Pflanzenzellen und gegebenenfalls Integration
ins pflanzliche Genom.
-
Eine
weitere Alternative zur Herstellung von transgenen Pflanzen mit
erhöhter
Pathogenresistenz bietet die Übertragung
von Nukleinsäuren
durch Vektoren, die in 5'-3'-Orientierung einen in Pflanzen funktionsfähigen Promotor,
operativ daran gebunden eine DNA-Sequenz, die antisense-Sequenzen
der für
ADFs oder Teile davon kodierenden Sequenzen sowie die für RNAse
P kodierende Sequenz umfasst, sowie eine Terminationssequenz umfassen.
Bei der Transkription solcher Vektoren entstehen in der Zelle RNA-Moleküle, die über eine
Führungssequenz
(die antisense-Sequenz) verfügen,
welche die RNAse P zur mRNA der ADFs führt, wodurch die Spaltung der
mRNA durch RNAse P bewirkt wird (US-Patent Nr. 5,168,053). Vorzugsweise umfasst
die Führungssequenz
10 bis 15 Nukleotide, die zur DNA-Sequenz der ADFs komplementär sind,
und eine 3'-NCCA
Nukleotidsequenz, wobei N vorzugsweise ein Purin ist. Die Transkripte
der externen Führungssequenz
binden an die Ziel-mRNA über
die Ausbildung von Basenpaaren, was die Spaltung der mRNA durch die
RNAase P am Nukleotid 5' von
der gepaarten Region ermöglicht.
Eine solche gespaltene mRNA kann nicht in ein funktionsfähiges Protein
translatiert werden.
-
Ein
solches Verfahren kann z.B. die folgenden Schritte umfassen:
- a) Herstellung eines Vektors, umfassend folgende
Nukleinsäuresequenzen
in 5'-3'-Orientierung:
– eine in Pflanzen funktionelle
Promotersequenz,
– eine
operativ daran gebundene DNA-Sequenz, die zu der für die mRNA
des/der endogenen ADF(s) oder Teilen davon kodierenden Sequenz komplementär ist,
– operativ
daran gebunden eine DNA-Sequenz, die für Ribonuklease P kodiert,
– operativ
daran gebunden eine ein Pflanzen funktionelle Terminationssequenz,
- b) Übertragen
des Vektors aus a) auf Pflanzenzellen und gegebenenfalls Integration
ins pflanzliche Genom.
-
Darüber hinaus
können
zur erfindungsgemäßen Herstellung
von transgenen Pflanzen mit einer erhöhten Pathogenresistenz auch
Vektoren verwendet werden, die eine DNA-Sequenz enthalten, die in
5'-3'-Orientierung die
folgenden Bestandteile aufweist: Eine DNA-Sequenz, die dem 5'-Bereich der für einen
ADF kodierenden DNA-Sequenz entspricht, eine DNA-Sequenz für Resistenzgene, sowie eine
DNA-Sequenz, die dem 3'-Bereich
der für
einen ADF kodierenden Sequenz entspricht. Solche Vektoren können verwendet
werden, um über
homologe Rekombination einen spezifischen Gen-knock-out des interessierenden
ADF's herbeizuführen. Bei
Pflanzenzellen, in denen die homologe Rekombination stattgefunden
hat, wird in die DNA, die für
den ADF kodiert, die Sequenz für
das Resistenzgen inseriert, so dass keine funktionelle mRNA des
ADF's mehr in der Zelle
hergestellt werden kann. Durch Selektion gegen das Resistenzgen
können
die Pflanzenzellen, in denen die Rekombination stattgefunden hat,
identifiziert werden. Wie solche Vektoren zum Gen-Knock-out durch
homologe Rekombination im Einzelnen zu konstruieren sind, welche
Elemente sie umfassen müssen
(Promotoren, Enhancer, flankierende Sequenzen) und wie die Pflanzenzellen
des Knock-outs identifiziert werden, ist dem Fachmann bekannt. Als
Resistenzgene werden typischerweise Antibiotika-Resistenzgene verwendet. Andere
Resistenzgene, die eine Selektion der Zellen, in denen die Rekombination
stattgefunden hat, erlauben, können
natürlich
auch verwendet werden.
-
Ein
solches Verfahren kann z.B. folgende Schritte umfassen:
- a) Herstellung eines Vektors, umfassend folgende Nukleinsäuresequenzen
in 5'-3'-Orientierung:
– eine in Pflanzen funktionelle
Promotersequenz,
– operativ
daran gebunden eine DNA-Sequenz, die identisch oder homolog zu der
für das
5'-Ende des/der endogenen
ADF(s) kodierenden Sequenz(en) ist,
– operativ daran gebunden eine
DNA-Sequenz, die für
ein Resistenzgen kodiert,
– operativ
daran gebunden eine DNA-Sequenz, die identisch oder homolog zu der
für das
3'-Ende des/der endogenen
ADF(s) kodierenden Sequenz(en) ist,
– operativ daran gebunden eine
in Pflanzen funktionelle Terminationssequenz,
- b) Übertragen
des Vektors aus a) auf Pflanzenzellen und Integration ins pflanzliche
Genom.
-
Wenn
im Rahmen der vorliegenden Erfindung von Nukleinsäure-Sequenzen
gesprochen wird, die für ADFs
oder Teile davon kodieren, dann sind damit sowohl die komplette
kodierende DNA-Sequenz der ADFs als auch die komplette mRNA-Sequenz
bzw. die jeweiligen Teilbereiche gemeint. Da einige der oben erwähnten Verfahren
zur Herstellung von transgenen Pflanzen, in denen die Expression
von ADFs signifikant reduziert ist, darauf beruhen, dass eine spezifische
Hybridisierung zwischen der endogenen mRNA von ADFs und den Sequenzen,
die bei der Transkription der oben erwähnten Vektoren entstehen, stattfindet
(wie z.B. der antisense-Strategie), weiß der Fachmann, dass die übertragenen
Nukleinsäuren
nicht immer die gesamte für
die ADFs kodierende Sequenz, unabhängig ob es sich um die sense-
oder antisense-Sequenz handelt, enthalten müssen. Vielmehr können für eine spezifische
Hybridisierung bereits relativ kurze Bereiche der für ADFs kodierenden
Sequenzen ausreichend für
ein effizientes Silencing sein.
-
Bei
Vektoren, deren Transkription zu doppelsträngigen RNA-Molekülen führt, reicht
es aus, wenn die Sequenzen, die den Sequenzbereichen der mRNA von
ADFs entsprechen, letztendlich zu doppelsträngigen RNA-Molekülen mit
ca. 25 Nukleotiden, bevorzugt 21, 22 oder 23 Nukleotiden Länge führen. Die
bei der Antisense-Strategie übertragenen
Sequenzen umfassen in der Regel zwischen 20-1000 Nukleotide, bevorzugt zwischen
20-750 Nukleotide, besonders bevorzugt um die 400-800 und 500-750
Nukleotide. Es können
aber auch Sequenzen verwendet werden, die zwischen 20-500 Nukleotide,
zwischen 20-300 Nukleotide, zwischen 20-150 Nukleotide und zwischen
20-100 oder 20-50 Nukleotide umfassen.
-
Der
Fachmann weiß,
dass beim RNAi bzw. PTGS die zur Ausbildung von doppelsträngigen RNA-Molekülen verwendeten
sense- und antisense RNAs auch um die 21, 22 oder 23 Nukleotide
mit einem charakteristischen 3'-Überhang
umfassen können
(Tuschl, 2002, Nat. Biotechnol. 20, 446–448).
-
Wenn
Nukleinsäuren
auf die Pflanzenzellen übertragen
werden, deren Transkription in der Zelle zu Sequenzen führen, die
zu der mRNA von ADFs komplementär
sind (wie z.B. bei der antisense-Strategie), dann müssen diese
Sequenzen nicht hundertprozentig komplementär zu der mRNA sein. Vielmehr
reicht es aus, wenn diese Sequenzen zu mindestens 50%, bevorzugt
zu mindestens 60%, besonders bevorzugt zu mindestens 70%, weiterhin
besonders bevorzugt zu mindestens 80%, insbesondere bevorzugt zu
mindestens 90% und am meisten bevorzugt zu mindestens 95% komplementär sind.
Die Abweichungen können
dabei durch Deletion, Substitution und/oder Insertion entstanden
sein. Dem Fachmann ist natürlich
klar, dass mit abnehmender Komplementarität die Wahrscheinlichkeit steigt,
dass mehrere ADFs gesilenct werden.
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Generell
gilt, dass nur solche komplementären
Sequenzen erfindungsgemäß verwendet
werden können,
die in der Lage sind, spezifisch mit mRNA-Bereichen von ADFs zu
hybridisieren. Sequenzen, die in vivo mit RNA-Bereichen von anderen
Proteinen als ADFs hybridisieren und deren Silencing bewirken, sind
für die erfindungsgemäßen Verfahren
nicht geeignet. Je nach der gewählten
Sequenz und je nach dem Komplementaritätsgrad, wird eine Vielzahl
oder einige wenige ADFs gesilenct werden. Unter Umständen wird
nur die Expression eines ganz spezifischen ADF unterbunden. Die
Länge von
komplementären
Sequenzen beträgt
bevorzugt zwischen 20-1000 Nukeotide, ebenfalls bevorzugt zwischen
20-750 Nukleotide,
besonders bevorzugt zwischen 20-500 Nukleotide, ebenfalls besonders bevorzugt
zwischen 20-300 Nukleotide, insbesondere bevorzugt zwischen 20-150
Nukleotide, ebenfalls insbesondere bevorzugt zwischen 20-75 Nukleotide
und am meisten bevorzugt um die 20-50 Nukleotide. Unter Umständen können die
Sequenzen auch nur um die 20 oder 25 Nukleotide umfassen.
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Einige
der oben erwähnten
Verfahren können
auch mit Sequenzen durchgeführt
werden, die nicht Bestandteil des kodierenden Teils der mRNA von
ADFs sind oder dazu komplementär
sind. Es kann z.B. ausreichend sein, wenn es sich um Sequenzen aus
dem 5'- oder 3'- untranslatierten Bereich handelt, sofern
diese regulatorischen Sequenzen charakteristisch für die mRNA
des jeweiligen ADF's
sind.
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Solche
Sequenzen können
insbesondere dann eingesetzt werden, wenn das Silencing durch doppelsträngige RNA-Konstrukte
induziert wird oder die Translation einer mRNA durch antisense-Konstrukte
inhibiert wird. Daher umfasst der Begriff mRNA erfindungsgemäß nicht
nur die kodierenden Bestandteile der mRNA von ADFs, sondern auch
alle regulatorischen Sequenzen, die in der prä-mRNA oder reifen mRNA auftreten
und die für
die mRNA der ADFs charakteristisch sind. Dies gilt entsprechend
auch für
die DNA-Sequenz. Dabei kann es sich z.B. um 5'- und 3'- untranslatierte Bereiche handeln,
um Promotorsequenzen, um upstream activating sequences, um Introns
etc.
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Wenn
Vektoren verwendet werden, deren Transkription zu RNA-Molekülen führt, die
aus einer Führungssequenz
und RNAse P bestehen, dann muss die Führungssequenz ausreichend komplementär sein,
um spezifisch den ADF zu erkennen. Welcher Bereich der mRNA des
ADF's durch die
Führungssequenz
erkannt wird, kann gemäß den jeweiligen
Erfordernissen gewählt
werden. Bevorzugt umfassen solche Führungssequenzen um die 20 Nukleotide,
sie sollten jedoch nicht wesentlich kürzer als 15 Nukleotide sein.
Bei einer 100%-igen Komplementarität der Führungssequenz sollten auch
12 Nukleotide ausreichend sein.
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Selbstverständlich können die
Führungssequenzen
bis zu 100 Nukleotide oder mehr umfassen, da dadurch lediglich ihre
Spezifität
für die
jeweilige mRNA erhöht
wird.
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Wenn
im Rahmen der vorliegenden Erfindung von sense-Sequenzen gesprochen
wird, dann sind damit diejenigen Sequenzen gemeint, die dem kodierenden
Strang der Gene für
ADFs entsprechen oder Teile davon umfassen. Solche Sequenzen müssen jedoch
nicht zu 100% identisch mit den für die interessierenden ADFs
kodierenden Sequenzen sein. Es genügt, wenn die Sequenzen zu den
für ADFs
kodierenden Sequenzen derart ausreichend ähnlich sind, dass ihre Expression
in pflanzlichen Zellen zu einem effizienten und spezifischen Silencing
der ADFs in der Zelle z.B. durch RNA interference oder Co-Suppression
führt.
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Es
sollte ausreichen, wenn diese Sequenzen zu mindestens 50% identisch
sind, bevorzugt zu mindestens 60%, besonders bevorzugt zu mindestens
70%, weiterhin besonders bevorzugt zu mindestens 80%, insbesondere
bevorzugt zu mindestens 90% und am meisten bevorzugt zu mindestens
95% identisch sind. Bei solchen Identitätsgraden wird erfindungsgemäß davon
gesprochen, dass die Sequenzen zueinander homolog sind bzw. eine
Homologie aufweisen (siehe oben). Die Abweichungen zu den für die ADFs
oder Teilen davon kodierenden Sequenzen können dabei durch Deletion,
Addition, Substitution und/oder Insertion entstanden sein. Dem Fachmann
ist natürlich
klar, dass mit abnehmender Identität die Wahrscheinlichkeit steigt,
dass mehrere ADFs gesilenct werden. Sequenzen, deren Identitäts- bzw.
Homologiegrad so gering ist, dass andere Proteine als ADFs gesilenct
werden, sind für
die erfindungsgemäßen Verfahren
nicht ausreichend spezifisch und nicht geeignet.
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Wenn
entsprechend von antisense-Sequenzen gesprochen wird, dann sind
erfindungsgemäß diejenigen
Sequenzen gemeint, die dem nicht kodierenden DNA-Strang der Gene
der interessierenden ADFs entsprechen. Auch diese Sequenzen müssen natürlich nicht
hundertprozentig identisch mit der Sequenz des nicht-kodierenden
DNA-Strangs der Genen der jeweiligen interessierenden ADFs sein,
sondern können
die oben genannten Homologiegrade aufweisen. Dieser Sachverhalt
kommt auch in dem Umstand zum Ausdruck, dass antisense-Sequenzen,
die definitionsgemäß zu der
mRNA eines Gens komplementär
sind, nicht zu 100% komplementär
zu dieser mRNA sein müssen.
Sie können
z.B. auch zu mindestens 50% komplementär, bevorzugt zu mindestens
60% komplementär,
besonders bevorzugt zu mindestens 70% komplementär, weiterhin besonders bevorzugt
zu mindestens 80% komplementär,
insbesondere bevorzugt zu mindestens 90% komplementär und am
meisten bevorzugt zu mindestens 95%, 98% und/oder 100% komplementär sein.
Wie oben ausgeführt,
ist es ausreichend, wenn die antisense-Sequenzen in der Lage sind,
spezifisch mit der jeweiligen interessierenden mRNA von ADFs zu
hybridisieren. Die Hybridisierung kann entweder in vivo unter zellulären Bedingungen
oder in vitro stattfinden.
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Die
Hybridisierung einer antisense-Sequenz mit einer endogenen mRNA-Sequenz
findet typischerweise in vivo unter zellulären Bedingungen oder in vitro
statt.
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Die
Begriffe "sense" und "antisense" sind darüber hinaus
dem Fachmann bekannt. Der mit dem Silencing von Genen in Pflanzen
vertraute Fachmann weiß entsprechend
aus dem Stand der Technik auch, wie groß die zum Silencing verwendeten
Nukleinsäuremoleküle sein
müssen
und welche Homologie bzw. Komplementarität sie zu den jeweils interessierenden
Sequenzen aufweisen müssen.
Erfindungsgemäß können antisense-Sequenzen,
die z.B. in vivo und/oder in vitro nicht spezifisch mit kodierenden
sense-Sequenzen von ADFs hybridisieren können, d.h. auch mit den kodierenden
sense-Sequenzen von anderen Protein-Klassen hybridisieren, nicht verwendet
werden.
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Prinzipiell
kann die antisense-Strategie mit einem Ribozym-Verfahren gekoppelt
werden. Ribozyme sind katalytisch aktive RNA Sequenzen, die, gekoppelt
an die antisense-Sequenzen,
die Zielsequenzen katalytisch spalten (Tanner et al., (1999) FEMS
Microbiol Rev. 23 (3), 257–75).
Dies kann die Effizienz einer antisense-Strategie erhöhen.
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Weitere
Methoden zur Reduzierung der Expression von ADFs insbesondere in
Pflanzen als Organismen umfassen die zur Kosuppression führende Überexpression
homologer ADF-Nukleinsäuresequenzen (Jorgensen
et al., (1996) Plant Mol. Biol. 31 (5), 957–973) oder die Induktion des
spezifischen RNA-Abbaus durch die Pflanze mit Hilfe eines viralen
Expressionssystems (Amplikon) (Angell et al., (1999) Plant J. 20
(3), 357–362).
Diese Methoden werden auch als "post-transcriptional
gene silencing" (PTGS)
bezeichnet (siehe oben).
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Weitere
Methoden sind die Einführung
von Nonsense-Mutationen in das endogene Gen mittels Einführung von
RNA/DNA-Oligonukleotiden in die Pflanze (Zhu et al., (2000) Nat.
Biotechnol. 18 (5), 555–558) oder
die Generierung von Knockout-Mutanten mit Hilfe von z.B. T-DNA-Mutagenese
(Koncz et al., (1992) Plant Mol. Biol. 20 (5) 963–976) oder
homologer Rekombination (Hohn et al., (1999) Proc. Natl. Acad. Sci.
USA. 96, 8321–8323.).
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Ferner
ist eine Genrepression (aber auch die Genüberexpression) auch mit spezifischen
DNA-bindenden Faktoren
z.B. Faktoren vom Typus der Zinkfingertranskriptionsfaktoren möglich. Ferner
können
Faktoren in eine Zelle eingebracht werden, die das Zielprotein selber
inhibieren. Die proteinbindenden Faktoren können z.B. Aptamere sein (Famulok
et al., (1999) Curr Top Microbiol Immunol. 243, 123–36).
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Die
Reduktion kann auch durch Aptamere erfolgen. Aptamere können auch
so entworfen werden, dass sie spezifisch an die ADF-Proteine binden
und durch z.B. Bindung an das katalytische Zentrum der ADFs die
Aktivität
der ADFs reduzieren. Die Expression von Aptameren erfolgt üblicherweise
durch Vektor-basierte Überexpression
und ist dem Fachmann ebenso wie der Entwurf und die Selektion von
Aptameren wohl bekannt (Famulok et l1., (1999) Curr Top Microbiol
Immunol., 243, 123–36).
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Eine
gute Übersicht
zu einigen der oben beschriebenen Verfahren findet sich in z.B.
Waterhouse et al., (2001), Nature 411, 834–842; Tuschl (2002), Nat. Biotechnol.
20, 446–448
und weiteren Publikationen in dieser Ausgabe, Paddison et al., (2002),
Genes Dev., 16, 948–958;
Brummelkamp et al., (2002), Science 296, 550–553).
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Als
weitere proteinbindende Faktoren, deren Expression in Pflanzen eine
Reduktion des Gehalts und/oder der Aktivität an ADFs bewirkt, kommen ADF-spezifische
Antikörper
in Frage. Die Herstellung von monoklonalen, polyklonalen oder rekombinanten
ADF-spezifischen
Antikörpern
folgt Standard-Protokollen (Guide to Protein Purification, Meth.
Enzymol. 182, pp. 663–679
(1990), M. P. Deutscher, ed.). Die Expression von Antikörpern ist
ebenfalls aus der Literatur bekannt (Fiedler et al., (1997) Immunotechnology
3, 205–216;
Maynard and Georgiou (2000) Annu. Rev. Biomed. Eng. 2, 339–76). Dieser
Ansatz ist weiter unten ausführlich
dargestellt.
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Ein
weiteres erfindungsgemäßes Verfahren
zur Herstellung von transgenen Pflanzen mit erhöhter Pathogenresistenz sieht
vor, dass die Aktivität
an endogenen ADFs dadurch verringert wird, dass in der Pflanze bzw.
in den Pflanzenzellen nicht-funktionelle Mutanten von ADFs exprimiert
werden. Durch Einführung
solcher nicht-funktioneller Mutanten, bei denen es sich bevorzugt
um dominant-negative Mutanten handelt, wird die Interaktion der
endogenen ADFs mit ihren zellulären
Bindungspartnern inhibiert. Durch Einführung von nicht-funktionellen
Mutationen in die endogenen ADFs können erfindungsgemäß ebenfalls
Pflanzen und Pflanzenzellen hergestellt werden, die über eine
erhöhte
Pathogenresistenz verfügen.
Unter nicht-funktionellen Mutanten werden erfindungsgemäß Formen
von ADFs verstanden, die über
Mutationen verfügen,
die verhindern, dass die ADFs mit G-Actin, F-Actin, Komponenten des Pathogens und/oder
mit anderen physiologischen Bindungspartnern interagieren.
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Wenn
solche dominant-negativen Mutanten in der transgenen Zelle bzw.
Pflanze exprimiert bzw. überexprimiert
werden, sind sie in der Lage, die Interaktion der Pathogenkomponenten
mit Wildtyp-ADFs bzw. die Interaktion von Wildtyp-ADFs mit den anderen
physiologischen Faktoren, wie z.B. Actin, auszukompetitieren, so
dass das Pathogen keine Möglichkeit
zur Propagation hat. Überraschend
bei diesem Verfahren ist, dass dadurch transgene Pflanzen hergestellt
werden können,
die über
eine erhöhte
Pathogenresistenz verfügen und
gleichzeitig einen im Wesentlichen normalen Phänotyp aufweisen, obwohl solche
dominant-negativen Mutanten das endogene Cytoskelett der Pflanzenzelle
beeinflussen sollten.
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Der
Fachmann ist sich darüber
bewusst, dass erfindungsgemäße transgene
Pflanzen und Pflanzenzellen nicht nur durch Expression bzw. Überexpression
dominant-negativer Mutanten von ADFs aus Pflanzen wie ADF3 hergestellt
werden können,
sondern selbstverständlich
auch durch Expression bzw. Überexpression von
dominant-negativen Mutanten von ADFs aus anderen Organismen. Dabei
kommen ADFs aus Eukaryoten wie Hefen (z.B. S. cerevisiae), C. elegans
oder höheren
Säugetieren
wie Maus, Ratte und Mensch in Frage. Voraussetzung ist, dass die
Expression dieser dominant-negativen Mutanten eine Kompetition der
endogenen pflanzlichen ADFs mit Pathogenkomponenten und/oder deren
zellulären
Interaktionspartnern bewirkt. Die ADFs aus anderen Organismen können durch
die oben beschriebenen Datenbankanalysen und Homologie-Vergleiche
identifiziert werden. Voraussetzung ist, dass sie über eine
Region bzw. Regionen verfügen,
die zu den oben genannten Konsensus-Sequenzen homolog ist.
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Transgene
Pflanzen, die dominant-negative Mutanten von ADFs exprimieren, können hergestellt
werden, indem ein entsprechender Expressionsvektor auf Pflanzenzellen übertragen
wird.
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Ein
solches Verfahren kann z.B. die folgenden Schritte umfassen:
- a) Herstellung eines Vektors, umfassend folgende
Nukleinsäuresequenzen
in 5'-3'-Orientierung:
– eine in Pflanzen funktionelle
Promotersequenz,
– operativ
daran gebunden eine DNA-Sequenz, die für eine dominant-negative Mutante
eines pflanzlichen ADFs, kodiert
– operativ daran gebunden eine
in Pflanzen funktionelle Terminationssequenz,
- b) Übertragen
des Vektors aus a) auf die Pflanzenzellen und gegebenenfalls Integration
ins pflanzliche Genom.
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Nicht-funktionelle
Mutationen, bei denen es sich um dominant-negative Mutanten von
ADFs handelt, kann der Fachmann durch einfaches routiniertes Experimentieren
identifizieren. Zum einen sind, wie bereits oben erwähnt, eine
Reihe von Mutationen z.B. aus dem ADF3 von Mais bekannt, die die
Interaktion mit F-Actin bzw. G-Actin inhibieren. Bei diesen handelt
es sich um Mutationen, bei denen die Thyrosinreste in den Positionen
67 und 70 von ADF3 aus Mais durch Phenylalanin ersetzt werden. Durch
so genannte Sequenz-Alignments können
die für
die Thyrosine 67 und 70 äquivalenten
Positionen z.B. in ADF3 aus Gerste bzw. anderen ADFs bestimmt werden
und auf diese Weise ähnlich
Mutationen hergestellt werden. Beim ADF3 aus Gerste handelt es sich
z.B. um die Positionen Phenylalanin-66 und Phenylalanin-69. Diese
können
z.B. durch Alanin ersetzt werden.
-
Mutationen,
die die Interaktion von ADFs mit G-Actin, F-Actin, anderen physiologischen
Bindungspartnern und/oder Pathogenkomponenten unterbinden, können durch
Herstellen von rekombinanten ADF-Proteinen, die unterschiedliche
Mutation und/oder Deletion tragen, und Testen dieser rekombinanten
Proteine in Bindungsassays mit den vorgenannten Komponenten in einfacher
Weise ermittelt werden.
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Auf
gleiche Weise kann z.B. in in vitro-Bindungstests getestet werden,
ob dominant-negative Mutanten von ADF-Proteinen und bevorzugt von
ADF3 aus Gerste in der Lage sind, die Interaktion der ADF mit G-Actin, F-Actin,
anderen zellulären
Bindungspartnern und/oder Pathogenkomponenten zu kompetitieren.
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Unter "dominant-negativen
Mutationen" werden
alle Mutationsarten verstanden, d.h. Insertion, Deletion und Punktmutation,
die in der Lage sind, die Interaktion von ADFs mit G-Actin, F-Actin,
anderen zellulären Bindungspartnern
und/oder Pathogenkomponenten zu unterbinden.
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Bei
dem erfindungsgemäßen Verfahren
zum Herstellen von transgenen Pflanzen mit erhöhter Pathogenresistenz durch
Expression von dominant-negativen Mutanten von ADFs findet eine
Modulation des Grades an Interaktion zwischen den endogenen ADFs
mit ihren Bindungspartnern und kein Silencing der Wirtsfaktoren
statt, was den zusätzlichen
Vorteil bringt, dass dieser Mechanismus keinen direkten Angriffspunkt
für Pathogen-kodierte
Suppressoren bietet.
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Dem
Fachmann ist bekannt, wie Punktmutation(en), Insertionsmutation(en)
oder Deletionsmutation(en) in die für ADFs kodierende Nukleinsäuresequenzen
eingeführt
werden können.
PCR-Techniken können z.B.
zur Einführung
von Punktmutationen bevorzugt sein ("PCR technology: Principle and Applications
for DNA Amplification",
H. Ehrlich, id, Stockton Press). Beispiele zur Einführung von
Punktmutationen in für
ADF3 kodierende DNA-Sequenzen
finden sich zudem in den Ausführungsbeispielen.
-
Transgene
Pflanzen bzw. Pflanzenzellen, die eine erhöhte Pathogenresistenz aufweisen,
können
erfindungsgemäß auch derart
hergestellt werden, dass z.B. ein rekombinanter Antikörper, der
spezifisch die Interaktion von ADFs (und bevorzugt ADF3 aus Gerste),
mit G-Actin, F-Actin, anderen zellulären Bindungspartnern und/oder
Pathogenkomponenten blockiert bzw. kompetitiert, in den Pflanzen
exprimiert wird.
-
Wie
solche rekombinanten Antikörper
gegen z.B. eine spezifische Domäne
von ADFs isoliert und identifiziert werden können, ist dem Fachmann bekannt
und kann der Literatur entnommen werden (Harlow et al., 1999, Using
antibodies: a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press).
-
Unter
rekombinanten Antikörpern
werden erfindungsgemäß die bekannten
unterschiedlichen Formen von rekombinanten Antikörpern verstanden, wie sie z.B.
in Skerra et al. (Curr. Opin. Immunol. (1993) 2, 250–262) beschrieben
wurden. Die erfindungsgemäßen rekombinanten
Antikörper
umfassen dabei die so genannten Fab-Fragmente, Fv-Fragmente, scFv-Antikörper, scFv-Homodimere,
die über
Disulfid-Brücken
miteinander verknüpft
sind und so genannte VH-Ketten. Die Fab-Fragmente bestehen aus assemblierten
vollständigen
leichten und verkürzten
schweren Ketten, wohingegen Fv-Fragmente aus nicht-kovalent miteinander verknüpften VH-
und VL-Ketten bestehen. Ein Überblick über die
genannten Fragmente und rekombinanten Antikörper findet sich in Conrad
et al. (Plant Mol. Biol. (1998) 38, 101–109). Die genannten Fab- und
Fv-Fragmente können
in vivo miteinander assoziieren.
-
Da
dieser Prozess unter Umständen
jedoch nicht sehr effizient abläuft,
werden erfindungsgemäß bevorzugt
scFv-Antikörper
eingesetzt. Diese bestehen aus dem variablen Anteil der leichten
Kette und dem variablen Anteil der schweren Kette, die über ein
flexibles Linkerpeptid miteinander fusioniert sind. Die Herstellung
solcher scFv-Antikörper
ist im Stand der Technik intensiv beschrieben worden (siehe u.a.
Conrad et al., vide supra; Breitling et al. (1999) Recombinant Antibodies,
John Wiley & Sons,
New York). Die scFv-Antikörper weisen
die gleiche Antigen-Spezifität
und Aktivität
wie normale Antikörper
auf, müssen
aber nicht wie andere natürliche
oder rekombinante Antikörper
in vivo aus Einzelketten assembliert werden. Sie eignen sich deshalb insbesondere
für die
erfindungsgemäßen Verfahren.
-
In
den oben angegebenen Referenzen wird ausführlich dargestellt, wie Nukleinsäuresequenzen,
die für
die erfindungsgemäß bevorzugten
scFv-Antikörper
kodieren, durch den Fachmann isoliert und hergestellt werden können.
-
Üblicherweise
wird dabei von bestehenden Hybridoma-Zelllinien ausgegangen, die
monoklonale Antikörper
produzieren. Danach werden die für
die leichte und schwere Ketten des Antikörpers kodierenden cDNAs isoliert
und in einem zweiten Schritt die kodierenden Regionen für die variable
Region der leichten und der schweren Kette in einem Molekül miteinander
fusioniert.
-
Ein
weiterer, dem Fachmann bekannter Weg zur Erzeugung rekombinanter
Antikörper
ist das Screening von Bibliotheken rekombinanter Antikörper (so
genannte "phage
display libraries",
siehe auch Hoogenboom et al. (2000) Immunology Today 21, 371–378; Winter
et al. (1994) Annu. Rev. Immunol. 12, 433–455; De Wildt et al. (2000)
Nat. Biotechnol. 18, 989–994).
Durch dem Fachmann bekannte Vorgehensweisen können bei diesem Verfahren rekombinante
Antikörper
gegen ein gegebenes Antigen angereichert, selektiert und isoliert
werden.
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Ein
Verfahren zur Expression von Antikörpern gegen ADFs kann z.B.
die folgenden Schritte umfassen:
- a) Herstellung
eines Vektors, umfassend folgende Nukleinsäuresequenzen in 5'-3'-Orientierung:
– eine in Pflanzen funktionelle
Promotersequenz,
– operativ
daran gebunden eine DNA-Sequenz, die für einen rekombinanten Antikörper kodiert,
der für
die endogene(n) ADF(s) spezifisch ist und/oder die Interaktionen
mit physiologischen Bindungspartnern, bevorzugt G-Actin und/oder
F-Actin, blockiert,
– operativ
daran gebunden eine in Pflanzen funktionelle Terminationssequenz,
- b) Übertragen
des Vektors aus a) auf die Pflanzenzellen und gegebenenfalls Integration
ins pflanzliche Genom.
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Ein
weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft Pflanzenzellen
und Pflanzen, in denen die endogenen Gene von ADFs Mutationen, d.h.
Substitutionen, Insertionen und/oder Deletionen aufweisen, die dazu
führen,
dass die exprimierten endogenen ADFs nicht mehr oder nur bedingt
in der Lage sind, mit Pathogenfaktoren und/oder ihren endogenen
zellulären
Bindungspartnern zu interagieren. Pflanzen bzw. Pflanzenzellen,
die solche Mutationen aufweisenden, endogenen Genkopien für ADFs besitzen,
werden sich, wie die oben beschriebenen transgenen Pflanzen und
Pflanzenzellen, durch eine erhöhte
transiente oder permanente Pathogenresistenz gegenüber den
oben genannten Virusgruppen und Stämmen auszeichnen. Solche Pflanzen
und Pflanzenzellen, die im Gegensatz zu den oben genannten Pflanzen
und Pflanzenzellen nicht transgen sind, können durch klassische Mutagenese
hergestellt werden.
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Erfindungsgemäß müssen solche
nicht-transgenen Pflanzen oder Pflanzenzellen aber in den für endogene
ADFs kodierenden Genen die oben genannten Mutationsarten aufweisen,
die zu einer Modulation der Expression der endogenen ADFs und/oder
des Bindungsverhaltens der endogenen ADFs führen. Modulation der Expression
der endogenen ADFs kann z.B. bedeuten, dass durch Mutationen in
regulatorischen DNA-Elementen der Gene der endogenen ADFs, wie z.B.
Promotor, Enhancern oder allgemein so genannten "upstream activating sequences", die Expression
der endogenen ADFs herunterreguliert wird.
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Die
Modulation des Bindungsverhaltens von ADFs bedeutet im Rahmen der
vorliegenden Erfindung, dass die oben genannten Mutationsarten zu
einer Veränderung
des Bindungsverhaltens der endogenen ADFs gegenüber den pathogenen Faktoren
und/oder den normalen zellulären
Bindungspartnern führen.
Bevorzugt ist eine Modulation des Bindungsverhaltens der endogenen
ADFs, die dazu führt,
dass diese nicht mehr oder nur bedingt mit Pathogenfaktoren und/oder
ihren zellulären
Partnern interagieren. Auch eine Kombination der Modulation der
Expression und des Bindungsverhalten der endogenen ADFs ist denkbar.
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Zum
Beispiel können
Pflanzen oder Pflanzenzellen Mutationen in den Gensequenzen für endogene ADFs
aufweisen, die zur Reduktion der Expression dieser Proteine führen. Andere
Pflanzen oder Pflanzenzellen weisen Mutationen auf, die zu den oben
beschriebenen dominant-negativen Mutanten führen. In beiden Fällen werden
Pflanzen mit einer erhöhten
Pathogenresistenz erhalten.
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Der
Fachmann ist sich bewusst, dass durch Mutagenese z.B. auch Pflanzen
bzw. Pflanzenzellen hergestellt werden können, die aufgrund von Mutationen
in Enhancer- und/oder Promotor-Sequenzen der Gene für endogene
ADFs eine Reduktion der Expression dieser Proteine aufweisen und
gleichzeitig Mutationen in den kodierenden Bereichen der für endogene
ADFs kodierenden Gene aufweisen, die bewirken, dass die verbleibenden
exprimierten ADFs nicht mehr oder nur begrenzt mit den pathogenen
und/oder anderen zellulären Bindungspartnern
interagieren können.
Umgekehrt können
entsprechende Mutationen in Enhancer- und/oder Promotor-Sequenzen
und in den kodierenden Sequenzen bewirken, dass eine oben dargestellte
dominant-negative Mutante von endogenen ADFs, die nicht mehr oder
nur sehr begrenzt in der Lage ist, mit pathogenen und/oder normalen
zellulären
Interaktionspartnern wechselzuwirken, überexprimiert wird und es somit
zur oben beschriebenen Kompetitionsreaktion kommt.
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Diese
Pflanzen zeichnen sich durch eine erhöhte transiente oder permanente
Pathogenresistenz gegenüber
den oben genannten Pathogenen aus.
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Bevorzugt
können
die erfindungsgemäßen nicht-transgenen
Pflanzen und Pflanzenzellen, die sich durch eine Modulation der
Expression und/oder des Bindungsverhaltens der endogenen ADFs auszeichnen und
eine permanente oder transiente Pathogenresistenz besitzen, durch
den so genannten "TILLING"-Ansatz (Targeting
Induced Local Lesion in Genomes) hergestellt werden. Dieses Verfahren
ist im Detail in Colbert et al. (2001, Plant Physiology, 126, 480–484), McCallum
et al. (2000, Nat. Biotechnol., 18, 455–457) und McCallum et al. (2000,
Plant Physiology, 123, 439–442)
beschrieben worden. Die vorgenannten Referenzen werden hier explizit
als Offenbarung hinsichtlich der "TILLING"-Methode eingeführt.
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Das
TILLING-Verfahren ist eine Strategie der so genannten reversen Genetik,
das die Produktion hoher Dichten von Punktmutationen in mutagenisierten
Pflanzenkollektionen, z.B. durch chemische Mutagenese mit Ethylmethansulphonat
(EMS), mit der schnellen systematischen Identifizierung von Mutationen
in Zielsequenzen kombiniert. Zunächst
wird die Zielsequenz über
PCR in DNA-Pools mutagenisierter M2-Populationen amplifiziert. Denaturierungs-
und Annealingsreaktionen der heteroallelischen PCR-Produkte erlauben
die Ausbildung von Heteroduplexen, bei denen ein DNA-Strang von
dem mutierten und der andere vom „Wildtyp" PCR-Produkt stammt. An der Stelle der
Punktmutation erfolgt ein sogenannter Mismatch, der entweder über denaturierende
HPLC (DHPLC, McCallum et al., 2000, Plant Physiol., 123, 439–442) oder
mit dem CelI Mismatch-Detektionssystem (Oleykowsky et al., 1998,
Nucl. Acids Res. 26, 4597–4602)
identifiziert werden kann. CelI ist eine Endonuklease, die Mismatche
in Heteroduplex-DNA erkennt und spezifisch an diesen Stellen die DNA
spaltet. Die Spaltungsprodukte können
dann über
automatisierte Sequenzierungs-Gelelektrophorese aufgetrennt und
detektiert werden (Colbert et al., 2001, vide supra). Nach Identifizierung
von Zielgen-spezifischen Mutationen in einem Pool werden individuelle
DNA-Proben entsprechend analysiert, um die Pflanze mit der Mutation
zu isolieren. Auf diese Weise wird bei den erfindungsgemäßen Pflanzen
und Pflanzenzellen nach der Herstellung der mutagenisierten Pfanzenpopulationen
durch Verwendung gegen ADF3 bzw ADFs gerichtete Primersequenzen
die Identifizierung der mutagenisierten Pflanzenzellen bzw. Pflanzen
durchgeführt.
Das TILLING-Verfahren ist generell für alle Pflanzen anwend bar und
daher sind die oben genannten Kultur- und Nutzpflanzen für das erfindungsgemäße Verfahren
geeignet.
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Die
Vektoren, die zur Expression bzw. zum Silencing von ADFs verwendet
werden, umfassen neben der zu übertragenden
Nukleinsäuresequenz
weitere regulatorische Elemente. Welche konkreten regulatorischen
Elemente diese Vektoren enthalten müssen, hängt dabei jeweils von der Methode
ab, die mit diesen Vektoren durchgeführt werden sollen. Über welche
regulatorischen Elemente und auch anderen Elemente diese Vektoren
verfügen
müssen,
ist dem Fachmann, der mit den verschiedenen oben erwähnten Verfahren
zum Herstellen von transgenen Pflanzen, in denen die Expression
eines Proteins unterbunden wird, vertraut ist, bekannt.
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Der
Begriff "operativ
verknüpft" bedeutet, dass die
Sequenzen, die die unterschiedlichen verwendeten Nukleinsäuresequenzen
miteinander verknüpfen,
so ausgewählt
sind, dass die Funktion des jeweiligen verknüpften Nukleinsäuresegments
erhalten bleibt. Sollen z.B. die kodierenden Sequenzen von ADF3
in einer Zelle exprimiert werden, ist darauf zu achten, dass sich
zwischen der Sequenz für
den Promotor und der kodierenden Sequenz für ADF3 keine Sequenzen befinden,
die zu einer Beendigung der Transkription führen würden.
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Typischerweise
handelt es sich bei den regulatorischen Elementen, die die Vektoren
enthalten, um solche, die die Transkription und, falls erwünscht, Translation
in der Pflanzenzelle gewährleisten.
Solche Elemente können
aber auch eine gezielte Lokalisierung der Proteine in bestimmten
Zelltypen bzw. Zellorganellen bewirken. Dies kann z.B. durch Verwendung
von Epidermiszellen-spezifischen Promotoren geschehen.
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So
können
die zu übertragenden
Nukleinsäuresequenzen
beispielsweise unter Kontrolle von in Pflanzen funktionellen Promotoren
stehen. Bei diesen Promotoren kann es sich um konstitutive, aber
auch induzierbare oder gewebe- bzw. entwicklungsspezifische Promotoren
handeln. Darüber
hinaus kann es sich auch um pilzspezifische Promotoren handeln.
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Typischerweise
wird man als Promotor für
Vektoren den konstitutiven 35S-Promotor verwenden. Darüber hinaus
können
natürlich
auch weitere Promotoren verwendet werden, die aus unterschiedlichen
Quellen wie z.B. aus Pflanzen oder Pflanzenviren erhalten werden
und für
die Expression von Genen in Pflanzen geeignet sind. Die Auswahl
des Promotors wie auch anderer regulatorischer Sequenzen bestimmen
dabei das räumliche
und zeitliche Expressionsmuster und damit auch die Expresson bzw.
das Silencing der ADFs in transgenen Pflanzen.
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Neben
weiteren konstitutiven Promotoren wie beispielsweise dem Actin Promotor
(McElroy et al., 1990, Plant Cell, 2: 163) und dem Ubiquitin Promotor
(Binet et al., 1991, Plant Science, 79: 87) kommen als gewebespezifische
Promotoren die Promotoren der Phosphoenolpyruvat-Carboxylase aus Mais (Hudspeth et al.,
1989, Plant Mol. Biol., 12: 579) oder der Fructose-1,6-bisphosphatase aus
Kartoffel (WO 98/18940), die blattspezifische Expression vermitteln,
in Frage. Es können
auch Verwundungs-, Licht- oder Pathogen-induzierte sowie andere
entwicklungsabhängige
Promotoren oder Kontrollsequenzen verwendet werden (Xu et al., 1993,
Plant Mol. Biol. 22: 573; Logemann et al., 1989, Plant Cell, 1:
151; Stockhaus et al., 1989, Plant Cell, 1: 805; Puente et al.,
1996, EMBO J., 15: 3732; Gough et al., 1995, Mol. Gen. Genet., 247:
323). Eine Zusammenfassung von verwendbaren Kontrollsequenzen findet
sich z.B. in Zuo et al., 2000, Curr. Opin. Biotech., 11: 146.
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Geeignete
Promotoren umfassen auch Promotoren, die eine Expression lediglich
in photo-synthetisch aktiven
Geweben garantieren, wie z.B. der ST-LS1-Promotor (Stockhaus et
al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 7943–7947; Stockhaus et al. (1989)
EMBO J. 8: 2445–2451).
Ebenfalls verwendet werden können Promotoren,
die während
der Pflanzentransformation, der Pflanzenregeneration oder bestimmten
Stadien dieser Prozesse aktiv sind, wie z.B. zellteilungsspezifische
Promotoren wie der Histon H3-Promotor (Kapros et al. (1993) InVitro
Cell Cev. Biol. Plant 29: 27–32)
oder das chemisch induzierbare Tet-Repressor-System (Gatz et al.
(1991) Mol. Gen. Genet. 227: 229–237). Weitere geeignete Promotoren
können
der Literatur, z.B. Ward (1993, Plant Mol. Biol. 22: 361–366), entnommen
werden. Gleiches gilt für
induzierbare und zell- bzw. gewebespezifische Promotoren, wie Meristem-spezifische
Promotoren, die ebenfalls in der Literatur beschrieben worden sind
und im Rahmen der Erfindung ebenfalls geeignet sind.
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Weitere
induzierbare Promotoren umfassen virusinduzierbare Promotoren wie
den ACMV virion-sense Promotor (Hong et al., 1996, Virology, 220:
119–227),
der durch das Genprodukt AC2 induziert wird. Darüber hinaus sind alle Promotoren
solcher Proteine geeignet, die in Virus-befallenem Gewebe induziert
werden, wie z.B. Phenylalanin Ammonium Lyase, Chalcone Synthase,
Hydroxyprolin-reiches Glykoprotein, Extensin, Pathogenese-verwandte
Proteine (z.B. PR-1a) und Wund-induzierbare Protease-Inhibitoren
(
US 6,013,864 ).
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Darüber hinaus
ist der Durchschnittsfachmann in der Lage, mittels Routinemethoden
weitere geeignete Promotoren zu isolieren. So kann der Fachmann
mit Hilfe gängiger
molekularbiologischer Methoden, z.B. Hybridisierungsexperimenten
oder DNA-Protein-Bindungsstudien, Speicherorgan-spezifische regulatorische Nukleinsäurelemente
identifizieren. Dabei wird z.B. in einem ersten Schritt aus Speicherorgangewebe
des gewünschten
Organismus, aus dem die regulatorischen Sequenzen isoliert werden
sollen, die gesamte poly(A)+-RNA isoliert
und eine cDNA-Bank angelegt. In einem zweiten Schritt werden mit
Hilfe von cDNA-Klonen, die auf poly(A)+-RNA-Molekülen aus
einem Nicht-Speicherorgangewebe basieren, aus der ersten Bank mittels Hybridisierung
diejenigen Klone identifiziert, deren korrespondierende poly(A)+-RNA-Moleküle lediglich im Gewebe des
Speicherorgans akkumulieren. Anschließend werden mit Hilfe dieser
so identifizierten cDNAs Promotoren isoliert, die über Speicherorgan-spezifische
regulatorische Elemente verfügen.
Dem Fachmann stehen darüber hinaus
weitere auf PCR basierende Methoden für die Isolierung geeigneter
Speicherorgan-spezifischer
Promotoren zur Verfügung.
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In
einer weiteren Ausführungsform
handelt es sich um den Promotor des Klasse I Patatin-Gens B33 aus Kartoffel.
Weiterhin bevorzugte Promotoren sind solche, die insbesondere in
Früchten
aktiv sind. Hierzu zählen
beispielsweise der Promotor eines Polygalacturonase-Gens, z.B. aus Tomate,
der während
der Reife von Tomatenfrüchten
Expression vermittelt (Nicholass et al. (1995) Plant Mol. Biol.
28: 423–435;
dieser Stand der Technik beschreibt die Analyse von Promotor/GUS-Fusionskonstrukten),
der Promotor einer ACC-Oxidase, z.B. aus Apfel, der in transgenen
Tomaten Reife- und Fruchtspezifität vermittelt (Atkinson et al.
(1998) Plant Mol. Biol. 38: 449–460;
dieser Stand der Technik offenbart ebenfalls Promotor/GUS-Expressionsanalysen), oder
der 2A11-Promotor aus Tomate (van Haaren et al. (1991) Plant Mol.
Biol. 17: 615–630,
beschreibt ebenfalls Promotor/GUS-Fusionen).
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Auch
im Fall von Frucht-spezifischen Promotoren kann der Fachmann weitere
geeignete Promotoren der Literatur entnehmen oder, wie oben für Speicherorgan-spezifische
Promotoren beschrieben, mittels Routineverfahren isolieren.
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Der
Fachmann weiß,
dass die Verwendung von induzierbaren Promotoren die Herstellung
von Pflanzen und Pflanzenzellen erlaubt, die die erfindungsgemäßen Sequenzen
nur transient exprimieren bzw. transient silencen. Eine solche transiente
Expression erlaubt die Herstellung von Pflanzen, die nur eine transiente Pathogenresistenz
zeigen. Solch eine transiente Resistenz kann z.B. dann wünschenswert
sein, wenn die Gefahr einer Pathogenkontamination droht und die
Pflanzen deswegen nur für
einen bestimmten Zeitraum resistent gegen das Pathogen sein müssen. Weitere
Situationen, in denen eine transiente Resistenz wünschenswert
ist, sind dem Fachmann bekannt. Dem Fachmann ist darüber hinaus
auch bekannt, dass er durch die Verwendung nicht stabil in Pflanzenzellen
replizierender Vektoren, die die ent sprechenden Sequenzen zur Expression
zum Silencing von ADFs tragen, eine transiente Epxression bzw. ein
transientes Silencing und eine transiente Resistenz erzielen kann.
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Auch
sonst kann durch wahl eines entsprechenden Vektors sichergestellt
sein, dass die Transfektion der transgenen Pflanzen nur transient
erfolgt. Welche Vektoren für
eine transiente Transfektion geeignet sind und welche Vektoren für eine stabile
Transfektion verwendet werden müssen,
ist dem Fachmann bekannt.
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Die
erfindungsgemäßen Vektoren
können
als regulatorische Elemente auch noch z.B. Enhancer-Elemente umfassen,
ferner können
sie Resistenzgene, Replikationssignale und weitere DNA-Bereiche
enthalten, die eine Propagation der Vektoren in Bakterien wie z.B.
E. coli ermöglichen.
Die regulatorischen Elemente umfassen auch Sequenzen, die eine Stabilisierung
der Vektoren in den Wirtszellen bewirken. Insbesondere umfassen
solche regulatorischen Elemente Sequenzen, die eine stabile Integration
des Vektors in das Wirtsgenom der Pflanze oder eine autonome Replikation
des Vektors in den Pflanzenzellen ermöglichen. Solche regulatorischen
Elemente sind dem Fachmann bekannt.
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Bei
den so genannten Terminationssequenzen handelt es sich um Sequenzen,
die sicherstellen, dass die Transkription bzw. die Translation ordnungsgemäß beendet
wird. Sollen die übertragenen
Nukleinsäuren translatiert
werden, handelt es sich bei ihnen typischerweise um Stopcodons und
entsprechende regulatorische Sequenzen; sollen die übertragenen
Nukleinsäuren
nur transkribiert werden, handelt es sich in der Regel um poly-A-Sequenzen.
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Erfindungsgemäß sind mit
Vektoren Plasmide, Cosmide, Viren und andere in der Gentechnik gängige Vektoren
gemeint, mit denen Nukleinsäuremoleküle auf Pflanzen
bzw. Pflanzenzellen übertragen
werden können.
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Zur
Vorbereitung der Einführung
fremder Gene in höhere
Pflanzen bzw. deren Zellen stehen eine große Anzahl von Klonierungsvektoren
zur Verfügung,
die ein Replikationssignal für
E. coli und ein Markergen zur Selektion transformierter Bakterienzellen
enthalten. Beispiele für
derartige Vektoren sind pBR322, pUC-Serien, M13mp-Serien, pACYC184
usw. Die gewünschte
Sequenz kann an einer passenden Restriktionsschnittstelle in den
Vektor eingeführt
werden. Das erhaltende Plasmid wird für die Transformation von E.
coli-Zellen verwendet. Transformierte E. coli-Zellen werden in einem
geeigneten Medium gezüchtet
und anschließend
geerntet und lysiert. Das Plasmid wird wiedergewonnen. Als Analysemethode
zur Charakterisierung der gewonnenen Plasmid-DNA werden im Allgemeinen
Restriktionsanalysen, Gelelektrophoresen und weitere biochemisch-molekularbiologische
Methoden eingesetzt. Nach jeder Manipulation können die Plasmid-DNA gespalten
und gewonnene DNA-Fragmente mit anderen DNA-Sequenzen verknüpft werden.
Jede Plasmid-DNA-Sequenz
kann in den gleichen oder anderen Plasmiden kloniert werden. Klonierungsstandardverfahren
können Sambrook
et al., 2001 (Molecular cloning: A laboratory manual, 3rd edition,
Cold Spring Harbor Laboratory Press) entnommen werden.
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Für die Einführung von
DNA in eine pflanzliche Wirtszelle stehen eine Vielzahl bekannter
Techniken zur Verfügung,
wobei der Fachmann die jeweils geeignete Methode ohne Schwierigkeiten
ermitteln kann. Diese Techniken umfassen die Transformation pflanzlicher
Zellen mit T-DNA unter Verwendung von Agrobacterium tumefaciens
oder Agrobacterium rhizogenes als Transformationsmittel, die Fusion
von Protoplasten, den direkten Gentransfer isolierter DNA in Protoplasten,
die Elektroporation von DNA, die Einbringung von DNA mittels der
biolistischen Methode sowie weitere Möglichkeiten. Dabei können sowohl
stabile als auch transiente Transformanten erzeugt werden.
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Bei
der Injektion und Elektroporation von DNA in Pflanzenzellen werden
per se keine speziellen Anforderungen an die verwendeten Plasmide
gestellt. Ähnliches
gilt für
den direkten Gentransfer. Es können
einfache Plasmide wie beispielsweise pUC-Derivate verwendet werden.
Sollen aber aus derartig transformierten Zellen ganze Pflanzen regeneriert
werden, ist die Anwesenheit eines selektierbaren Markergens notwendig. Dem
Fachmann sind die gängigen
Selektionsmarker bekannt und es stellt für ihn kein Problem dar, einen
geeigneten Marker auszuwählen.
Gebräuchliche
Seklektionsmarker sind solche, die den transformierten Pflanzenzellen
Resistenz gegenüber
einem Biozid oder einem Antibiotikum wie Kanamycin, G418, Ampicillin,
Bleomycin, Hygromycin, Methotrexat, Glyphosat, Streptomycin, Sulfonyl-Harnstoff, Gentamycin
oder Phosphinotricin und dergleichen vermitteln.
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Je
nach Einführungsmethode
gewünschter
Gene in die Pflanzenzelle können
weitere DNA-Sequenzen
erforderlich sein. Werden beispielsweise für die Transformation der Pflanzenzelle
das Ti- oder Ri-Plasmid verwendet, so muss mindestens die rechte
Begrenzung, häufig
jedoch die rechte und linke Begrenzung der im Ti- und Ri-Plasmid
enthaltenen T-DNA als Flankenbereich mit den einzuführenden
Genen verbunden werden.
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Werden
für die
Transformationen Agrobakterien verwendet, muss die einzuführende DNA
in spezielle Plasmide kloniert werden, und zwar entweder in einen
intermediären
oder in einem binären
Vektor. Die intermediären
Vektoren können
aufgrund von Sequenzen, die homolog zu Sequenzen in der T-DNA sind,
durch homologe Rekombination in das Ti- oder Ri-Plasmid der Agrobakterien
integriert werden. Dieses enthält
außerdem
die für
den Transfer der T-DNA notwendige vir-Region. Intermediäre Vektoren
können
nicht in Agrobakterien replizieren. Mittels eines Helferplasmids
kann der intermediäre
Vektor auf Agrobakterium tumefaciens übertragen werden (Konjugation).
Binäre
Vektoren können
sowohl in E. coli als auch in Agrobakterien replizieren. Sie enthalten
ein Selektionsmarker-Gen und einen Linker oder Polylinker, welche
von der rechten und linken T-DNA-Grenzregion eingerahmt werden.
Sie können
direkt in die Agrobakterien transformiert werden (Holsters et al.
(1978), Molecular and General Genetics 163, 181–187). Das als Wirtszelle dienende
Agrobakterium soll ein Plasmid, das eine vir-Region trägt, enthalten.
Die vir-Region ist für
den Transfer der T-DNA in die Pflanzenzelle notwendig. Zusätzlich kann
T-DNA vorhanden sein. Das derartig transformierte Agrobakterium
wird zur Transformation von Pflanzenzellen verwendet.
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Die
Verwendung von T-DNA für
die Transformation von Pflanzenzelle ist intensiv untersucht und
ausreichend in
EP 120 515 beschrieben
worden.
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Für den Transfer
der DNA in die Pflanzenzelle können
Pflanzen-Explantate zweckmäßigerweise
mit Agrobacterium tumefaciens oder Agrobacterium rhizogenes kultiviert
werden. Aus dem infizierten Pflanzenmaterial (beispielsweise Blattstücke, Stengelsegmente,
Wurzeln, aber auch Protoplasten oder Suspensions-kultivierte Pflanzenzellen)
können
dann in einem geeignetem Medium, welches Antibiotika oder Biozide
zur Selektion transformierter Zellen enthalten kann, wieder ganze
Pflanzen regeneriert werden. Die Regeneration der Pflanzen erfolgt
nach üblichen
Regenerationsmethoden unter Verwendung bekannter Nährmedien.
Die so erhaltenen Pflanzen bzw. Pflanzenzellen können dann auf Anwesenheit der
eingeführten
DNA untersucht werden.
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Andere
Möglichkeiten
der Einführung
fremder DNA unter Verwendung des biolistischen Verfahrens oder durch
Protoplasten-Transformation sind dem Fachmann bekannt (vgl. L. Willmitzer
(1993) Transgenic Plants in: Biotechnology, A Multi-Volume Comprehensive
Treatise (Herausgeber: H.J. Rehm et al.), Band 2, 627–659, VCH
Weinheim, Deutschland).
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Während die
Transformation dikotyler Pflanzen bzw. derer Zellen über Ti-Plasmid-Vektorsysteme
mit Hilfe von Agrobakterium tumefaciens wohl etabliert ist, weisen
neuere Arbeiten darauf hin, dass auch monokotyle Pflanzen bzw. deren
Zellen der Transformation mittels auf Agrobakterien basierender
Vektoren sehr wohl zugänglich
sind (siehe u.a. Chan et al. (1993), Plant Mol. Biol. 22, 491–506).
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Alternative
Systeme zur Transformation von monokotylen Pflanzen bzw. deren Zellen
sind die Transformation mittels des biolistischen Ansatzes (Wan
und Lemaux (1994) Plant Physiol. 104, 37–48; Vasil et al. (1993) Bio/Technology
11, 1553–1558;
Ritala et al. (1994) Plant Mol. Biol. 24, 317–325; Spencer et al. (1990), Theor.
Appl. Genet. 79, 625–631),
die Protoplasten-Transformation, die Elektroporation von partiell
permeabilisierten Zellen sowie die Einbringung von DNA mittels Glasfasern.
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Die
transformierten Zellen wachsen innerhalb der Pflanze in der üblichen
Weise (siehe auch McCormick et al. (1986), Plant Cell Reports 5,
81–84).
Die resultierenden Pflanzen können
normal angezogen werden und mit Pflanzen, die die gleiche transformierte
Erbanlage oder andere Erbanlagen besitzen, gekreuzt werden. Die
daraus entstehenden hybriden Individuen besitzen die entsprechenden
phänotypischen
Eigenschaften.
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Es
sollten zwei oder mehrere Generationen angezogen werden, um sicherzustellen,
dass das phänotypische
Merkmal stabil beibehalten und vererbt wird. Auch sollten Samen
geerntet werden, um sicherzustellen, dass der entsprechende Phänotyp oder
andere Eigenarten erhalten geblieben sind.
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Ebenso
können
nach üblichen
Methoden transgene Linien bestimmt werden, die für die neuen Nukleinsäuremoleküle homozygot
sind und ihr phänotypisches
Verhalten hinsichtlich einer vorhandenen bzw. nicht vorhandenen
Pathogen-Responsivität
untersucht und mit dem von hemizygoten Linien verglichen werden.
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Selbstverständlich können Pflanzenzellen,
die die erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle enthalten,
auch als Pflanzenzellen (einschließlich Protoplasten, Kalli,
Suspensionskulturen und dergleichen) weiterkultiviert werden.
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Die
oben dargestellten Vektoren können
auf Pflanzenzellen auf verschiedene Weise übertragen werden. Ob die Vektoren
in linearer oder zirkulärer
Form vorliegen müssen,
hängt von
der jeweiligen Anwendung ab. Dem Fachmann ist bekannt, ob und wann
er entsprechende linearisierte Vektoren verwenden kann oder nicht.
Zum Beispiel weiß der
Fachmann, dass zur Herstellung von spezifischen Knock-outs von Genen
für ADFs
durch homologe Rekombination es ausreichen kann, die entsprechenden
Vektoren zu linearisieren und in transgene Pflanzen zu injizieren.
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Erfindungsgemäß umfasst
der Begriff transgene Pflanze sowohl die Pflanze in ihrer Gesamtheit,
als auch alle Pflanzenteile, in denen erfindungsgemäß die Expression
und/oder Aktivität
von ADFs verändert
ist. Bei solchen Pflanzenteilen kann es sich um Pflanzenzellen handeln,
um Pflanzensamen, um Blätter,
um Blüten und
um Pollen. Mit "transgener
Pflanze" sind erfindungsgemäß auch das
Vermehrungsmaterial von erfindungsgemäßen transgenen Pflanzen gemeint
wie z.B. Samen, Früchte,
Stecklinge, Knollen, Wurzelstücke etc.,
wobei dieses Vermehrungsmaterial ggf. oben beschriebene transgene
Pflanzenzellen enthält,
sowie Teile dieser Pflanzen wie Protoplasten, Pflanzenzellen und
Kalli.
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Bei
der Herstellung von transgenen Pflanzen bieten sich verschiedene
Methoden und Möglichkeiten an,
wie bereits oben ausgeführt
worden ist. Generell können
Pflanzen bzw. Pflanzenzellen mit Hilfe herkömmlicher gentechnologischer
Transformationsmethoden derart modifiziert werden, dass die neuen
Nukleinsäuremoleküle in das
pflanzliche Genom integriert werden, d.h. dass stabile Transformanten
erzeugt werden und die überführten Nukleinsäuremoleküle mit dem
pflanzlichen Genom repliziert werden. Je nach dem verwendeten Vektorsystem
können
erfindungsgemäß auch transgene
Pflanzen hergestellt werden, bei denen die zu übertragenden Nukleinsäuren in
der Pflanzenzelle bzw. der Pflanze als selbstständig replizierendes System enthalten
sind. Die zur Übertragung
der Pflanzen verwendeten Vektoren müssen dann entsprechend über DNA-Sequenzen
verfügen,
die die Replikation von zur Übertragung
verwendeten Plasmiden innerhalb der Zelle ermöglichen.
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Bei
den für
das erfindungsgemäße Verfahren
verwendeten Pflanzen kann es sich im Prinzip um jede beliebige Pflanze
handeln. Vorzugsweise ist es eine monokotyle oder dikotyle Nutz-,
Nahrungs- oder Futterpflanze. Beispiele für monokotyle Pflanzen sind
Pflanzen, die zu den Gattungen Avena (Hafer), Triticum (Weizen),
Secale (Roggen), Hordeum (Gerste), Oryza (Reis), Panicum, Pennisetum,
Setaria, Sorghum (Hirse), Zea (Mais) und dergleichen gehören.
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Dikotyle
Nutzpflanzen umfassen unter anderem Baumwolle, Leguminosen wie Hülsenfrüchte und
insbesondere Alfalfa, Sojabohne, Raps, Tomate, Zuckerrübe, Kartoffel,
Zierpflanzen sowie Bäume.
Weitere Nutzpflanzen können
Obst (insbesondere Äpfel,
Birnen, Kirschen, Weintrauben, Citrus, Ananas und Bananen), Kürbis, Gurke,
Wein, Ölpalmen,
Tee-, Kakao- und
Kaffeesträucher,
Tabak, Sisal sowie bei Heilpflanzen Rauwolfia und Digitalis umfassen.
Besonders bevorzugt sind die Getreide Weizen, Roggen, Hafer, Gerste,
Reis, Mais und Hirse, Zuckerrübe,
Raps, Soja, Tomate, Kartoffel und Tabak. Weitere Nutzpflanzen können dem US-Patent
US 6,137,030 entnommen werden.
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Bevorzugte
Pflanzen sind Getreide, Alfalfa, Hafer, Gerste, Roggen, Weizen,
Triticale, Hirse, Reis, Luzerne, Flachs, Baumwolle, Hanf und Brassicacaeen
wie beispielsweise Raps oder Canola.
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Solche
transgenen Pflanzen, deren Vermehrungsgut, sowie deren Pflanzenzellen,
-gewebe oder -teile sind ein weiterer Gegenstand der vorliegenden
Erfindung.
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Die
Erfindung betrifft somit ebenfalls Ernteprodukte und Vermehrungsmaterial
transgener Pflanzen, die nach einem erfindungsgemäßen Verfahren
hergestellt wurden und eine erhöhte
Pathogenresistenz aufweisen. Bei den Ernteprodukten und dem Vermehrungsmaterial
handelt es sich insbesondere um Früchte, Samen, Blüten, Knollen,
Wurzelstöcke,
Sämlinge,
Steck linge, etc. Es kann sich auch um Teile dieser Pflanzen wie
Pflanzenzellen, Protoplasten und Kalli handeln.
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Die
vorliegende Erfindung betrifft auch die Verwendung der vorgenannten
Nukleinsäuresequenzen
zur Herstellung von transgenen Pflanzen bzw. Pflanzenzellen mit
einer erhöhten
Pathogenresistenz im Sinne der vorliegenden Erfindung.
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Durch
die vorliegende Erfindung ist es erstmals gelungen, neben Ror1 und
Ror2 mit ADF3 ein weiteres Gen in der Gerste zu identifizieren,
das in die durch mlo-vermittelte Resistenz involviert ist. Darüber hinaus konnte
im Rahmen der vorliegenden Erfindung, wie aus den im Folgenden dargestellten
Experimenten hervorgeht, gezeigt werden, dass durch die Erhöhung oder
Erniedrigung der Expression bzw. der Aktivität von ADF3 in Gerste resistente
Gerstepflanzen erhalten werden, die über eine Rasse-unspezifische
Resistenz gegenüber verschiedenen
Isolaten des Pflanzenpathogens Blumeria graminis f. sp. hordei verfügen.
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Solche
transgenen Pflanzen weisen gegenüber
anderen resistenten Pflanzen den Vorteil auf, dass sie nicht nur
gegenüber
einigen spezifischen Mehltauisolaten resistent sind, sondern gegenüber einer
Vielzahl der genannten Mehltauisolate, und diese Resistenz auch
nicht auf einzelne Gerste-Kultivare beschränkt ist.
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Daher
betrifft eine besonders bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden
Erfindung transgene Gerstepflanzen bzw. -zellen mit einer erhöhten Resistenz
gegenüber
Blumeria graminis f. sp. hordei, bei denen der Gehalt und/oder die
Aktivität
von ADF3 aus Gerste mit der SEQ ID No. 1 gegenüber dem Wildtyp verändert ist.
Ebenso betreffen besonders bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden
Erfindung Verfahren zur Herstellung von transgenen Gerstepflanzen
bzw. der entsprechenden Zellen, die eine erhöhte Resistenz gegenüber Blumeria
graminis f. sp. hordei aufweisen, bei denen der Gehalt und/oder
die Aktivität
an ADF3 mit der SEQ ID No. 1 gegenüber dem Wildtyp verändert ist.
Ebenso betrifft eine besonders bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden
Erfindung die isolierte Nukleinsäuresequenz,
die für
ADF3 aus der Gerste mit der SEQ ID No. 1 kodiert sowie funktionell äquivalente
Teile und funktionelle oder nicht-funktionelle Mutanten davon. Dasselbe
gilt für
Nukleinsäuresequenzen,
die zu den besonders bevorzugten zuletzt genannten Nukleinsäuresequenzen
im Wesentlichen komplementär
sind und unter stringenten Bedingungen an diese hybridisieren.
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Da
das Mlo-Gen bisher in allen untersuchten Landpflanzen identifiziert
wurde und somit auch in anderen Organismen als Gerste wie z.B. Arabidopsis
thaliana sowie in anderen Gramineae-Arten wie z.B. Weizen, Hafer,
Mais, Roggen, Reis, Panicum, Pennisetum, Setaria, Sorghum, Mais
und dergleichen auftritt, kann davon ausgegangen werden, dass der
ADF3 aus Gerste als Prototyp für
die entsprechenden homologen ADFs aus anderen Pflanzen bei der Herstellung
von transgenen Pflanzen bzw. Pflanzenzellen mit einer erhöhten Pathogenresistenz
fungiert. Bei der jeweiligen Pathogenresistenz kann es sich dabei
bevorzugt um eine Resistenz gegen formae speciales von Blumeria
graminis handeln, da dieser Parasitismus auch z.B. bei Weizen, Hafer
und Roggen auftritt. Darüber
hinaus kann die Verwendung von ADFs zur Herstellung von transgenen Pflanzen
bzw. Pflanzenzellen mit erhöhter
Pathogenresistenz auch auf solche Pathogene ausgedehnt werden, die
eine funktionelle Interaktion mit dem Actin-Cytoskelett eingehen
müssen,
um eine effiziente Infektion zu etablieren.
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Die
erfindungsgemäßen transgenen
Pflanzen und Pflanzenzellen können
eine permanente oder transiente Pathogenresistenz aufweisen. Die
Art der Resistent hängt
von den verwendeten Vektoren und angewandten Selektionsmechanismen
ab.
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Besonders
bevorzugt sind transgene Pflanzen mit einer erhöhten Pathogenresistenz, die
ausgewählt sind
aus der Gruppe enthaltend Weizen, Gerste, Hafer, Reis, Panicum,
Pennisetum, Setaria, Sorghum, Mais und dergleichen.
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Besonders
bevorzugt sind die oben genannten Pflanzen resistent gegen die verschiedenen
formae speciales des Mehltauerregers Blumeria graminis, wie z.B.
die Isolate Blumeria graminis f. sp. hordei, Blumeria graminis f.
sp. tritici, Blumeria graminis f. sp. avenae.
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Die
Identifizierung von ADF3 aus Gerste als ein Faktor, der eine Rasse-unspezifische
Resistenz gegen verschiedene Isolate von Blumeria graminis f. sp.
hordei vermittelt, wird nun im Folgenden dargestellt. Darüber hinaus
werden Experimente dargestellt, die die Verwendung von ADF3 zur
Herstellung von transgenen Pflanzen bzw. Pflanzenzellen mit erhöhter Resistenz
gegen Blumeria graminis f. sp. hordei belegen. Diese Experimente
dienen lediglich der Illustrierung der allgemeinen Aspekte der vorliegenden
Erfindung und sind in keiner Weise ausschließend zu deuten.
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Experimente
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1. Identifizierung von
ADF3 aus Gerste
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Die
Identifizierung von Faktoren, die in den durch mlo-vermittelten
Rasse-unspezifischen Resistenz-Mechanismus in Gerste verwickelt
sind, ist üblicherweise
anhand von Mutations-Screeningverfahren durchgeführt worden
(Freialdenhoven et al., vide supra). Dabei wird von Gerstekultivaren
ausgegangen, die über
mlo-Allele verfügen
und resistent gegen Isolate von Blumeria graminis f. sp. hordei
sind. Die Identifizierung von Faktoren, die mit dem Mlo-Locus interagieren,
erfolgt dadurch, dass auf Pflanzen selektioniert wird, die nach
der Mutagenese trotz eines mlo-Genotyps für eine Infektion mit Isolaten
von Blumeria graminis f. sp. hordei sensitiv sind. Der Nachteil
dieser Identifikationsmethoden liegt darin, dass sie in einem erheblichen
Ausmaß von
der Sensitivität
und der Stringenz des Screeningverfahrens zum Nachweis eines modifizierten
Infektionstyps abhängen.
Dieser Umstand sowie die Tatsache der genetischen Redundanz von
verschiedenen Gramineae-Arten kann die Erklärung dafür sein, dass es bisher nicht
gelungen ist, weitere Bestandteile des mlo-vermittelten Rasse-unspezifischen Mechanismus
zu identifizieren.
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Im
Rahmen der vorliegenden Erfindung wurde daher ein komplett anderer
Ansatz zur Identifizierung von Faktoren, die die mlo-vermittelte
Resistenz in Gerste beeinflussen, gewählt. Dazu wurde ein auf doppelsträngiger RNA
interference basierendes Screeningverfahren durchgeführt, durch
das Gene identifiziert werden sollten, die die Breitbandresistenz,
wie sie durch rezessive "Loss
of Function" mlo-Allele
vermittelt wird, beeinflussen.
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Damit
wurde im Rahmen der vorliegenden Erfindung ein Screeningverfahren
verwendet, mittels dem es möglich
ist, durch RNAi sämtliche
Allele eines Gens spezifisch auszuschalten. Dazu wurde eine cDNA-Bibliothek
verwendet, die Epidermis-spezifische cDNA aus Gerste enthielt und
von Dr. Patrick Schweizer (IPK Gatersleben, Deutschland) zur Verfügung gestellt
wurde.
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Die
Herstellung einer solchen Epidermis-spezifischen cDNA-Bibliothek
aus Gerste erfolgt dabei folgendermaßen:
Bibliothek: HO
Pflanze:
Hordeum vulgare
Sorte: Ingrid BC mlo5
Gewebe: Epidermis
wurde von 7 Tage alten Pflanzen, die mit Blumeria graminis hordei
oder tritici beimpft worden waren, 6 und 24 h nach der Beimpfung
abgezogen
kompetente Zellen: XL10_Gold von Stratagene
Vector:
pBluescript SK+
Insertionsstellen: EcoRI (5'-Ende der cDNA), XhoI (3'-Ende der cDNA)",
Selektion
der transformierten Zellen: Ampicillin
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Die
cDNA Bank wurde mit einem Kit von Stratagene erstellt (pBluescriptII
XR cDNA Library Construction Kit, Katalog Nr. 200455). Die Selektion
der transformierten Zellen erfolgte mit Ampicillin.
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Die
so isolierten cDNA-Fragmente wurden dann mittels der Gateway®-Technologie
der Firma Invitrogen in den Vektor pUAMBN kloniert. Die Verwendung
der Gateway®-Technologie
ist im Detail in Walhout et al. beschrieben (Walhout et al. (2000) "GATEWAY recombinational
cloning: Application of the cloning of large numbers of open reading
frames or ORFeomes",
in Applications of Chimeric Genes and Hybrid Proteins, San Diego:
ACADEMIC PRESS Inc., pp 575–592).
-
Die
cDNA-Fragmente wurden mittels PCR durch Gateway®-kompatible
Oligonukleotide mit folgenden Sequenzen amplifiziert:
HO-attB-For:
5'-GGG GAC AAG TTT
GTA CAA AAA AGC AGG CTG TGG ATC
CCC CGG GCT GCA GG-3'
-
Die
unterstrichene Sequenz ist für
die cDNA-Bibliothek spezifisch.
HO-attB-Rev: 5'-GGG GAC CAC TTT
GTA CAA GAA AGC TGG GTT AGG GCG
AAT TGG GTA CCG GG-3'
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Die
unterstrichene Sequenz ist für
die cDNA-Bibliothek spezifisch.
-
Anschließend wurden
diese amplifizierten PCR-Fragmente in den Vektor pDONR (Invitrogen)
durch die BP-Rekombination gemäß der Gateway®-Technologie
inseriert und anschließend
in den Vektor pUAMBN durch LR-Rekombination gemäß der Gateway®-Technologie transferiert.
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Die
Klonierung erfolgte im Detail folgendermaßen:
- 1.
Kolonie-PCR (je 50 μl
in 96er well) aus HO-Bibliothek
- 2. von diesen PCR-Reaktionen wurden je 1 μl in 4 μl BP-Gateway-Reaktion eingesetzt:
• 1 μl DNA (ca.
75 ng)
• 1 μl Vektor
pDonr201 (ca. 75 ng)
• 1 μl BP-Reaktionspuffer
• 1 μl BP-Enzym
• 1 μl H2O
Die Mirotiterplatten wurden 24 h
bei RT inkubiert; die kompletten Ansätze wurden in 50 μl chemokompetente
E.coli (DH5α)
transformiert (1 Std. 4°C;
2 Min. 42°C);
die kompletten Transformationen wurden auf LB-Kan ausplattiert
- 3. dann wurden Kolonien gepickt und in Mikrotiterplatten angezogen
und Millipore 96er Minipräparation
hergestellt. Die DNA wurde in 50 μl
aufgenommen
- 4. je 1 μl
der Minipräparationen
wurde in 4 μl
LR-Reaktion eingesetzt
• 1 μl DNA (ca.
75 ng)
• 1 μl Vektor
pUAMBN (ca. 75 ng)
• 1 μl LR-Reaktionspuffer
• 1 μl LR-Enzym
• 1 μl H2O
Die Mirotiterplatten wurden 24 h
bei RT inkubiert; die kompletten Ansätze wurden in 50 μl chemokompetente
E.coli (DH5α)
transformiert (1 Std. 4°C;
2 Min. 42°C);
die kompletten Transformationen wurden auf LB-Amp ausplattiert
- 5. dann wurden Kolonien gepickt und in Mikrotiterplatten angezogen
und Millipore 96er Minipräparation
hergestellt. Die DNA wurde in 50 μl
aufgenommen
-
Der
pUAMBN-Vektor hat einen Polyubiquitin-Promotor aus Mais, dem zwei
Gateway®-Rekombinationskassetten
in entgegengesetzter Orientierung folgen, die durch das dritte Intron
des Gerste Mla1-Resistenzgens getrennt werden (siehe 2).
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Durch
diese Anordnung des Vektors ist gewährleistet, dass sich die durch
PCR amplifizierten Fragmente in sense- und antisense-Richtung im
Vektor befinden. Da das gleiche PCR-Fragment einmal in sense- und antisense-Richtung
in den Vektor kloniert wird, entsteht nach der Transfektion des
Vektors in die Pflanzenzelle und Expression der Sequenzen ein doppelsträngiges Oligonukleotidmolekül, das in
der Lage ist, in den Pflanzen eine RNAi-Antwort auszulösen.
-
Für die biolistische
Transfektion wurde das Particle Delivery System Biolistic® PDS-1000/He
(BioRad) verwendet. Das Verfahren wurde gemäß den Herstellerangaben durchgeführt. Dazu
wurden Goldpartikel mit der entsprechenden DNA beschichtet. Zur
Beschichtung der Goldpartikel wurden typischerweise 5 μl DNA (1 μg/μl), 50 μl 2,5 M CaCl2 und 20 μl
0,1 M Spermidin auf vorpräparierte
Goldpartikel gegeben. Die Partikel wurden dann mittels einer Tischzentrifuge
pelletiert und mit 140 μl
70% Ethanol und 140 μl
100% Ethanol gewaschen. Nach erneuter Zentrifugation wurden die
beschichteten Goldpartikel in 48 bis 60 μl 100% Ethanol resuspendiert.
Anschließend
wurden die Epidermiszellen gemäß den Herstellerangaben
mit den beschichteten Partikeln beschossen.
-
Zur
Transfektion mit dem GUS-Reporterplasmid wurde der so genannte Single-Cell
Transient Expression Assay, wie er von Shirasu et al. beschrieben
wurde, verwendet (Shirasu et al. (1999), Plant J., 17, 293–299). Dazu
wurde das Reporterplasmid, das das GUS-Gen enthielt, auf Goldpartikel
beschichtet. Die Beschichtung und Bombardierung der Blätter wurde
wie oben dargestellt durchgeführt.
Die beschossenen Blätter wurden
auf 1%ige Agar-Platten, die mit 8% mM Benzimidazol versetzt waren,
transferiert und bei 18°C
für 4 Stunden
inkubiert. Anschließend
wurden die Blätter
bezüglich
GUS-Aktivität
angefärbt
und mikroskopisch untersucht.
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Das
GUS-Konstrukt ist in Nielsen et al. beschrieben (Nielsen et al.
(1999) Physiol. Mol. Plant Pathol., 54, 1–12).
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In
Experimenten, in denen die dsRNAi-Konstrukte zusammen mit den GUS-Konstrukten
transfiziert wurden, wurden die entsprechenden DNA-Konstrukte vor
der Beschichtung auf die Goldpartikel vermischt. Die Experimente
wurden dann entsprechend durchgeführt.
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Gruppen
von jeweils fünf
doppelsträngigen
RNAi (dsRNAi)-Konstrukten, die jeweils ein Gerstegen in Form von "inverted repeats" in der oben beschriebenen
Weise in pUAMBN enthielten, wurden zusammen mit einem Plasmid, das
die konstitutive Expression des Reporterproteins β-Glucuronidase
(GUS) vermittelt, in die Epidermis-Zellen von einzelnen Gersteblättern transfiziert.
-
Anschließend wurden
die transformierten Proben mit Blumeria graminis f. sp. hordei (Bgh)
96 Stunden nach der ballistischen Transfektion beimpft. 48 Stunden
nach der Beimpfung wurden die Blätter
hinsichtlich GUS-Aktivität
gefärbt
und einzelne transformierte Epidermiszellen, die mit Bgh-Sporen
beimpft worden waren, wurden mikroskopisch hinsichtlich des Penetrationserfolges
des Pilzes untersucht. Bei den Gerstekultivaren, die mit den zwei
genannten Vektoren transfiziert wurden, handelte es sich sowohl
um den Mlo-Wildtyp als auch um Mehltau-resistente mlo-Genotypen,
sowie Genotypen, die eine Rasse-spezifische Resistenz gegen bestimmte
Mehltau-Isolate verleihen (Mla1, Mla6, Mla12, Mlg).
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Es
wurden folgende Gerste-Kultivare verwendet:
Kultivar Golden
Promise (Mlo): Max Planck Institut, Köln
Kultivar I10 (Mla12)
: near isogenic to cv Ingrid
Kultivar BCPallasMla1
Kultivar
BCPallasMla6
Kultivar BCPallasMlg
Kultivar BCIngridmlo5
Kultivar
BCIngridmlo3
-
Es
wurden folgende Mehltau Isolate verwendet:
Blumeria graminis
f.sp. hordei K1
Blumeria graminis f.sp. hordei A6
Blumeria
graminis f.sp. tritici JIW2
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Bei
dieser Vorgehensweise kann ein Gen, dessen Expression durch das
dsRNAi-Konstrukt gesilenct wird, dann als Teil des Mlo-Rasse-unspezifischen
Resistenzmechanismus angesehen werden, wenn es in dem resistenten
mlo-Genotyp eine erhöhte
Sensitivität
gegenüber
dem Bgh-Erreger bewirkt, aber die Rasse-spezifische Resistenz in
den Mla1-, Mla6-, Mla12-, Mlg-Genotypen
nicht beeinflusst.
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Der
Penetrationserfolg wird dabei mikroskopisch untersucht, indem z.B.
das Ausmaß der
Haustorienbildung beobachtet wird.
-
Auf
diese Weise konnte das Gerstegen, das im Folgenden als ADF3 oder
HvADF3 benannt wird, identifiziert werden. Dieses Gerstegen wies
eine hohe Aminosäuresequenzähnlichkeit
zu den bereits früher
beschriebenen Actin-depolymerisierenden Faktoren aus Arabidopsis
thaliana und Zea mays auf. Der ADF3 aus Gerste hat die Sequenz mit
der SEQ ID No. 1. Ein Sequenz-Alignment mit anderen ADFs aus Arabidopsis
thaliana ist in 1 gezeigt.
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Es
wurden die folgenden Penetrationsraten beim Silencing der Expression
von ADF3 beobachtet. Die Daten repräsentieren Mittelwerte und Standardabweichungen
von drei von einenander unabhängigen
Versuchen:
-
2. Interaktionen von HvADF3
mit dem Actin-Cytoskelett
-
Eine
genaue Untersuchung der Auswirkungen sowohl der Überexpression als auch des
Silencing von HvADF3 auf das Actin-Cytoskelett zeigte, dass sowohl
die Überexpression
als auch das Silencing zu einem beinahe kompletten Verlust an Phalloidin-färbbaren
Actin-Filamenten
führt.
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Für dieses
Experiment wurden Blatt-Epidermiszellen von Gerste mit einem Plasmid
transfiziert, das dsRED (RFP) exprimiert, um die transfizierten
Zellen zu kennzeichnen. Zusätzlich
wurde in manchen Experimenten eine konstitutiv aktive Variante von
HvADF3, die eine S6A-Aminosäuresubstitution
trägt,
die das Protein für
eine N-terminale Phosphorylierung unzugänglich macht, exprimiert. Eine
entsprechende Mutante wurde für
ADF3 aus Mais beschrieben (Smertenko et al., Plant J 14, 187–193.)
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Zur
Herstellung der HvADF3-(S6A)-Mutante wurde
ein PCR-Mutagenese-Verfahren verwendet:
Primer: HvADF3-CA-F
(hat HindIII-Stelle sowie Mutation Ser6 → Ala6):
5'-TTT AAG CTT GCC
ACC ATG GCA AAC GCT TCA GCA GGT
GCT GGG-3'
Primer:
HvADF3-CA-R (hat MluI-Stelle):
5'-GTT ACG CGT CTA GTG TGC GCG CTC CTT
GA-3'
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Der
Serin6 gegen Alanin6-Austausch wurde durch Design der entsprechenden
Primer in das Wildtyp-Gen von HvADF3 eingefügt. Das PCR-Produkt wurde mit
den oben angegebenen Restriktionsenzymen geschnitten und in den Überexpressionvektor
pUbi-MCS-Nos ligiert, der zuvor mit denselben Restriktionsenzymen
geschnittenen worden war.
-
Der
resultierende Überexpressionvektor
(pHvADF3-CA, 3) besitzt einen Mais Polyubiquitin
Promotor (pUbi), das mutierte HvADF3-Gen (HvADF3-CA) und eine Nopaline
Synthase Transkriptions-Terminationssequenz (NOS).
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Zur
Herstellung der Silencing-Vektoren wurde die Sequenz von HvADF3
(SEQ ID No. 45) mit spezifischen Gateway Primern amplifiziert und
mit Hilfe der Gateway-Technologie in den Vektor pUAMBN (siehe oben)
rekombiniert. Folgende Primer wurden verwendet:
Primer HvADF3-Gate-F
(verfügt über attB1-Region):
5'- GGG GAC AAG TTT
GTA CAA AAA AGC AGG CT GCC ACC ATG
GCA AAC GCT TCA TCA GG-3'
Primer
HvADF3-Gate-R (verfügt über attB2-Region):
5'- GGG GAC CAC TTT
GTA CAA GAA AGC TGG GTT AGT GTG
CGC GCT CCT TGA -3'
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HvADF3
spezifische Sequenzen sind unterstrichen.
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Diese
Vektoren wurden dann wie oben beschrieben zur Transfektion der Pflanzen
verwendet.
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Der
dsRED Vektor (pUbi-RFP-Nos, 4) besitzt
einen Mais Polyubiquitin Promotor (pUbi), das kodierende Gen für das rot
fluoreszierende Protein (Discosoma sp. fluorescent protein FP583;
RFP) und eine Nopaline Synthase Transkriptions-Terminationssequenz
(NOS). Die GenBank Accessionnumber für RFP ist AF168419.
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Die
Experimente wurden in BCIngridmlo5 durchgeführt.
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Wenn
kein zusätzliches
HvADF3 (S6A) exprimiert wurde, konnten gefärbte Actinfasern
sowohl innerhalb der bombardierten Zelle als auch in den benachbarten
Zellen nachgewiesen werden (5a).
Dagegen konnten bei der gleichzeitigen Expression von dsRED sowie
HvADF3 (S6A) anfärbbare Actinfasern nur in den benachbarten,
aber nicht in den bombardierten mit dsRED-markierten Zellen nachgewiesen
werden, unabhängig
davon ob HvADF3 gesilenct (siehe 5b)
oder überexprimiert
wurde (siehe 5c).
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Um
die HvADF3-Funktion in Gerste weiter zu untersuchen, wurde die Auswirkung
der Überexpression oder
des Silencings von HvADF3 auf die Mobilität von Peroxisomen untersucht.
Für Peroxisomen
ist bekannt, dass sie entlang Actinfilamenten bewegt werden (Mathur
(2002) Plant Physiology, Vol. 128, 1031–1045). Gerste-Peroxisomen
wurden dabei durch die Co-Transformation eines Plasmids, das eine
Variante des Green Fluorescent Protein (GFP) mit einer peroxisomalen
Targetingsequenz exprimierte (Mathur et al., vide supra), visualisiert.
Dabei wurden Blatt-Epidermiszellen von Gerste entweder nur mit dem
GFP-Konstrukt oder
zusammen mit der bereits erwähnten
Mutante von HvADF3 (S6A) transfiziert. Die
Expression dieser Mutante entspricht einer Erhöhung des Gehalts und der Aktivität an ADF3.
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Mit
Hilfe der PCR-Methode wurde C-terminal an das grün fluoreszierende Protein eine
so genannte Peroxisomen-Zielsequenz (PTS) fusioniert. Diese besteht
aus den drei Aminosäuren
Serin (S), Arginin (R) und Leucin (L) (Jedd, G. et al. (2002) Plant
Cell Physiol 43, 384–392).
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Primer
GFP-F (hat HindIII-Stelle und bindet in GFP-Sequenz):
5'-GCG AAG CTT GCC
ACC ATG GTG AGC AAG GGC GAG-3'
-
Primer
GFP-PTS-R (hat zusätzliche
PTS und MluI-Stelle, bindet in GFP-Sequenz):
5'-AAG ACG CGT TTA
GAG GCG GGA CTT GTA CAG CTC G-3'
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Die
PCR wurde mit einer GFP-Sequenz als Template durchgeführt.
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Das
PCR Produkt wurde mit den oben angegebenen Restriktionsenzymen geschnitten
und in den Überexpressionsvektor
pUbi-MCS-Nos ligiert, der zuvor mit denselben Restriktionsenzymen
geschnittenen worden war.
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Der
GFP-Peroxisomen-Zielsequenz-Vektor (pGFPTS, 6) besitzt
einen Mais Polyubiquitin Promotor (pUbi), das kodierende Gen für das grün fluoreszierende
Protein inklusive der Peroxisomen-Zielsequenz (GFPTS) und eine Nopaline
Synthase Transkriptions-Terminationssequenz
(NOS).
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Die Überexpression
von HvADF3 wurde wie oben beschrieben durchgeführt. Die Silencing-Experimente wurden
ebenfalls wie oben beschrieben durchgeführt.
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Die Überexpression,
aber auch das Silencing (Daten nicht gezeigt) von HvADF3 bewirkte
eine drastische Verlangsamung oder sogar einen kompletten Stopp
der peroxisomalen Bewegung und führte
häufig
zur Bildung von peroxisomalen Aggregaten (siehe 7).
Während
sich bei der Kontrolltransfektion mit GFP alleine GFP-markierte
Peroxisomen konstant innerhalb der bombardierten Zelle bewegen (siehe 7a), ist die Bewegung der Peroxisomen bei Co-Expression
von HvADF3 (S6A) wesentlich verlangsamt,
und es kommt schließlich
zu einer Aggregation der Peroxisomen (siehe 7b).
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Zusammenfassend
zeigen diese Ergebnisse, dass die Überexpression und ebenso das
Silencing von HvADF3 zu einem Verlust an Phalloidin-färbbaren
Actin-Filamenten des Cytosekeletts führt, was zur Folge hat, dass
intrazelluläre
durch Actin-Filamente vermittelte Transportprozesse beeinträchtigt sind.
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3. Resistenz von Pflanzen,
die bezüglich
des Gehalts bzw. der Aktivität
von HvADF3 gegenüber
dem Wildtyp verändert
sind
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Die
oben beschriebene Beeinträchtigung
der intrazellulären
Transportmechanismen in Folge der Überexpression oder des Silencing
von HvADF3 kann zur Konsequenz haben, dass Transport-abhängige Verteidigungsmechanismen
wie z.B. die Vesikelanhäufung
an Infektionsstellen der Grund dafür sein könnten, dass in den Experimenten,
die zur Identifizierung von HvADF3 führten, eine erhöhte Penetrationsrate
in eigentlich resistenten mlo-Genotypen
beobachtet wurde. Es wurde daher untersucht, ob die Überexpression
oder das Silencing von HvADF3 ebenfalls zu einer Rasse-unspezifischen
Resistenz gegen verschiedene Bgh-Isolate führt.
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Daher
wurden Zellen untersucht, die mit HvADF3 Überexpressions-Konstrukten
transfiziert worden waren.
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Eine
genaue Analyse solcher transfizierten Zellen ergab, dass die Entwicklung
des Pathogens zu späteren
Zeitpunkten entweder arretiert oder zumindest erheblich verlangsamt
war. Während
72 Stunden nach der Infektion die Entwicklung von Pilzstrukturen
in Stomatazellen, die sich in der Nähe der transfizierten Zellen
befanden, normal erschien, waren die Pilzstrukturen von Sporen,
die die transfizierten Zellen attackierten, nur gering entwickelt.
Dabei muss beachtet werden, dass Stomatazellen eine verbleibende
Empfindlichkeit für
Mehltauinfektion auch in mlo-Genotypen behalten.
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Für diese
Experimente wurden Blatt-Epidermiszellen von Gerste mit einem Plasmid
für den
GUS-Reporter zusammen mit einem Plasmid, das für HvADF3 (S6A)
kodiert, wie oben beschrieben ko-transfiziert. Vier Stunden nach
dem Bombardement wurden die Blätter
mit Bgh-Konidien infiziert und 22 Stunden nach der Beimpfung wurden
die Blätter
hinsichtlich GUS-Aktivität
und Pilzstrukturen gefärbt.
Die 8a und b zeigen die Pilzentwicklung
in einer transfizierten Blatt-Epidermiszelle. Die 8c zeigt die Pilzentwicklung in einer Stomatazelle.
Die Expression von HvADF3(S6A) entspricht
einer Überexpression
von HvADF3. Die Experimente wurden in BCIngridmlo5-Pflanzen durchgeführt.
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Wie
man aus den 8a, b und c erkennt, kann der
Pilz bei Zellen, in denen HvADF3 überexprimiert wird, nur sehr
kurze Hyphen bilden, was die Etablierung einer nachhaltigen Infektion
verhindert. Dagegen werden die Pilzstrukturen in Stomatazellen,
die nicht transfiziert wurden, voll ausgebildet (siehe 8c). Es sieht daher so aus, dass das pilzliche
Pathogen zwar zunächst
von dem beeinträchtigten
Actin-Cytoskelett des Wirts bei der erfolgreichen Zellwandpenetration
profitiert, aber eine erfolgreiche Infektion nicht etablieren kann,
da offensichtlich intakte Actin-Filamente für die Aufrechterhaltung einer
kompatiblen Interaktion notwendig sind. Somit kann durch Erhöhung bzw.
Erniedrigung des Gehalts und/oder der Aktivität von ADF3 in Gerste eine Rasse-unspezifische
Resistenz gegen verschiedene Bgh-Isolate erreicht werden.
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Die
vorstehend beschriebenen Experimente beruhen alle auf einer transienten
Expression mittels Particle Bombardement. Die dadurch gewonnen Ergebnisse
lassen sich jedoch ohne weiteres auf stabil transformierte transgene
Pflanzen übertragen,
bei denen die Expression von ADFs dauerhaft gesteigert oder reduziert ist.
Stabil transformierte Pflanzen können
z.B. wie nachfolgend beschrieben hergestellt werden.
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Die
in SEQ ID No. 11 angegebene Nukleinsäuresequenz für ADF 3
aus Arabidopsis thaliana kann durch folgende Primer amplifiziert
werden:
Fra224 atggctaatgcagcatcagg
Fra255 tcaattggctcggcttttga
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Zur
Transformation wird das erhaltene Fragment in einen binären Vektor
kloniert. Vorher erfolgt eine Subklonierung in den Vektor pCR®2.1
TOPO (Invitrogen, Karlsruhe), aus dem das Gen mit den Enzymen EcoRV
und HindIII wieder ausgeschnitten werden kann (siehe 9).
Die überhängenden
Enden werden mit Hilfe des Klenow-Enzyms aufgefüllt.
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Für die konstitutive
Expression von AtADF3 wird das oben hergestellte Fragment in den
mit SmaI geöffneten,
dephosphorylierten binären
Vektor pSUN2 ligiert (siehe 10).
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Um
auch die pathogen-induzierbare Expression von AtADF3 zu ermöglichen,
wird dieses mit BglII und XbaI aus pSUN2 ausgeschnitten und in den
Vektor Lo215 ligiert. Dieser Vektor enthält bereits den Thi2.1-Promotor
aus Arabidopsis thaliana (Acc. L41244; Epple, P., Apel, K. and Bohlmann,
H. (1995) An Arabidopsis thaliana thionin gene is inducible via
a signal transduction pathway different from that for pathogenesis-related proteins.
Plant Physiol. 109 (3), 813–820),
der durch Pathogenbefall induziert wird, was über ein nachgeschaltetes GUS-Gen
bereits gezeigt wurde. AtADF3 wird an die Stelle des vorhandenen
GUS-Gens kloniert, indem dieses mit SacI und SmaI aus dem Vektor
ausgeschnitten, der Vektor dephosphoryliert und aufgefüllt und
das AtADF3-Fragment in den Vektor ligiert wird. Über eine homologe Rekombination
(Gateway®-Reaktion,
Invitrogen, Karlsruhe) wurde das Promotor-Gen Konstrukt anschließend in
den binären
Vektor Lo123 umkloniert (siehe 11).
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Die
Transformation wird nach der Floral-Dip-Methode (modifiziert nach
Clough und Bent, 1998) durchgeführt.
Die Samen werden nach dem Ernten über Nacht mit Chlorgas sterilisiert
und anschließend
auf Selektionsplatten ausgelegt. Die Antibiotikazugabe erfolgt in
Abhängigkeit
vom pflanzlichen Resistenzmarker. Bei pSUN2 wird BASTA zugesetzt,
bei Lo123 wird Kanamycin zugegeben. Die Samen werden nach der Sterilisation
auf den Selektionsplatten ausgelegt und zur Stratifizierung zwei
Tage bei 4°C
im Kühlraum
aufbewahrt. Danach werden sie unter Kurztagbedingungen weiter beobachtet.
Nach etwa 10 Tagen kann die erste Selektion der Pflanzen durchgeführt werden.
Nicht-transgenen Pflanzen bleichen während Selektion aus, während die
transgenen Pflanzen, die das entsprechende Resistenz-Gen besitzen,
grün bleiben.
Die Pflanzen, die nach der ersten Selektion grün bleiben, werden ein zweites
Mal unter den gleichen Bedingungen selektiert. Die Pflanzen, die
auch während
der zweiten Selektion nicht ausbleichen, können dann auf Erde umgesetzt
werden. Die Pflanzen werden geselbstet und die resultierenden T2-Samenpopulationen
der phytopathologischen Analyse unterworfen.
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Zur
Analyse der Resistenz der transgenen Arabidopsis thaliana-Pflanzen
gegenüber
pathogenen Pilzen werden Inokulationen mit den biotrophen Oomyceten
bzw. Pilzen Peronospora parasitica und Erysiphe cichoracearum vorgenommen.
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a) Infektion mit Peronospora
parasitica
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5
bis 8 Wochen alte Pflanzen werden mit einer Konidiensporensuspension
(ca. 106 Sporen/ml) besprüht. Die
inokulierten Pflanzen werden über
Nacht in einem Kühlschrank
bei ca. 16°C
mit einer Plastiktüte überdeckt
dunkel und feucht gehalten. Nach einem Tag wird die Plastiktüte etwas
geöffnet
und später
vollständig
entfernt. Sechs Tage nach Inokulation werden die Pflanzen wieder über Nacht
mit der Plastiktüte
zugedeckt, wodurch die Sporulation induziert wird. Am folgenden
Tag werden die Blätter
auf das Auftreten von Konidiophoren untersucht. Das interzelluläre Wachstum
des Pilzes führt
in den nächsten
Tagen zur Induktion von schwachen Chlorosen bis hin zu starken Nekrosen
in den Blättern.
Diese Symptome werden quantifiziert und auf Signifikanz getestet.
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b) Infektion mit Erysiphe
cichoracearum
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Der
biotrophe Mehltau-Pilz wird auf Arabidopsis thaliana-Pflanzen kultiviert.
Zur Infektion der 4 Wochen alten transgenen Arabidopsis-Pflanzen
werden mit einem feinen Pinsel Konidienträger auf der Oberfläche der
Blätter
abgenommen und auf die Blätter
der transgenen Pflanzen gestrichen. Die Pflanzen werden für 7 Tage
bei 20°C
inkubiert. 7 Tage nach Inokulation werden die Konidienträger auf
den Blättern
sichtbar, und es treten in den folgenden Tagen Chlorosen und Nekrosen
zutage. Diese Symptome werden quantifiziert und auf Signifikanz
getestet.
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c) Ergebnisse
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Die
transgenen Arabidopsis Pflanzen, die AtADF3 konstitutiv oder pathogen-induzierbar
exprimieren, zeigen sowohl gegen Peronospora parasitica als auch
gegen Erysiphe cichoracearum eine signifikant erhöhte Resistenz
im Vergleich zu nicht-transgenen Wildtyp-Pflanzen zeigen.
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Abbildungslegende
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1:
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1 zeigt
ein Sequenz-Alignment von HvADF3 sowie verschiedenen ADFs aus Arabidopsis
thaliana (siehe auch Tabelle 7)
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2:
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2 zeigt
den Vektor pUAMBN, der für
das dsRNAi-basierte Silencing in Epidermiszellen von Gerste verwendet
wurde. Ubi, Mais Polyubiquitin Promotor; attR1 und attR2, Gateway
Rekombinationsstellen; ccdB, negativer Selektionsmarker; nos, Agrobacterium
tumefaciens Nopaline Synthase transkriptioneller Terminator.
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3:
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3 zeigt
den Vektor pHvADF3-CA.
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4:
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4 zeigt
den Vektor pUbi-RFP-nos.
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5:
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5 zeigt
die Visualisierung des Actin-Cytoskeletts in transfizierten einzelnen
Epidermisblattzellen von Hafer durch Phalloidin-Färbung. Die
Zellen wurden mit einem Plasmid transfiziert, das dsRED (RFP) exprimierte,
um bombardierte Zellen zu markieren. Wenn kein zusätzliches
Gen exprimiert wurde (Kontrolle, A), waren gefärbte Actin-Fasern innerhalb
der markierten Zellen sowie in benachbarten Zellen detektierbar.
Sowohl im Fall von dsRNAi-basiertem Silencing von HvADF3 (B) als
auch im Fall der Überexpression
einer konstitutiv aktiven Variante von HvADF3, die eine S6A-Aminosäuresubstitution
trägt,
die eine N-terminale Phosphorylierung des Proteins verhindert (C),
waren Actin-Fasern nur in den benachbarten Zellen, aber nicht in
den durch dsRED-markierten Zellen sichtbar.
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6:
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6 zeigt
den Vektor pGFPTS.
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7:
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7 zeigt
die Bewegung von GFP-markierten Peroxisomen in einzelnen Blattepidermiszellen
von Gerste. Ein Plasmid, das eine GFP-Variante mit einer C-terminalen
peroxisomalen Targetingsequenz kodierte, wurde entweder alleine
(A, Kontrolle) oder zusammen mit einem Plasmid, das eine "konstitutiv aktive" Variante von HvADF3,
die eine S6A-Aminosäuresubstitution trägt (B),
exprimiert. Während
sich in den Kontrolltransfektionen (A) GFP-markierte Peroxisomen
konstant innerhalb der bombardierten Zellen bewegten, waren die
Peroxisomen bei Co-Expression der konstitutiv aktiven Variante von
HvADF3 (B) verlangsamt und aggregierten schließlich.
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8:
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8 zeigt,
dass die Überexpression
von HvADF3 die Entwicklung des Pilzes inhibiert. Blattepidermiszellen
von Gerste wurden mit GUS (β-Glucuronidase)-Reporterplasmiden
und einem Plasmid transfiziert, das die ektopische Expression einer
konstitutiv aktiven Variante von HvADF3 (die eine S6A-Aminosäuresubstitution
trägt)
bewirkt. 4 Stunden nach der Bombardierung wurden die Zellen mit
Bgh-Konidiosporen beimpft und 72 Stunden nach der Beimpfung wurden
die Blätter
auf GUS-Aktivität
und pilzliche Strukturen gefärbt.
A, B, die pilzliche Entwicklung einer transfizierten Blattepidermiszelle.
C, die pilzliche Entwicklung einer erfolgreich befallenen Stomatazelle.
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9:
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9 zeigt
den Vektor pCR2.1 TOPO mit inseriertem AtADF3-Gen.
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10:
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10 zeigt den Vektor pSUN2 mit inseriertem AtADF3-Gen.
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11:
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11 zeigt den Vektor Lo123 mit inseriertem AtADF3-Gen.
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Es
folgt ein Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25.
Dieses kann
von der amtlichen Veröffentlichungsplattform
des DPMA heruntergeladen werden.