DE10131984A1

DE10131984A1 - Nukleotidsequenz sowie Verfahren zur Steigerung der Krankheitsresistenz von Pflanzen

Info

Publication number: DE10131984A1
Application number: DE2001131984
Authority: DE
Inventors: Karl-Heinz Kogel; Karin Beser; Gregor Langen
Original assignee: BASF Plant Science GmbH
Current assignee: BASF Plant Science GmbH
Priority date: 2001-07-02
Filing date: 2001-07-02
Publication date: 2003-01-16
Also published as: WO2003004521A2; AU2002325255A1; WO2003004521A3; DE10292937D2

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft eine isolierte Nukleotidsequenz kodierend für ein Ca·2+·-bindendes EF-hand-Protein sowie ein Verfahren zur Steigerung der Krankheitsresistenz in Pflanzen.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Nukleotidsequenz sowie ein Verfahren zur Steigerung der Krankheitsresistenz von Pflanzen.

Das Auftreten von Pflanzenkrankheiten, beispielsweise hervorgerufen durch Viren, Bakterien oder Pilze, kann zu erheblichen Schädigungen oder sogar zum Ausfall der ganzen Pflanze führen, verbunden mit einer drastisch verringerten Menge oder Qualität des Erntegutes. Um die Ertragsverluste auf ein wirtschaftlich vertretbares Maß zu begrenzen, sind Pflanzenschutzmaßnahmen unabdingbar.

Dem Phänomen der Induzierten Resistenz (IR) liegt ein natürlicher Mechanismus zu Grunde, der durch pathogene oder apathogene Mikroorganismen sowie Herbivore ausgelöst werden kann und zu einer erhöhten Resistenz gegenüber einem Befall mit anderen Pathogenen bzw. Schädlingen führt (bIR, biotisch Induzierte Resistenz, Hammerschmidt 1993, von Loon et al. 1998). Es handelt sich bei der IR um einen aktiven pflanzlichen Prozess, der sowohl die Auslösung und Verstärkung zellulärer Abwehrmechanismen durch einen Induktor umfasst, als auch die erhöhte Bereitschaft der Pflanze beinhaltet, schneller mit Abwehrreaktionen auf den Angriff zu antworten (Hammerschmidt 1993; Kessmann et al. 1994).

Ross (1961) benutzt die Begriffe local und systemic acquired resistance (lokale und systemische erworbene Resistenz) für das oben beschriebene Phänomen. Treffender ist jedoch der Ausdruck Induzierte Resistenz, daher werden im folgenden die Abkürzungen IR bzw. sIR benutzt. Bei der IR bleibt der Effekt auf das mit dem Induktor-Pathogen inokulierte Blatt beschränkt, bei der sIR weitet sich die Resistenz auf unbehandelte Pflanzenteile wie höhere Blattetagen, den Zuwachs oder auch Wurzeln (Gessler & Ku ≙ 1982), also systemisch, aus.

Auf den Versuchen von Ross (1961) aufbauend, wurde das Phänomen der sIR in verschiedenen Dikotyledonen wie Tabak und Gurke sehr gut charakterisiert und konnte auch in Arabidopsis thaliana, der experimentellen Modellpflanze, nachgewiesen werden (Kessmann et al. 1994). Die Ausprägung der sIR ist mit der Expression eines komplexen Sets von Genen assoziiert, zu denen PR-Gene pathogenesis-related genes und solche unbekannter Funktion gehören (Ward et al. 1991, Uknes et al. 1992, Ryals et al. 1996). Ihre Expression variiert jedoch in Quantität und Qualität zwischen verschiedenen Pflanzenarten und Induktoren (Ryals et al. 1996, Thomma et al. 1998, Thomma et al. 2001, Bostock 1999).

Eine Form der sIR ist durch die Akkumulation von Salicylsäure (SA) charakterisiert, die sowohl lokal am Ort der Infektion, als auch systemisch in distal gelegenem Gewebe z. T. durch den Transport im Phloem, beobachtet wird (SAR, Schneider et al. 1996). Dabei korreliert der endogene SA-Gehalt mit der Induktion von PR-Proteinen und der Resistenz (Enyedi et al. 1992b, Yalpani et al. 1993). Auch die exogene Applikation von SA kann sowohl Resistenz als auch ein gleiches Set von SAR- Genen wie nach Pathogenbefall induzieren (Ward et al. 1991). Die Natur des systemischen Signals zur Etablierung der SAR ist bislang allerdings nicht identifiziert.

Nahezu alle Erkenntnisse über die Induzierte Resistenz sind in dikotylen Pflanzen gewonnen und lassen sich nicht ohne weiteres auf die Wirt-Pathogen-Interaktionen monokotyler Pflanzen übertragen. Da die bedeutendsten Nutzpflanzen jedoch monokotyledone Pflanzen sind, sind Erkenntnisse zu Resistenzmechanismen und deren Auslöser in diesem Pflanzenstamm von enormer Relevanz.

In der WO 00/71748 werden Genfragmente (ESTs) offenbart, die durch chemische Resistenzinduktoren induziert werden und an der Expression von IR beteiligt sind. Schwerpunkt dieser Anmeldung ist ein Screening-Verfahren zur generellen Identifizierung von Chemikalien, die an der Induktion von Resistenz beteiligt sind. Bei Beßer et al. (2000, Molecular Plant Pathology, 1 (5): 277-286) sind Untersuchungen zu chemisch induzierten Genen in Gerste sowie deren Beteiligung an verschiedenen Wegen der Krankheitsresistenz beschrieben. Unter anderen ist hier auch ein mit Bci-4 bezeichnetes Genfragment (312 bp) beschrieben, das weder durch die Phytohormone Jasmonat oder Jasmonsäure-Methylester noch durch Ethylen oder Abscisinsäure oder durch Sorbit induziert wird. Auch die Verwundung der Pflanze oder die Inokulation mit dem pathogenen Pilz Blumeria graminis f. sp. hordei (Echter Gerstenmehltau) induziert die Expression von Bci-4 in Gerste nicht. Letzteres stellt einen wesentlichen Unterschied zu den PR-Genen (pathogen-related genes) aus dicotyledonen Pflanzen dar. Bci-4 aus Gerste wird alleine durch Resistenzinduktoren, wie SA (Salicylsäure), 2,6-di-Chlorisonicotinsäure (DCINA) und Benzo-(1,2,3)-thiadiazol-7-carbothionsäure-S-methylester (BTH oder Bion®) aktiviert, wobei die beiden letzten Verbindungen wahrscheinlich SA-Analoga darstellen.

Allerdings wäre es wünschenswert auch ohne den Einsatz von Chemikalien, die eine zusätzliche Belastung für Boden und Grundwasser sowie den Anwender darstellen, die Abwehr von Pflanzen gegenüber Schädlingen zu verbessern.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, Gene und Verfahren zur Verfügung zu stellen, durch die die Resistenz von Pflanzen, vorteilhafter Weise von Nutzpflanzen, auch ohne die Induktion durch Chemikalien gegenüber Pathogenen gesteigert werden kann.

Die Aufgabe wird durch die vorliegende Erfindung in vorteilhafter Weise gelöst.

Gegenstand der Erfindung ist eine isolierte Nukleotidsequenz, kodierend für ein Ca²⁺- bindendes EF-hand-Protein, deren Überexpression in Pflanzen eine erhöhte Krankheitsresistenz bewirkt, ausgewählt aus

a) einer Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID No. 1,
b) einer Nukleotidsequenz, die eine wenigstens 75%ige Identität mit der in SEQ ID No. 1 gezeigten Nukleotidsequenz,
c) einer mit a) und b) hybridisierenden Nukleotidsequenz,
d) einer zu a), b) oder c) komplementären Nukleotidsequenz.

In einer Variante der vorliegenden Erfindung stammt die Nukleotidsequenz aus Gerste (Hordeum). Da es sich bei der zuvor genannten Nukleotidsequenz um ein chemisch induzierbares Gen handelt, wird es auch mit Bci-4 bezeichnet für barley chemically induced gene.

Unter einer isolierten Nukleinsäure oder einem isolierten Nukleinsäurefragment ist erfindungsgemäß ein Polymer aus RNA oder DNA zu verstehen, das einzel- oder doppelsträngig sein kann und optional natürliche, chemisch synthetisierte, modifizierte oder artifizielle Nukleotide enthalten kann. Der Begriff DNA-Polymer schließt hierbei auch genomische DNA, cDNA oder Mischungen davon ein.

Unter hybridisierenden Nukleotidsequenzen im Sinne der Erfindung sind Oligo- oder Polynukleotide zu verstehen, die unter Standard-Hybridisierungsbedingungen an die erfindungsgemäße Nukleotidsequenz des Bci-4 binden. Der Begriff Standard- Hybridisierungsbedingungen ist breit zu verstehen und meint stringente und weniger stringente Hybridisierungsbedingungen. Solche Bedingungen sind unter anderem bei Sambrook et al. (1989, Molecular Cloning, 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press,) beschrieben. Der Begriff hybridisierende Sequenzen schließt erfindungsgemäß substanziell ähnliche Nukleotidsequenzen aus der Gruppe von DNA oder RNA ein, die unter an sich bekannten Standard- Hybridisierungsbedingungen eine spezifische Wechselwirkung (Bindung) mit den erfindungsgemäßen Nukleotidsequenzen eingehen. Hierzu zählen auch kurze Nukleotidsequenzen mit einer Länge von beispielsweise 10 bis 30, bevorzugt 12 bis 15 Nukleotiden. Dies umfaßt erfindungsgemäß u. a. auch sogenannte Primer oder Sonden.

Unter Allelen sind erfindungsgemäß funktionell äquivalente, d. h. im wesentlichen gleichwirkende Nukleotidsequenzen zu verstehen. Funktionell äquivalente Sequenzen sind solche Sequenzen, welche trotz abweichender Nukleotidsequenz, beispielsweise durch die Degeneriertheit des genetischen Codes noch die gewünschten Funktionen besitzen. Funktionelle Äquivalente umfassen somit natürlich vorkommende Varianten der hierin beschriebenen Sequenzen sowie künstliche, z. B. durch chemische Synthese erhaltene und gegebenenfalls an den Kodon-Gebrauch des Wirtsorganismus angepaßte Nukleotid-Sequenzen. Darüber hinaus umfassen funktionell äquivalente Sequenzen solche, die eine veränderte Nukleotidsequenz aufweisen, welche dem Protein beispielsweise eine Desensitivität oder Resistenz gegenüber Inhibitoren verleiht.

Unter einem funktionellen Äquivalent versteht man insbesondere auch natürliche oder künstliche Mutationen einer ursprünglich isolierten Sequenz, welche weiterhin die gewünschte Funktion zeigen. Mutationen umfassen Substitutionen, Additionen, Deletionen, Vertauschungen oder Insertionen eines oder mehrerer Nukleotidreste.

Inbegriffen sind hier auch sogenannte Sinnmutationen (sense mutations), die auf Proteinebene beispielsweise zum Austausch konservierter Aminosäuren führen können, welche aber zu keiner grundsätzlichen Veränderung der Aktivität des Proteins führen und somit funktionsneutral sind. Dies beinhaltet auch Veränderungen der Nukleotidsequenz, die auf Proteinebene den N- oder C-Terminus eines Proteins betreffen, ohne jedoch die Funktion des Proteins wesentlich zu beeinträchtigen. Diese Veränderungen können sogar stabilisierenden Einfluß auf die Proteinstruktur ausüben.

Außerdem sind artifizielle DNA-Sequenzen Gegenstand der vorliegenden Erfindung, solange sie, wie oben beschrieben, die gewünschten Eigenschaften vermitteln. Solche artifiziellen DNA-Sequenzen können beispielsweise durch Rückübersetzung von mittels computergestützten Programmen (molecular modelling) erstellten Proteinen oder durch in-vitro-Selektion ermittelt werden. Besonders geeignet sind kodierende DNA-Sequenzen, die durch Rückübersetzung einer Polypeptidsequenz gemäß der für den Wirtsorganismus spezifischen Kodon-Nutzung erhalten wurden. Die spezifische Kodon-Nutzung kann ein mit molekulargenetischen Methoden vertrauter Fachmann durch Computerauswertungen anderer, bereits bekannter Gene des zu transformierenden Organismus leicht ermitteln.

Der Begriff des funktionellen Äquivalents bezieht sich auch auf das durch die entsprechende Nukleotidsequenz kodierte Protein. In diesem Fall beschreibt der Begriff funktionelles Äquivalent ein Protein, dessen Aminosäuresequenz mit der des Referenzproteins (hier des Ca²⁺-bindenden EF-hand-Proteins kodiert durch BCI-4) bis zu einem bestimmten Prozentsatz homolog ist. Der Prozentsatz liegt bei mindestens 75%, bevorzugt 80%, besonders bevorzugt 90-95% und insbesondere bei 99,9%.

Gegenstand der Erfindung ist auch eine isolierte Nukleotidsequenz der zuvor erwähnten Art, deren um den Faktor von etwa 10- bis 100-fach gesteigerte Expression in Pflanzen eine gesteigerte Resistenz gegenüber Pathogenen bewirkt.

Die vorliegende Erfindung umfaßt auch das Ca²⁺-bindende EF-hand-Protein kodiert durch eine Nukleotidsequenz der zuvor genannten Art oder eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO. 2, wobei eine erhöhte Protein-Konzentration in Pflanzen eine gesteigerte Resistenz gegenüber Pathogenen bewirkt.

In einer Variante der vorliegenden Erfindung wird, ausgehend von einer nur mit RT- PCR nachweisbaren, extrem schwachen konstitutiven Expression des für ein Ca²⁺- bindendes EF-hand-Protein kodierendes Gen, nach Induktion mit einem Resistenzinduktor (z. B. BTH) eine ca. 10- bis 100-fach stärkere Expression (mRNA- Gehalt) nachgewiesen.

Das erfindungsgemäße Ca²⁺-bindende EF-hand-Protein zeichnet sich dabei dadurch aus, daß es bei verstärkter Expression in Pflanzen die Resistenz gegenüber Pathogenen um etwa 20 bis 90%, bevorzugt um etwa 50 bis 80%, besonders bevorzugt um 70% steigert. Die Resistenz der Pflanze wird dabei über die Abnahme der Penetrationsfrequenz ermittelt.

Unter Penetrationsfequenz ist erfindungsgemäß die Anzahl der Infektionsstellen mit erfolgreich penetrierten Epidermiszelle zu verstehen, dividiert durch die Gesamtzahl der Infektionsstellen.

Das erfindungsgemäße Ca²⁺-bindende EF-hand-Protein bewirkt in vorteilhafter Weise in Pflanzen eine erhöhte Resistenz gegenüber biotrophen Pilzen. Bevorzugt bewirkt eine erhöhte Konzentration an Ca²⁺-bindendem EF-hand-Protein eine erhöhte Resistenz gegenüber Mehltaupilzen, besonders bevorzugt Blumeria graminis f. sp. hordei oder f. sp. tritici. Eine erhöhte Resistenz gegenüber weiteren Pflanzenpathogenen ist dadurch jedoch nicht ausgeschlossen.

Unter dem erfindungsgemäßen Ca²⁺-bindenden EF-hand-Protein sind auch modifizierten Formen zu verstehen, bei denen Änderungen in der Sequenz, beispielsweise am N- und/oder C-Teminus des Polypeptids oder im Bereich konservierter Aminosäuren vorliegen, ohne jedoch die Funktion des Proteins zu beeinträchtigen. Diese Veränderungen können in Form von Aminosäureaustauschen nach an sich bekannten Methoden vorgenommen werden.

Eine besondere Ausführungsvariante der vorliegenden Erfindung umfaßt Varianten des erfindungsgemäßen Polypeptids, dessen Aktivität beispielsweise durch Aminosäureaustausche, verglichen mit dem jeweiligen Ausgangsprotein, abgeschwächt oder verstärkt ist. Gleiches gilt für die Stabilität des erfindungsgemäßen Proteins in den Zellen, die beispielsweise gegenüber dem Abbau durch Proteasen verstärkt oder vermindert anfällig sind.

Die vorliegende Erfindung umfaßt auch eine Genstruktur enthaltend wenigstens den kodierenden Bereich der isolierten Nukleotidsequenz des Bci-4-Gens sowie damit operativ verknüpfte regulatorische Nukleotidsequenzen.

Unter einer operativen Verknüpfung versteht man die sequenzielle Anordnung beispielsweise von Promotor, kodierender Sequenz, Terminator und ggf. weiterer regulatorischer Elemente derart, daß jedes der regulatorischen Elemente seine Funktion bei der Expression der kodierenden Sequenz bestimmungsgemäß erfüllen kann. Diese regulatorischen Nukleotidsequenzen können natürlichen Ursprungs sein oder durch chemische Synthese erhalten werden. Als Promotor ist grundsätzlich jeder Promotor geeignet, der die Genexpression in dem entsprechenden Wirtsorganismus steuern kann. Hierbei kann es sich erfindungsgemäß auch um einen natürlichen oder synthetisch erzeugten chemisch induzierbaren Promotor handeln, durch den die Expression der ihm unterliegenden Gene in der Wirtszelle zu einem bestimmten Zeitpunkt gesteuert werden kann. Hierzu zählen auch gewebespezifische Promotoren. Die Herstellung einer Genstruktur erfolgt durch Fusion eines geeigneten Promotors mit wenigstens einer erfindungsgemäßen Nukleotidsequenz nach gängigen Rekombinations- und Klonierungstechniken, wie sie beispielsweise in T. Maniatis, E. F. Fritsch und J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratury, Cold Spring Harbor, NY (1989) beschrieben sind. Für die Verbindung der DNA-Fragmente miteinander können an die Fragmente Adaptoren oder Linker angesetzt werden.

Erfindungsgemäß sind auch die den kodierenden Bereichen (Strukturgenen) vorausgehenden (5'- oder upstream) und/oder nachfolgenden (3'- oder downstream) Sequenzbereiche eingeschlossen. Insbesondere sind hierin Sequenzbereiche mit regulatorischer Funktion inbegriffen. Sie können die Transkription, die RNA-Stabilität oder das RNA processing sowie die Translation beeinflussen. Beispiele für regulatorische Sequenzen sind u. a. Promotoren, Enhancer, Operatoren, Terminatoren oder Translationsverstärker.

Erfindungsgemäß umfaßt ist ferner ein Vektor enthaltend wenigstens eine Nukleotidsequenz der eingangs erwähnten Art kodierend für ein Ca²⁺-bindendes EF- hand-Protein oder ein Genkonstrukt der zuvor genannten Art sowie zusätzliche Nukleotidsequenzen zur Selektion und/oder zur Replikation in der Wirtszelle und/oder zur Integration in das Wirtszell-Genom.

Beispiele für vorteilhafte Vektoren im Sinne der vorliegenden Erfindung sind pPCV, (Koncz et al., PMB Manual B2, 1-22, 1994), pBIN19 (Yokubaitis et al., PMB 27, 405-409, 1995). Diese Beispiele wirken sich nicht limitierend auf die vorliegende Erfindung aus.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine transgene Pflanze und deren Nachkommen mit erhöhter Resistenz gegenüber einer nicht genetisch veränderten Pflanze, enthaltend in replizierbarer Form und erhöhter Kopienzahl eine Nukleotidsequenz und/oder eine Genstruktur und/oder einen Vektor der erfindungsgemäßen Art.

Die vorliegende Erfindung umfaßt auch ein Verfahren zur Steigerung der Krankheitsresistenz in Pflanzen, wobei die erfindungsgemäße Nukleotidsequenz kodierend für ein Ca²⁺-bindendes EF-hand-Protein der zuvor beschriebenen Art und/oder ein Genkonstrukt und/oder ein Vektor der genannten Art in replizierbarer Form in ganze Pflanzen, Pflanzenteile und/oder Pflanzenzellen übertragen, im Vergleich zu einer nicht-transformierten Pflanze in erhöhter Kopienzahl repliziert und das kodierte Ca²⁺-bindende EF-hand-Protein in erhöhter Konzentration zur Expression gebracht wird.

Verfahren zur Herstellung solcher erfindungsgemäßen trangenen Pflanzen gehören zur gängigen Laborpraxis. In einer vorteilhaften Variante der vorliegenden Erfindung werden die Nukleotidsequenz und/oder Genkonstrukte und/oder Vektoren durch sogenanntes "particle bombardment" und/oder Agrobakterien-vermittelte Transformation in die Pflanze oder Pflanzenteile oder Zellen übertragen.

In einer Variante des vorliegenden Verfahrens wird die Nukleotidsequenz kodierend für ein Ca²⁺-bindendes EF-hand-Protein in eine monokotyledone Pflanze übertragen. Bevorzugt erfolgt die Übertragung in eine Pflanze der Gattung Hordeum oder Triticum.

Ein besonderer Vorteil der erfindungsgemäß transgenen Pflanze und deren Nachkommen ist, das eine Erhöhung der Kopienzahl der erfindungsgemäßen Nukleotidsequenz und analog das Vorliegen einer erhöhten Konzentration an durch die Nukleotidsequenz kodierten Proteins überraschender Weise zu einer wesentlich gesteigerten Krankheitsresistenz führt. D. h. das erfindungsgemäße Gen bzw. das kodierte Protein ist kausal an der Ausbildung der Resistenz gegenüber pathogenen Schädlingen beteiligt.

Die erfindungsgemäße transgene Pflanze weist somit den Vorteil auf, daß sie eine induzierte Resistenz zeigt, wobei diese Resistenz jedoch nicht durch Chemikalien ausgelöst werden muß. Dies bringt den enormen Vorteil mit sich, das ungewollte Nebeneffekte, wie z. B. eine erhebliche Ertragsminderung, wie sie bei der herkömmlichen durch Chemikalien induzierten Resistenz stets auftritt, nun durch die Bereitstellung der erfindungsgemäßen Nukleotidsequenzen und transgenen Pflanzen vernachlässigbar klein werden oder sogar ausgeschlossen werden können. Zudem wird die Belastung für Umwelt und Anwender durch das Ausbringen der Chemikalien auf Null reduziert.

Die erfindungsgemäß transgene Pflanze zeichnet sich ferner dadurch aus, daß die Nukleotidsequenz kodierend für ein Ca²⁺-bindendes EF-hand-Protein extrachromosomal vorliegt und/oder stabil in das pflanzliche Genom integriert ist. Entsprechende Vorgehensweisen und Hilfsmittel, wie Genkonstrukte oder Vektoren und geeignete Hilfsorganismen zur Integration der Nukleotidsequenz in das pflanzliche Genom sind dem Fachmann geläufig und werden nicht näher ausgeführt.

In einer Variante der vorliegenden Erfindung sind transgene Pflanze umfaßt, in denen die erfindungsgemäße Nukleotidsequenz in ca. 2-100, bevorzugt ca. 5-50 und besonders bevorzugt ca. 2-15 Kopien vorliegt.

Ferner ist auch eine transgene Pflanze Gegenstand der vorliegenden Erfindung, enthaltend im Vergleich zu einer nicht genetisch veränderten Pflanze ein Ca²⁺- bindendes EF-hand-Protein der eingangs erläuterten Art oder Allele davon in erhöhter Konzentration. Die erhöhte Konzentration beruht dabei u. a. auf einer etwa 10- bis 100-fach gesteigerten Expression des für das Ca²⁺-bindende EF-hand-Protein kodierenden Gens.

Die transgene Pflanze zeichnet sich erfindungsgemäß dadurch aus, daß ihre Resistenz gegenüber Pathogenen im Vergleich zu einer genetisch nicht veränderten Pflanze um 20 bis 100%, bevorzugt 50 bis 80% und besonders bevorzugt um 50 bis 60% erhöht ist.

D. h. das in der erfindungsgemäßen transgenen Pflanze die Penetrationsfrequenz von Pathogenen um 20 bis 100%, bevorzugt 50 bis 80% und besonders bevorzugt um 50 bis 60% reduziert ist.

Eine Funktion von Bci-4 bei der Resistenz gegenüber Blumeria graminis f. sp. hordei konnte durch die Überexpression des Bci-4 Gens in Gerstenepidermiszellen nachgewiesen werden. Die Penetrationsrate attackierter Epidermiszellen durch den Pilz wurde in transformierten Zellen in fünf von sechs Experimenten um 20 bzw. 50% reduziert (s. Fig. 1). Da die Coexpressionsrate von Reportergen und Testgen bei 70% liegt, wird der Einfluss des Testgens prinzipiell unterschätzt (Schweizer et al. 1999). Zellen, die nur das Testgen enthalten, werden aufgrund fehlender Markierung nicht ausgewertet und ein Teil der Zellen, die ein Reportergen exprimaren, enthalten kein Testgen.

Die transgene Pflanze ist verstärkt gegenüber Mehltaupilzen resistent. Bevorzugt liegt eine gesteigerte Resistenz gegenüber den phytopathogenen Pilzen Blumeria graminis f. sp. hordei oder f, sp. tritici vor. Jedoch ist eine gesteigerte Resistenz gegenüber anderen Phytopathogenen nicht ausgeschlossen.

In einer vorteilhaften Variante der Erfindung ist die transgene Pflanze eine Nutzpflanze, bevorzugt eine monokotyledone Nutzpflanze. Besonders bevorzugt sind Gattungen von Gerste (Hordeum) oder Weizen (Triticum).

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch die Verwendung der erfindungsgemäßen Nukleotidsequenz zur Steigerung der Resistenz in Pflanzen. Dabei kann die isolierte Nukleotidsequenz auch als Markergen für das Phänomen der Induzierten Resistenz (cIR; chemisch induzierte Resistenz) in monokotyledonen Nutzpflanzen genutzt werden. Die vorliegende Erfindung umfaßt auch die Verwendung des Ca²⁺-bindenden EF-hand-Proteins kodiert durch eine Nukleotidsequenz der beschriebenen Art oder eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO. 2 zur Steigerung der Pathogenresistenz in Pflanzen.

Die vorliegende Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert, die jedoch nicht limitierend sind:

Allgemeine Methoden

Allgemeine DNA- und Klonierungstechniken, Sequenzierung, PCR, Northern-Blots, Western-Blots sowie die Kultivierung von Mikroorganismen sind gängige Labormethoden und u. a. in Sambrook et al. (Molecular cloning. A laboratory manual (1989) Cold Spring Harbour Laboratory Press) beschrieben.

Die Behandlung von Pflanzenmaterial ist ebenfalls gängige Laborpraxis und u. a. in Beßer et al., 2000 beschrieben.

Pflanzenmaterial

Es wurden Gerstenpflanzen (Hordeum vulgare L.) der Sorten (cv.) Ingrid, Manchuria, Pallas und Golden Promise und Weizenpflanzen (Triticum aestivum L.) cv. Kanzler verwendet. Die Gerstensorte Ingrid stammt von James McKey, University of Uppsala, Schweden. Die Sorte Pallas wurde von Lisa Munk, Department of Plant Pathology, Royal Veterinary and Agricultural University, Kopenhagen, Dänemark zur Verfügung gestellt. Die sechszeilige Wintergerste cv. Manchuria, die kein bekanntes Resistenzgen gegen Echten Mehltau besitzt, wurde vom Institut für Biometrie, JLU Gießen, bereitgestellt. Der Winterweichweizen cv. Kanzler, ebenfalls ohne bekanntes Resistenzgen gegen Echten Mehltau, wurde von der Saatzucht Engelen-Büchling oHG, Büchlingen/Oberschneiding, bezogen. Weitere Angaben zu Weizensorten sind bei Breown, J. K. M. et al. (1991) beschrieben. Die vorliegende Erfindung ist jedoch nicht auf das zuvor genannte Pflanzenmaterial beschränkt.

Das 12-36 h im Dunkeln auf feuchtem Filterpapier vorgekeimte Saatgut wurde, wenn nicht anders beschrieben, zu je 5 Körnern an den Rand eines Vierkanttopfes (8 × 8 cm) in Fruhstorfer Erde vom Typ P ausgelegt, mit Erde bedeckt und regelmäßig mit Leitungswasser gegossen. Alle Pflanzen wurden in Klimaschränken oder -kammern bei 16-18°C, 50-60% relativer Luftfeuchte und einer Lichtperiode von 16 h mit 3000 bzw. 5000 lux (50 bzw. 60 µE s^-1 m^-2) 5-8 Tage lang kultiviert und im Keimlingsstadium in den Versuchen verwendet. Bei Experimenten, in denen Applikationen an Primärblättern durchgeführt wurden, waren diese vollständig entwickelt.

Pflanzen, die bis zur Entwicklung von Ähren kultiviert werden sollten, wurden einzeln in Fruhstorfer Erde LD 80 getopft, regelmäßig gegossen, bei Bedarf in größere Töpfe umgetopft und im Gewächshaus zusätzlich beleuchtet.

Für die Untersuchung verschiedener Blattgewebe wurde zu verschiedenen Erntezeitpunkten die Epidermis der abaxialen Blattspreite von Gerstenprimärblättem abgezogen und getrennt vom restlichen Blattgewebe (Mesophyll und Epidermis der adaxialen Blattspreite) in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei -70°C aufbewahrt.

Pathogene und Schädlinge Blumeria graminis

Für die Inokulation von Gerstenpflanzen mit dem Echten Gerstenmehltaupilz wurden Konidiosporen von Blumeria [syn Erysiphe] graminis f. sp. hordei Speer der Rasse A6 (BghA6) verwendet. BghA6 (Kølster et al. 1986) wurde vom Institut für Biometrie, JLU Gießen zur Verfügung gestellt. Die Nachzucht des Inokulums erfolgte in Klimakammern bei gleichen Bedingungen, wie für die Pflanzenanzucht beschrieben, durch Übertragung der Konidien von befallenem Pflanzenmaterial auf regelmäßig angezogene, sieben Tage alte Gerstenpflanzen cv. Golden Promise.

Für die Inokulation mit dem Echten Weizenmehltaupilz wurden Konidien von Blumeria graminis f. sp. tritici Speer (Bgt) verwendet. Bei Bgt handelte es sich um ein Feldisolat aus Aachen, das vom IPAZ Gießen, von Weizen isoliert und dem Institut zur Verfügung gestellt wurde. In Klimakammern bzw. -schränken wurde das Isolat unter den in 2.1 genannten Bedingungen auf Weizen cv. Kanzler erhalten.

Behandlung des Pflanzenmaterials Inokulation Blumeria graminis

Primärblätter sieben Tage alter Keimlinge wurden durch Abschütteln der Konidien befallener Pflanzen in einem Inokulationsturm mit 1-8 Konidien mm² von BghA6 oder Bgt (Feldisolat) inokuliert und in Klimaschränken bzw. -kammern inkubiert. Bei Versuchen, in denen die Mehltaukolonien zur Bestimmung der Befallsdichte ausgezählt werden sollten, wurden die Primärblätter vor der Inokulation mit der adaxialen Seite nach oben mit Hilfe von Klebestreifen auf Tabletts fixiert. Mit Kontrollpflanzen wurde bis auf das Abschütteln von Sporen ebenso verfahren (mock[Schein]-Behandlung). Zur Auswertung 6-7 dpi (days post inoculation) wurden Segmente inokulierter und mock-behandelter Primärblätter auf 0,5%igen Wasseragar mit 20 mg L^-1 Benzimidazol gelegt.

Zur Überprüfung einer resistenzinduzierenden Wirkung verschiedener Behandlungen wurden die Keimlinge zu unterschiedlichen Zeitpunkten nach der Behandlung mit 1-8 Konidien mm^-2 von Bgh inokuliert und in Klimaschränken bzw. -kammern inkubiert.

Applikation chemischer Resistenzinduktoren

Alle Behandlungen mit chemischen Resistenzinduktoren wurden, wenn nicht anders beschrieben, bei Gerste an 5-8 Tage alten Keimlingen durchgeführt. Behandelte Pflanzen (je 5 in einem Topf) wurden in Klimaschränken oder -kammern weiter kultiviert.

2,6-Dichlorisonikotinsäure (DCINA, CGA41396, Ciba-Geigy, jetzt Syngenta, Basel, Schweiz) wurde als Formulierung von 25% aktiver Substanz mit wettable powder (WP) oder nach Vorlösen der Reinsubstanz mit Dimethylformamid (DMF) in wässriger Lösung (1% DMF) mit NaOH auf pH 7 eingestellt und in Konzentrationen von 5 und 10 mg L^-1 (entspricht 0,02 bzw. 0,04 mM) bezogen auf das Bodenvolumen über den Boden appliziert. Kontrollpflanzen wurden mit WP- oder 1%iger DMF- Lösung gegossen.

Benzo(1,2,3)thiadiazol-7-carbothionsäure-S-methylester (BTH, auch Azibenzolar-S- methyl, CGA245704, Bion®, Ciba-Geigy, jetzt Syngenta, Basel, Schweiz) wurde als Formulierung von 50% aktiver Substanz mit WP in Wasser in Konzentrationen von 63, 100, 125 und 250 mg L^-1 (entspricht 0,3, 0,48, 0,6 bzw. 1,2 mM) gesprüht, bis die Blätter gleichmäßig von feinen Tröpfchen bedeckt waren. Eine Bodenapplikation erfolgte in Konzentrationen von 20 und 50 mg L^-1 (entspricht 0,095 bzw. 0,24 mM) bezogen auf das Bodenvolumen. Kontrollpflanzen wurden entsprechend mit WP- Lösung behandelt.

Salicylsäure (SA) wurde direkt in Wasser gelöst oder nach Vorlösen in DMF in wässriger Lösung (1% DMF) mit NaOH auf pH 6-7 eingestellt und in Konzentrationen von 50 und 100 mg L^-1 (entspricht 0,36 bzw. 0,72 mM) bezogen auf das Bodenvolumen über den Boden appliziert. Kontrollpflanzen wurden mit Wasser oder 1%iger DMF-Lösung gegossen.

Applikation von Phytohormonen

Behandlung mit Jasmonsäuremethylester (JM) erfolgte in Glaspetrischalen durch "Floaten" von Primärblättern sieben Tage alter Pflanzen auf einer Lösung von 45 µM JM in Klimakammern. Kontrollblätter wurden auf Wasser "gefloatet".

Abscisinsäure (ABA) wurde durch Sprühen einer wässrigen Lösung von 50 µM auf sieben Tage alte Keimlinge appliziert, bis sie gleichmäßig von feinen Tröpfchen bedeckt waren. Kontrollpflanzen wurden mit Wasser besprüht. Behandelte Pflanzen wurden in Klimakammern inkubiert.

Primärblätter sieben Tage alter Pflanzen wurden auf angefeuchtetem Filterpapier in gasdichten Erlenmeyerkolben mit Ethylengas in Konzentrationen von 0,001, 1, 10 und 100 µL L^-1 (entspricht 0,028, 28, 280 bzw. 2800 µM) im Klimaschrank inkubiert. Kontrollblätter wurden mit Luft begast. Nach dieser Behandlung erfolgte keine Expression von Bci-4.

Applikation von Sorbit

Durch "Floaten" von Primärblättern sieben Tage alter Keimlinge auf 1 M Sorbit- Lösung kann über den dabei entstehenden osmotischen Stress der endogene Jasmonatgehalt in Gerste erhöht werden (Lehmann et al. 1995). Zur Überprüfung des erhöhten Jasmonatgehaltes behandelter Blätter wurde die Genexpression von Jip-23 (jasmonatinduziertes Protein 23, Ortet et al. 1999; Hause et al. 1999) in Gelblot Analysen nachgewiesen. Die entsprechende Sonde wurde vom Institut für Pflanzenbiochemie, Halle, zur Verfügung gestellt. Kontrollblätter wurden unter sonst gleichen Bedingungen in Klimakammern auf Wasser "gefloatet". Nach dieser Behandlung erfolgte keine Expression von Bci-4.

Verwundung

Eine Verwundung wurde durch Perforation der Primärblätter sieben Tage alter Pflanzen mit 15 Nadeln cm^-2 erreicht. Kontrollpflanzen blieben unverletzt und wurden zusammen mit den Verwundeten im Klimaschrank weiter kultiviert. Nach dieser Behandlung erfolgte keine Expression von Bci-4.

Erzeugung einer subtrahierten cDNA Bank

Zur Erzeugung dieser cDNA-Bank wurden fünf Tage alte Gerstenpflanzen der Mutante A89 (Beßer et al., 2000) mit 5 mg L^-1 DCINA bezogen auf das Bodenvolumen bzw. mit WP als Kontrolle begossen. Aus den Primärblättern wurde nach 12, 24 und 48 h Gesamt-RNA nach Dudler et al. (1991) extrahiert und jeweils gleiche RNA-Mengen von DCINA- bzw. WP-Proben der verschiedenen Erntezeitpunkte vereinigt. Nach Isolierung von poly(A)⁺-RNA mit Hilfe des Dynabeads mRNA Puriflcation Kit (Dynal, Hamburg) und reverser Transkription der mRNA wurde eine suppressive Subtrakionshybridisierung (SSH, Diatchenko et al. 1996) durchgeführt (PCR-Select™ cDNA Subtraction Kit, Clontech, Heidelberg). Dabei wurde doppelsträngige cDNA von nicht-induzierten Kontrollpflanzen mit der DCINA-induzierter Pflanzen nach Rsal-Restriktionsverdau und Adapterligation hybridisiert. Die cDNA-Fragmente differentiell exprimierter Gene standen dann für eine nachfolgende Suppressions-PCR als template zur Verfügung, in der sie unter Angleichung der Anzahl selten und häufig vorhandener Fragmente angereichert wurden. Die so gewonnenen PCR-Produkte subtrahierter cDNA-Fragmente wurden über T/A-Klonierung in pTAdv-Vektoren ligiert und in TOP 10F' E. coli-Zellen transformiert (Clontech, Heidelberg). In der anschließenden Blau/Weiss-Selektion (α- Komplementierung defekter β-Galactosidase, Sambrook et al. 1989) wurden insgesamt 1680 Bakterienkolonien mit integrierten cDNA-Fragmenten identifiziert und nach vierstündigem Schütteln bei 37°C in LB-Medium mit Ampicillin und 10% Dimethylsulfoxid (DMSO) bei -20°C gelagert.

Identifizierung differentiell exprimierter Gene Kolonie-PCR

Die einzelnen Klone der subtrahierten cDNA-Bank wurden zunächst auf die Größe der inserierten cDNA-Fragmente hin überprüft. Dazu wurde eine Kolonie-PCR mit Primern (nested 1 und nested 2R) durchgeführt, die komplementär zu der Sequenz der Adapter sind, die an die Rsa/-geschnittenen cDNA-Fragmente ligiert wurden, und somit den inserierten Bereich direkt flankieren. Jeweils 5 µL der Bakterienkulturen wurden in 15 µL A, bidest. 5 min bei 98°C denaturiert und 10 µL der denaturierten Kultur zu 20 µL PCR-Mix pipettiert. Die Amplifikation erfolgte dann in 1 × PCR-Puffer (Silverstar, Eurogentec, Heidelberg) mit 1,5 mM MgCl₂, je 0,2 mM dNTP, je 0,4 µM Primer (s. u.) und 0,5 u Taq-Polymerase (Silverstar, Eurogentec, Heidelberg) als Endkonzentration im PCR-Ansatz (30 µL). Der Temperaturzyklus der Amplifikation verlief in einem Thermocycler (Perkin Eimer 9700):

Der komplette PCR-Ansatz wurde anschließend mit 7,5 µL 5 × DNA-Auftragspuffer versetzt, wovon 10 µL im 1,5%igen Agarosegel mit Ethidiumbromid (0,16 µg mL^-1) in 1x TBE-Puffer gelelektrophoretisch aufgetrennt wurden. Als Größenstandard diente ein 1 kb⁺-Marker (Invitrogen, Groningen, Niederlande). Bei Vorhandensein eines inserts ≥ 100 bp Größe wurde die Kultur mit einem sterilen Zahnstocher zur Erhaltung auf LB-Agarplatten mit Ampicillin übertragen und über Nacht bei 37°C inkubiert.

Die cDNA-Fragmente wurden z. T. nachträglich entweder in pCR®II-TOPO-Vektor umkloniert und in TOP10 one shot ZelIen nach Herstellerangaben transformiert (TOPO TA Cloning Kit Dual F'romoter, Invitrogen, Groningen, Niederlande), oder in pGEM-T-Vektor (Promega, Mannheim) kloniert und in DH5α-Zellen (Clontech, Heidelberg) transformiert. Dazu wurde eine Kolonie-PCR-Reaktion (mit nested 1/2R- Primern, s. o.) durchgeführt, die PCR-Produkte im Agarosegel aufgetrennt (s. o.), aus dem Gel eluiert (Quiaquick Gel Extraction Kit, Qiagen, Hilden), laut Herstellerangaben in den entsprechenden Vektor ligiert und in E. coli-Zellen transformiert.

Erzeugung eines full length-Klons

Ausgehend von dem ursprünglich in der SSH identifizierten cDNA-Fragment wurden die Enden des Gens in 5'- und 3'-Richtung mittels RACE (rapid amplification of cDNA ends) entsprechend der Herstellerangaben des Marathon cDNA Amplifrcation Kit (Clontech, Heidelberg) erzeugt. Die Methode beruht darauf, dass eine cDNA-Bank durch reverse Transkription aus RNA erstellt wird. An die Enden der möglichst vollständigen cDNAs werden Adapter ligiert, zu denen komplementäre Primer existieren. Ausgehend von dem bekannten cDNA-Fragment wird für jede Richtung (3'- und 5'-Ende) ein Primer abgeleitet, der bei einer Amplifikation in die entsprechende Richtung verlängert wird. In hot start PCR-Ansätzen mit jeweils einem nach außen gerichteten genspezifischen und einem Adapter-Primer (AP) sollen dann die Enden der cDNAs hergestellt werden. Es wurden 5 µL der verdünnten adapterligierten cDNA-Bank mit je 0,2 mM dNTP, 0,2 µM AP1, je 0,2 µM genspezifische sense- oder antisense-Primer und 1 × Advantage cDNA Polymerase PCR Mix in 1 × cDNA PCR Reaction Buffer (Clontech, Heidelberg) für die touch down PCR angesetzt:

Die PCR-Produkte wurden nach gelelektrophoretischer Trennung aus dem 1 × TBE- Agarosegel mit Ethidiumbromid extrahiert, gemäß Herstellerangaben in den pGEM- T-Vektor ligiert (Promega, Mannheim), in DH₅α-Zellen (Clontech, Heidelberg) transformiert, und vom Plasmid sequenziert. Aus den Sequenzinformationen wurde ein mögliches offenes Leseraster für die Aminosäuresequenz (open reading frame, ORF) abgeleitet.

Mit Hilfe genspezifischer Primer, die den kompletten ORF umspannten und an ihren 5'-Enden Schnittstellen für Restriktionsenzyme (5'-BamHI, 3'-HindIII) enthielten, wurde eine unabhängige RT-PCR (SuperScript™ One-Step™ RT-PCR System, GibcoBRL™ Life Technologies™, Karlsruhe) mit 500 ng RNA von BTH-induzierten Pflanzen (250 mg L^-1 gesprüht, 24 hpt) als template, je 0,2 µM sense- und antisense-

Primer (s. u.) und 0,5 µl RT/Taq Mix in 1 × Reaction Mix (GibcoBRL™ Life Technologies™, Karlsruhe) durchgeführt:

Die Produkte wurden nach Gelextraktion und A-tailing kloniert, transformiert und die Sequenz überprüft.

Herstellung von Antikörpern

Zur Gewinnung von Antikörpern wird das rekombinante Protein eines auf Transkriptebene chemisch induzierbaren Gens (Bci-4) in einem heterologen bakteriellen Expressionssystem synthetisiert. Die rekombinante Proteinexpression wurde mit Hilfe des QIAexpress system Type IV nach Herstellerangaben (The QIAexpressionist™, 3^rd edition, Qiagen, Hilden) durchgeführt. Der verwendete Vektor pQE 30 besitzt am 5'-Ende vor der multiple cloning site (MCS) eine Sequenz, die für sechs aufeinanderfolgende N-terminale Histidin-Reste kodiert (6 × His-tag), mit deren Hilfe das synthetisierte Protein anschließend aufgereinigt werden kann.

Übertragung des chemisch induzierbaren Gens (Bci-4) in monocotyledone Pflanzen

Die (stabile) Übertragung einer Gens in Getreide ist Stand der Technik und u. a. bei Repellin et al. (Plant Cell, Tissue and Organ Culture 64, 159-183, 2001) beschrieben.

Transiente Überexpression von Bci-4 in Gerstenblättern

In einem von Schweizer et al. (1999) auf der Grundlage erster transienter Expressionssysteme in Gerste (Nelson & Bushnell 1997, Shirasu et al. 1999) entwickelten transienten Transformationssystems zur Überprüfung einer Genfunktion im Pathosystem Gerste - Echter Gerstenmehltau wurde der Einfluss von BCI-4 auf die Interaktion mit Bgh untersucht. Primärblattsegmente suszeptibler Gerstenpflanzen cv. Pallas, Golden Promise und Ingrid wurden mit dem ORF von Bci-4 und einem Reportergen (UidA für β-Glucuronidase [GUS] oder GFP, für das grün fluoreszierende Protein [GFP]) cotransformiert (Schweizer et al. 1999). insgesamt erfolgte in je drei Versuchen eine Cotransformation durch Partikelbeschuss von Bci-4 mit UidA bzw. GFP. Für Bci-4 wurden Konstrukte mit ORF1 (open reading frame mit Startcodon) und ORF2 (open reading frame ohne erstes Startcodon) in pGY1 hergestellt, so dass einmal das funktionale Protein (ORF1), und einmal ein verkürztes Protein (ORF2, kein Signalpeptid, EF-hand Motiv direkt N-terminal) entstehen konnte. Vier Stunden nach Beschuss der Blattsegmente wurden diese mit BghA6 dicht inokuliert und für 48 h bei Raumtemperatur inkubiert. Die Interaktionen der transformierten Epidermiszellen wurden bei Coexpression von GFP anschließend in vivo unter Fluoreszenzanregung mikroskopisch ausgewertet. Mit β-Glucuronidase cotransformierte Blätter wurden mit einer Substratlösung (x- gluc) inkubiert, anschließend entfärbt und danach im Durchlicht mikroskopiert. In Fig. 1 ist die mikroskopische Auswertung des Einflusses der Überexpression von Bci-4 auf die Interaktion von Gerste mit dem Echten Mehltaupilz dargestellt. Es wurden erfolgreiche und abgestoppte Penetrationsereignisse an transformierten Epidermiszellen nach Beschuss mit Bci-4 (plus Reporter) im Vergleich zu Beschuss des Reporterkonstruktes alleine (Kontrolle) ausgezählt. In den Photos auf der rechten Seite (Fig. 1b, 1c) ist jeweils ein erfolgreiches Penetrationsereignis abgebildet, in dem es dem Pilz gelingt, ein Haustorium in einer transformierten Epidermiszelle zu etablieren und daraufhin sekundäres Mycel (elongating secondary hyphae, ESH) auszubilden. Die grünblaue Färbung der transformierten Zellen erfolgte aufgrund der Umsetzung des Substrates xgluc durch die coexprimierte β- Glucuronidase. Das Haustorium ist ebenfalls deutlich grünblau gefärbt, da es von einer extrahaustorialen Matrix umgeben ist, die aus der Plasmamembran der Wirtszelle gebildet und vom Cytoplasmasaum der Epidermiszelle, in dem der Farbstoff akkumuliert, umgeben wird. In der auf der linken Seite abgebildeten Interaktion (Fig. 1Aa) wurde das Eindringen des Pilzes durch die Bildung einer effektiven Papille verhindert, der Penetrationsversuch wurde abgestoppt und der Pilz war nicht in der Lage, sich weiter auf der Blattoberfläche auszubreiten. Aus Fig. 1B geht hervor, dass die Überexpression von Bci-4 die Penetrationsfrequenz von Bgh reduziert. In den Versuchen mit den Gerstensorten cv. Pallas und Golden Promise (Fig. 1[1] und 1[2]) reduzierte die Akkumulation des funktionalen Proteins BCI-4 (ORF1) bei Coexpression von β-Glucuronidase (GUS) die Anzahl der erfolgreich etablierten Haustorien durch verstärkte Abwehrreaktionen der attackierten Zellen (Papillenbildung) um ca. 50% im Vergleich zur Kontrolle (Expression von β- Glucuronidase). In drei Experimenten mit cv. Ingrid (Fig. 1[3]-[5]) wurde die Penetrationsrate durch Bci-4 (ORF1) jeweils um ca. 20% im Vergleich zur Kontrolle (Expression von β-Glucuronidase, GUS [3] oder grün fluoreszierendem Protein, GFP [4] und [5]) reduziert. In einem Versuch blieb der Anteil abgewehrter Pilzattacken unverändert (Fig. 1[6]). Die Überexpression des um das Signalpeptid verkürzten BCI-4-Proteins (ORF2) wurde in einem Experiment mit untersucht (Fig. 1[5]), hatte jedoch keinen Einfluss auf die Interaktion von Gerste cv. Ingrid mit Bgh. In der Beschreibung zitierte Literatur Beßer, K., Jarosch, B., Langen, G., Kogel K. H. (2000) Expression analysis of genes induced in barley after chemical activation reveals distinet disease resistance pathways. Mol. Plant. Pathol., 1: 277-86.
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Beschreibung zu den Figuren

Fig. 1: Einfluss von Bci-4 auf die Interaktion von Gerste mit Bgh.

In Primärblattsegmenten von Gerstenpflanzen cv. Pallas (1), Golden Promise (2) und Ingrid (3-6) wurde BCI-4 (ORF1) und ein am N-Terminus verkürztes BCI-4-Protein (ORF2*) jeweils mit einem Reporterprotein (β-Glucuronidase: GUS oder das grün fluoreszierende Protein: GFP), bzw. ein Reporterkonstrukt alleine als Kontrolle exprimiert. Die transiente Transformation von Epidermiszelten wurde in sechs unabhängigen Experimenten (1-6) mittels Partikelbeschuss intakter Blätter durchgeführt. Die Auswertung der Interaktionsstellen von Pilz und transformierten Zellen erfolgte 48 hpi nach Inokulation mit BghA6 (Schweizer et al. 1999). Die Anzahl der Interaktionsstellen mit effektiver Papillenbildung (abgewehrter Penetrationsversuch) und mit Ausbildung eines Haustoriums bzw. Sekundärmycel (ESH) wurde im Vergleich zu Kontrolltransformationen (Expression von Reportergen alleine) ausgewertet (30-70 Interaktionstellen pro Säule). Die Penetrationsrate gibt das Verhältnis von etablierten Haustorien zu untersuchten Interaktionsstellen in % an. SEQUENCE LISTING

Claims

1. Isolierte Nukleotidsequenz, kodierend für ein Ca²⁺-bindendes EF-hand-Protein, deren Überexpression in Pflanzen eine erhöhte Krankheitsresistenz bewirkt, ausgewählt aus

a) einer Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID No. 1,

b) einer Nukleotidsequenz, die eine wenigstens 75%ige Identität mit der in SEQ ID No. 1 gezeigten Nukleotidsequenz,

c) einer mit a) und b) hybridisierenden Nukleotidsequenz,

d) einer zu a), b) oder c) komplementären Nukleotidsequenz.

2. Isolierte Nukleotidsequenz gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie aus Hordeum stammt.

3. Isolierte Nukleotidsequenz gemäß einem der Ansprüche 2 oder 3, deren um den Faktor von etwa 10- bis 100-fach gesteigerte Expression in Pflanzen eine gesteigerte Resistenz gegenüber Pathogenen bewirkt.

4. Ca²⁺-bindendes EF-hand-Protein kodiert durch eine Nukleotidsequenz gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3 oder eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO. 2, dadurch gekennzeichnet, daß eine erhöhte Konzentration in Pflanzen eine gesteigerte Resistenz gegenüber Pathogenen bewirkt.

5. Ca²⁺-bindendes EF-hand-Protein gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß es bei verstärkter Expression in Pflanzen die Resistenz gegenüber Pathogenen um etwa 20 bis 90%, bevorzugt um etwa 50 bis 80%, besonders bevorzugt um 70% steigert.

6. Ca²⁺-bindendes EF-hand-Protein gemäß einem der Ansprüche 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, daß es in Pflanzen eine erhöhte Resistenz gegenüber biotrophen Pilzen bewirkt.

7. Ca²⁺-bindendes EF-hand-Protein gemäß einem der Ansprüche 4 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß es eine erhöhte Resistenz gegenüber Mehltaupilzen, bevorzugt Blumeria graminis f. sp. hordei oder f. sp. tritici bewirkt.

8. Genstruktur enthaltend wenigstens den kodierenden Bereich der isolierten Nukleotidsequenz gemäß Anspruch 1 sowie damit operativ verknüpfte regulatorische Nukleotidsequenzen.

9. Vektor enthaltend wenigstens eine Nukleotidsequenz gemäß Anspruch 1 oder ein Genkonstrukt gemäß Anspruch 8 sowie zusätzliche Nukleotidsequenzen zur Selektion und/oder zur Replikation in der Wirtszelle und/oder zur Integration in das Wirtszell-Genom.

10. Transgene Pflanze und deren Nachkommen mit erhöhter Krankheitsresistenz im Vergleich zu einer nicht genetisch veränderten Pflanze, enthaltend in replizierbarer Form und erhöhter Kopienzahl eine Nukleotidsequenz gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3 und/oder eine Genstruktur gemäß Anspruch 8 und/oder einen Vektor gemäß Anspruch 9.

11. Transgene Pflanze gemäß Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleotidsequenz kodierend für ein Ca²⁺-bindendes EF-hand-Protein extrachromosomal vorliegt und/oder stabil in das pflanzliche Genom integriert ist.

12. Transgene Pflanze gemäß einem der Ansprüche 10 oder 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleotidsequenz in 2-100, bevorzugt 5-50 und besonders bevorzugt 2-15 Kopien vorliegt.

13. Transgene Pflanze gemäß einem der Ansprüche 10 bis 12, enthaltend im Vergleich zu einer nicht genetisch veränderten Pflanze ein Ca²⁺-bindendes EF- hand-Protein gemäß einem der Ansprüche 4 bis 7 kodiert durch eine Nukleoitdsequenz gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3 in erhöhter Konzentration.

14. Transgene Pflanze gemäß einem der Ansprüche 10 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß ihre Resistenz gegenüber Pathogenen im Vergleich zu einer genetisch nicht veränderten Pflanze um etwa 20 bis 100%, bevorzugt etwa 50 bis 80% und besonders bevorzugt um etwa 50 bis 60% erhöht ist.

15. Transgene Pflanze gemäß einem der Ansprüche 10 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß die Penetrationsfrequenz von Pathogenen um ca. 20 bis 100%, bevorzugt um ca. 50 bis 80% und besonders bevorzugt um ca. 50 bis 60% reduziert ist.

16. Transgene Pflanze gemäß einem der Ansprüche 10 bis 15; dadurch gekennzeichnet, daß sie verstärkt gegenüber biotrophen Pilzen resistent ist.

17. Transgene Pflanze gemäß einem der Ansprüche 10 bis 16, dadurch gekennzeichnet, daß sie verstärkt gegenüber Mehltaupilzen, bevorzugt Blumeria graminis f. sp. hordei oder f. sp. tritici resistent ist.

18. Transgene Pflanze gemäß einem der Ansprüche 10 bis 17, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine Nutzpflanze ist.

19. Transgene Pflanze gemäß einem der Ansprüche 10 bis 18, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine monokotyledone Pflanze, bevorzugt der Gattung Hordeum oder Triticum ist.

20. Verfahren zur Steigerung der Pathogenresistenz in Pflanzen, dadurch gekennzeichnet, daß eine Nukleotidsequenz gemäß Anspruch 1 kodierend für ein Ca²⁺-bindendes EF-hand-Protein gemäß einem der Ansprüche 4 bis 7 und/oder ein Genkonstrukt gemäß Anspruch 8 und/oder ein Vektor gemäß Anspruch 9 in replizierbarer Form in ganze Pflanzen, Pflanzenteile und/oder Pflanzenzellen übertragen, im Vergleich zu einer nicht-transformierten Pflanze in erhöhter Kopienzahl repliziert und das kodierte Ca²⁺-bindende EF-hand-Protein in erhöhter Konzentration zur Expression gebracht wird.

21. Verfahren gemäß Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleotidsequenz kodierend für ein Ca²⁺-bindendes EF-hand-Protein in eine monokotyledone Pflanze übertragen wird.

22. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 20 oder 21, dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleotidsequenz kodierend für ein Ca²⁺-bindendes EF-hand-Protein in eine Pflanze der Gattung Hordeum oder Triticum übertragen wird.

23. Verwendung der isolierten Nukleotidsequenz gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3 zur Steigerung der Krankheitsresistenz in Pflanzen.

24. Verwendung der isolierten Nukleotidsequenz gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3 als Markergen für induzierte Resistenz in monokotyledonen Nutzpflanzen.

25. Verwendung des Ca²⁺-bindenden EF-hand-Proteins kodiert durch eine Nukleotidsequenz gemäß Anspruch 1 oder eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO. 2 zur Steigerung der Krankheitsresistenz in Pflanzen.