EP0927262A1 - Nematodenresistenzgen - Google Patents

Nematodenresistenzgen

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Publication number
EP0927262A1
EP0927262A1 EP97910308A EP97910308A EP0927262A1 EP 0927262 A1 EP0927262 A1 EP 0927262A1 EP 97910308 A EP97910308 A EP 97910308A EP 97910308 A EP97910308 A EP 97910308A EP 0927262 A1 EP0927262 A1 EP 0927262A1
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EP
European Patent Office
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nucleic acid
plants
resistance
gene
sequence
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP97910308A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Christian Jung
Michael Kleine
Daguang Cai
Johannes c/o A. Dieckmann Heimbg.Saatz. DIECKMANN
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Planta Angewandte Pflanzengenetik und Biotechnologie GmbH
Danisco Bioteknologi AS
DLO-Centrum voor Plantenveredelings- en Reproductie Onderzoek (CPRO-DLO)
Original Assignee
Planta Angewandte Pflanzengenetik und Biotechnologie GmbH
Danisco Bioteknologi AS
DLO-Centrum voor Plantenveredelings- en Reproductie Onderzoek (CPRO-DLO)
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Filing date
Publication date
Priority claimed from DE19700844A external-priority patent/DE19700844A1/de
Application filed by Planta Angewandte Pflanzengenetik und Biotechnologie GmbH, Danisco Bioteknologi AS, DLO-Centrum voor Plantenveredelings- en Reproductie Onderzoek (CPRO-DLO) filed Critical Planta Angewandte Pflanzengenetik und Biotechnologie GmbH
Publication of EP0927262A1 publication Critical patent/EP0927262A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
    • C12N15/8222—Developmentally regulated expression systems, tissue, organ specific, temporal or spatial regulation
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    • C12N15/8227—Root-specific
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    • C12N15/8279—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance
    • C12N15/8285—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance for nematode resistance
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
    • Y02A40/10—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in agriculture
    • Y02A40/146—Genetically Modified [GMO] plants, e.g. transgenic plants

Definitions

  • the present invention relates to a nucleic acid which induces resistance to sedentary nematodes in plants, preferably the families of the Solanaceae and / or C enopodiaceae and / or the Brassicaceae, particularly preferably of the genus Beta and / or Brassica and / or Solarrum.
  • the present invention also relates to the DNA sequence of a cDNA clone and a genomic clone of this nucleic acid.
  • the present invention further relates to a vector which e.g. an yeast artificial chromosome ("YAC") which contains the nucleic acid for resistance to sedentary nematodes in plants.
  • YAC yeast artificial chromosome
  • the present invention relates to the use of the nucleic acid or the vector for inducing resistance to sedentary nematodes in plants and to a transgenic plant which contains the nucleic acid or the vector.
  • the invention further relates to the protein encoded by the nucleic acid, a test kit containing the nucleic acid and / or the vector, and a method of a transgenic plant and a method for producing nematode resistance in plants.
  • the invention relates to the promoter of the resistance gene.
  • Nematodes are important Rasites that cause damage of around DM 150 million per year in crops all over the world. Nematodes of the genera Meloidogyne, Heterodera and Globodera are particularly harmful. They permanently settle in the roots of the infected plant after they have induced certain nutritional structures.
  • the nematode Heterodera schachtii has a broad host spectrum, which includes many types of different plant families, for example the Chenopodiaceae and Brassicaceae.
  • the life cycle of nematodes is divided into four larval stages (J1-J4).
  • the roots are infected by J2 juvenile stadiums, which migrate to the central cylinder, where they induce the development of syncytia.
  • These extensive nutritional structures result from partial cell wall degradation between the cells of the xylem parenchyma.
  • the nematode ends its adult life cycle after three stages.
  • the female nematodes swell and eventually destroy the root cortex while still feeding on the syncytia.
  • the male stages stop feeding after the end of the third stage and, when they grow up, move towards the female stages, which are attracted to them by sex pheromones.
  • the mature female stages are filled with eggs. After their death, they form a cyst in which the infectious larvae (J2) can survive in the earth for up to 10 years.
  • Nematode resistance genes are believed to elicit an incompatible host-parasite response that has been described at the cellular level.
  • the roots of plants that carry this gene (s) are affected by J2 juvenile stages, but most of the nematodes die in the late J2 stage due to the breakdown of the initiated syncytium. In rare cases you can female stages develop, but which show a transparent appearance and stop growing. In this way, the nematodes cannot complete their life cycle.
  • Beta genus e.g. sugar beet, fodder beet, chard, beetroot
  • Beta genus e.g. sugar beet, fodder beet, chard, beetroot
  • beet cyst nematode Heterodera schachtii It has been working for a long time to create resistance to Heterodera schachtii and other phytopathogenic nematodes (e.g. Globodera) in plants, especially crop plants, because they lack corresponding resistance genes.
  • the only sources of resistance are the wild species Beta procumbens and its close relatives B. webbiana and B. patellaris.
  • Genes for resistance to different types of nematodes are used for breeding in different types of crops (e.g. potato, tomato, wheat, oil radish).
  • a resistance gene from the wild species Beta procumbens was also transferred to the sugar beet by crossing the species. From this, resistant sugar beets could be selected, but they had the disadvantage that they were characterized by poor quality and performance properties.
  • the resistant sugar beet lines that resulted from crossing species with Beta procumbens have alternately large translocations from the wild beets of the Procumbentes section. Their low performance and reduced quality is probably due to the fact that in addition to the resistance gene there are other performance-altering genes from the wild species in these sugar beet lines. That too is Transmission of resistance to incomplete generations.
  • a further object according to the present invention was to enable the use of such a gene for inducing resistance to sedentary nematodes.
  • Figure 1 shows a Northern analysis of total RNA from leaves and roots.
  • Total RNA was isolated from leaves and roots of six week old plants that were either (1) infected or (2) uninfected. The full length 1832 cDNA was used as a probe. 20 ⁇ g of total RNA were separated in 1.3% agarose and transferred to nylon membranes. The filter was hybridized with the radiolabelled probe at 60 ° C. overnight and then washed for 2 ⁇ 30 min at 60 ° C. in 0.2 ⁇ SSC.
  • Chen gene allows cultivated plants to be grown which are resistant to sedentary nematodes.
  • Such resistant crop plants are of course far superior to their non-resistant relatives since they cannot be infected by nematodes and are therefore less susceptible to disease.
  • nucleic acid that bears the resistance to sedentary nematodes in plants it is also possible to obtain resistant plants which nevertheless have the same high quality and performance as other, non-resistant crop plants. This is due to the fact that a single nucleic acid, namely the nucleic acid for resistance to sedentary nematodes, is transferred into the plants, while in conventional breeding methods, besides the desired genes, other DNA sequences are also transferred, which may code for undesirable properties.
  • the nucleic acid which induces resistance to sedentary nematodes particularly preferably comprises a translated region which is at least 60% homologous to the sequence of the Hsl pro ⁇ gene from Beta procumbens. These include the homologous genes from Beta webbiana and Beta patellaris.
  • the HSl pro ⁇ gene from Beta procumbens bears resistance to sedentary nematodes in plants.
  • a 60% homology with the DNA sequence listed above is already sufficient to induce the desired property of resistance to sedentary nematodes in a plant which carries this nucleic acid.
  • Genes according to the invention can also be obtained by searching gene banks with the sequence 1832, and the hybridization conditions can be selected as follows:
  • Hybridization temperature 50 ° C, preferably 60 ° C, and washing the filter in 0.5 x SSC, preferably in 0.2 x SSC for 30 minutes, for example.
  • the nucleic acid which induces resistance to sedentary nematodes in plants and which comprises the following DNA sequence is particularly preferred:
  • nucleic acids which encode a protein which confers the same nematode resistance as the gene product encoded by nucleic acid No. 1832 above, preferably all of these gene products comprising the same amino acid sequence.
  • the nucleic acid is preferably a cDNA.
  • the nucleic acid which induces resistance to sedentary nematodes in plants is a genomic DNA which comprises the following DNA sequence:
  • the present invention comprises the sequence according to Seq.Id.No3. (also referred to as 1832A1).
  • nucleic acid that is obtainable by searching a DNA library with a DNA sequence as described above and that codes for nematode resistance, as demonstrated for clone 1832.
  • the nucleic acid preferably originates from a wild species of the Procumbentes section of the genus Beta.
  • the nucleic acid particularly preferably dissolves resistance to sedentary nematodes of the genera Meloidogyne. Heterodera and / or globodera. Induction of resistance to Heterodera schachtii in plants is very particularly preferred. Resistance to sedentary nematodes is particularly preferably induced in plants of the Beta vulcraris species.
  • nematode resistance When such a gene is introduced into the plants to be modified, only the property of nematode resistance is generally influenced. No pleotropic gene effects are to be expected. This means that the performance of the breeding material remains unaffected.
  • the transgenic plants that express the above gene show an incompatible reaction to cyst nematodes. It can be used for Breeding resistant varieties can be used. Since it is a natural resistance nucleic acid from wild species of the Procumbentes section of the genus Beta, no acceptance problems with regard to genetically modified plants are expected. Nematode-resistant varieties that have the above-mentioned gene can lead to an increase in the proportion of host cultures in the crop rotation.
  • HSI pro ⁇ sequence is not only active in plants of the genus Beta, but it is also capable of nematode resistance in plants of other genera, such as, for example, in Arabidopsis thaliana. to create.
  • Whether a sequence found has the potential to confer nematode resistance on a plant can be checked using conventional tests, as will be explained in more detail below, for example.
  • a vector particularly preferably an artificial yeast chromosome
  • yeast artificial chromosome YAC
  • YAC yeast artificial chromosome
  • the YAC can e.g. contain the following DNA sequence:
  • YACs A 60% homology to the nucleic acids contained in the YACs is sufficient to induce resistance in the plants.
  • Preferred YACs are the following: TABLE 1
  • resistance to nematodes of the genera Meloidogyne, Heterodera and / or Globodera is induced in plants. Resistance to Heterodera schachtii is particularly preferred.
  • Resistance to sedentary nematodes is preferably induced in plants of the Beta vulgaris species.
  • the invention further relates to the use of the nucleic acid or the vector, as described above, for inducing resistance to sedentary nematodes in plants.
  • the invention is also directed to a transgenic plant containing the nucleic acid or vector as described above.
  • the gene can be transformed into plants by transformation using standard methods either under the control of a constitutive promoter or under the control of the internal promoter, which is upstream of the translated sequence. be brought to the pression. This causes an incompatible reaction with the sedentary nematodes, in particular the cyan atode Heterodera schachtii.
  • the upstream promoter region of the gene comprising approximately 1500 nucleotides can be used for the root-specific expression of any genes in any plants. Promoters are included which are derived from the 5 'untranslated region of the HSl p o_ gene and show the same promoter activity as the HSl pro ⁇ gene promoter.
  • a preferred promoter is located within the Xbal fragment between nucleotide positions 1 and 1521 in sequence 1832.1. Also preferred are promoters which differ from the promoter mentioned by e.g. Derive insertions, deletions, substitutions and / or inversions and maintain the same promoter activity or even show stronger promoter activity. The presence of promoter activity can be determined using the customary methods, as explained below using the examples.
  • the 1832 promoter is activated in Arabidopsis thiana with the result that the sequence 1832, under the control of the promoter mentioned, causes resistance to Heterodera schachtii in this host.
  • the transgenic plant belongs to the Beta or Brassica genus.
  • the transgenic plant particularly preferably belongs to the Beta vulqaris species.
  • the invention is also directed to cells, seeds or parts of plants containing the nucleic acid or vector as described above.
  • the invention is directed to the protein encoded by the nucleic acid and to derivatives thereof with the same resistance-imparting properties.
  • the proteins according to the invention can be obtained by expression of the nucleic acid according to the invention in a suitable host such as bacteria, yeast, mammalian and plant cells.
  • the invention also relates to a test kit containing a nucleic acid or vector as described above or a protein as described above.
  • the invention further relates to a method for producing a plant, characterized in that a nucleic acid, as described above, is introduced into a plant cell and a plant is regenerated from the plant cell.
  • the present invention relates to a method for producing a nematode resistance in plants, which is characterized in that a nucleic acid, as described above, is introduced into a nematode-sensitive plant.
  • the invention also relates to a promoter which also controls the expression of the nucleic acid described above and which is characterized in that it is root-specific active.
  • the 5 'flanking region of the gene contains typical elements of eukaryotic promoters, such as the TATA box.
  • the promoter is obviously root-specific, because according to Northern analysis with leaf and root RNA only a signal with root RNA was found. This is also confirmed by experiments with transgenic potatoes using a fusion product from the 1832 promoter and the GUS gene have been transformed. There the roots showed a clear color reaction, which indicated activity of the 1832 promoter.
  • the 5 'region of the 1832 gene comprising 1521 nucleotides and derivatives thereof with corresponding promoter activity can thus be used for the expression of any genes, in particular in root tissues, of different plants.
  • Suitable derivatives are those which have at least 10% of the promoter activity of the 1832.1 sequence. Examples of use are the expression of genes for resistance to nematodes and resistance to other root-borne pathogens, and expression of genes which are involved in sucrose translocation and in general of genes which are involved in sucrose or inulin storage.
  • Derivatives of the promoter according to the invention are sequences which differ from the promoter of the 1832 gene e.g. by deletions, insertions, base changes etc., while maintaining the promoter properties of the 1832 gene promoter.
  • the invention relates to a primer for PCR, obtainable from sequence no. 1832.1.
  • a B. procumbens-specific satellite (pRK643) was cloned from one of the fragment addition lines. Southern analysis showed that all of the tested resistant lines were true of this satellite. gene, which indicated that it is distributed in the region of the genome of the wild species B. procumbens in which the gene is located. This marker was found to be helpful in identifying the translocation line with the smallest segment of the beet among a plurality of chromosomal mutants. This line was chosen for the positional cloning of the gene. The marker pRK643 co-segregated perfectly with resistance in a segregating F2 population of 241 individuals. Using this satellite arker as a probe, 3 clones were extracted from a YAC library of line A906001, which included the HSI pro ⁇ gene region.
  • a cDNA library was created from the roots of nematode-infected A906001 plants and screened with the three YACs, resulting in the isolation of three cDNA clones, numbers 1832, 1845 and 1859 leads.
  • Clone 1845 showed cross-hybridization with sugar beet DNA, while clone 1859 showed multiple band patterns with the DNA of both susceptible and resistant beets.
  • the further work concentrated on the cDNA 1832 because:
  • clone 1832 represented a beet-specific gene that is only expressed in roots and is stimulated after nematode infection.
  • Hair root cultures obtained by induction with Agrobacterium rhizogenes were obtained and used for the genetic complementation analysis.
  • the hair root cultures of the sugar beet proved to be a suitable substrate for root pathogens.
  • the compatible reaction of the susceptible as well as the incompatible reaction of the resistant roots to cyst nematodes is maintained in hair root cultures of the sugar beet.
  • a susceptible sugar beet line (No. 93161p) was transformed with the 1450 base pair (bp) cDNA 1832 using an A. rhizogenes-mediated gene transfer.
  • the genetic modification of the transformants was confirmed by GUS assay and DNA blot analysis.
  • the amino acid sequence of the predicted polypeptide can be divided into four different subdones.
  • a putative signal peptide domain A
  • a leucine-rich region domain C
  • LRR repeating leucine-rich units
  • LRRs of the HS1 pro ⁇ polypeptide are poorly conserved compared to the consensus sequence of the LRR consensus superfamily.
  • the leucine and aliphatic residues at positions 2, 5 and 16 are located in the same position as in the LRR superfamily consensus.
  • the highly conserved asparagine at position C is substituted with a leucine / isoleucine. This asparagine also falls within the consensus LRRs of the RPS2 polypeptide.
  • the hydrophobic domain of 17aa of the HSl pro ⁇ gene (domain F) indicates a transmembrane segment.
  • the C-terminal domain contains aa with positively charged residues and a putative N-glycosylation site.
  • the elicitor receptor model of the plant pathogenic interaction indicates that the products of the resistance genes act as specific receptors for pathogenic triggers according to the gene for gene hypothesis.
  • Sequence analysis of HS1 pro ⁇ indicates that it is involved in gene-for-gene resistance as part of a cascade of defense reactions.
  • the predicted polypeptide consists of imperfect LRRs located at the N-terminus with an additional signal peptide, a putative cross-membrane domain and a positively charged C-terminus, and thus fits into the second group of plant resistance genes.
  • HS1 pro_ and the resistance gene Cf-9 from the tomato could be predicted, although no significant sequence homology was found.
  • the ex- tracytoplasmic LRRs act as receptor-recognizing putative triggers.
  • Nematodes are known to produce secretions that can interact with membrane-bound plant receptors. The positively charged C-terminus may interact with the cytoplasmic components for signal transmission.
  • a protein located in the cytoplasm it can act as a receptor for triggers injected into the cell via the nematode's mouth prick.
  • An approx. 1.5 kb Xbal fragment was isolated from a lambda DASHII bank with a PCR fragment from the 5 'region of the HS1 pro ⁇ gene, which corresponds to the 5' flanking region of the gene and the sequence with the number 1832.1.
  • the isolated promoter sequence contains the typical elements of eukaryotic promoters, such as the TATA box with the sequence TACATAAA in position -23 before the start of transcription or the 5 'end of the cDNA.
  • the promoter identified is root-specific, since a signal with the sample from the 5 'region of the 1832 gene is found only in root tissue in Northern blots. Furthermore, constructs containing the promoter according to the invention and a GUS reporter gene exclusively show a color reaction in roots of transformed potatoes or tobacco.
  • the promoter can be induced by nematodes. This shows a comparison of the transcriptional activity of sugar beet roots infected and not infected with H. schachtii. This suggests that the promoter according to the invention binds transcription factors which originate from nematodes or which are formed as a result of the infection.
  • the cDNA 1832 was fused to the GUS intron gene (Vancanneyt et al. (1990) MGG, p. 245) and brought under the control of the 35S promoter.
  • the construct was introduced into Arabidopsis thaliana using the vector pAM194 (described below) by standard methods using Agrobacterium tumefaciens. After three generations of selfing, lines were obtained which showed complete resistance to Heterodera schachtii, i.e. no cysts or developed females were observed. The resistance test was carried out with infectious larvae in a petri dish. GUS activity was also determined.
  • the Xbal restriction fragment was used for the studies. Xbal positions at positions 1 and 1521 of the 1832.1 sequence) with the GUS intron gene fused and introduced into the root of sugar beets and potatoes using the vector pBIN19 and Agrobacterium tumefaciens / Agrobacerium rhizogenes co-transformation. It was observed in the sugar beet that in a "hairy root culture" the GUS activity was only detectable in the syncytium. A corresponding GUS activity was not visible in uninfected roots or in areas where there were no nematodes. This shows that the promoter used has a “pathogen-responsive” element or elements that are or are increasingly activated after attack by neododes. The 1832 promoter thus enables the tissue-specific expression of any genes in host plants, such as sugar beet.
  • Rapeseed cotyledons were transformed with a construct containing the sequence 1832 as described in Example 7 above.
  • the cotyledons were grown on MS nutrient medium, the selection on MS nutrient medium being carried out with the addition of carbenicillin.
  • the examination of the transformants showed positive results both in the GUS test and in the PCR analysis.
  • a variant of clone 1832 was identified which comprises an open reading frame in which the start codon with the ATG corresponds to position 924 of the 1832.1 sequence.
  • the stop codon corresponds to position 2397 in the sequence 1832.1.
  • the variant 1832A1 contains further minor differences compared to the sequence 1832.1, as can be seen from the sequence comparison.
  • all sequences, ie 1832.1, 1832 and 1832A1 after expression in host cells lead to resistance to nematode attack. Without being bound by theory, it can be assumed that the shorter of the sequences, namely 1832, encodes all elements which give the encoded protein the ability to induce resistance to nematodes.
  • Figure 3 shows schematically the coding capacity of the 3 clones 1832.1, 1832 and 1832A1 relative to each other. Section 1832 is common to all clones.
  • the binary vector pAM194 produced combines the properties of a cloning vector and a plant transformation vector (Ti plasmids).
  • Ti plasmids a plant transformation vector
  • the suitability as a transformation vector was tested together with Agrobacterium tumefaciens and in combination with Agrobacterium rhizogenes for co-transformation experiments.
  • the vector is a derivative of pBI121 (Jefferson et al. 1987) (Clontech Laboratories); the basic structure for pBI121 is provided by pBIN19 (Bevan et al. 1984).
  • pAM194 includes the following elements:
  • the fragment outside the edge sequences contains NPTII, as a selection arker;
  • the plasmid pBI121 was cut with HindIII / SstI.
  • the cleaved HindIII / SstI-35S-GUS fragment was replaced by a subcloned 35S-GUS intron fragment.
  • the EcoRI restriction site was destroyed by digging with EcoRI and filling in the protruding ends with "Klenowönt" from E. coli polymerase I; it was then ligated again to produce pBIN-GUSINT.
  • a 35S promoter-35S terminator cassette with a single EcoRI cloning site from plasmid pRT104 was cloned into the HindIII site of pBIN-GUS-INT, resulting in pAM194.
  • the references cited above are as follows:
  • Agrobacterium tumefaciens, strain EHA101 (Hood EE et al. 1986, J. Bacteriology 168, pp. 1291-1301), which was used with the plasmid LD10 / 1832-13 (FIGS. 5a to d) or with the vector LD10, was used for the transformation , a plasmid lacking the 1832 cDNA, was transformed by the freeze thaw method (Holters et al. 1978).
  • sterile sugar beet seeds of the type "Elite 0-272" were germinated on a medium containing 2.0 g / 1 sucrose and 4.0 g / 1 agarose. The seedlings were capped and the cotylidons were carefully removed and used as explants.
  • the Agrobacterium tumefaciens strain EHA101 with the plasmid LD10 / 1832-13, or the control with plasmid LDIO (FIG. 5c) was added to LB medium (Maniatis et al.
  • transgenic saplings The selection for transgenic saplings was carried out after a modification of the mannose selection system. The selection was made for transgenic sugar beet saplings. After the cultivation, the explants were supplemented with selection medium consisting of MS medium (Murashige & Skoog 1962)
  • the analysis of the mannose-resistant saplings was then carried out as follows. To ensure that the mannose-resistant saplings that survived the selection were transgenic, all saplings were examined for PMI activity. The non-transgenic sugar beet saplings show no PMI activity (Phosphomannosei.somerase). Extracts were made from 2-3 leaf tips with a size of approx. 3 mm and the coupled PMI enzyme assay, modified according to Feramisco et al. (1973) and Gill et al. (1986). About 80-90% of the saplings showed significant PMI activity. The remaining 10-20% were discarded.
  • the female cysts developed 3 weeks after the inoculation and were quantified using a stereomicroscope. The entire root of each plant was examined. The results obtained are shown in Table 1. This table shows the results obtained with the non-transgenic susceptible line Cl, the transgenic control line CLD10, the non-transgenic susceptible control developed from seeds (C2), and the transgenic plants that construct LD10 / 1832-13 included (T1-T9).
  • FIGS. 5a-d The production of the plasmid mentioned is shown in FIGS. 5a-d.
  • the Xbal fragment from nucleotide position 1521-2904 from SEQ ID No. 1 was filled in to blunt ends with Klenow enzyme. This fragment was then inserted into the blunt-ended BamHI site of plasmid pPS48.
  • This new plasmid, called pPS48 / BamHI-15 was then digested with HindIII.
  • the HindiII fragment of base pair 0-2403 was inserted into the HindIII site of plasmid pLDIO to give plasmid LD10 / 1832-13.
  • the Ti plasmid pAM194 containing the gene for nematode resistance was used as the transformation vector.
  • the vector is described in more detail in Example 11.
  • Strain C58C1 ATHV Rif was used as the bacterial strain, which is derived from the Agrobacterium tumefaciens strain EHA101, which carries the helper plasmid pEHAlOl without Kana ycin resistance.
  • the AMT strain corresponds to the above-mentioned strain C58C1 ATHV Rif, which contains the plasmid pAM194-1832.
  • the bacteria for the transformation were grown for the AMT culture on LB agar with 50 mg / 1 kanamycin and 100 mg / 1 rifampicin and were kept in the refrigerator until use.
  • 30 ml LB culture medium are inoculated with the appropriate bacterial culture.
  • the liquid medium like the LB agar, contains 50 mg / 1 kanamycin and 100 mg / 1 rifampicin.
  • the bacteria were incubated 24 in the dark at 28 ° C on a shaker at 190 up.
  • inoculate 30 ml LB medium without antibiotics with 20 ⁇ l of the above-mentioned bacterial culture obtained after 24 hours and incubate for a further 24 hours under the same conditions.
  • the cotyledons are separated from four-day-old seedlings with a scalpel just above the meristem. To do this, grasp both cotyledons with tweezers and simultaneously cut them off with a straight cut. Immediately after separation, the petioles of the cotyledons are immersed in the undiluted bacterial suspension (overnight culture) for 10 seconds. Then the cotyledons are put back on the culture medium. The coculture of 48h is carried out at 25 ° C and dim light.
  • the cotyledons are placed in containers with 50 ml of MSM medium which contains 750 mg / l of carbenicillin for killing bacteria and cultured for 7 days at 25 ° C. and 2000 lux for 16 hours. After 7 days on MSM with 750 mg / 1 carbenicillin, the cotyledons are transferred to the same nutrient medium, which initially contains an additional 20 mg / 1 kanamycin for sprout selection. In later passages, the kanamycin concentration was increased to 25 mg / 1. Non-transgenic callus is removed at regular intervals. The separated shoots are placed on B5 medium with 50 mg / 1 kanamycin and 400 mg / 1 betabactyl for further selection or to demonstrate transgenicity.
  • the GUS gene that is also transmitted allows a further identification of transgenic shoots at the earliest possible time.
  • the transgenic shoots are rooted on B5 nutrient medium without hormones.
  • a GUS test is carried out as histochemical detection of ⁇ -glucuronidase activity. The enzyme cleaves indole from an artificial substrate, so that GUS-positive leaf pieces turn blue.
  • the test procedure is according to Jefferson RA (1987): Assaying chimeric genes in plants: The GUS gene fusion system. Plant Mol. Biol. Rep. 5: 387-405.
  • NPTII-ELISA test Another molecular biological proof of gene transfer is the NPTII-ELISA test, in which the formation of the enzyme neomycin phosphotransferase, which mediates the transgenic plant kanamycin resistance, is detected qualitatively and quantitatively.
  • the test was carried out using the NPTII ELISA kit (Cat. No. 5307-630101) from CP Instruments Co., Ltd. carried out.
  • the nematodes on the host plants mustard (variety "Albatross” Petersen-Saatzucht) and beets were propagated.
  • the seeds are rinsed in 3% Ca (0C1) 2 solution for 10 min and then 3-4 times with sterile distilled water.
  • the seeds then dry on sterile filter paper and are then placed on water agar with 8% agar agar. After 3-4 days on this agar at 25 ° C in the dark, the young seedlings are transferred to 0.2 concentrated Knoop medium.
  • the roots should be about 3-4 cm long.
  • Petri dishes with a diameter of 15 cm and cams are used, in which two seedlings are placed opposite each other. After 14 days of growth in the dark at 25 ° C, 1000 nematode larvae are inoculated in the L2 stage. After about 4 weeks at 25 ° C in the dark, mature cysts have formed that can now be collected.
  • cyst harvest approx. 200 cysts are collected in a small sieve, mesh size 50-200 ⁇ m, using spring steel tweezers, which is filled with zinc chloride solution (3 mM) in a glass funnel.
  • a silicone hose is attached to the funnel outlet, which is clamped with a steel hose clamp. This arrangement is in a tall 250 ml beaker, which is covered with aluminum foil.
  • the hatched larvae After 3 days at 25 ° C in the heating cabinet, the hatched larvae have collected in the silicone tube in front of the steel clamp and can be harvested by briefly opening the clamp in a sieve with a mesh size of 15 ⁇ m, holding the funnel with tweezers. The larvae are then rinsed 3 times with sterile water and then transferred into a sterile block bowl using a Pasteur pipette. After a waiting time of about 3 minutes, during which the larvae sink to the bottom, the excess liquid is largely sucked off and replaced by 0.5% Gelrite solution, which ensures a homogeneous distribution of the larvae. After thorough mixing, the concentration of the larvae is checked using a stereomicroscope, the larvae being counted in a 10 ⁇ l drop.
  • the roots were separated from the sprouts of the transgenic starting clones and placed on 4 B5 medium with 300 mg / 1 beta-lactyl and 8 g / 1 Daishin agar.
  • Each inoculation of a transgenic starting clone is carried out with 5 roots each.
  • Oil radish the roots of which have been obtained as described above, is used as a susceptible control.
  • Approximately 100 L2 larvae of Heterodera schachtii are dropped onto the roots per dish, which have been obtained as described above.
  • a Multipette with 0.5 ml Combitip is used for inoculation.
  • the cysts that have formed are counted for the first time after 14 days, the second and last count after 20 days, when the cysts are already slightly browned and thus stand out better from the white roots.
  • rungs per transgenic starting clone are first transferred to the greenhouse.
  • the rungs should already have stretched a little and have a few roots. They are pricked into seed soil, where they remain for 1.5 weeks to develop more root mass. This also gives them the opportunity to acclimatize to the greenhouse conditions.
  • the plants are pricked into quartz sand with a cord diameter of 0.1-0.5 cm, which has previously been moistened with Steiner nutrient solution. Inoculation is carried out in this sand, since the elutriation and counting of the cysts is made very difficult by humus particles and dirt particles.
  • the sand is in tubes that are placed in a box.
  • the transgenicity of the plants was demonstrated by PCR analyzes as well as NPTII-ELISA and GUS tests.
  • the table shows the results from the in vivo resistance test with the non-transgenic susceptible variety T 0 and the transgenic plants T 7 to T 15 with the gene 1832.
  • Bintje potatoes were transformed with plasmid pAM194 with insert 1832 under the control of the 35S promoter with A. rhizogenes. 40 independent hairy root cultures were inoculated with 250 Globodera pallida larvae. After 56 days the nematode development was examined. 35 cultures showed normal nematode development with an average of 40 mature females / petri dish. The development of females was disturbed in 5 root cultures. Only 10 mature females were found there. This shows that the sequence 1832 in potatoes can improve their resistance to neomode attack. SEQUENCE LOG
  • ERSATZBLAH (REGEL26) ATGTATTTTC ATAATATCAA CTTTTTATAT TTTTTTACTA ATACGAAATT GAAGATATAC 420
  • TTTTTCTTTA ATTATAAACA GTTGTTGGTG ATCATGATGG GTAGTTTGGA AGCGAAAGCG 660
  • REPLACEMENT SHEET (RULE 26) TGAATTAATT GTTACACTTG TATTAGTAAA TTCT 1774 (2) INFORMATION ABOUT SEQ ID NO: 4:
  • ORGANISM Arabidopsis thaliana
  • AAAAACGATG CGTTTTGTTT CAGATCTAAA GGATTAGTGG AGATGATGAA GATGTCGAAA 1020

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Nukleinsäure, die eine Resistenz gegen sedentäre Nematoden in Pflanzen der Familien der Solanaceaen, Chenopodiaceaen und/oder Brassicaceaen induziert. Insbesondere umfaßt diese Nukleinsäure eine translatierte Region, die zu mindestens 60 % zu der Sequenz des Hslpro-1-Gen aus Beta procumbens homolog ist. Die vorliegende Erfindung betrifft außerdem die Sequenz einens cDNA-Klons und eines genomischen Klons dieser Nukleinsäure. Ferner betrifft die vorliegende Erfindung einen Vektor, der z.B. ein künstliches Hefechromosom (yeast artificial chromosome) 'YAC' sein kann, der die Nukleinsäure für eine Resistenz gegen sedentäre Nematoden in Pflanzen enthält. Schließlich betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung der Nukleinsäure oder des Vektors zur Induktion einer Resistenz gegen sedentäre Nematoden in Pflanzen sowie eine transgene Pflanze, die die Nukleinsäure oder den Vektor enthält. Ferner betrifft die Erfindung das durch die Nukleinsäure kodierte Protein, einen die Nukleinsäure und/oder den Vektor enthaltenden Testkit und ein Verfahren einer transgenen Pflanze sowie ein Verfahren zum Erzeugen einer Nematodenresistenz in Pflanzen. Schließlich betrifft die Erfindung den Promotor der Nukleinsäure, seine Verwendung und einen Primer für die PCR.

Description

Nematoden resistenzgen
Die vorliegende Erfindung betrifft eine Nukleinsäure, die in Pflanzen, vorzugsweise der Familien der Solanaceen und/oder C enopodiaceen und/oder der Brassicaceen, besonders bevorzugt der Gattung Beta und/oder Brassica und/oder Solarrum, eine Resistenz gegen sedentäre Nematoden induziert.
Die vorliegende Erfindung betrifft außerdem die DNA-Sequenz eines cDNA-Klons und eines genomischen Klons dieser Nukleinsäure. Ferner betrifft die vorliegende Erfindung einen Vektor, der z.B. ein künstliches Hefechromosom (yeast artificial chromosome) "YAC" sein kann, der die Nukleinsäure für eine Resistenz gegen sedentäre Nematoden in Pflanzen enthält. Schließlich betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung der Nukleinsäure oder des Vektors zur Induktion einer Resistenz gegen sedentäre Nematoden in Pflanzen sowie eine transgene Pflanze, die die Nukleinsäure oder den Vektor enthält.
Ferner betrifft die Erfindung das durch die Nukleinsäure kodierte Protein, einen die Nukleinsäure und/oder den Vektor enthaltenden Testkit und ein Verfahren einer transgenen Pflanze sowie ein Verfahren zum Erzeugen einer Nematodenresistenz in Pflanzen.
Schließlich betrifft die Erfindung den Promotor des Resistenzgens.
Es ist bekannt, daß Pflanzen von verschiedenen Erregern und Parasitenarten befallen werden. Es ist ebenfalls bekannt, daß Kulturpflanzen meist anfälliger sind für einen Parasitenbefall als ihre wildwachsenden Verwandten. Häufig trifft man Pflanzenparasiten aus der Familie der Nematoden an, mit einer Flüssigkeits-erfüllten, von einem Hautmuskelschlauch umschlossenen Pseudocylo hülle. Nematoden sind wichtige Pa- rasiten, die in den Ernten überall auf der Welt einen Schaden von ca. 150 Millionen DM pro Jahr verursachen. Besonders schädlich sind Nematoden der Gattungen Meloidogyne, Hetero- dera und Globodera, die sich permanent in den Wurzeln der befallenen Pflanze festsetzen, nachdem sie bestimmte Ernährungsstrukturen induziert haben. Der Nematode Heterodera schachtii hat ein breites Wirtsspektrum, das viele Arten verschiedener Pflanzenfamilien umfaßt, z.B. die Chenopo- diaceae und Brassicaceae.
Der Lebenszyklus von Nematoden ist in vier larvale Stadien untergliedert (J1-J4) . Die Wurzeln werden von J2 Juvenilsta- dien infiziert, die zum Zentralzylinder wandern, wo sie die Entwicklung von Syncytien induzieren. Diese extensiven Nahrungsstrukturen resultieren aus einem teilweisen Zellwandabbau zwischen den Zellen des Xylem-Parenchyms. Der Nematode beendet seinen Lebenszyklus zum Erwachsenen nach drei Abschnitten. Die weiblichen Nematoden schwellen an und zerstören schließlich den Wurzelcortex, während sie sich immer noch aus den Syncytien ernähren. Die männlichen Stadien ernähren sich nach Beendigung des dritten Stadiums nicht mehr und bewegen sich, wenn sie erwachsen sind, auf die weiblichen Stadien zu, von denen sie durch Sexpheromone angezogen werden. Die reifen weiblichen Stadien sind mit Eiern angefüllt. Nach ihrem Tod formen sie eine Zyste, in der die in- fektösen Larven (J2) in der Erde für bis zu 10 Jahre überleben können.
Es wird angenommen, daß Nematodenresistenzgene eine inkompatible Reaktion zwischen dem Wirt und dem Parasiten auslösen, die auf zellulärem Niveau bereits beschrieben wurden. Die Wurzeln von Pflanzen, die dieses bzw. diese Gen(e) tragen, werden von J2-Juvenilstadien zwar befallen, aber die meisten der Nematoden sterben im späten J2-Stadium aufgrund des Abbaus des initiierten Syncytiums. In seltenen Fällen können sich weibliche Stadien entwickeln, die jedoch ein durchsichtiges Aussehen zeigen und ihr Wachstum einstellen. Auf diese Weise können die Nematoden ihren Lebenszyklus nicht vollenden.
Da der Einsatz von Nematiziden aufgrund umweltpolitischer Überlegungen nur begrenzt möglich ist, ist es besonders wünschenswert, diese Resistenzgene auch in Kulturpflanzen zu verwirklichen.
Insbesondere Kulturrüben der Gattung Beta (z.B. Zuckerrübe, Futterrübe, Mangold, Rote-Bete) sind hochanfällig gegen den Rübenzystennematoden Heterodera schachtii. Es wird bereits seit langem daran gearbeitet, Resistenzen gegen Heterodera schachtii und andere phytopathogene Nematoden (z.B. Globo- dera) in Pflanzen, insbesondere Kulturpflanzen, zu erzeugen, da diesen entsprechende Resistenzgene fehlen. Einzige Quellen für eine Resistenz sind die Wildart Beta procumbens und ihre nahen Verwandten B. webbiana und B. patellaris.
Gene für die Resistenz gegen verschiedene Nematodenarten werden in unterschiedlichen Nutzpflanzenarten züchterisch genutzt (z.B. Kartoffel, Tomate, Weizen, Ölrettich) . Es wurde auch ein Resistenzgen aus der Wildart Beta procumbens mittels Artkreuzung in die Zuckerrübe überführt. Daraus konnten resistente Zuckerrüben selektiert werden, die jedoch den Nachteil aufwiesen, daß sie durch mangelnde Qualitätsund Leistungseigenschaften charakterisiert waren. Die resi- stenten Zuckerrübenlinien, die aus der Artkreuzung mit Beta procumbens hervorgingen, verfügen über wechselnd große Translokationen aus den Wildrüben der Sektion Procumbentes. Ihre geringe Leistungsfähigkeit und verminderte Qualität liegt vermutlich darin begründet, daß sich neben dem Resistenzgen noch weitere leistungs indernde Gene aus den Wildarten in diesen Zuckerrübenlinien befinden. Auch ist die Transmission der Resistenzeigenschaft auf nachfolgende Generationen unvollständig. Auf rein Züchterischem Wege lassen sich diese Nachteile nicht beseitigen, da eine Züchtung durch Kreuzung kaum spezifische Eigenschaften selektieren kann, ohne daß auch andere - unter Umständen nachteilige - Eigenschaften mitübertragen werden.
Weiterhin wurden zahlreiche Versuche unternommen, um künstliche Nematodenresistenz in Pflanzen durch eine Kombination von "Selbstmordgenen" mit Syncytien-spezifischen Promotoren zu induzieren. Bislang konnten daraus jedoch keine resisten- ten Pflanzen gezüchtet werden.
Es ist außerdem bisher noch nicht gelungen, ein natürliches Resistenzgen molekular zu identifizieren und für die Erzeugung einer Resistenz in Kulturpflanzen zu nutzen.
Es war daher eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine Nukleinsäure bereitzustellen, die eine Resistenz gegen Nematoden in Pflanzen vermittelt. Es war eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, die diesem Gen zugrunde liegende DNA-Sequenz bereitzustellen.
Ferner war es eine weitere Aufgabe gemäß der vorliegenden Erfindung, die Verwendung eines solchen Gens zur Induktion einer Resistenz gegen sedentäre Nematoden zu ermöglichen.
Es war außerdem eine Aufgabe gemäß der vorliegenden Erfindung, eine transgene Pflanze anzugeben, die eine solche Resistenz vermittelnde Nukleinsäure enthält, sowie Zellen, Samen oder Pflanzenteile, die diese Nukleinsäure enthalten.
Schließlich war es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Vektoren anzugeben, in die das Gen zur Resistenzvermittlung gegen Nematoden in Pflanzen wirksam eingebaut werden kann und darin enthalten ist.
Es war weiterhin eine Aufgabe gemäß der vorliegenden Erfindung, das von der Nukleinsäure kodierte Protein und einen Testkit, der die Nukleinsäure enthält, anzugeben.
Schließlich war es eine Aufgabe gemäß der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanze und ein Verfahren zum Erzeugen einer Resistenz gegen Nematoden anzugeben.
Es war auch eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, den Promotor anzugeben, der die Expression des oben angegebenen Resistenzgens kontrolliert.
Diese Aufgaben werden durch die in den Ansprüchen angegebenen Gegenstände der Erfindung gelöst.
Figur 1 zeigt eine Northern-Analyse von Gesamt-RNA aus Blättern und Wurzeln. Die Gesamt-RNA wurde aus Blättern und Wurzeln von sechs Wochen alten Pflanzen isoliert, die entweder (1) infiziert oder (2) nicht infiziert waren. Die Vollängen- cDNA 1832 wurde als Sonde verwendet. 20 μg Gesamt-RNA wurden in 1,3 %iger Agarose aufgetrennt und auf Nylonmembranen transferiert. Der Filter wurde über Nacht mit der radioaktiv markierten Sonde bei 60 °C hybridisiert und anschließend für 2 x 30 min bei 60°C in 0,2 x SSC gewaschen.
Gemäß Anspruch 1 der vorliegenden Erfindung wird eine Nukleinsäure, die in Pflanzen, vorzugsweise aus der Familie der Solanaceaen und/oder Chenopodiaceaen und/oder Brassi- caceaen, besonders bevorzugt der Gattung Beta und/oder Bras- sica und/oder Solanu eine Resistenz gegen sedentäre Nematoden induziert, bereitgestellt. Die Bereitstellung eines sol- chen Gens erlaubt es, Kulturpflanzen zu züchten, die eine Resistenz gegen sedentäre Nematoden aufweisen. Derartig resistente Kulturpflanzen sind selbstverständlich ihren nicht resistenten Verwandten weit überlegen, da sie nicht von Nematoden befallen werden können und daher weniger kranheits- anfällig sind. Durch die Bereitstellung der Nukleinsäure, die die Resistenz gegen sedentäre Nematoden in Pflanzen trägt, ist es weiterhin möglich, resistente Pflanzen zu erhalten, die dennoch eine gleichhohe Qualität und Leistungsfähigkeit wie andere, nicht resistente Kulturpflanzen aufweisen. Dies ist darauf zurückzuführen, daß eine einzelne Nukleinsäure, nämlich die Nukleinsäure für die Resistenz gegen sedentäre Nematoden, in die Pflanzen übertragen wird, während bei konventionellen Züchtungsverfahren neben den gewünschten Genen auch andere DNA-Sequenzen übertragen werden, die unter Umständen für unerwünschte Eigenschaften kodieren.
Besonders bevorzugt umfaßt die Nukleinsäure, die die Resistenz gegen sedentäre Nematoden induziert, einen transla- tierten Bereich, der zu der Sequenz des Hslpro~ -Gens aus Beta procumbens mindestens 60 % homolog ist. Hierzu zählen unter anderem die homologen Gene aus Beta webbiana und Beta patellaris. Das HSlpro~ -Gen aus Beta procumbens trägt eine Resistenz gegen sedentäre Nematoden in Pflanzen. Eine 60%- ige Homologie mit der oben aufgeführten DNA-Sequenz ist bereits ausreichend, um die gewünschte Eigenschaft der Resistenz gegen sedentäre Nematoden in einer Pflanze zu induzieren, die diese Nukleinsäure trägt. Erfindungsge äße Gene sind ebenfalls erhältlich durch Absuchen von Genbanken mit der Sequenz 1832, wobei die Hybridisierungsbedingungen wie folgt gewählt werden können:
Hybridisierungstemperatur 50°C, vorzugsweise 60°C, und Waschen der Filter in 0,5 x SSC, vorzugsweise in 0,2 x SSC für beispielsweise 30 Minuten. Besonders bevorzugt ist die Nukleinsäure, die eine Resistenz gegen sedentäre Nematoden in Pflanzen induziert, die folgende DNA-Sequenz umfaßt:
ATGAGAAGGT
GTGGGTATAG TTTGGGCCTT GGTGAGCCCA ATTTGGACGG AAAGCCCAAT
TTAGATTACG ACGCCGTTTG TCGTCCTTCT GAGCTTCACG CGCTTAAAAA
GGGCGCGTTG GATTATATTC AGAATTCGGA AAATCAGATA TTGTTTACAA
TTCATCAGAT TTTCGAGTCG TGGATTTTTT CCTCGAAAAA ATTGTTGGAT
CGAATAAGTG AGAGGATCAG TAAAGAAGAG TTTACCAAAG CAGCAGATGA
TTGTTGGATA CTGGAGAAAA TATGGAAGTT ATTGGAGGAA ATCGAGAATT
TACATTTATT AATGGATCCT GACGATTTCC TGCATCTGAA GACGCAACTG
AGGATGAAAA CAGTGGCGGA TTCTGAAACT TTTTGTTTTC GATCAAAAGG
ACTGATCGAG GTAACAAAAT TAAGCAAGGA TCTACGGCAC AAGGTGCCGA
AGATCCTTGG TGTAGAGGTG GACCCTATGG GAGGACCGGT GATACAAGAG
TCGGCAATGG AGTTGTACCG AGAAAAAAGA AGATACGAGA AGATACATCT
GTTACAAGCG TTTCAAGGGG TGGAATCCGC TGTTAAAGGG TTTTTCTTTA
ATTATAAACA GTTGTTGGTG ATCATGATGG GTAGTTTGGA AGCGAAAGCG
AATTTTGCTG TGATTGGTGG TTCTACTGAG TCTTCGGATT TGTTGGCTCA
GTTGTTTTTA GAACCTACTT ATTATCCGAG TTTGGATGGT GCCAAGACTT
TTATTGGTGA TTGTTGGGAG CATGATCAGG CTGTTGG AG CGGCCTCGAT
TGTCGTCATC ATCGGAAGAA TCGGACTGCG AAACAATGA
Diese Sequenz soll im folgenden als Nr. 1832 bezeichnet werden.
Ebenfalls von der vorliegenden Erfindung umfaßt sind Nukleinsäuren, die ein Protein kodieren, das die gleiche Nematodenresistenz verleiht, wie das durch obige Nukleinsäure Nr. 1832 kodierte Genprodukt, wobei vorzugsweise alle diese Genprodukte die gleiche Aminosäuresequenz umfassen.
Vorzugsweise ist die Nukleinsäure eine cDNA.
In einer weiteren Ausführungsform ist die Nukleinsäure, die die Resistenz gegen sedentäre Nematoden in Pflanzen induziert, eine genomische DNA, die die folgende DNA-Sequenz umfaßt:
TCTAGAGCTG TCGACGCGGC CGCGGAATTA ACCCTCACTA AAGGGAACGA ATTCGGATCT TCTTTCTTGG TGCTTAATTT TTTGACACTA ATCCGATTCT TAGCATTAAG TTGAAGCACA CTCTTGATAA ACTATGTTAC TATGTATCAT TGTCAATATG CTAAGAATTT GTCTTGACCT CATCGCTATG TATAAGCATC TAATACTTTC CTAAACTAGT AAAAACAAAT ATTCCATCCG TCCCATAATA TGAGTCCCCT TTCTATTTTA GGAGTCAAAA TTTTAAAATT TTTGACCAAA TATTCTTATT ACTATATATA AAAACATATT CATGTGGGAT CTTGTTAGAT TCGTCTTAAT ATGTATTTTC ATAATATCAA CTTTTTATAT TTTTTTACTA ATACGAAATT GAAGATATAC AATGTCTTAA AGACTATGCA AAAGTAAGCA GAACCTATAT TTTGGGACGG AGGGAGTAAT AAGTAATATT GATTGACGCA TAATTTGTAT ATAAATATTT CAAATTGATA CTACTTTAAA TAATATAGTT AATGCTTATA AATAAGCCTA AAGACTGTGA ATAGCAAGAT CGTTAAAAAT AAAATTTGAA AATATTTGAT ATGGATAATG AAATTGGAAA TGGCATGCTT AGCTTCTCGG GAATCTTATA CCGCTACATC TATAATAAAA ATTCCTCATA AAATTTTGCC CATTTTAACA CACGAAATTC GTCCTTTTAC GCGAGCCCTT TCCACACGTC TTTAAAATTT AAAAACCTCG TCTTTACTCT CCCCACCTAT ATATATACAC GTCCCCCCTT CTCTACTTCC CATCTCACAT ACACATACCC AATCCACAAA CTTCCATCTT ATCCAACTTT CTCTCACCTA TCTCCTTCTT CAATTTTCAA AACTCAAAAG AAAATGGTAG ATTTCGATTG CAAAACAAAA ATGGTACAAT CAACACCAAA CCTCACAAAA AAATCTCCAA AAATCACAAC CAAACGCACA ATATCAACAC CATTAATTTC ACCAGTACCA GTAATTTCCG GCGAATTATC TCCGGCGTCG GAATCATCCT GTTCAGCTTA CGAATCGTAT CTCAAATTAC CGGAGCTCCG TCAACTATGG AGTTCAAAAG AATTCCCCGG TTGGGATAAC GAACCGATAA TCAAACCGGC TTTGCAAGCA TTAGAGATAA CATTCCGGTT CATCTCACTC GTTTTATCCG ACGCTAGACC GTACATAAAC CGGCGAGAAT GGAACCGGAA ATTAGAGTCG TTAGCGAGAG ATCAAGTCCG AAACTCATCT CAGTTCTCTG CGGAAGACGA TGAGACACGT GGATCAGCTC CGAATCGTTG ATCTGACGTC ATCGTATGGT GAGGTGATGT CACAAACAGA AGTTCAGCGG AGGTATGGAA GCTTGCGAAT GGAGAACATG ATACTACCGT GGTCTGTCGT AGTAGCGAAT TTAGTCTCCT TCCGAGGTTA GCCACGTGGC AGAAGTCGGA GGAGATTGCT TCTAGAATCT TCTACGCGGT TGAATCTGCT ATGAGAAGGT GTGGGTATAG TTTGGGCCTT GGTGAGCCCA ATTTGGACGG AAAGCCCAAT TTAGATTACG ACGCCGTTTG TCGTCCTTCT GAGCTTCACG CGCTTAAAAA GGGCGCGTTG GATTATATTC AGAATTCGGA AAATCAGATA TTGTTTACAA TTCATCAGAT TTTCGAGTCG TGGATTTTTT CCTCGAAAAA ATTGTTGGAT CGAATAAGTG AGAGGATCAG TAAAGAAGAG TTTACCAAAG CAGCAGATGA TTGTTGGATA CTGGAGAAAA TATGGAAGTT ATTGGAGGAA ATCGAGAATT TACATTTATT AATGGATCCT GACGATTTCC TGCATCTGAA GACGCAACTG AGGATGAAAA CAGTGGCGGA TTCTGAAACT TTTTGTTTTC GATCAAAAGG ACTGATCGAG GTAACAAAAT TAAGCAAGGA TCTACGGCAC AAGGTGCCGA AGATCCTTGG TGTAGAGGTG GACCCTATGG GAGGACCGGT GATACAAGAG TCGGCAATGG AGTTGTACCG AGAAAAAAGA AGATACGAGA AGATACATCT GTTACAAGCG TTTCAAGGGG TGGAATCCGC TGTTAAAGGG TTTTTCTTTA ATTATAAACA GTTGTTGGTG ATCATGATGG GTAGTTTGGA AGCGAAAGCG AATTTTGCTG TGATTGGTGG TTCTACTGAG TCTTCGGATT TGTTGGCTCA GTTGTTTTTA GAACCTACTT ATTATCCGAG TTTGGATGGT GCCAAGACTT TTATTGGTGA TTGTTGGGAG CATGATCAGG CTGTTGGTAG CGGCCTCGAT TGTCGTCATC ATCGGAAGAA TCGGACTGCG AAACAATGAT GGTTTCGAAG TTAGTTTTGG ATTGAGTTTG GTTTGATCTG ACTCGGCTGA GTAATGGGCG GCGATAGGGA GGTTATGGAG AACGTGGGGC GGAAAGTGGG TGGCCTTGTT AGTGAGACGT GCAAACTTTG GTTACTATTA CATGTGATAT ACTTATATTT AGTGGGAATA TTGCTTTGGT GTATATAGAT AAATTTTTGA ATTAATTGTT ACACTTGTAT TAGTAAATTC TGTATCATGA TGATTATAAC ATGAATTTTT TGTTGTGACT TTAAATGAGA TTTATGCTCC TTAATCCTTA TTTCACTGAT ATTATTTTTT TGTAGTCTGA GTATAAGTGC GGAGTTTAAT CAAGCAAGAG AAAATAATAG AAGGTGATTG CATACTTGGA TTGGAGATCA ATATCTAAAA GATGGTTATG AAACTATTGT GAATAACGGA GTACATGTCC AACACCACAC ACGTATGACT GTGTACCTCT AATTTACAAA GAGATTTACA AAATCTAGAT GAGTTTTGAT ATGATCGACA TTGTCTCTAA ATGGGAGATA AGAATTAAAT CGTGAGGCTC TTTGCGGCTA G7TCTTCCGA ATAAAATAAG AAACAATGGT TTACTCTAAT TCA7TTTTCC AATTGGCAAA GTGGCACAAG CTTCAATAA? 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Der Translationsstart ist unterstrichen. Die fettgedruckten Buchstaben stellen den cDNA-Anteil dar. In dem beigefügten Sequenzprotokoll entspricht (?) dem Buchstaben N.
Diese Sequenz soll im folgenden als Nr. 1832.1 bezeichnet werden. Die ursprüngliche Sequenz von 5407 Nukleotiden, wie in Figur 2 angegeben, enthielt Sequenzierfehler, die sich jedoch nicht auf den proteinkodierenden Bereich auswirken.
Schließlich umfaßt die vorliegende Erfindung die Sequenz gemäß dem Seq.Id.No3. (auch als 1832A1 bezeichnet).
Umfaßt ist auch eine Nukleinsäure, die erhältlich ist durch Absuchen einer DNA-Bank mit einer wie oben beschriebenen DNA-Sequenz und die für eine Nematodenresistenz kodiert, wie für Klon 1832 nachgewiesen.
Vorzugsweise stammt die Nukleinsäure aus einer Wildart der Sektion Procumbentes der Gattung Beta.
Besonders bevorzugt löst die Nukleinsäure, wie oben beschrieben, eine Resistenz gegen sedentäre Nematoden der Gattungen Meloidogyne. Heterodera und/oder Globodera aus. Ganz besonders bevorzugt ist die Induktion einer Resistenz gegen Heterodera schachtii in Pflanzen. Besonders bevorzugt wird die Resistenz gegen sedentäre Nematoden in Pflanzen der Art Beta vulcraris induziert.
Bei der Einschleusung eines derartigen Gens in die zu verändernden Pflanzen wird in aller Regel lediglich die Eigenschaft Nematodenresistenz beeinflußt. Es sind keine pleio- tropen Geneffekte zu erwarten. Damit bleibt die Leistungsfähigkeit des Zuchtmaterials unberührt. Die transgenen Pflanzen, die das o.g. Gen exprimieren, zeigen eine inkompatible Reaktion gegenüber Zystennematoden. Damit können sie für die Züchtung resistenter Sorten eingesetzt werden. Da es sich um eine natürliche Resistenz-Nukleinsäure aus Wildarten der Sektion Procumbentes der Gattung Beta handelt, werden keine Akzeptanzprobleme hinsichtlich gentechnisch veränderter Pflanzen erwartet. Nematodenresistente Sorten, die das oben genannte Gen besitzen, können zu einer Erhöhung des Anteils von Wirtskulturen in der Fruchtfolge führen. Im Falle der Zuckerrübe bedeutet das theoretisch, daß eine Kultur mit hohem Deckungsbeitrag in verstärktem Maß angebaut werden kann. Ferner ist die HSlpro~ -Sequenz nicht nur in Pflanzen der Gattung Beta aktiv, sondern sie vermag auch eine Nematodenresistenz in Pflanzen anderer Gattungen, wie beispielsweise in Arabidopsis thaliana. zu erzeugen.
Ob eine aufgefundene Sequenz das Potential besitzt, einer Pflanze Nematodenresistenz zu verleihen, läßt sich anhand üblicher Teste überprüfen, wie sie beispielsweise im folgenden noch näher erläutert werden.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein Vektor, besonders bevorzugt ein künstliches Hefechromosom, zur Verfügung gestellt (yeast artificial chromosome, YAC) , das eine Resistenz gegen sedentäre Nematoden in Pflanzen vermittelt und die Nukleinsäure, wie oben beschrieben, enthält.
Das YAC kann z.B. folgende DNA-Sequenz enthalten:
1. (Nr. 1832)
2. (Nr. 1832.1)
Eine 60%-ige Homologie zu der in den YACs enthaltenen Nukleinsäuren genügt zur Induktion einer Resistenz in den Pflanzen. Bevorzugte YACs sind die folgenden: TABELLE 1
YAC Größe in Spezifität klonierte Sequenzen der YAC-Enden kBp links rechts
YAC42D12 50 643 — +
YAC112G9 60 643 + +
YAC120E7 150 643 + +
YAC31G11 70 D13 + +
YAC80G3 200 YAC31L — +
YAC116C5 50 YAC31R — —
YAC114H8 120 YAC104L — —
In einer bevorzugten Ausführungsform wird eine Resistenz gegen Nematoden der Gattungen Meloidogyne, Heterodera und/oder Globodera in Pflanzen induziert. Besonders bevorzugt richtet sich die Resistenz gegen Heterodera schachtii.
Vorzugsweise wird die Resistenz gegen sedentäre Nematoden in Pflanzen der Art Beta vulgaris induziert.
Weiterhin richtet sich die Erfindung auf die Verwendung der Nukleinsäure oder des Vektors, wie oben beschrieben, zur Induktion einer Resistenz gegen sedentäre Nematoden in Pflanzen.
Die Erfindung ist außerdem auf eine transgene Pflanze gerichtet, die die Nukleinsäure oder den Vektor, wie oben beschrieben, enthält.
Das Gen kann durch Transformation mit Standardmethoden entweder unter der Kontrolle eines konstitutiven Promotors oder unter der Kontrolle des internen Promotors, der stromaufwärts der translatierten Sequenz liegt, in Pflanzen zur Ex- pression gebracht werden. Dadurch wird eine inkompatible Reaktion mit den sedentären Nematoden, insbesondere dem Zy- stenne atoden Heterodera schachtii, hervorgeru en.
Die stromaufwärts gelegene, ca. 1500 Nukleotide umfassende Promotorregion des Gens kann zur wurzelspezifischen Expression beliebiger Gene in beliebigen Pflanzen verwendet werden. Umfaßt sind Promotoren, die sich von der 5' nicht translat- ierten Region des HSlp o_ -Gens ableiten und die gleiche Promotoraktivität zeigen wie der HSlpro~ -Genpromotor.
Ein bevorzugter Promotor befindet sich innerhalb des Xbal- Fragments zwischen Nukleotidposition 1 und 1521 in der Sequenz 1832.1. Weiterhin bevorzugt sind Promotoren, die sich von dem genannten Promotor durch z.B. Insertionen, Deletio- nen, Substitutionen und/oder Inversionen ableiten und die gleiche Promotoraktivität beibehalten oder sogar stärkere Promotoraktivität zeigen. Das Vorhandensein von Promotoraktivität läßt sich mit den üblichen Verfahren bestimmen, wie beispielsweise im folgenden anhand der Beispiele erläutert.
Als erfindungsgemäß werden Derivate des oben genannten 1832- Promotors angesehen, die mindestens 10 % von dessen Promotorstärke aufweisen.
So wird der 1832-Promotor beispielsweise in Arabidopsis tha- liana aktiviert mit dem Ergebnis, daß die Sequenz 1832 unter der Kontrolle des genannten Promotors in diesem Wirt eine Resistenz gegen Heterodera schachtii hervorruft.
In einer bevorzugten Ausführungsform gehört die transgene Pflanze der Gattung Beta oder der Gattung Brassica an. Besonders bevorzugt gehört die transgene Pflanze der Art Beta vulqaris an. Die Erfindung ist auch auf Zellen, Samen oder Pflanzenteile gerichtet, die die Nukleinsäure oder den Vektor, wie oben beschrieben, enthalten.
Ferner ist die Erfindung auf das von der Nukleinsäure kodierte Protein gerichtet, sowie auf Derivate davon mit den gleichen resistenzverleihenden Eigenschaften.
Die erfindungsgemäßen Proteine sind erhältlich durch Expression der erfindungsgemäßen Nukleinsäure in einem geeigneten Wirt wie Bakterien, Hefen, Säuger- und Pflanzenzellen.
Die Erfindung betrifft außerdem einen Testkit, der eine Nukleinsäure oder einen Vektor, wie oben beschrieben, oder ein Protein, wie oben beschrieben, enthält. Ferner betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer Pflanze, dadurch gekennzeichnet, daß eine Nukleinsäure, wie oben beschreiben, in eine Pflanzenzelle eingebracht wird und eine Pflanze aus der Pflanzenzelle regeneriert wird.
Desweiteren betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Erzeugen einer Nematodenresistenz in Pflanzen, das dadurch gekennzeichnet ist, daß eine Nukleinsäure, wie oben beschrieben, in eine nematodensensitive Pflanze eingebracht wird.
Die Erfindung betrifft außerdem einen Promotor, der die Expression der oben beschriebenen Nukleinsäure mit steuert und der dadurch gekennzeichnet ist, daß er wurzelspezifisch aktiv ist.
Der 5 '-flankierende Bereich des Gens, ein ca. 1,5 kb Xbal- Fragment, enthält typische Elemente eukaryotischer Promotoren, wie z.B. die TATA-Box. Der Promotor ist offensichtlich wurzelspezifisch, weil nach Northern-Analyse mit Blatt- und Wurzel-RNA lediglich ein Signal mit Wurzel-RNA gefunden wurde. Dies bestätigen auch Experimente mit transgenen Kartoffeln, die mit einem Fusionsprodukt aus dem 1832-Promotor und dem GUS-Gen transformiert worden sind. Dort zeigten die Wurzeln eine eindeutige Farbreaktion, die auf eine Aktivität des 1832-Promotors schließen ließ.
Damit kann der 1521 Nukleotide umfassende 5 '-Bereich des 1832-Gens und Derivate davon mit entsprechender Promotoraktivität für die Expression beliebiger Gene, insbesondere in Wurzelgeweben, unterschiedlicher Pflanzen genutzt werden. Geeignete Derivate sind solche, die mindestens 10 % der Promotoraktivität der 1832.1-Sequenz aufweisen. Anwendungsbeispiele sind die Expressionen von Genen für Resistenz gegen Nematoden sowie Resistenz gegen weitere wurzelbürtige Schaderreger, sowie Expression von Genen, die an der Saccharose- Translokation beteiligt sind und allgemein von Genen, die an der Saccharose- oder Inulinspeicherung beteiligt sind. Derivate des erfindungsgemäßen Promotors sind Sequenzen, die sich von dem Promotor des 1832-Gens z.B. durch Deletionen, Insertionen, Basenaustausche usw. ableiten, wobei die Promo- toreigenschaften des 1832-Genpromotors beibehalten werden.
Schließlich betrifft die Erfindung einen Primer für die PCR, erhältlich aus der Sequenz Nr. 1832.1.
Im folgenden wird die Erfindung anhand von Beispielen im einzelnen beschrieben, wobei diese Beispiele den Umfang der Erfindung nicht begrenzen sollen.
Beispiel 1
Klonierung des HSlE£g--Gens
Für die Klonierung des HSlpro -Gens wurden eng miteinander verbundene Marker identifiziert. Ein B. procumbens-spezi- fischer Satellit (pRK643) wurde von einer der Fragment- Additionslinien kloniert. Eine Southern-Analyse zeigte, daß alle getesteten, resistenten Linien diesen Satelliten tru- gen, was andeutete, daß er in der Region des Genoms der Wildart B. procumbens verteilt ist, in der das Gen lokalisiert ist. Dieser Marker erwies sich als hilfreich bei der Identifizierung der Translokationslinie mit dem kleinsten Segment der Wildrübe unter einer Mehrzahl chromosomaler Mutanten. Diese Linie wurde für die positionale Klonierung des Gens ausgewählt. Der Marker pRK643 kosegregierte perfekt mit der Resistenz in einer segregierenden F2-Population von 241 Individuen. Unter Verwendung dieses Satelliten arkers als Sonde wurden 3 Klone aus einer YAC-Bibliothek der Line A906001 extrahiert, die die HSlpro~ -Genregion umfaßten.
Beispiel 2
Identifizierung der transkribierten Sequenzen der YACs
Um die transkribierten Sequenzen der YACs zu identifizieren, wurde eine cDNA-Bibliothek aus den Wurzeln von mit Nematoden infizierten A906001-Pflanzen erstellt und mit den drei YACs gescreent, was zu der Isolierung von drei cDNA-Klonen, nämlich den Nummern 1832, 1845 und 1859 führt. Der Klon 1845 zeigte eine Kreuzhybridisierung mit Zuckerrüben-DNA, während der Klon 1859 multiple Bandenmuster mit der DNA von sowohl anfälligen als auch resistenten Rüben ergab. Die weiterführende Arbeit konzentrierte sich auf die cDNA 1832, da:
1. Diese cDNA ein Einzelkopiesignal mit DNA der resistenten Linien ergab, während kein Signal mit DNA von der anfälligen Zuckerrübe sichtbar war, was die Annahme zuläßt, daß dieses Gen in kultivierten Rüben nicht vorhanden ist. Alle monoso- men Additionslinien, die das HSlpro~ -Gen trugen, ergaben ein Signal mit dieser Sonde.
2. Es zeigte eine vollständige Cosegregation mit der Resistenzeigenschaft in den segregierenden F2-Populationen. 3. Ein ca. 1,6 kb-Transkript war nur in Wurzeln von resistenten Pflanzen vorhanden, wie durch Northern-Analyse gezeigt wurde. Ein deutlich stärkeres Hybridisierungssignal wurde im Vergleich zu nichtinfizierten Wurzeln mit RNA von Wurzeln gefunden, die mit Heterodera schachtii infiziert waren.
4. Die Sequenzanalyse des vorhergesagten Polypeptids zeigte Motive, die typisch sind für in letzter Zeit klonierte Resistenzgenprodukte .
Unter Zusammenfassung dieser Resultate repräsentierte der Klon 1832 ein wildrübenspezifisches Gen, das nur in Wurzeln exprimiert wird und nach Nematodeninfektion stimuliert wird.
Beispiel 3
Genetische Komplementierunqsanalyse
Für die genetische Komplementierungsanalyse wurden Haarwurzelkulturen durch Induktion mit Agrobacterium rhizogenes erhalten und verwendet. Die Haarwurzelkulturen der Zuckerrübe erwiesen sich als geeignetes Substrat für Wurzelpathogene. Die kompatible Reaktion der anfälligen wie auch die inkompatible Reaktion der resistenten Wurzeln auf Zystenne atoden wird in Haarwurzelkulturen der Zuckerrübe aufrecht erhalten. Eine anfällige Zuckerrübenlinie (Nr. 93161p) wurde mit der 1450 Basenpaar (bp) cDNA 1832 unter Verwendung eines A. rhi- zogenes-ver ittelten Gentransfers transformiert. Die gentechnische Veränderung der Transformanden wurde durch GUS- Assay und DNA-Blot-Analyse bestätigt. Nach Inokulierung mit J2-Juvenilen wurden sechs unabhängig voneinander transformierte Wurzeln gefunden, die das 1832-Gen exprimierten und dieselbe inkompatible Reaktion wie die resistente Linie A906001 zeigten, während sich Nematoden regelmäßig auf den anfälligen Kontrollen entwickelten und auf den Haarwurzeln, die das Gen nicht enthielten. Anfälligkeit konnte nach Transformation von einer resistenten Wurzelkultur mit einem Gegensinnkonstrukt der cDNA 1832 wiederhergestellt werden.
Diese experimentellen Daten belegen, daß die Resistenz in Haarwurzeln aus der Linie 93161p von der Expression des 1832 Gens abhängt. Das isolierte Gen wird als HSlpro -Gen bezeichnet, da es die Nematodenresistenz auf die anfällige Zuckerrübenlinie derartig überträgt, daß sie vollständig mit der Resistenz in der Linie A906001 übereinstimmt.
Beispiel 4
Sequenzierung der cDNA
Die Sequenzierung der gesamten cDNA und des korrespondierenden genomischen Klons zeigte einen offenen Leserahmen ohne Introns von 846 bp, die ein vorhergesagtes Genprodukt von 282 Aminosäuren kodierten, was mit den von den RNA-Blots erhaltenen Daten übereinstimmt.
Beispiel 5
Strukturanalyse der Aminosäuresequenz
Die Aminosäuresequenz des vorhergesagten Polypeptids kann in vier verschiedene Subdo änen unterteilt werden. Ein vermutliches Signalpeptid (Domäne A) kann am N-Terminus definiert werden, der vermutlich die Aufgabe hat, das Protein zur Cytoplasmamembran zu leiten. Eine leucinreiche Region (Domäne C) , die in imperfekten, leucinreichen, sich wiederholenden Einheiten angeordnet ist, zeigt sich deutlich am N- Terminus des HSlpro~ -Polypeptids. Die sich wiederholenden leucinreichen Einheiten (LRR) sind Teil der Protein-Protein- Interaktion und wurden in vorher klonierten Resistenzgenen aus Pflanzen gefunden, z.B. dem RPS2-Gen von A. thaliana. Ihre Funktion variiert von mutativen Erkennungsstellen in Rezeptor-ähnlichen Molekülen, die extrazellulär lokalisiert sind, zu katalytischen Domänen von Enzymen, die im Cytoplas- ma aktiv sind. Ähnlich anderen LRRs, die in Pflanzenresi- stenzgenen identifiziert wurden, sind die LRRs des HSlpro~ - Polypeptids wenig konserviert im Vergleich zu der Konsensussequenz der LRR-Konsensus-Superfamilie. Die LRRs des HSlpro~ -Polypeptids sind gekennzeichnet durch ein 20aa- Konsensusmotiv (xLxxaxxaxLxxLxxaxxxL; L = Leucin oder Iso- leucin, a = aliphatiεches oder aromatisches aa, x = jedes aa) . Die Leucin- und aliphatischen Reste an den Positionen 2, 5 und 16 sind in derselben Position lokalisiert wie im Konsensus der LRR-Superfamilie. Das hochkonservierte Aspara- gin an Position C ist mit einem Leucin/Isoleucin substituiert. Dieses Asparagin fällt ebenso in die Konsensus-LRRs des RPS2-Polypeptids. Die hydrophobe Domäne von 17aa des HSlpro~ -Gens (Domäne F) zeigt ein Transmembransegment an. Die C-terminale Domäne enthält aa mit positiv geladenen Resten und eine putative N-Glycosylierungsstelle.
Das Elicitor-Rezeptor odell der pflanzenpathogenen Interaktion deutet an, daß die Produkte der Resistenzgene als spezifische Rezeptoren für pathogene Auslöser gemäß der Genfür-Gen-Hypothese wirken. Die Sequenzanalyse von HSlpro~ deutet an, daß es in einer Gen-für-Gen-Resistenz als Teil einer Kaskade von Abwehrreaktionen involviert ist. Das vorhergesagte Polypeptid besteht aus imperfekten LRRs, die am N-Terminus lokalisiert sind mit einem zusätzlichen Signal- peptid, einer putativen Transmembran-übergreifenden Domäne und einem positiv geladenen C-Terminus, und paßt so in die zweite Gruppe von Pflanzenresistenzgenen.
Ähnliche Proteinstrukturen zwischen HSlpro_ und dem Resistenzgen Cf-9 aus der Tomate konnten vorhergesagt werden, obwohl keine signifikante Sequenzhomologie festgestellt wurde. Als mögliche Art der Resistenzreaktion können die ex- tracytoplasmatischen LRRs als rezeptorerkennende putative Auslöser wirken. Von Nematoden ist es bekannt, daß sie Sekrete produzieren, die mit membrangebundenen Pflanzenrezeptoren interagieren können. Der positiv geladene C-Terminus interagiert möglicherweise mit den cytoplasmatischen Bestandteilen für die Signalübertragung. Alternativ als Protein, das im Cytoplasma lokalisiert ist, kann es als Rezeptor für Auslöser wirken, die in die Zelle über den Mundstachel des Nematoden injiziert wurde.
Durch die Klonierung des ersten Pflanzengenes, das in die Nematodenresistenz involviert ist, sollte es besser möglich sein, den Prozeß der wirtsspezifischen Abwehr gegen Nematoden zu verstehen. Außerdem bietet die Isolierung des HSlpro_
-Gens die Möglichkeit, eine Resistenz auf Wirtspezies mit landwirtschaftlicher Bedeutung zu übertragen, in denen keine allele Form des Gens vorhanden ist.
Beispiel 6
Identifizierung und Charakterisierung des HSlpro~ -Promotors
Aus einer Lamda-DASHII-Bank wurde mit einem PCR-Fragment aus dem 5' -Bereich des HSlpro~ -Gens ein ca. 1 , 5 kb Xbal-Frag ent isoliert, das dem 5 ' -flankierenden Bereich des Gens und der Sequenz mit der Nummer 1832.1 entspricht. Die isolierte Promotorsequenz enthält die typischen Elemente eukaryotischer Promotoren, wie die TATA-Box mit der Sequenz TACATAAA in der Position -23 vor dem Transkriptionsstart bzw. dem 5' -Ende der cDNA.
Der identifizierte Promotor ist wurzelspezifisch, da in Northern-Blots ein Signal mit der Probe aus dem 5 '-Bereich des 1832-Gens nur in Wurzelgewebe gefunden wird. Weiterhin zeigen Konstrukte enthaltend den erfindungsgemäßen Promotor und ein GUS-Reportergen ausschließlich eine Farbreaktion in Wurzeln transformierter Kartoffeln bzw. Tabak.
Darüber hinaus ist der Promotor durch Nematoden induzierbar. Dies zeigt ein Vergleich der transkriptionellen Aktivität von mit H. schachtii infizierten und nicht infizierten Zuk- kerrübenwurzeln. Dies läßt darauf schließen, daß der erfindungsgemäße Promotor Transkriptionsfaktoren bindet, die von Nematoden stammen oder die infolge der Infektion gebildet werden.
Die genannten Versuche demonstrieren die Wurzelspezifität des HSlpro_1-Promotors.
Beispiel 7
Expression der Seguenz 1832 in Arabidopsis
Die cDNA 1832 wurde mit dem GUS-Intron-Gen (Vancanneyt et al. (1990) MGG, S. 245) fusioniert und unter die Kontrolle des 35S-Promotors gebracht. Das Konstrukt wurde unter Zuhilfenahme des Vektors pAM194 (unten beschrieben) nach Standardverfahren mittels Agrobacterium tumefaciens in Arabidopsis thaliana eingebracht. Nach drei Selbstungsgenerationen wurden Linien erhalten, die eine vollständige Resistenz gegen Heterodera schachtii aufweisen, d.h. es wurden keinerlei Zysten oder entwickelte Weibchen beobachtet. Der Resistenztest erfolgte mit infektiösen Larven in einer Petrischale. Ferner wurde die GUS-Aktivität bestimmt.
Beispiel 8
Gewebespezifische Regulation des 1832-Promotors
Für die Studien wurde das Xbal-Restriktionsfragment . Xbal- Stellen an Position 1 und 1521 der 1832.1-Sequenz) mit dem GUS-Intron-Gen fusioniert und mittels dem Vektor pBIN19 und Agrobacterium tumefaciens/Agrobacerium rhizogenes-Kotrans- formation in die Wurzel von Zuckerrüben und Kartoffeln eingeführt. Bei der Zuckerrübe wurde beobachtet, daß in einer "Hairy-Root-Kultur" die GUS-Aktivität lediglich in dem Syn- zytium nachweisbar war. In nicht-infizierten Wurzeln oder in Bereichen, in denen sich keine Nematoden befanden, war eine entsprechende GUS-Aktivität nicht sichtbar. Dies zeigt, daß der eingesetzte Promotor ein "Pathogen-Responsive"-Element bzw. Elemente besitzt, das bzw. die nach Ne atodenbefall verstärkt aktiviert wird bzw. werden. Somit ermöglicht der 1832-Promotor die gewebespezifische Expression beliebiger Gene in Wirtspflanzen, wie beispielsweise der Zuckerrübe.
Beispiel 9
Expression von cDNA 1832 in Brassica
Es wurden Rapskotyledonen mit einem Konstrukt, enthaltend die Sequenz 1832, wie oben in Beispiel 7 beschrieben, transformiert. Die Anzucht der Kotyledonen erfolgte auf MS-Nähr- medium, wobei die Selektion auf MS-Nährmedium unter Zusatz von Carbenicillin erfolgte. Die Untersuchung der Transformanden zeigte positive Ergebnisse sowohl im GUS-Test wie auch in der PCR-Analyse.
Beispiel 10
Identifizierung einer Variante von Klon 1832.1, im folgenden 1832A1 genannt
Es wurde eine Variante zu Klon 1832 identifiziert, die ein offenes Leseraster umfaßt, bei dem das Startkodon mit dem ATG der Position 924 der 1832.1-Sequenz entspricht. Das Stopkodon entspricht der Position 2397 in der Sequenz 1832.1. Die Variante 1832A1 enthält weitere geringfügige Unterschiede im Vergleich zu der Sequenz 1832.1, wie sich aus dem Sequenzvergleich ergibt. Bemerkenswerterweise führen sämtliche Sequenzen, d.h. 1832.1, 1832 und 1832A1 nach Expression in Wirtszellen zur Resistenz gegenüber Nematodenbe- fall. Ohne an eine Theorie gebunden zu sein, kann man davon ausgehen, daß die kürzere der Sequenzen, nämlich 1832, sämtliche Elemente kodiert, die dem kodierten Protein die Fähigkeit verleihen, eine Resistenz gegen Nematoden hervorzurufen. Figur 3 zeigt schematisch die Kodierungskapazität der 3 Klone 1832.1, 1832 und 1832A1 relativ zueinander. Sämtlichen Klonen ist der Abschnitt 1832 gemeinsam.
Beispiel 11
Herstellen des Expressionsvektors pAM194
Der hergestellte binäre Vektor pAM194 verbindet die Eigenschaften eines Klonierungsvektors und eines Pflanzentransformationsvektors (Ti-Plasmids) . Die Eignung als Transformationsvektor wurde zusammen mit Agrobacterium tumefaciens als auch in Kombination mit Agrobacterium rhizogenes für Ko- transformationsexperimente geprüft. Der Vektor ist ein Derivat von pBI121 (Jefferson et al. 1987) (Clontech Laboratories) ; das Grundgerüst für pBI121 stellt pBIN19 (Bevan et al. 1984) bereit.
pAM194 umfaßt folgende Elemente:
- das Fragment außerhalb der Randsequenzen (LB; RB) enthält NPTII, als einen Selektions arker;
- die linken und rechten Randsequenzen (LB; RB) ;
- das NPTII-Gen aus Tn5 für die Selektion in Pflanzen; - das GUS-Gen aus E. coli mit der ST-LSl-Intronsequenz (Vancanneyt et al. 1990);
- die 35S-Promotor-Terminator-Kassette mit singulären Restriktionsspaltstellen zum Zwecke der Klonierung
Herstellung:
Das Plasmid pBI121 wurde mit Hindlll/SstI gespalten. Das gespaltene HindIII/SstI-35S-GUS-Fragment wurde ersetzt durch ein subkloniertes 35S-GUS-Intron-Fragment . Die EcoRI- Restriktionsspaltstelle wurde zerstört, indem mit EcoRI gespalten wurde und die überstehenden Enden mit "Klenow- Frag ent" von E. coli-Poly erase I aufgefüllt wurden; anschließend wurde erneut ligiert unter Herstellung von pBIN- GUSINT. Eine 35S-Promotor-35S-Terminator-Kassette mit einer einzigen EcoRI-Klonierunqsstelle aus dem Plasmid pRT104 (Töpfer et al. 1987) wurde in die Hindlll-Stelle von pBIN- GUS-INT kloniert, wobei dies zu pAM194 führte. Die oben angegebenen Literaturstellen lauten wie folgt:
- Bevan M. 1984: Binary Agrobacterium vectors for plant transformation; Nucleic Acids Research Band 12, Nr. 22, 8711.
- Jefferson R.A. , Kavanaugh T.A. , Bevan M.W. 1987. EMBO Journal Band 6: 3901.
- Töpfer R. , Matzeit V., Gronenborn B. , Schell J., Steinbiss H.H. 1987; A set of plant expression vectors for trans- criptional and translational fusions. Nucleic Acids Research Band 15, Nr. 14: 5890.
- Vancanneyt G. , Schmidt R. , O'Connor-Sanches A. , Willmitzer L. , Rocha-Sosa M. 1990. Construction of an intron-contai- ning marker gene. Molecular General Genetics, 245-250.
Die Konstruktion des Plas ids ist schematisch in Figur 4 wiedergegeben . Beispiel 12
Transformation von Zuckerrübe
Zur Transformation wurde Agrobacterium tumefaciens , Stamm EHA101 (Hood E.E. et al. 1986, J. Bacteriology 168, S. 1291- 1301) , verwendet, der mit dem Plasmid LD10/1832-13 (Figur 5a bis d) oder mit dem Vektor LD10, einem Plasmid, dem die 1832-cDNA fehlte, nach dem Friertauverfahren (Holters et al. 1978) transformiert worden war.
Zur Transformation der Zuckerrübe wurden sterile Zuckerrübensamen des Typs "Elite 0-272" zur Keimung gebracht auf einem Medium, enthaltend 2,0 g/1 Sucrose und 4,0 g/1 Agarose . Die Sämlinge wurden gekappt und die Kotylidonen wurden sorgfältig entnommen und als Explantate verwendet. Der Agrobace- rium tumefaciens-Stamm EHA101 mit dem Plasmid LD10/ 1832-13 , oder die Kontrolle mit Plasmid LDIO (Figur 5c) wurde auf LB- Mediu (Maniatis et al. 1982), ergänzt mit 50 mg/1 Kanamy- cin, 75 mg/1 Spectinomycin, 150 mg/1 Streptomycin und 50 mg/1 Acetosyringon auf einem Drehschüttler (340 U/min) bei 27°C bis zu einer OD von ungefähr 1,0 (bei 660 nm) kultiviert. Die Bakteriensuspension wurde dann mit LB auf OD 0,1 verdünnt und zur Inokulation mit den Explantaten, die für 2 bis 4 Tage bei 22°C kokultiviert wurden, verwendet.
Die Selektion auf transgene Schößlinge erfolgte nach einer Modifikation des Mannoseselektionssystems. Dabei wurde auf transgene Zuckerrübenschößlinge hin selektiert. Nach der Co- kultivierung wurden die Explantate auf Selektionsmedium, bestehend aus MS-Medium (Murashige & Skoog 1962) , ergänzt mit
0,05 mg/1 α-Naphthylessigsäure, 0,25 mg/1 6-Benzyladenin, 500 mg/1 Carbenicillin, 20 g/1 Sucrose und D-Mannose überführt, wobei die Konzentration der D-Mannose schrittweise während der Selektion erhöht wurde, wobei mit einer Konzentration von 1,25 g/1 für die ersten zwei Subkulturperioden begonnen wurde, dann wurde auf 5,0 g/1 für die nächsten 2 Subkulturperioden gesteigert, und schließlich wurde die Konzentration auf 10 g/1 Mannose für die letzte Periode erhöht. Jede Subkulturperiode dauerte 3 Wochen. Die Mannose- resistenten Schößlinge wurden weiter auf MS-Medium, dem 0,25 mg/1 6-Benzyladenin zugesetzt waren, kultiviert, und das Ausbilden der Wurzeln erfolgte im wesentlichen gemäß Miedema (1982) .
Die Analyse der Mannose-resistenten Schößlinge wurde dann wie folgt durchgeführt. Zum Sicherstellen, daß die Mannose- resistenten Schößlinge, die die Selektion überstanden, transgener Natur waren, wurden sämtliche Schößlinge auf PMI- Aktivität untersucht. Die nicht-transgenen Zuckerrübenschößlinge zeigen keine PMI-Aktivität (Phosphomannosei.somerase) . Es wurden Extrakte aus 2-3 Blattspitzen von einer Größe von ca. 3 mm hergestellt und dem gekoppelten PMI-Enzymassay , modifiziert nach Feramisco et al. (1973) und Gill et al. (1986) , unterzogen. Ungefähr 80-90 % der Schößlinge zeigten eine signifikante PMI-Aktivität. Die restlichen 10-20 % wurden verworfen.
Zum Durchführen des Nematodentests wurden die Schößlinge mit PMI-Aktivät und guter Wurzelentwicklung (4-6 Wochen alt) von den Agarplatten abgenommen, und die Wurzeln wurden sorgfältig in Leitungswasser gewaschen. In eine 4 x 2 x 12 cm Sandsäule, die auf den Seiten in Plastik eingehüllt war, wurde ein Loch eingeführt und die Schößlinge wurden darin eingepflanzt. Der Sand wurde vorsichtig um die Wurzeln gegeben und sorgfältig gewässert, und die Pflanzen in der Sandsäule wurden unter ein Kunststoffzeit für 10 Tage bei 25°C überführt. Das Zelt wurde nach und nach während dieser Dauer entfernt, um die Pflanzen abzuhärten. Diese Pflanzen wurden mit Nematoden unter Verwendung einer Spritze inokuliert, indem jeweils 200 juvenile Nematoden (J2) möglichst nahe an der einzelnen Pflanze in den Sand eingebracht wurden. 3 Wochen nach der Inokulation entwickelten sich die weiblichen Zysten, und sie wurden quantitativ bestimmt unter Verwendung eines Stereomikroskops. Die gesamte Wurzel einer jeden Pflanze wurde untersucht. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt. Diese Tabelle zeigt die Ergebnisse, die erhalten wurden mit der nicht-transgenen, anfälligen Linie Cl, der transgenen Kontrollinie CLD10, der nicht-transgenen anfälligen Kontrolle, die aus Samen entwickelt wurden (C2) , und den transgenen Pflanzen, die das Konstrukt LD10/1832-13 enthalten (T1-T9) .
Pf lanze Anzahl der durchschn itt l iche I D-Nummer
Pf lanzen Anzahl an Zysten/Pf lanze
Kontrol le Ci 4 9 lab 535
Kontrol le C2 9 9 , 3 Samenpf lanzen
Kontr . CLD10 2 9 , 5 T9600130 l 2 14 1458D τ2 2 9 , 5 1468A τ3 2 4 143614J τ 4 4 , 3 14479K τ5 2 2 , 5 144710L τ6 3 5 , 3 14054D τ7 4 6 , 75 142611H τ8 5 5 14052B τ9 4 7 , 5 14053C
9 unabhängige transgene Linien mit dem Konstrukt LDIO/ 1832- 13 wurden in diesem Test analysiert. 2 (Ti und T ) haben ungefähr die gleiche Anzahl an Zysten entwickelt wie die Kontrollen Cl f C und CLD10. 3 der transgenen Pflanzen (T3, T4 und T8) zeigen eine Zystenentwicklung von ungefähr der Hälfte der Kontrollen, wobei dies anzeigt, daß das Gen in diesen Pflanzen bis zu einem gewissen Grade aktiv ist. Eine der transgenen Linien, T5, zeigt eine Zystenentwicklung, die den zuvor berichteten Ergebnissen (Cai et al. 1997) entspricht. Die T5-Linie entwickelte nur durchschnittlich 2,5 Zysten pro Pflanze, wobei dies deutlich niedriger ist als die Anzahl an Zysten, die im Mittel von ungefähr 10 Pflanzen für die verschiedenen Kontrollen beobachtet wird. Dies zeigt deutlich, daß das 1832-Gen in den Wurzeln einer Zuckerrübenlinie, die kommerziell von Interesse ist, aktiv ist.
Die oben erwähnten Literaturstellen lauten wie folgt:
- Cai D., Kleine M. , Kifle S. , Harloff H.-J., Sandal N.N., Marcker K.A. , Klein-Lankhorst R.M. , Salentijn E.M.J., Lange W. , Stieke a W.J., Wyss U, Grundler M.W. und Jung C. (1997) Science 275, 832-834.
- Fera isco R. , Tilley B.E., Conn W.R., Gracy R.W., Noltmann E.A. (1973) Biochem. Biophys. Res. Comm. 55: 636-641
- Gill J.F., Deretic V., Chakrabarty A.M. (1986) J. Bacteri- Ol. 167: 611-615
- Holters et al. (1978) Mol. Gen. Genet . 163: 181-187
- Maniatis T. , Fritsch E.F., Sambrook J. (1982) Molecular Cloning: A laboratory manual. Cold Spring Harbor Laborato- ry, New York, USA
- Miedema P. (1982) Euphytica 31: 635-643
- Murashige T. , Skoog F. (1962) Plant Physiol. 15: 473-497
Beispiel 13
Herstellen des Plas ids LD10/1832-13
In Figur 5a-d ist die Herstellung des genannten Plasmids dargestellt. Das Xbal-Fragment von Nukleotidposition 1521- 2904 aus der SEQ ID Nr. 1 wurde mit Klenow-Enzym zu glatten Enden aufgefüllt. Dieses Fragment wurde dann in die mit glatten Enden versehene BamHI-Stelle des Plasmids pPS48 eingefügt. Dieses neue Plasmid, pPS48/BamHI-15 genannt, wurde dann mit Hindlll gespalten. Das HindiII-Fragment von Basen- paar 0-2403 wurde in die Hindlll-Stelle des Plasmids pLDIO eingeführt, wobei Plasmid LD10/1832-13 erhalten wurde.
Beispiel 14
Transformation von Brassica napus mit der Sequenz 1832 zur Erzeugung von Nematodenresistenz und Resistenztest
Als Transformationsvektor wurde das Ti-Plasmid pAM194 , enthaltend das Gen für die Nematodenresistenz (Sequenz 1832) verwendet. Der Vektor ist im einzelnen näher in Beispiel 11 beschrieben.
Als Bakterienstamm wurde Stamm C58C1 ATHV Rif verwendet, der sich vom Agrobacterium tumefaciens-Stamm EHA101 ableitet, welcher das Helferplasmid pEHAlOl ohne Kana ycinresistenz trägt.
Der Stamm AMT entspricht dem oben genannten Stamm C58C1 ATHV Rif, der das Plasmid pAM194-1832 enthält.
Die Anzucht der Bakterien für die Transformation erfolgte für die AMT-Kultur auf LB-Agar mit 50 mg/1 Kanamycin und 100 mg/1 Rifampicin und wurde bis zum Gebrauch im Kühlschrank aufbewahrt. Zwei Tage vor der beabsichtigten Transformation werden 30 ml LB-Nährmedium mit der entsprechenden Bakterienkultur angeimpft. Zur Bakterienselektion enthält das Flüssigmedium, wie auch der LB-Agar, 50 mg/1 Kanamycin und 100 mg/1 Rifampicin. Die Bakterien wurden 24 im Dunkeln bei 28°C auf einem Schüttler bei 190 up inkubiert. Am zweiten Tag impft man 30 ml LB-Medium ohne Antibiotika mit 20 μl der oben genannten, nach 24 Stunden erhaltenen Bakterienkultur an und inkubiert für weitere 24 Stunden bei gleichen Bedingungen.
Zur Anzucht von Sommerraps in vitro (Brassica napus ssp. oleifera cv. Sommerraps) wird das Saatgut in sterilen Erlen- meyer-Kolben mit NaOCl (3 % aktives Chlor) für 10 Minuten sterilisiert und anschließend 3 x mit sterilem destilliertem Wasser gespült. Die Samen werden dann auf MS-N-Medium mit B5-Mikroelementen und Vitaminen ausgelegt. In einem Container mit 50 ml Nährmedium werden 10 Körner ausgelegt. Die Körner werden bei ca. 2000 Lux und einem Tag-/Nacht-Rhythmus von 16 h/8 h für 4 Tage inkubiert. Die Anzuchttemperatur beträgt 25°C.
Zur Transformation mit A. tumefaciens (Kotyledonentransformation) werden von vier Tage alten Keimlingen die Kotyledonen mit einem Skalpell kurz über dem Meristem abgetrennt. Dazu faßt man beide Kotyledonen mit einer Pinzette und trennt sie gleichzeitig mit einem geraden Schnitt ab. Sofort nach dem Abtrennen taucht man die Petiole der Kotyledone für 10 sec in die unverdünnte Bakteriensuspension (Übernachtkultur) . Dann werden die Kotyledonen zurück auf das Anzuchtmedium gesteckt. Die Cokultur von 48h wird bei 25°C und Dämmerlicht durchgeführt. Nach Beendigung der Cokultur werden die Kotyledonen in Container mit 50 ml MSM-Medium, das 750 mg/1 Carbenicillin zur Bakterienabtötung enthält, gesetzt und 7 Tage bei bei 25°C und 2000 Lux bei 16 h Tag kultiviert. Nach 7 Tagen auf MSM mit 750 mg/1 Carbenicillin werden die Kotyledonen auf das gleiche Nährmedium umgesetzt, das zu Beginn zusätzlich 20 mg/1 Kanamycin zur Sproßselektion enthält. Bei späteren Passagen ist die Kanamycin-Konzen- tration auf 25 mg/1 erhöht worden. Nicht-transgener Kallus wird turnusmäßig entfernt. Die abgetrennten Sprosse werden zur weiteren Selektion bzw. zum Nachweis der Transgenität auf B5-Medium mit 50 mg/1 Kanamycin und 400 mg/1 Betabactyl gesetzt. Das mitübertragene GUS-Gen erlaubt eine weitere Identifikation transgener Sprosse zum frühestmöglichen Zeitpunkt. Die Bewurzelung der transgenen Sprosse findet auf B5- Nähr edium ohne Hormone statt. Zum molekularbiologischen Nachweis der Genübertragung wird ein GUS-Test als histochemischer Nachweis auf ß-Glucuroni- dase-Aktivität durchgeführt. Das Enzym spaltet Indol von einem künstlichen Substrat ab, so daß sich GUS-positive Blattstücke blau färben. Der Testablauf ist gemäß Jefferson R.A. (1987) : Assaying chimeric genes in plants: The GUS gene fu- sion System. Plant Mol. Biol. Rep. 5: 387-405.
Ein weiterer molekularbiologischer Nachweis der Genübertragung ist der NPTII-ELISA-Test , bei dem die Bildung des Enzyms Neomycin-Phosphotransferase, welches der transgenen Pflanze Kanamycin-Resistenz vermittelt, qualitativ und quantitativ nachgewiesen wird. Der Test wurde mit dem NPTII- ELISA-kit (Kat. Nr. 5307-630101) der Firma CP Instruments Co., Ltd. durchgeführt.
Um ständig ausreichende Larvenmengen für die Inokulation bei Resistenztests mit Heterodera schachtii zur Verfügung zu haben, wurden die Nematoden an den Wirtspflanzen Senf (Sorte "Albatross" Petersen-Saatzucht) sowie Rüben vermehrt. Die Samen werden in 3 %iger Ca (0C1) 2-Lösung für 10 min und anschließend 3-4 x mit sterilem destilliertem Wasser gespült. Anschließend trocknen die Samen auf sterilem Filterpapier und werden dann auf Wasseragar mit 8 % Agar-Agar aufgelegt. Nach 3-4 Tagen auf diesem Agar bei 25°C in Dunkelheit werden die jungen Keimlinge auf 0,2 konzentriertes Knoop-Medium umgesetzt. Die Wurzeln sollten dabei etwa 3-4 cm Länge aufweisen. Verwendet werden Petrischalen mit 15 cm Durchmesser und Nocken, in die zwei Keimlinge gegenüber plaziert werden. Nach 14 Tagen Wachstum im Dunkeln bei 25°C erfolgt die Inokulation mit 1000 Nematodenlarven im L2-Stadium. Nach etwa 4 Wochen bei 25°C in Dunkelheit haben sich reife Zysten gebildet, die nun gesammelt werden können. Bei der Zystenernte werden mit einer Federstahlpinzette ca. 200 Zysten in ein kleines Sieb, Maschenweite 50-200 μm, gesammelt, welches in einem Glastrichter gefüllt mit Zinkchloridlösung (3 mM) steht. Am Trichterauslauf ist ein Silikonschlauch befestigt, wicher mit einer Stahlschlauchklemme abgeklemmt ist. Diese Anordnung steht in einem hohen 250 ml Becherglas, welches mit einer Alufolie abgedeckt wird.
Nach 3 Tagen bei 25°C im Wärmeschrank haben sich die geschlüpften Larven vor der Stahlklemme im Silikonschlauch gesammelt und können durch kurzes Öffnen der Klemme in ein Sieb mit 15 μm Maschenweite geerntet werden, wobei der Trichter mit einer Pinzette gehalten wird. Die Larven werden nun 3 x mit sterilem Wasser gespült und anschließend mit einer Pasteurpipette in ein steriles Blockschälchen überführt. Nach etwa 3 min Wartezeit, in der die Larven zu Boden sinken, wird die überschüssige Flüssigkeit weitestgehend abgesaugt und durch 0,5 %ige Gelrite-Lösung ersetzt, die eine homogene Verteilung der Larven gewährleistet. Nach sorgfältigem Durchmischen wird die Konzentration der Larven mittels Stereomikroskop überprüft, wobei die Larven in einem 10 μl Tropfen gezählt werden.
Zur Durchführung der in vitro-Tests wurden die Wurzeln von den Sprossen der transgenen Ausgangsklone abgetrennt und auf 4 B5-Medium mit 300 mg/1 Betabactyl und 8 g/1 Daishin-Agar aufgelegt. Jede Inokulation eines transgenen Ausgangsklons wird mit je 5 Wurzeln durchgeführt. Als anfällige Kontrolle wird Ölrettich verwendet, dessen Wurzeln wie oben beschrieben erhalten worden sind. Pro Schale werden etwa 100 L2- Larven von Heterodera schachtii auf die Wurzeln getropft, die wie oben beschrieben erhalten worden sind. Zur Inokulation wird eine Multipette mit 0,5 ml Combitip verwendet. Die mit Parafilm versiegelten Schalen inkubieren bei 25°C im Dunkeln. Die erste Zählung der gebildeten Zysten erfolgt nach 14 Tagen, die zweite und letzte Zählung nach 20 Tagen, wenn die Zysten bereits schwach gebräunt sind und sich so besser von den weißen Wurzeln abheben.
Bei der Durchführung der in situ-Tests werden zunächst je 5 Sprosse pro transgenem Ausgangsklon in das Gewächshaus überführt. Die Sprosse sollten sich dazu bereits etwas gestreckt haben und einige wenige Wurzeln besitzen. Sie werden in Aussaaterde pikiert, in der sie 1,5 Wochen verbleiben, um mehr Wurzelmasse zu entwickeln. Überdies gibt ihnen das die Möglichkeit, sich an die Gewächshausgbedingungen zu aklimati- sieren. Nach 1,5 Wochen werden die Pflanzen in Quarzsand mit einem Kordurchmesser von 0,1-0,5 cm pikiert, der zuvor mit Nährlösung nach Steiner angefeuchtet worden ist. Die Inokulation wird in diesem Sand durchgeführt, da das Ausschlämmen und Auszählen der Zysten durch Humusteilchen und Schmutzpartikel stark erschwert wird. Der Sand befindet sich in Röhrchen, die in einer Kiste aufgestellt werden. Da die Randbereiche einer Kiste den Pflanzen mehr Licht und damit bessere Wachstumsbedingungen geben, werden die Testpflanzen von anderen Pflanzen umgeben, so daß jede Testpflanze einen Nachbarn hat. Eine Woche nach dem zweiten Pikiertermin erfolgt die Inokulation mit (600) frisch geschlüpften H. schachtii-Larven , L2-Stadium. Die Auswertung erfolgt nach ca. 6 Wochen, wenn die Zysten braun geworden sind und leicht von den Wurzeln abgespült werden können. Die Zysten werden durch Abspülen mit einem scharfen Wasserstrahl durch ein Küchensieb von den Pflanzenwurzeln abgetrennt, in einem 100 μm Sieb aufgefangen und durch Zentrifugation vom Sand getrennt. Das erhaltene Gemisch aus Zysten, feinen Wurzeln und Wasser wird filtriert und die Zysten dann unter dem Biokular bei 10-facher Vergrößerung ausgezählt.
Die Transgenität der Pflanzen wurde durch PCR-Analysen sowie NPTII-ELISA- und GUS-Tests gezeigt. Die Tabelle zeigt die Ergebnisse aus dem in vivo-Resi- stenztest mit der nicht-transgenen anfälligen Sorte T0 und den transgenen Pflanzen T7 bis T15 mit dem Gen 1832.
10 unabhängige, transgene Linien mit dem Gen 1832 wurden in diesem Test ausgewertet. 6 Linien (T8, T9, T10, T1X T13 und T1 ) hatten eine vergleichbare Anzahl von Zysten wie die anfällige Linie; 3 Linien (T7, Tai und T15 hatten im Vergleich zur Kontrolle eine Reduktion der Zysten von 27% und 1 Linie (τ ll) eine Reduktion der Zysten von 47 %. Dies zeigt, daß das Gen in den Pflanzen aktiv ist und bei Brassica napus eine deutliche Reduktion des Zystenbefalls zu erzielen ist.
Beispiel 15
Kartoffeln der Sorte Bintje wurden mit dem Plasmid pAM194 mit dem Insert 1832 unter der Kontrolle des 35S-Promotors mit A. rhizogenes transformiert. 40 unabhängige Hairy-Root- Kulturen wurden mit je 250 Globodera pallida-Larven inokuliert. Nach 56 Tagen wurde die Nematodenentwicklung untersucht. 35 Kulturen zeigten eine normale Nematodenentwicklung mit durchschnittlich 40 reifen Weibchen/Petrischale. An 5 Wurzelkulturen war die Entwicklung von Weibchen gestört. Dort wurden nur je 10 reife Weibchen gefunden. Dies zeigt, daß die Sequenz 1832 in Kartoffeln deren Resistenz gegen Ne- matodenbefall verbessern kann. SEQUENZPROTOKOLL
(1) ALLGEMEINE ANGABEN:
(i) ANMELDER:
(A) NAME: Prof. Dr. Christian Jung
(B) STRASSE: Zum Amt 15
(C) ORT: Daenischenhagen
(E) LAND: DEUTSCHLAND
(F) POSTLEITZAHL: 24229
(ii) BEZEICHNUNG DER ERFINDUNG: Nematodenresistenzgen (iii) ANZAHL DER SEQUENZEN: 5
(iv) COMPUTER-LESBARE FASSUNG:
(A) DATENTRÄGER: Floppy disk
(B) COMPUTER: IBM PC compatible
(C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS
(D) SOFTWARE: Patentin Release #1.0, Version #1.30 (EPA)
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 1:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 5401 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Genom-DNA
(vi) URSPRÜNLICHE HERKUNFT:
(A) ORGANISMUS: Beta vulgaris
(B) STAMM: A906001
(vii) UNMITTELBARE HERKUNFT:
(A) BIBLIOTHEK: lambda DASHII
(B) CLON(E) : 1832.1
(viii) POSITION IM GENOM:
(C) EINHEITEN: 5401
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 1:
TCTAGAGCTG TCGACGCGGC CGCGGAATTA ACCCTCACTA AAGGGAACGA ATTCGGATCT 60
TCTTTCTTGG TGCTTAATTT TTTGACACTA ATCCGATTCT TAGCATTAAG TTGAAGCACA 120
CTCTTGATAA ACTATGTTAC TATGTATCAT TGTCAATATG CTAAGAATTT GTCTTGACCT 180
CATCGCTATG TATAAGCATC TAATACTTTC CTAAACTAGT AAAAACAAAT ATTCCATCCG 240
TCCCATAATA TGAGTCCCCT TTCTATTTTA GGAGTCAAAA TTTTAAAATT TTTGACCAAA 300
TATTCTTATT ACTATATATA AAAACATATT CATGTGGGAT CTTGTTAGAT TCGTCTTAAT 360
ERSATZBLAH(REGEL26) ATGTATTTTC ATAATATCAA CTTTTTATAT TTTTTTACTA ATACGAAATT GAAGATATAC 420
AATGTCTTAA AGACTATGCA AAAGTAAGCA GAACCTATAT TTTGGGACGG AGGGAGTAAT 480
AAGTAATATT GATTGACGCA TAATTTGTAT ATAAATATTT CAAATTGATA CTACTTTAAA 540
TAATATAGTT AATGCTTATA AATAAGCCTA AAGACTGTGA ATAGCAAGAT CGTTAAAAAT 600
AAAATTTGAA AATATTTGAT ATGGATAATG AAATTGGAAA TGGCATGCTT AGCTTCTCGG 660
GAATCTTATA CCGCTACATC TATAATAAAA ATTCCTCATA AAATTTTGCC CATTTTAACA 720
CACGAAATTC GTCCTTTTAC GCGAGCCCTT TCCACACGTC TTTAAAATTT AAAAACCTCG 780
TCTTTACTCT CCCCACCTAT ATATATACAC GTCCCCCCTT CTCTACTTCC CATCTCACAT 840
ACACATACCC AATCCACAAA CTTCCATCTT ATCCAACTTT CTCTCACCTA TCTCCTTCTT 900
CAATTTTCAA AACTCAAAAG AAAATGGTAG ATTTCGATTG CAAAACAAAA ATGGTACAAT 960
CAACACCAAA CCTCACAAAA AAATCTCCAA AAATCACAAC CAAACGCACA ATATCAACAC 1020
CATTAATTTC ACCAGTACCA GTAATTTCCG GCGAATTATC TCCGGCGTCG GAATCATCCT 1080
GTTCAGCTTA CGAATCGTAT CTCAAATTAC CGGAGCTCCG TCAACTATGG AGTTCAAAAG 1140
AATTCCCCGG TTGGGATAAC GAACCGATAA TCAAACCGGC TTTGCAAGCA TTAGAGATAA 1200
CATTCCGGTT CATCTCACTC GTTTTATCCG ACGCTAGACC GTACATAAAC CGGCGAGAAT 1260
GGAACCGGAA ATTAGAGTCG TTAGCGAGAG ATCAAGTCCG AAACTCATCT CAGTTCTCTG 1320
CGGAAGACGA TGAGACACGT GGATCAGCTC CGAATCGTTG ATCTGACGTC ATCGTATGGT 1380
GAGGTGATGT CACAAACAGA AGTTCAGCGG AGGTATGGAA GCTTGCGAAT GGAGAACATG 1440
ATACTACCGT GGTCTGTCGT AGTAGCGAAT TTAGTCTCCT TCCGAGGTTA GCCACGTGGC 1500
AGAAGTCGGA GGAGATTGCT TCTAGAATCT TCTACGCGGT TGAATCTGCT ATGAGAAGGT 1560
GTGGGTATAG TTTGGGCCTT GGTGAGCCCA ATTTGGACGG AAAGCCCAAT TTAGATTACG 1620
ACGCCGTTTG TCGTCCTTCT GAGCTTCACG CGCTTAAAAA GGGCGCGTTG GATTATATTC 1680
AGAATTCGGA AAATCAGATA TTGTTTACAA TTCATCAGAT TTTCGAGTCG TGGATTTTTT 1740
CCTCGAAAAA ATTGTTGGAT CGAATAAGTG AGAGGATCAG TAAAGAAGAG TTTACCAAAG 1800
CAGCAGATGA TTGTTGGATA CTGGAGAAAA TATGGAAGTT ATTGGAGGAA ATCGAGAATT 1860
TACATTTATT AATGGATCCT GACGATTTCC TGCATCTGAA GACGCAACTG AGGATGAAAA 1920
CAGTGGCGGA TTCTGAAACT TTTTGTTTTC GATCAAAAGG ACTGATCGAG GTAACAAAAT 1980
TAAGCAAGGA TCTACGGCAC AAGGTGCCGA AGATCCTTGG TGTAGAGGTG GACCCTATGG 2040
GAGGACCGGT GATACAAGAG TCGGCAATGG AGTTGTACCG AGAAAAAAGA AGATACGAGA 2100
AGATACATCT GTTACAAGCG TTTCAAGGGG TGGAATCCGC TGTTAAAGGG TTTTTCTTTA 2160 ATTATAAACA GTTGTTGGTG ATCATGATGG GTAGTTTGGA AGCGAAAGCG AATTTTGCTG 2220
TGATTGGTGG TTCTACTGAG TCTTCGGATT TGTTGGCTCA GTTGTTTTTA GAACCTACTT 2280
ATTATCCGAG TTTGGATGGT GCCAAGACTT TTATTGGTGA TTGTTGGGAG CATGATCAGG 2340
CTGTTGGTAG CGGCCTCGAT TGTCGTCATC ATCGGAAGAA TCGGACTGCG AAACAATGAT 2400
GGTTTCGAAG TTAGTTTTGG ATTGAGTTTG GTTTGATCTG ACTCGGCTGA GTAATGGGCG 2460
GCGATAGGGA GGTTATGGAG AACGTGGGGC GGAAAGTGGG TGGCCTTGTT AGTGAGACGT 2520
GCAAACTTTG GTTACTATTA CATGTGATAT ACTTATATTT AGTGGGAATA TTGCTTTGGT 2580
GTATATAGAT AAATTTTTGA ATTAATTGTT ACACTTGTAT TAGTAAATTC TGTATCATGA 2640
TGATTATAAC ATGAATTTTT TGTTGTGACT TTAAATGAGA TTTATGCTCC TTAATCCTTA 2700
TTTCACTGAT ATTATTTTTT TGTAGTCTGA GTATAAGTGC GGAGTTTAAT CAAGCAAGAG 2760
AAAATAATAG AAGGTGATTG CATACTTGGA TTGGAGATCA ATATCTAAAA GATGGTTATG 2820
AAACTATTGT GAATAACGGA GTACATGTCC AACACCACAC ACGTATGACT GTGTACCTCT 2880
AATTTACAAA GAGATTTACA AAATCTAGAT GAGTTTTGAT ATGATCGACA TTGTCTCTAA 2940
ATGGGAGATA AGAATTAAAT CGTGAGGCTC TTTGCGGCTA GNTCTTCCGA ATAAAATAAG 3000
AAACAATGGT TTACTCTAAT TCANTTTTCC AATTGGCAAA GTGGCACAAG CTTCAATAAN 3060
TNGGCTCTTC ACAATTGAGT ATAAAAGAAT GGGTTAATTA CNCCGGNCTT TGAATAAAAT 3120
TAATCCTATT TAATTGTTTT TGAAATATTC TTAAAAATAN CGTTGTCTAA TACTTTCTTT 3180
AGTTGGGACC CGGTTCTGAA CCNACTTAAA TTAATGGGCT CAATGGCCGC CTAATTTCCT 3240
CTTGTTATTT TTAGCCTTTT TTTTCCTTTT TTTCCCTTTA AAATAACTAT TTGTTCTCTT 3300
GAATATCTTA AAATACGTGT CTATCNNCTT TAGTTGGACC GTCTGAACTA TTATTATGCT 3360
ATGCACTATT CCTTTGTATT TACCTTTTTC TTTTTCCTTT AAATACTATT GTTCTCATTT 3420
CAATTATATT CTATTTTTGT TAAAAAACGG TCTTAATTTT TACAACAGTA AAATTATTGA 3480
TTTTCCTTCT ATATTAAAAT TTGAAAGTGA ATGTATTTCG AAATTTAGGT ATATGAATAT 3540
TTATATTGTT CGATTAATGA TGATAAAAGG ATTTTACTCA TTAACCTAAA CCATTTCTAG 3600
ATAAGATAAG AGGAACTTCC ACCTAGTTAA CATGTCTCAC TTTCCTAGTA GACGAATCTA 3660
AATTGCGTTG CTGGATTTAG AACTTTGGTC AAGATAATGG CAAAACTTTC AAGCACCCGT 3720
AGATGCATTT TCCNCGACAT TTCTCATACA GCACTAAACG TTTCAACTTC CTCTTTTATT 3780
TTCTTGAAAT TTTTTGTGGC AATGAGAAAC GTTCGAAGTT GATCTTTGCG TTTCGACGAT 3840
TTGAAATAAG AAAATGCGTA TTGTCGGCAA CTGATTGTAG TAGTTGCNGT TATTATAATG 3900
ATAGTCTTTT ATATAGAATT CATTTAATTC TAATTCATTT GAATCCAGTT AAGTTGAGTT 3960 TAGTTTAGTC AGCCTAAAAG AACAAAGTAA GTCATGGAAT GGAATGAAGA TGTAATCAAA 4020
TAGAGGAGGG GCTGATAACA ATAATTATTA CTTATGTTGC GTGTTCAATT CAGTAATGAA 4080
AAAAATAAGG TTGAATTAGG AGGGTAATAC AATTATTACC GGTGATGTGA TAAAACTAAT 4140
GTTTAAGGGT TTAAGTTACT CTAAACCCTC AATTAAACAT AGTCTAACAA AAAATTCTCA 4200
TAATCTAAAT CAAACACGTA CTTATACAAT CCTCTACATG AATCCGTTTC TAACTCTAAA 4260
GGAAGATCGA TACTTATTAG AATCCGTTTC CAACCCTAAA AATGACTGAT CAAAGGTTCA 4320
TGGATTTTGG AAGGGAAAGA CGAATGCGAG GGCAGTGTAC AGGATAATGT GCATGAGATG 4380
GCAAGGGTCA TGCTAGTTAG AGCAAAATAT ANATGACTTA ATTCAAAAAC TACCTACTAT 4440
TTCAAATTAA TAGACTTTAT TGGAGTCATG AAGTGTACTG TTTGGTACAC CCCACATTAC 4500
TCATGCACTA CACCTAATTT GTCACAGCAT TCAGCTGCCC TTGTTTTGCA GTCTTTGGAG 4560
CTGGCGTGCC TCTTGTTGCT GGTTAGTCGG CGCTTGGTCT GTTGTGNNGT GACCCTCTGT 4620
TTTTTTTTTT TTTTAAAATG GTCGCTGATT ACTATNCTGT GTATTNCATT TTGTACTCCC 4680
TCGTATCCAA TTATATGCTA CACTTTTTTT GCGGACTCCA AAACGTTTTT TTTTTNTGTC 4740
CGAGAGATAG AGAGGAAAAG CCCATGTTGT TAGGAGAGAG NTCGGGAGAA GGAAAAGCCA 4800
AATAAAGAAG TAATAACATC TAAATAAGAA AATTCCTTTG ATGGAAAGTG TAGCGACTAA 4860
AAAACGAAGG ACAATATGTA GTTTTCATAT GCCTTTACCT TTGCAATCTC CTTTTTTATT 4920
GTTTACCCAT ACTGGATTAG GTTGGATTTA TCAACACAAA ATGAGTTGGA CTATATCACT 4980
ACATTACTGT GGTCCTGTGG ATACATCAAC AAAAAAAATG AGTTGGACCA TATCAATGTG 5040
TTAGCGTGGA TTATGTACAC ATTGGACTGG AGTTGAAGCA AATATAATCT GAAAAGGGCG 5100
ATGGGTTAGG TCATGAGGTA TTTAGAATAA GACTTTGATC AAGCCCAAAT CCACCCGCAA 5160
AGAATTATAC CCTTTATTTT CAAGGCACCA TCACTGCATA AAATAATCTG AAATGCCACA 5220
AAAGATTAAC GTCCAATATG CTCACAGCCA AAAATCAATC CATTATTGTT TGGTAAGAAA 5280
AGGTAATAGG CTAGATCAAT TTGCTGCCAA TTGCCAGGCC TGTGGGCCTG TCACCTGTGG 5340
GTAATTTAAT ATGNCTCAAA TGGGTCGGCC TGTTAAGTAC ACCAACATGA ACTTAAAGCT 5400
T 5401 (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO : 2:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LANGE: 849 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA (viii) POSITION IM GENOM:
(C) EINHEITEN: 849bp
( i) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO : 2:
ATGAGAAGGT GTGGGTATAG TTTGGGCCTT GGTGAGCCCA ATTTGGACGG AAAGCCCAAT 60
TTAGATTACG ACGCCGTTTG TCGTCCTTCT GAGCTTCACG CGCTTAAAAA GGGCGCGTTG 120
GATTATATTC AGAATTCGGA AAATCAGATA TTGTTTACAA TTCATCAGAT TTTCGAGTCG 180
TGGATTTTTT CCTCGAAAAA ATTGTTGGAT CGAATAAGTG AGAGGATCAG TAAAGAAGAG 240
TTTACCAAAG CAGCAGATGA TTGTTGGATA CTGGAGAAAA TATGGAAGTT ATTGGAGGAA 300
ATCGAGAATT TACATTTATT AATGGATCCT GACGATTTCC TGCATCTGAA GACGCAACTG 360
AGGATGAAAA CAGTGGCGGA TTCTGAAACT TTTTGTTTTC GATCAAAAGG ACTGATCGAG 420
GTAACAAAAT TAAGCAAGGA TCTACGGCAC AAGGTGCCGA AGATCCTTGG TGTAGAGGTG 480
GACCCTATGG GAGGACCGGT GATACAAGAG TCGGCAATGG AGTTGTACCG AGAAAAAAGA 540
AGATACGAGA AGATACATCT GTTACAAGCG TTTCAAGGGG TGGAATCCGC TGTTAAAGGG 600
TTTTTCTTTA ATTATAAACA GTTGTTGGTG ATCATGATGG GTAGTTTGGA AGCGAAAGCG 660
AATTTTGCTG TGATTGGTGG TTCTACTGAG TCTTCGGATT TGTTGGCTCA GTTGTTTTTA 720
GAACCTACTT ATTATCCGAG TTTGGATGGT GCCAAGACTT TTATTGGTGA TTGTTGGGAG 780
CATGATCAGG CTGTTGGTAG CGGCCTCGAT TGTCGTCATC ATCGGAAGAA TCGGACTGCG 840
AAACAATGA 84 (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO : 3:
( i ) SEQUENZKENNZEICHE :
(A) LÄNGE: 1774 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA
(Vi) URSPRÜNLICHE HERKUNFT:
(A) ORGANISMUS: Beta vulgaris
(B) STAMM: B883
(vii) UNMITTELBARE HERKUNFT:
(A) BIBLIOTHEK: lambdaZAPII
(B) CLON(E) : extl832-16c
(viii) POSITION IM GENOM:
(C) EINHEITEN: 1774 (xi ) SEQUENZBESCHREIBUNG : SEQ ID NO : 3 :
CCACAAACTT CCATCTTATC CAACTTTCTC TCACCTATCT CCTTCTTCAA TTTTCAAAAC 60
TCAAAAGAAA ATGGTAGATT TCGATTGCAA AACAAAAATG GTACAATCAA CACCAAACCT 120
CACAAAAAAA TCTCCAAAAA TCACAACCAA ACGCACAATA TCAACACCAT TAATTTCACC 180
AGTACCAGTA ATTTCCGGCG AATTATCTCC GGCGTCTGAA TCATCCTGTT CAGCTTACGA 240
ATCGTATCTC AAATTACCGG AGCTCCGTCA ACTATGGAGT TCAAAAGAAT TCCCCGGTTG 300
GGATAACGAA CCGATAATCA AACCGGCTTT GCAAGCATTA GAGATAACAT TCCGGTTCAT 360
CTCACTCGTT TTATCCGACG CTAGACCGTA CATAAACCGG CGAGAATGGA ACCGGAAATT 420
AGAGTCGTTA GCGAGAGATC AAGTCGAACT CATCTCAGTT CTCTGCGAAG ACGATGAGAC 480
ACGTGGATCA GCTCCGATCG TTGATCTGAC GTCATCGTAT GGTGAGGTGA TGTCACAAAC 540
AGGAAGTTCA GCGGAGGTAT GGAAGCTTGC GAATGGAGAA CATGATACTA CCGTGGTCTG 600
TCGTAGTAGC GAATTTAGTC TCCTTCCGAG GTTAGCCACG TGGCAGAAGT CGGAGGAGAT 660
TGCTTCTAGA ATCTTCTACG CGGTTGAATC TGCTATGAGA AGGTGTGGGT ATAGTTTGGG 720
CCTTGGTGAG CCCAATTTGG ACGGAAAGCC CAATTTAGAT TACGACGCCG TTTGTCGTCC 780
TTCTGAGCTT CACGCGCTTA AAAAGGGCGC GTTGGATTAT ATTCAGAATT CGGAAAATCA 840
GATATTGTTT ACAATTCATC AGATTTTCGA GTCGTGGATT TTTTCCTCGA AAAAATTGTT 900
GGATCGAATA AGTGAGAGGA TCAGTAAAGA AGAGTTTACC AAAGCAGCAG ATGATTGTTG 960
GATACTGGAG AAAATATGGA AGTTATTGGA GGAAATCGAG AATTTACATT TATTAATGGA 1020
TCCTGACGAT TTCCTGCATC TGAAGACGCA ACTGAGGATG AAAACAGTGG CGGATTCTGA 1080
AACTTTTTGT TTTCGATCAA AAGGACTGAT CGAGGTAACA AAATTAAGCA AGGATCTACG 1140
GCACAAGGTG CCGAAGATCC TTGGTGTAGA GGTGGACCCT ATGGGAGGAC CGGTGATACA 1200
AGAGTCGGCA ATGGAGTTGT ACCGAGAAAA AAGAAGATAC GAGAAGATAC ATCTGTTACA 1260
AGCGTTTCAA GGGGTGGAAT CCGCTGTTAA AGGGTTTTTC TTTAATTATA AACAGTTGTT 1320
GGTGATCATG ATGGGTAGTT TGGAAGCGAA AGCGAATTTT GCTGTGATTG GTGGTTCTAC 1380
TGAGTCTTCG GATTTGTTGG CTCAGTTGTT TTTAGAACCT ACTTATTATC CGAGTTTGGA 1440
TGGTGCCAAG ACTTTTATTG GTGATTGTTG GGAGCATGAT CAGGCTGTTG GTAGCGGCCT 1500
CGATTGTCGT CATCATCGGA AGAATCGGAC TGCGAAACAA TGATGGTTTC GAAGTTAGTT 1560
TTGGATTGAG TTTGGTTTGA TCTGACTCGG CTGAGTAATG GGCGGCGATA GGGAGGTTAT 1620
GGAGAACGTG GGGCGGAAAG TGGGTGGCCT TGTTAGTGAG ACGTGCAAAC TTTGGTTACT 1680
ATTACATGTG ATATACTTAT ATTTAGTGGG AATATTGCTT TGTGTATATA GATAAATTTT 1740
ERSΛTZBLATT (REGEL 26) TGAATTAATT GTTACACTTG TATTAGTAAA TTCT 1774 ( 2 ) ANGABEN ZU SEQ ID NO : 4 :
( i ) SEQUENZKENNZEICHEN :
(A) LÄNGE : 1705 Basenpaare
(B) ART : Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA
(vi) URSPRÜNLICHE HERKUNFT:
(A) ORGANISMUS: Beta vulgaris
(B) STAMM: B883
(vii ) UNMITTELBARE HERKUNFT :
(A) BIBLIOTHEK : lambdaZAPII
(B ) CLON (E) : Bvl832 -6b
(viii) POSITION IM GENOM:
( C) EINHEITEN : 1705
(xi ) SEQUENZBESCHREIBUNG : SEQ ID NO : 4 : ACAAACCACA AAATTACATC TTATCCAATT TTCTCTCTCC TACTATTTAT CTCTCTTCAT 60 CTTCAAATTC AAAACTCAAA ATTTCCAAAA AACATATCAG AAATTCAAAA AAATGGTTGA 120 TTTCGATTGC AAAACAAAAA TGGTTCAATC AACACCAAAT CTCACAAAAA AAAACCCCAA 180 AACGCATCAC TTCAACGCCG GTAATTTCAC CGGTACCGGT AATCGCCGGT GAATTATCAC 240 CGGCATCGGA ATCTTCATGT TTAGCATACG AATCATATCT CCGGTTACCG GAGCTCCGAG 300 AATTATGGAG TTCAAAAGAA TTTCCAGGGT GGAAAAACGA GTCAATAATT AAACCGGCTT 360 TACAAGCTTT AGAAATAACT TTCCGGTTTA TTTCAATTAT TTTATCCGAC GCTAGACCGT 420 ACGTGAACCG GCGTGAATGG AATCGTCGAT TGGAGTCGTT AACTCGAGAT CAAGTCGAGT 480 TAATCTCGAT ATTATGTGAA GATGATGAAA CATCTGGTTC TGCTCCCATA ATGGATCTGA 540 CATCATCTTT CGGTGAAGTG ATGTCACAAA CTGGAAGTTT TACAACAGAA GTATGGAAAC 600 ATGAAACTAC TTCGGTAGTA TGTCGTAGTA GTGAATTTAG TCTACTTCCT AGACTTGCCA 660 CGTGGCATAA ATCAGATGAG ATTTCTTCTA GAATATTCTA CGCGGTTGAG AGCGCGATGA 720 AGAGGTGTCC ATATAGTTTG GGCTTAGGTG AGCCCAATTT AGATGGAAAG CCCAATTTGG 780 ATTACGACGT CGTTTGTCGT CCTACTGAAA TCCACGCGCT TAAAAAAGGC GCGTTGGATT 840 ATATTCAAAA TCCGGAAAAC CAGATTTTAT TCACAATTCA TCAGATTTTC GAGTCGTGGG 900 TTTTTTGCGC GAAACAATTG TTGATTCGTG TAGGAGAGAG AATCAACAAA GAAGAATTCA 960 ACAAAGTTGC AGATGATTGT TGGGTTTTAA CAAGAATCTG GAACATTCTA GAAGAAATCG 1020
AGAATTTACA TTTATTAATG GATCCAGATG ATTTTCTACA TTTGAAAACT CAATTACGGA 1080
TGAAAACGAC GTCGGATTCT GAAACATTTT GTTTCAGATC AAGAGGTTTA ATTGAAATTA 1140
CAAAATTAAG TAAAGATTTA CGTCACAAAG TTCCAGAAAT TCTAGCCGTT GAAGTGGACC 1200
CCATGGGTGG ACCAGTAATA CAAGAATCAG CAATGGAGTT ATATAGAGAG AAGAGAAAGT 1260
TCGAGAAGAT TCATGTTTTG CAAGCATTTC AAGGTGTTGA ATCTGCTGTG AAAGGTTTTT 1320
TTTATAATTA TAAACAATTG TTGGTGATTA TGATGGGAAG TTTAGAAGCT AAGGCTAATT 1380
TTGCTGTAAT TGGTGGTGGT TCTGAATCGT CTGATTTATT GGCTCAGATC TTTCTAGAAC 1440
CTACTTATTA TCCTAGCTTA GATGGTGCCA AGACTTTTAT TGGTGATTTT TGGGATCATG 1500
ATCAGACGGT TGTGAGTGGG TGTGATAGGA AAAATCGGGT TGCGAAAAAT TGATCATTGA 1560
TAAAAGGGCG AAAGTATACT TGGCCGTCCT CCTTAACCAA GTCTGGTTTC GCTCCTGGGT 1620
GATGGTGGTG GTGTCGTTGG TGAGACGTGG GTTACTTTGA TTACTTGTTA CAATGTGATG 1680
ATATATTTAG TGGAATACTA TTGCT 1705 (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO : 5:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 1490 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA
(vi) URSPRÜNLICHE HERKUNFT:
(A) ORGANISMUS: Arabidopsis thaliana
(B) STAMM: Columbia
(vii) UNMITTELBARE HERKUNFT:
(A) BIBLIOTHEK: lambdaPRL-2
(B) CLON(E) : 61cllt7
(viii) POSITION IM GENOM:
(C) EINHEITEN: 1490
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 5:
ACAAACACAA ACACACACAC CAAAAAAAAC ACAGACCTTA AAAAAATAAA AATGGTTGAT 60
ATGGATTGGA AGAGGAAGAT GGTATCATCA GATTTACCAA ACTCACCTAA GCTTTCTTCA 120
AAGCTTCACG TAACTATTCC ATCACCGTTC AAAATCGTCC CTGTTTCATC TCCGATCTCA 180
TGTTCAGCAC CTGCTCTTTG CTCTGCTTAC GAGCTTTACC TTCGTCTCCC TGAGCTAAGA 240
AAGCTCTGGT CATCTCGTGA TTTTCCTCAA TGGACATCAG AGCCGATTCT CAAACCAGCT 300 CTTCAAGCTT TGGAGATCAG TTTCAGATTA GTTTTCGCCG TTTGTTCTGA TACTAGACCG 360
TACATCAACC ACCGTGAATG GAACCGGAGG CTAGATTCTC TCATCACGAA GCAGATCCAG 420
CTTGTAGCAG CGATCTGCGA AGATGAAGAA GAAGAAGGTA TATCAGCGGA GGCTCCGGTC 480
GGCGGTGGAC GGAGTTCGTT GAGTTTGTTA CCGCAGCTAG CTACGTGGAG GAGATCAGAG 540
GCTTTGGGGA AGAAGATCTT ATATACGATC GATAACGAGA TGAGTCGGTG TAAGTACACG 600
CTCGGACTCG GTGAACAAAA CATCGCCGGA AAACCAAATC TCCGGTACGA TGCGATTTGC 660
CGACCAAACG AGATCTATAG CCTCAAGGAT AATCCATACG CAGATCATAT CGATAATCAC 720
GAGAATCAAA CTCTCTATAT CATTCACCAG ATCCTCGAAT CGTGGATCTA CGCATCTGGA 780
AATCTTCTGA ATCGAATCGT CTCAAGTATC GAAGAAGAGA AATTCGGAAA AGCTTCAAAC 840
GATGTTTACT TGCTGGAGAA GATCTGGAAA ATTTTAGCGG AGATTGAAGA TCTTCATATG 900
TTGATGGATC CGGAAGATTT TTTGAAATTG AAGAAACAGT TACAGATCAA ATCGACGGGT 960
AAAAACGATG CGTTTTGTTT CAGATCTAAA GGATTAGTGG AGATGATGAA GATGTCGAAA 1020
GATCTGAGAC AGAAAGTACC GGCGGTCTTG GCGGTTGAGG TAGATCCAAC CGGAGGACCA 1080
AGATTACAAG AGGCGGCGAT GAAGCTTTAC GCGAGGAAGA CAGAGTGCGA TAAGATTCAT 1140
TTGCTTCAGG GGATGCAAGC GGTGGAAGCG GCGGCGAAGA GTTTCTTCTT TGGGTATAGG 1200
CAGTTAGTGG CGGCTATGAT GGGAAGTGCG GAGATGAACG CGACGGCGAG TCAAGAGTCG 1260
TGTGACTCAC TGAGTCAGAT ATTTATGGAG CCGACGTATT TCCCGAGCCT TGACGCGGCA 1320
AAGACGTTTC TGGGAGAGTT TTGGAGTCAT TTGGGATGAT TAAATTTTAA TTTCTGCTGG 1380
TATAATTATT TAATATAAAT TTAAATTGGT GGTTTGGTTT AATTTAGTTT GTAAGATAGT 1440
GAAATTTTTG GAACATTTGA CGATCCATAT TTGAATACAA ATTCATTTTT 1490

Claims

Patentansprüche
1. Nukleinsäure, die in Pflanzen, vorzugsweise der Familien der Solanaceaen und/oder Chenopodiaceaen und/oder der Brassicaceaen, besonders bevorzugt der Gattung Beta und/oder Brassica und/oder Solanum, eine Resistenz gegen sedentäre Nematoden induziert.
2. Nukleinsäure gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine translatierte Sequenz umfaßt, die zu der proteinkodierenden Sequenz des Hslpr°~ -Gens aus
B. procumbens zu mindestens 60 % homolog ist.
3. Nukleinsäure gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das HSlpro~ -Gen die folgende Sequenz umfaßt:
ATGAGAAGGT
GTGGGTATAG TTTGGGCCTT GGTGAGCCCA ATTTGGACGG AAAGCCCAAT
TTAGATTACG ACGCCGTTTG TCGTCCTTCT GAGCTTCACG CGCTTAAAAA
GGGCGCGTTG GATTATATTC AGAATTCGGA AAATCAGATA TTGTTTACAA
TTCATCAGAT TTTCGAGTCG TGGATTTTTT CCTCGAAAAA ATTGTTGGAT
CGAATAAGTG AGAGGATCAG TAAAGAAGAG TTTACCAAAG CAGCAGATGA
TTGTTGGATA CTGGAGAAAA TATGGAAGTT ATTGGAGGAA ATCGAGAATT
TACATTTATT AATGGATCCT GACGATTTCC TGCATCTGAA GACGCAACTG
AGGATGAAAA CAGTGGCGGA TTCTGAAACT TTTTGTTTTC GATCAAAAGG
ACTGATCGAG GTAACAAAAT TAAGCAAGGA TCTACGGCAC AAGGTGCCGA
AGATCCTTGG TGTAGAGGTG GACCCTATGG GAGGACCGGT GATACAAGAG
TCGGCAATGG AGTTGTACCG AGAAAAAAGA AGATACGAGA AGATACATCT
GTTACAAGCG TTTCAAGGGG TGGAATCCGC TGTTAAAGGG TTTTTCTTTA
ATTATAAACA GTTGTTGGTG ATCATGATGG GTAGTTTGGA AGCGAAAGCG
AATTTTGCTG TGATTGGTGG TTCTACTGAG TCTTCGGATT TGTTGGCTCA
GTTGTTTTTA GAACCTACTT ATTATCCGAG TTTGGATGGT GCCAAGACTT
TTATTGGTGA TTGTTGGGAG CATGATCAGG CTGTTGGTAG CGGCCTCGAT
TGTCGTCATC ATCGGAAGAA TCGGACTGCG AAACAATGA
Nukleinsäure gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3 , dadurch gekennzeichnet, daß sie eine DNA, vorzugsweise eine cDNA, ist. Nukleinsäure gemäß Anspruch 1 oder 2 , dadurch gekennzeichnet, daß sie eine genomische DNA ist, die die folgende Sequenz umfaßt:
TCTAGAGCTG TCGACGCGGC CGCGGAATTA ACCCTCACTA AAGGGAACGA ATTCGGATCT TCTTTCTTGG TGCTTAATTT TTTGACACTA ATCCGATTCT TAGCATTAAG TTGAAGCACA CTCTTGATAA ACTATGTTAC TATGTATCAT TGTCAATATG CTAAGAATTT GTCTTGACCT CATCGCTATG TATAAGCATC TAATACTTTC CTAAACTAGT AAAAACAAAT ATTCCATCCG TCCCATAATA TGAGTCCCCT TTCTATTTTA GGAGTCAAAA TTTTAAAATT TTTGACCAAA TATTCTTATT ACTATATATA AAAACATATT CATGTGGGAT CTTGTTAGAT TCGTCTTAAT ATGTATTTTC ATAATATCAA CTTTTTATAT TTTTTTACTA ATACGAAATT GAAGATATAC AATGTCTTAA AGACTATGCA AAAGTAAGCA GAACCTATAT TTTGGGACGG AGGGAGTAAT AAGTAATATT GATTGACGCA TAATTTGTAT ATAAATATTT CAAATTGATA CTACTTTAAA TAATATAGTT AATGCTTATA AATAAGCCTA AAGACTGTGA ATAGCAAGAT CGTTAAAAAT AAAATTTGAA AATATTTGAT ATGGATAATG AAATTGGAAA TGGCATGCTT AGCTTCTCGG GAATCTTATA CCGCTACATC TATAATAAAA ATTCCTCATA AAATTTTGCC CATTTTAACA CACGAAATTC GTCCTTTTAC GCGAGCCCTT TCCACACGTC TTTAAAATTT AAAAACCTCG TCTTTACTCT CCCCACCTAT ATATATACAC GTCCCCCCTT CTCTACTTCC CATCTCACAT ACACATACCC AATCCACAAA CTTCCATCTT ATCCAACTTT CTCTCACCTA TCTCCTTCTT CAATTTTCAA AACTCAAAAG AAAATGGTAG ATTTCGATTG CAAAACAAAA ATGGTACAAT CAACACCAAA CCTCACAAAA AAATCTCCAA AAATCACAAC CAAACGCACA ATATCAACAC CATTAATTTC ACCAGTACCA GTAATTTCCG GCGAATTATC TCCGGCGTCG GAATCATCCT GTTCAGCTTA CGAATCGTAT CTCAAATTAC CGGAGCTCCG TCAACTATGG AGTTCAAAAG AATTCCCCGG TTGGGATAAC GAACCGATAA TCAAACCGGC TTTGCAAGCA TTAGAGATAA CATTCCGGTT CATCTCACTC GTTTTATCCG ACGCTAGACC GTACATAAAC CGGCGAGAAT GGAACCGGAA ATTAGAGTCG TTAGCGAGAG ATCAAGTCCβ AAACTCATCT CAGTTCTCTG CGGAAGACGA TGAGACACGT GGATCAGCTC CGAATCGTTG ATCTGACGTC ATCGTATGGT GAGGTGATGT CACAAACAGA AGTTCAGCGG AGGTATGGAA GCTTGCGAAT GGAGAACATG ATACTACCGT GGTCTGTCGT AGTAGCGAAT TTAGTCTCCT TCCGAGGTTA GCCACGTGGC AGAAGTCGGA GGAGATTGCT TCTAGAATCT TCTACGCGGT TGAATCTGCT ATGAGAAGGT GTGGGTATAG TTTGGGCCTT GGTGAGCCCA ATTTGGACGG AAAGCCCAAT TTAGATTACG ACGCCGTTTG TCGTCCTTCT GAGCTTCACG CGCTTAAAAA GGGCGCGTTG GATTATATTC AGAATTCGGA AAATCAGATA TTGTTTACAA TTCATCAGAT TTTCGAGTCG TGGATTTTTT CCTCGAAAAA ATTGTTGGAT CGAATAAGTG AGAGGATCAG TAAAGAAGAG TTTACCAAAG CAGCAGATGA TTGTTGGATA CTGGAGAAAA TATGGAAGTT ATTGGAGGAA ATCGAGAATT TACATTTATT AATGGATCCT GACGATTTCC TGCATCTGAA GACGCAACTG AGGATGAAAA CAGTGGCGGA TTCTGAAACT TTTTGTTTTC GATCAAAAGG ACTGATCGAG GTAACAAAAT TAAGCAAGGA TCTACGGCAC AAGGTGCCGA AGATCCTTGG TGTAGAGGTG GACCCTATGG GAGGACCGGT GATACAAGAG TCGGCAATGG AGTTGTACCG AGAAAAAAGA AGATACGAGA AGATACATCT GTTACAAGCG TTTCAAGGGG TGGAATCCGC TGTTAAAGGG TTTTTCTTTA ATTATAAACA GTTGTTGGTG ATCATGATGG GTAGTTTGGA AGCGAAAGCG AATTTTGCTG TGATTGGTGG TTCTACTGAG TCTTCGGATT TGTTGGCTCA GTTGTTTTTA GAACCTACTT ATTATCCGAG TTTGGATGGT GCCAAGACTT TTATTGGTGA TTGTTGGGAG CATGATCAGG CTGTTGGTAG CGGCCTCGAT TGTCGTCATC ATCGGAAGAA TCGGACTGCG AAACAATGAT
GGTTTCGAAG TTAGTTTTGG ATTGAGTTTG GTTTGATCTG ACTCGGCTβA
GTAATGGGCG GCGATAGGGA GGTTATGGAG AACGTGGGGC GGAAAGTGGG
TGGCCTTGTT AGTGAGACGT GCAAACTTTG GTTACTATTA CATGTGATAT
ACTTATATTT AGTGGGAATA TTGCTTTGGT GTATATAGAT AAATTTTTGA
ATTAATTGTT ACACTTGTAT TAGTAAATTC TGTATCATGA TGATTATAAC
ATGAATTTTT TGTTGTGACT TTAAATGAGA TTTATGCTCC TTAATCCTTA
TTTCACTGAT ATTATTTTTT TGTAGTCTGA GTATAAGTGC GGAGTTTAAT
CAAGCAAGAG AAAATAATAG AAGGTGATTG CATACTTGGA TTGGAGATCA
ATATCTAAAA GATGGTTATG AAACTATTGT GAATAACGGA GTACATGTCC
AACACCACAC ACGTATGACT GTGTACCTCT AATTTACAAA GAGATTTACA
AAATCTAGAT GAGTTTTGAT ATGATCGACA TTGTCTCTAA ATGGGAGATA
AGAATTAAAT CGTGAGGCTC TTTGCGGCTA G7TCTTCCGA ATAAAATAAG
AAACAATGGT TTACTCTAAT TCA?TTTTCC AATTGGCAAA GTGGCACAAG
CTTCAATAA? T7GGCTCTTC ACAATTGAGT ATAAAAGAAT GGGTTAATTA
C?CCGG?CTT TGAATAAAAT TAATCCTATT TAATTGTTTT TGAAATATTC
TTAAAAATA? CGTTGTCTAA TACTTTCTTT AGTTGGGACC CGGTTCTGAA
CC7ACTTAAA TTAATGGGCT CAATGGCCGC CTAATTTCCT CTTGTTATTT
TTAGCCTTTT TTTTCCTTTT TTTCCCTTTA AAATAACTAT TTGTTCTCTT
GAATATCTTA AAATACGTGT CTATC??CTT TAGTTGGACC GTCTGAACTA
TTATTATGCT ATGCACTATT CCTTTGTATT TACCTTTTTC TTTTTCCTTT
AAATACTATT GTTCTCATTT CAATTATATT CTATTTTTGT TAAAAAACGG
TCTTAATTTT TACAACAGTA AAATTATTGA TTTTCCTTCT ATATTAAAAT
TTGAAAGTGA ATGTATTTCG AAATTTAGGT ATATGAATAT TTATATTGTT
CGATTAATGA TGATAAAAGG ATTTTACTCA TTAACCTAAA CCATTTCTAG
ATAAGATAAG AGGAACTTCC ACCTAGTTAA CATGTCTCAC TTTCCTAGTA
GACGAATCTA AATTGCGTTG CTGGATTTAG AACTTTGGTC AAGATAATGG
CAAAACTTTC AAGCACCCGT AGATGCATTT TCC7CGACAT TTCTCATACA
GCACTAAACG TTTCAACTTC CTCTTTTATT TTCTTGAAAT TTTTTGTGGC
AATGAGAAAC GTTCGAAGTT GATCTTTGCG TTTCGACGAT TTGAAATAAG
AAAATGCGTA TTGTCGGCAA CTGATTGTAG TAGTTGC7GT TATTATAATG
ATAGTCTTTT ATATAGAATT CATTTAATTC TAATTCATTT GAATCCAGTT
AAGTTGAGTT TAGTTTAGTC AGCCTAAAAG AACAAAGTAA GTCATGGAAT
GGAATGAAGA TGTAATCAAA TAGAGGAGGG GCTGATAACA ATAATTATTA
CTTATGTTGC GTGTTCAATT CAGTAATGAA AAAAATAAGG TTGAATTAGG
AGGGTAATAC AATTATTACC GGTGATGTGA TAAAACTAAT GTTTAAGGGT
TTAAGTTACT CTAAACCCTC AATTAAACAT AGTCTAACAA AAAATTCTCA
TAATCTAAAT CAAACACGTA CTTATACAAT CCTCTACATG AATCCGTTTC
TAACTCTAAA GGAAGATCGA TACTTATTAG AATCCGTTTC CAACCCTAAA
AATGACTGAT CAAAGGTTCA TGGATTTTGG AAGGGAAAGA CGAATGCGAG
GGCAGTGTAC AGGATAATGT GCATGAGATG GCAAGGGTCA TGCTAGTTAG
AGCAAAATAT A7ATGACTTA ATTCAAAAAC TACCTACTAT TTCAAATTAA
TAGACTTTAT TGGAGTCATG AAGTGTACTG TTTGGTACAC CCCACATTAC
TCATGCACTA CACCTAATTT GTCACAGCAT TCAGCTGCCC TTGTTTTGCA
GTCTTTGGAG CTGGCGTGCC TCTTGTTGCT GGTTAGTCGG CGCTTGGTCT
GTTGTG??GT GACCCTCTGT π rπ.τv ιI"|"|*T"|"|' TTTTAAAATG GTCGCTGATT
ACTAT7CTGT GTATT7CATT TTGTACTCCC TCGTATCCAA TTATATGCTA
CACTTTTTTT GCGGACTCCA AAACGTTTTT TTTTT7TGTC CGAGAGATAG
AGAGGAAAAG CCCATGTTGT TAGGAGAGAG 7TCGGGAGAA GGAAAAGCCA
AATAAAGAAG TAATAACATC TAAATAAGAA AATTCCTTTG ATGGAAAGTG
TAGCGACTAA AAAACGAAGG ACAATATGTA GTTTTCATAT GCCTTTACCT
TTGCAATCTC CTTTTTTATT GTTTACCCAT ACTGGATTAG GTTGGATTTA
TCAACACAAA ATGAGTTGGA CTATATCACT ACATTACTGT GGTCCTGTGG ATACATCAAC AAAAAAAATG AGTTGGACCA TATCAATGTG TTAGCGTGGA
TTATGTACAC ATTGGACTGG AGTTGAAGCA AATATAATCT GAAAAGGGCG
ATGGGTTAGG TCATGAGGTA TTTAGAATAA GACTTTGATC AAGCCCAAAT
CCACCCGCAA AGAATTATAC CCTTTATTTT CAAGGCACCA TCACTGCATA
AAATAATCTG AAATGCCACA AAAGATTAAC GTCCAATATG CTCACAGCCA
AAAATCAATC CATTATTGTT TGGTAAGAAA AGGTAATAGG CTAGATCAAT
TTGCTGCCAA TTGCCAGGCC TGTGGGCCTG TCACCTGTGG GTAATTTAAT
ATG7CTCAAA TGGGTCGGCC TGTTAAGTAC ACCAACATGA ACTTAAAGCT T
6. Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß sie erhältlich ist durch Absuchen einer DNA-Bank mit einer DNA-Sequenz wie in Anspruch 3 und/oder 5 angegeben.
7. Nukleinsäure gemäß einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß sie einer Wildart der Sektion Procumbentes der Gattung Beta entstammt .
8. Nukleinsäure gemäß einem oder mehreren der vorgehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine Resistenz gegen sedentäre Nematoden der Gattungen Meloido- qyne. Heterodera und/oder Globodera induziert.
9. Nukleinsäure gemäß einem oder mehreren der vorgehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine Resistenz gegen Heterodera schachtii induziert.
10. Nukleinsäure gemäß einem oder mehreren der vorgehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine Resistenz gegen sedentäre Nematoden in Pflanzen der Art Beta vulgaris induziert.
11. Vektor, enthaltend eine Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 10.
12. Vektor nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß er ein YAC-Vektor ist.
13. Verwendung einer Nukleinsäure und/oder eines Vektors gemäß einem oder mehreren der vorgehenden Ansprüche zur Induktion einer Resistenz gegen sedentäre Nematoden in Pflanzen.
14. Transgene Pflanze, enthaltend eine Nukleinsäure und/oder einen Vektor gemäß einem oder mehreren der vorgehenden Ansprüche.
15. Transgene Pflanze gemäß Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß sie der Gattung Beta oder der Gattung Brassica angehört.
16. Transgene Pflanze gemäß Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß sie Beta vulgaris angehört.
17. Zelle, Samen oder Pflanzenteile, enthaltend eine Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 10 und/oder einen Vektor nach einem der Ansprüche 11 oder 12.
18. Protein, kodiert durch eine Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 10.
19. Protein, erhältlich durch Expression einer Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 10 in einem geeigneten Wirt, wobei das Protein eine Resistenz gegen sedentäre Nematoden in Pflanzen hervorrufen kann.
20. Testkit, enthaltend eine Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 10 und/oder einen Vektor nach einem der Ansprüche 11 oder 12 und/oder ein Protein nach Anspruch 18 oder 19.
21. Verfahren zur Herstellung einer Pflanze, dadurch gekennzeichnet, daß eine Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 10 in eine Pflanzenzelle eingebracht wird und eine Pflanze aus der Pflanzenzelle regeneriert wird.
22. Verfahren zum Erzeugen einer Nematodenresistenz in Pflanzen, dadurch gekennzeichnet, daß eine Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 10 in eine nematodensen- sitive Pflanze eingebracht wird.
23. Wurzelspezifischer Promotor, erhältlich durch Absuchen einer Genbank mit der Sequenz, wie in Anspruch 5 angegeben, und Derivate davon mit gleicher Promotoraktivität.
24. Promotor nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, daß er die Expression des HSlpro~ -Gens kontrolliert.
25. Promotor, dadurch gekennzeichnet, daß er auf dem ca. 1,5 kb Xbal-Fragment der Sequenz 1832.1 gelegen ist, welches sich 5' vom Startkodon in Position 1551 befindet, sowie davon abgeleitete Derivate.
26. Promotor nach einem der Ansprüche 23-25, dadurch gekennzeichnet, daß er eine Resistenz gegen Heterodera schachtii in Arabidopsis induzieren kann.
27. Verwendung des Promotors gemäß einem der Ansprüche 23 bis 26 für die Expression von Genen.
28. Verwendung der Nukleinsäure gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10 und/oder des Promotors nach einem der Ansprüche 23 bis 26 zur Herstellung nematodenresistenter Pflanzen.
29. Primer für die PCR, erhältlich aus der Sequenz Nr. 1832.1.
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