DE68923728T2

DE68923728T2 - Insektenresistente Salatpflanzen.

Info

Publication number: DE68923728T2
Application number: DE68923728T
Authority: DE
Inventors: David Allen Fischhof; Stephen Gary Rogers
Original assignee: Monsanto Co
Current assignee: Monsanto Co
Priority date: 1988-04-25
Filing date: 1989-04-21
Publication date: 1996-02-22
Anticipated expiration: 2009-04-22
Also published as: DE68923728D1; EP0340197A3; IL90083A0; ZA893006B; ES2077589T3; ATE126005T1; EP0340197B1; EP0340197A2; US5349124A; JPH0231677A; AU3331989A; GR3018061T3; AU614602B2

Description

Diese Erfindung betrifft transgene Pflanzen, welche eine Toxizität gegenüber Insekten aufweisen, und insbesondere Salat- (Genus Lactuca)-Pflanzen, die ein chimäres Gen enthalten, welches für ein Bacillus-thuringiensis (B.t.)-Toxinprotein codiert und dieses exprimiert.

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Es ist bekannt, daß es wünschenswert ist, Pflanzenzellen durch Insertion eines in Pflanzen exprimierbaren, für das Toxinprotein des Lepidopteran-Typs Bacillus thuringiensis (B.t.) codierten Gens zu transformieren und aus solchen Zellen transgene Pflanzen zu regenerieren, die eine Widerstandskraft gegen Insekten aufweisen. Europäische Patentanmeldungen 84306494.0 und 86300291.1, Veröffentlichungsnummern 142,924 bzw. 193,259. Transgene Tabakpflanzen, welche Gene für insektizide B.t.- Proteine exprimieren, wurden hergestellt. Es waren jedoch nur jene Pflanzen, die fragmentierte B.t.-Gene enthielten, insektizid, und Pflanzen, die das B.t.-Gen der gesamten Länge enthielten, waren gegenüber Insekten nicht stärker toxisch als Kontrollpflanzen, die nur einen selektierbaren Marker enthielten. M. Vaeck et al., Nature, Bd. 328, Juli 1987, 33-37 und K.A. Barton et al., Plant Physiol., (1987) 85, 1103-1109. Transgene Tomatenpflanzen, die Gene für insektizide B.t.-Proteine exprimierten, wurden ebenfalls hergestellt. Pflanzen, die sowohl fragmentierte Gene als auch Gene der gesamten Länge enthielten, wurden hergestellt, doch erholten sich die transgenen Pflanzen wesentlich besser, wenn fragmentierte B.t.-Gene verwendet wurden, als wenn das B.t.-Gen der gesamten Länge verwendet wurde. Bezeichnenderweise war die Insektenmortalität bei Pflanzen, die das fragmentierte B.t.-Gen enthielten, hoher als bei jenen Pflanzen, die das B.t.-Gen der gesamten Länge enthielten; D.A. Fischhoff et al., Bio/Technology, Bd.5, (1987) 807-813.
Untersuchungen zeigten, daß das in Bakterien erzeugte Toxinprotein der gesamten Länge vom Lepidopteran-Typ 13mal toxischer ist als um 80%-50% gekürzte Versionen des Toxinproteins; M.J. Adang et al., Gene 36 (1986) 289-300. Somit kann die Expression des Genprodukts der gesamten Länge in Pflanzen ein wirksameres Toxinprotein erzeugen, und dieses Protein kann gegen ein breiteres Spektrum von Lepidopteran-Insekten wirksam sein.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Man entdeckte nun, daß Salatpflanzen, die eine Toxizität gegenüber Lepidopteran-Insekten aufweisen, durch Regeneration aus differenzierten transformierten Salatpflanzenzellen erzeugt werden können, die ein chimäres Gen mit einer DNA-Codiersequenz enthalten, welche im wesentlichen für das Bacillus thuringiensis-Toxinprotein der gesamten Länge codiert, wobei das Gen ein Protein exprimiert, das gegenüber Lepidopteran-Larven toxisch ist. Transformierte Salatpflanzenzellen der Erfindung werden durch herkömmliche Transformationstechniken durch Insertion eines chimären Gens mit einer DNA-Codiersequenz, die für das B.t.-Toxinprotein der gesamten Länge codiert, erzeugt. Die transformierten Zellen werden gezüchtet und über herkömmliche Techniken in Salatpflanzen regeniert, die eine Lepidopteran- Insekten-Toxizität aufweisen, welches Charakteristikum sexuell reproduzierbar ist und sich in der Folgegeneration zeigt. Zum Unterschied von transgenen Tomatenpflanzen weisen die transgenen Salatpflanzen dieser Erfindung eine Toxizität gegenüber Lepidopteran-Insekten auf, die der Toxizität transgener Salatpflanzen, die ein fragmentiertes B.t.-Gen enthalten, gleich ist oder größer als diese ist.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Fig. 1 veranschaulicht die Codiersequenz für ein kristallines Protein-Toxin von Bacillus thuringiensis, Subspezies kurstaki HD-1.
Fig. 2 veranschaulicht die Herstellung des Plasmids pMON9733.
Fig. 3 veranschaulicht die Herstellung des Plasmids pMAP17.
Fig. 4 veranschaulicht die Herstellung des Plasmids pMON294.
Fig. 5 veranschaulicht das Plasmid pMON316.
Fig. 6 veranschaulicht die Herstellung des Plasmids pMON8053.
Fig. 7 veranschaulicht die Herstellung des Plasmids pMON9712.
Fig. 8 veranschaulicht die Herstellung des Plasmids pMON9711.
Fig. 9 veranschaulicht die Herstellung des Plasmids pMON9741.
Fig. 10 veranschaulicht die Herstellung der Plasmide pMON9755 und pMON9756.

BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN

Codiersequenzen für Toxinprotein der gesamten Länge gegen den Lepidopteran-Typ sind bekannt, vgl. beispielsweise Vaeck et al., Barton et al., Fischhoff et al. supra. Die für das Toxinprotein der gesamten Länge codierenden DNA-Sequenzen können chemisch synthetisiert werden oder aus den Genom-Banken isoliert und mittels herkömmlicher Techniken daraus konstruiert werden. Beispiele für Bacillus thuringiensis-Spezies, die als Quellen für eine solche DNA-Codiersequenz geeignet sind, sind kurstaki Subspezies HD-1 und HD-73, berliner, sotto, thuringiensis, tolworthi, dendrolimus, alesti galleriae, aizawai und subtoxicus.
Jedes Pflanzengen, das in Pflanzen exprimiert, kann bei der Ausübung dieser Erfindung verwendet werden. Die Expression eines Pflanzengens, das in doppelsträngiger DNA-Form existiert, involviert die Transcription von Boten-RNA (mRNA) aus einem Strang der DNA durch das RNA-Polymeraseenzym, und die nachfolgende Verarbeitung des primären mRNA-Transcripts innerhalb des Kerns. Diese Verarbeitung involviert einen 3'-nicht- translatierten Bereich, der die Addition von Polyadenylat- Nucleotiden an das 3'-Ende der RNA bewirkt.
Die Transcription von DNA in mRNA wird durch einen DNA- Bereich reguliert, der üblicherweise als "Promotor" bezeichnet wird. Der Promotorbereich enthält eine Sequenz von Basen, die der RNA-Polymerase signalisiert, sich mit der DNA zu verbinden und die Transcription der mRNA unter Verwendung eines der DNA- Stränge als Matrize zur Herstellung eines korrespondierenden RNA-Stranges zu beginnen.
Eine Reihe von Promotoren, die in Pflanzenzellen wirksam sind, sind in der Literatur beschrieben. Zu diesen zählen die Nopalin-Synthase(NOS)- und Octopin-Synthase (OCS)-Promotoren (die auf Tumor-verursachenden Plasmiden von Agrobacterium tumefaciens getragen werden), der Blumenkohl-Mosaikvirus(CaMV)-19S- und - 35S-Promotor, der durch Licht induzierbare Promotor aus der kleinen Untereinheit von Ribulose-bisphosphatcarboxylase (ssRUBISCO, ein sehr verbreitetes pflanzen-Polypeptid) und Promotoren von für Hydroxyprolin-reiche Glycoprotein codierenden Genen. Alle diese Promotoren wurden zur Schaffung verschiedener Arten von DNA-Konstrukten, die in Pflanzen exprimiert worden sind, verwendet; vgl. z.B. PCT-Veröffentlichung WO 84/02913 (Rogers et al., Monsanto).
Promotoren, von welchen bekannt ist oder festgestellt wird, daß sie eine Transcription von RNA in Pflanzenzellen bewirken, können bei der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Solche Promotoren können aus Pflanzen oder Pflanzenviren erhalten werden und schließen den CaMV35S-Promotor und aus Pflanzengenen isolierte Promotoren, wie ssRUBISCO-Nopalinsynthase (NOS) und Mannopinsynthase(MAS)-Gene mit ein, sind jedoch nicht auf diese beschränkt. Wie nachstehend beschrieben, wird bevorzugt, daß der besondere, ausgewählte Promotor eine genügende Expression bewirken können sollte, um zur Produktion des Toxinproteins zu führen. Die Menge an Toxinprotein, die nötig ist, um eine Resistenz herbeizuführen, kann je nach der Insektenspezies, gegen die ein Schutz erreicht werden soll, verschieden sein. Dementsprechend sollte verständlich sein, daß der CaMV35S- Promotor, der bevorzugt wird, möglicherweise nicht für alle Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung der optimale ist.
Die in den DNA-Konstrukten der vorliegenden Erfindung verwendeten Promotoren können gewünschtenfalls modifiziert werden, um ihre Steuerungscharakteristika zu beeinflussen. Beispielsweise kann der CaMV35S-Promotor an den Teil des ssRUBISCO-Gens, der die Expression von ssRUBISCO bei Nichtvorhandensein von Licht unterdrückt ligiert werden, um einen Promotor zu schaffen, der in Blättern, aber nicht in Wurzeln aktiv ist. Der resultierende chimäre Promotor kann wie hierin beschrieben verwendet werden. Für die Zwecke dieser Beschreibung inkludiert somit der Ausdruck "CaMV35S"-Promotor Variationen von Promotoren, z.B. Promotoren, die mittels Ligation mit Operator-Bereichen, durch Zufalls- oder gesteuerte Mutagenese usw. erhalten worden sind.
Eine Codiersequenz, die in einem DNA-Konstrukt dieser Erfindung verwendet wird, kann gewünschtenfalls modifiziert werden, um entweder mittels Zufalls- oder mittels gesteuerter Mutagenese unter Verwendung von Methoden, die den Fachleuten bekannt sind, Mutanten zu schaffen. Solche Mutanten und Varianten liegen somit im Bereich der vorliegenden Erfindung. Der 3'-nicht-translatierte Bereich enthält ein Polyadenylierungssignal, das in Pflanzen wirksam ist, um die Addition von Polyadenylat-Nucleotiden an das 3'-Ende der mRNA zu bewirken. Beispiele für geeignete 3'-Bereiche sind (1) der transkribierte, nicht-translatierte 3'-Bereich, welcher das polyadenylierte Signal von Agrobacterium des Tumor-verursachenden (Ti) Plasmidgens, wie des Nopalinsynthase(NOS)-Gens enthält, und (2) Pflanzengene, wie Sojabohnenspeicherproteingene und die kleine Untereinheit des RUBP-Carboxylase-Gens. Ein Beispiel für einen bevorzugten 3'-Bereich ist jener des NOS-Gens, der in den nachstehenden Beispielen genauer beschrieben ist.
Die durch ein DNA-Konstrukt der vorliegenden Erfindung erzeugte RNA enthält auch eine 5'-nicht-translatierte Leader- Sequenz. Diese Sequenz kann vom zur Expression des Gens ausgewählten Promotor stammen und kann besonders modifiziert werden, so daß sie die Translation der mRNA erhöht. Die nicht- translatierten 5'-Bereiche können auch aus viralen RNAs, aus geeigneten eukaryontischen Genen oder aus einer synthetischen Gensequenz erhalten werden.
Die bei der Ausübung der vorliegenden Erfindung verwendeten Gene können mittels jedes geeigneten Verfahrens in das Genom einer Pflanze inseriert werden. Zu den geeigneten Pflanzentransformationsvektoren gehören jene, die von einem Tumor-verursachenden Plasmid von Agrobacterium stammen, wie jene, die von Herrera-Estralla et al. (Nature 303:209, 1983), Bevan et al. (Nature 304:184, 1983), Klee et al. (Bio/Technology 3:637, 1985), Fraley et al. (Bio/Technology 3:629, 1985) und Schilperoort et al. (EPO-Veröffentlichung 120,516) beschrieben wurden. Zusätzlich zu den aus Tumor-verursachenden Plasmiden von Agrobacterium stammenden Pflanzentransformationsvektoren können alternative Methoden zur Insertion von Genen in Pflanzenzellen verwendet werden. Solche Methoden können beispielsweise die Verwendung von Liposomen, Elektroporation, der Gen-Pistole ("gene gun") und Chemikalien, die die Aufnahme von freier DNA erhöhen, involvieren. Mit dem B.t.-Gen transformierte Pflanzenzellen werden in ganze (differenzierte) Pflanzen regeneriert, die eine verbesserte Widerstandskraft gegen Insekten aufweisen.
Die Wahl der Methodik für den Regenerationsschritt ist nicht kritisch. Ein bevorzugtes Regenerationsprotokoll ist detailliert von Michelmore et al., Plant Cell Reports (1987) 439-442, welches durch Hinweis hierin miteinbezogen ist, beschrieben.

Beispiel 1

BESCHREIBUNG BEVORZUGTER AUSFÜHRUNGSFORMEN

Das insektizide Toxin-Gen aus Bacillus thuringiensis, Subspezies kurstaki HD-1, wurde zuvor von Watrud et al. (1985), Engineered Organisms in the Environment-Scientific Issues ASM Press, Washington, D.C., beschrieben. Das Toxin-Gen ist auf einem 4,6 kb-Fragment von B.t.-DNA im Plasmid pMAP4 enthalten. Die DNA-Sequenz von 3734 Nukleotiden von pMAP4 einschließlich der gesamten Toxinprotein-Codiersequenz wird durch die Kettenterminationsmethode von Sanger et al. (1977) P.N.A.S., USA 74, 5463-5467, bestimmt. Die DNA-Sequenz und die davon stammende Aminosäuresequenz für das Toxinprotein sind in Fig. 1 gezeigt. Nucleotidkoordinaten, auf die nachstehend Bezug genommen wird, basieren auf der Numerierung der Fig. 1.
Diese Sequenz umfaßt 171 Nucleotide stromaufwärts des Translations-Initiations-Codons und erstreckt sich bis zu einer KpnI-Stelle 188 Nucleotide nach dem Translations-Terminations- Codon. Das erste Nucleotid der Proteincodiersequenz ist als Position +1 bezeichnet. Die DNA-Sequenzen vom Nucleotid -75 bis zum Nucleotid 220 und vom Nucleotid 3245 bis 3650 werden ebenfalls mittels der chemischen Methode von Maxam und Gilbert (1977) P.N.A.S., USA 74, 560-564, bestimmt. Die DNA-Sequenz von -171 bis -160 stammt von der bekannten Sequenz des Plasmidvektors pUC7 (Vieira, 1982). Die DNA-Sequenz von -159 bis -153 stammt von einem chemisch synthetisierten PstI-Linker (New England Biolabs); die drei Nucleotide von -152 bis -150 stammen von der bekannten Spaltungsstelle für das Restriktionsenzym HpaI. Die Sequenz vom Nucleotid -149 bis -76 wird von bekannten 5'-flankierenden Sequenzen anderer B.t.-Toxingene hergeleitet.

Beispiel 2

CHIMÄRE B.t.-TOXIN-GENE FÜR PFLANZENTRANSFORMATION MIT DEM CaMV35S-PROMOTOR

A. Toxin der gesamten Länge

Zur Herstellung eines für das Toxinprotein von B.t. codierenden chimären Gens wird eine NcoI-Stelle am Translations- Initiations-Codon (ATG) der für das B.t.-Toxin codierenden DNA so eingeführt, daß das ATG-Codon in der NcoI-Erkennungsstelle (CCATGG) enthalten ist. Die DNA-Sequenzanalyse des Bereiches des Toxingens um das Initiatorcodon herum zeigte die Sequenz:
Um die gewünschte NcoI-Stelle einzuführen, wird die Sequenz um das ATG herum von TTATGG zu CCATGG verändert. Unter Bezugnahme auf Fig. 2 wird ein 340 bp DraI-EcoRI-Fragment, das den Translations-Initiationsbereich mit einschließt, aus pMAP4 zwischen der SmaI- und der EcoRI-Stelle des filamentösen Bakteriophagenvektors M13mp8 subkloniert. Dieses Plasmid wird pMON9732 genannt. Einzelsträngige Phagen-DNA aus diesem Konstrukt enthält den nicht-kodierenden Strang der Toxin-Gensequenz.
Stellengerichtete Mutagenese wird an der Einzelstrang-DNA aus diesem Konstrukt mittels des Verfahrens von Zolle und Smith (1983) vorgenommen, wobei als Primer ein synthetisches Oligonucleotid der Sequenz
5'-GAGATGGAGGTAACCCATGGATAACAATCC-3'
benützt wird. Nach der Mutagenese wird ein die gewünschte Veränderung enthaltender Klon durch Verdau mit NcoI identifiziert, und das Vorhandensein der NcoI-Stelle wird durch DNA- Sequenzanalyse bestätigt. Dieser Klon wird als pMON9733 bezeichnet.
Ein intaktes Toxin-Gen wird konstruiert, welches die NcoI- Stelle aus der oben beschriebenen stellengerichteten Mutagenese eingebaut hat. Unter Bezugnahme auf Fig. 3 wird pMAP3 mit BamHI und ClaI verdaut, und ein den pUC8-Vektor und das Toxin-Gen aus der ClaI-Stelle an der Position 1283 bis zur PstI-Stelle hinter dem Ende des Gens enthaltendes Fragment wird isoliert. Ein 185 bp-Fragment, das von der BamHI-Stelle im mpB-Multilinker bis zur ClaI-Stelle an der Position 106 reicht, wird aus pMON9733 isoliert. Diese beiden Fragmente werden ligiert, um pMAP16 zu schaffen. pMAP16 enthält die NcoI-Stelle am ATG, ihm fehlt jedoch das Segment des Toxin-Gens zwischen den ClaI-Stellen an 106 und 1283. Das ClaI-Fragment wird aus pMAP4 isoliert und mit mit ClaI verdautem pMAP16 ligiert. Ein Plasmid, das dieses inserierte ClaI-Fragment in der richtigen Orientierung zur Rekonstruktion eines funktionellen Toxin-Gens enthält, wird identifiziert und als pMAP17 bezeichnet. E.coli, welche dieses Plasmid enthielt, produzierte ein Protein von etwa 134.000 Dalton, welches mit Antikörpern reagiert, die gegen gereinigtes kristallines Toxinprotein aus Bacillus thuringiensis Subspezies kurstaki HD-1 in Mengen hergestellt worden war, die mit jenen vergleichbar waren, die von pMAP4 enthaltender E. coli produziert wurden. pMAP17-enthaltende E. coli ist für die Lepidopteran-Larven Manduca sexta toxisch.
Zur Erleichterung der Konstruktion chimärer Toxin-Gene in Pflanzentransformationsvektoren werden BamHI- und BglII-Stellen direkt stromaufwärts der NcoI-Stelle im Toxin-Gen eingeführt. Unter Bezugnahme auf Fig. 4 wird das Plasmid pMAP146 als Quelle für einen synthetischen Linker verwendet, der Restriktionsstellen für BamHI, BGlII, XbaI und NcoI enthält, wie dargestellt:
pMON146 wird mit PstI teilverdaut und dann mit NcoI fertig verdaut, und ein 3,5 kb NcoI-PstI-Fragment wird isoliert. Das das gesamten Toxin-Gen enthaltende 4,5 kb NcoI-PstI-Fragment wird aus pMAP17 isoliert, und dieses Fragment wird mit dem 3,5 kb pMON146-Fragment ligiert. Ein diese beiden Fragmente enthaltendes Plasmid wird mit pMON294 bezeichnet. In pMON294 befinden sich eine BamHI- und eine BGlII-Stelle direkt stromaufwärts des Initiationscodons für das Toxinprotein, und eine BamHI-Stelle befindet sich direkt stromabwärts der PstI-Stelle.
Unter Bezugnahme auf Fig. 5 ist das Plasmid pMON316, ein Derivat von pMON200 (Fraley et al., (1985) Bio/Technology 3, 629-635, Rogers et al., (1985) Biotechnology in Plant Sciences, Academic Press, Orlando, 214-226) ein intermediärer Vektor vom Co-Integrationstyp, der den CaMV35S-Promotor und das 3'-Polyadenylierungssignal des NOS-Gens enthält. pMON316 hat unike Spaltstellen für die Restriktionsendonucleasen BglII, ClaI, KpnI, XhoI und EcoRI, die sich zwischen dem 5'-Leader- und dem 3'-NOS-Polyadenylierungssignal befinden. Die Spaltstellen sorgen für die Insertion von Codiersequenzen, die ihre eigenen Translations-Initiationssignale direkt angrenzend an die CaMV35S-Leadersequenz tragen. Das Plasmid pMON316 behält all die Eigenschaften von pMON200 bei, einschließlich der Spectinomycin- Resistenz zur Selektion in E. coli und A. tumefaciens, sowie ein chimäres Kanamycin-Gen (NOS/NPTII/NOS) zur Selektion transformierten Pflanzengewebes und das Nopalinsynthase-Gen zum einfachen Erkennen von Transformanten und für den Erbgang in der Folgegeneration.
Unter Bezugnahme auf Fig. 6 wird ein Plasmid für die Expression des B.t.-Toxin-Gens in Pflanzen konstruiert, durch Ligation des 4,5 kb BamHI-Fragments, welches das Toxin-Gen aus pMON294 enthält, in pMON316, welches mit BglII verdaut worden war. Ein Plasmid, welches das Toxin-Gen so ausgerichtet enthält, daß sich die Translations-Initiation angrenzend an den CaMV35S- Promotor befindet, wird durch Verdau mit EcoRI identifiziert und als pMON8053 bezeichnet. ein weiteres chimäres Pflanzengen wird hergestellt, welches das Konstrukt der gesamten Länge enthält, in welchem die strukturelle Codiersequenz für das B.t.-Toxin an der DraI-Stelle an der Position 3479 fragmentiert ist. Diese Stelle befindet sich 10 Nukleotide hinter dem Translations- Terminations-Codon für die Codiersequenz für das B.t.-Toxin der gesamten Länge. So enthält dieses Konstrukt die Codiersequenz der gesamten Länge, aber nur sehr wenig 3'-flankierende Sequenz aus dem B.t.-Subspezies kurstaki-Gen. Dieses Konstrukt wird mit pMON9712 bezeichnet.
Unter Bezugnahme auf Fig. 7 wird das Plasmid pMON9712 durch Verdau von pMON294 mit Endonuclease DraI hergestellt. Ein Paar komplementärer Oligonucleotide mit der folgenden Sequenz
wird synthetisiert. Bei Anlagerung an einander codieren diese Oligonucleotide für Translations-Terminatoren in allen drei Leserahmen. Das angelagerte Oligonucleotid-Paar ist an einem Ende bündig und bietet einen Vier-Nucleotid- Einzelstrangbereich, der am anderen Ende zur Ligation mit mit BglII- verdauter DNA fähig ist. Die Oligonucleotide werden aneinander angelagert und an pMON294-DNA ligiert, die mit DraI verdaut worden war. Die ligierte DNA wird mit BGlII verdaut, und ein BGlII-Fragment von etwa 3,5 kb, welches die B.t.-toxin- Codiersequenz der gesamten Länge enthält, wird isoliert. Dieses Fragment reicht von der BGlII-Stelle direkt stromaufwärts des Translations-Initiations-Codons bis zur BGlII-Stelle, die durch das Oligonucleotid-Paar geschaffen wurde. Dieses BGlII-Fragment wird mit mit BGlII-Verdautem pMON316 ligiert. Durch Verdau mit EcoRI wird ein Klon (pMON9712) identifiziert, in welchem der Translationsinitiator für das Toxin-Gen der gesamten Länge angrenzend an den CaMV35S-Promotor vorliegt.

Beispiel 3

B. Fragmentiertes Toxin

Frühere Arbeiten haben gezeigt, daß ein Fragment der B.t.- Toxin-Codiersequenz, die von stromaufwärts des Translationsinitiators bis zur KpnI-Stelle an der Position 2170 reicht, ein Protein erzeugte, welches bei Expression in E. coli für M. sexta toxisch ist. Ein Pflanzenexpressionsvektor, der ein solches fragmentiertes, für B.t.-Toxin codierendes Gen eingebaut hat, wird folgendermaßen konstruiert. Bezogen auf die DNA-Sequenz des Toxin-Gens an der KpnI-Stelle an der Position 2170 wird ein Paar komplementärer Oligonucleotide synthetisiert, wie nachstehend dargestellt, welche bei Anlagerung aneinander und Ligation an das Toxin-Gen an der KpnI-Stelle für zwei Translations- Terminationscodons im Leserahmen mit der Toxin-Codiersequenz codieren.
Die angelagerten Oligonucleotide schaffen an einem Ende einen Vier-Nucleotid-Einzelstrangbereich, der zur Ligation mit mit KpnI verdautem Toxin-Gen fähig ist, und am anderen Ende einen Vier-Nucleotid-Einzelstrangbereich, der zur Ligation mit mit BGlII-verdauter DNA fähig ist. Unter Bezugnahme auf Fig. 8 sind die Oligonucleotide aneinander angelagert und mit pMON294 ligiert, das mit KpnI verdaut worden war. Diese ligierte DNA wird dann mit BGlII verdaut, und ein 2,2 kb BglII-Fragment wird isoliert. Dieses Fragment reicht von der BglII-Stelle direkt stromaufwärts des Translations-Initiators des Toxin-Gens bis zur BGlII-Stelle, die durch das Oligonucleotid-Paar geschaffen worden ist.
Ein Plasmid zur Expression in Pflanzen wird aus dem an der KpnI-Stelle fragmentierten B.t.-Toxin-Gen durch Ligation des 2,2 kb BglII-Fragments mit mit BglII-verdautem pMON316 konstruiert. Ein Klon wird durch Verdau mit EcoRI indentifiziert, in welchem sich der Translations-Initiator für das fragmentierte Toxin-Gen angrenzend an den CaMV35S-Promotor befindet, und wird mit pMON9711 bezeichnet.

Beispiele 4 und 5

CHIMÄRE B.t.-TOXIN-GENE FÜR PFLANZENTRANSFORMATION UNTER VERWENDUNG DES MAS-PROMOTORS

Zwei chimäre B.t.-Toxin-Gene werden konstruiert, wobei der Mannopin-Synthase(MAS)-Promotor aus dem Plasmid pTiA6, einem Plasmid vom Octopin-Typ aus Agrobacterium tumefaciens, in Kombination mit den in den zuvor beschriebenen Konstrukten pMON9711 und pMON9712 verwendet wurde.
Der MAS-Promotor wird aus pTiA6 als 1,5 kb EcoRI-ClaI- Fragment isoliert. Dieses DNA-Fragment reicht von der ClaI- Stelle am Nucleotid 20.138 bis zur EcoRI-Stelle bei 21.631 in der Sequenz von Barker et al. (1983), Plant Mol. Biol. 2, 335- 350. Unter Bezugnahme auf Fig. 9 wird das EcoRI-ClaI-Fragment mit dem binären Vektor pMON505, Horsch und Klee (1986) P.N.A.S., USA 83, 4428-4432, ligiert, welches zuvor mit EcoRI und ClaI verdaut worden war. Das resultierende Plasmid wird mit pMON 706 bezeichnet. Ein das NOS 3'-Ende enthaltendes Fragment wird stromabwärts vom MAS-Promotor inseriert, um einen MAS-NOS 3'- Expressionskassettenvektor zu erhalten. Das NOS 3'-Fragment wird aus pMON530 als ein 300 bp BglII-BamHI-Fragment herausgeschnitten und in mit BglII-verdauten pMON706 inseriert. Das resultierende Plasmid wird mit pMON707 bezeichnet.
Das Plasmid pMON530 wird durch Spaltung von pMON200 mit NdeI zur Entfernung eines 900 bp NdeI-Fragments zur Schaffung von pMON503 konstruiert. Das Plasmid pMON503 wird mit HindIII und SmaI gespalten und mit dem Plasmid pTJS75, Schmidhauser und Helinski (1985) J. Bacterial 164, 155, das ebenfalls mit HindIII und SmaI geschnitten worden war, gemischt. Ein Plasmid, das das 3,8 kb HindIII-SmaI-Fragment von pTJS75 verbunden mit dem 7,8 kb HindIII-SmaI-Fragment von pMON503 enthielt, wird isoliert und mit pMON5O5 bezeichnet. Danach wird die CaMV35S-NOS3'-Kassette durch Spaltung von pMON316 mit StuI und HindII und Isolierung des 2,5 kb StuI-HindIII, das den MOS-NPTII'-NOS-Marker und die CaMV35S-NOS3'-Kassette enthält, zu pMON5O5 transferiert. Dies wird zu pMON505 DNA- die mit StuI und HindIII gespalten worden ist, hinzugefügt. Nach Ligation und Transformation wird ein die CaMV35S-NOS3'-Kassette in pMON505 tragendes Plasmid isoliert und mit pMON530 bezeichnet.
Da einige binäre Vektoren im Vergleich zu Co-Integrationsvektoren eine stark verringerte Transformationsfrequenz aufweisen, wird die MAS-NOS 3'-Kassette von pMON707 in den cointegrierenden Vektor pMON200 bewegt. Das Plasmid pMON200 wird mit StuI und HindIII verdaut, und ein 7,7 kb-Fragment wird durch Agarose-Gelelektrophorese isoliert. Das Plasmid pMON707 wird auf ähnliche Weise mit StuI und HindIII verdaut, und ein 3,5 kb StuI-HindIII-Fragment, das die MAS-NOS 3'-Kassette enthält, wird durch Agarose-Gelelektrophorese isoliert und auf einer DEAE- Membran mit nachfolgender Elution mit 1M NaCl gewonnen. Diese beiden DNA-Fragmente werden ligiert, und das resultierende Plasmid wird mit pMON9741 bezeichnet. Dieses Plasmid enthält die MAS-NOS 3'-Kassette im pMON200 co-integrierenden Hintergrund. Chimäre B.t.-Toxin-Gene, die vom MAS-Promotor angetrieben werden, werden hergestellt. Unter Bezugnahme auf die Fig. 10 werden die B.t.-Toxin-Geninserts als BglII-Fragmente aus pMON9711 und pMON9712 herausgeschnitten. Jedes dieser Fragmente wird mit mit BGlII verdautem pMON9741 ligiert. In jedem Fall des Verdaus mit EcoRI wird ein Klon erhalten, in welchem das 5'-Ende des B.t.- Toxin-Gens angrenzend an den MAS-Promotor vorhanden ist. Diese Plasmide werde mit pMON9755 und pMON9756 bezeichnet und enthalten die B.t.-Toxin-Codiersequenzen aus pMON9711 bzw. pMON9712.

Beispiel 6

EXPRESSION CHIMÄRER B.t.-GENE IN SALATPFLANZEN

Einführung intermediärer Vektoren in Agrobacterium

Intermediäre Vektoren, die pMON200, pMON9711 und pMON9712 enthalten, werden in Agrobacterium tumefaciens-Stämme GV3111SE und ASE eingeführt, die das von Fraley et al. (1985), supra, beschriebene entwaffnete Ti-Plasmid pTiB6SE enthalten. Agrobacterium tumefaciens-Stämme, die Cointegrationsprodukte aus pTiB6SE und diesen intermediären Vektoren enthalten, werden wie nachstehend beschrieben ausgewählt.

Transformation und Regeneration von Salat

Die Transformation und Regeneration von transformiertem Salat unter Verwendung der oben beschriebenen Agrobacterium tumefaciens-Stämme wird wie von Michelmore et al. (1987) Plant Cell Rep. 6, 439-442 beschrieben, durchgeführt.
Samen von Salat (Lactuca sativa), Kulturvarietät Cobham Green, werden durch 15 Sekunden langes Eintauchen in 75% Ethanol gefolgt von 60 Minuten in 10% NaOCl mit einer Spur Tween-20 Detergens, gefolgt von zwei Waschungen in sterilem, destilliertem Wasser oberflächensterilisiert. Die Samen werden dann auf 1% Agar, enthaltend Hoaglands-Lösung in der halben Stärke und 10ug/ml Gibberellinsäure 3, placiert (25 bis 30 Samen/Platte). Die Samen werden bei 27ºC mit einer 14stündigen Photoperiode bei 800 Lux inkubiert. Nach vier Tagen werden die Kotyledonen in vier Stücke geschnitten und zur Transformation verwendet.
Die Agrobacterium-Stämme 3111SE und ASE, die B.t.-Vektoren pMON9711 und pMON9712 enthalten, werden in Luria-Nährlösung enthaltend Chloramphenicol (25 ug/ml), Kanamycin (50 ug/ml) und Spectinomycin (100 ug/ml) bis zu einer Dichte von etwa 5 x 10&sup8; Bakterien/ml gezüchtet Die zerschnittenen Kotyledonen werden 10 min lang mit der Bakterienlösung getränkt und danach 2 Tage lang auf Filterpapier über Tabak-Ammenzellkulturen gegeben. Die Ammenkulturplatten werden folgendermaßen zubereitet: Zwei Tage vor der gemeinsamen Züchtung werden 3 ml einer log-Phasenzell- Suspension von Nicotiana plumbaginifolia auf RMNO-Tabaknährmedium (3 mg/l Indolessigsäure, 0,06 mg/l Kinetin)-enthaltende Platten pipettiert und, wie oben für Salatsamen beschrieben, inkubiert. Filterpapiere (Whatman Nr. 2, 9 cm) werden in flüssigem RMNO-Medium getränkt und autoklaviert. Ein Filterpapier wird unmittelbar bevor die Salatkotyledonen auf die Filter gegeben werden, über die Ammenkultur gelegt.
Alle Inkubationen der Salatexplantate erfolgen unter den oben beschriebenen Bedingungen. Die Salatexplantate werden 2 Tage lang ohne Kanamycin oder Carbenicillin im Medium über den Ammenkulturen inkubiert. Die Explantate werden dann transferiert und 12 Tage lang auf Callus-Einleitungsmedium (Shenk und Hildebrandt Nährmedium plus 0,1 mg/l Indolessigsäure und 0,05 mg/l Kinetin) enthaltend 50 mg/l Kanamycin und 500 mg/l Carbenicillin inkubiert. Die gebildeten Calli werden alle 2 Wochen auf Regenerationsmedium (Shenk und Hildebrandt Nährmedium plus 0,05 mg/l Kinetin und 0,05 mg/l Zeatin) enthaltend 50 mg/l Kanamycin und 500 mg/l Carbenicillin subkultiviert. Um alle Explantate bildete sich konfluenter Callus. Etwa 10% der Explantate bildeten ab drei Wochen Triebe.
Auf dem Regenerationsmedium bis zu einer Länge von etwa 5 mm (aber nicht länger) entwickelte Triebe werden aus dem Callus herausgeschnitten, in 10 mg/l Indolessigsäure getaucht, auf 50 mg/l Kanamycin enthaltendes Anwurzelungsmedium (Shenk und Hildebrandt Nährmedium) placiert und wie oben beschrieben inkubiert. Nach 2 bis 5 Wochen begannen sich Wurzeln zu entwickeln. Nachdem sich Wurzeln gebildet hatten, werden die Pflänzchen auf Vermiculit transferiert und in einem Wachstumsraum bei 15ºC inkubiert, um ein Abfallen (bolting) zu verhindern. Wenn die Pflänzchen etwa 6 cm hoch sind, werden sie in eine Erdmischung umgepflanzt und bis zur Reife in einem Gewächshaus gezüchtet.
Beim Transferieren der Pflänzchen auf Vermiculit werden Blattexplantate genommen und zur Bestätigung der Transformation auf Callusbildungsmedium mit 50 mg/l Kanamycin plattiert. Die Opinproduktion wird auch im Saft dieser Pflänzchen analysiert, um die Transformation zu bestätigen.

Insektenfütterungsversuche bei transformierten Salatpflanzen

Die Toxizität transformierter Salatpflanzen, die die chimären B.t.-Toxingene enthalten, werden durch Fütterungsversuche an Testinsekten bestimmt. Blätter von transgenen Salatpflanzen werden entfernt und in sterile 82mm-Petrischalen gegeben, die steriles feuchtes Filterpapier enthalten. Zehn bis zwanzig Insektenlarven werden auf die Blätter gegeben, und man läßt sie vier Tage lang fressen, zu welchem Zeitpunkt die Larven auf ihre Mortalität und ihr relatives Wachstum beurteilt werden. Alle Versuche werden bei Raumtemperatur vorgenommen.
R&sub0;-Pflanzen (primäre Transformanten) werden gezüchtet und die Samen geerntet. R&sub1;-Pflanzen werden aus den Samen der R&sub0;- Pflanzen gezüchtet. Nopalin-positive R&sub1;-Pflanzen werden auf ihre Toxizität gegen Insekten untersucht. Die Versuche werden mit neu ausgebrüteten Larven von Heliothis virescens (Tabakknospenwurm (tobacco budworm)) durchgeführt. Drei verschiedene Versuche werden zu verschiedenen Zeiten vorgenommen. Die ersten drei Stellen der Pflanzennummer identifizieren die elterlichen Stammtransformanten, und die letzten drei Stellen identifizieren verschiedene R&sub1;-Folgegenerationen. Beim ersten Versuch ist die Kontrolle eine R&sub1;-Folgegeneration einer Pflanze, die mit einem Vektor transformiert wurde, der eine Antibiotika-Resistenz verleiht, aber kein B.t.-Gen enthält. Beim zweiten Versuch wurde keine Kontrolle verwendet. Beim dritten Versuch werden untransformierte Pflanzen als Kontrollen verwendet. Die Daten sind in Tabelle 1 zusammengefaßt. Tabelle 1 PFLANZE NR. VEKTOR ANZAHL TOTER LARVEN/ANZAHL GETEST.LARVEN Versuch Nicht-transformierte Kontrollen keiner "s" zeigt an, daß überlebende Larven verkümmert sind.
Die Daten zeigen, daß Salatpflanzen, die das B.t.-Gen enthalten, für H.virescens in Mengen, die deutlich über den Kontrollen liegen, toxisch sind. Außerdem zeigen die Daten weiters, daß die Toxizität vererbt wird, weil alle getesteten Pflanzen Folgegenerationen, nicht primäre Transformanten, sind. Die getesteten R&sub1;-Pflanzen sind eine Mischung aus Heterozygoten und Homozygoten, was für einen Teil der Aktivitätsveränderlichkeit verantwortlich sein könnte, da Homozygoten, die zwei Kopien des B.t.-Gens enthalten, aktivere Pflanzen sein würden.

Claims

1. Pflanze vom Genus Lactuca, welche eine Toxizität gegenüber Lepidopteran-Insekten aufweist, welche Pflanze aus differenzierten Pflanzenzellen zusammengesetzt ist, die ein chimäres Gen enthalten, welche in Sequenz:

(a) einen Promotor, der in Pflanzen zur Bewirkung der Produktion von RNA wirkt;

(b) eine DNA-Sequenz, die die Produktion einer RNA-Sequenz bewirkt, die für ein Toxin-Protein des Bacillus thuringiensis in der gesamten Länge kodiert; und

(c) eine 3'- nicht-translatierte DNA-Sequenz, die in Pflanzenzellen zur Bewirkung der Addition von Polyadenylat- Nucleotiden an das 3'-Ende der RNA-Sequenz wirkt, aufweist

2. Pflanze nach Anspruch 1, wobei die Pflanze Lactuca sativa ist.

3. Pflanze nach Anspruch 2, wobei die Codiersequenz für das Toxin-Protein der Bacillus thuringiensis-Spezies, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus kurstaki Subspezies HD-1 und HD-73, berliner, sotto, thuringiensis, tolworthi, dendrolimus, alesti, galleriae, aizawai und subtoxicus, kodiert.

4. Pflanze nach Anspruch 3, wobei die Codiersequenz für das Protein kodiert, das durch die DNA-Sequenz 1-3471 der Fig. 1 kodiert ist.

5. Pflanze nach Anspruch 3, welche eine Toxizität gegenüber einem Lepidopteran vom Genus Heliothis virescens aufweist.

6. Pflanze nach Anspruch 4, welche eine Toxizität gegenüber einem Lepidopteran vom Genus Heliothis virescens aufweist.

7. Pflanzenzelle vom Genus Lactuca, welche eine Toxizität gegenüber Lepidopteran-Insekten aufweist, welche Pflanzenzelle ein chimäres Gen enthält, welches in Sequenz:

(a) einen Promotor, der in Pflanzen zur Bewirkung der Produktion von RNA wirkt;

(c) eine 3'-nicht-translatierte DNA-Sequenz, die in Pflanzenzellen zur Bewirkung der Addition von Polyadenylat- Nucleotiden an das 3'-Ende der RNA-Sequenz wirkt, aufweist.

8. Zelle nach Anspruch 7, wobei die Pflanzenzelle Lactuca sativa ist.

9. Zelle nach Anspruch 8, wobei die Codiersequenz für das Toxin-Protein der Bacillus thuringiensis-Spezies, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus kurstaki Subspezies HD-1 und HD-73, berliner, sotto, thuringiensis, tolworthi, dendrolimus, alesti, galleriae, aizawai und subtoxicus, kodiert.

10. Zelle nach Anspruch 9, wobei die Codiersequenz für das Protein kodiert, das durch die DNA-Sequenz 1-3471 der Fig. 1 kodiert ist.

11. Zelle nach Anspruch 9, welche eine Toxizität gegenüber einem Lepidopteran vom Genus Heliothis virescens aufweist.

12. Zelle nach Anspruch 10, welche eine Toxizität gegenüber einem Lepidopteran vom Genus Heliothis virescens aufweist.