MXPA06007005A - Composiciones de proteinas y genes secretados de bacillus thuringiensis y usos de las mismas. - Google Patents

Abstract

La presente invencion se refiere al aislamiento y caracterizacion de secuencias de nucleotido que codifican proteinas insecticidas novedosas secretadas dentro del espacio extracelular de Bacillus thuringiensis y cepas relacionadas; las proteinas se aislan de sobrenadantes de cultivo de Bacillus thuringiensis y cepas relacionadas y despliegan actividad insecticida contra insectos incluyendo el barrenador de maiz Europeo (ECB), el gusano de tabaco (TBW) y la polilla de espalda de diamante (DBM); se describen las proteinas insecticidas codificadas por las secuencias de nucleotido que hibridizan bajo condiciones severas a las secuencias de nucleotido aisladas y caracterizadas, se describen los metodos para hacer y utilizar celulas y plantas transgenicas que comprenden la secuencia de nucleotido novedosa de la invencion.

Description

COMPOSICIONES DE PROTEÍNAS Y GENES SECRETADOS DE BACILLUS THURINGIENSIS Y USOS DE LAS MISMAS ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a una nueva familia de genes codificando proteínas tóxicas de lepidópteros y fragmentos insecticidas de las mismas. En particular, la presente invención está dirigida a proteínas ilustrativas designadas aquí como TIC900, TIC402, TIC403, TIC404, TIC961 , TIC962, TIC963, TIC965 Y TIC966, y fragmentos insecticidas, cada uno codificado a través de secuencias de codificación de nucleótido designadas aquí respectivamente, tic900, tic402, tic403, tic404, tic434, tic961 , tíc962, tic963, tic965, y tic966, así como homólogos de secuencia de nucleótido que (1 ) codifican las proteínas insecticidas y (2) hibridizan las secuencias de codificación tic900, tic402, tic403, tic404, tic434, tic961 , tic962, tic963, tic965, y tic966 bajo condiciones de hibridación estrictas. La presente ¡nvención también se refiere a células huésped transformadas con una o más secuencias de nucleótido de la presente invención o transformadas con variantes de secuencias de nucleótido establecidas aquí, genes relacionados a través de la identidad y/o similitud con las secuencias establecidas aquí, y/o homólogos de las mismas, particularmente aquellas secuencias que" han sido modificadas para mejorar la expresión en plantas. En una modalidad preferida, las células huésped transformadas son células de plantas.

Casi todos los campos de cultivo, plantas y áreas de labranza comerciales son susceptibles de ataques de uno o más plagas de insectos. Particularmente problemáticas son las plagas de coleópteros y lepidópteros. Por ejemplo, cultivo de vegetales y coles tales como alcachofa, colinabo, especie de lechuga, puerro, espárragos, lentejas, frijoles, lechuga (por ejemplo, cabeza, hoja, romana), acelga, col china, malanga, brócoli, sandías (por ejemplo, melón dulce, sandía, Crenshaw, melón de miel, cantalupo), coles de bruselas, col, cardón, zanahorias, napa, coliflor, quimbombo, cebollas, apio, perejil, granos de garbanzo, pastinaca, achicoria, chícharos, calabaza china, pimiento, repollo, papas, pepinos, calabazas, curcubitáceas, rábanos, cebollas de bulbo seco, nabo sueco, berenjena, salsifí, escarola, cebollino, lechuga crespa, fríjol de soya, ajo, espinaca, cebollas verdes, chayóte, verduras, remolacha azucarera, papas dulces, nabo, rábano picante, tomates, coliflor, nabos, y una variedad de especies que son sensibles a la infestación a través de una o más de las siguientes plagas de insectos: oruga de alfalfa, gusano de polilla, gusano de acelga, polilla de alcachofa, gusano de col, oruga de col, larva de col, larva de maíz, consumidor de hojas de apio, gusano de col con rayas transversales, larva de maíz europeo, polilla con espalda en forma de diamante, gusano de trébol verde, gusano de col importado, gusano de sandía, enrollador de hojas omnívoro, gusano de encurtidos, complejo de gusano de corteza, oruga de pantanos salados, oruga de fríjol de soya, oruga de tabaco, gusano de fruta de tomate, homogusano de tomate, lombriz de tomate, oruga de fríjol de terciopelo, gusano de polilla rayado amarillo. Igualmente, los cultivos de pasto y heno tales como alfalfa, pastos, y forraje por lo general son atacados por dichas plagas tales como gusano de polilla, gusano de polilla de carne, orugas de alfalfa, saltador europeo y una variedad de larvas de polilla y orugas, así como larvas de polilla rayadas amarillas. Los cultivos de fruta y vid tales como manzanas, chabacanos, cerezas, nectarinas, duraznos, peras, ciruelas, ciruelas tasas, almendras en el brillo, castañas, avellanas, nuez lisa, pistaches, nueces, fruta cíclicas, zarzamora, mora azul, bayas negras, arándanos, grosella, frambuesas americanas, frambuesas, fresas, uvas, aguacates, plátanos, kiwi, caqui, granada, pina, y frutas tropicales por general son susceptibles de ataques y defoliación, a través de la polilla achema sphinx, amorbia, polilla de gusano, larva de polilla de cítricos, saltador de plátanos, gusano de fuego de cabeza negra, enrollador de hojas de mora azul, oruga, gusano de fruta de cereza, larva de polilla de cítricos, ceñidor de arándano, oruga de tienda de este, oruga de otoño, enrollados de hojas de avellano, enrollados de hojas de árbol de frutas, polilla de baya de uvas, doblador de hojas de uva, formador de esqueletos de hoja de uva, gusano de fruta verde, gummosos-batrachedra commosae, polilla gitana, oruga de nogal, homogusanos, orugas sin pelo, oruga de ombligo anaranjado, enrollados de hojas con bandas oblicuas, enrollador de hojas omnívoro, orugas sin pelo omnívoras, tortix naranja, perro naranja, polilla de fruta oriental, enrollados de hojas pandémico, barrenador de rama de durazno, larva de insecto con capullo de nuez, enrollados de hojas de banda roja, oruga de espalda roja con joroba, larva de polilla de piel rugosa, oruga de pantano salado, pequeña oruga, oruga de tienda, thecla-thecla basillides, oruga de tabaco, polilla tortix, polilla de capullo de manzana de copa, enrollados de hoja abigarrado, oruga de nogal, oruga de tienda del oeste, y gusano de polilla rayado amarillo. Los cultivos de campo tales como semilla de cánola/colza, primavera, espuma de pastizal, maíz (campo, dulce, rosetas de maíz), algodón, lúpulo, jojoba, cacahuates, arroz, cártamo, granos pequeños (serrana, avena, centeno, trigo, etc.), sorgo, fríjol de soya, girasoles, y tabaco por lo general son objetivos de infestación a través de insectos ¡ncluyendo gusano de polilla, barrenadores asiáticos y otros de maíz, polilla de girasoles de banda, gusano de polilla de remolacha, gusanos, oruga sin pelo de col, gusano de raíz de maíz (incluyendo variedades del sur y del oeste), perforador de hojas de algodón, polilla con espalda de diamante, barrenador de maíz europeo, gusano de trébol verde, polilla de cabeza, gusano de cabeza, gusano de col importado, orugas sin pelo (incluyendo Anacamptodes spp.), enrollados de hojas de banda oblicua, consumidor de hojas omnívoro, gusano de vaina, oruga de pantano salado, barrenador de maíz del sudoeste, orugas sin pelo de fríjol de soya, y orugas de fríjol terciopelo. Plantas base, Flores, ornamentales, vegetales y contenedores de abastecimiento frecuentemente se alimentan de un huésped de plagas de insectos tales como gusano de polilla, polilla de azalea, gusano de polilla de remolacha, polilla de espalda de diamante, polilla ello (homopolilla), oruga de helécho de Florida, polilla lo, orugas sin pelo, polilla de laurel, enrollador de hojas omnívoro, orugas sin pelo omnívoras, larva de polilla de tabaco. Los bosques, frutos, ornamentales, y árboles que llevan nueces, así como arbustos y otros viveros por general son susceptibles 'de ataque a partir de diversos insectos tales como gusanos de bolsa, gusanos de cabeza negra, polilla de cola café, gusano de roble de California, polilla de pasto de abeto douglas, oruga medidora de olmo, larva de red del otoño, enrollados de hojas de árbol frontal, gusano de maple verde rayado, polilla gitana, gusano de pino jack, larva de red de mimosa, mariposa de pino, oruga jorobada roja, oruga de espalda en forma de silla de montar, u oruga con espalda de silla de^ montar prominente, oruga de primavera y otoño, gusano de abeto, oruga de tienda, tortix, polilla de mata de hierba del oeste. Igualmente, las plagas tales como gusano de polilla, larva de red de césped, larva de red de césped tropical por lo general atacan los pastos. Debido a que los cultivos de interés comercial por lo general son el objetivo del ataque de insectos, los métodos ambientálmente sensibles para controlar o erradicar la infestación de insectos son deseables en muchas instancias. Esto es particularmente veraz para granjeros, arboricultores, agricultores y áreas comerciales y residenciales que buscan el control de poblaciones de insectos utilizando composiciones eco-amigables. Bacillus thuringiensis es una bacteria gram-positiva que produce inclusiones cristalinas proteínicas durante la esporulación. Estas proteínas de cristal B. thuringiensis por lo general son altamente tóxicas para insectos específicos. Las actividades insecticidas han sido identificadas para proteínas de cristal de varios cepas de B. thuringiensis contra larvas de insectos de insectos en los órdenes de Lepidópteros (orugas), Coleópteros (escarabajos) y Dípteros (mosquitos, mosca). Las proteínas de cristal B. thuringiensis individuales, también denominadas cristales delta-endotoxinas o cristales parasporales o proteínas de toxina, pueden diferir extensivamente en sus estructuras y actividades insecticidas. Estas proteínas de insecticidas se codifican a través de genes típicamente localizados en grandes plásmidos, mayores de 30 mega Daltons (mDa) en tamaño, que se encuentran en la cepas ß. thuringiensis. Se han clonado un número de éstos genes de toxina B. thuringiensis y los productos de la proteína de cristal insecticida caracterizados por sus propiedades insecticidas específicas. Hofte y otros (1989) y Schnepf y otros (1998) proveen análisis de genes de toxina B. thuringiensis y proteínas de cristal. Las propiedades insecticidas de B. thuringiensis han sido ampliamente reconocidas, y las cepas de B. thuringiensis se han incorporado en productos insecticidas biológicos comerciales durante 40 años. Las formulaciones insecticidas B. thuringiensis comerciales típicamente contienen cultivos de fermentación de B. thuringiensis que producen esporas secas cuyas proteínas de cristal son tóxicas para varias especies de insectos. Los productos bio-insecticidas de B. thuringiensis comerciales tradicionales se derivan de cepas de B. thuringiensis de "tipo silvestre", es decir, cultivos purificados de cepas B. thuringiensis aislados a fuentes naturales. Los productos bio-ínsecticidas de B. thuringiensis comerciales más nuevos se basan en cepas de B. thuringiensis genéticamente alteradas, tales como la cepas B. thuringiensis transconjugadas descritas en las patentes de E.U.A. Nos. 5,080,897 y 4,935,353. Una característica de las proteínas de cristal es su habilidad para conminase para formar cristales dentro de la célula madre de B. thuringiensis. Después de la lisis de la célula madre las proteínas se liberan como cristales dentro de la ambiente externo. Además, B. thuringiensis también produce proteínas de cristal que, en contraste con las proteínas de cristal, se secretan a través de células de B. thuringiensis como proteínas solubles en el medio de cultivo. Las proteínas no de cristal secretas de B. thuringiensis incluyendo fosfolipasas, proteasa, y p-lactamasas que tienen poca, si hay alguna, actividad insecticida. Sin embargo, tres proteínas no de cristal secretadas de B. thuringiensis designadas Vipl, Vip2 y Vip3 han sido reportadas como siendo tóxicas para insectos coleópteros o lepidópteros (Estruch y otros , 1996; Patentes de E.U.A. Nos. 5,866,326; W094/21795; W096/10083). Una proteína no de cristal de B. thuringiensis designada CryV se reporta como siendo tóxica para insectos lepidópteros (Kostichka y otros, 1996). Un gran número de aislados de B. thuringiensis que producen proteínas de toxina insecticida extracelularmente secretadas han sido identificadas a través de un número de diferentes investigadores. Dichos aislados todos han demostrado que producen una o más estas proteínas de toxina VIP o CryV u homólogos estrechamente relacionados. Las proteínas BT secretadas inhibidoras de coleópteros tales como TIC901 , TIC1201 , TIC407, y TIC417 han sido previamente descritas pero parece que no están relacionadas con las proteínas de la presente invención (Solicitud de Patente Provisional de E.U.A. No. 60/485,483 presentada el 7 de junio del 2003; PCT/US04/21692 presentada el 6 de julio del 2004). Los inventores de la presente describen una nueva clase de toxinas de proteína insecticidas extracelularmente secretadas que no exhiben una homología con las clases de proteínas VIP o CRyB conocidas. Ninguna de estas 137 proteínas tóxicas de insectos de B. thuringiensis (Crickmore y otros, 1998), más o menos, está sustancialmente relacionadas con las" proteínas de la presente invención. De hecho, no se encontró ninguna homología significativa entre las secuencias de proteína de la presente ¡nvención y cualquiera de las miles de secuencias de proteína contenidas en el Centro Nacional de Recursos de Genoma (GenBank), Santa Fe, NM.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN En una modalidad, la presente invención se refiere a una proteína insecticida aislada y purificada, que exhibe una secuencia de aminoácido sustancialmente como se establece en SEC ID NO:4, (TIC900), SEC ID NO:6 (TIC402), SEC ID NO: 8 (TIC403), SEC ID NO: 10 (TIC404), SEC ID NO: 30 (TIC434), SEC ID NO:12 (TIC961 ), SEC ID NO:14 (TIC962), SEC ID NO:16 (TIC963), SEC ID NO: 18 (TIC965), y SEC ID NO: 20 (TIC966), o secuencias de aminoácido relacionadas y homólogos de las mismas. La actividad insecticida de TIC900 y las proteínas relacionadas se han demostrado en bioensayos con insectos lepidópteros incluyendo el barrenador de maíz europeo (ECB), el gusano de tabaco (TBW) y la Polilla con espalda de diamante (DBM), como se muestra aquí. En otra modalidad, la presente invención se refiere a una secuencia de nucleótido aislada y purificada, es decir, una secuencia de codificación, que comprende una secuencia de nucleótido como se establece en SEC ID NO: 3 (t¡c900), SEC ID NO: 5 (tic402), SEC ID NO: 7 (tic403), SEC ID NO: 9 (tic404), SEC ID NO: 29 (tic434), SEC ID NO:11 (tic961 ), SEC ID NO: 13 (tic962), SEC ID NO: 15 (tic963), SEC ID NO: 17 (tic965), o SEC ID NO: 19 (tic966), o secuencias u homólogos relacionados de las mismas. La secuencia de codificación tic900 nativa, como se establece en SEC ID NO:3 codifica la proteína TIC900 que exhibe la secuencia de aminoácido como se establece en SEC ID NO:4. Los organismos que producen TIC900 o proteínas relacionadas exhiben una actividad insecticida y/o propiedades resistentes a insectos. La secuencia de codificación tic402 nativa como se establece en SEC ID NO: 5 codifica la proteína TIC402 que exhibe la secuencia aminoácido como se establece en SEC ID NO: 6. La secuencia de codificación tic403 nativa como se establece en SEC ID NO: 7 codifica la proteína TIC403 que exhibe la secuencia de aminoácido como se establece en SEC ID NO: 8. La secuencia de codificación tic404 nativa como se establece en SEC ID NO:9 codifica la proteína TIC404 exhibe la secuencia de aminoácido como se establece en SEC ID NO: 10. La secuencia de codificación tic434 nativa como se establece en SEC ID NO:29 codifica la proteína TIC434 que exhibe la secuencia de aminoácido como se establece en SEC ID NO: 30. La secuencia de codificación tic961 nativa como se establece en SEC ID NO:11 codifica la proteína TIC961 que exhibe la secuencia de aminoácido como se establece en SEC ID NO: 12. La secuencia de codificación tic962 nativa como se establece en SEC ID NO: 13 codifica la TIC962 proteína que exhibe la secuencia de aminoácido como se establece en SEC ID NO:14. La secuencia de codificación tic963 nativa como se establece en SEC ID NO.J5 codifica la proteína TIC963 que exhibe la secuencia de aminoácido como se establece en SEC ID NO: 16. La secuencia de codificación tic965 nativa como se establece en SEC ID NO: 17 codifica la proteína TIC965 que exhibe la secuencia de aminoácido como se establece en SEC ID NO: 18. La secuencia de codificación tic966 nativa como se establece en SEC ID NO: 19 codifica la proteína TIC966 que exhibe la secuencia de aminoácido como se establece en SEC ID NO: 20. TIC900 o la secuencia de proteínas y nucleótido relacionadas derivadas de cepas ßf tic codifican éstas proteínas se describen aquí como homólogos uno de otro, es decir, proteína insecticidas o fragmentos insecticida de los mismos codificados por secuencias de nucleótido que se hibridizan una la otra o a cualquiera de las secuencias descritas aquí ya sea bajo condiciones de hibridación específicas o bajo condiciones de hibridación severas, y se pretenden específicamente incluir dentro del alcance de la presente invención.

En una modalidad adicional, la presente invención se refiere a un cultivo biológicamente puro de una bacteria ß. thuringiensis transformada Con un vector de plásmido que contiene una secuencia de nucleótido como se establece en SEC ID NO: 3 (tic900), SEC ID NO: 5 (tic402), SEC ID NO: 7 (tic403), SEC ID NO: 9 (tic404), SEC ID NO: 29 (tic434), SEC IDNO:11(tic961 ), SEC ID NO: 13 (tic962), SEC ID NO:15 (tic963), SEC ID NO: 17 (tic965), o SEC ID NO: 19 (tic966), una secuencia u homólogo relacionado que produce una proteína insecticida y secreta la proteína dentro del espacio extracelular que circundan la cepa de la bacteria durante la fermentación. Una cepa ilustrativa SIC9002 ha sido depositada en el Laboratorio de Investigación Regional del Norte de la Colección del Centro de Servicio de Investigación Agrícola (NRRL), USDA, 1815 North University Street, Peoría, IL 61604; en aplicación han dispuesto por el Tratado de Budapest del Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos para los Propósitos de Procedimientos de Patente el 24 de Abril del 2000, y se lea asignado el número de registro NRRL B-30582. Un plásmidos que contiene la secuencia de nucleótido tic900 se establece aquí como pBD1. En una modalidad más, la ¡nvención también se refiere -a un cultivo biológicamente puro de una bacteria B. thuringiensis designará, lá cepa EG5438 que exhibe actividad insecticida contra insectos lepidópteros. La cepa ß. thuringiensis EG5438 representa una cepa de ß. thuringiensis de tipo silvestre a partir de la cual se asiló una secuencia de codificación tic900. La cepa ha sido depositada en NRRL, USDA, en aplicación a lo dispuesto en el Tratado de Budapest el 3 de Mayo, del 2000 y se le ha asignado el número de registro NRRL B-30584. En una modalidad más, la presente invención provee una secuencia de nucleótido como se establece en SEC ID NO: 3 que codifica la secuencia de aminoácido TIC900 (SEC ID NO: 4), y una porción de un oligonucleótido que puede ser marcada y utilizada como una sonda de hibridación para identificar los genes relacionados adicionales que codifica las proteínas u homólogos insecticidas relacionados de los mismos. Otras secuencias de nucleótido relacionadas específicamente ilustradas aquí comprenden las secuencias establecidas en SEC ID NO: 5, SEC ID NO: 7, SEC ID NO: 9, SEC ID NO: 29, SEC ID NO:11 , SEC ID NO: 13, SEC ID NO: 15, SEC ID NO: 17, y SEC ID NO: 19, cada una de las cuales codifica las toxinas de proteína insecticida como se establece en SEC ID NO: 6, SEC ID NO: 8, SEC ID NO:10, SEC ID NO: 30, SEC ID NO:12, SEC ID NO:14, SEC ID NO:16, SEC ID NO:18, y SEC ID NO:20, respectivamente. En una modalidad más, la invención provee células de planta y plantas que han sido transformadas con una secuencia de nucleótido que codifica a TIC900 o una proteína relacionada como se establece en SEC ID NO: 4 un fragmento insecticida de la misma, o un homólogo de proteína TIC900 del mismo, seleccionado del grupo que consiste de SEC ID NO: 6, SEC ID NO: 8, SEC ID NO: 10, SEC ID NO: 30, SEC ID NO: 12, SEC ID NO: 14, SEC ID NO: 16, SEC ID NO: 18, y SEC ID N0:20. La secuencia de nucleótido se puede traducir y expresar a través de células de planta y en tejidos de planta a niveles suficientes para inhibir o aniquilar las plagas de insectos lepidópteros que se ponen en contacto con las plantas transgénicas expresan dicha proteína, particularmente cuando dichas plagas inquieren parte de dicha planta transgénica. Tanto las plantas monocotiledóneas como dicotiledóneas están dentro del alcance de la ¡nvención. Las modificaciones a la secuencia pueden ser requeridas con el fin de afectar el nivel máximo de expresión y para mejorar la habilidad de la planta que contiene la secuencia para producir niveles insecticidas de TIC900 o la proteína relacionada. La transformación de las plantas con las secuencias de nucleótido descritas aquí pueden dar como resultado un incremento en la secuencia de transformantes expresan el transgen, es decir, tic900 o su homólogo, así como la generación de un porcentaje mayor de eventos de transformación que exhibe en una fisiología morfológicamente normal. En aún otra modalidad, la presente invención también provee un método para producir una planta transgénica que exhibe niveles de expresión incrementados de una secuencia de nucleótido que codifica una proteína TIC900 o su fragmento insecticida o su homólogo y por lo tanto niveles incrementados de la proteína TIC900 o su homólogo. De esta forma las plantas transformadas con las secuencias de nucleótido descritas aquí exhiben niveles mejorados incrementados de habilidades resistentes a plagas de lepidópteros en comparación con una planta que carece de una secuencia de nucleótido que codifica TIC900, un fragmento insecticida de TIC900, uno o más de sus homólogos.

Para lograr lo anterior, se provee un método para expresar una secuencia de nucleótido que codifica una proteína TIC900 o su homólogo en una planta que comprende los pasos de a) insertar dentro del genoma de una célula de planta una secuencia de ácido nucleico que comprende la dirección 5' a 3', un promotor funcional de planta operablemente enlazado a una secuencia de ADN estructural optimizada para el expresión de planta que causa la producción de una secuencia de ARN que codifica todos o un fragmento insecticida de una secuencia de polipéptido TIC900 como se establece en SEC ID NO: 4, o su homólogo seleccionado del grupo que consiste de SEC ID NO: 6, SEC ID NO:8, SEC ID NO:10, SEC ID NO: 30, SEC ID NO:12, SEC ID NO:14, SEC ID NO: 16, SEC ID NO: 18, y SEC ID N0:20, una secuencia que tiene por lo menos de aproximadamente 80%, de por lo menos aproximadamente 85%, o de por lo menos aproximadamente 90%, o de por lo menos aproximadamente 95%, o de por lo menos aproximadamente 99% de identidades secuencia con la secuencia de aminoácido establecida en SEC ID NO: 4, una secuencia que codifica una proteína insecticida que hibridiza a cualquiera de estas secuencias bajo condiciones de hibridación específicas o severas, y una secuencia de ADN no traducida que funciona en las células de la planta para causar la terminación de la transcripción y la poliadenilación; b) obtener las células de planta transformadas que contiene la secuencia de acción nucleico; y c) generar a partir de las células de planta transformadas plantas genéticamente transformadas expresan la secuencia de nucleótido que codifica TIC900 una proteína relacionada, en la de las plantas transformadas están morfológicamente normales y exhibe en niveles elevados o mejorados de resistencia a plagas de lepidópteros comparada con plantas no transformadas para expresar dicha proteína. Otra modalidad de la presente invención es la provisión de anticuerpos que se unen específicamente a epítopos presentados solamente a través de la proteína TIC900 o sus homólogos. Las anticuerpos se pueden utilizar para identificar la presencia de una proteína TIC900 un homólogo, para la purificación de la proteína un homólogo, par identificar una secuencia de nucleótido a partir de la cual la proteína TIC900 o un homólogo están siendo expresadas, y para uso en kits diseñados para permitir la detección de una proteína TIC900 o un homólogo o la detección de una secuencia de nucleótido expresan la proteína u homólogo. Los inventores contemplan en las composiciones de proteínas descritas aquí encontrarán utilidad particular como insecticidas para aplicación tópica y/o sistémica a cultivo de campos, pastos, frutas y vegetales, y plantas ornamentales. En una modalidad preferida, la composición bioinsecticida comprende una suspensión fluible en aceite de células bacterianas expresan una proteína insecticida novedosa descritas aquí. Preferiblemente las células son células ß. thuringiensis EG5438 o SIC9002, sin embargo, cualquiera de dichas células huésped bacterianas expresan los fragmentos de ácido nucleico novedosos descritas aquí y que producen una proteína de cristal se contemplan como siendo útiles, tales como B. megaterium, B. subtilis, E. coli, o Pseudomonas spp. Una ventaja particular de la presente invención comprende una mejora en la administración de la resistencia del insecto (IRM). La habilidad de combinar dos o más agente insecticidas, cada uno tóxico para ia misma-especie de aclarar ¡nsectos, en una composición individual, y cada agente exhibe un modo de acción diferente de los otros agentes insecticidas con los cuales está combinado, presenta medios para más efectivamente controlar una especie de aclarar insectos particular sustancialmente reduciendo la probabilidad de que se desarrolle la resistencia a la composición insecticida en una población. La proteína TIC900 un fragmento insecticida de la misma, o cualquier homólogo de la misma, de la presente invención se puede combinar con cualquier número de agentes insecticidas conocidos para lograr nivel de administración de resistencia en una composición particular, preferiblemente a través del expresión de la combinación de agentes insecticidas en plantas. En particular TIC900 o las composiciones de proteína insecticida relacionadas se pueden combinar con una secuencia de aminoácido Cryl o Cry2 una variante de la misma para lograr el control de varias especies de plagas de lepidópteros de plantas, o con otras proteínas Cry apropiadas, y con varios composiciones insecticidas derivadas de especies de bacterias Xenorhabdus y Photorhabdus que han demostrado que exhibe en bioactividad insecticida dirigida a especies de plagas de lepidópteros de plantas. Preferiblemente el uso in planta de estas composiciones podría dirigirse para mejorar expresión de las proteínas en las partes de la planta que exhiben la mayor vulnerabilidad a la depredación de insectos lepidópteros. Para la protección de especies de maíz contra el barrenador de maíz europeo (ECB), sería preferible lograr los niveles más altos de expresión en las hojas y en los tallos de la planta. Para especies de tabaco susceptibles a orugas, sería preferible lograr los niveles más altos expresión en las partes que brotan de la planta, es decir, dentro de los sistemas del capullo de la planta. Para la protección de especies vegetales cruciferas contra la polilla con espalda de diamante (DBM), sería preferible lograr los niveles más altos expresión en las hojas y tallos de la planta. Las proteínas insecticidas de la presente invención cambios se pueden combinar con toxinas insecticidas y/o fungicidas expresadas in planta para lograr una planta recombinante que exhibe múltiples niveles de resistencia a la infestación con plagas que no son benéficas para las "plantas. Por ejemplo, una proteína de la presente invención se puede expresar junto con una proteína que exhibe el control de insectos coleópteros, y/o con una proteína u otra agente exhibe actividad antimitótica, para lograr una planta transgénica recombinante que exhibe una resistencia mejorada a plagas de insectos lepidópteros, plagas de insectos coleópteros y plagas mitóticas. Los expertos en la técnica conocen otras permutaciones de niveles de resistencia, tales como medios para la resistencia a infestación de insectos perforadores y succionadores, infestación de nemátodos, etc. las proteínas insecticidas de la presente invención también se pueden combinar con una o más secuencias de nucleótido expresadas como ARNds para uso la supresión de uno o más genes (1) en la plaga objetivo como medios para lograr que una planta exhiba múltiples capas de resistencia al infestación a través de una plaga particular, (2) en la planta como medios para lograr características de planta apreciadas, o (3) en varias combinaciones para lograr las propiedades deseadas de (1 ) o (2) colectivamente. Las proteínas quiméricas que consisten de todas una parte de una o más proteínas de la presente invención fusionadas con otras proteínas que son útiles en la protección de plantas de infestación, o de alguna otra forma se contemplan aquí. Por ejemplo, los dominios de proteínas de la presente invención se ha encontrado que exhibe un bajo nivel de similitud con otras toxinas Bt, tales como el dominio I de toxina Cry3Aan I, el dominio II de toxinas CrylCa, y el dominio lll de toxina CrylJa (en particular, los Dominios I, II, y lll de la porción de toxina de la proteína TIC900, respectivamente). Las proteínas de la presente invención se pueden funcionar con los dominios de protoxina de cualquiera de las proteínas Cryl conocidos en la técnica, dando como resultado la formación de la proteína de toxina de cristal cuando se expresan en Bt u otras cepas Bacillus de bacterias. Además, los dominios identificados aquí dentro de la secuencia de aminoácido de las proteínas de la presente invención se pueden intercambiar con otros dominios similares de proteínas de toxina Bt insecticida para lograr una actividad insecticida mejorada y/o escalas de huésped que no se habían observado previamente con los intercambios de dominio de toxina Cryl (Malvar y otros Patente de E.U.A. No. 6,017,534; Galizzi y otros, PCT/EP90/0114, WO91/01087).

Otra modalidad comprende un polinucleótido aislado que codifica una toxina insecticida Bacillus thuringiensis o fragmento insecticida del mismo, activo contra un aclarar ¡nsectos, en donde la toxina o el fragmento insecticida tienen un peso molecular entre aproximadamente 65,000 datlons y aproximadamente 70,000 daltons. Además, la secuencia de nucleótido que codifica la toxina, o el complemento de la misma, se hibridiza bajo condiciones de hibridación específicas o severas a SEC ID NO:3. La toxina preferiblemente exhibe una actividad biológica en el control aniquilación de una plaga de insectos lepidópteros, preferiblemente el barrenador de maíz europeo (ECB), o lugar de tabaco (TBW) y/o la polilla con espalda de diamante (DBM). En una modalidad la secuencia de nucleótido que codifica la toxina se optimiza para la expresión en plantas, aún codifica sustancialmente la toxina un fragmento insecticida de la misma, es decir, codifica la misma o sustancialmente la misma secuencia de aminoácido que esta presente la secuencia de aminoácido nativa. - " Otra modalidad de la presente invención provee células huéspe transformadas para contener un polinucleótido que codifica una proteína insecticida de la presente invención un fragmento insecticida de la mismo.

Preferiblemente las secuencias de nucleótido de la presente invención se modifican para mejorar expresión de las proteínas de la presente invención en una célula huésped preferida. La célula huésped de la presente ¡nvención se selecciona del grupo que consiste de célula bacteriana, célula mitótica, y una célula de planta. La expresión en una célula de planta puede comprender la expresión para lograr ia acumulación de la proteína insecticida en el citoplasma, o puede dar como resultado la proteína insecticida que se está acumulando en un orgánulo subcelular tal como una plastlda, cloroplasto, o mitocondria. Alternativamente la proteína Insecticida de la presente invención o los fragmentos insecticidas de la misma podría localizarse para la maquinaria de secreción de la proteína de la célula huésped particular y dar como resultado la acumulación del producto de proteína fuera de la célula y dentro de los espacios extracelulares que rodea la célula. Una modalidad adicional de la presente invención provee un método para controlar infestación de una planta a través de especies de insectos lepidópteros. Preferiblemente una cantidad pesticida de una proteína insecticida de la presente invención o fragmento insecticida de la misma se provee para consumo a través de la plaga ¡nsectos en la dieta del insectos. La dieta por consiste de una parte de la planta de la cual normalmente en ¡nsectos se alimenta, tal como un tejido de planta una célula de planta. La proteína insecticida o fragmento insecticida de la misma puede ser provista en una composición que se aplica la superficie tejido de la planta, parte de la planta, o célula de la planta o más preferiblemente se puede producir a través de maquinaria de síntesis de proteína de la célula y, como se describió anteriormente, acumularse dentro de la célula de la planta o secretase fuera de la célula de la planta, mientras la cantidad de la toxina de proteína provista sea una cantidad suficiente de insecticida para inhibir la plaga de insectos de alimentación adicional, o para inhibir el crecimiento y desarrollo adicional de ia plaga insectos, o para causar la mortalidad del aclarar insectos. La toxina insecticida o fragmento de la misma se deriva de la secuencia de nucleótido que esta codificada en Bacillus thuringiensis a través de una secuencia de nucleótido que se hibridiza bajo condiciones severas a \a secuencia de nucleótido sustancialmente complementaria a SEC ID NO:3. La presente invención también provee un método para detectar una primera secuencia de nucleótido que hibridiza una segunda secuencia de nucleótido como se establece en SEC ID NO: 3, en donde la" primera secuencia de nucleótido codifica una proteína insecticida o un fragmento insecticida de la misma hibridiza bajo condiciones de hibridación específicas o severas a la segunda secuencia de nucleótido. Otras segundas secuencias de nucleótido ilustrativas son SEC ID NO: 5, SEC ID NO: 7, SEC ID NO: 9, SEC ID NO:29, SEC ID NO:11 , SEC ID NO:13, SEC ID NO:15, SEC" ID NO: 17, y SEC ID NO: 19. También se contempla que las proteínas de la presente invención podría ser útiles cuando se expresan in planta para proveer nivel mejorado de protección a partir de la infestación de insectos a plantas expresan las proteínas o fragmentos insecticidas de las mismas. Por consiguiente se contempla que una o más secuencias de nucleótido codifican una proteína insecticida TIC900 o fragmento insecticida de la misma u homólogo de la misma, o combinaciones de la misma, ya sea individualmente expresadas o como quimeras o fusiones, se podrían introducir dentro de la -célula de planta, ya sea dentro de genoma, dentro del cloropiasto o ADN mitocondrial, o en un orgánulo como un elemento extra-cromosómico estable y autónomo de replicación, para el expresión de dicha proteína TIC900 o fragmento insecticida de la misma u homólogo de la misma. Preferiblemente la secuencia es una secuencia de nucieótido no de existencia natural que codifica la proteína insecticida fue fragmento insecticida de la misma. Las células de planta transformadas con dichas secuencias se proveen aquí. Las plantas que crecen a partir de células de planta transformadas se proveen través de los inventores de la presente. Las semillas y la progenie de las semillas de las plantas transformadas de la presente invención también se proveen mientras las semillas contengan por lo menos las secuencias de codificación de las proteínas insecticidas o de los fragmentos de proteína insecticida de la misma. Las secuencias de nucleótido contempladas son de por lo menos 60% a aproximadamente 85% idénticas a las secuencias de nucleótido de la presente invención como un aislado de B. thuringiensis. Las secuencias ilustrativas de la presente invención ¡ncluye por lo menos, además de aquella relacionadas con SEC ID NO: 5 y SEC ID NO:4: (1 ) la secuencia de nucleótido como se establece en SEC ID NO:5, y la secuencia de aminoácido codificada por SEC ID NO: 5 como se establece en SEC ID NO: 6, también referida aquí como proteína insecticida TIC402; (2) la secuencia de nucleótido como se establece en SEC ID NO: 7, y la secuencia de aminoácido codificada por SEC ID NO: 7 como se establece en SEC ID NO: 8, también referida aquí como proteína insecticida TIC403;- (3) la secuencia de nucleótido como se establece en SEC ID NO: 9, y la secuencia de aminoácido codificada por SEC ID NO: 9 como se establece en SEC ID NO: 10, también referida aquí como proteína insecticida TIC404; (4) la secuencia de nucleótido como se establece en SEC ID NO: 29, y la secuencia de aminoácido codificada por SEC ID NO: 29 como se establece en SEC ID NO: 30, también referida aquí como proteína insecticida TIC434; (5) la secuencia de nucleótido como se establece en SEC ID NO:11, y la secuencia de aminoácido codificada por SEC ID NO: 11 como se establece en SEC ID NO: 12, también referida aquí como proteína insecticida TIC961 ; (6) la secuencia de nucleótido como se establece en SEC ID NO: 13, y la secuencia de aminoácido codificada por SEC ID NO: 13 como se establece en SEC ID NO: 14, también referida aquí como proteína insecticida TIC962; (7) la secuencia de nucleótido como se establece en SEC ID NO: 15, y la secuencia de aminoácido codificada por SEC ID NO: 15 como se establece en SEC ID NO: 16, también referida aquí como proteína insecticida TIC963; (8) la secuencia de nucleótido como se establece en SEC ID NO: 17, y la secuencia de aminoácido codificada por SEC ID NO: 17 como se establece en SEC ID NO: 18, también referida aquí como proteína insecticida TIC965; y (9) la secuencia de nucleótido como se establece en SEC ID NO: 19, y la secuencia de aminoácido codificada por SEC ID NO:19 como se establece en SEC ID NO: 20, también referida aquí como proteína insecticida TIC966. Cada una de estas proteínas y las secuencias de nucleótido B.t. Nativas y codifican estas proteínas están relacionadas con TIC900 como se define aquí. Por ejemplo, y respectivamente, SEC ID NO: 5 es una secuencia de nucleótido que codifica una proteína insecticida TIC402 como se establece en SEC ID NO: 6. SEC ID NO: 5 como se muestra aquí se identifica a través de hibridación para SEC ID NO: 3 bajo condiciones severas. SEC ID NO: 5 codifica una proteína que exhibe actividad biológica tóxica lepidóptero, exhibe toxicidad para el barrenador de maíz Europeo (ECB), el gusano de tabaco (TBW) y/o la polilla de espalda de diamante (DBM). SEC ID NO: 7, SEC ID NO: 9, SEC ID NO: 29, SEC ID NO:11 , SEC ID NO: 13, SEC ID NO: 15, SEC ID NO: 17, y SEC ID NO: 19 cada una son capaces de hibridizarse una la otra bajo condiciones severas, y cada secuencia se puede identificar a través de hibridación de SEC ID NO: 3 bajo condiciones severas, y cada secuencia se puede identificar a través de amplificación utilizando los iniciadores de oligonucleótido como se establece en SEC ID NO: 21 y SEC ID NO: 22. Los iniciadores como se establece en SEC ID NO: 21 y SEC ID NO: 22 son el diagnóstico para la identificación de la presencia de una secuencia de nucleótido que codifica TIC900 una proteína insecticida relacionada en una muestra. Estos oligonucleótido, cuando se utilizan juntos bajo condiciones de amplificación definidas y la presencia de un sustrato de secuencia de nucleótido adecuado, producen amplicón que es el diagnóstico de la presencia de una secuencia de codificación TIC900 un homólogo de la misma. Esta reacción particular es útil para detectar la presencia de un gen B. t. que codifica una proteína insecticida correspondiente a una TIC900 o proteína relacionada, y simplifica enormemente la búsqueda de y la identificación de dichas secuencias relacionadas.

También se contemplan los kits para detectar la presencia de las secuencias de nucleótido de la presente invención. Dichas kits contienen una o más secuencias de nucleótido cada una para uso como una sonda para detectar la presencia de una secuencia de nucleótido que codifica una proteína insecticida de la presente invención un fragmento de la misma. Dichos kits también o alternativamente podrían contener un anticuerpo específico para el enlace con uno o más péptidos de las proteínas de la presente invención, así como reactivos para uso con la sonda o anticuerpo, y los kits también podrían contener muestras de control para uso en el aseguramiento de que los nucleótido o péptidos identificados con la sonda y/o el anticuerpo y reactivos estuviera funcionando de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Todos los reactivos necesarios para llevar a cabo los métodos de identificación de cualquier secuencia de nucleótido o péptidos se empacaron juntos en un kit junto con instrucciones para uso. Un kir ilustrativo podría contener TIC900 una secuencia de nucleótido relacionada que codifica una proteína insecticida junto con una muestra de los -iniciadores de amplificación de la secuencia de nucleótido ilustrativa como se establece en SEC ID NO:21 y SEC ID NO: 22, junto con los reactivos necesarios para llevar a cabo la región de amplificación, todos empaquetados juntos en el kit. Una planta o tejido de planta transformado para contener (a) una secuencia de nucleótido que codifica una o más de las proteínas de la presente invención, (2) todas una porción insecticidamente activa de una o más de las proteínas de la presente invención, o (3) una quimera conteniendo todas una porción de una o más proteínas de la presente invención se pueden detectar utilizando cualquier número de medios bien conocidos en la técnica, incluyendo, pero no limitándose a la secuencia de nucleótido con base en métodos de detección y/o métodos detección con base en proteína. Los productos agronómica y comercialmente importantes y/o composiciones de materia derivados de dichas plantas transformadas o tejido se planta incluyen pero no se limitan a alimentos para animales, artículos de consumo, y seos de producir maíz, soya, algodón, cánola, trigo, avena, arroz, caña de azúcar, garbanzos y chícharos y sub-productos que son previstos para uso como alimento para consumo humano o para uso en composiciones previstas para consumo humano incluyendo, pero no limitándose a harinas, comidas, jarabes, aceite, al mirón, rosetas de maíz, pasteles, cereales conteniendo frutas y semillas de estos cultivos y sub-productos, y similares que pretenden estar dentro del alcance de la presente invención si estos productos y composiciones de materia contienen cantidades detectables de las secuencias de nucleótido de proteínas o derivados de proteínas como se establece aquí. Las plantas o partes de plantas que se sospecha que contienen una proteína un nucleótido que codifica una proteína de la presente invención en una muestra biológica se pueden detectar utilizando el método que comprende los pasos de, poner en contacto una muestra que se sospecha que contiene dicho nucleótido con una sonda de polinucleótido hibridiza bajo condiciones de hibridación severas con dicho nucleótido y que no hibridiza bajo condiciones de hibridación severas con un nucleótido de una planta de control, someter dicha muestra y dichas sonda a dichas condiciones de hibridación severas, y detectar la hibridación de dichas sonda para nucleótido. Una modalidad de la presente invención comprende una muestra biológica derivada de una planta, tejido, o semillas transgénica, en donde la muestra comprende una secuencia de nucleótido que es, o que está complementaria una secuencia que codifica una proteína de la presente invención, y en donde dicha secuencia es detectar en dicha muestra utilizando un método de amplificación de ácido nucleico o hibridación de ácido nucleico. La muestra puede consistir de una muestra que se selecciona de! grupo que consiste de un extracto que se obtiene de la planta transgénica conteniendo la secuencia de nucleótido, y el extracto puede contener cualquier secuencia de nucleótido que codifica una o más de las proteínas de la presente invención, o el complemento de la misma. La muestra biológica preferiblemente selecciona del grupo que consiste de una harina, tal como harina de maíz, una comida tal como comida de maíz, un jarabe, tal como jarabe de maíz, un aceite tal como aceite de maíz, aceite de algodón, aceite de linaza, aceite de fríjol de soya o aceite de cánola, aceite de girasol, aceite de cárcamo, aceite de cacahuate, y similares, un almidón tal como almidón de maíz, y cualquier cereal que puede fabricante todo en parte para contener granos o sub-productos de grano. La secuencia de nucleótido es detectable en el extracto utilizando un método de amplificación de ácido nucleico o de hibridación de ácido nucleico.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS SECUENCIAS SEC ID NO: 1 representa una secuencia de aminoácido derivada por la degradación Edmund de un fragmento de bromuro de cianógeno de 14 kDa de una proteína TIC900 proteína y corresponde a las posiciones aminoácido 397-414 como se establece en SEC ID NO:4. SEC ID NO:2 representa la secuencia de nucleótido de una sonda de hibridación designada como WD470 designada con base en la secuencia de aminoácido como se establece en SEC ID NO:1 , para uso la detección de las secuencias de nucleótido que codifican TIC900 proteína relacionadas. SEC ID NO: 3 representa una secuencia de nucleótido de Bacillus thurngiensis nativo que consiste de 1803 nucleótido consecutivos que codifican una proteína insecticida TIC900 que consiste de 601 aminoácidos como se establece en SEC ID NO:4. SEC ID NO: 4 representa la secuencia de aminoácido TIC900 derivada de la secuencia de nucleótido como se establece en SEC ID NO:3. SEC ID NO:5 representa una secuencia de nucleótido homologa tic900 que codifica una proteína relacionada TIC900 Bacillus thuringiensis nativa, designada aquí como TIC402. SEC ID NO: 6 representa la secuencia de aminoácido TIC402 derivada de la secuencia de nucleótido como se establece en SEC ID NO:5. SEC ID NO:7 representa una secuencia de nucleótido homologa tic900 que codifica una proteína relacionada TIC900 Bacillus thuringiensis nativo, designada aquí como TIC403. SEC ID NO: 8 representa la secuencia de aminoácido TIC403 derivada de la secuencia de nucleótido como se establece en SEC ID NO:7. SEC ID NO:9 representa una secuencia de nucleótido homologa tic900 que codifica una proteína relacionada TIC900 Bacillus thuringiensis nativa, designada aquí como TIC404. SEC ID NO: 10 representa la secuencia de aminoácido TIC404 derivada de la secuencia de nucleótido como se establece en SEC ID NO:9. SEC ID NO: 11 representa una secuencia de nucleótido homologa tic900 que codifica una proteína relacionada TIC900 Bacillus thuringiensis nativo, designada aquí como TIC961. SEC IDNOJ2 representa la secuencia de aminoácido TIC961 derivada de la secuencia de nucleótido como se establece en SEC ID NO: 11. SEC ID NO:13 representa a tic900 secuencia de nucleótido homologa que codifica una proteína relacionada TIC900 Bacillus thuringiensis nativa, designada aquí como TIC962. SEC ID NO:14 representa la secuencia de aminoácido TIC962 derivada de la secuencia de nucleótido como se establece en SEC ID NO:13. SEC ID NO:15 representa una secuencia de nucleótido homologa tic900 que codifica una proteína relacionada TIC900 Bacillus thuringiensis nativa, designada aquí como TIC963. SEC ID NO: 16 representa secuencia de aminoácido laTIC963 derivada de la secuencia de nucleótido como se establece en SEC ID NO:15. SEC ID NO:17 representa una secuencia de nucleótido homologa tic900 que codifica una proteína relacionada TIC900 Bacillus thuringiensis nativa, designada aquí como TIC965. SEC ID NO: 18 representa ia secuencia de aminoácido TIC965 derivada de la secuencia de nucleótido como se establece en SEC ID NO: 17. SEC ID N0:19 representa una secuencia de nucleótido homologa tic900 que codifica una proteína relacionada TIC900 Bacillus thuringiensis nativa, designada aquí como TIC966. SEC ID NO: 20 representa la secuencia de aminoácido TIC966 derivada de la secuencia de nucleótido como se establece en SEC ID NO: 19. SEC ID NO:21 representa entre un iniciador de secuencia de extremo 5' utilizado como una sonda que se une específicamente a las secuencias homologas TIC900. SEC ID NO: 22 representa un Iniciador de secuencia de extremo 3' utilizado como una donde que se une específicamente a las secuencias homologas TIC900. SEC ID NO: 23 representa una t secuencia de nucieótido id 09 que codifica una proteína quimérica TIC109 que consiste de una secuencia de nucleótido que codifica una dominio de proteína insecticida TIC900 enlazado en marco a una secuencia de nucleótido que codifica un fragmento del dominio de protoxina CrylAc. SEC ID NO: 24 representa una secuencia de proteína quimérica TIC109 de aminoácido que consiste de una secuencia Ve aminoácido insecticida TIC900 que consiste de una secuencia insecticida (1-603) enlazada a una secuencia de aminoácido del fragmento de domino de protoxina CrylAc (606-1168). SEC ID NO: 25 representa una secuencia de nucleótido ticl 10 que codifica una proteína quimérica TIC110 que consiste de una secuencia de nucleótido que codifica un fragmento del dominio I de toxina aCrylF (nucleótidos 1- 723) enlazado en marco a una secuencia de nucleótido que codifica un dominio ll-ll del fragmento de toxina TIC900 (nucleótidos 724-1809) enlazado en marco a una secuencia de nucleótido que codifica un fragmento del dominio de protoxina CrylAc (nucleótidos 1810-3510). SEC ID NO: 26 representa una secuencia de proteína quimérica de aminoácido TIC110 que consiste del fragmento del dominio I de toxina CrylF (aminoácidos 1-233) enlazado al fragmento del dominio ll-lll de toxina TIC900 (aminoácidos 234-603) enlazado al fragmento del dominio de" protoxina CrylAc (aminoácidos 604- 1170). SEC ID NO: 27 representa una secuencia de nucleótido tic111 que codifica una proteína quimérica TIC111 que consiste de una secuencia de nucleótido que codifica un fragmento del dominio I de toxina CrylAc (nucleótidos 1-705) enlazado en marco a una secuencia de nucleótido que codifica un fragmento del dominio ll-lll de toxina TIC900 (nucleótidos 706-1815) enlazado en marco a una secuencia de nucleótido que codifica un fragmento del dominio de protoxina CrylAc (nucleótidos 1822-3516).

SEC ID NO: 28 representa una secuencia de proteína quimérica de aminoácido TIC111 que consiste de un fragmento del dominio I de toxina CrylAc (aminoácidos 1-235) enlazado a un fragmento dominio ll-lll de toxina TIC900 (aminoácidos 236-605) enlazado a un fragmento del dominio de protoxina CrylAc (aminoácidos 608- 1172). SEC ID NO: 29 representa una cepa B. thuringiensis EG4611 de una secuencia de nucleótido de alrededor de 7.5 kb que contiene una secuencia de codificación TIC434, dicha secuencia de codificación siendo de alrededor de la posición 425 del nucleótido a alrededor de la posición 2238 del nucleótido. SEC ID NO:30 representa una secuencia de aminoácido TIC434. SEC ID NO: 31 representa una secuencia quimérica que codifica una secuencia de aminoácido TIC435 correspondiente una secuencia de aminoácido TIC434 fusionada en marco a una secuencia que codifica una secuencia de aminoácido de protoxina Cryl; dicha secuencia de aminoácido TIC434 codifica la región correspondiente a alrededor de la posición 1 del nucleótido a alrededor de la posición 1825 del nucleótido, y dicha secuencia de aminoácido de protoxina Cryl codifica la región correspondiente a alrededor de la posición 1826 del nucleótido a alrededor de la posición 3525 del nucleótido. SEC ID NO: 32 representa una secuencia de aminoácido quimérica TIC435.

DESCRIPICION DETALLADA DE LA INVENCIÓN La siguiente descripción detallada de la invención se provee para ayudar a aquellos expertos en la técnica en la práctica de la presente invención. Aún así, la descripción detallada no deberá construirse para limitar indebidamente la presente invención ya que se pueden hacer modificaciones y variaciones en las modalidades explicadas aquí por aquellos con experiencia en la técnica sin apartarse del espíritu o alcance del descubrimiento de la invención. De acuerdo con la presente invención, se ha descubierto un género nuevo de secuencias de nucleótido que codifican proteínas insecticidas derivadas de Bacillus thuringiensis y cepas de Bacilllus relacionadas. Como se definen cualquier lugar aquí, todas estas secuencias de nucleótido se hibridizan una a la otra bajo condiciones severas. Las proteínas codificadas por esta secuencia de nucleótido cada una exhibe una actividad biológica inhibidora de las especies de lepidópteros, y por lo tanto se consideran como proteínas insecticidas. Cada una de las proteínas codificadas por esta secuencia de nucleótido se puede expresar en planta sola recombinación una con la otra o con otros agentes insecticidas inhibidores de lepidópteros tales como proteínas, proteínas de cristal, toxinas, y/o ARNs estructura de cadena doble específicos de plagas, para suprimir ios genes dentro de una o más plagas objetivo, y similares para lograr medios para la administración de Resistencia de insectos en el campo que no fue factible antes a través del solo uso de proteínas insecticidas de lepidópteros conocidas derivadas de cepas Bacillus thuringiensis, tales como proteínas Cryl y varias proteínas insecticidas inhibidoras de lepidópteros derivadas de especies Bacillus laterosporous y Bacillus sphaericus. Las proteínas de la presente invención camiseta de utilizar en plantas en combinación con otros tipos de toxinas insecticidas para lograr en las plantas transformadas contengan por lo menos un medio para controlar una o más de las plagas de plantas comunes seleccionadas de los grupos que consisten de plagas de insectos lepidópteros, plagas de insectos coleópteros, plagas de insectos perforadores y succionadores, y similares. Las proteínas de la presente invención de 1000 se contemplan para uso formulaciones, ya sea solas o en combinación con otros agentes insecticidas, como insecticidas para aplicación tópica y/o sistémica para cultivos de campo, pastos, frutas y vegetales, y plantas ornamentales. En una modalidad preferida, la composición bio-insecticida contiene una suspensión fluible de aceite de células bacterianas expresan una o más de las proteínas insecticidas novedosas descritas aquí. Preferiblemente, las células son células ß. thuringiensis EG5438 o SIC9002, sin embargo, cualquiera de dicha células huésped bacterianas expresan segmentos de ácido nucleico novedosos descritas y que producen una proteína de cristal. Las proteínas insecticidas la presente invención cabeza pueden utilizar en composiciones para controlar infestación de insectos de plantas ya sea solas o en combinación con otros proteínas insecticidas o agentes, dictamen se pueden utilizar sólo son combinación con metodologías de supresión de gen, y supresión transcripcional. Como se utiliza aquí, "supresión de gen" significa cualquiera de los métodos bien conocidos para suprimir la expresión de la proteína a partir de un gen que incluye la supresión de un gen después de la transcripción y supresión de transcripción. Como se utiliza aquí una característica "resistencia a plagas" es una característica de una planta transgénica es resistente al ataque de una plaga de plantas tal como un virus, nematodo, ¡nsectos de larva o un insecto adulto que típicamente es capaz de inflingir pérdida de rendimiento del cultivo en una planta progenitora. Dichas resistencia a las plagas puede surgir de una mutación natural, o más típicamente de la incorporación de ADN recombinante que confiere resistencia las plagas. Para impartir resistencia insectos a una planta transgénica tal como ADN recombinante se puede, por ejemplo, codificar una proteína letal de insecto tal como la bacteria en endotoxina delta de Bacillus thuringiensis, por ejemplo como se utiliza en variedades comercialmente disponibles de algodón y maíz, codificar una proteína de toxina insecticida descritas aquí tal como una TIC900 una proteína relacionada, o fragmento insecticida de la misma, o se puede transcribir a un ARN estructura de cadena doble activado para la supresión de un gen esencial en el insecto, o cualquier combinación de estos agentes insecticidas. Para ilustrar que la producción de plantas transgénicas con resistencia las plagas es una capacidad y aquellos con experiencia en la técnica hacer referencia a 5,250,515; 5,880,275 y 6,555,655 que describe las plantas expresan una endotoxina de bacteria Bacillus thuringiensis. También ver la Patente de E.U.A. No. 6,506,599 (Fire y otros) y la Publicación de la Solicitud de Patente de E.U.A. 2003/0061626 A1 (Plaetinck y otros) y Publicación de de Solicitud de Patente 2003/0150017 A1 (Mesa y otros) que describen el control de invertebrados permitiendo que la plaga se alimente de plantas transgénicas que producen a ARN estructura de cadena doble para suprimir un gen objetivo en la plaga. Ver también la Patente de E.U.A. 5,986,175 (Jilka y otros) que . describe el control de plagas virales a través de plantas transgénicas que expresa replicasa viral. Todas las patentes y- solicitudes anteriormente descritas que describen materiales y métodos para el control de plagas en plantas se incorporan aquí por referencia. Sorprendentemente, las proteínas de la presente invención parece que no están estacionadas con ninguna de las proteínas-insecticidas de Bacillus thuringiensis hasta ahora descubiertas en la técnica. Las proteínas de la presente invención se muestran aquí, siendo excretadas en el espacio extracelular que rodea las especies Bacillus a partir de las cuales se derivan. Estos proteínas se muestran aquí, siendo significativamente menores de las proteínas Cry previamente conocidas en la técnica, y se expresan durante la etapa vegetativa del crecimiento de cultivos de célula bacterianos aislados y codificados. Esto es diferente de la expresión de proteínas Cry que se expresan generalmente en la fase de esporulación de crecimiento y que forman varios cuerpos cristalinos dentro de la espora frontal de la célula. - Como será evidente para aquellos con experiencia técnica, los inventores aquí describen el aislamiento y purificación de una secuencia de nucleótido, tic900, que codifica que codifica una proteína TIC900 precursora (TIC900p) que es subsiguientemente procesada para liberar una proteína TIC900 madura (TIC900m) que exhibe actividad biológica inhibidoras de especies de lepidópteros. Los inventores de la presente describen el uso de la secuencia tic900 como un medio para identificar una multitud de otros homólogos y secuencias relacionadas, y también cada una puede codificar las proteínas Insecticidas relacionadas con TIC900. La secuencia de nucleótido es descrita aquí y que codifica TIC900 y proteína relacionadas se derivaron de varias cepas de Bacillus thuringiensis, es decir, las cepa EG5438 que contiene por lo menos un gen designado aquí como tic900. Las cepa EG5438 se depositó bajo las provisiones del Tratado de Budapest con la colección permanente de NRRL el 3 de mayo del 2002, y se provee con el número de registro NRRL No. NRRL B-30584. Otra cepa identificada aquí para contener una secuencia que codifica TIC900, a secuencia de nucleótido idéntica al alelo EG5438 tic900, fue la cepa EG5526 B. thuringiensis . La secuencia de los proteína relacionada con tic900, y la secuencia de aminoácidos relacionada con TIC900 (incluyendo las especies precursora y madura de TIC900) que se describen aquí, incluyen pero no se limitan a tic402 y la proteína insecticida codificada TIC402 aislada de y producida por lo menos por las cepas EG3879ß. t, tic403 y la proteína insecticida codificada TIC403 aislada y producida por lo menos por las cepa EG4332 ß. t, tic404 y la proteína insecticida codificada TIC404 aislada de y producida al menos por la cepa EG4971 B.t, tic434 y la proteína insecticida codificada TIC434 aislada de y producida al menos por la cepa EG4611 ß. t, tic961 y la proteína insecticida codificada TIC961 aislada de y producida al menos por la cepa EG4090 ß. t, tic962 y la proteína insecticida codificada TIC962 aislada de y producida al menos por la cepa EG4293 B. t, tic963 y la proteína insecticida codificada TIC963 aislada de y producida al menos por la cepa EG4611 ß. t, tic965 y la proteína insecticida codificada TIC965 aislada de y producida al menos por la cepa EG5023 B. t, y tic966 y la proteína insecticida codificada TIC966 aislada de y producida ai menos por la cepa EG4092 ß. í.. Se pretende que las proteínas de la presente invención se utilicen para propósitos agrícolas, es decir, para proteger plantas de infestación de plagas ¡nsectos, y más particularmente para proteger plantas de infestación de plagas insectos lepidópteros. Como se ilustra aquí, las proteínas de la presente invención son útiles para proteger plantas por lo menos de la infestación del barrenador de maíz europeo (ECB), por lo menos infestación del gusano del tabaco (TBW) y por lo menos infestación de la polilla la espalda de diamante (DBM). La protección de las plantas se puede lograr a través de aplicación tópica de una planta o partes de la planta tal como a través de la aplicación a la superficie de la planta, es decir, las hojas, flores, tallos, pedúnculo, y raíces, una composición que contiene una cantidad insecticidamente efectiva de una o más las proteínas de la presente invención.

Alternativa, y preferiblemente, la planta misma se transformará para contener una secuencia de nucleótido modificada para la expresión mejorada de la proteína de la presente invención in planta o la expresión de una porción insecticida de la misma. La proteína TIC900 es un compuesto insecticida activo contra insectos lepidópteros tales como ECB, TBW y DBM. La proteína TIC900 como se establece en SEC ID NO: 4 y proteínas insecticidas relacionadas se puede utilizar como el Ingrediente activo en las formulaciones insecticidas útiles para controlar los insectos lepidópteros. Como se utiliza aquí con referencia las proteínas insecticidas que están relacionadas con TIC900, se pretende que -las proteínas insecticidas relacionadas sean aquellas que se identifican como homólogos de TIC900 o aquellos que se identifican como estando codificadas por una secuencia de nucleótido que hibridiza bajo condiciones severas a toda o partes de la secuencia de codificación Bacillus thuringiensis nativa la proteína TIC900 una porción insecticida de la misma. Por supuesto, un experto la técnica reconocer aquí, gracias a la redundancia del código genético, muchas otras secuencias son capaces de codificar dichas proteínas relacionadas, y esa secuencias, hasta el punto en que funcionan para expresar proteínas insecticidas ya sea en cepas Bacillus o de células de planta, y pretenden estar abarcabas por la presente invención, reconociendo por supuesto que muchas de dichas secuencias de codificación redundantes no se hibridizarán bajo condiciones severas a la secuencia de codificación nativa TIC900. La secuencia de codificación son concebibles que funcionan para codificada toda o una porción insecticida de una TIC900 o proteína relacionada que no se hibridiza bajo condiciones severas. Sin embargo, dichas secuencias se derivan de la secuencia de nucleótido nativa sobre las bases de que la secuencia de nucleótido nativa es capaz de ser modificada para exhibir una secuencia no nativa que aún codifica la misma o sustancialmente la misma secuencia de aminoácido nativa, o que la secuencia de aminoácidos nativa es capaz de ser utilizada junto con un cuadro de codón para traducirse en forma inversa, permitiendo a un experto la técnica llegar a una secuencia de nucleótido tic codificar toda o una porción insecticida de una TIC900 o proteína relacionada. Todas estas secuencias pretenden estar dentro del alcance de la presente ¡nvención. Las cepas B. thuringiensis que contienen una secuencia de nucleótído que codifica una TIC900 una proteína relacionada equivalentes sustanciales de la misma, se pueden cultivar utilizando medios conocidos y técnicas de fermentación. Después de la finalización del ciclo de fermentación, la bacteria expresa TIC900 un homólogo de la misma se puede cosechar primero separando las esporas y cristales ß. thuringiensis del caldo de fermentación consumido a través de medios bien conocidos en la técnica. Las esporas y cristales B. thuringiensis recuperados se pueden formular en un polvo humectable, un concentrado líquido, granulos u otros formulaciones a través de la adición de agentes tensioactivos, dispersantes, portadores inertes u otros componentes para facilitar el manejo y la aplicación de plagas objetivo particulares. Los procedimientos de formulación y aplicación son bien conocidos en la técnica. Las proteínas en el caldo de fermentación consumido que incluyen TIC900 o proteínas relacionadas de la presente invención se pueden concentrar y formular en un polvo humectable, un concentrado líquido, granulos u otros formulaciones a través de la adición de agentes tensioactivos, dispersantes, portadores inertes, y otros componentes para facilitar el manejo la aplicación para plagas objetivo particulares. Los granulos de carnada formulados que contienen un atrayente y esporas y cristales de los medios de fermentación consumidos aislados o concentrados de ß. thuringiensis o proteínas insecticidas purificadas " de esporas o medios de fermentación consumidos, o microbios recombinante que comprende la secuencia de nucleótido tic codifican TIC900 o proteínas relacionadas que se obtienen a partir de los aislados de ß. thuringiensis descritos aquí, se pueden aplicar al ambiente de la plaga. La carnada se puede aplicar liberablemente ya que la toxina no afecta animales o seres humanos. El producto también se puede formular como una aspersión un polvo. Las plagas recogen el producto con sus patas o abdomen y los llevan de regreso al nido en donde las otras plagas serán expuestas a la toxina. El huésped aislado o recombinante B. thuringiensis expresa una secuencia de nucleótido o gen que codifica TIC900 o proteína relacionada de la presente ~ invención también se puede incorporar dentro de una carnada u origen de alimento para la plaga. Como se apreciará por un experto la técnica, la concentración de pesticida variará ampliamente dependiendo de la naturaleza de la formulación particular, particularmente si es un concentrado o se va utilizar directamente. El pesticida estará presente en por lo menos uno por ciento en peso, y puede ser 100% en peso. Las formulaciones secas tendrán de aproximadamente 1-95% en peso de pesticida mientras que las formulaciones líquidas generalmente serán de aproximadamente 1-60%o en peso de los sólidos en la fase líquida. Las formulaciones generalmente tendrán de aproximadamente 10 aproximadamente 104 células/mg o de aproximadamente 5 a aproximadamente 100 partes por millón de la proteína insecticida del componente activo, es decir, la proteína TIC900, una variante de la secuencia de aminoácido de la misma, una porción insecticida o fragmento de la misma, un homólogo de la misma. Estos formulaciones administrarán en aproximadamente 50 mg (líquida o secas) a un kilogramo o más por hectárea. Las formulaciones se pueden aplicar al ambiente de las plagas de lepidópteros, por ejemplo, plantas, suelo, o agua a través de aspersión, espolvoreado, rocío, o similares y también se puede aplicar a las superficies de las semillas como tratamiento de semilla o recubrimiento de semilla y se pueden impregnar dentro de la cubierta de la semilla y/o cotiledónea(s). Un experto la técnica sabrá que para lograr la expresión mejorada de una proteína insecticida Bt en una planta, primero necesita preparar una secuencia de nucleótido que codifica la proteína Bt, una variante o fragmento activa de la proteína. Entonces la secuencia de nucleótido que codifica la proteína un fragmento de la misma se colocará en un cásete de expresión que funciona en plantas para causar la transcripción de la secuencia de codificación en un ARN mensajero que subsecuentemente se traduce en las células de la planta de tal forma que una cantidad insecticidamente efectiva traducida de la proteína insecticida se produce dentro de los tejidos de la planta. Un experto la técnica también sabrá cómo transformar una célula de planta, preferiblemente una célula de maíz, algodón, fríjol de soya, cánola, arroz, trigo, apenas, pasto, planta de forraje, planta crucifera, árbol frutal, planta ornamental, tomate, papa, zanahoria, coliflor, y tabaco y similares con la secuencia de nucleótido insertada dentro del cásete de expresión funcional de la planta y para seleccionar células que contienen la secuencia y que están expresando cantidades insecticidamente efectivas, preferiblemente una TIC900 o proteína relacionada o fragmento insecticida de la misma, y para producir plantas a partir de dichas células transformadas. Un experto la técnica sabrá utilizar la electroporación, infusión, métodos balísticos, un métodos mediados por Agrobacterium tumefaciens y similares para introducir la secuencia de nucleótido de la presente invención o -modificaciones de las mismas dentro de las células de planta. El término "variante o modificado", con referencia la secuencia de nucleótidos, pretende referirse a la secuencia de nucleótido que codifica las mismas toxinas o que codifica toxinas equivalentes que tienen la misma actividad insecticida, el término "toxina equivalentes" se refiere a una toxina que exhibe la misma, esencialmente la misma, una actividad biológica mejorada contra las plagas objetivo, la toxina nativa o referente reclamada. Una secuencia de nucleótido variante o modificada prevista para el uso en plantas dicotiledóneas podría codificar sustancialmente la misma secuencia de aminoácidos que la secuencia de codificación nativa, es decir, la secuencia de codificación encontrada la naturaleza, pero podría comprender una composición GC combinada total de aproximadamente 49 a aproximadamente 58%, y podría utilizar substancialmente la secuencia de preferencia de codón o de utilización de codón determinada por la compilación de dichas secuencias de preferencia de utilización a partir de un consorcio de secuencias de codificación derivadas de una o más especies de plantas dicotiledóneas individuales que pretenden transformarse con la secuencia de nucleótido variante o modificada. Una secuencia de nucleótido variante o modificada prevista para uso en una planta monocotiledónea también podría codificar sustancialmente la misma secuencia de aminoácidos que la secuencia de codificación nativa, pero podría comprender una composición GC combinada total de aproximadamente 52 a aproximadamente 59%, y también podría uso utilizar substancialmente la secuencia de preferencia de codón y de utilización a partir de un consorcio de secuencias de codificación derivadas de una o más especies de plantas monocotiledóneas que pretenden transformarse con la secuencia de nucleótido variante o modificada. La frecuencia utilización de codón pretende referirse al número de veces, en promedio, que se utiliza un codón particular en una secuencia de codificación. Para una especie de planta particular, un codón es previsto para causar la incorporación de un aminoácido particular en una secuencia de aminoácido naciente se utilizarán sobre el promedio con alguna frecuencia fija relativa.

Para los aminoácidos que utilizan solamente dos codones, esta frecuencia es generalmente de alrededor de 50-50, es decir, cada codón está utilizando alrededor de la mitad del tiempo, a menos que uno de los codones utilice un número sustancialmente mayor de purinas o pirimidinas que típicamente no son representativas del contenido GC de la especie de planta particular. Para especies Bacillus, por ejemplo, las secuencias de codificación generalmente son de alrededor de 60 a alrededor de 70% AT. La utilización del codón en las especies Bacillus está influenciada hacia el uso de codones están enriquecidos para la presencia de A o T en un codón particular. Por consiguiente, los codones que principalmente utilizan G o C se utilizan en una secuencia de codificación de Bacillus de existencia nativa y/o natural con mucho menos frecuencia que los codones que contienen A's o T's. Por consiguiente, cuando se produce una secuencia de nucleótido variante o modificada prevista para uso en una planta particular, monocotiledónea o. dicotiledónea, es importante asegurarse que se da una atención apropiada al uso de los codones que no están particularmente enriquecidos con A's o T's cuando es posible, y evitar la incorporación de secuencias de poliadenilación sospechosas (ver por ejemplo, la Patente de E.U.A. No. 5,500,365). Como se utiliza aquí, "secuencias de codificación sintéticas" o "secuencias de codificación de existencia natural" que codifica las proteínas TIC900 ß. thuringiensis u homólogos o derivados de las mismas como toxinas insecticida de la presente invención son aquellas preparadas en una forma que involucran cualquier clase de aislamiento o manipulación genética. Esto incluye el aislamiento de la secuencia de codificación de su estado de existencia natural, la manipulación de la secuencia de codificación según la modificación de la secuencia de codificación de nucleótido (como se describe aquí), el truncamiento de la secuencia de codificación o cualquier otro método manipulativo o aislativo para que la secuencia de aminoácido codificada por la secuencia de codificación de existencia natural codifique la secuencia -que codifica sustancialmente el mismo o un nivel mejorador de bioactividad insecticida como la proteína de toxina insecticida nativa. Como se utiliza aquí, la frase "porcentaje de identidad de secuencia" se determina a través de la comparación de los secuencias óptimamente alineadas sobre una ventana de comparación, en donde la porción de la secuencia en la ventana de comparación puede comprender adiciones un eliminaciones (es decir, huecos) según comparado con la secuencia de referencia (la cual no comprender adiciones eliminaciones) para una alineación óptima de las dos secuencias. El porcentaje se calcula a través de la determinación de número de posiciones en que existen la base de aminoácido idéntica o los residuos aminoácido en ambas secuencias para producir el número de posiciones coincidentes, dividiendo el número de posiciones comparadas por el total de número de posiciones en la ventana de comparación, y multiplicando resultado por 100 para producir el porcentaje de identidad de secuencia. Una secuencia que es idéntica en cada posición en comparación con una secuencia de referencia se dice que es idéntica a la secuencia de referencia y viceversa. Una primera secuencia de nucleótido cuando se observen la dirección 5' a 3' se dice que es un "complemento" de una segunda secuencia de nucleótido o de referencia exhibe una complementariedad completa con la segunda secuencia o de referencia. Como se utiliza aquí, las moléculas de la secuencia de ácido nucleico se dice que exhibe en una "complementariedad completa" cuando cada nucleótido de una de las secuencias se lee 5' a 3' es complementaria a cada nucleótido cuando se lee 3' a 5J Una secuencia de nucleótído que es idéntica en cada posición cuando se lee 5' a 3' en comparación con una secuencia de nucleótido de referencia que se lee 5' a 3' se dice que es idéntica a la secuencia de referencia y viceversa. Una secuencia de nucleótido que es complementaria a una secuencia de nucleótido referencia exhibirá una secuencia idéntica a la secuencia complementaria inversa de la secuencia de nucleótido de referencia. Estos términos y descripciones están bien definidos en la técnica y son fácilmente entendibles por aquellos con experiencia técnica. Como se utiliza aquí, "homología sustancial", con referencia a las secuencias de ácido nucleico, se refiere a una secuencia de nucleótido que hibridiza bajo condiciones severas para la secuencia de codificación TIC900 como se establece en SEC ID NO: 3 o complementos de la misma. Las secuencias de hibridizan bajo condiciones severas para SEC ID NO: 3 o complementos de ia misma, en particular de la secuencia de nucleótido de alrededor de la posición uno de nucleótido a aproximadamente la posición 1800 dice nucleótido, y más particularmente de la posición 121 de nucleótido aproximadamente la posición 1800 dice nucleótído, contiene una o - más secuencias lineales que son suficientemente idénticas a una o más secuencias lineales de SEC ID NO: 3 de tal forma que una alineación es capaz de tomar lugar y las dos secuencias entonces son capaces, bajo condiciones severas, de formar enlaces de hidrógeno, sus correspondientes en estructura de cadena opuesta para formar una molécula doble que es suficientemente estable bajo condiciones severas durante un período suficientemente largo para ser detectable utilizando métodos bien conocidos en la técnica. Dichas secuencias homologas son de aproximadamente 67% idénticas, a aproximadamente 70% idénticas, a aproximadamente 80%-idénticas, a aproximadamente 85% idénticas, a aproximadamente 90% idénticas, a aproximadamente 95% idénticas, a aproximadamente 99% idénticas o más a la secuencia de nucleótido de referencia como se establece en SEC ID NO: 3 un complemento de la misma. Además, la secuencia de nucleótido que codifica proteínas insecticidas que se pueden aislar a partir de las cepa Bacillus thuringiensis y similares, que hibridiza bajo condiciones severas para SEC ID NO: 3 también se contemplan para exhibir homología sustancial con la secuencia de nucleótido de referencia que hibridiza bajo condiciones severas para la secuencia de codificación tic900 como se establece en SEC ID NO: 3 o complementos de la misma. Dicha secuencia de nucleótidos es referida aquí como homólogos de SEC ID NO: 3 y similares y comprende SEC ID NO: 5, SEC ID NO: 7, SEC ID NO:9, SEC ID NO: 29, SEG ID NO:11 , SEC ID NO:13, SEC ID NO:15, SEC ID NO:17, y SEC ID NO:19, y secuencias y homólogos relacionados de la misma. Con referencia a la secuencias de polipéptido, el término "homología sustancial" se refiere a polipéptido que son aproximadamente 70 por ciento homólogos a, aproximadamente 80% homólogos a, aproximadamente 86% homólogos a, aproximadamente 90% homólogos a, aproximadamente 95% homólogos a, aproximadamente 90% homólogos a, una secuencia de polipéptido de referencia. Más específicamente, los inventores contemplan homólogos sustanciales como siendo de aproximadamente 81 , 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91 , 92, 93, 94,95, 96, 97, 98, y 99% homólogos a la secuencia de polipéptido de referencia como se establece en SEC ID NO: 4, SEC ID NO: 6, SEC ID NO:8, SEC ID NO: 10, SEC ID NO: 30, SEC ID NO: 12, SEC ID NO: 14, SEC ID NO:16, SEC ID NO: 18, y SEC ID NO:20. Con referencia las proteínas de la solicitud inmediata, los términos "secuencia de aminoácido valiente", o "secuencia de aminoácido valiente", o "secuencia de aminoácido variante modificada" pretenden referirse a secuencias de aminoácido que son sustancialmente equivalentes a la secuencia aminoácidos de la presente invención. Por ejemplo, una proteína producida a través de la introducción de un sitio de restricción para la conveniencia de las manipulaciones moleculares en una secuencia de codificación de la presente invención era como resultado la adición o sustracción de uno o más comunes sin por el contrario (1 ) afectar la secuencia de codificación activa, (2) afectar el marco de lectura abierto nativo, y (3) afectar la actividad biológica insecticidas de la proteína, podrían constituir (a) una secuencia de aminoácido variante comparada con la toxina insecticida nativa, (b) una secuencia de aminoácido variante comparada con la toxina insecticida nativa, o (c) una secuencia de aminoácido variante modificada comparada con la toxina insecticida nativa. Un experto la técnica reconocerán que existen otros tipos de modificaciones que se pueden hacer a la secuencia de aminoácido de la presente invención sin afectados la actividad biológica de la proteína. Las inserciones, eliminaciones, y sustituciones están dentro del alcance de la presente descripción para abarcar de la secuencia de aminoácido variante resultante exhibe una actividad insecticida no menor de aquella de la proteína insecticida nativa. Las quimeras de las proteínas descritas aquí, ias fusiones de las proteínas o partes de las proteínas descritas aquí, y permuteínas de las proteínas descritas aquí están específicamente contempladas. Los inventores contemplan que las composiciones de proteínas descritas aquí encontrarán una utilidad particular como insecticidas para administración tópica y/o sistémica en cultivos de campos, pastos, frutas y vegetales, y plantas ornamentales. En una modalidad preferida, la composición bioinsecticida comprende una suspensión fluible enlaces de de células bacterianas expresan una proteína insecticida novedosa descrita aquí. Preferiblemente las células son células EG5438 o SIC9002 ß. thuringiensis, sin embargo, cualquiera de dichas células huésped bacterianas expresan los segmentos de ácido nucleico novedosos descritas aquí y que producen una proteína de cristal se contemplan como siendo útiles, tales como B. megaterium, B. subtilis, E. coli, o Pseudomonas spp. En otra modalidad, la composición bioinsecticida comprende un granulo dispersable en agua. Este granulo comprende células bacterianas expresan una proteína insecticida novedosa descrita aquí. Las células bacterianas preferidas son células EG5438 o SIC9002 B. thuringiensis, sin embargo, las células de bacteria tales como B. megaterium, B. subtilis, E. coli, o Pseudomonas spp. Transformadas con un segmento de ADN descritas aquí y que expresan la proteína Insecticida también se contemplan como siendo útiles. En una tercera modalidad, la composición bioinsecticida comprende un polvo humeetable, polvo, un comprimido o un concentrado coloidal. Este polvo comprende células bacterianas expresan la proteína insecticida novedosa descrita aquí. Las células bacterianas preferidas son las células EG5438 o SIC9002 de B. thuringiensis, sin embargo, las bacteria tales como las células ß. megaterium, B. subtilis, E. coli, ó Pseudomonas spp.-, transformadas con un segmento de ADN descritas aquí y que expresan la proteína insecticida también se contemplan como siendo útiles. Dichas formas secas de las composiciones insecticidas se pueden formular para disolverse inmediatamente después de la humectación, o alternativamente, disolver en una forma de liberación controlada, liberación sostenida, o dependiente del tiempo. En una cuarta modalidad, la composición bioinsecticida comprende una suspensión acuosa de células bacterianas tales como aquellas descritas anteriormente que expresan una proteína insecticida. Dichos sustancias acuosas se pueden proveer como una solución de abastecimiento concentrada que se diluye antes de una aplicación, o alternativamente, como una solución diluida lista para aplicar. Para estos métodos que involucran aplicación de células bacterianas, el huésped celular que contiene el(los) gen(es) de la proteína insecticida se harán crecer en cualquier medio nutriente conveniente, en donde la construcción de ADN provee una ventaja selectiva, proveyendo un medio selectivo por lo que sustancialmente todas o todas las células retienen el gen ß. thuringiensis. Esta células después se pueden cosechar de acuerdo con formas convencionales. Alternativamente, las células se pueden tratar antes de la cosecha. Cuando las composiciones insecticidas comprenden células B. thuringiensis intactas que expresan la proteína de interés, dichas bacterias se . podrán formular en una variedad de formas. Esto se pueden emplear como polvos humectables, granulos o polvos, mezclándolos con varios materiales inertes, tales como minerales inorgánicos (filosilicatos, carbonato, sulfatos, fosfatos, y similares) o materiales botánicos (mazorcas en polvo, corteza de arroz, cortezas de nueces, y similares). Las formulaciones pueden incluir auxiliares esparcidores-adhesivos, agentes de estabilización, otros aditivos pesticidas, o agentes tensioactivos. Las formulaciones líquidas pueden ser basadas en acuosa, o no acuosas y emplearse como espumas, suspensiones, concentrados emulsificables, o similares. Los ingredientes pueden incluir agentes reológicos, agentes tensioactivos, emulsificantes, dispersantes copolímeros. Alternativamente, la TIC900 novedosa o derivada de TIC900 o proteína relacionada u homólogo de la misma se puede preparar a través de sistemas de expresión bacterianos nativos o recombinantes in vitro y aislarse para el aplicación subsiguiente en el campo. Dicha proteína puede ser ya sea lisatos de células crudos, suspensiones, coloides, etc., o alternativamente se pueden purificar, refinar, regular pH, y/o procesar adicionalmente, antes de formularse en una formulación biocida activa. Igualmente, bajo ciertas circunstancias, puede ser deseable aislar la proteína en alguna forma cristalina y/o como esporas de cultivos bacterianos que expresan la proteína insecticida y aplicación de soluciones, suspensiones, o preparaciones coloidales de dichos cristales y/o esporas, la composición bioinsecticida activa. Independientemente del método de aplicación, la cantidad del (de los) componente(s) activo(s) aplicado(s) en una cantidad insecticidamente efectiva, que variará dependiendo de tales factores como, por ejemplo, los insectos lepidópteros específicos de se van a controlar, la planta o cultivo -específico que será tratar, las condiciones ambientales, y el método, velocidad, y cantidad de aplicación de la composición insecticidamente efectiva. Las composiciones insecticidas descritas se pueden hacer a través de la formulación de células bacterianas, cristales y/o suspensión de esporas, pues componente de la proteína aislado con el portador agrícolamente deseado. Las composiciones se pueden formular antes de la administración en un medio apropiado, tal como liofilizadas, secado por congelación, desecado, o en un portador acuoso, medio o diluyente adecuado, tal como salina u otro regulador de pH. Las composiciones formuladas pueden estar en la forma de un polvo o material granulado, una suspensión en aceite (vegetales, mineral), o agua o emulsiones de aceite/agua, un polvo humectable, o en combinación con cualquier otro material portador adecuado para el aplicación agrícola. Los portadores agrícolas adecuados pueden ser sólidos o líquidos y son bien conocidos en la técnica. El término "portador agrícolamente aceptable" cubre todos los auxiliares, por ejemplo, componentes inertes, dispersantes, agentes tensioactivos, fijadores, aglutinantes, etc., que se utilizan ordinariamente en la tecnología de formulación de insecticidas; estos son bien conocidos por los expertos en la formulación de insecticidas. Las formulaciones se pueden mezclar con uno o más auxiliares líquidos o sólidos y prepararse a través de varios medios, por ejemplo, a través de un mezclado homogéneo, combinación y/o trituración de la composición insecticida con auxiliares adecuados utilizando técnicas de formulación convencionales. Las composiciones insecticidas de esta invención se aplican al entorno de los insectos lepidópteros objetivo, típicamente sobre el follaje de la planta o cultivo que se va a proteger, a través de métodos convencionales, preferiblemente a través de aspersión. La resistencia la duración del aplicación insecticida se establecerá con respecto a las condiciones específicas de la(s) plaga(s) particulare(s), que se van a tratar y de las condiciones ambientales particulares. La relación proporcional del ingrediente activo con el portador naturalmente dependerá de la naturaleza química, solubilidad, y estabilidad de la composición insecticida, así como de la formulación particular contemplada. Otros técnicas de aplicación, por ejemplo, espolvoreo, rociadura, inmersión, incisión del suelo, recubrimiento de la semilla, recubrimiento del semillero, aspersión, ventilación, empañamiento, atomización y similares, también su factibles y se pueden requerir bajo ciertas circunstancias tales como, por ejemplo, ¡nsectos que causan la infestación de raíz o del tallo, o para el aplicación a vegetación delicada, o plantas ornamentales. Estos procedimientos aplicación también son conocidos por aquellos con experiencia técnica. La composición insecticida de la invención se puede emplear en el método de la invención individualmente o en combinación con otros compuestos, incluyendo y no limitándose a otros pesticidas. El método de la invención también se puede utilizar en conjunción con otros tratamientos tales como agentes tensioactivos detergentes, polímeros, o formulaciones deliberación por tiempo. Las composiciones insecticidas de la presente invención se pueden formular ya sea para uso sistémico o tópico. La concentración de la composición insecticida que se utiliza para aplicación ambiental, sistémica o foliar variará ampliamente dependiendo de la naturaleza de la formulación particular, de los medios aplicación, en las condiciones ambientales, y el grado de la actividad biocida. Típicamente, la composición bio-insecticida estará presente en la formulación aplicada en una concentración de por lo menos 1 % en peso y puede ser de hasta e incluyendo aproximadamente 99% en peso. Las formulaciones secas de las composiciones pueden estar en aproximadamente 1 a 90% en peso o más en peso de la composición, mientras las formulaciones líquidas generalmente pueden comprender de aproximadamente 1 a aproximadamente 99% o más del ingrediente activo en peso. Las formulaciones que comprenden células bacterianas intactas generalmente contendrán de aproximadamente 104 a aproximadamente 1012 células/mg. La formulación insecticida se puede administrar a una planta en particular o un área objetivo en una o más aplicaciones según sea necesario, con una velocidad de aplicación de campo típica por hectárea en escala en el orden de aproximadamente 50 gramos a aproximadamente 500 gramos del ingrediente activo, o de aproximadamente 500 gramos a aproximadamente mg, o de aproximadamente 1000 gramos a aproximadamente cinco mg o más del ingrediente activo. Las modificaciones y cambios se pueden hacer en estructura de los péptidos de la presente invención y los segmentos de ADN que los codifican y aún obtener una molécula funcional que codifica una proteína o péptido con características de fiables. En modalidades particulares de la invención, las variantes de la secuencia de aminoácido de las proteínas de la-presente invención se contemplan como siendo útiles a incrementar la actividad insecticida de la proteína, y como consecuencia incrementar la actividad insecticida y/o la expresión del transgen recombinante en una célula de planta. Los cambios de aminoácido se pueden lograr cambiando los codones de la secuencia de ADN Las proteínas que son substancialmente equivalentes a las proteínas de la solicitud presente pretenden ser biológicamente funcionalmente equivalentes. Como se utiliza aquí, la frase "equivalentes funcionales biológicos", con respecto a las proteínas insecticidas de la presente invención, son péptidos, polipéptidos y proteínas que contienen una secuencia o porción que exhibe una similitud de secuencia con los péptidos novedosos de la presente invención, tal como TIC900 o la proteína relacionada o fragmento insecticida de la misma, y que exhiben las mismas o similares propiedades funcionales que aquellas de los polipéptido descritas aquí, incluyendo la actividad insecticida. Los equivalentes biológicos también incluyen péptidos, polipéptidos, y proteínas que reaccionan con, es decir, específicamente se enlazan a anticuerpos que surgen contra epítopos presentes en o dentro de TIC900 y proteínas relacionadas y que exhiben la misma o similar actividad de enlace o reactiva, incluyendo tanto anticuerpos, monoclonales como poiiclonales. También se contempla que las proteínas de la presente invención podría ser útiles para proteger plantas dicotiledónea de infestación de insectos. Dichas infestaciones podrían ser el resultado de infestación de lepidópteros, coleópteros, dípteros, o aún infestación a través de polillas, gusanos de alimentos, gorgojos, o una amplia variedad de insectos que daña la planta a través de la perforación de los tejidos de la planta y extrayendo los nutrientes previstos para el crecimiento y desarrollo de la planta. Las modificaciones a la secuencia de aminoácido primaria de las proteínas de la presente invención podrían dar como resultado una proteína que exhibe una escala de huésped diferente de aquella de la proteína nativa. Las proteínas de la presente invención, debido a su localización - dentro del espacio está células cuando se expresan a través de las cepas Bacillus, pueden ser útiles para activar otras proteínas para la localización dentro del espacio extracelular. Por ejemplo, el experto en la técnica podría saber enlazar una primera proteína que normalmente no se secreta dentro del espacio extracelular a una segunda proteína que normalmente se secreta en el espacio extracelular con el fin de lograr la localización de la primera proteína dentro del espacio extracelular. Las proteínas de la presente invención se puede fusionar a través de cualquier número de medios bien conocidos en la técnica por una o más toxinas insecticidas tales como delta- endotoxinas cristalinas para formar una proteína química que se activa a través de la secreción dentro del espacio extracelular que rodea una célula huésped particular. Aún se contempla que el evento de secreción mismo podría conducir a la separación de dos partes de la proteína de tal forma que las dos proteínas insecticidas separadas y diferentes se liberan dentro del espacio extracelular que rodea una célula huésped particular. Las dos proteínas podrían ya sea (1 ) ambas ser tóxicas para las mismas especies ¡nsectos pero efectuar su actividad insecticida utilizando diferentes modos de acción, o (2) cada una puede ser tóxicas a diferentes especies insectos. Es concebible que cualquier número de proteínas insecticidas podría enlazarse extremo a extremo a las proteínas de la presente invención para formar quimeras multiméricas que se activa para el espacio extracelular que rodea una célula huésped particular. Es preferible, en situaciones en donde se contempla que se utilizan otras proteínas insecticidas Bt, que las proteínas insecticidas fusionadas a las proteínas de la presente invención sean menores que las proteínas Crykl de longitud completa, más preferiblemente meramente fragmentos de toxina insecticidas de núcleo de proteínas Cryl, proteínas Cry2A, proteínas Cry3, proteínas Cry9, etc. Dichas "otras" proteínas concebibles podrían ser fluorescentes verdes y proteínas y variantes relacionadas, cinasas y fosfatasas para la modulación de los procedimientos de señalización de célula, nucleasas, lipasas, proteínas de tolerancia a herbicidas expresadas de genes tales como gox, varios homólogos epsps, barras y homólogos y similares, PhnO, Nptll, Aad, y similares. Todas estas proteínas podrían utilizarse como marcadores seleccionables también, particularmente cuando se enlazan a un gen que codifica una o más de las proteínas de la presente invención, para arrastrar la presencia de genes y codifican una o más de las proteínas de la presente invención en una planta u otras célula huésped.

Las proteínas de la presente invención podrían activa se para importar las dentro de un orgánulo subcelular. Por ejemplo, una primera secuencia de nucleótido que codifica un cloroplasto o secuencia que activa una plastida podría estar operablemente enlazada o fusionada a una segunda secuencia de nucleótido que codifica una proteína insecticida de la presente invención para producir una proteína precursora quimérica de esta activada para la inserción dentro del cloroplasto o la plastida dentro de una célula de planta. La expresión de dichas proteínas quiméricas podría dar como resultado la importación de las proteínas de la presente invención dentro del cloroplasto o plastida de la planta, dando como resultado la localización de ¡a toxina insecticida o del fragmento insecticida de la misma en el cloroplasto o plastida. Adicionalmente, se podría localizar una secuencia de nucleótido que codifica una o más proteínas de la presente invención para el cloroplasto o plastida para expresión. La localización de la secuencia de nucleótido para la piastida o cloroplasto podría dar como resultado la incorporación de la secuencia de nucleótido dentro del genoma del cloroplasto o plastida, o podría dar como resultado la presencia de una secuencia de ácido nucleico autónomamente de replicación que codifica la proteína de la presente invención. En cualquier sentido, las proteínas de la presente invención se-localizarían para el cloroplasto o plastida. Como se utiliza aquí por consiguiente, ya sea polinucleótido o polipéptido, está colocado dentro del cloroplasto o plastida de tal forma que la molécula se aisla del ámbito citoplásmico celular, y funciona dentro del cloroplasto o citoplasma de plastida para proveer los efectos insecticidas benéficos reclamados en la presente invención. La localización de la molécula biológica para el cloroplasto o plastida puede ocurrir, con referencia los polinucleótido, a través de medios mecánicos artificiales tales como electroporación, micro inyección mecánica, o a través de bombardeo de micro proyectiles recubiertos de polinucleótido, o con referencia a polipéptido, a través de medios secretores p de importación en donde se utiliza una secuencia de activación de péptido de plastida heterólogo o cloroplasto que funciona para activar, insertar, ayudar, o localizar un polipéptido enlazado en un cloroplasto o plastida. En cualquier evento, la localización de una o más proteínas insecticidas para el cloroplasto o plastida necesariamente implica que las células conteniendo la planta resultante que contiene plastida que contiene dicha proteína insecticida o " proteínas localizadas también debe exhibir características morfológicas normales. No se sabe cuál, si hay alguna, proteína insecticida cuando se localiza para el cloroplasto o plastida, dará como resultado el logro de una planta recombinante que exhibe características morfológicas normales ejemplificadas sin limitación a través de la ausencia de clorosis, una ausencia de una fisiología de planta atrofiada o de impedimento incluyendo, pero no limitándose a tallos más gruesos el promedio, tallos acortados o intermedios, floración inapropiada, infertilidad, rendimiento disminuido, etc.. Como se utiliza aquí, la frase "operativamente enlazado" u "operablemente enlazado" se refiere a segmentos de codificación de ácido nucleico conectados en marco por lo que las propiedades de uno influencian la expresión del otro. Estas frases y grupos de palabras también se pueden utilizar para referirse a una secuencia de aminoácidos que exhibe alguna función cuando está enlazada a otra proteína interés es referida como estando operablemente enlazada a la proteína interés con el propósito de activar la proteína interés para el aparato secretor de la célula huésped en la cual se produce la proteína. Para los propósitos de la presente invención, la palabra "gen" se refiere a una secuencia de nucleótido que contiene un marco de lectura abierto y codifica la proteína TIC900, un fragmento insecticida de la misma una variante de la secuencia de aminoácido de la misma, un homólogo de una proteína relacionada o fragmento insecticida de la misma enlazada a una secuencia promotora y a una secuencia de terminación de transcripción, en donde el las secuencias de terminación promotora y de transcripción son funcionales en la célula huésped en la cual se produce la proteína. Como se utiliza aquí, "gen estructural" se refiere a un gen que se expresa para producir un polipéptido. Un gen estructural de la presente invención puede contener, además de las secuencias de terminación promotora y de transcripción, cinco secuencias no traducidas principales, secuencias intrónicas, y elementos mejoradores que funcionan en plantas en particular, y preferiblemente aquellas que se derivan de plantas monocotiledónea tales como plantas de maíz o de plantas dicotiledóneas tales como plantas de tabaco o plantas vegetales cruciferas aquí, cuando se enlazan juntas en una secuencia apropiada con una o más secuencias de codificación de la presente ¡nvención dar como resultado niveles expresión mejorados en tejidos de planta particulares, y preferiblemente tan como resultado una expresión mejorada en los tejidos de las hojas y tallos de esas plantas. La información de la secuencia de nucleótido provista por la presente invención permite la preparación de secuencias de ADN relativamente cortas, referidos aquí como sondas o iniciadores, que tiene la habilidad específicamente hibridizar las secuencias de los pollnucleótidos seleccionados descritos aquí. Dicha sondas de ácido nucleico de una longitud apropiada se preparan con base en una consideración de las secuencias de polipéptido seleccionadas que codifican los polipéptido insecticidas de la presente invención, por ejemplo, una secuencia tal como la que muestra todas o una parte específica de la sonda de SEC ID NO: 3, todas o una parte específica de SEC ID NO: 5, todas o una parte específica de SEC ID NO:7, todas o una parte específica de SEC ID NO: 9, todas o una parte específica de SEC ID NO: 29, todas o una parte específica de SEC ID NO: 11 , todas o una parte específica de SEC ID NO: 13, todas o una parte específica de SEC ID NO: 15, todas o una parte específica de SEC ID NO: 17, todas o una parte específica de SEC ID NO: 19, y similares. La referencia a la frase "todas o una parte específica de" pretende referirse a una sonda de secuencia de nucleótido que comprende por lo menos de aproximadamente 15 a aproximadamente 50, más o menos, nucleótido contiguos seleccionados del grupo de nucleótido establecidos en una secuencia de referencia particular tal como SEC ID NO: 3, SEC ID NO: 5, SEC ID NO: 7, SEC ID NO: 9, SEC ID NO: 29, SEC ID NO:11 , SEC ID NO: 13, SEC ID NO: 15, SEC ID NO: 17, y SEC ID NO: 19. La habilidad de dicha sondas de ácido nucleico para específicamente utilizar una secuencia de nucleótido que codifica una secuencia de polipéptido insecticida les presta la utilidad particular en una variedad de modalidades. Más de importancia, las sondas se pueden utilizar en una variedad ensayos para detectar la presencia de secuencias complementarias en una muestra biológica dada. A-través de la. referencia al término "muestra biológica", ser pretende que cualquier muestra que contenga una secuencia de nucleótido de referencia que pueda ser detectada a través de una secuencia de sonda como se establece aquí es una muestra que contiene una molécula biológica seleccionada del grupo consiste de secuencia de los partidos contiguos establecidos aquí, y por consiguiente la muestra es esta forma referida como una "muestra biológica". En ciertas modalidades, es ventajoso utilizar iniciadores oligonucleótido. La secuencia de dichos iniciadores se designa utilizando un polinucleótido de ia presente invención para uso la detección, amplificación o modificación de un segmento definido de una secuencia de codificación de proteína insecticida de B. thuringiensis o de Bacillus sphaericus y similares utilizando la tecnología de amplificación térmica. La segmentos de la secuencia de nucleótido relacionados con los polinucleótidos que codifican los polipéptido si insecticidas de la presente invención también se pueden aislar y caracterizar utilizando tecnología de amplificación térmica y dichos iniciadores. Para proveer ciertas de las ventajas de acuerdo con la presente invención, una secuencia de ácido nucleico preferida empleada para estudios o ensayos de hibridación o como iniciador incluye secuencias que son complementarios a por lo menos de 14 a 30 o más tramos contiguos de nucleótidos de una secuencia de polinucleótido que codifica todas o una parte de la proteína insecticida de la presente invención, tal como se muestra en SEC ID NO:2, SEC ID NO:3, SEC ID NO:5, SEC ID NO:7, SEC ID NO:9, SEC ID NO: 29, SEC ID NO:11 , SEC ID NO: 13, SEC ID NO: 15, SEC ID NO: 17, SEC ID NO: 19, SEC ID NO:21 , y SEC ID NO:22. El tamaño de un iniciador o sonda de por lo menos 14 nucleótido en longitud ayuda asegurar que el fragmento será lo suficientemente largo para formar una molécula doble que es tanto estable como selectiva. Las moléculas que tienen secuencias complementarias sobre segmentos mayores de 14 bases en longitud generalmente son preferidas. Con el fin de-incrementar la estabilidad y selectividad del híbrido, y por lo tanto mejorar la calidad y grado de moléculas híbridas específicas obtenidas, generalmente se preferirá diseñar moléculas de ácido nucleico que tiene secuencias complementarias tic900 y similares de 14 a 20 nucleótidos, o aún más largas cuando se desee. Dichos fragmentos pueden ser preparados fácilmente a^ través de, por ejemplo, la sintetización directa del fragmento a través de medios químicos, a través del aplicación de tecnología de reproducción de ácido nucleico, y eliminando fragmentos de ADN seleccionados de secuencias recombinantes localizadas en los plásmidos u otros vectores que contienen -los insertos apropiados y los sitios de restricción adecuados.

La presente invención también contempla un vector de expresión que comprende un polinucleótido de la presente invención. De esta forma, en una modalidad un vector de expresión es una molécula de ADN aislada y purificada que comprende un promotor operativamente enlazado a una región de codificación que codifica un polipéptido de la presente invención, cuya región de codificación está operativamente enlazada a una región de transcripción-terminación, mientras el promotor conduce la transcripción de la región de codificación. La región de codificación puede incluir un segmento que codifica una toxina insecticida B. thuringiensis de la presente invención y un segmento que codifica un partido activado por lo aplastó plastida. La-molécula de ADN que comprende el vector de expresión también puede componer una secuencia de intrón funcional colocada ya sea en corriente ascendente de la secuencia de codificación o aún dentro de la secuencia de codificación, y también puede contener una secuencia líder no traducida cinco prima (5') (es decir, una UTR o 5'-UTR) colocada entre el promotor y.el punto de iniciación de la traducción. Como se utiliza aquí, y con referencia los elementos promotores, los términos "operativamente enlazado" o "operablemente enlazado" pretende indicar que una secuencia de nucleótido que contiene un promotor, es decir, un elemento genético que funciona en una célula huésped particular para conducir la iniciación de la transcripción, está conectada una región de codificación en tal forma que la transcripción de esa región de codificación está controlada y substancialmente regulada por ese promotor. Los medios para operativamente enlazadas un promotor a una región de codificación son bien conocidos en la técnica. Los promotores que funcionan en la bacteria son bien conocidos en la técnica. Los promotores ilustrativos y preferidas para las proteínas de cristal B. thuringiensis incluyen los promotores de gen sigA, sigE, y sigK. Alternativamente, los promotores nativos, modificados, heterólogos o recombinantes, derivados de especies Bacillus thuringiensis u otros Bacillus se pueden utilizar para lograr expresión de las proteínas de la presente invención en una cepa de la especie Bacillus. Cuando se va utilizar una secuencia de nucleótido que codifica todas o una parte insecticida de una proteína de la presente invención para-transformar una planta, se selecciona un promotor que tiene ia habilidad de conducir expresión de la secuencia de codificación en esa especie particular de una planta. Los promotores que funcionan en diferentes especies de planta también son bien conocidos en la técnica. Los promotores útiles para la expresión de polipéptidos en plantas son aquellos que son inducibles, virales, o constitutivos como se describen en Odell y otros (Nature 313: 810-812, 1985), y/o promotores que están temporalmente regulados, espaciaimente regulados, y espacio-temporalmente regulados. Los promotores preferidos incluyen los promotores CaMV35S mejorados, el promotor GBOX10, el promotor FMV35S, el promotor de Actina de arroz, y variantes y quimeras de los mismos. Para un control óptimo de las especies ECB a través del expresión de las proteínas de la presente invención en plantas, por ejemplo, se prefiere lograr los niveles más altos expresión de estas proteínas dentro de las hojas y tallos de plantas de maíz. La regulación temporal o espacial temporal se refiere al expresión de un gen dentro de una planta o tejido de planta de una planta operable como promotora. Con referencia la regulación temporal, un promotor se puede regular para expresión solamente durante los tiempos específicos durante el crecimiento y desarrollo de la célula o tejido de la planta o aún de la planta completa. Un promotor que activamente expresa uno o más genes solamente durante la germinación de la semilla, podría ser un ejemplo de regulación temporal. Otros ejemplos podrían incluir promotores que activamente expresa uno o más genes solamente durante los tiempos cuando la planta, la célula de planta o tejido de planta se exponen las ciertas intensidades de luz o durante oscuridad total. La regulación temporal sustancial se refiere un promotor que es activamente expresado en un cierto momento pero que puede o no puede ser completamente suprimido en otros momentos, de tal forma que la expresión aún puede ser detectada a través de monitoreo para la presencia de un indicador tal como una enzima producida de una secuencia de codificación enlazada ha dicho promotor, una medición a través del incremento o disminución en algunos productos de gen tal como un ARNm producido en varios momentos a lo largo del crecimiento de la planta, diferenciación y desarrollo y/o en respuesta a varios estímulos ambientales. La regulación espacial sustancial se refiere al expresión de un gen enlazado a un promotor a partir del cual expresión prosigue solamente durante el crecimiento de desarrollo de ciertas células o tejidos dentro de una planta. Por ejemplo, un promotor de pétalos es uno que substancialmente se expresa espacialmente durante el crecimiento y desarrollo de la flor. Similarmente, un promotor específico de hoja o mejorados de hoja solamente se podría esperar que fuera espacialmente expresado substancialmente dentro de células de hoja o tejidos de hoja. Sustancialmente regulado espacialmente también se refiere a nivel de expresión de un promotor específico de tejido particular en ese tejido particular y según relacionado con los niveles de expresión de ese un promotor similar en otros tejidos, en donde la expresión también se puede detectada en tejidos diferentes de tejido particular en el cual se prefiere expresión del promotor, pero a niveles de expresión significativamente más bajos según medido por la producción de una enzima producida de una secuencia de codificación enlazada promotor o a través de la aparición de algunos productos de gen detectables. Los promotores también pueden ser substancialmente temporales y substancialmente espaciales regulados juntos y simultáneamente en una forma coordinadamente regulada. Otros promotores que específicamente pretenden estar dentro dei alcance de la presente invención incluyen pero no se limitan a, el promotor de ubiquitina, el promotor del virus de ADN baciliforme de caña de azúcar, ei promotor de la sub-unidad grande de carboxilasa de bis-fosfato de ribulosa, entre otros. Las secuencias de intrón preferidas para lograr expresión óptima de secuencias de nucleótido de existencia natural en plantas monocotiledóneas también se pueden incluir en la construcción expresión de ADN. Dicho intrón típicamente se coloca cerca del 5' de ARNm dentro o inmediatamente en corriente descendiente de una secuencia no traducida. El intrón se podría obtener de, pero no se limita a, un grupo de ¡ntrones que consiste del intrón 70 de la Proteína de Abastecimiento de Calor de maíz (HSP) (Patente de E.U.A. No. 5,424,412; 1995), el ¡ntrón Acti de maíz (McEIroy y otros , Plant Cell 2: 163-171 , 1990), el intrón 1 Adh (Callis y otros, Genes & Develop. 1 :1183-1200, 1987), o el intrón de sintasa de sacarosa (Vasil y otros, Plant Phys. 91 :1575-1579, 1989). Otro elemento que funciona para regular o para modular la expresión del gen esta secuencia de ADN entre sitio de iniciación de la transcripción y el inicio de la secuencia de codificación, denominada como la secuencia líder no traducida (UTL). Las recopilaciones de ias secuencias líder se han hecho para pronosticar las secuencias óptima o sub-óptima y generar "consensos" y secuencias líder preferidas (Joshi, Nucí. Acids Res. 15: 9627-9640, 1987). Las secuencias líder preferidas se contemplan para ¡ncluir aquellos que comprenden secuencias pronosticadlas para dirigir la expresión óptima de un gen estructural enlazado, es decir, para incluir una secuencia líder de consenso preferida que incrementa o mantiene la estabilidad de ARNm y previene la iniciación inapropiada de traducción. La selección de dichas secuencias será bien conocida por aquellos con experiencia en la técnica de la presente expresión. Las secuencias que forman genes que son altamente expresados en plantas, y en particular en maíz será las más preferidas. Una líder particularmente útil en la líder HSP70 de petunia. Los mejoradores de transcripción o duplicadores de mejoradores podrían utilizarse para incrementar la expresión. Estos mejoradores por lo general se encuentran en 5' al inicio de la transcripción en un promotor que funciona en células eucarióticas, pero a menudo se puede insertar en ia orientación hacia adelante o inversa 5' o 30 de la secuencia de codificación. Ejemplos de mejoradores incluyen elementos del promotor 35S CaMV, genes de octopina sintasa (Ellis y otros , EMBO Journal 6: 11-16, 1987), el gen de actina de arroz, y el promotor de eucariotes no de planta (por ejemplo, levadura; Ma y otros, Nature 334:631-633, 1988). La polimerasa de ARN transcribe un ADN de genoma nuclear que codifica la secuencia través de un sitio en donde ocurre la poliadenilación. Típicamente, las secuencias de ARN localizan unos cuantos cientos de bases pares en corriente descendiente del sitio de poliadenilación que sirve para terminar la transcripción. Esa secuencias de ARN son requeridas aquí como regiones de transcripción-terminación. Estas regiones son requeridas para la eficiente poliadenilación del ARN mensajero transcrito nuclear (mRNA). Para secuencias de codificación introducidas dentro de un cloroplasto o plastida, o dentro de un genoma del cloroplasto o plastida, la terminación de- la transcripción de ARNm es similar a los métodos reconocidos a la técnica de . expresión de gen bacteriano. Por ejemplo, ya sea en una secuencia policistrónica o monocistrónlca, la transcripción se puede terminar a través de -estructuras de tallo o del bucle o estructuras similares a las secuencias dependientes rho bacterianas. Las construcciones de expresión típicamente incluirán una secuencia de codificación ejemplificada la presente invención un derivados de la misma junto con una secuencia de ADN extreme 3' que funciona como una señal para terminar la transcripción y, en construcciones que pretenden la expresión del genoma nuclear de la planta, que permiten la poliadenilación del extreme 3' de la transcripción de ARN resultante. Los elementos 3' más preferidas se contemplan como siendo aquellos del gen de sintasa de nopalína de A.. tumefaciens (extremo nos 3'), el terminador para la transcripción T7 del gen de sintasa de octopina de A. tumefaciens, y la terminación de la transcripción no traducida 3' del gen E9 de sintasa RUBISCO de chícharo ( (E9 3') y la secuencia de poliadenilación. Estas y otras secuencias reguladoras del extreme 3' son bien conocidas en la técnica. Los vectores de transformación de planta preferidos incluyen aquellos derivados de un plásmidos Ti de Agrobacterium tumefaciens, así como aquellos descritos, por ejemplo, por Herrera-Estrella (Nature 303:209- 213, 1983), Bevan (Nature 304: 184-187,1983), Klee (Bio/Technol. 3:637-642, 1985). La presente invención describe una secuencia -de nucleótido aislada y purificada que codifica proteínas insecticidas derivadas de las especies Bacillus, y particularmente de especies Bacillus thuringiensis. En particular, las cepas de ß. thuringiensis la cepas EG5438, EG3879, EG4332, EG4971 , EG4090, EG4293, EG4611 , EG5526, EG5023 y EG4092 cada una se muestra aquí para producir una o más proteínas insecticidas solubles están localizadas en la sobrenadantes de cultivo (ver Cuadro 1 ).

CUADRO 1 Proteínas Relacionadas TIC900 y Cepas 5. thuringiensis de Origen * la secuencia de aminoácido de TIC964, obtenida de la cepa EG5526, se derivó después del análisis de la secuencia de nucleótido de un gen que sirve homología con tic900, y se determinó como siendo idéntica a tic402 obtenida de la cepa EG3879. # significa que esta cepa sido depositada bajo condiciones que aseguran el acceso al cultivo de partes autorizadas durante el estado pendiente de esta solicitud de patente o patentes emitidos de la misma. La cepas B. thuringiensis y otras cepas bacterianas descritas aquí pueden cultivarse utilizando medios de crecimiento convencionales y técnicas de fermentación estándar. La cepa ß. thuringiensis que contiene uno o más tic900 o genes relacionados se puede fermentar como se describe aquí, hasta que las células B.thuringiensis cultivadas alcance la etapa de su ciclo de crecimiento cuando TIC900 y/o las proteínas relacionadas se producen.

Los cultivos del tema han sido depositados bajo condiciones que aseguran el acceso al cultivo estará disponible para partes autorizadas durante la etapa pendiente de esta solicitud de patente o patentes emitidos. Sin embargo, se deberá entender que la disponibilidad de un depósito no constituye una licencia para practicar el tema de la invención en derogación de los derechos de la patente otorgados por acción gubernamental. TIC900 y las proteínas relacionadas de la presente invención se produjeron como se muestra aquí y se secretaron en medios de crecimiento durante la fase vegetativa de crecimiento. Las fermentaciones utilizando la cepas de la presente invención se pueden continuar a través del etapa esporulación cuando las proteínas de cristal, si hay alguna, se forman junto con las esporas. Los restos de esporas y de célula se pueden separar del sobrenadante a través de centrifugación, y el medio de cultivo consumido se puede utilizar para aislar las proteínas insecticidas de la presente invención. Los inventores aquí ilustran el método de precipitación de sulfato de amonio como un medio para concentrar recolectar todas la mayor parte de las proteínas presentes en el medio de cultivo consumido y clarificado. Sin embargo, un experto la técnica reconocerá que existe un número de otros medios disponibles para la purificación y aislamiento de las proteínas de la presente invención. La cromatografía de filtración de gel y de exclusión de tamaño son dos medios fácilmente disponibles para extraer proteínas directamente de! medio consumido. El medio consumido también se puede desalar y el filtrado utilizar para extraer la proteína utilizando columnas de intercambio de ion. También, las columnas de afinidad, que contiene los anticuerpos que se enlazan específicamente a TIC900 o proteínas relacionadas se pueden utilizar para purificar las proteínas de la presente invención directamente de! medio. La secuencia de aminoácidos de la presente invención ha sido comparada con la secuencia de aminoácidos presente en bases de datos de secuencia de proteína comercialmente disponibles, y no se han identificado homología o similitudes significativas. Con base en este análisis, la proteína TIC900 y las secuencias relacionadas parecen ser únicas y forman la base para el establecimiento de una nueva y separada clase de proteínas insecticidas de Bacillus debido a que las proteínas de la presente invención no exhiben ninguna relación con otras proteínas insecticidas conocidas. Las modificaciones y cambios se pueden hacer en estructura de las péptidos de la presente invención y los segmentos de ADN que los codifican y aún obtener una molécula funcional que codifica una proteína o péptido con características deseables. Los péptidos, polipéptidos y proteínas equivalentes biológicamente funcionales, contemplados aquí deberán poseer de aproximadamente 70% o más de similitudes secuencia, o de aproximadamente 80 o más de similitudes secuencia, o de aproximadamente 90% o más de similitudes secuencia, con la secuencia de, o con la- porción correspondiente dentro de, la secuencia TIC900 fundamental de aminoácido como se establece en SEC ID NO: 4, o la porción correspondiente dentro de la secuencia de aminoácidos como se establece en SEC ID NO: 6, SEC ID NO: 8, SEC ID NO.JO, SEC ID NO: 30, SEC ID NO:12, SEC ID NO: 14, SEC ID NO: 16, SEC ID NO: 18, y SEC ID NO: 20 y secuencias relacionadas. De acuerdo con la referencia de la presente invención al gen tic900 gene y la toxina de proteína codificada, incluyendo solamente las secuencias de longitud completa descritas aquí sino también fragmentos de estas secuencias, variantes naturales, mutantes, y derivados producidos por ingeniería recombinante son genéticos del gen tic900 que comprende SEC ID NO:3. Dichas proteínas codificadas deberán retener esencialmente las propiedades insecticidas características iguales con mejores que aquellas de la proteína TIC900 que comprende SEC ID NO: 4. Las proteínas útiles en la presente invención también pueden incluir proteínas de fusión que retienen las propiedades insecticidas características esencialmente ¡guales o mejores que aquellas de la proteína TIC900. En algunas instancias, la proteína de fusión puede contener, además de las propiedades insecticidas características de las proteínas específicamente ilustradas aquí, otra actividad insecticida aportada por la secuencia de aminoácido del socio de la fusión. Alternativamente, el análisis cristalográfico en la proteína TIC900 o variantes insecticidas de la misma pueden proveer medios para determinar si la proteína podría ser un candidato para la construcción de una permuteína exhibe la misma o preferiblemente una actividad insecticida mayor que la TIC900 nativa o la proteína relacionada, y que preferiblemente exhibe características mejoradas relacionadas con expresión en una célula huésped preferida tal como una célula de planta.

Deberá ser evidente para un experto en la técnica de la secuencia de nucleótido es que codifica toxinas inhibidoras de lepidópteros se pueden identificar y obtener a través de varios medios. Las secuencias específicas ¡lustradas aquí se pueden obtener el de aislados depositados en el depósito de cultivo como se describió anteriormente. Estas secuencias, o porciones o variantes de las mismas, cambios se pueden construir sintéticamente, por ejemplo, través del uso de un sintetizador de secuencia de nucleótido. Las variaciones de las secuencias de codificación pueden ser fácilmente construidas utilizando técnicas estándares para ser mutaciones de punto. También, los fragmentos de estas secuencias se pueden hacer utilizando exonucleasas o endonucleasas comercialmente disponibles de acuerdo con procedimientos estándares. Por ejemplo, las enzimas tales como Ba131 o mutagénesis dirigida al sitio se pueden utilizar para sistemáticamente extirpar nucleótidos de los extremos de dichas secuencias como se ejemplifica aquí, o de la secuencia de codificación de proteína. También, la secuencia de los péptidos que codifica fragmentos de proteína insecticidamente activos se puede obtener utilizando una variedad enzimas de restricción, endonucleasas, métodos amplificación térmica, y similares. Las proteasas tales como Ja proteínasa K, trlpisina, quimiotripisina, pepsina, y similares se pueden utilizar para directamente obtener fragmentos activos de estas toxinas. Otras toxinas y secuencias de nucleótido que codifican dichas toxinas relacionadas con las toxinas y secuencias de codificación de la presente invención se pueden derivar de ADN obtenido de especies aisladas de ß. thuringiensis, B. laterosporous, B. sphaericus, y especies Bacillus relacionadas, utilizando las enseñanzas provistas en la técnica en combinación con la secuencia de nucleótido descritas aquí. Dichas toxinas y secuencias de nucleótido están relacionadas con las toxinas y secuencias de codificación de la presente invención se consideran aquí equivalentes a las toxinas y secuencias de nucleótido de la presente invención. Por "equivalentes" significa que una proteína exhibe las características de la proteína TIC900, incluyendo, pero no limitándose a la bioactividad inhibidora insecticida similar, descarga del huésped de la bioactividad insecticida, exhibe epítopos antigénicos similares que pueden reaccionar de manera cruzada con los anticuerpos que surgen contra TIC900 y proteína relacionadas, exhibe un tamaño similar relativo a TIC900 y proteína relacionadas, exhibe en perfiles de expresión y características similares, exhibe una propensión para el aislamiento del entorno extracelular cuando se expresan en especies bacterianas Bacillus thuringiensis o especies relacionadas, y similares. La frase "exhibe una propensión para el aislamiento del entorno extracelular" pretende incluir TIC900 y ias proteína relacionadas ¡ncluyendo, pero no limitándose a, TIC402, TIC403, TIC404, TIC434, TIC961 , TIC962, TIC963, - - TIC965 y TIC966 que se producen a través de la bacteria o de la célula huésped como una proteína precursora que contiene una secuencia de aminoácido enlazada a la proteína insecticida que funciona- para activar la proteína insecticida para un aparato secretor de la célula bacteriana huésped en donde, éstos de ponerse en contacto con el aparato secretora, se divide proteolíticamente a través de peptidasa de señal, liberando la de proteína madura o insecticida dentro del entorno extracelular en el caso de un microbio gram-positivo, por lo menos en el periplasma en el caso de un microbio gram-negativo, y dentro del retículo endoplásmico, o vesícula secretora o dentro de un orgánulo celular tal como una mitocondrial o cloroplasto, o plástico en el caso de una célula huésped de hongo, o de planta o eucariótica. Existen un número de métodos al identificar la presencia de y obtener las toxinas insecticidas equivalentes relacionadas con los péptidos descritas aquí. Por ejemplo, los anticuerpos de las toxinas insecticidas descritos y reclamados aquí se pueden utilizar para identificar y aislar otras toxinas de una mezcla de proteínas. Específicamente, los anticuerpos pueden surgir de las porciones de las toxinas que son más constantes dentro de la nueva clase de proteínas y más diferentes de otras toxinas B.thuringiensis. Estos anticuerpos entonces se puede utilizar para específicamente identificar toxinas equivalentes con actividad característica a través de inmuno-precipitación, el ensayo inmuno-absorbente enlazado enzima (ELISA), o Western blotting. Los anticuerpos para las toxinas descritas aquí, o las toxinas equivalentes, o fragmentos de estas toxinas, pueden prepararse fácilmente utilizando procedimientos estándares en la técnica. La secuencia de nucleótidos que codifica estas toxinas entonces se puede obtener pélvica organismo o de otras varias fuentes. Los fragmentos y equivalentes que retienen actividad insecticida de toxinas ilustradas podrían estar dentro de alcance de la presente ¡nvención.

También, debido a la redundancia del código genético, una variedad de secuencias de ADN diferentes pueden codifica la secuencia de aminoácidos descritas aquí. Está bien dentro del experiencia de un experto en la técnica crear secuencias de ADN alternativas que codifican la misma o esencialmente las misma toxinas. Estas secuencias de ADN variantes estar dentro de alcance de la presente invención. Es bien conocido en la técnica que ciertos aminoácidos pueden estar sustituidos por otros aminoácidos en una estructura de proteína sin una pérdida apreciable de la capacidad de enlace interactivo con estructuras tales como, por ejemplo, regiones de enlace a antígeno de anticuerpos los sitios de unión en moléculas de sustrato. Ya que es la capacidad interactiva y la naturaleza de una proteína que define la actividad funcional biológica de la proteína, ciertas sustituciones de secuencias de aminoácidos se pueden hacer en una secuencia de proteína, y, por supuesto, su secuencia de codificación de ADN subyacente, y sin embargo obtener una proteína con propiedades similares. De esta forma se contempla través de los inventores que los varios cambios se pueden hacer en las secuencias de péptido de las composiciones descritas aquí, o secuencias de ADN correspondientes que codifican dichos péptidos sin una pérdida apreciable de su utilidad o actividad biológica. Dichas sustituciones también son conocidas en la técnica como sustituciones conservadoras. Al hacer estos cambios, el índice hidropático de los aminoácidos se puede considerar. La importancia del índice de aminoácido hidropático en conferir la función biológica interactiva en una proteína generalmente se extiende en la técnica (Kyte y Doolittle, 1982). Se acepta que el carácter hidropático del aminoácido contribuye a la secuencia secundaria de la proteína resultante, la cual a su vez define la interacción de la proteína con otros moléculas, por ejemplo, enzimas, sustratos, receptores, ADN, anticuerpos, antígenos y similares. También se entiende en la técnica que la sustitución de aminoácido similares se puede hacer efectivamente sobre las bases de la característica hidrofílica. La característica hidrofílica promedio local más alta de una proteína, según controlada por la característica hidrofílica de sus aminoácidos adyacentes, se correlaciona con una propiedad biológica de la proteína (Patente de E.U.A. No. 4,554,101 ). Como se subrayó anteriormente, la sustituciones de aminoácido por consiguiente generalmente se basan en la similitud relativa de los sustituyen desde la cadena lateral de aminoácido, por ejemplo, su hidrofobicidad, hidrofilicidad, carga, tamaño, y similares. La sustituciones ilustrativas que toman las varias características anteriores en consideración también conocidas por aquellos expertos en la técnica e incluyen: arginina y lisina; glutamato y aspartato; serina y treonina; de glutamina y asparagina; y valina, leucina e isoleucina. Los péptidos, polipéptidos y proteínas biológicamente funcionalmente equivalentes a TIC900, TIC402, TIC403, TIC404, TIC434, TIC961 , TIC962, TIC963, TIC965 y TIC966 incluye la secuencia de aminoácidos que contiene cambios de aminoácido conservadores en la secuencia fundamental mostrada en SEC ID NO: 4, SEC ID NO: 6, SEC ID NO: 8, SEC ID NO:10, SEC ID NO: 30, SEC ID NO:12, SEC ID NO: 14, SEC ID NO: 16, SEC ID NO: 18, y SEC ID NO: 20. En dicha secuencia de aminoácidos, estar sustituidos uno o más aminoácidos en la secuencia fundamental con otro(s) aminoácido(s), carga y polaridad que son similares a aquellas del aminoácido nativo, es decir, una sustitución de aminoácido conservadora, dando como resultado un cambio silenciosa. Los sustituyen estar aún aminoácido dentro de las secuencia de polipéptido fundamental se pueden seleccionar de otros miembros de la clase a la cual pertenecen el aminoácido de existencia natural. Los aminoácidos se pueden dividir en los siguientes cuatro grupos: (1 ) aminoácidos ácidos; (2) aminoácidos básicos; (3) aminoácidos polares neutrales; y (4) aminoácidos no polares neutrales. Los aminoácidos representativos dentro de estos varios grupos incluyen, pero no se limitan a: (1 ) aminoácidos ácidos (negativamente cargados) tales como ácido aspártico y ácido glutámico; (2). aminoácidos básicos (positivamente cargados) tales como arginina, histidina y lisina; (3) aminoácidos polares neutrales tales como, glicina, serina, treonina, citeina, cistina, tirosina, asparagina y glutamina; (4) aminoácidos no polares neutrales (hidrofóbicos) tales como alanina, leucina, isoleucina, valina, prolina, fenilalanina, triptófano y metionina. Los cambios de aminoácido conservadores dentro de las secuencias de polipéptido fundamentales de la presente invención se pueden hacer a través de la sustitución de un aminoácido dentro de uno de estos grupos con otro aminoácido dentro del mismo grupo. Los equivalentes biológicamente activos de TIC900 y secuencias relacionadas pueden tener 10 o menos cambios en aminoácido conservadores, más preferiblemente de cinco o menos cambios de aminoácido conservadores. La secuencia de nucleótido de codificación (gen, plásmido, ADN, ADNc o ADN sintéticos) de esta forma tendrá sustituciones base correspondientes, permitiéndole codificar formas equivalentes biológicamente funcionales de TIC900. Las variantes de la secuencia de aminoácidos de TIC900 y secuencias relacionadas se pueden hacer a través de procedimientos bien conocidos en la técnica. Un método adicional para identificar las toxinas y genes de la presente invención es a través del uso del sondas de oligonucleótido. Estas sondas son esencialmente secuencias de nucleótido que hibridizan bajo condiciones de hibridación su severas para la secuencia de codificación TIC900 una secuencia relacionada con la secuencia de codificación TIC900. Como es bien conocido la técnica, si una molécula de sonda y una molécula de secuencia de ácido nucleico en una muestra se hibridizan a través de la formación de un enlace lo suficientemente fuerte entre las dos moléculas, se puede asumir razonablemente en las dos moléculas exhiben una homología substancial. El enlace de la sonda se detecta utilizando un número de medios conocidos en la técnica incluyendo para no limitándose a, espectroscopia de resonancia fluorescencia, de luminiscencia, isotópica, inmunológica, y de plasmón de superficie, y similares. Dichos análisis de sonda proveen un método rápido para identificar los genes que codifican toxinas de la presente invención. Estos fragmentos de nucleótido que se utilizan como sondas de acuerdo con la ¡nvención se pueden sintetizar a través del uso de sintetizadores de ADN utilizando procedimientos estándares o a través de otros medios conocidos en la técnica. Esta secuencia de nucleótido están en se puede utilizar como iniciadores de PCR para amplificar la secuencia de nucleótido de la presente ¡nvención o porciones de la misma. tic900 y las secuencias de codificación de nucleótido relacionadas como se establecen aquí en SEC ID NO: 3, SEC ID NO: 5, SEC ID NO: 7, SEC ID NO: 9, SEC ID NO: 29, SEC ID NO:11 , SEC ID NO: 13, SEC ID NO: 15, SEC ID NO: 17, y SEC ID NO: 19 se puede utilizar como sondas de hibridación tal identificar y aislar variantes naturales de tic900 y secuencias de codificación de nucleótido relacionadas de otras cepas de B. thuringiensis o de otros microorganismos. La presente invención abarca las secuencia de nucleótido de microorganismos, en donde la secuencia de nucleótidos es aislable a través de hibridación con toda, o parte de la secuencia de nucleótido Bacillus de la ¡nvención. Las proteínas codificadas por cada secuencia de nucleótido se pueden probar para la actividad insecticida. La invención también abarca las proteínas codificadas por la secuencia de nucleótido. Los anticuerpos de TIC900 o proteína relacionadas de la presente invención se pueden producir utilizando técnicas inmunológicas estándares para la producción de antisuero policlonal y, si se desea, inmortalizar las células productoras de anticuerpo del huésped humanizado de fuentes de producción de anticuerpo monoclonal. Las técnicas para la producción de anticuerpos para cualquier substancia de interés son bien conocidas, por ejemplo en Harlow y Lañe (1988) y como en Goding (1986). Los anticuerpos anti-TIC900 se puedan utilizar identificar las cepas B. thuringiensis u otros microorganismos que producen variantes de TIC900 o proteína relacionadas que están codificadas a través de variaciones de un gen tic900 un gen relacionado. La presente ¡nvención abarca proteínas obtenidas de organismos en donde las proteínas obtenidas reaccionan en forma cruzada con los anticuerpos que surgen contra una o más las proteínas de la presente invención. Los anticuerpos producidos en la presente ¡nvención también son útiles en inmunoensayos para determinar la cantidad o presencia de un TIC900 o una proteína relacionada. Dichos ensayos también son útiles en la producción de composiciones de calidad controlada que contienen TIC900 o una proteína relacionadas de la presente invención. Además, los anticuerpos el poder utilizar para evaluar eficiencia de la producción recombinante de una TIC900 o una proteína relacionada, así como para clasificar las colecciones de expresión para la presencia de TIC900 o una secuencia con el codificación de la proteína relacionada. Los anticuerpos son útiles también como ligandos de afinidad para purificar y/o aislar TIC900 y proteína relacionadas. TIC900 y los epítopos antigénicos relacionados se pueden obtener a través de la sobre expresión de longitud completa o parcial de una secuencia que codifica toda una parte de una TIC900 o una proteína relacionada en una célula huésped preferida. Los péptidos de la presente invención son principalmente, sin embargo no exclusivamente, previstos para uso en plantas, y en ciertas modalidades preferidas, la secuencia de nucleótido modificada para codificar las proteínas de la presente invención en plantas están contenidas dentro de uno o más vectores de plásmido. Dichos vectores pueden contener una variedad de elementos reguladores y otros elementos que pretenden permitirle expresión óptima de las proteínas de la presente invención en células de planta. Estos elementos adicionales pueden incluir promotores, terminadores, e intrones como se mencionó anteriormente. Cualquier vector que contiene una construcción de ADN y cualquier elemento regulador u otro elemento se puede seleccionar del grupo que consiste de un cromosoma artificial de levadura, un cromosoma artificial de bacteria, un plásmidos, un cósmido, y similares. Además, los vectores expresión mismos pueden ser de una variedad de formas. Estas formas pueden diferir por varias razones, y probablemente están comprendidos de componentes variables dependiendo de si pretenden transformar una planta monocotiledónea una planta -dicotiledónea. Los vectores adicionales contemplados para estar dentro del alcance de la presente invención incluyen aquellos vectores capaces de contener un tic900 o composiciones de ácido nucleico relacionadas descritas anteriormente, así como cualquier otra construcción de ADN que además comprende regiones de codificación que se expresan en plantas para otras proteínas insecticida derivadas de especies Bacillus. La secuencia de nucleótido que codifica la proteína insecticida TIC900 (SEC ID NO: 4) o que codifica una secuencia de polipéptido relacionada tal como TIC402 (SEC ID NO: 6), TIC403 (SEC ID NO:8), TIC404 (SEC ID NO:10), TIC434 (SEC ID NO: 30), TIC961 (SEC ID NO:12), TIC962 (SEC ID NO: 14), TIC963 (SEC ID NO: 16), TIC965 (SEC ID NO: 18) y TIC966' (SEC ID NO: 20) se puede introducir en una variedad de huéspedes de microorganismos sin una experimentación indebida, utilizando procedimientos en conocidos por aquellos expertos en la técnica para transformar huéspedes adecuados bajo condiciones que permiten el mantenimiento estable y la expresión de los genes clonados (Sambrook y otros, 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2a. Ed. , Cold Spring Harbor Press, New York). Los huéspedes adecuados que permiten expresión de la proteína TIC900 (SEC ID NO: 4) y secuencias relacionadas incluyen las especies ß. thuringiensis y otras Bacillus tales como Bacillus subtilis o Bacillus megaterium. Los microorganismos genéticamente alterados o producidos por ingeniería que contienen el gen tic900 gene (SECJD NO: 3) también pueden contenerJa secuencia de nucleótidos que codifica otras proteínas de toxina presentes en el mismo microorganismos; estas secuencias de codificación podrían concurrentemente producir proteínas insecticida diferentes de TIC900 o una proteína relacionada. En particular, sería preferible producir dos o más diferentes proteínas insecticida en una célula huésped, en donde cada proteína es tóxica para las mismas especies insectos y cada proteína exhibe un modo de acción diferente de la(s) otra(s). Los microorganismos colonizadores en plantas o colonizadores de tallos también pueden emplearse como células huéspedes para la producción de una TIC900 o una proteína relacionada. Los huéspedes de microorganismos ilustrativos para los genes de toxina B. thuringiensis incluyen en microbio colonizadores planta Clavibacter xyli como se describe por Turner y otros (1993; Endophytes: an alternativa genome for crop improvement; International crop science I. International Crop Science Congress, Ames, lowa, USA, 14-22 Julio 1992, pp. 555-560). La secuencia de nucleótidos de codificación de toxina a partir de aislados de la presente invención se puede introducir en una amplia variedad de huéspedes microbianos o de planta. La expresión del gen de toxina da como resultado, directa o indirectamente, la producción intracelular y el mantenimiento del pesticida. Con huéspedes microbianos adecuados, por ejemplo pseudomonas, los microbios se pueden aplicar al sitio de la plaga, en donde proliferarán y serán ingeridos por la plaga. El resultado es un control de la plaga. Alternativamente, en microbio que aloja el gen de toxina se puede tratar bajo condiciones que prolongan la actividad de la toxina y estabilizan la célula. La célula tratada, se retiene la actividad tóxica, después se puede aplicar al ambiente de la plaga objetivo. Cuando el gen de toxina tic900 de una secuencia de codificación de nucleótido relacionada por medio de un vector adecuado dentro de un huéspedes microbianos, y el huéspedes se aplica al ambiente en un estado vivo, es ventajoso utilizar ciertos microbios huésped. Por ejemplo, los huéspedes de microorganismos se pueden seleccionar sabiendo cuales ocupan el habitat de las plagas. Los huéspedes microorganismos también pueden vivir simbióticamente con una especie de plaga específica. Estos microorganismos se seleccionaron como siendo capaces de exitosamente competir en un ambiente particular con los microorganismos de tipo silvestre, previstos para el mantenimiento estable y la expresión del gen que expresa el pesticida de polipéptido, y, deseablemente proveer una protección del pesticida de la degradación ambiental y la inactivación. Se sabe que un gran número de microorganismos habitan en el habitat de las plagas. Estos microorganismos incluyen bacterias, algas -y hongos. De particular interés son los microorganismos, tales como bacterias, por ejemplo de género Bacillus, Escherichia, Pseudómonas, Erwinia, Serratia, Klebsiella, Salmonella, Pasteurella, Xanthomonas, Streptomyces, .Rhizobium, Rhodopseudomonas, Methylophilius, Agrobacterium, Acetobacter, LactoBacillus, Arthrobacter, Azotobacter, Leuconostoc, y Alcaligenes, hongos, por ejemplo de género Metarhizium, Bavaria, Saccharomyces, Cryptococcus, Kluyveromyces, Sporobolomyces, Rhodotorula, y Aureobasidium. Están disponibles una amplia variedad de medios para introducir un gen de toxina que codifica una toxina dentro de un huéspedes microorganismos bajo condiciones que permiten el mantenimiento estable y la expresión del gen. Estos métodos son bien conocidos por los expertos en la técnica y se describen, por ejemplo, en la Patente de E.U.A. No. 5,135,867. Como se mencionó anteriormente, B. thuringiensis o las células recombinante expresan TIC900 una toxina relacionada se puede tratar para prolongar la actividad de la toxina y estabilizar la célula. La micro cápsula de pestlcida que se forma comprende una o más TIC900 o toxina relacionadas dentro de una estructura celular que ha sido estabilizada y que protegerá a la toxina o toxinas cuando se aplica la micro cápsula al ambiente de la plaga objetivo. Las células huésped adecuadas pueden incluir ya sea procariotes o eucariotes, normalmente estando limitadas a aquellas células que no producen sustancias tóxicas para organismos mayores, tales como mamíferos. Sin embargo, los organismos que producen sustancias tóxicas para organismos mayores se podrían utilizar, cuando la sustancias tóxicas son inestables o el nivel de aplicación es suficientemente bajo para evitar cualquier posibilidad de toxicidad aún cuestan mamíferos. De interés particular como huéspedes serán los procariotes así como eucariotes inferiores tales-corno hongos. Las células estos organismos usualmente estarán intactas y estarán sustancialmente en la forma prolifera activa cuando se trataron, en lugar de la forma de espora, aunque en algunas instancias se pueden emplear esporas. Dichas micro cápsulas también pueden contener una o más TIC900 o una proteína relacionada junto con una o más composiciones de proteína insecticida relacionadas incluyendo, pero no limitándose a endotoxinas detal Insecticidas para especies de lepidópteros tales como proteínas Cryl, Cry2, y Cry9, así como endotoxinas delta insecticidas para especies de coleópteros tales como proteínas Cry3, Cry22, ET70, ET80/76, ET33/34, PS149B1 , ET100/101 , y ET29 y similares. Las células generalmente tendrán una estabilidad - estructural mejorada que mejorará la resistencia a condiciones ambientales. Cuando el pesticida esta en una proforma o forma precursora, el método de tratamiento de la célula deberá seleccionarse para no inhibir el procesamiento de la proforma para la forma madura del pesticida a través del patógeno de la plaga objetivo. Por ejemplo, el formaldehído entrecruzará las proteínas y podría inhibir el procesamiento de la proforma de un pesticida de polipéptido. El método de tratamiento de célula retiene por lo menos una porción sustancial de la biodisponibilidad o bioactividad de la toxina. TIC900 y las secuencias de codificación relacionadas como se establece en SEC ID NO: 3, SEC ID NO:5, SEC ID NO:7, SEC ID NO:9, SEC ID NO:29, SEC IDNO: 11 , SEC ID NO: 13, SEC ID NO: 15, SEC ID NO:17, y SEC ID NO:19 y similares secaron utilizar, las bases para la construcción de la secuencia de nucleótido modificada para incorporación dentro de las células de planta. Aún más preferible es la síntesis de una secuencia de nucleótido de existencia natural que codifica TIC900 o la proteína insecticida relacionada o su equivalente para la expresión en una célula de planta, la síntesis de la secuencia de nucleótido de existencia natural estando basada en la secuencia de aminoácido de la proteína nativa sin referencia a la secuencia de nucleótido nativa a partir de la cual se deriva la secuencia de aminoácido nativa. La expresión de dichas secuencias en células de planta podría convertir una planta que comprende dichas células en más resistente al ataque de insectos de especies de lepidópteros. La ingeniería genética de plantas con secuencias modificadas codifican uno o más TIC900 o una proteína relacionada una secuencia de aminoácido insecticida relacionada se puede lograr a través de la introducción del ADN deseado conteniendo la secuencia de codificación dentro de los tejidos o células de planta, utilizando molecular de ADN de una variedad de formas y orígenes que son bien conocidas por los expertos en la Ingeniería genética de plantas. El método para introducir la secuencia de nucleótidos en las plantas y tejidos de plantas es bien conocido la técnica. El ADN que contiene un gen modificado que codifica TIC900 una proteína insecticida relacionada, operativamente enlazado a un promotor funcional de planta, se puede distribuir en las células o tejidos de planta directamente a través de un número de medios incluyendo, pero no limitándose a, la transformación mediada por Agrobacterium, virus-de planta, electroporación, micro inyección, infiltración de vacío, medios de fusión de liposoma, y métodos balísticos. El promotor de planta puede ser un promotor constitutivo; un promotor imposible temporalmente, espacialmente, químicamente, fotosintéticamente, térmicamente o artificialmente; un promotor específico del tejido; un promotor quimérico o híbrido ensamblado de partes de otros promotores funcionales de planta. Por ejemplo, el promotor puede ser un promotor del virus de mosaico de coliflor (CaMV) 35S un derivado funcional de planta del mismo. Los genes bacterianos nativos y las secuencias de codificación por lo general se expresan pobremente en células de plantas transgénicas. La utilización del codón de planta más estrechamente se aparece a nosotros organismos más altos que los organismos unicelulares, tales como bacterias. Varios reportes han descrito métodos para mejorar expresión de genes recombinante se plantas (Murray y otros, 1989, Nucleic Acids Research, Vo1.17:477-498; Diehn y otros, 1998 (b), Plant Physiology, 117: 1433-1443; Rocher y otros, 1998, Plant Phys. 117:1445-1461 ). Esta reportes describen varios métodos para diseñar por ingeniería secuencias de codificación para representar secuencias que son más eficientemente traducidas con base en los cuadros de secuencia de codón de planta, mejoras en la tendencia de la tercera posición base del codón, utilizando secuencias recombinante evitan la poliadenilación sospechosa o dominios ricos en A/T o secuencias de consenso de división de intrón. Ya que estos métodos para la construcción de genes sintéticos son notables, los genes sintéticos de la presente ¡nvención para la expresión en plantas particulares se preparan sustancialmente de acuerdo con el método de Brown y otros (Patente de E.U.A. No. 5,689,052). El trabajo descrito aquí, la ventaja de los métodos de potenciación en la expresión in planta de TIC900 y proteínas insecticida relacionadas, que confiere resistencia a patógeno de insectos de lepidópteros, a través de la incorporación o localización de las secuencias de codificación en el genoma nuclear, de plastida o cloroplasto de plantas susceptibles. La Patente de E.U.A. No. 5,500,365 y las patente relacionadas describen métodos para sintetizar genes de plantas para lograr niveles expresión óptimos de la proteína que codifica el gen sintetizado, no de existencia natural, sintéticos, o artificial. Estos métodos se relacionan con la modificación de las secuencias de genes estructurales Bt nativos para producir una secuencia de codificación que es más "de tipo planta" y por consiguiente más probablemente ser traducirá y expresará a través de la planta, monocotiledónea o dicotiledónea. Sin embargo, el método como se describe por Brown y otros (Patente de E.U.A. No. 5,689,052) provee la expresión mejorada de transgenes, preferiblemente en plantas monocotiledóneas. - De esta forma, la cantidad de un gen que codifica un polipéptido interés, por ejemplo, TIC900 o polipéptido relacionada, se puede Incrementar en plantas a través de la transformación de esas plantas utilizando métodos de transformación mencionados anteriormente. En particular, la transformación del cloroplasto o plastida pueda dar como resultado, la secuencias de codificación deseadas estando presentes en hasta aproximadamente 10,000 copias por célula en tejidos que contienen estas estructuras de orgánulo subcelulares (McBride y otros , WO 95/24492). El ADN que codifica TIC900 y proteínas relacionadas también se puede introducir dentro de las plantas a través del uso de un método de transferencia de ADN directo dentro del polen como se describe (Zhou y otros, 1983, Mol. Cell Biol., 10: 4529-4537; Hess, 1987, Hess, Intern Rev. Cytol., 107: 367.). Expresión de las secuencias de codificación de polipéptido,- es decir, tic900 y similares, se puede obtener a través de la inyección de ADN en órganos reproductores de una planta como se describe (Pena y otros, 1987, Nature, 325: 274). El ADN también se puede inyectar directamente dentro de las células de embriones inmaduros y dentro de embriones desecados rehidratados como se describe (Neuhaus y otros, 1987, Theor. Appl. Genet. , 75: 30). Después de efectuar la distribución de la secuencia de nucleótido exógena que codifica TIC900 o una proteína relacionada para las células receptoras, el siguiente paso para obtener una planta" transgénica generalmente concierne la identificación de las células transformadas para un cultivo adiciona! y la regeneración de la planta, es decir, la selección de las células transformadas. Como se mencionó aquí, con el fin de mejorar la habilidad para identificar los transformantes, se puede utilizar un gen marcador seleccionable o identificable como, o además de, el gen de interés que se puede expresar. En este caso, entonces se podría generalmente ensayar la población de célula potencialmente transformada a través de la exposición de las células aun agente o agentes selectivos, o se podrían detectar las células para la característica de gen marcador deseada. Una modalidad ilustrativa de los métodos para identificar células transformadas involucra la exposición de los cultivos transformados aún agentes selectivos, tal como un inhibidor metabólico, un antibiótico, un herbicida o similar. Las células que han sido transformadas y tienen un gen marcador establemente integrado que confiere resistencia al agente selectivo utilizado, crecerán y se dividirán en el cultivo. Las células sensibles no serán tratables para cultivo adicional. Un ejemplo de un gen marcador preferido confiere resistencia a glífosato herbicida. Cuando se utiliza este gen como marcador seleccionable, el cultivo de célula putativamente transformado se trata con gllfosato. Después de la exhibición a glifosato, las células transgénicas que contienen una enzima GOX recombinante un glifosato recombinante insensible al enzima EPSPS están disponibles para un cultivo adicional mientras son sensibles, o células no transformadas no. (Patente de E.U.A. No. 5,569,834). Un ejemplo de un sistema marcador seleccionable preferido este sistema de resistencia a fosfotransferasa (nptll) de neomicina a través del cual se confiere resistencia a canamicina de antibiótico, como se describe en la Patente de E.U.A. No. 5,569,834. Otra vez, después de- la transformación con este sistema, las células transformadas estarán disponibles para un cultivo adicional después del tratamiento con canamicina, mientras no lo estarán las células no transformadas. Aún otro sistema marcador seleccionable preferido involucra el uso de una construcción de gen -que confiere resistencia a paromicina. El uso de este tipo de sistema marcador seleccionable se describe en la Patente de E.U.A. No. 5,424,412. Otros marcadores seleccionables son bien conocidos en la técnica, e incluyen pero no se limitan a marcadores de resistencia antibiótico tales como nptll, tet, aad, y similares, phnO y otras varias acetilasas (Patente de E.U.A. No. 6,448,476), varias esterasas (6,107,549), bamasa (Hartley, 1988), J. Mol. Biol. 202: 913), enzimas bacterianas que confiere la actividad de glifosato de oxidasa sobre las células transformadas (gox) (Barry y otros , 1992, Inhibitors of amino acid biosynthesis: Strategies for imparting glyphosate tolerance to crop plants. In: Biosynthesis y Molecular Regulation of Aminoácidos in Plants. pp. 139-145. Singh, Flores, y Shannon Eds., American Society of Plant Physiologists, Rockville, Md.) y similares La selección transpiastonómica (selección de los eventos de transformación de la plastida o cloroplasto) para espectinomicina, un inhibidor de la síntesis de proteína de plastida o cloroplasto, pero no de síntesis de proteína a través de ribosomas citoplásmicos que codifican el genoma. La espectinomicina previene la acumulación de proteínas de cloroplasto requeridas para la fotosíntesis por lo que las células de plantas transformadas resistentes a espectinomicina se pueden distinguir sobre las bases de su diferencia en color: las células transformadas, resistentes son verdes, mientras que las células sensibles son blancas, debido a la inhibición de la síntesis de plastida-proteína. La transformación de cloroplasto o plastidas con un gen aad bacteriano adecuado, o con un gen que codifica un ARN ribosómico funcional de cloroplasto o plastida resistente a espectinomicina provee medios para seleccionar y mantener los eventos transplastonómicos (Maliga, 1993, Trends in Biotechnology 11 :101-106). Además se contemplan las combinaciones de marcadores seleccionables y detectables que serán útiles para la Identificación de células transformadas. En algunos tipos de célula o tejido un agente de selección, tal como un glifosato o canamicina, puede ya sea proveer una actividad aniquiladora suficiente para claramente reconocer las células transformadas o puede causar una inhibición no selectiva substancial de transformantes y no transformantes similares, de esta forma causando de la técnica de selección no sea efectiva. Se propone la selección con un compuesto inhibidor del crecimiento, tal como glifosato, o AMPA (ácido amino-metil fosfórico) a concentraciones por debajo de aquellas que causan el 100% de inhibición, seguido por la detección del tejido en crecimiento para la expresión de un gen marcador detectable tal como canamlcina podrían permitir recuperar los transformantes de los tipos de célula o tejidos que no son susceptibles de selección solos. Se propone que las combinaciones de selección y detección puedan habilitar la identificación de los transformantes en una amplia variedad de tipos de célula y tejido. El desarrollo o regeneración de las plantas de ya sea protoplastos de planta individual o de varios explantes son bien conocidos en la técnica. Este procedimiento de regeneración y crecimiento típicamente incluyen los pasos de seleccionar las células transformadas, cultivar esa células individualizadas a través de las etapas usuales de desarrollo en periódico a través de la etapa de plantillas con raíces. Los embriones transgénicos y las semillas sea regeneración en la mente. Los brotes con raíces transgénicos resultantes después se plantan en un medio de crecimiento de planta apropiado tal como tierra. El desarrollo o regeneración de las plantas que contienen un gen exógeno, extraño, que codifican un TIC900 o polipéptido relacionado introducido dentro de genoma de la planta a través de transformación Agrobacterium de explantes de hoja se puede lograr a través de métodos bien conocidos en la técnica (Horsch y otros, Science 227: 1229-1231 ; 1985). En este procedimiento, los transformantes se cultivan en la presencia de un agente de selección en un medio que induce la regeneración de los brotes en la cepa de la planta está siendo transformada como se describe (Fraley y otros, PNAS, USA 80: 4803; 1983). En particular, la Patente de E.U.A. No. 5,349,124 detalla la creación de células de lechuga genéticamente transformadas y plantas resultantes de las mismas que expresen proteínas de cristal híbridas que confiere una actividad insecticida contra la larva de lepidópteros para dichas plantas. Preferiblemente, las plantas regeneradas sea auto-polinizan para proveer plantas transgénicas homocigosas, oponen obtenido de plantas regeneradas se entrelaza con plantas con crecimiento de semillas de líneas agrícola mente importantes, preferiblemente innatas. Inversamente, el polen de plantas de esas líneas importantes se utiliza para polinizar plantas regeneradas. Una planta transgénica de la presente invención que contiene una secuencia de nucleótido que codifica TIC900 deseado un polipéptido relacionado se cultiva utilizando métodos bien conocidos por los expertos en la técnica. Una planta transgénica esta invención de esta forma tiene una cantidad incrementada de región de codificación que codifica TIC900 un polipéptido relacionado. Una planta transgénica preferida es una segregación independiente y puede transmitir ese gen y su actividad a su progenie. Una planta transgénica más preferida es homocigosa para ese gen, y transmite ese gen a todos sus vastagos de apareamiento sexual. Las semillas de una planta transgénica se pueden hacer crecer en el campo o en un invernadero, y dan como resultado plantas transgénicas sexualmente maduras que se auto-polinizan para generar plantas de producción reales. La progenie - estas plantas se convierte en una línea de producción real que se evalúa para una expresión incrementada del transgen ß. - thuringiensis. Para Identificar una planta transgénica que expresa alto niveles de TIC900 o una proteína relacionada de una secuencia de nucleótido preferida, es necesario detectar elemento transgénicos seleccionado (generación Ro) para la actividad insecticida y/o la expresión de gen. Esto se puede lograr a través de varios métodos bien conocidos por los expertos en la técnica, incluyendo, pero rio limitándose a 1 ) la obtención de pequeñas muestras de tejido de la planta Ro transgénica y directamente ensayar el tejido para la actividad contra insectos susceptibles, por ejemplo el barrenador de maíz Europeo (ECB), el gusano del tabaco (TBW) y la polilla de espalda de diamante (DBM), en paralelo con el tejido derivado de una planta de control negativa, no expresada; 2) el análisis de los extractos de proteína a través de inmunoensayos enlazados enzimas (ELISA) específicos para TIC900 y una proteína relacionada; o 3) amplificación térmica de transcriptasa inversa (también conocida en la técnica como rtPCR) para identificar los eventos que expresan la secuencia que codifica TIC900 o una proteína relacionada.

Los siguientes ejemplos además ilustra las características de la secuencia nucleótidos descrita aquí y de la actividad insecticida de las proteínas codificadas por la secuencia de nucleótido descrita. Además, se describen los métodos y procedimientos para practicar la invención. Sin embargo, aquellos con experiencia en la técnica deberán, en luz de la presente invención, apreciar que se pueden hacer muchos cambios las modalidades específicas que se describen y aún obtener un resultado parecido o similar sin apartarse dei espíritu y alcance de la invención EJEMPLOS EJEMPLO 1 Preparación y vivo ensayo del sobrenadante de cultivo de la cepa B. thuringiensis EG5438 La cepa ß. thuringiensis EG5438 se hizo crecer en 60 ml de medio de cultivo PYG con agitación durante la noche a 30°C. El medio PYG contuvo lo siguiente: 11.8 g de peptona, 23.6 g de extracto de levadura, 4 ml de glicerol, 19.4 g de K2HP0 anhidro, y 2.2 g de KH2P04 anhidro. Se agregó un litro de agua deslonízada, y el medio se esterilizó en autoclave durante 15 minutos. El cultivo B. thuringiensis se centrifugó a 11 ,000 xg durante 30 minutos y el sobrenadante se transfirió a un frasco limpio. El sobrenadante se enfrió a 4°C, y se agregaron lentamente 34 gramos de sulfato de amonio más 1 ml de NaOH 1 M a! sobrenadante con agitación. La mezcla se centrifugó y el comprimido resultante se disolvió en 2 ml de 20 mM de Tris-HGI pH 7.5. La solución se transfirió para entubado de diálisis (6000 MWCO) y se dializó a 4°C contra 20 mM de Tris-HCl pH 7.5. Esto es referido como el sobrenadante dializado. El sobrenadante dializado se probó para toxicidad á" la larva de polilla de espalda de diamante (DBM) como sigue. Cincuenta µl del sobrenadante dializado se aplicó tópicamente a 2 ml de dieta de insecto en una taza. Se trataron un total de 32 tazas de dieta con el sobrenadante dializado. Como un control no se trataron 64 tazas de dieta con el sobrenadante dializado. Una primera forma de larva DBM se colocó en cada taza de dieta y la mortalidad del insecto se marcó después de 7 días. Para las larvas en las dietas de control no tratadas 1 de 64 larvas murió (2%). Para las larvas en las dietas tratadas con el sobrenadante dializado 29 de 32 murieron (90%), sugiriendo que el sobrenadante dializado de la cepa EG5438 contuvo uno o más factores tóxicos para la larva DBM.

EJEMPLO 2 Fraccionamiento de proteínas en el sobrenadante dializado y bioensayo de fracciones de proteína Las proteínas en el sobrenadante dializado fueron inicialmente fraccionadas a través de electroforesis de gel de poliacrilamida de dodecilsulfato de sodio (SDS-PAGE). Se mezclaron 30 I del sobrenadante dializado con 15 I de regulador de pH de solubilización de proteína-, la mezcla se calentó a 100°C durante 15 minutos, y se aplicaron 25 I de la mezcla a un gel de pollacrilamida. Se aplicó una corriente eléctrica al gel para separar las proteínas por tamaño en el gel. Las proteínas se visualizaron después de la electroforesis a través de tinción con colorante Coomassie. El sobrenadante dializado contuvo aproximadamente 20 proteínas en la escala de aproximadamente 20 kDa a aproximadamente 100 kDa. Las proteínas en el sobrenadante dializado se fraccionaron a través de cromatografía de intercambio de ¡ón DEAE- Se aplicaron 2 ml del sobrenadante dializado a una columna de 1 ml de DEAE. La columna se lavó con 10 ml de 20 mM de Tris-HCl, pH 7.5, seguido por lavado con 20 ml de un gradiente de NaCI de 0 a 1 M en 20 mM deTrls-HCI, pH 7.5. Las fracciones de 1 ml se recolectaron. Cada fracción se dializó contra 20 mM de Tris-HCl, pH 7.5, y las fracciones individuales se probaron para toxicidad a larvas DBM como se describió anteriormente. Las fracciones con la toxicidad más alta se recolectaron y se combinaron y son referidas como un agrupamiento DEAE. El agrupamiento DEAE se aplicó a una columna de Intercambio de ion de carboximetil celulosa (CM). La columna se lavó con 10 ml de 20 mM de Tris-HCl, pH 7.5, seguido por lavado con 20 ml de un gradiente de NaCI de 0 to 1 M NaCI en 20 mM deTris-HCI, pH 7.5. Se recolectó 1 ml de las fracciones y de dializó contra 20 mM de Tris-HCl, pH 7.5. Estas fracciones se probaron para toxicidad a larva DBM. Este análisis mostró que las fracciones CM tuvieron la toxicidad más alta a DBM y contuvieron una proteína de aproximadamente 66 kDa. La proteína de 66 kDa fue referida como, la proteína 5438-66, también referidas como TIC900 secretada, o mTIC900 (refiriéndose a la forma madura de la proteína identificada en el sobrenadante de cultivo que puede ser diferente de cualquier proteína TIC900 precursora (pTIC900) aún no liberada de la célula).

EJEMPLO 3 Determinación de la secuencia N-terminal de un fragmento de una proteína TIC900 La proteína mTIC900 se purificó del sobrenadante de la cepa EG5438 a través de cromatografía de intercambio de ion DEAE y CM. Los intentos para determinar la secuencia N-terminal de la proteína mTIC900 purificada a través de métodos estándares no fueron exitosos. Para superar esta dificultad, la proteína mTIC900 se fragmentó a través del tratamiento de bromuro de cianógeno (Córdoba y otros, J. Biochem. Biophys. Methods 35:1 , 1997). Los fragmentos TIC900 generados por el bromuro de cianógeno se separaron por tamaños a través de SDS-PAGE sin tinción Coomassie. Los fragmentos TIC900 separados se transfirieron de SDS-PAGE a una membrana de difluoruro de polivinilideno (PVDF) a través de una electro-transferencia. La membrana PVDF se tiñó con colorante Coomassie y una porción de la membrana conteniendo un fragmento de aproximadamente 14 kDa de la proteína TIC900 se extirpó con una navaja de rasurar. La membrana PVDF extirpada conteniendo el fragmento de 14 kDa se sometió a secuenciación Edmund automatizada, revelando la secuencia de aminoácido como se muestra en SEC ID NO:1 , en donde el residuo de aminoácido Xaa en la posición uno (1 ) fue indeterminable excepto que se presume que es ya sea un residuo de Serina, Tirosina, Aspartato o Histidina, pero más probablemente un residuo de Tirosina, el residuo de aminoácido Xaa en la posición 15 fue indeterminable excepto que fue probablemente un residuo de Prollna, y el residuo Xaa en la posición 18 también fue indeterminable excepto que probablemente fue un residuo de Arginina.

EJEMPLO 4 Clonación del gen tic900 que codifica la proteína TIC900 Con base en la secuencia obtenida del fragmento de proteína TIC900 de 14 kDa (SEC ID NO:1 ), se designó un oligonucleótido específico de gen. Debido a la degeneración del código genético no es posible conocer la secuencia exacta de un gen con base en la secuencia de la proteína codificada por el gen. Por consiguiente, para los aminoácidos que se pueden codificar a través de más un codón individual, es necesario suponer el codón correcto. La probabilidad de suponer acertadamente se mejora a través del hecho de que el genoma B. thuringiensis es de aproximadamente 68% AT (adenosina y timldina). Por consiguiente, para los aminoácidos codificados por más de un codón, el codón o codones que contienen A's o T's se seleccionan, y para los codones que contienen substancialmente G/C, esos codones que tienen una degeneración en ia tercera posición base se seleccionan preferencialmente con base en si la tercera base en un nucleótido A o T. UN oligonucleótido designado WD470 (SEC ID NO: 2) se designó el cual es uno de muchos que podrían concebiblemente codificar el aminoácido establecido en SEC ID NO:1 , tomando en consideración que la utilización de A/T en Bacillus thuringiensis para los codones que codifican cualquier aminoácido dado. El ADN se purificó de células EG5438 de la cepa B. thuringiensis a través de procedimientos estándares. Las muestras del ADN EG5438 se sometieron a ya sea la digestión de la enzima de restricción Hindlll o EcoRI y se fraccionaron por tamaño a través de electroforesis a través de un gel dé agarosa y se sometieron a análisis Southern blot utilizando una sonda de oligonucleótido WD470 conjugada con fosfatasa alcalina. Después de la incubación durante aproximadamente 16 horas a 40°C el blot se lavó, se trató con regulador de pH quimiolumlniscente, y se expuso á película de rayos X. La sonda WD470 específicamente se hibridiza con los fragmentos de restricción de ADN EG5438 que fueron aproximadamente de 2.5 kb (Hindlll) y 3.0 kb (EcoRI) en longitud, respectivamente. Se construyó una colección de ADN EG5438 que consiste de aproximadamente fragmento EcoRI de3.0 kb construidos en un CIP (fosfatasa de intestino de becerro) tratado con el plásmido pUC18 digerido con EcoRl. La colección se transformó a través de electroporación en una cepa XLIBLUE E. coli y se colocó en plagas para LB-ampicilina. Las colonias que surgieron se mancharon con una membrana y se sondearon con sonda de oligonucieótido WD470 conjugada con fosfatasa alcalina. Se seleccionaron varios clones positivos y el ADN de plásmido se obtuvo de cada uno. Los ADNs de plásmido se digirieron con EcoRi para confirmar la presencia de un inserto EcoRI individual que consiste de aproximadamente 3.0 kb. Los plásmidos también se sometieron a hibridación para la sonda WD470 conjugada con alk-phos para confirmar la complementaridad de la sonda y el ADN insertado. Se seleccionó un solo clon para análisis adicional y se designó como el plásmido pEG1398. El ADN insertado en pEG1398 se sometió a análisis de secuencia. Se obtuvo una secuencia conteniendo un marco de lectura abierto parcial que consiste de la posición 1176 a 1803 del nucleótido como se establece en SEC ID NO: 3, así como 2 nucleótidos adicionales más allá del nucleótido 1803 (datos no mostrados) que contuvieron un codón de terminación inmediatamente después de los nucleótidos en la posición 1801-1803 como se establece en SEC ID NO:3. La secuencia completa de un ORF que codifica la proteína TIC900 proteína no estuvo presente dentro del fragmento EcoRI clonado en el plásmido pEG1398. Los iniciadores de oligonucleótido específicos para los extremos 5' y 3' de la secuencia identificada ahí se designaron para habilitar la síntesis de una sonda marcada para uso en la detección de un fragmento clonado más grande de ADN EG5438 que probablemente contuvo el ORF de longitud completa que codifica la proteína TIC900. Una sonda de ADN marcada de digoxigenina se prepare a través de amplificación utilizando los iniciadores y el ADN insertado en pEG1398 como una plantilla. El ADN marcado DIG se utiliza para sondear una Southern blot del ADN EG5438 que había sido redisuelto en un gel de agarosa después de la digestión con varias enzimas de restricción. Se identificó un fragmento Hindlll de aproximadamente 2.5 kb en longitud como un fragmento que podría. contener el ORF de longitud completa que codifica la proteína TIC900. Un fragmento de ADN EG5438 se clonó utilizando medios similares a aquellos descritos anteriormente para el fragmento EcoRid de aproximadamente 3.0 kb excepto que el fragmento Hindlll se clonó en un plásmido KS pBlueScript y la sonda se utilizó como un segmento de -ADN marcado DIG que consiste de una parte de marco de lectura abierto identificado dentro del fragmento EcoRI de 3.0 Kb en el plásmido pEG1398. Se seleccionó un plásmido conteniendo un fragmento Hindlll de aproximadamente 2.5 kb que hibridizó el fragmento EcoRi marcado DIG presente dentro de pEG1398 para análisis adicional y se designó como el plásmido p5438-2.5-kb-H3. La cepa E. coli que lleva p5438-2.5-H3 se designó como 5438 2.5kb H3. Se determine la secuencia de ADN del inserto Hindlll de 2.5 kb en el plásmido p5438-2.5-kb-H3, y la traducción de esta secuencia en los seis marcos de lectura reveló un marco de lectura abierto de 1803 nucleótidos, la secuencia de los cual se establece en SEC ID NO:3. El ORF de la posición 1 del nucleótido a través de ia posición 1803 de nucleótido como se establece en SEC ID NO: 3 se pronostica para codificar una proteína de aproximadamente 68,868 Daltons, la cual ha sido designada como TIC900. La secuencia de aminoácido del precursor pronosticado de una proteína TIC900 (pTIC900) derivada del marco de lectura abierto en SEC ID NO: 3 se muestra como se establece en SEC ID NO: 4. La comparación de la identidad y similitud de la secuencia de aminoácido de la secuencia de aminoácido TIC900 derivada (SEC ID NO: 4) con la base de datos de la proteína de GenBank reveló que la identidad más cercana fue a una proteína CrylCa que exhibe alrededor de 49% de identidad.

EJEMPLO 5 Expresión de un gen tic900 clonado en B. thuríngiensis recombinante Los genes de toxina insecticida B. thuringiensis por lo general están pobremente expresados en las cepas E. coli. La cepa B.thuringiensis EG10650 es una cepa acrystalliferous que fue designada para uso común receptor de la cepa para probar si los genes Bt Granados codifica la proteína insecticida. (EG10650, número de registro NRRL NRRL B-30217, Patente de E.U.A. No. 6,468,52). La secuencia de codificación TIC900 en el fragmento Hindlll clonado en el plásmido p5438-2.5kb-H3 se transición un sitio de restricción Hindlll en el vector pEG597 transportador de E. coli de B. thuringiensis (Baum, J. A.; Coyle, D. M.; Gilbert, M. P.; Jany, C. S.; Gawron-Burke, C, 1990 Novel cloning vectors for .Bacillus thuringiensis; Applied y Environmental Microbiology 56 (11 ) : 3420-3428) tanto como resultado la construcción del plásmido pMON74010 que confiere resistencia a cloranfenicol al receptor de células Bacillus. El plásmido pMON74010 se transformó a través de electroporación en la cepa EG 10650 de B. thuringiensis acrystalliferous produciendo la cepa SIC9002. La cepa EG10650 se hizo crecer como un medio PYG de control como se describe en el Ejemplo 1. La cepa recombinante SIC9002 se hizo crecer en medio PYG más 5 ug/ml de cloranfenicol. Los sobrenadantes de cultivo se prepararon como se describe en el Ejemplo 1. Las proteínas en los sobrenadantes de cultivo se volvieran a disolver a través de análisis SDS-PAGE y se visualizaron después de la tinción con azul brillante Coomassie. Los resultados del análisis SDS-PAGE revelaron que las cepas EG10650 y SIC9002 secretaron números y tamaños de proteína similares en sus sobrenadantes de cultivo respectivos con la excepción de que el sobrenadantes de cultivo de la cepa SIC9002 contuvo una proteína de aproximadamente 66 kDa que no parece estar presente en el sobrenadante de cultivo de la cepa EG 10650. Este resultado sugiere que el marco de lectura abierto tic900 clonado en p5438-2.5kb-H3 modificó una proteína que emigró con una masa de aproximadamente 66 kDa en geles de SDS-PAGE. Se establece una discrepancia en el tamaño de la secuencia de aminoácido derivada de ORF como se establece en SEC ID NO: 3 (aproximadamente 69 kDa) y la masa observada mediante la emigración en SDS-PAGE sugiere que ia forma secreta de la proteína puede de hecho reducirse en tamaño a aproximadamente 2500 a 3000 Da. Esto no es inesperado ya que la mayor parte de ias proteínas decretadas exhibe una reducción proteolítica en tamaño según pasan a través de cualquier maquinaria de secreción. Sin embargo, no hay un péptido de señal de tipo II aparente presente según el juicio de un análisis de la secuencia de aminoácido primaria del precursor de la proteína TIC900 (pTIC900).

EJEMPLO 6 Bioensayo de proteína TIC900 producida de la secuencia de codificación tic900 clonada Los sobrenadantes de cultivo de las cepas EG10650 y SIC9002 se aplicaba la superficie de la dieta del insecto como se describe aquí anteriormente. Se colocaron las primeras formas de lava del barrenador de maíz Europeo (ECB) huevos del gusano de tabaco (TBW) sobre dietas tratadas y se dejaron desarrollar durante una semana. Las larvas de insectos fueron visualmente evaluadas. La larva ECB y la larva TBW criadas con dieta no tratada o con dieta tratada con el sobrenadante EG10650 exhibieron un crecimiento normal. En contraste, la larva ECB y la larva criada con dieta tratada con el sobrenadante SIC9002 exhibieron una atrofia significativa. Esto resultados sugirieron que la proteína producida del expresión del gen tic900 clonado inhibió el crecimiento de la larva ECB y TBW.

EJEMPLO 7 Identificación de las cepas que contienen homólogos tic900 - - - Una sonda marcada DIG que abarca el marco de lectura abierto completo de la secuencia de codificación tic900 se preparó utilizando los siguientes iniciadores de amplificación térmica: 5'-gcgctagcatgaattcaaaggaacatgattatctaaaag-3', SEC ID NO:21 , y 5'-cgggctcgagctattcaacaggaataaattcaattttatcc-3', SEC ID NO:22. Se digirieron entre 1 y 5 gramos de ADN genómico de una colección de cepas Bt para completar con Hindlll y los fragmentos resultantes ser volverán a disolver como un cultivo en un gen de agarosa. En gel se utilizó en el procedimiento de Southern blot en el cual el ADN redisuelto se desnaturalizó, se transfirió a una membrana de nylon, se fijó y se expuso a la sonda marcada DIG descrita anteriormente. La hibridación se llevó a cabo en DIG Easy Hybe (Roche) a 42°C (DIG Easy Hybe a 42°C es equivalente a una hibridación a 42 grados centígrados severa con un sistema regulador de pH hibridación conteniendo 50% de formamida). Se realizaron los lavados moderadamente severos como sigue: 1 ) una vez durante cinco minutos y una vez durante 15 minutos a 25°C en 2X SSC, 0.1 % de SDS; y 2) dos veces durante 15 minutos cada 165°C en 0.5X SSC, 0.1 % de SDS. Se identificaron 13 cepas que contuvieron uno y tres fragmentos Hindlll que hibridizaron a la sonda tic900. El ADN de cada una de esta cepas se utilizó como una plantilla para la amplificación térmica de homólogos tic900. Los iniciadores establecidos como SEC ID NO:21 y SEC ID NO: 22 se utilizaron para amplificar los homólogos tic900 utilizando el kit de PCR de Alta Fidelidad de Expansión (Roche). Las condiciones de reacción de amplificación térmica consistieron de un volumen de 5 litros comprendiendo 200 M cada dNTP, 300 nM cada iniciador, 0.1-250 ng de plantilla de ADN genómica, y 2.6 unidades de mezclar enzima en regulador de reacción IX (suministrado por el fabricante con los reactivos en un concentrado 10X). Los ciclos amplificación térmica consistieron de un ciclo de 2 minutos a 94°C; diez ciclos de 15 segundos a 94°C, treinta segundos a 60°C, y 2 minutos a 72°C; seguidos por 25 ciclos de 15 segundos a 94°C, treinta segundos a 60°C, y los minutos a 72°C, incrementando cada uno de los últimos 25 ciclos en cinco segundos por ciclo; y una fase de extensión terminal de siete minutos a 72°C al final del último ciclo. El ADN de 9 de las 13 cepas sometidas a ésta reacción de amplificación térmica produjeron productos de amplificación (amplicones) que subsecuentemente se clonaron y se secuenciaron. Las secuencias de extremos 5' y 3' de los productos de amplificación térmica clonados se fijaron a través de las secuencias de los iniciadores y pueden no ser representativos de la secuencia del gen nativo a lo largo de la secuencia establecida por los iniciadores de amplificación. Independientemente, las secuencias de amplicón fueron sustancialmente las mismas según las secuencias nativas de longitud completa expresadas por el análisis de actividad insecticida. Un experto la técnica se dará cuenta que los amplicones se pueden utilizar como sondas para pescar las secuencias nativas de longitud completa que codifica las proteínas insecticida relacionadas con la proteína TIC900. Las proteínas codificadas por el marco de lectura abierto para cada producto de amplificación térmica y las cepas de las cuales y obtiene cada producto de amplificación térmica se obtuvieron como se indica en el Cuadro 1 , como se muestra continuación. Los iniciadores amplificación variantes y las condiciones de amplificación múltiples cambios utilizaron para identificar homólogos tic900 de la cepa EG3907 Bt activa CRW. El homólogo tic900 en EG3907 se representó a través de southern blot para facilitar el marco de lectura abierto codificara esta proteína. El homólogo tic900 en EG3907 tuvo un patrón de restricción Hindlll diferente de aquel del gen tic900 de EG5438. El homólogo EG3907 se identificó en un fragmento BamHl / Bglll de aproximadamente 13 kb. El ADN EG3907 digerido por BamHl / Bglll se ligó en los brazos del fago lambdaGEM-11 digeridos por BamHl. Los Southern blots de ADN de 30 cepas Bt adicionales exhibieron actividad CRW en el caldo de fermentación identificó dos cepas, EG3291 , EG3388, conteniendo ADN y hibridizó una sonda tic900 bajo condiciones severas. Ambas de esta cepas exhibieron patrones de restricción Hindlll idénticos, pero éstos fueron diferentes del patrón de restricción conteniendo la secuencia tic900 de la cepa EG5438 como se establece en SEC ID NO: 3, diferente del patrón de restricción conteniendo el homólogo identificado, estando presente en la cepa EG3907. El ADN (0.5 µg) de 132 cepas Bt se platicaron con puntos para membranas Nytran y se sondearon con una sonda de ADN tic900 bajo condiciones severas. El ADN de 15 de la cepas que exhibieron señales de hibridación tic900 más fuertes se analizaron adicionalmente. El ADN de cada una de las cepas se digirió para completar con Hindlll y se sometió al procedimiento Southern blot como se describió anteriormente. El ADN de varias de la cepas que parece que hibridiza en las representaciones por puntos, no exhiben señales de hibridación fuertes utilizando el método Southern blot. 14 de la cepas conteniendo las secuencias homologas al gen tic900 se han analizado utilizando Southern blots Hindlll. Con base en los perfiles de hibridación que aparecen utilizando la digestión Hindlll, por lo menos cuatro diferentes homólogos tic900 están presentes en esta cepas. Las siguientes cepas Bacillus thuringiensis exhiben fragmentos Hindlll que hibridiza en auna sonda a tic900 específica bajo condiciones de hibridación severas o específicas: EG3291 , EG3388, EG3879, EG3907, EG4090, EG4092, EG4293, EG4332, EG4577, EG4611 , EG4963, EG4971 , EG5023, EG5438, y EG5526. Esta cepas producen proteínas extracelulares que se pueden evaluar para actividad insecticida. Dependiendo de la cepa seleccionada, los fragmentos de hibridación varían en tamaño de aproximadamente 0.8 kb aproximadamente 6.3 kb. Se determinó la secuencia de nucleótido de cada fragmento que hibridiza a la sonda tic900, y los marcos de lectura abiertos se derivaron estas secuencias, cada una de las" cuales establece aquí como SEC ID NO: 5, SEC ID NO: 7, SEC ID NO: 9, SEC ID NO: 29, SEC ID NO:11 , SEC ID NO: 13, SEC ID NO:15, SEC ID NO: 17, y SEC ID NO: 19. La secuencia de aminoácido de una proteína comparable en tamaño con aquella de TIC900 se derivó de cada uno de los marcos de lectura abiertos, como se establece respectivamente en SEC ID NO: 6, SEC ID NO: 8, SEC ID NO:10, SEC ID NO: 30, SEC ID NO: 12, SEC ID NO: 14, SEC ID NO:16, SEC ID NO: 18, y SEC ID NO:20. Ésta secuencia de aminoácido derivada se designó respectivamente, TIC402, TIC403, TIC404, TIC434, TIC961 , TIC962, TIC963, TIC965, y TIC966. Como se establece en el Cuadro 1 , esta secuencia de nucleótidos se origina respectivamente de las siguientes cepas B. thuringiensis: EG3879 (TIC402), EG4332 (TIC403), EG4971 (TIC404), EG4090 (TIC961), EG4293 (TIC962), EG4611 (TIC963 y TIC434), EG5023 (TIC965), y EG4092 (TIC966). Se identificó una cepa adicional recibió una secuencia que hibridizó a la sonda tic900. La cepa EG5526 contuvo un fragmento Hindlll que aparentemente fue idéntico en tamaño al fragmento Hindlll Identificado como que codifica TIC402 de la cepa EG3879. El análisis de secuencia de ADN reveló el fragmento EG5526 contenido en ORF (TIC964) que fue idéntico en secuencia aquella de ORF tic402. Las cepas de B. thuringiensis Acrystalliferous conteniendo los plásmidos que codifican estos homólogos clonados de tic900 se-sometieron cada uno al bioensayo de insecto y se determinó que exhiben bioactividad insecticida. Existe un alto grado de identidad entre las secuencias que codifican las proteínas de la presente invención. De hecho, una alineación de marcos de lectura abierto incluyendo cada uno de los genes tic revela que ninguno de los ORF's son menos aproximadamente 97% idénticos no con el otro. Una alineación de la secuencia de aminoácidos codificada por cada uno--de los ORF's también indica que existe un alto grado de identidad entre las proteínas de la presente invención. TIC962 y TIC963 son las más distantemente relacionadas, pero aún estrechamente relacionadas en que exhiben una identidad mayor de 96% con el nivel de la secuencia de aminoácido. Muchos cambios a la secuencia de nucleótido para cualquier cambio dado en cualquier ORF con relación a una secuencia de consenso establecida con base en una alineación de todas las secuencias de nucleótido los indica que los cambios son silenciosos y que afectan solamente la tercera base en un codón y resultan más a menudo en una modificación en la secuencia de aminoácidos codificada. Los subcultivos de la -cepas EG5438 de B. thuringiensis conteniendo el gen tic900 nativo, y SIC9002 conteniendo la secuencia de codificación tic900 clonada se depositaron en la colección permanente de Agricultural Research Service Culture Collection, Northern Regional Research Laboratory (NRRL), U. S. Department of Agriculture (USDA), 1815 North University Street, Peoría, IL. 61604, USA. La cepa SIC9002 de ß. thuringiensis ser depositó el 25 de abril de 2002, y provista con el número de registro NRRL, No. NRRL B-30582. La cepa EG5438 de B. thuringiensis ser depositó el 3 de mayo del 2002, y se provee con el número de registro NRRL No. NRRL B-30584.

EJEMPLO 8 Genes que codifican proteínas insecticidas quiméricas Este ejemplo ilustra en la clase TIC900 de proteínas exhiben similitudes con la clase Cryl de proteínas insecticidas Bt y que una proteíná quiméricas se puede construir toda una parte de una proteína de clase TIC900 enlazada en marco con toda o parte de la proteína Cryl y probase para actividad insecticida. La comparación de cualquiera de las clases de proteína TIC900 descritos aquí con otras proteínas insecticidas ßf sugieren que estas proteínas están más estrechamente relacionadas con las clases de proteínas Cryl , y en particular con la porción insecticida de las proteínas Cryl. La clase de proteínas TIC900 exhiben similitudes estructurales con las porciones de toxina de proteína Cryl en que las proteínas Cry! exhiben una estructura de dominio que consiste de un primer dominio que consiste los primeros 200 aproximadamente los primeros 240 aminoácidos terminales y- son referidos como dominio I, un segundo dominio que consiste de aproximadamente 240 aminoácidos a aproximadamente 400 aminoácidos, que son referidos como dominio romano, y un dominio carboxi -terminal referido como el dominio lll que consiste de aminoácidos de aproximadamente 400 residuos al extremo del dominio de toxina. La clase de proteínas TIC900 parece que exhibe este tipo de estructura de dominio aún cuando la clase de proteínas TIC900 generalmente no es tan larga como la mayor parte de los dominios de toxina Cryl. Se ha demostrado previamente en los dominios de toxina Cryl se pueden funcionar con estructuras de péptido de protoxina heterólogas, y que las funciones darán como resultado la formación de cristales, y por lo general también retienen la bioactividad insecticida cuando los cristales resultantes se prueban envío ensayos. Se construyó una proteína de fusión (SEC ID NO: 24, TIC109) en donde TIC900 se funcionó con el estructura de péptido de protoxina CrylAc. La proteína de fusión se expresó a partir de la secuencia de nucleótido como se establece en SEC ID NO: 23 en pMON74119 en la cepa EG10650 ß. thuringiensis (la cepa recombinante designada como SIC1047). SEC ID NO: 23 corresponde una secuencia de codificación TIC900 de la posición 1-1809 fue de nucleótido, y una secuencia de codificación del dominio de protoxina CrylAc de la posición 1816-3504 de nucleótido. La proteína quimérica TIC109 formada en las inclusiones cristalinas" producidas de fermentaciones SIC1047, que se probaron envío ensayos contra el gusano de tabaco, el gusano de maíz, y gusano de polilla del otoño. La proteína quiméricas exhibió una bioactividad similar a aquella exhibida por TIC900, pero no fue biológicamente activa contra el gusano de polilla del otoño. TIC110 (SEC ID NO: 26) codificada por la secuencia de nucleótido como se establece en SEC ID NO: 25 es una proteína insecticidas quimérica CrylF/TIC900 enlazada a una secuencia de péptido de protoxina CrylAc. SEC ID NO:25 corresponde a una secuencia que codifica el dominio I CrylF de aproximadamente la posición 1-723 de nucleótido, una secuencia que codifica los dominios II y lll TIC900 de la posición 724- 1809 de nucleótido, y una secuencia de codificación CrylAc de la posición 1810-3510 de nucleótido. Esta proteína se puede expresar en la cepa de ßf acrystalliferous y las inclusiones de proteína cristalina probadas en bioensayos para determinar actividad biológica contra varias especies de plagas de lepidópteros. TIC111 (SEC ID NO: 28) se codifica por la secuencia de nucleótido como se establece en SEC ID NO:27. TIC111 corresponde a una proteína quiméricas insecticida que consiste de un dominio I CrylAc enlazado los dominios II y lll TIC900, este enlazado a un dominio de protoxina CrylAc . TIC111 se puede expresar a partir de pMON74122 e inclusiones de la proteína cristalina probadas en el bioensayo para actividad contra varias especies de plagas de lepidópteros. pMON74122 se transformó en la cepa EG10650 "de Bt acrystalliferous dando como resultado la célula huésped transformada SIC1049 que expresar la proteína TIC111. Los cristalesTIC111 se recolectaron se probaron en bioensayo contra la alarma de polilla negra (BCW), la polilla respalda de diamante (DBM), el gusano de tabaco (TBW), el gusano de maíz (CEW), y la alarma de polilla del otoño (FAW). La bioactividad insecticida se observó para BCW, DBM y TBW, consistente con ia bioactividad insecticida para TIC900. En resumen, la descripción anteriormente detallada describe la presente invención. Se entenderá por aquellos expertos en la técnica que, sin apartarse del espíritu y alcance de la ¡nvención y sin una experimentación indebida, la presente invención se puede llevar a cabo dentro de una amplia escala de parámetros equivalentes. Ya que la presente invención ha sido descrita en conexión con modalidades específicas de la misma, se entenderá que es capaz de modificaciones adicionales. La presente invención pretende incluir cualesquiera usos, variaciones o adaptaciones de la invención siguiendo los principios de la invención general. Son posibles varias permutaciones y combinaciones de los elementos provistos en toda la reivindicaciones que siguen y caen dentro del alcance de esta invención. La referencia la palabra "comprendiendo" o "comprende" o "se comprende" ya sea en el lenguaje de la reivindicaciones o en la especificación pretende ser definida como un término o términos que significan- "incluye al menos". Todas las publicaciones y patentes mencionadas en esta especificación se incorporan aquí por referencia como si cada publicación o patente individual fue especialmente individualmente manifestada como estando incorporada por referencia.

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Claims (20)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1.- Un polinucleótido aislado que codifica una proteína de toxina insecticida Bacillus thuringiensis o fragmento insecticida de la misma, activa contra una plaga de insectos lepidópteros, en donde dicha proteína de toxina insecticida comprende una secuencia de polipéptido que tiene por lo menos alrededor de 80% de identidad con una secuencia de polipéptido seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO: 4 (TIC900), SEC ID NO:6 (TIC402), SEC ID NO: 8 (TIC403), SEC ID NO:10 (TIC404), SEC ID NO: 30 (TIC434), SEC ID NO: 12 (TIC961 ), SEC ID NO: 14 (TIC962), SEC ID NO:16 (TIC963), SEC ID NO: 18 (TIC965) y SEC ID NO:20 (TIC966), o una variante de toxina insecticida activa de lepidóptero o una porción de la misma.

2.- El polinucleótido aislado de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque dicha proteína de toxina insecticida comprende una secuencia de polipéptido seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO: 4 (TIC900), SEC ID NO:6 (TIC402), SEC ID NO: 8 (TIC403), SEC ID NO:10 (TIC404), SEC ID NO:30 (TIC434), SEC ID NO:12 (TIC961 ), SEC ID NO:14 (TIC962), SEC ID NO:16 (TIC963), SEC ID NO:18 (TIC965) y SEC ID NO: 20 (TIC966), o una variante de toxina insecticida activa de lepidóptero o una porción de la misma.

3.- El polinucleótido aislado de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado además porque dicha plaga de insecto lepidóptero se selecciona del grupo que consiste de un Noctuidae, un Tortrlcidae, Epinotia aporema, Anticarsia gemmatalis, Pseudoplusia incíudens, el Barrenador de Maíz Europeo, un gusano de tabaco (TBW), una larva de polilla negra (BCW), y una polilla de espalda de diamante (DBM).

4.- El polinucleótido aislado de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque dicha toxina tiene un peso molecular entre aproximadamente 65 kDa y aproximadamente 70 kDa, y en donde dicha toxina insecticida se selecciona del grupo que consiste de SEC ID NO: 4 (TIC900), SEC ID NO: 6 (TIC402), SEC ID NO: 8 (TIC403), SEC ID NO:10 (TIC404), SEC ID NO:30 (TIC434), SEC ID NO: 12 (TIC961), SEC ID NO: 14 (TIC962), SEC ID NO:16 (TIC963), SEC ID NO:18 (TIC965) y SEC ID NO: 20 (TIC966).

5.- El polinucleótido aislado de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado además porque dicho polinucleótido aislado está presente en -un vector de plásmido.

6.- El polinucleótido aislado de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque dicha secuencia de nucleótido ha sido optimizada para la expresión en plantas.

7.- El polinucleótido aislado de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado además porque dicha secuencia de nucleótido (a) ia expresión en plantas monocotiledóneas, dicha optimización comprende uno o más de los pasos seleccionados del grupo que consiste de (i) remover las secuencias de poliadenilación, (ii) ajustar el contenido A y t de la secuencia de nucleótido para ser de aproximadamente 40% a aproximadamente 49% sin modificar la secuencia de aminoácido de la proteína, y (iii) modificar los codones en la secuencia de codificación para ser consistente con los pasos (i) y (ii), o (b) la expresión en una planta dicotiledónea, dicha optimización comprende uno o más de los pasos seleccionados del grupo que consiste de (i) remover las secuencias de poliadenilación, (ii) ajustar el contenido A y t de la secuencia de nucleótido para ser de aproximadamente 40% a aproximadamente 49% sin modificar la secuencia de aminoácido de la proteína, y (¡ii) modificar los codones en la secuencia de codificación para ser consistente con los pasos (i) y (ii).

8.- Una proteína insecticida de Bacillus thuringiensis aislada seleccionada del grupo que consiste de TIC900, TIC402, TIC403, TIC404, TIC434, TIC961 , TIC962, TIC963, TIC965, y TIC966.

9.- La proteína aislada de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada además porque dicha Bacillus thuringiensis se selecciona del grupo que consiste de EG5438, EG3879, EG4332, EG4971 , EG4090, EG4293, EG4611 , EG5526, EG5023 y EG4092.

10.- Una célula huésped transformada para contener un polipéptido que codifica una proteína insecticida o fragmento insecticida de la misma como se establece en SEC ID NO: 4, SEC ID NO: 6, SEC ID NO:8, SEC ID NO: 10, SEC ID NO: 30, SEC ID NO: 12, SEC ID NO: 14, SEC ID NO: 16, SEC ID NO:18, o SEC ID NO: 20, en donde dicho polipéptido comprende (1 ) una secuencia de nucleótido seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO: 3, SEC ID NO: 5, SEC ID NO: 7, SEC ID NO: 9, SEC ID NO: 29, SEC ID NO:11 , SEC ID NO:13, SEC ID NOJ5, SEC ID NO:17, y SEC ID NO:19, o (2) a secuencia de nucleótido que exhibe de aproximadamente 60% a aproximadamente 85% de identidad de secuencia de nucleótido seleccionad del grupo que consiste de SEC ID NO: 3, SEC ID NO: 5, SEC ID NO: 7, SEC ID NO: 9, SEC ID NO: 29, SEC ID NO:11 , SEC ID NO: 13, SEC ID NO: 15, SEC ID NO:17, y SEC ID NO:19.

11.- La célula huésped de conformidad con la reivindicación 10, caracterizada además porque dicha célula huésped es una célula de planta.

12.- Un método para controlar una plaga de insecto lepidóptero que comprende poner en contacto dicha plaga con una cantidad de pesticida de aproximadamente 65 kDa a aproximadamente 70 kDa de proteína de toxina Bacillus thuringiensis o un fragmento insecticida de la misma, en donde dicha proteína de toxina comprende una secuencia de polipéptido seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO: 4, SEC ID NO: 6, SEC ID NO: 8, SEC ID NO: 30, SEC ID NO:10, SEC ID NO:12, SEC ID NO:14, SEC ID NO.J6, SEC ID NO.J8, y SEC ID NO:20.

13.- El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizada además porque dicha proteína de toxina se codifica a través de una secuencia de nucleótido que hibridiza bajo condiciones severas a una secuencia de nucleótido que comprende al menos 18 nucleótidos consecutivos seleccionados del grupo que consiste de SEC ID NO: 3, SEC ID NO: 5, SEC ID NO: 7, SEC ID NO: 9, SEC ID NO: 29, SEC ID NO:11 , SEC ID NO: 13, SEC ID NO: 15, SEC ID NO:17, y SEC ID NO:19.

14.- Un método para detectar una secuencia de nucleótido en una muestra, dicho método comprende los pasos de (a) seleccionar un par de iniciadores de nucleótido para uso en la producción de un amplicón de dicha secuencia de nucleótido a partir de una alineación de secuencias de polinucleótido seleccionadas del grupo que consiste de SEC ID NO:3, SEC ID NO: 5, SEC ID NO: 7, SEC ID NO:9, SEC ID NO:29, SEC ID NO:11 , SEC ID NO: 13, SEC ID NO: 15, SEC ID NO: 17, SEC ID NO:19; (b) producir un amplicón de dicha secuencia de nucleótido en dicha nuestra; y (c) detectar dicho amplicón.

15.- La célula huésped de conformidad con la reivindicación 11 , caracterizada además porque comprende una célula de planta de maíz, una célula de planta de trigo, una célula de planta de arroz, una célula de planta de avena, una célula de planta de cebolla, y una célula de planta de pasto; y en donde dicha célula de planta dicotiledónea comprende una célula de planta de algodón, una célula de planta cánola, una célula de planta de fríjol de soya, una célula de planta de tabaco, una célula de planta de árbol frutal, una célula de planta de crucifera, una célula de planta de pimiento, una célula de planta ornamental, una célula de planta de girasol, una célula de planta cucurbitácea, y una célula de planta de melón.

16.- Un método para expresar una proteína de toxina activa de lepidóptero en una planta, que comprende los pasos de: (a) insertar dentro del genoma de una célula de planta una secuencia de ácido nucleico que comprende en la dirección 5' a 3' una molécula de ADN de estructura" de cadena doble, recombinante operablemente enlazada, en donde la una molécula de ADN de estructura de cadena doble, recomblnante comprende: (i) un promotor que funciona en una célula de planta; (ii) una secuencia de nucleótido que codifica una secuencia de aminoácido insecticida como se establece en SEC ID NO: 4,SEC ID NO:6, SEC ID NO:8,SEC ID NO: 30, SEC ID NO: 10, SEC ID NO:12, SEC ID NO: 14, SEC ID NO:16, SEC ID NO:18, o SEC ID NO:20; y (iii) una secuencia de nucleótido 3' no traducida que funciona en las células de ia planta para causar la terminación de la transcripción; (b) obtener una célula de planta transformada que contiene una secuencia de ácido nucleico del paso (a); y (d) generar a partir de dicha célula de planta transformada una planta que expresa la proteína de toxina activa de lepidóptero en la planta transformada.

17.- Una semilla de la planta transformada de la reivindicación 16, en donde dicha semilla comprende dicha secuencia de ácido nucleico.

18.- Una progenie de la semilla de la reivindicación 17, en donde dicha progenie comprende dicha secuencia de ácido nucleico.

19.- Una planta transformada de la reivindicación 16, en "donde dicha célula de planta es (a) una célula de planta monocotiledónea que comprende una célula de planta de maíz, una célula de planta de trigo, una célula de planta de arroz, una célula de planta de avena, una célula de planta de cebolla, y una célula de planta de pasto, o (b) una célula de planta dicotiledónea que comprende una célula de planta de algodón, célula de planta de cánola, una célula de planta de fríjol de soya, una célula de planta de tabaco, una célula de planta del árbol frutal, una célula de planta crucifera, una célula de planta de pimiento, una célula de planta ornamental, una célula de planta de girasol, una célula de planta cucurbitácea, y una célula de planta de melón.

20.- Una muestra biológica derivada de los tejidos o semillas de la planta de la reivindicación 18, en donde la muestra comprende una cantidad detectable de dicha secuencia de nucleótido.