KR20080052623A - 살충 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열들 - Google Patents

Abstract

본 발명은 Cry1A.150 살충제로 지칭되는 신규의 살충단백질, 인시류 억제 활성을 나타내는 살충단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열들, 상기 살충을 발현하는 유전자도입 식물, 및 생물학적 시료 내에서 상기 뉴클레오티드 서열들 또는 상기 살충제의 존재를 검출하기 위한 방법들을 제공한다.

인시류, 살충단백질

Description

살충 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열들{Nucleotide Sequences Encoding Insecticidal Proteins}

본 발명은 식물들에서 사용하기 위한 신규의 코딩서열들을 제공한다. 상기 코딩서열들은 광범위한 인시류종(lepidopteran species) 작물 해충들에 대해 독성이 있는 키메릭 살충 단백질을 암호화한다.

천연유래의 바실러스 투린지엔시스(B. thuringiensis ) 분리물의 상업적 제제는 농업 해충의 생물학적 조절을 위하여 오랫동안 사용되어 왔다.

바실러스 투린지엔시스(Bacillus thuringiensis ) 종들의 발효로부터 얻어진 Bt 포자들과 결정들은 전통적인 농업방식에 따라서 엽면살포(foliar application)를 위해 농축되어 제제화되었다.

Cry1 결정 단백질과(family)에 속하는 물질들은 인시류 유충에 대해 생물학적 활성을 나타내는 것으로 알려져 있고, 인시류 해충 억제를 위한 약제로서 유용하다. Cry1 δ-엔도톡신의 전구체 형태는 두 개의 거의 동일한 크기로 된 세그먼트로 이루어진다. 전구체 단백질 카르복시 말단 부분, 또는 프로-톡신 세그먼트는 결정형성을 안정화시키고, 살충활성을 전혀 나타내지 않는다. 전구체 단백질의 나머지 반의 아미노말단은 Cry1 단백질의 톡신 세그먼트를 포함하고, Cry1과(family) 멤버들 내에 보존되거나 또는 실질적으로 보존된 서열들의 정렬에 기초하여, 3개의 구조적 도메인들로 더 세분될 수 있다. 이들 3개의 서브-도메인들은 Cry1A δ-엔도톡신의 3차원적 결정학적인 구조모델에 기초를 두고 있고, 여기에서 상기 3개의 서브-도메인들은, 단백질 톡신 세그먼트의 아미노 말단으로부터 측정되는 바에 따라,각각 도메인I, 도메인II 및 도메인III으로 언급된다.

도메인I은 활성톡신 세그먼트의 약 1/3을 포함하고, 채널형성을 위해 필수적인 것으로 알려져왔다(톰슨 등, 1995). 도메인II와 III은 각각 거의 중앙과 활성 톡신 부분의 카르복시말단 세그먼트들을 포함한다. 도메인II와 III은 모두, 시험 곤충과 δ-엔도톡신에 따라서, 수용체 결합과 곤충종 특이성에 관련되어있다.(톰슨 등, 1995).

당분야에 공지된 수많은 천연의 살충 결정 단백질들의 도메인 구조들의 재분류를 통해서, 향상된 특성들을 지닌 키메릭 단백질을 임의로 생산하기는 어렵다. 이는 단백질구조, 폴딩, 올리고머화 반응, 및 키메릭 전구체(만일 이러한 형태로 발현된다면)의 살충성 톡신 세그먼트를 방출시키기 위한 정확한 단백질 분해공정을 포함하는 활성화과정의 복잡한 성질에 따른 결과이다. 키메릭 구조체내에 포함시키기 위한 각각의 모단백질 내에 존재하는 특정 목표 영역에 대한 신중한 선택에 의해서만, 기능성 살충톡신을, 키메라가 파생되는 모단백질의 살충활성에 비해 향상된 살충활성을 나타내도록 구조화할 수 있다. 실험결과는, 톡신 도메인의 재조합, 즉 서로 다른 어느 둘 또는 그 이상의 톡신들로부터 도메인I, II, 및 III으로 이루어진 키메릭 톡신을 조합함으로써 결정형성에 결함이 있고, 그리고/또는 목표로한 해충종에 대하여 검출가능한 살충활성이 완전히 결핍된 단백질이 구성된다는 것을 보여주었다.

몇 가지의 예들에서, 키메릭 톡신은 우수한 결정형성성을 나타낼 수 있지만, 여전히 검출가능한 살충활성을 나타내지는 못하고 있다. 오직 시행착오에 의해서만이 효과적인 살충키메라들이 조제되고, 그런 경우에 조차도, 당업자들은 그 키메라의 구성성분들이 파생될 수 있는 어떤 단일의 모단백질과 비교하여 동등하거나 향상된 살충활성을 나타내는 키메라인지를 확신하지 못한다.

문헌에는 둘 또는 그 이상의 Bt 살충 결정 단백질의 전구체들로부터의 키메릭 단백질의 구조 또는 조합체의 예들이 보고되어 있으나 , 그 전부가 키메라가 파생된 전구체 단백질과 비교하여 동등 또는 향상된 살충성 또는 결정형성성을 나타내지는 못했다. (보쉬 등(WO95/06730); 톰슨 등(WO95/30753); 톰슨 등(WO95/30752); 말바르 등(WO98/22595); 질로이 등(미국특허 제5,128,130호); 질로이 등(미국특허 제5,055,294호); 리 등(1992) Gene 267:3115-3121; 호네 등(1991) Mol. Microbiol. 5:2799-2806; 슈네프 등(1990), J. Biol. Chem. 265:20923-20930; 펄락 등(1990) Bio/Technol. 8:939-9943; 펄락 등(1993) Plant Mol. Biol. 22:313-321).

유전자도입 옥수수 식물들에서의 바실러스 투린지엔시스(B. thuringiensis) δ-엔도톡신의 발현은 농업적으로 중요한 해충들을 억제하는 효과적인 수단인 것으로 판명되었다(펄락 등 1990;1993). 바실러스 투린지엔시스(B. thuringiensis ) δ-엔도톡신들을 발현하는 유전자도입 작물들은 재배자에게 국부적으로 도포되는 화학 적 살충제들의 적용과 관련된 시간과 비용들을 상당히 감소시켜줄 수 있다. 바실러스투린지엔시스(B. thuringiensis ) δ-엔도톡신을 암호화하는 도입유전자의 사용은 특히 유리하다. 곤충 고밀도지역에서 바실러스 투린지엔시스(B. thuringiensis ) δ-엔도톡신을 발현하는 옥수수 식물들은 유사한 상업적 비-유전자도입 식물변종들보다 개선된 수득율을 나타낸다.

그러나, 유전자도입 식물들에서 발현된 바실러스 투린지엔시스(B. thuringiensis ) δ-엔도톡신에 대한 곤충의 내성이 점점 강해질 것으로 예상된다. 이러한 내성이 널리 확산되게 된다면, 바실러스 투린지엔시스(B. thuringiensis ) δ-엔도톡신과 같은 암호화 유전자들을 포함하는 배원질의 상업적 가치는 명백히 제한될 것이다. 목표 해충에 대한 유전자도입 살충의 효과를 증가시키면서 동시에 살충제 내성이 있는 해충들의 성장을 감소시키는 하나의 가능한 방법은 유전자도입 작물들이 고수준으로 바실러스 투린지엔시스(B. thuringiensis ) δ-엔도톡신들을 발현하는 것을 확실하게 하는 것이다(McGaughey와 Whalon 1993; Roush 1994). 게다가, 해충군에 대해 효과적이고, 상이한 작용방식으로 효과를 나타내는 살충유전자들의 저장소를 갖는 것은 내성의 성장을 차단할 수 있다. 식물 내에서, 동일한 곤충종에 대해 독성이 있는 둘 또는 그 이상의 살충조성물의 발현은, 각각의 살충제가 내성의 개시를 효과적으로 지연시키기에 충분한 고수준으로 발현되는 경우, 내성의 성장을 억제할 수 있는 또 다른 방법이 될 것이다.

그러한 조합들에서 유용한 살충들의 예로서는, 제한되지는 않지만, Bt 톡신, 제노르하브더스 종(Xenorhabdus sp.) 또는 포토하브더스 종(Photorhabdus sp.) 살충단백질, 탈-알레르겐화 파타틴 단백질 및 탈-글리코실화 파타틴 단백질 및/또는 퍼뮤테인, 식물 렉틴(lectins) 등을 포함한다. 동일한 식물 내에서 다수의 살충 활성 단백질들의 공동-발현 및/또는 바람직하지 못한 식물형태학적 효과들을 야기하지 않는 살충단백질들의 고도의 발현을 달성하는 것은 어렵다.

바실러스 투린지엔시스(Bacillus thuringiensis)종들로부터 동정된 소량의 250개 이상의 개별적인 살충단백질들이 식물에서의 발현을 위해 시험되었다. 몇 개의 Cry1's, Cry3's, Cry2Aa 및 Cry2Ab, 바이너리 톡신 Cry33/34 및 Cry23/37, 및 Cry9는 식물에서 성공적으로 발현되었다. Cry1 단백질들은 식물들에서 발현된 가장 큰 부류의 단백질들을 대표하나, 어느 것도 고수준으로 발현되지는 못했다. 바람직하지 못한 식물독성효과들을 피하기 위해 Cry2Ab를 엽록체에 타깃팅 할 필요가 있었다. 경작된 대부분의 재조합 식물에서 Cry1A 단백질이 발현한다. 목표 해충종에 의한 Cry1A 단백질들에 대한 내성 개시의 가능성은 내성관리 대립형질 유전자가 cry1 대립형질 유전자와 함께 발현되거나 또는 cry1 대립형질 유전자가 고수준으로 발현된 경우보다 실질적으로 더 높다. 따라서 유전자도입 곤충 저항 식물의 1세대 및 2세대에서 현재 사용되고 있는 톡신 유전자들에 대한 보충물 및 대체물로서 식물에서의 발현을 위한 대체 톡신유전자들이 개발되는 것이 바람직하다.

발명의 요약

본 발명은 인시류 곤충억제성을 나타내는 살충단백질을 암호화하는, 식물내에서의 발현을 위한 분리된 뉴클레오티드 서열들을 제공한다. SEQ ID NO:1은 Cry 1A.105 유전자로 이루어진 그러한 뉴클레오티드 서열들의 예이고, 이는 곤충억제 Cry1A.105단백질을 암호화한다.

SEQ ID NO:1은 SEQ ID NO:3에 유사하고, 양자 모두 Cry1A.105 단백질을 암호화한다. SEQ ID NO:1은 쌍떡잎세포들에서 유용한 반면에 SEQ ID NO:3는 단자엽식물 세포들에서 유용하다. SEQ ID NO:4는 SEQ ID NO:3로부터 암호화되고 SEQ ID NO:2와 아미노산 서열에서 동일하다. 상기 분리된 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO:1으로 표시되는 서열에 대해 적어도 약 88%~약 90% 또는 그 이상의 뉴클레오티드 서열 동일성을 나타내거나 또는 엄격한 혼성화 조건하에서 SEQ ID NO:1에 혼성화되는 서열을 포함하는 것을 의미한다. 또한 상기 분리된 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO:3의 서열에 대하여 적어도 약 90%의 뉴클레오티드 서열 동일성을 나타내거나 또는 엄격한 혼성화 조건하에서 SEQ ID NO:3에 혼성화되는 서열을 포함하는는 것을 의미한다.

또한 본 발명은 인시류 곤충종에 대한 억제활성을 나타내는 분리되고 정제된 살충단백질을 제공한다. 여기에서 상기 살충단백질은 적어도 Cry1A.105의 톡신 부분으로서 지칭되고, SEQ ID NO:2로 표시되는 아미노산 서열을 나타낸다. SEQ ID NO:2로 표시되는 약 1177개 아미노산들로 이루어진 전장의 전구체 단백질은 또한 살충 Cry1A.105 단백질로서 언급되지만, 살충제 생활성을 나타내는 상기 전구체 단백질의 어떤 단편이 살충 Cry1A.105 단백질로서 언급될 수 있고, 이는 적어도 SEQ ID NO:2로 표시되는 아미노산 약 1~612의 아미노산 서열 세그먼트에 상응하는 Cry1A.105 살충단백질을 포함하고, 또한 아미노산 약 2~610의 세그먼트를 포함할 수 있다. 살충성에 효과적인 양의 살충단백질로 이루어진 조성물도 본 발명의 범위 내에 포함된다.

또한 본 발명은 숙주세포 내에서 SEQ ID NO:2로 표시되는 살충 단백질을 발현하는데 사용하기 위한 발현 카세트를 제공한다. 상기 발현카세트는 그것에 연결된 숙주세포 내에서 기능하는 프로모터를 포함하고, Cry1A.105 단백질의 살충성 세그먼트를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 발현을 조절한다. 여기에서, 각각 쌍자엽 식물세포 또는 단자엽 식물세포에서 사용되는 SEQ ID NO:5와 SEQ ID NO:7로 표시되는 예시적인 발현카세트가 제공된다. 상기 프로모터와 코딩서열은 숙주세포 내에서 작동가능하게 연결되어 함께 기능한다. 발현카세트는 어떤 숙주세포 내에서도 사용할 수 있지만, 박테리아 세포, 균류 세포, 포유동물 세포, 또는 식물세포 내에서의 사용이 바람직하다. 박테리아 세포들은 바실러스(Bacillus)종 세포, 엔테로박테리아캐(Enterobacteriacae)종 세포, 슈도모나스(Pseudomonas)종 세포, 클로스트리디움( Clostridium)종 세포와 리조비움(Rhizobium)종 세포, 및 아그로박테리움(Agrobacterium)종 세포로 이루어진 군으로부터 선택하는 것이 바람직하다. 숙주세포가 식물세포라면, 작물종의 식물세포, 바람직하게는 쌍자엽식물세포 또는 단자엽식물세포들로부터 선택되는 세포가 바람직하다. 쌍자엽식물세포들의 예로서는 자주개자리, 사과, 살구, 아스파라거스, 콩, 장과(berry), 검은나무딸기, 월귤나무열매, 캐놀라, 당근, 꽃양배추, 샐러리, 버찌, 이집트콩, 감귤류나무, 목화, 광저기(cowpea), 덩굴월귤열매, 오이, 조롱박, 가지, 과수, 포도, 레몬, 상추, 아마씨, 메론, 겨자, 호두나무, 오크라(okra), 오렌지, 완두, 복숭아, 땅콩, 배, 자두, 감자, 대두, 호박, 딸기, 사탕무, 해바라기, 고구마, 담배, 토마토, 순무와 야채를 들 수 있다. 단자엽식물세포들의 예들은 옥수수, 밀, 귀리, 쌀, 사탕수수, 마일로(수수일종), 메밀, 호밀, 풀(김의털(fescue), 큰조아재비(timothy), 브롬(brome), 새발풀(orchard), St.오그스틴(St. Augustine)), 버뮤다(bermuda), 겨이삭띠)와 보리를 들 수 있다.

식물세포에 사용되기 위한 발현카세트는 전형적으로 Cry1A.105 살충단백질과 같은, 의도된 물질의 발현의 수준과 효율을 통제하는, 작동가능하게 연결된 서열들을 포함한다. 이러한 서열들은 발현강화서열, 미번역리더서열, 인트론서열, 엽록체 타깃팅 펩티드암호화서열, 및 전사종료 및 폴리아데닐화서열일 수 있다.

발현카세트는, 바람직하게는 숙주세포 내에서 Cry1A.105 암호서열의 유지를 안정화하기 위한 용도의 벡터 내로 혼입된다. 벡터는 당 분야에서 공지된 어떤 구조일 수 있지만, 전형적으로는 발현카세트가 숙주세포 내로 혼입되기 전에 그곳으로 구성 또는 삽입되는 플라스미드 또는 레프리콘이다. 벡터는, 제한되지는 않지만, 플라스미드, 코스미드, 백미드, 파아지미드, YAC, BAC, 자해벡터, 삽입서열, 트랜스포존, 또는 발현카세트가 연결되거나 혹은 발현카세트가 삽입되는 선형 뉴클레오티드 서열을 포함한다.

인시류 곤충의 만연에 대해 저항성을 갖는 유전자도입식물은 본 발명의 구체예이다. 그러한 식물들은 적어도 SEQ ID NO:2에서 나타낸 아미노산 약 2~약 612에 이르는 Cry1A.105 살충단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 상기 유전자도입식물은 잎말이나방(leaf rollers), 야도충(cutworms), 거염벌레(armyworms), 나무좀(borers), 도롱이벌레(bagworms), 및 사료 먹는 벌레(forage feeder)와 같은 곤충들에 의해 초래되는 인시류 곤충의 만연을 조절하는데 있어서 효과적이다. 바람직한 해충들은 구체적으로 가을거염벌레(fall armyworms), 유럽 옥수수잎 나무좀(European corn borers), 큰담배밤나방(corn earworms, 목화씨벌레(cotton bollworms)와 동일), 사우스웨스턴 옥수수잎 나무좀(southwestern corn borers), 및 검은 야도충(black cutworms)들이다.

본 발명은, Cry1A.105 살충 세그먼트를 암호화하는 본 발명의 뉴클레오티드 서열이 식물, 그 자손, 종자 등의 세포의 유전성 및/또는 색소체 게놈내에 유지되는 한, 본 발명의 유전자도입식물로부터 수확된 자손과 종자, 과일들, 또는 그 생성물을 포함한다.

또한 본 발명은 살충 효과량의 살충 Cry1A.105 단백질을 포함하는 조성물을 해충의 먹이에 공급함으로써 식물의 인시류 곤충의 만연을 조절하는 하나 이상의 방법들을 제공한다. 하나의 그러한 조성물은 SEQ ID NO:2에서 나타낸 Cry1A.105 아미노산 서열의 살충 세그먼트를 암호화하는 핵산서열로 형질전환된 식물세포의 자손이거나 혹은 자손이었던 식물세포일 수 있다.

Cry1A.105 살충 아미노산서열을 암호화하는 서열을 포함하는, SEQ ID NO:5와 SEQ ID NO:7로 예시적으로 표시되는 발현카세트를 포함하도록 형질전환된 식물세포로부터 생성된 유전자도입식물은 곤충의 먹이내에 살충조성물을 제공하기 위한 한 가지 수단일 수 있다. 또 다른 수단은 박테리아세포 또는 균류세포 내에서 살충 효과량의 Cry1A.105 단백질을 생성시키고, Cry1A.105 단백질에 민감한 하나 이상의 목표 해충들의 먹이에 상기 박테리아 세포 또는 균류세포 또는 정제된 양의 Cry1A.105 단백질을 제공하는 것일 수 있다.

생물학적 시료 내에서, Cry1A.105 아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 동정하는 방법이 제공된다. 이 방법은 Cry1A.105 코딩서열의 존재를 시험하기 위한 시료를 Cry1A.105 코딩서열에 대해 특이적으로 결합하는 폴리뉴클레오티드 프로브와 접촉시키는 것으로 이루어진다. 특히, 상기 프로브서열은 엄격한 혼성화조건하에서 Cry1A.105 코딩서열에 결합 또는 혼성화된다. 반응혼합물 내에서의 결합을 검출하므로써 Cry1A.105 코딩서열의 존재를 진단한다.

또한 시료 내의 Cry1A.105 단백질의 살충 단편을 동정하는 방법이 제공된다. 이 방법은 Cry1A.105 살충 단편의 존재를 시험하기 위한 시료를 상기 살충 단편에 대해 특이적으로 결합하는 항체와 접촉시키는 것으로 이루어진다. 반응혼합물 내에서의 결합을 검출하므로써 시료 내의 Cry1A.105 단백질의 존재를 진단한다.

또한 키메릭 살충단백질 또는 혼성(hybrid) 살충단백질들도 제공된다. 이러한 혼성 살충단백질들은 두 개 이상의 상이한 살충단백질들을 포함하고, 이들 각각은 동종의 곤충 중 적어도 어느 하나에 대해 살충활성을 나타낸다. 혼성 살충단백질은 상이한 살충단백질들의 각각의 부분들로 구성된다. 혼성 살충단백질을 구성하는데 사용된 살충단백질들의 세그먼트들은 상이한 살충 단백질들의 어느 하나를 구성하는 연속되는 아미노산들로부터 선택된 적어도 약 50개~적어도 약 200개의 연속되는 아미노산들로 이루어진다. SEQ ID NO:2에서 나타낸 아미노산 위치 약 2~약 612에 이르는 Cry1A.105 살충단백질은, 혼성 살충단백질의 구성을 위한 세그먼트가 선택될 수 있는 다양한 살충단백질의 그룹내에 포함된다.

본 발명의 여러 가지의 장점들과 특징들은 명확하고, 본 발명의 성질은 다음의 상세한 설명, 실시예들 및 첨부된 특허청구범위를 참고로 하면 더욱 분명히 이해될 수 있을 것이다.

서열의 간단한 설명

SEQ ID NO:1은, 바람직하게는 쌍자엽식물세포 내에서, Cry1A.105 살충단백질의 발현을 위한 합성서열이다.

SEQ ID NO:2는 SEQ ID NO:1로 표시되는 뉴클레오티드 서열로부터 암호화된 Cry1A.105 단백질이다.

SEQ ID NO:3는, 바람직하게는 단자엽식물세포 내에서, Cry1A.105 살충단백질의 발현을 위한 합성서열이다.

SEQ ID NO:4는 SEQ ID NO:3로 표시되는 뉴클레오티드 서열로부터 암호화된 Cry1A.105 단백질이다.

SEQ ID NO:5는 식물세포 내에서 기능을 하는 발현카세트로 이루어진 뉴클레오티드 서열을 나타내고, 바람직하게는 쌍자엽식물세포 내에서, Cry1A.105 살충단백질을 발현하기 위한 것이다.

SEQ ID NO:6는 SEQ ID NO:5로 표시되는 발현카세트 내의 세그먼트에 의해 암호화된 Cry1A.105 살충단백질을 나타낸다.

SEQ ID NO:7은 식물세포 내에서 기능을 하는 발현카세트로 이루어진 뉴클레오티드 서열을 나타내고, 바람직하게는, 단자엽식물세포 내에서, Cry1A.105 살충단백질을 발현하기 위한 것이다.

SEQ ID NO:8는 SEQ ID NO:7로 표시되는 발현카세트 내의 세그먼트에 의해 암호화된 Cry1A.105 살충단백질을 나타낸다.

발명의 상세한 설명

본 발명에 따라서, 본 발명자들은 여기에서 Cry1A.105 단백질로서 동정된 신규의 살충단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열들을 구성했다.

SEQ ID NO:2로 표시되는, Cry1A.105 아미노산서열은 인시류 곤충종들에 대해 독성이 있는 천연유래의 Bt 살충단백질들을 능가하는 장점들을 제공하는 성질들을 나타내는 것이 확인되었다. 특히, Cry1A.105 단백질은, 식물내에서 천연유래의 Cry1 단백질이 발현될 경우에 관찰된 효과와 비교하여 볼 때, 대부분의 유전자도입 계통들이 유전자발현의 수준이 증가함에 따른 결과로 인한 식물독성 효과를 나타냄이 없이 단자엽식물 및 쌍자엽식물 모두에서 고수준으로 발현될 수 있다. 더구나, Cry1A.105 단백질은 바실러스 투린지엔시스(Bacillus thuringiensis )내에서 발현시, 안정된 결정들을 이루는데, 이는 키메릭 Cry1A.105 단백질의 톡신부분에 연결된 Cry1Ac 프로톡신 세그먼트의 안정화 효과때문일 것이다. 더욱이, Cry1A.105 살충단백질은 오늘날까지 동정된 다른 천연유래의 Cry1 단백질들로는 관찰되지 않은 인시류종들에 대한 일정범위의 살충의 생물학적 활성을 나타낸다. 따라서 유전자도입 식물에서의 Cry1A.105 단백질의 발현은, 상용화를 위해 선택되는 어떤 계통에 대한 인시류 해충종들의 넓은 범위의 억제를 나타내는 Cry1톡신의 유사체를 고수준으로 발현하는, 형태상 정상적인 유전자도입 계통들의 수를 증가시킨다. 이러한 계통들은 Cry1A 톡신 유사체에 대한 내성의 개시가 지연되는 이점을 가져다주고, Cry1A 유사체 또한 독성을 갖는 한 가지 이상의 곤충해충종들에 대해 독성이 있고, Cry1A 유사체와는 다른 방식으로 작용하는 제2의 톡신과 조합시에는, 이들 톡신에 대한 내성의 성장가능성은 상당히 멀 것으로 기대된다.

본 발명자들은 식물에서의 사용을 위하여 적어도 두 개의 상이한 뉴클레오티드 서열들을 구성했고, 각각의 뉴클레오티드 서열은 동일한 Cry1A.105 살충단백질을 암호화한다. Cry1A.105 단백질의 살충부분의 처음의 약 2/3부분(또는 아미노말단)은 Cry1Ab 아미노산 서열로부터 파생된 아미노산 서열로 이루어진다. 이 서열은 톡신부분의 카르복시-말단 및 에코겐 Bt 아이자와이(aizawai ) 균주 EG6346(Chambers 등, 1991, J. Bacteriol. 173:3966-3976)로부터 얻어진 살충 Cry1 단백질로부터 파생된 아미노산 서열의 프로톡신 도메인의 일부에 연결된다. Cry1A.105 톡신 세그먼트는 실질적으로 Cry1Ac 프로톡신 펩티드 서열인 세그먼트에 연결된다. 본 발명자들은 이러한 구조체가 키메라가 유래된 단백질이 나타낸 살충성과 비교해보았을 때 현저히 증가한 살충성을 나타내는 특별한 아미노산 서열을 제공한다는 사실을 입증했다.

더욱이, Cry1A.105 전구체 단백질은 우수한 결정형성성을 나타내고, 효과적으로 용해되며, 특정 목표의 인시류 해충들의 장내에서 활성적인 톡신 형태로 가공처리된다.

여기에서 구체화된 뉴클레오티드 서열들은 미국특허 제5,500,365호와 제5,689,052호에 설명된 방법들을 이용하여 구성되었는데, 특히 식물세포 내에서 이종 유전자 서열들의 발현에 문제가 될 것으로 관찰된 불리한 코딩서열들을 피하여 구성되었다. Cry1A.105 단백질의 톡신 부분을 암호화하는 세그먼트는 SEQ ID NO:1 및 SEQ ID NO:3에서 나타낸 위치 약1~ 위치 약 1830 이내의 뉴클레오티드들로 이루어진다. SEQ ID NO:1로 표시되는 서열은 특히 목화와 같은 쌍자엽 식물종들에 사용되기 위해 구성되었다. SEQ ID NO:3으로 표시되는 서열은 특히 메이즈(maize) 또는 옥수수와 같은 단자엽 식물들에서의 발현을 위해 구성되었다.

본 발명의 뉴클레오티드 서열들은 서로 약 94.3%의 전체적인 동일성을 나타내고, 약 1330~약 3534에 이르는 뉴클레오티드 위치가 동일하다. Cry1A.105 단백질의 톡신 부분을 암호화하는 이들 뉴클레오티드 서열들의 각각의 세그먼트는, 서로 뉴클레오티드 위치 1~ 위치 약 1830까지 약 88.9%의 동일성을 나타낸다. Cry1A.105 단백질의 맨 앞의 두 도메인 구조를 암호화하는 이들 뉴클레오티드 서열들의 세그먼트는 실질적으로 더 다양하고, 서로 약 84.7%의 동일성만을 나타낸다.

본 발명자들은 이 서열들을 사용해 유전자도입 식물을 만들었다.

SEQ ID NO:1은 페투니아 하이브리다(Petunia hybrida ) Hsp70 미번역 리더서열(Ph.Hsp70, a.k.a., DnaK)에 작동가능하게 연결된 강화 Figwort Mosaic Virus 프로모터(eFMV)서열, 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana ) 리불로스 비스 포스페이트 카르복실라제 작은 서브유니트 엽록체 타깃팅 펩티드 코딩서열, 및 피숨 사티붐(Pisum sativum ) E9 리불로스 비스포스페이트 카르복실라제 작은 서브유니트 유전자 전사종료 및 폴리아데닐화 서열로 이루어진 발현 카세트를 포함하는 플라스미드 벡터 내로 도입되었다. SEQ ID NO:1로 표시되는 Cry1A.105 코딩서열은 상기 발현 카세트 내의 프레임 내로 삽입되었고, 삽입위치는 목표 펩티드 코딩서열의 3' 말단 코딩서열에 바로 인접하고 E9 종료서열의 상류인 위치이었다. 결과적으로 얻어진 발현 카세트의 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO:5로 표시된다. 식물 발현가능성이 있는 GUS 마커를 포함하는 제 2의 발현 카세트에 연결된 Cry1A.105 발현 카세트를 포함하는 벡터의 세그먼트를 절단하고, 바이오리스틱(biolistic) 방법을 이용하여 유전자도입 목화를 생성시키기 위해서 이용하였다. 유전자도입 계통들은 다양한 종류의 인시류 해충종들에 대한 살충활성 분석을 위해 생물학적 검정법으로 시험되었고, 그 결과 Cry1Ac 단백질 단독 또는 Cry1Ac와 Cry2Ab의 조합 단백질을 함유한 기존의 곤충저항성 목화보다 현저히 우수한 곤충억제성을 나타내는 것으로 판명되었다. 게다가, Cry1A.105 유전자도입 목화 계통들의 몇몇은 심지어 그 꼬투리에서도 성장기 동안 내내 10~20ppm을 초과하는 Cry1A.105 단백질 축적 수준을 나타내었고, 식물 또는 번식조직에 대해 어떤 식물독성 효과들도 없었다. 이는, 엽록체를 목표로 한 것인지의 여부와 무관하게, 이미 테스트를 통해 일반적으로 약 10ppm 미만의 축적 수준만을 나타낼 수 있었던 다른 Cry1 단백질들과는 대조적이다. 식물독성 효과들은 다른 Cry1 타입의 단백질들을 목화에서 테스트했을 때, 특히 Cry1 축적수준이 약 10ppm에 접근하거나 또는 초과했을 때 관찰되었다.

SEQ ID NO:3는 트리티쿰 애스티붐(Triticum aestivum ) 주엽록소 a/b 결합단백질 유전자 미번역 리더서열과, 오리자 사티바(oryza sativa ) 액틴 인트로서열에 작동가능하게 연결된 강화 콜리플라워 모자이크 바이러스(Cauliflower Mosaic Virus) 프로모터(eCaMV) 서열 및 트리티쿰 애스티붐(Triticum aestivum ) hsp17 유전자 전사종료 및 폴리화데닐화 서열로 이루어진 발현카세트를 포함하는 플라스미드 벡터 내로 도입되었다. SEQ ID NO:3로 표시되는 Cry1A.105 코딩서열은 이 발현카세트 내의 인트론서열의 3'에 인접하여 종료서열의 상류에 삽입되었다.

결과의 발현카세트의 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO:7에 나타나 있다. 또한 이 벡터는 Cry1A.105 발현카세트로 형질전환된 계통들을 선택하기 위해 사용된 글리포세이트 제초제 선택성 마커를 포함한다. Cry1A.105 발현카세트로 형질전환된 후에 선택된 메이즈(maize)를 몇 개의 인시류 해충종들에 대해 생물학적 검정법으로 테스트한 결과, Cry1Ab와 같은 다른 Bt 살충 단백질들로 형질전환된 계통들에는 없었던 광범위한 살충활성을 나타내는 것으로 확인되었다. Cry1Ab를 발현하는 계통들의 살충활성과 동등하거나 또는 이보다 더 큰, 큰담배밤나방과 옥수수잎 좀에 대한 Cry1A.105 살충활성과 조합된 살충수준의 Cry1A.105의 발현에 의해 나타나는 가을거염벌레와 검은 야도충 활성은 Cry1A.105 계통들에 대해 더 광범위한 살충활성 스펙트럼을 제공한다.

본 발명의 뉴클레오티드 서열들은 예시적이다. 다른 뉴클레오티드 서열들이 식물세포 내에서 Cry1A.105 살충단백질 단편을 발현시킬 수 있고, 또 다른 뉴클레오티드 서열들은 다른 유형의 숙주세포들에서 잘 발현하도록 디자인될 수 있다. 개시내용들의 범위를 제한함이 없이, Cry1A.105 살충 단편의 발현에 사용되기 위한 뉴클레오티드 서열은 여기에서 예시된 뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 약 85%, 또는 적어도 약 90%, 또는 적어도 약 95%, 또는 적어도 약 99% 또는 그 이상의 뉴클레오티드 서열동일성을 나타내게 될 것이다.

식물세포 이외의 숙주세포 내에서 Cry1A.105 살충 단편의 발현을 위해 의도된 다른 뉴클레오티드 서열들은 예시된 뉴클레오티드 서열들에 대해 일정 퍼센트 의 동일성 또는 유사성을 갖는 것일 수 있다. 뉴클레오티드 서열들은 유전자 코드의 중복때문에 다양할 수 있고, 따라서 SEQ ID NO:2로 표시되는 아미노산 서열의 어떤 부분을 암호화하는 임의의 수의 핵산서열들을 합성할 수 있고, 이러한 서열들은 모두 본 발명의 범위 내에 속한다. 적어도 Cry1A.105 단백질의 살충 단편을 암호화하는 분리정제된 핵산서열뿐 아니라, 이 서열로 이루어진 앰플리콘을 만들기 위해 디자인된 항체, 핵산프로브 또는 한 쌍 이상의 프라이머에 의해 검출될 수 있는 상기 핵산을 포함하는 어떤 조성물도 본 명세서의 범위내에 속한다.

여기에서 예시되고 메이즈(maize)에서 발현된 핵산서열은 Cry1A.105 전구체 단백질 코딩서열만으로 이루어진 반면에, 목화에서 발현된 서열은 엽록체를 타깃으로 한 Cry1A.105 전구체 단백질 코딩서열로 이루어진다.

식물들에서 Cry1 단백질들의 발현은 문제가 있을 수 있는 것으로 판명되었다. 어떤 특정 Cry1 단백질이 어떤 특정 식물에서 잘 발현될 것인지 여부는 공지되지 않았으므로 시행착오가 필요하다. 옥수수에서 발현된 몇몇 Cry1 단백질들은 식물독성 효과를 야기할 것이므로, 따라서 때로는 상기 단백질을 엽록체에 대해 타깃팅하므로써 그러한 효과들을 완화시키게 된다.

유사한 환경들이 Cry1 단백질들의 목화에서의 발현에서도 관찰된다. 본 명세서에서의 실시예들은, Cry1A.105 발현이 세포질 공간으로 국부화된 경우, 메이즈 에서만 가능하다는 것을 의미하는 것은 아니고, 또한 그와 유사하게 Cry1A.105 발현이 색소체로 국부화된 경우, 목화에서만 가능하다는 것을 의미하는 것은 아니다. 실시예들은, 고수준의 Cry1A.105 단백질 발현 및 축적을 나타내고, 안티카르시아(Anticarsia), 슈도프루시아(Pseudoplusia), 라치프루시아(Rachiplusia), 헬리코베르파(Helicoverpa), 헬리오티스(Heliothis), 스포돕테라(Spodoptera), 에피노티아(Epinotia) 및 아르미게라(Armigera)로 이루어진 그룹에서 선택되는 속(genus)에서 인시류 곤충 식물해충에 대한 넓은 범위의 상용적인 수준의 내성을 나타내는, 형태학적으로 정상적인 식물을 얻기 위해, 어떠한 단백질 국부화(localization) 방법이든 본 발명에 적용될 수 있음을 나타낸다. 색소체 타깃팅 펩티드 암호화서열은 전구체 Cry1A.105 단백질이 색소체/엽록체에서 발현되도록 하기 위해 효과적으로 기능할 것으로 여겨진다.

미번역 리더서열들, 인트론서열, 및 3'전사종료 및 폴리아데닐화 서열들은 당 분야에 공지되어 있고, 어떤 조건하에서, 발현카세트들 내로 이들 서열들을 도입시킴으로써 발현이 향상되고 또는 안정화될 수 있음을 당업자들은 알 것이다. 다수의 이와 같은 서열은 당 분야에 공지이고, 본 발명의 범위 내에 포함되는 것이다. 이와 유사하게, 연결 서열의 조절된 발현을 이루도록 기능을 하는 프로모터 역시 당 분야에 공지이고, 이 또한 본 발명의 범위 내에 포함되는 것이다.

프로모터들은, 제한되지는 않지만, 발현의 일시적 조절, 발현의 공간 특이적 또는 조직 특이적 조절 및 특정 식물세포 또는 조직 내에 축적되기를 원하는 특별한 유전자 생성물의 양의 조절을 포함하는, 매개변수들의 임의의 수의 조합하에서 연결 서열의 발현을 일으키기 위해 선택될 수 있다.

또한 Cry1A.105 아미노산 서열의 살충단편을 포함하는 분리되고 정제된 단백질도 본 발명의 범위내에 포함된다. 변이를 초래하는 아미노산 치환 또는 치환들이, 치환된 아미노산(들)을 보존하고 있는 한, 그리고 치환(들)이 생물학적 살충활성의 감소 또는 종 특이성의 범위의 감소를 초래하지 않는 한, 그러한 변이체들 또한 본 발명의 범위 내에 속한다. Cry1A.105 단백질의 살충 단편은, SEQ ID NO:2에서 나타낸 아미노산 위치 약 1~약 650, 또는 아미노산 위치 약 2~약 612, 또는 아미노산 위치 약 5~약 610, 또는 아미노산 위치 약 10~약 600의 아미노산 서열의 세그먼트일 것이다. 또는, Cry1A.105 단백질의 살충 단편은 SEQ ID NO:2에서 나타낸 아미노산 잔기 1~ 약 650까지의 아미노산 잔기들로 이루어진 군으로부터 선택되는 약 550~ 약 650의 연속되는 아미노산들로 이루어진다. 1~약 3534까지의 아미노산 잔기들로 이루어진, 전장의 전구체 단백질은 우수한 결정형성성을 나타내고, 단자엽식물과 쌍자엽식물종들 양쪽 모두는 이에 대해 잘 견딘다. 또한 전구체 단백질은 결정형성시에 우수한 안정성을 나타내고, 또한 알카리성 pH에서, 특히, 약 8.0 ~ 약 12.0의 범위 내에서, 약 8.5 ~ 약 11.5, 또는 약 9.0 ~ 약 11.0의 알카리성 pH에서, 우수한 안정성을 나타낸다.

본 발명의 단백질은 정제되어, 인시류 해충조절제로서의 사용을 위한 조성물들에서 살충 효과량으로 단독으로 사용될 수 있으며, 또는 Cry1A.105 단백질과는 상이한 다른 살충제들과 살충 효과량으로 조합될 수 있다. 이러한 다른 살충제들은, 제한되지는 않지만, 다른 Bt Cry 또는 화학적 살충제, 살균제 또는 균발육저지제, 항생제들, 항세균제들, 세균발육저지제들 및 살선충제 또는 선충발육저지제들을 포함하는, 인시류종들에 대해 독성이 있거나 혹은 독성이 없는 다른 살충 조성물들을 포함한다. 몇몇 다른 살충제들과 함께 Cry1A.105를 포함하는 이러한 살충제 조합물들은 유전자도입 세포에 의해 생산될 수 있거나, 또는 정제되거나 또는 실질적으로 정제된 살균제들을 사용하여, 가루, 입자물질, 오일현탁액, 물현탁액, 오일과 물 에멀죤의 혼합물, 또는 수화분말로 이루어진 형태로 된 살균제 조성물 내로 제제화될 수 있고, 그 후 잎에 도포(적용)하기 위해 농업적으로 허용가능한 담체내로 제공된다. 이 조성물들은, 종자처리용 조성물 내에 포함되는 Cry1A.105와 함께, 살충 효과량의 Cry1A.105를 발현하기 위해 형질전환된 유전자도입 식물로부터 파생된 종자에 적용되는 종자처리 조성물로도 제제화될 수 있고, 따라서 살충제를 포함하는 종자처리 조성물은 살충 효과량의 Cry1A.105 단백질을 생산하는 종자로부터 성장된 식물의 세포와 함께 목표 인지류 해충에 제공된다. 동일한 곤충종에 대해 독성이 있고, 그 독성효과를 다른 작용방식을 통해 나타내는 각각의 살충단백질들의 조합은 인시류종들을 조절하거나, 또는 특정의 인시류종들에 대해 효과적인 어떤 다른 단일 살충제에 대한 내성의 개시를 지연시키기 위해 특별히 유용한 살충제의 조합일 수 있다. 이러한 단백질들의 예시적인 조합물은 본 발명의 Cry1A.105 단백질(즉, 제1의 살충단백질)과 적어도 상기 제1의 살충단백질과는 다른 제2의 살충단백질의 조합물일 것이다. 이러한 상이한 살충 단백질들은, 제한되지는 않지만, 다른 인시류 Bt 결정성 단백질들(다른 Cry1's, Cry2's, Cry5's, Cry9's), VIP 단백질들, TIC 단백질로서 언급되는 인시류 살충 단백질들 및 크세노르하브더스(Xenorhabdus)와 포토르하브더스(Phtorhabdus ) 박테리아 종들에 의해 생산된 살충단백질들을 포함한다. 해충의 먹이속에, 곤충생존을 위해 필수적인 하나 이상의 유전자의 dsRNA매개된 억압을 달성하기 위해 고안된 제제와 함께 하나 또는 그 이상의 살충단백질의 조합물을 제공하는 것은 인시류 곤충종을 조절하거나 특정의 인시류 종들에 대해 효과적인 다른 어떤 단독 살충제에 대한 내성의 개시를 지연시키는데 특히 유용한 살충제의 조합이 된다.

본 발명의 뉴클레오티드 서열로 형질전환된 식물들은 본 발명의 다른 구체예로서 제공된다. 식물세포들 내로 DNA를 안정하게 도입시키는 방법들은 당분야에 공지이고, 제한되지는 않지만, 이 방법들로는 진공침투, 아그로박테리움(Agrobacterium ) 또는 리조비움(Rhizobium)매개 형질전환, 전기영동 및 다양한 탄동(ballistic)법들이 있다. 식물내로 도입된 DNA는 일반적으로 핵염색체내로의 삽입이 목적이나, 엽록체 또는 플라스티드 DNA내로의 삽입이 이루어질 수도 있다. 식물내로 도입된 DNA는 일반적으로, 제한되지는 않으나, 적절한 기질의 존재하에서, 형질전환된 세포에 색채적 특성을 부여하는 형광유전자나 발광유전자 및 염료나 효소를 암호화하는 유전자와 같은 계산가능한 마커(scorable marker)를 포함하거나, 또는 형질전환된 세포에 대해서는 성장이점을 제공하고 비-형질전환세포나 조직에 대해서는 본질적으로 성장정지 혹은 사멸반응을 일으키므로써 형질전환된 세포 및 조직에 대해 양성선별을 가능하게하는 선택가능한 마커(selectable marker)를 포함하는, 목적 DNA에 의해 안정적으로 형질전환된 세포 또는 세포들을 동정하거나 선택하는 수단을 제공하는 서열에 연결되거나 회합된다. 이러한 선택가능한 마커들에는 제한이 없지만, 바스타, 바, 메토트렉세이트 내성, 네오마이신 포스포트랜스퍼라제, 글리포세이트 무감각 EPSPS 효소들, 글리포세이트 옥시도리덕타제(GOX) 효소들, E-Coli phnO 또는 그것의 균등물 등을 암호화하는 유전자들을 포함한다.

실험실에서의 조작과정에서, 예시된 뉴클레오티드 서열들을 유지, 조작 및/또는 유도하기 위해 디자인되거나 또는 숙주세포 내로의 도입을 위해 디자인된 벡터들과 다른 유형의 서열들은 본 발명의 범위 내에 또한 포함되고, 이들은 제한은 없으나, 파아지, 플라스미드, 백미드, 약미드, 코스미드 등을 포함할 것이다.

또한 본 발명은 형질전환된 식물들도 포함한다. 특히 Cry1A.105 단백질의 적어도 살충 단편을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하도록 형질전환된 식물들이 제공된다. 단자엽식물과 쌍자엽식물들 모두는 본 발명의 범위 내에 속한다. 제한은 없으나, 옥수수, 밀, 귀리, 쌀, 사탕수수, 마일로(수수일종), 메밀, 호밀, 풀(김의털(fescue), 큰조아재비(timothy), 브롬(brome), 새발풀(orchard), St.오그스틴(St. Augustine), 버뮤다(Bermuda), 겨이삭띠)와 보리가 단자엽식물들에 포함될 것이고, 적어도 자주개자리, 사과, 살구, 아스파라거스, 콩, 장과(berry), 검은나무딸기, 월귤나무열매, 캐놀라, 당근, 꽃양배추, 샐러리, 버찌, 이집트콩, 감귤류나무, 목화, 광저기(cowpea), 덩굴월귤열매, 오이, 조롱박, 가지, 새발풀(ochard), 포도, 레몬, 상추, 아마씨, 메론, 겨자, 호두나무, 오크라(okra), 오렌지, 완두, 복숭아, 땅콩, 배, 자두, 감자, 대두, 호박, 딸기, 사탕무, 해바라기, 고구마, 담배, 토마토, 순무와 야채가 쌍자엽식물들에 포함된다.

이들 식물들로부터 생산된 종자들과 조직들 뿐 아니라 이들 식물들로부터의 생산물은, 상기 종자, 조직 또는 생산물이 Cry1A.105 단백질의 살충 단편을 암호화하는 도입유전자를 포함하는 한, 본 발명의 범위 내에 특별히 포함된다.

본 발명은 생물학적 시료에서, Cry1A.105 단백질 또는 Cry1A.105 단백질의 살충 단편을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 검출하는 방법들을 제공한다. Cry1A.105 에피토프에 특이적인 항체들을 생산하기 위해 동물들을 면역시키는데 Cry1A.105를 사용할 수 있다. Cry1A.105 특이적 항체들은 생물학적 시료 내에서 Cry1A.105의 존재를 검출하기 위해 사용될 수 있다. 항원에 대한 항체의 결합을 검출하는 방법들은 공지의 기술이다. 생물학적 시료 내에서 Cry1A.105 에피토프에 대한 항체의 결합에 대한 검출은 시료 내의 상기 단백질의 존재에 대한 진단이 된다.

Cry1A.105 살충 단편을 암호화하는 뉴클레오티드 서열들 또한 검출가능하다. 합성 뉴클레오티드 프로브는 목표서열, 즉 Cry1A.105 살충 단편을 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 결합시키기 위해 사용가능하다. 목표서열에 대한 프로브의 결합을 검출하기 위한 방법은 공지기술이다. 목표 Cry1A.105 코딩서열에 대한 프로브의 결합을 검출하는 것은 시료 내의 상기코딩서열의 존재에 대한 진단이 된다.

합성 뉴클레오티드 프라이머들은 Cry1A.105 단백질의 살충 단편을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것으로 의심되는 생물학적 시료로부터 앰플리콘을 생산하기 위한 열증폭반응에 사용될 수 있다. 이러한 열증폭반응에서 생산된 앰플리콘의 존재는 시료 내의 상기 뉴클레오티드 서열의 존재에 대한 진단이 된다. 생물학적 시료에서 본 발명의 Cry1A.105 코딩서열들의 존재를 검출하기 위한 진단이 되는 프로브로서 특히 유용한 서열들은 (1) SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:3로 표시되는 뉴클레오티드 위치 1401~1420에 상응하거나 또는 이에 완전히 상보적인 서열들, 또는 (2) SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:3로 표시되는 뉴클레오티드 위치 1821~1840에 상응하거나 또는 이에 완전히 상보적인 서열들이다. 이 서열들은 (1) 본 발명의 단백질들의 살충 부분을 구성하기 위하여 사용된 상이한 살충단백질들의 세그먼트들의 도메인II와 도메인III간의 연결부를 암호화하는 서열을 연결해주는 20 뉴클레오티드들과 (2) 프레-프로-톡신 Cry1Ab.105 단백질의 암호화서열을 구성하기 위해 사용된 상이한 단백질 암호화 세그먼트들의 프로톡신 암호화 세그먼트와 도메인III간의 연결부를 암호화하는 서열을 연결해주는 20 뉴클레오티드들에 상응한다.

DNA의 이들 세그먼트들(1401~1420 또는 1821~1840)의 어느 하나이거나, 또는 이에 상보적인 뉴클레오티드 서열은 생물학적 시료에서 이들 암호화서열들의 존재를 검출하기 위한 프로브로서 사용될 수 있다. 이러한 결합의 검출은 생물학적 시료에서 이러한 암호화서열들의 존재를 검출하기 위한 진단법이다. 당업자에게 인지되는 바와 같이, DNA의 이들 세그먼트들의 어느 한쪽 측면에 접하는 다른 서열들은 생물학적 시료들로부터의 다양한 크기의 앰플리콘 세그먼트들을 증폭시키기 위한 프라이머로 사용가능하고, 이러한 앰플리콘들은 시료 내에서 상기 암호화서열들의 존재에 대한 진단이 된다. 예를 들면, SEQ ID NO:1에 나타낸 위치 1201~1220에 이르는 뉴클레오티드 서열에 상응하는 제1의 프라이머서열은 위치 1581~1600에 이르는 SEQ ID NO:1에서 나타낸 뉴클레오티드 서열의 역 상보체에 상응하는 제2의 프라이머 서열을 함께 사용하는 열증폭반응에서 전방 프라이머로서 사용될 수 있다. SEQ ID NO:1을 포함하는 생물학적 시료의 열증폭반응에 함께 사용되는 경우, 이 같은 프라이머들은 SEG ID NO:1에서 뉴클레오티드 위치 1201~1600에 상응하는 앰플리콘, 즉, SEQ ID NO:1에 나타낸 뉴클레오티드 위치 1401~1420에 이르는 20 뉴클레오티드 세그먼트를 포함할 수 있는 400 뉴클레오티드 앰플리콘의 합성이 이루어지게 하며, 따라서 이는 그러한 시료에서 Cry1A.105 암호화서열의 존재를 확인하기 위한 진단이 될 것이다.

시료내에서 Cry1A.105의 존재를 검출하거나 또는 Cry1A.105를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 존재를 검출하기 위한 킷트가 제공된다. 이 킷트는 사용을 위한 설명서들과 함께, 원하는 제제를 검출하기 위한 방법을 실행하기 위해 필요한 모든 시약들과 대조군 시료들과 함께 제공된다.

다음의 실시예들은 본 발명의 바람직한 구체예들을 설명한다. 청구범위 내에 속하는 다른 구체예들은 여기에서 개시된 바와 같은 본 발명의 상세한 설명 또는 실시를 고려함으로써 당업자에게 명백할 것이다. 상세한 설명과 실시예는 단지 예시적인 것이며, 본 발명의 범위와 사상은 실시예 다음의 청구범위에 의해 나타내어진다.

실시예 1

이 실시예는 살충성 Cry1A.105 단백질을 암호화하는 합성 뉴클레오티드 서열들을 예시한다.

Cry1A.105 살충 단백질을 암호화하는 SEQ ID NO:1로 표시되는 뉴클레오티드 서열은 쌍자엽식물들에 사용하기 위해 구성되었다. 아미노산서열 번역은 SEQ ID NO:2로 표시된다. 톡신 암호화 세그먼트는 위치 약 1~1830 이내의 뉴클레오티드로 이루어진다.

Cry1A.105 아미노산 서열을 암호화하는 SEQ ID NO:3로 표시되는 뉴클레오티드 서열은 단자엽식물에서의 발현을 위해 구성되었다. 아미노산서열 번역은 SEQ ID:4로 표시된다. 톡신 암호화 세그먼트는 위치 약 1~1830 이내의 뉴클레오티드로 구성된다.

SEQ ID NO:1과 SEQ ID NO:3에 나타낸 뉴클레오티드 서열들은 서로 실질적으로 동등하다. SEQ ID NO:1과 SEQ ID NO:3은 약 94.3%의 전체적인 동일성을 나타낸다. 상기 두 개의 암호화서열들은 대략 뉴클레오티드 위치 1330으로부터 뉴클레오티드 위치 3534까지 동일하다. 각 서열의 톡신 암호화 부분은 뉴클레오티드 위치 약 1~ 1830으로 이루어지고, 이 세그먼트들은 서로 약 88.9%의 동일성을 나타낸다. 두 서열들 사이에서 실질적인 차이는 뉴클레오티드 위치 약1~ 위치 1329의 범위 안에 있고, Cry1A.105 단백질의 톡신 부분을 암호화하는 세그먼트의 약 처음 2/3 지점에 있다. 두 서열들은 이 세그먼트 전체에 걸쳐서 약 84.7%의 동일성을 나타낸다.

베타-락타마아제 선택성 마커와 Cry1A.105를 암호화하는 SEQ ID NO:3에서 나 타낸 서열을 포함하는, pMON70522로서 지칭된 플라스미드로 형질전환된 E. Coli 균주(TOP10, Invitrogen, Inc.)는 특허절차들의 목적을 이루기 위한 미생물 기탁의 국제적 승인에 관한 부다페스트조약에 따라서 미국 일리노이주 61604, Peoria, North University Street 1815에 있는 Agriculture Research Culture Collection(NRRL) International Depository Authority에, 2005년 8월 31일에 기탁되었고, NRRL B-30873으로 지정됐다.

실시예 2

이 실시예는 Cry1A.105 단백질을 발현하는 유전자도입 목화를 예시한다.

Delta와 Pineland DP50 목화종자들을 표면살균처리하고 밤새 발아시켰다. 분열조직 외식편들을 분리하고 떡잎들을 현미해부에 의해 제거했다. 제거된 외식편들을 목표 배지 내에 놓음으로써 분열조직들은 입자 운반방향에 대해 수직으로 향하게 했다. 형질전환 벡터인 pMON47740은 SEQ ID NO:9에 나타낸 뉴클레오티드서열을 갖는 발현카세트를 포함한다. e35S 프로모터의 제재하의 GUS 마커유전자와 eFMV 프로모터의 제재하의 엽록체 타깃팅 Cry1A.105 암호화서열을 포함하는 KpnI단편은 이 플라스미드로부터 절단되어 HPLC에 의해 분리되었으며, 목화 분열조직 외식편들의 총(gun)형질전환을 위해 사용되었다. Cry1A.105 발현카세트와 GUS 마커 모두를 포함하는 정제된 DNA를 미세금구슬(microscopic gold beads) 위에 침전시키고, Mylar 시트 위에 얇은 층으로 코팅했다. DNA를 부분진공 하에서 전기방전입자 전달에 의해 분열조직 내로 가속시켰다. 입자충격 후에, 외식편들을 선택제 없이 호르몬이 없는 배지 위로 탈-타깃팅(de-targetting) 했다.

재생된 묘목들로부터의 잎조직들을 샘플로 하여, GUS 마커의 발현을 위해 분석했다. 고수준의 GUS 발현을 나타내는 유전자도입식물들을 추가의 스크리닝을 위해 온실로 보냈다. 이 식물들을 GUS 발현에 대해 다시 테스트하고, 식물들의 음성부분들을 잘라냈다. 이와 같은 GUS-음성조직의 샘플링과 절단의 사이클을 각 식물의 모든 부분들이 GUS 마커에 대해 양성반응이 나올 때까지 반복했다. 그 다음, 식물들을 종자수확 때까지 표준온실 조건 하에서 유지시켰다.

F1 GUS 양성 유전자도입 목화로부터 얻은 조직들이 목화씨벌레(CBW)와 가을거염벌레(FAW)에 대해 살충활성을 나타내는지 생물학적 분석법으로 테스트했다. 살충성을 나타내는 수준의 Cry1Ac, 또는 Cry1Ac와 Cry2Ab의 조합물을 발현하는 이미 생성된 동질의 목화가 양성 대조군들로 사용됐고, 비-유전자도입 목화는 음성대조군으로 사용됐다.

CBW(목화씨벌레) 스퀘어 분석법이 유전자도입 목화의 살충활성을 결정짓는 한 가지 수단으로서 사용됐다. (Adamczyck 등, (2001) J. Econ. Entomol. 94:284-290; Kranthi 등 (2005) Current Science 89:291-298). 잎조직의 스퀘어들(가지끝의 잎 크기와 동일하거나 더 큰 것)을 모으고 각각 분석용 웰 내로 넣었다. 각각의 스퀘어에 단일의 제3-영충기의 CBW 유충이 만연하도록 했다. 이 후 생존한 곤충들의 숫자를 5일간 기록했다.

CBW(목화씨벌레) 꼬투리 분석은 유전자도입 식물들로부터 모인 꼬투리조직의 살충활성을 결정하는데 또한 사용됐다. 각각의 계통으로부터 8개의 딱딱한 녹색 꼬 투리(개화 후)들을 모아서 각각의 컵들에 넣고, 제3-영충기의 CBW 유충이 만연하도록 했다. 이후 생존한 곤충들의 숫자를 5일간 기록했다.

FAW(가을거염벌레)에 대한 유전자도입 잎조직의 살충활성을 결정하기 위해 잎 분석을 실시했다. 새로운 잎들을 목화의 말단으로부터 취했다. 각각 직경이 약 3/4인치인 2개의 잎 펀치(punch)를 모으고, 각각 16개의 분석용 웰 내로 넣었다. 각각의 웰을 단일의 제2 또는 제3 영충기의 FAW 유충이 만연하도록 했다. 이후 생존한 곤충들의 숫자를 5일간 기록했다.

생물학적 검정결과들은 표1에 설명되어 있다. 결과들은 Cry1A.105를 발현하는 유전자도입 목화 계통이 FAW와 CBW 양쪽 모두에 대해 Cry1AC 또는 Cry1AC와 Cry2Ab의 조합물들 중의 어느 하나를 발현하는 도입유전자 계통들보다 더 큰 살충활성을 나타냈음을 보여준다.

표 1 유전자도입 목화조직을 사용한 경우의 FAW와 CBW의 생물학적 검정결과.

식물	FAW(% 생존율) (잎조직)	CBW(% 생존율) (스퀘어조직)	CBW(% 생존율) (꼬투리조직)
Cry1Ac/Cry2Ab	74.5	32.0	35.8
Cry1Ac	92.7	35.5	35.8
동일계통	99.6	96.8	54
17238	10.9	9.4	25
17567	0	12.5	12.5
17774	1.6	1.2	0
17875	3.1	4.2	0
18026	1.6	18.8	12.5
18122	7.8	22.9	0

또한 담배눈벌레와 큰담배밤나방을 유사한 생물학적 검정방법으로 테스트했다. 각각의 경우에, Cry1A.105 식물들은 이들 해충들에 대해 마찬가지로 살충 활성을 나타냈다.

실시예 3

이 실시예는 Cry1A.105 단백질을 발현하는 유전자도입 옥수수 식물들을 예시한다.

유전자도입 옥수수 식물들은 벡터 pMON40232로 형질전환된 세포들로부터 재 생됐다. pMON40232는 작동가능하게 연결된, 강화된 CAMV 35S 프로모터, 밀 CAB 리더서열, 쌀 액틴 1인트론, Cry1A.105 암호화서열, 및 밀 hsp17 유전자 3' 전사종료 및 폴리아데닐화 서열을 포함하는, SEQ ID NO:7에서 나타낸 뉴클레오티드 서열을 갖는 발현카세트를 포함한다. 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana) EPSPS 엽록체 타깃팅 서열을 암호화하는 뉴클레오티드 서열(At.EPSES-CTP2)은 Cry1A.105 암호화서열의 상류에 위치하고, Cry1A.105 암호화서열과 함께 프레임 내에 위치한다. pMON40232는, 도입유전자 계통의 선택에 사용하기 위하여, 제초제 글리포세이트에 대해 무감각한 EPSPS를 암호화하는 재조합 유전자를 포함한다. pMON40232로 형질전환된 조직으로부터 발생된 도입유전자 계통들은 LAJ 105로서 지칭됐다. 도입유전자 계통들은 스크리닝처리되었는데, 이는 어떤 벡터골격의 부재확인, 단일의 단순 삽입된 서열의 존재확인, 및 Cry1A.105 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드서열을 포함하는 발현카세트의 비손상(흠 없음) 확인을 위한 것이다.

생물학적 검정은 계통 스크린의 제한요건들이 충족되는 계통들로 실시됐다. LAJ105 유전자도입 옥수수 식물들을 Cry1Ab 단백질의 살충부분을 발현하는 동질계의 LH198 음성대조군과 양성대조군 MON810 변종에 대해 생물학적 검정법으로 비교했다. 직경이 각각 1cm인, 5개의 잎 디스크들을 각각 10개의 개별적인 Cry1A.105 도입유전자 계통들과 대조군들로부터 얻었다. 잎 디스크들을 식물재료 팽창을 유지시키기 위해 아가로 채워진 웰에 넣었다. 그 다음에, 그 잎 디스크들을 제일령층(neonate)의 FAW, BCW(검은 야도충), ECB(유럽 옥수수잎 나무좀), CEW(큰담배밤나방), 및 SWCB(사우스웨스턴 옥수수잎 나무좀) 유충의 먹이로 제공했다.

한마리의 제일령층의 FAW 유충, 한마리의 CEW 유충, 두 마리의 제일령층의 BCW, 두 마리의 제일령층의 SWCB 유충 또는 4마리의 제일령층의 유충을 각각의 웰에 적용했다. 먹이손상은 0 ~ 11의 잎손상비(LDR)를 사용하여, 4일 후에 평가했다. 손상비율 0은 먹이손상이 전혀 없음을 나타내고, 11은 적어도 잎 디스크의 50%가 먹힌 경우를 나타내고, 0과 11 사이의 각각의 포인트는 잎 디스크에 대해 관찰된 먹이손상이 5%씩 증가함을 나타낸다.

생물학적 검정결과, Cry1A.105 단백질을 발현하는 계통들이 FAW, ECB 및 CEW의 동일한 해충유충에 대해 Cry1Ab 대조군에 의해 나타난 LDR(잎손상비율)보다 더 큰 살충활성을 나타냄이 확인되었다. Cry1A.105 계통에 대한 이들 3종의 해충들의 잎손상비율은 1보다 적은 반면, Cry1Ab 대조군은 약 8~10의 LDR(잎손상비율)을 나타냈다. LDR(잎손상비율)은 SWCB에 대한 활성을 테스트한 경우에, Cry1A.105 계통들과 Cry1Ab 대조군 양쪽 모두에 대해 일관되게 1과 2 사이였고, 이는 Cry1A.105 단백질이 Cry1Ab보다 SWCB에 대해 더 독성이 없음을 나타낸다. 이 생물학적 검정의 결과들은 Cry1Ab가 BCW를 조절하는데에 비효과적임을 나타내는 이전의 결과들을 뒷받침해주었다.

Cry1A.105 계통들은 Cry1Ab 대조군보다 BCW에 대해서 더 효과적이지는 않았다. 따라서, planta 내의 Cry1A.105 단백질의 발현 수준에서, 이들 식물들은, 제한되지는 않지만, 안티카르시아(Anticarsia ), 슈도프루시아( Pseudoplusia ), 라치프루시아(Rachiplusia) 헬리오티스(Heliothis ), 헬리코베르파( Helicoverpa ), 스포돕테라(Spodoptera ), 에피노티아( Epinotia ), 및 아르미게라(Armigera)속에 포함되는 다 른 인시류 속 식물해충들을 조절(제충)하는데 효과적일 것이다.

SEQUENCE LISTING <110> Monsanto Technology LLC Bogdanova, Natalia N. Corbin, David R. Malvar, Thomas M. Perlak, Frederick J. Roberts, James K. Romano, Charles P. <120> NUCLEOTIDE SEQUENCES ENCODING INSECTICIDAL PROTEINS <130> 38-21 (52905) A <150> 60/713,144 <151> 2005-08-31 <160> 8 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 3534 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic nucleotide sequence encoding Cry1A.105 amino acid sequence <220> <221> CDS <222> (1)..(3534) <400> 1 atg gac aac aac cca aac atc aac gaa tgc att cca tac aac tgc ttg 48 Met Asp Asn Asn Pro Asn Ile Asn Glu Cys Ile Pro Tyr Asn Cys Leu 1 5 10 15 agt aac cca gaa gtt gaa gta ctt ggt gga gaa cgc att gaa acc ggt 96 Ser Asn Pro Glu Val Glu Val Leu Gly Gly Glu Arg Ile Glu Thr Gly 20 25 30 tac act ccc atc gac atc tcc ttg tcc ttg aca cag ttt ctg ctc agc 144 Tyr Thr Pro Ile Asp Ile Ser Leu Ser Leu Thr Gln Phe Leu Leu Ser 35 40 45 gag ttc gtg cca ggt gct ggg ttc gtt ctc gga cta gtt gac atc atc 192 Glu Phe Val Pro Gly Ala Gly Phe Val Leu Gly Leu Val Asp Ile Ile 50 55 60 tgg ggt atc ttt ggt cca tct caa tgg gat gca ttc ctg gtg caa att 240 Trp Gly Ile Phe Gly Pro Ser Gln Trp Asp Ala Phe Leu Val Gln Ile 65 70 75 80 gag cag ttg atc aac cag agg atc gaa gag ttc gcc agg aac cag gcc 288 Glu Gln Leu Ile Asn Gln Arg Ile Glu Glu Phe Ala Arg Asn Gln Ala 85 90 95 atc tct agg ttg gaa gga ttg agc aat ctc tac caa atc tat gca gag 336 Ile Ser Arg Leu Glu Gly Leu Ser Asn Leu Tyr Gln Ile Tyr Ala Glu 100 105 110 agc ttc aga gag tgg gaa gcc gat cct act aac cca gct ctc cgc gag 384 Ser Phe Arg Glu Trp Glu Ala Asp Pro Thr Asn Pro Ala Leu Arg Glu 115 120 125 gaa atg cgt att caa ttc aac gac atg aac agc gcc ttg acc aca gct 432 Glu Met Arg Ile Gln Phe Asn Asp Met Asn Ser Ala Leu Thr Thr Ala 130 135 140 atc cca ttg ttc gca gtc cag aac tac caa gtt cct ctc ttg tcc gtg 480 Ile Pro Leu Phe Ala Val Gln Asn Tyr Gln Val Pro Leu Leu Ser Val 145 150 155 160 tac gtt caa gca gct aat ctt cac ctc agc gtg ctt cga gac gtt agc 528 Tyr Val Gln Ala Ala Asn Leu His Leu Ser Val Leu Arg Asp Val Ser 165 170 175 gtg ttt ggg caa agg tgg gga ttc gat gct gca acc atc aat agc cgt 576 Val Phe Gly Gln Arg Trp Gly Phe Asp Ala Ala Thr Ile Asn Ser Arg 180 185 190 tac aac gac ctt act agg ctg att gga aac tac acc gac cac gct gtt 624 Tyr Asn Asp Leu Thr Arg Leu Ile Gly Asn Tyr Thr Asp His Ala Val 195 200 205 cgt tgg tac aac act ggc ttg gag cgt gtc tgg ggt cct gat tct aga 672 Arg Trp Tyr Asn Thr Gly Leu Glu Arg Val Trp Gly Pro Asp Ser Arg 210 215 220 gat tgg att aga tac aac cag ttc agg aga gaa ttg acc ctc aca gtt 720 Asp Trp Ile Arg Tyr Asn Gln Phe Arg Arg Glu Leu Thr Leu Thr Val 225 230 235 240 ttg gac att gtg tct ctc ttc ccg aac tat gac tcc aga acc tac cct 768 Leu Asp Ile Val Ser Leu Phe Pro Asn Tyr Asp Ser Arg Thr Tyr Pro 245 250 255 atc cgt aca gtg tcc caa ctt acc aga gaa atc tat act aac cca gtt 816 Ile Arg Thr Val Ser Gln Leu Thr Arg Glu Ile Tyr Thr Asn Pro Val 260 265 270 ctt gag aac ttc gac ggt agc ttc cgt ggt tct gcc caa ggt atc gaa 864 Leu Glu Asn Phe Asp Gly Ser Phe Arg Gly Ser Ala Gln Gly Ile Glu 275 280 285 ggc tcc atc agg agc cca cac ttg atg gac atc ttg aac agc ata act 912 Gly Ser Ile Arg Ser Pro His Leu Met Asp Ile Leu Asn Ser Ile Thr 290 295 300 atc tac acc gat gct cac aga gga gag tat tac tgg tct gga cac cag 960 Ile Tyr Thr Asp Ala His Arg Gly Glu Tyr Tyr Trp Ser Gly His Gln 305 310 315 320 atc atg gcc tct cca gtt gga ttc agc ggg ccc gag ttt acc ttt cct 1008 Ile Met Ala Ser Pro Val Gly Phe Ser Gly Pro Glu Phe Thr Phe Pro 325 330 335 ctc tat gga act atg gga aac gcc gct cca caa caa cgt atc gtt gct 1056 Leu Tyr Gly Thr Met Gly Asn Ala Ala Pro Gln Gln Arg Ile Val Ala 340 345 350 caa cta ggt cag ggt gtc tac aga acc ttg tct tcc acc ttg tac aga 1104 Gln Leu Gly Gln Gly Val Tyr Arg Thr Leu Ser Ser Thr Leu Tyr Arg 355 360 365 aga ccc ttc aat atc ggt atc aac aac cag caa ctt tcc gtt ctt gac 1152 Arg Pro Phe Asn Ile Gly Ile Asn Asn Gln Gln Leu Ser Val Leu Asp 370 375 380 gga aca gag ttc gcc tat gga acc tct tct aac ttg cca tcc gct gtt 1200 Gly Thr Glu Phe Ala Tyr Gly Thr Ser Ser Asn Leu Pro Ser Ala Val 385 390 395 400 tac aga aag agc gga acc gtt gat tcc ttg gac gaa atc cca cca cag 1248 Tyr Arg Lys Ser Gly Thr Val Asp Ser Leu Asp Glu Ile Pro Pro Gln 405 410 415 aac aac aat gtg cca ccc agg caa gga ttc tcc cac agg ttg agc cac 1296 Asn Asn Asn Val Pro Pro Arg Gln Gly Phe Ser His Arg Leu Ser His 420 425 430 gtg tcc atg ttc cgt tcc gga ttc agc aac agt tcc gtg agc atc atc 1344 Val Ser Met Phe Arg Ser Gly Phe Ser Asn Ser Ser Val Ser Ile Ile 435 440 445 aga gct cct atg ttc tct tgg ata cac cgt agt gct gag ttc aac aac 1392 Arg Ala Pro Met Phe Ser Trp Ile His Arg Ser Ala Glu Phe Asn Asn 450 455 460 atc att gca tcc gac agc att act caa ata ccc ttg gtg aaa gca cat 1440 Ile Ile Ala Ser Asp Ser Ile Thr Gln Ile Pro Leu Val Lys Ala His 465 470 475 480 aca ctt cag tca ggt act act gtt gtc aga ggt cca ggg ttt aca gga 1488 Thr Leu Gln Ser Gly Thr Thr Val Val Arg Gly Pro Gly Phe Thr Gly 485 490 495 gga gac att ctt cgt cgc aca agt gga gga ccc ttt gct tac act att 1536 Gly Asp Ile Leu Arg Arg Thr Ser Gly Gly Pro Phe Ala Tyr Thr Ile 500 505 510 gtt aac atc aat ggc caa ttg ccc caa agg tat cgt gca aga atc cgc 1584 Val Asn Ile Asn Gly Gln Leu Pro Gln Arg Tyr Arg Ala Arg Ile Arg 515 520 525 tat gcc tct act aca aat ctc agg atc tac gtg act gtt gca ggt gaa 1632 Tyr Ala Ser Thr Thr Asn Leu Arg Ile Tyr Val Thr Val Ala Gly Glu 530 535 540 agg atc ttt gct ggt cag ttc aac aag act atg gat acc ggt gac cct 1680 Arg Ile Phe Ala Gly Gln Phe Asn Lys Thr Met Asp Thr Gly Asp Pro 545 550 555 560 ttg aca ttc caa tct ttt agc tac gca act atc aac aca gct ttt aca 1728 Leu Thr Phe Gln Ser Phe Ser Tyr Ala Thr Ile Asn Thr Ala Phe Thr 565 570 575 ttc cca atg agc cag agt agc ttc aca gta ggt gct gac act ttc agc 1776 Phe Pro Met Ser Gln Ser Ser Phe Thr Val Gly Ala Asp Thr Phe Ser 580 585 590 tca ggg aat gaa gtt tac atc gac agg ttt gaa ttg att cca gtt act 1824 Ser Gly Asn Glu Val Tyr Ile Asp Arg Phe Glu Leu Ile Pro Val Thr 595 600 605 gca acc ctc gag gct gag tac aac ctt gag aga gcc cag aag gct gtg 1872 Ala Thr Leu Glu Ala Glu Tyr Asn Leu Glu Arg Ala Gln Lys Ala Val 610 615 620 aac gcc ctc ttt acc tcc acc aat cag ctt ggc ttg aaa act aac gtt 1920 Asn Ala Leu Phe Thr Ser Thr Asn Gln Leu Gly Leu Lys Thr Asn Val 625 630 635 640 act gac tat cac att gac caa gtg tcc aac ttg gtc acc tac ctt agc 1968 Thr Asp Tyr His Ile Asp Gln Val Ser Asn Leu Val Thr Tyr Leu Ser 645 650 655 gat gag ttc tgc ctc gac gag aag cgt gaa ctc tcc gag aaa gtt aaa 2016 Asp Glu Phe Cys Leu Asp Glu Lys Arg Glu Leu Ser Glu Lys Val Lys 660 665 670 cac gcc aag cgt ctc agc gac gag agg aat ctc ttg caa gac tcc aac 2064 His Ala Lys Arg Leu Ser Asp Glu Arg Asn Leu Leu Gln Asp Ser Asn 675 680 685 ttc aaa gac atc aac agg cag cca gaa cgt ggt tgg ggt gga agc acc 2112 Phe Lys Asp Ile Asn Arg Gln Pro Glu Arg Gly Trp Gly Gly Ser Thr 690 695 700 ggg atc acc atc caa gga ggc gac gat gtg ttc aag gag aac tac gtc 2160 Gly Ile Thr Ile Gln Gly Gly Asp Asp Val Phe Lys Glu Asn Tyr Val 705 710 715 720 acc ctc tcc gga act ttc gac gag tgc tac cct acc tac ttg tac cag 2208 Thr Leu Ser Gly Thr Phe Asp Glu Cys Tyr Pro Thr Tyr Leu Tyr Gln 725 730 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Asn Cys Val Glu Glu Glu Ile Tyr 1055 1060 1065 ccc aac aac acc gtt act tgc aac gac tac act gtg aat cag gaa 3249 Pro Asn Asn Thr Val Thr Cys Asn Asp Tyr Thr Val Asn Gln Glu 1070 1075 1080 gag tac gga ggt gcc tac act agc cgt aac aga ggt tac aac gaa 3294 Glu Tyr Gly Gly Ala Tyr Thr Ser Arg Asn Arg Gly Tyr Asn Glu 1085 1090 1095 gct cct tcc gtt cct gct gac tat gcc tcc gtg tac gag gag aaa 3339 Ala Pro Ser Val Pro Ala Asp Tyr Ala Ser Val Tyr Glu Glu Lys 1100 1105 1110 tcc tac aca gat ggc aga cgt gag aac cct tgc gag ttc aac aga 3384 Ser Tyr Thr Asp Gly Arg Arg Glu Asn Pro Cys Glu Phe Asn Arg 1115 1120 1125 ggt tac agg gac tac aca cca ctt cca gtt ggc tat gtt acc aag 3429 Gly Tyr Arg Asp Tyr Thr Pro Leu Pro Val Gly Tyr Val Thr Lys 1130 1135 1140 gag ctt gag tac ttt cct gag acc gac aaa gtg tgg atc gag atc 3474 Glu Leu Glu Tyr Phe Pro Glu Thr Asp Lys Val Trp Ile Glu Ile 1145 1150 1155 ggt gaa acc gag gga acc ttc atc gtg gac agc gtg gag ctt ctc 3519 Gly Glu Thr Glu Gly Thr Phe Ile Val Asp Ser Val Glu Leu Leu 1160 1165 1170 ttg atg gag gaa taa 3534 Leu Met Glu Glu 1175 <210> 2 <211> 1177 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Synthetic Construct <400> 2 Met Asp Asn Asn Pro Asn Ile Asn Glu Cys Ile Pro Tyr Asn Cys Leu 1 5 10 15 Ser Asn Pro Glu Val Glu Val Leu Gly Gly Glu Arg Ile Glu Thr Gly 20 25 30 Tyr Thr Pro Ile Asp Ile Ser Leu Ser Leu Thr Gln Phe Leu Leu Ser 35 40 45 Glu Phe Val Pro Gly Ala Gly Phe Val Leu Gly Leu Val Asp Ile Ile 50 55 60 Trp Gly Ile Phe Gly Pro Ser Gln Trp Asp Ala Phe Leu Val Gln Ile 65 70 75 80 Glu Gln Leu Ile Asn Gln Arg Ile Glu Glu Phe Ala Arg Asn Gln Ala 85 90 95 Ile Ser Arg Leu Glu Gly Leu Ser Asn Leu Tyr Gln Ile Tyr Ala Glu 100 105 110 Ser Phe Arg Glu Trp Glu Ala Asp Pro Thr Asn Pro Ala Leu Arg Glu 115 120 125 Glu Met Arg Ile Gln Phe Asn Asp Met Asn Ser Ala Leu Thr Thr Ala 130 135 140 Ile Pro Leu Phe Ala Val Gln Asn Tyr Gln Val Pro Leu Leu Ser Val 145 150 155 160 Tyr Val Gln Ala Ala Asn Leu His Leu Ser Val Leu Arg Asp Val Ser 165 170 175 Val Phe Gly Gln 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2016 Asp Glu Phe Cys Leu Asp Glu Lys Arg Glu Leu Ser Glu Lys Val Lys 660 665 670 cac gcc aag cgt ctc agc gac gag agg aat ctc ttg caa gac tcc aac 2064 His Ala Lys Arg Leu Ser Asp Glu Arg Asn Leu Leu Gln Asp Ser Asn 675 680 685 ttc aaa gac atc aac agg cag cca gaa cgt ggt tgg ggt gga agc acc 2112 Phe Lys Asp Ile Asn Arg Gln Pro Glu Arg Gly Trp Gly Gly Ser Thr 690 695 700 ggg atc acc atc caa gga ggc gac gat gtg ttc aag gag aac tac gtc 2160 Gly Ile Thr Ile Gln Gly Gly Asp Asp Val Phe Lys Glu Asn Tyr Val 705 710 715 720 acc ctc tcc gga act ttc gac gag tgc tac cct acc tac ttg tac cag 2208 Thr Leu Ser Gly Thr Phe Asp Glu Cys Tyr Pro Thr Tyr Leu Tyr Gln 725 730 735 aag atc gat gag tcc aaa ctc aaa gcc ttc acc agg tat caa ctt aga 2256 Lys Ile Asp Glu Ser Lys Leu Lys Ala Phe Thr Arg Tyr Gln Leu Arg 740 745 750 ggc tac atc gaa gac agc caa gac ctt gaa atc tac tcg atc agg tac 2304 Gly Tyr Ile Glu Asp Ser Gln Asp Leu Glu Ile Tyr Ser Ile Arg Tyr 755 760 765 aat gcc aag cac gag acc gtg aat gtc cca ggt act ggt tcc ctc tgg 2352 Asn Ala Lys His Glu Thr Val Asn Val Pro Gly Thr Gly Ser Leu Trp 770 775 780 cca ctt tct gcc caa tct ccc att ggg aag tgt gga gag cct aac aga 2400 Pro Leu Ser Ala Gln Ser Pro Ile Gly Lys Cys Gly Glu Pro Asn Arg 785 790 795 800 tgc gct cca cac ctt gag tgg aat cct gac ttg gac tgc tcc tgc agg 2448 Cys Ala Pro His Leu Glu Trp Asn Pro Asp Leu Asp Cys Ser Cys Arg 805 810 815 gat ggc gag aag tgt gcc cac cat tct cat cac ttc tcc ttg gac atc 2496 Asp Gly Glu Lys Cys Ala His His Ser His His Phe Ser Leu Asp Ile 820 825 830 gat gtg gga tgt act gac ctg aat gag gac ctc gga gtc tgg gtc atc 2544 Asp Val Gly Cys Thr Asp Leu Asn Glu Asp Leu Gly Val Trp Val Ile 835 840 845 ttc aag atc aag acc caa gac gga cac gca aga ctt ggc aac ctt gag 2592 Phe Lys Ile Lys Thr Gln Asp Gly His Ala Arg Leu Gly Asn Leu Glu 850 855 860 ttt ctc gaa gag aaa cca ttg gtc ggt gaa gct ctc gct cgt gtg aag 2640 Phe Leu Glu Glu Lys Pro Leu Val Gly Glu Ala Leu Ala Arg Val Lys 865 870 875 880 aga gca gag aag aag 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Glu Phe Asn Asn 450 455 460 Ile Ile Ala Ser Asp Ser Ile Thr Gln Ile Pro Leu Val Lys Ala His 465 470 475 480 Thr Leu Gln Ser Gly Thr Thr Val Val Arg Gly Pro Gly Phe Thr Gly 485 490 495 Gly Asp Ile Leu Arg Arg Thr Ser Gly Gly Pro Phe Ala Tyr Thr Ile 500 505 510 Val Asn Ile Asn Gly Gln Leu Pro Gln Arg Tyr Arg Ala Arg Ile Arg 515 520 525 Tyr Ala Ser Thr Thr Asn Leu Arg Ile Tyr Val Thr Val Ala Gly Glu 530 535 540 Arg Ile Phe Ala Gly Gln Phe Asn Lys Thr Met Asp Thr Gly Asp Pro 545 550 555 560 Leu Thr Phe Gln Ser Phe Ser Tyr Ala Thr Ile Asn Thr Ala Phe Thr 565 570 575 Phe Pro Met Ser Gln Ser Ser Phe Thr Val Gly Ala Asp Thr Phe Ser 580 585 590 Ser Gly Asn Glu Val Tyr Ile Asp Arg Phe Glu Leu Ile Pro Val Thr 595 600 605 Ala Thr Leu Glu Ala Glu Tyr Asn Leu Glu Arg Ala Gln Lys Ala Val 610 615 620 Asn Ala Leu Phe Thr Ser Thr Asn Gln Leu Gly Leu Lys Thr Asn Val 625 630 635 640 Thr Asp Tyr His Ile Asp Gln Val Ser Asn Leu Val Thr Tyr Leu Ser 645 650 655 Asp Glu Phe Cys Leu Asp Glu Lys Arg Glu Leu Ser Glu Lys Val Lys 660 665 670 His Ala Lys Arg Leu Ser Asp Glu Arg Asn Leu Leu Gln Asp Ser Asn 675 680 685 Phe Lys Asp Ile Asn Arg Gln Pro Glu Arg Gly Trp Gly Gly Ser Thr 690 695 700 Gly Ile Thr Ile Gln Gly Gly Asp Asp Val Phe Lys Glu Asn Tyr Val 705 710 715 720 Thr Leu Ser Gly Thr Phe Asp Glu Cys Tyr Pro Thr Tyr Leu Tyr Gln 725 730 735 Lys Ile Asp Glu Ser Lys Leu Lys Ala Phe Thr Arg Tyr Gln Leu Arg 740 745 750 Gly Tyr Ile Glu Asp Ser Gln Asp Leu Glu Ile Tyr Ser Ile Arg Tyr 755 760 765 Asn Ala Lys His Glu Thr Val Asn Val Pro Gly Thr Gly Ser Leu Trp 770 775 780 Pro Leu Ser Ala Gln Ser Pro Ile Gly Lys Cys Gly Glu Pro Asn Arg 785 790 795 800 Cys Ala Pro His Leu Glu Trp Asn Pro Asp Leu Asp Cys Ser Cys Arg 805 810 815 Asp Gly Glu Lys Cys Ala His His Ser His His Phe Ser Leu Asp Ile 820 825 830 Asp Val Gly Cys Thr Asp Leu Asn Glu Asp Leu Gly Val Trp Val Ile 835 840 845 Phe Lys Ile Lys Thr Gln Asp Gly His Ala Arg Leu Gly Asn Leu Glu 850 855 860 Phe Leu Glu Glu Lys Pro Leu Val Gly Glu Ala Leu Ala Arg Val Lys 865 870 875 880 Arg Ala Glu Lys Lys Trp Arg Asp Lys Arg Glu Lys Leu Glu Trp Glu 885 890 895 Thr Asn Ile Val Tyr Lys Glu Ala Lys Glu Ser Val Asp Ala Leu Phe 900 905 910 Val Asn Ser Gln Tyr Asp Gln Leu Gln Ala Asp Thr Asn Ile Ala Met 915 920 925 Ile His Ala Ala Asp Lys Arg Val His Ser Ile Arg Glu Ala Tyr Leu 930 935 940 Pro Glu Leu Ser Val Ile Pro Gly Val Asn Ala Ala Ile Phe Glu Glu 945 950 955 960 Leu Glu Gly Arg Ile Phe Thr Ala Phe Ser Leu Tyr Asp Ala Arg Asn 965 970 975 Val Ile Lys Asn Gly Asp Phe Asn Asn Gly Leu Ser Cys Trp Asn Val 980 985 990 Lys Gly His Val Asp Val Glu Glu Gln Asn Asn Gln Arg Ser Val Leu 995 1000 1005 Val Val Pro Glu Trp Glu Ala Glu Val Ser Gln Glu Val Arg Val 1010 1015 1020 Cys Pro Gly Arg Gly Tyr Ile Leu Arg Val Thr Ala Tyr Lys Glu 1025 1030 1035 Gly Tyr Gly Glu Gly Cys Val Thr Ile His Glu Ile Glu Asn Asn 1040 1045 1050 Thr Asp Glu Leu Lys Phe Ser Asn Cys Val Glu Glu Glu Ile Tyr 1055 1060 1065 Pro Asn Asn Thr Val Thr Cys Asn Asp Tyr Thr Val Asn Gln 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aattctcagt ccaaagcctc aacaaggtca gggtacagag tctccaaacc attagccaaa 60 agctacagga gatcaatgaa gaatcttcaa tcaaagtaaa ctactgttcc agcacatgca 120 tcatggtcag taagtttcag aaaaagacat ccaccgaaga cttaaagtta gtgggcatct 180 ttgaaagtaa tcttgtcaac atcgagcagc tggcttgtgg ggaccagaca aaaaaggaat 240 ggtgcagaat tgttaggcgc acctaccaaa agcatctttg cctttattgc aaagataaag 300 cagattcctc tagtacaagt ggggaacaaa ataacgtgga aaagagctgt cctgacagcc 360 cactcactaa tgcgtatgac gaacgcagtg acgaccacaa aagaattagc ttgagctcag 420 gatttagcag cattccagat tgggttcaat caacaaggta cgagccatat cactttattc 480 aaattggtat cgccaaaacc aagaaggaac tcccatcctc aaaggtttgt aaggaagaat 540 tctcagtcca aagcctcaac aaggtcaggg tacagagtct ccaaaccatt agccaaaagc 600 tacaggagat caatgaagaa tcttcaatca aagtaaacta ctgttccagc acatgcatca 660 tggtcagtaa gtttcagaaa aagacatcca ccgaagactt aaagttagtg ggcatctttg 720 aaagtaatct tgtcaacatc gagcagctgg cttgtgggga ccagacaaaa aaggaatggt 780 gcagaattgt taggcgcacc taccaaaagc atctttgcct ttattgcaaa gataaagcag 840 attcctctag tacaagtggg gaacaaaata acgtggaaaa gagctgtcct gacagcccac 900 tcactaatgc gtatgacgaa cgcagtgacg accacaaaag aattccctct atataagaag 960 gcattcattc ccatttgaag gacacagaaa aatttgctac attgtttcac aaacttcaaa 1020 tattattcat ttatttgtca gctttcaaac tctttgtttc ttgtttgttg attgagaata 1080 tttaaaacaa tggcttcctc tatgctctct tccgctacta tggttgcctc tccggctcag 1140 gccactatgg tcgctccttt caacggactt aagtcctccg ctgccttccc agccacccgc 1200 aaggctaaca acgacattac ttccatcaca agcaacggcg gaagagttaa ctgcatgcag 1260 gccatg gac aac aac cca aac atc aac gaa tgc att cca tac aac tgc 1308 Asp Asn Asn Pro Asn Ile Asn Glu Cys Ile Pro Tyr Asn Cys 1 5 10 ttg agt aac cca gaa gtt gaa gta ctt ggt gga gaa cgc att gaa acc 1356 Leu Ser Asn Pro Glu Val Glu Val Leu Gly Gly Glu Arg Ile Glu Thr 15 20 25 30 ggt tac act ccc atc gac atc tcc ttg tcc ttg aca cag ttt ctg ctc 1404 Gly Tyr Thr Pro Ile Asp Ile Ser Leu Ser Leu Thr Gln Phe Leu Leu 35 40 45 agc gag ttc gtg cca ggt gct ggg ttc gtt ctc gga cta gtt gac atc 1452 Ser Glu Phe Val Pro Gly Ala Gly Phe Val Leu Gly Leu Val Asp Ile 50 55 60 atc tgg ggt atc ttt ggt cca tct caa tgg gat gca ttc ctg gtg caa 1500 Ile Trp Gly Ile Phe Gly Pro Ser Gln Trp Asp Ala Phe Leu Val Gln 65 70 75 att gag cag ttg atc aac cag agg atc gaa gag ttc gcc agg aac cag 1548 Ile Glu Gln Leu Ile Asn Gln Arg Ile Glu Glu Phe Ala Arg Asn Gln 80 85 90 gcc atc tct agg ttg gaa gga ttg agc aat ctc tac caa atc tat gca 1596 Ala Ile Ser Arg Leu Glu Gly Leu Ser Asn Leu Tyr Gln Ile Tyr Ala 95 100 105 110 gag agc ttc aga gag tgg gaa gcc gat cct act aac cca gct ctc cgc 1644 Glu Ser Phe Arg Glu Trp Glu Ala Asp Pro Thr Asn Pro Ala Leu Arg 115 120 125 gag gaa atg cgt att caa ttc aac gac atg aac agc gcc ttg acc aca 1692 Glu Glu Met Arg Ile Gln Phe Asn Asp Met Asn Ser Ala Leu Thr Thr 130 135 140 gct atc cca ttg ttc gca gtc cag aac tac caa gtt cct ctc ttg tcc 1740 Ala Ile Pro Leu Phe Ala Val Gln Asn Tyr Gln Val Pro Leu Leu Ser 145 150 155 gtg tac gtt caa gca gct aat ctt cac ctc agc gtg ctt cga gac gtt 1788 Val Tyr Val Gln Ala Ala Asn Leu His Leu Ser Val Leu Arg Asp Val 160 165 170 agc gtg ttt ggg caa agg tgg gga ttc gat gct gca acc atc aat agc 1836 Ser Val Phe Gly Gln Arg Trp Gly Phe Asp Ala Ala Thr Ile Asn Ser 175 180 185 190 cgt tac aac gac ctt act agg ctg att gga aac tac acc gac cac gct 1884 Arg Tyr Asn Asp Leu Thr Arg Leu Ile Gly Asn Tyr Thr Asp His Ala 195 200 205 gtt cgt tgg tac aac act ggc ttg gag cgt gtc tgg ggt cct gat tct 1932 Val Arg Trp Tyr Asn Thr Gly Leu Glu Arg Val Trp Gly Pro Asp Ser 210 215 220 aga gat tgg att aga tac aac cag ttc agg aga gaa ttg acc ctc aca 1980 Arg Asp Trp Ile Arg Tyr Asn Gln Phe Arg Arg Glu Leu Thr Leu Thr 225 230 235 gtt ttg gac att gtg tct ctc ttc ccg aac tat gac tcc aga acc tac 2028 Val Leu Asp Ile Val Ser Leu Phe Pro Asn Tyr Asp Ser Arg Thr Tyr 240 245 250 cct atc cgt aca gtg tcc caa ctt acc aga gaa atc tat act aac cca 2076 Pro Ile Arg Thr Val Ser Gln Leu Thr Arg Glu Ile Tyr Thr Asn Pro 255 260 265 270 gtt ctt gag aac ttc gac ggt agc ttc cgt ggt tct gcc caa ggt atc 2124 Val Leu Glu Asn Phe Asp Gly Ser Phe Arg Gly Ser Ala Gln Gly Ile 275 280 285 gaa ggc tcc atc agg agc cca cac ttg atg gac atc ttg aac agc ata 2172 Glu Gly Ser Ile Arg Ser Pro His Leu Met Asp Ile Leu Asn Ser Ile 290 295 300 act atc tac acc gat gct cac aga gga gag tat tac tgg tct gga cac 2220 Thr Ile Tyr Thr Asp Ala His Arg Gly Glu Tyr Tyr Trp Ser Gly His 305 310 315 cag atc atg gcc tct cca gtt gga ttc agc ggg ccc gag ttt acc ttt 2268 Gln Ile Met Ala Ser Pro Val Gly Phe Ser Gly Pro Glu Phe Thr Phe 320 325 330 cct ctc tat gga act atg gga aac gcc gct cca caa caa cgt atc gtt 2316 Pro Leu Tyr Gly Thr Met Gly Asn Ala Ala Pro Gln Gln Arg Ile Val 335 340 345 350 gct caa cta ggt cag ggt gtc tac aga acc ttg tct tcc acc ttg tac 2364 Ala Gln Leu Gly Gln Gly Val Tyr Arg Thr Leu Ser Ser Thr Leu Tyr 355 360 365 aga aga ccc ttc aat atc ggt atc aac aac cag caa ctt tcc gtt ctt 2412 Arg Arg Pro Phe Asn Ile Gly Ile Asn Asn Gln Gln Leu Ser Val Leu 370 375 380 gac gga aca gag ttc gcc tat gga acc tct tct aac ttg cca tcc gct 2460 Asp Gly Thr Glu Phe Ala Tyr Gly Thr Ser Ser Asn Leu Pro Ser Ala 385 390 395 gtt tac aga aag agc gga acc gtt gat tcc ttg gac gaa atc cca cca 2508 Val Tyr Arg Lys Ser Gly Thr Val Asp Ser Leu Asp Glu Ile Pro Pro 400 405 410 cag aac aac aat gtg cca ccc agg caa gga ttc tcc cac agg ttg agc 2556 Gln Asn Asn Asn Val Pro Pro Arg Gln Gly Phe Ser His Arg Leu Ser 415 420 425 430 cac gtg tcc atg ttc cgt tcc gga ttc agc aac agt tcc gtg agc atc 2604 His Val Ser Met Phe Arg Ser Gly Phe Ser Asn Ser Ser Val Ser Ile 435 440 445 atc aga gct cct atg ttc tct tgg ata cac cgt agt gct gag ttc aac 2652 Ile Arg Ala Pro Met Phe Ser Trp Ile His Arg Ser Ala Glu Phe Asn 450 455 460 aac atc att gca tcc gac agc att act caa ata ccc ttg gtg aaa gca 2700 Asn Ile Ile Ala Ser Asp Ser Ile Thr Gln Ile Pro Leu Val Lys Ala 465 470 475 cat aca ctt cag tca ggt act act gtt gtc aga ggt cca ggg ttt aca 2748 His Thr Leu Gln Ser Gly Thr Thr Val Val Arg Gly Pro Gly Phe Thr 480 485 490 gga gga gac att ctt cgt cgc aca agt gga gga ccc ttt gct tac act 2796 Gly Gly Asp Ile Leu Arg Arg Thr Ser Gly Gly Pro Phe Ala Tyr Thr 495 500 505 510 att gtt aac atc aat ggc caa ttg ccc caa agg tat cgt gca aga atc 2844 Ile Val Asn Ile Asn Gly Gln Leu Pro Gln Arg Tyr Arg Ala Arg Ile 515 520 525 cgc tat gcc tct act aca aat ctc agg atc tac gtg act gtt gca ggt 2892 Arg Tyr Ala Ser Thr Thr Asn Leu Arg Ile Tyr Val Thr Val Ala Gly 530 535 540 gaa agg atc ttt gct ggt cag ttc aac aag act atg gat acc ggt gac 2940 Glu Arg Ile Phe Ala Gly Gln Phe Asn Lys Thr Met Asp Thr Gly Asp 545 550 555 cct ttg aca ttc caa tct ttt agc tac gca act atc aac aca gct ttt 2988 Pro Leu Thr Phe Gln Ser Phe Ser Tyr Ala Thr Ile Asn Thr Ala Phe 560 565 570 aca ttc cca atg agc cag agt agc ttc aca gta ggt gct gac act ttc 3036 Thr Phe Pro Met Ser Gln Ser Ser Phe Thr Val Gly Ala Asp Thr Phe 575 580 585 590 agc tca ggg aat gaa gtt tac atc gac agg ttt gaa ttg att cca gtt 3084 Ser Ser Gly Asn Glu Val Tyr Ile Asp Arg Phe Glu Leu Ile Pro Val 595 600 605 act gca acc ctc gag gct gag tac aac ctt gag aga gcc cag aag gct 3132 Thr Ala Thr Leu Glu Ala Glu Tyr Asn Leu Glu Arg Ala Gln Lys Ala 610 615 620 gtg aac gcc ctc ttt acc tcc acc aat cag ctt ggc ttg aaa act aac 3180 Val Asn Ala Leu Phe Thr Ser Thr Asn Gln Leu Gly Leu Lys Thr Asn 625 630 635 gtt act gac tat cac att gac caa gtg tcc aac ttg gtc acc tac ctt 3228 Val Thr Asp Tyr His Ile Asp Gln Val Ser Asn Leu Val Thr Tyr Leu 640 645 650 agc gat gag ttc tgc ctc gac gag aag cgt gaa ctc tcc gag aaa gtt 3276 Ser Asp Glu Phe Cys Leu Asp Glu Lys Arg Glu Leu Ser Glu Lys Val 655 660 665 670 aaa cac gcc aag cgt ctc agc gac gag agg aat ctc ttg caa gac tcc 3324 Lys His Ala Lys Arg Leu Ser Asp Glu Arg Asn Leu Leu Gln Asp Ser 675 680 685 aac ttc aaa gac atc aac agg cag cca gaa cgt ggt tgg ggt gga agc 3372 Asn Phe Lys Asp Ile Asn Arg Gln Pro Glu Arg Gly Trp Gly Gly Ser 690 695 700 acc ggg atc acc atc caa gga ggc gac gat gtg ttc aag gag aac tac 3420 Thr Gly Ile Thr Ile Gln Gly Gly Asp Asp Val Phe Lys Glu Asn Tyr 705 710 715 gtc acc ctc tcc gga act ttc gac gag tgc tac cct acc tac ttg tac 3468 Val Thr Leu Ser Gly Thr Phe Asp Glu Cys Tyr Pro Thr Tyr Leu Tyr 720 725 730 cag aag atc gat gag tcc aaa ctc aaa gcc ttc acc agg tat caa ctt 3516 Gln Lys Ile Asp Glu Ser Lys Leu Lys Ala Phe Thr Arg Tyr Gln Leu 735 740 745 750 aga ggc tac atc gaa gac agc caa gac ctt gaa atc tac tcg atc agg 3564 Arg Gly Tyr Ile Glu Asp Ser Gln Asp Leu Glu Ile Tyr Ser Ile Arg 755 760 765 tac aat gcc aag cac gag acc gtg aat gtc cca ggt act ggt tcc ctc 3612 Tyr Asn Ala Lys His Glu Thr Val Asn Val Pro Gly Thr Gly Ser Leu 770 775 780 tgg cca ctt tct gcc caa tct ccc att ggg aag tgt gga gag cct aac 3660 Trp Pro Leu Ser Ala Gln Ser Pro Ile Gly Lys Cys Gly Glu Pro Asn 785 790 795 aga tgc gct cca cac ctt gag tgg aat cct gac ttg gac tgc tcc tgc 3708 Arg Cys Ala Pro His Leu Glu Trp Asn Pro Asp Leu Asp Cys Ser Cys 800 805 810 agg gat ggc gag aag tgt gcc cac cat tct cat cac ttc tcc ttg gac 3756 Arg Asp Gly Glu Lys Cys Ala His His Ser His His Phe Ser Leu Asp 815 820 825 830 atc gat gtg gga tgt act gac ctg aat gag gac ctc gga gtc tgg gtc 3804 Ile Asp Val Gly Cys Thr Asp Leu Asn Glu Asp Leu Gly Val Trp Val 835 840 845 atc ttc aag atc aag acc caa gac gga cac gca aga ctt ggc aac ctt 3852 Ile Phe Lys Ile Lys Thr Gln Asp Gly His Ala Arg Leu Gly Asn Leu 850 855 860 gag ttt ctc gaa gag aaa cca ttg gtc ggt gaa gct ctc gct cgt gtg 3900 Glu Phe Leu Glu Glu Lys Pro Leu Val Gly Glu Ala Leu Ala Arg Val 865 870 875 aag aga gca gag aag aag tgg agg gac aaa cgt gag aaa ctc gaa tgg 3948 Lys Arg Ala Glu Lys Lys Trp Arg Asp Lys Arg Glu Lys Leu Glu Trp 880 885 890 gaa act aac atc gtt tac aag gag gcc aaa gag tcc gtg gat gct ttg 3996 Glu Thr Asn Ile Val Tyr Lys Glu Ala Lys Glu Ser Val Asp Ala Leu 895 900 905 910 ttc gtg aac tcc caa tat gat cag ttg caa gcc gac acc aac atc gcc 4044 Phe Val Asn Ser Gln Tyr Asp Gln Leu Gln Ala Asp Thr Asn Ile Ala 915 920 925 atg atc cac gcc gca gac aaa cgt gtg cac agc att cgt gag gct tac 4092 Met Ile His Ala Ala Asp Lys Arg Val His Ser Ile Arg Glu Ala Tyr 930 935 940 ttg cct gag ttg tcc gtg atc cct ggt gtg aac gct gcc atc ttc gag 4140 Leu Pro Glu Leu Ser Val Ile Pro Gly Val Asn Ala Ala Ile Phe Glu 945 950 955 gaa ctt gag gga cgt atc ttt acc gca ttc tcc ttg tac gat gcc aga 4188 Glu Leu Glu Gly Arg Ile Phe Thr Ala Phe Ser Leu Tyr Asp Ala Arg 960 965 970 aac gtc atc aag aac ggt gac ttc aac aat ggc ctc agc tgc tgg aat 4236 Asn Val Ile Lys Asn Gly Asp Phe Asn Asn Gly Leu Ser Cys Trp Asn 975 980 985 990 gtg aaa ggt cat gtg gac gtg gag gaa cag aac aat cag cgt tcc gtc 4284 Val Lys Gly His Val Asp Val Glu Glu Gln Asn Asn Gln Arg Ser Val 995 1000 1005 ctg gtt gtg cct gag tgg gaa gct gaa gtg tcc caa gag gtt aga 4329 Leu Val Val Pro Glu Trp Glu Ala Glu Val Ser Gln Glu Val Arg 1010 1015 1020 gtc tgt cca ggt aga ggc tac att ctc cgt gtg acc gct tac aag 4374 Val Cys Pro Gly Arg Gly Tyr Ile Leu Arg Val Thr Ala Tyr Lys 1025 1030 1035 gag gga tac ggt gag ggt tgc gtg acc atc cac gag atc gag aac 4419 Glu Gly Tyr Gly Glu Gly Cys Val Thr Ile His Glu Ile Glu Asn 1040 1045 1050 aac acc gac gag ctt aag ttc tcc aac tgc gtc gag gaa gaa atc 4464 Asn Thr Asp Glu Leu Lys Phe Ser Asn Cys Val Glu Glu Glu Ile 1055 1060 1065 tat ccc aac aac acc gtt act tgc aac gac tac act gtg aat cag 4509 Tyr Pro Asn Asn Thr Val Thr Cys Asn Asp Tyr Thr Val Asn Gln 1070 1075 1080 gaa gag tac gga ggt gcc tac act agc cgt aac aga ggt tac aac 4554 Glu Glu Tyr Gly Gly Ala Tyr Thr Ser Arg Asn Arg Gly Tyr Asn 1085 1090 1095 gaa gct cct tcc gtt cct gct gac tat gcc tcc gtg tac gag gag 4599 Glu Ala Pro Ser Val Pro Ala Asp Tyr Ala Ser Val Tyr Glu Glu 1100 1105 1110 aaa tcc tac aca gat ggc aga cgt gag aac cct tgc gag ttc aac 4644 Lys Ser Tyr Thr Asp Gly Arg Arg Glu Asn Pro Cys Glu Phe Asn 1115 1120 1125 aga ggt tac agg gac tac aca cca ctt cca gtt ggc tat gtt acc 4689 Arg Gly Tyr Arg Asp Tyr Thr Pro Leu Pro Val Gly Tyr Val Thr 1130 1135 1140 aag gag ctt gag tac ttt cct gag acc gac aaa gtg tgg atc gag 4734 Lys Glu Leu Glu Tyr Phe Pro Glu Thr Asp Lys Val Trp Ile Glu 1145 1150 1155 atc ggt gaa acc gag gga acc ttc atc gtg gac agc gtg gag ctt 4779 Ile Gly Glu Thr Glu Gly Thr Phe Ile Val Asp Ser Val Glu Leu 1160 1165 1170 ctc ttg atg gag gaa taa tgagatccac gatatcctgc aggaattggc 4827 Leu Leu Met Glu Glu 1175 cggccagctt tcgttcgtat catcggtttc gacaacgttc gtcaagttca atgcatcagt 4887 ttcattgcgc acacaccaga atcctactga gtttgagtat tatggcattg ggaaaactgt 4947 ttttcttgta ccatttgttg tgcttgtaat ttactgtgtt ttttattcgg ttttcgctat 5007 cgaactgtga aatggaaatg gatggagaag agttaatgaa tgatatggtc cttttgttca 5067 ttctcaaatt aatattattt gttttttctc ttatttgttg tgtgttgaat ttgaaattat 5127 aagagatatg caaacatttt gttttgagta aaaatgtgtc aaatcgtggc ctctaatgac 5187 cgaagttaat atgaggagta aaacacttgt agttgtacca ttatgcttat tcactaggca 5247 acaaatatat tttcagacct agaaaagctg caaatgttac tgaatacaag tatgtcctct 5307 tgtgttttag acatttatgg actttccttt atgtaatttt ccagaatcct tgtcagattc 5367 taatcattgc tttataatta tagttatact catggatttg tagttgagta tgaaaatatt 5427 ttttaatgca ttttatgact tgccaattga ttgacaacat gcatcaatcg acc 5480 <210> 6 <211> 1176 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Synthetic Construct <400> 6 Asp Asn Asn Pro Asn Ile Asn Glu Cys Ile Pro Tyr Asn Cys Leu Ser 1 5 10 15 Asn Pro Glu Val Glu Val Leu Gly Gly Glu Arg Ile Glu Thr Gly Tyr 20 25 30 Thr Pro Ile Asp Ile Ser Leu Ser Leu Thr Gln Phe Leu Leu Ser Glu 35 40 45 Phe Val Pro Gly Ala Gly Phe Val Leu Gly Leu Val Asp Ile Ile Trp 50 55 60 Gly Ile Phe Gly Pro Ser Gln Trp Asp Ala Phe Leu Val Gln Ile Glu 65 70 75 80 Gln Leu Ile Asn Gln Arg Ile Glu Glu Phe Ala Arg Asn Gln Ala Ile 85 90 95 Ser Arg Leu Glu Gly Leu Ser Asn Leu Tyr Gln Ile Tyr Ala Glu Ser 100 105 110 Phe Arg Glu Trp Glu Ala Asp Pro Thr Asn Pro Ala Leu Arg Glu Glu 115 120 125 Met Arg Ile Gln Phe Asn Asp Met Asn Ser Ala Leu Thr Thr Ala Ile 130 135 140 Pro Leu Phe Ala Val Gln Asn Tyr Gln Val Pro Leu Leu Ser Val Tyr 145 150 155 160 Val Gln Ala Ala Asn Leu His Leu Ser Val Leu Arg Asp Val Ser Val 165 170 175 Phe Gly Gln Arg Trp Gly Phe Asp Ala Ala Thr Ile Asn Ser Arg Tyr 180 185 190 Asn Asp Leu Thr Arg Leu Ile Gly Asn Tyr Thr Asp His Ala Val Arg 195 200 205 Trp Tyr Asn Thr Gly Leu Glu Arg Val Trp Gly Pro Asp Ser Arg Asp 210 215 220 Trp Ile Arg Tyr Asn Gln Phe Arg Arg Glu Leu Thr Leu Thr Val Leu 225 230 235 240 Asp Ile Val Ser Leu Phe Pro Asn Tyr Asp Ser Arg Thr Tyr Pro Ile 245 250 255 Arg Thr Val Ser Gln Leu Thr Arg Glu Ile Tyr Thr Asn Pro Val Leu 260 265 270 Glu Asn Phe Asp Gly Ser Phe Arg Gly Ser Ala Gln Gly Ile Glu Gly 275 280 285 Ser Ile Arg Ser Pro His Leu Met Asp Ile Leu Asn Ser Ile Thr Ile 290 295 300 Tyr Thr Asp Ala His Arg Gly Glu Tyr Tyr Trp Ser Gly His Gln Ile 305 310 315 320 Met Ala Ser Pro Val Gly Phe Ser Gly Pro Glu Phe Thr Phe Pro Leu 325 330 335 Tyr Gly Thr Met Gly Asn Ala Ala Pro Gln Gln Arg Ile Val Ala Gln 340 345 350 Leu Gly Gln Gly Val Tyr Arg Thr Leu Ser Ser Thr Leu Tyr Arg Arg 355 360 365 Pro Phe Asn Ile Gly Ile Asn Asn Gln Gln Leu Ser Val Leu Asp Gly 370 375 380 Thr Glu Phe Ala Tyr Gly Thr Ser Ser Asn Leu Pro Ser Ala Val Tyr 385 390 395 400 Arg Lys Ser Gly Thr Val Asp Ser Leu Asp Glu Ile Pro Pro Gln Asn 405 410 415 Asn Asn Val Pro Pro Arg Gln Gly Phe Ser His Arg Leu Ser His Val 420 425 430 Ser Met Phe Arg Ser Gly Phe Ser Asn Ser Ser Val Ser Ile Ile Arg 435 440 445 Ala Pro Met Phe Ser Trp Ile His Arg Ser Ala Glu Phe Asn Asn Ile 450 455 460 Ile Ala Ser Asp Ser Ile Thr Gln Ile Pro Leu Val Lys Ala His Thr 465 470 475 480 Leu Gln Ser Gly Thr Thr Val Val Arg Gly Pro Gly Phe Thr Gly Gly 485 490 495 Asp Ile Leu Arg Arg Thr Ser Gly Gly Pro Phe Ala Tyr Thr Ile Val 500 505 510 Asn Ile Asn Gly Gln Leu Pro Gln Arg Tyr Arg Ala Arg Ile Arg Tyr 515 520 525 Ala Ser Thr Thr Asn Leu Arg Ile Tyr Val Thr Val Ala Gly Glu Arg 530 535 540 Ile Phe Ala Gly Gln Phe Asn Lys Thr Met Asp Thr Gly Asp Pro Leu 545 550 555 560 Thr Phe Gln Ser Phe Ser Tyr Ala Thr Ile Asn Thr Ala Phe Thr Phe 565 570 575 Pro Met Ser Gln Ser Ser Phe Thr Val Gly Ala Asp Thr Phe Ser Ser 580 585 590 Gly Asn Glu Val Tyr Ile Asp Arg Phe Glu Leu Ile 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(650)..(710) <220> <221> Intron <222> (727)..(1206) <223> rice actin intron RACT1 <220> <221> CDS <222> (1216)..(4752) <223> coding sequence for Cry1A.105 <220> <221> terminator <222> (4781)..(4990) <223> Ta.Hsp17 transcription termination and polyadenylation sequence <400> 7 ggtccgatgt gagacttttc aacaaagggt aatatccgga aacctcctcg gattccattg 60 cccagctatc tgtcacttta ttgtgaagat agtggaaaag gaaggtggct cctacaaatg 120 ccatcattgc gataaaggaa aggccatcgt tgaagatgcc tctgccgaca gtggtcccaa 180 agatggaccc ccacccacga ggagcatcgt ggaaaaagaa gacgttccaa ccacgtcttc 240 aaagcaagtg gattgatgtg atggtccgat gtgagacttt tcaacaaagg gtaatatccg 300 gaaacctcct cggattccat tgcccagcta tctgtcactt tattgtgaag atagtggaaa 360 aggaaggtgg ctcctacaaa tgccatcatt gcgataaagg aaaggccatc gttgaagatg 420 cctctgccga cagtggtccc aaagatggac ccccacccac gaggagcatc gtggaaaaag 480 aagacgttcc aaccacgtct tcaaagcaag tggattgatg tgatatctcc actgacgtaa 540 gggatgacgc acaatcccac tatccttcgc aagacccttc ctctatataa ggaagttcat 600 ttcatttgga gaggacacgc tgacaagctg actctagcag atcctctaga accatcttcc 660 acacactcaa gccacactat tggagaacac acagggacaa cacaccataa gatccaaggg 720 aggcctccgc cgccgccggt aaccaccccg cccctctcct ctttctttct ccgttttttt 780 ttccgtctcg gtctcgatct ttggccttgg tagtttgggt gggcgagagg cggcttcgtg 840 cgcgcccaga tcggtgcgcg ggaggggcgg gatctcgcgg ctggggctct cgccggcgtg 900 gatccggccc ggatctcgcg gggaatgggg ctctcggatg tagatctgcg atccgccgtt 960 gttgggggag atgatggggg gtttaaaatt tccgccgtgc taaacaagat caggaagagg 1020 ggaaaagggc actatggttt atatttttat atatttctgc tgcttcgtca ggcttagatg 1080 tgctagatct ttctttcttc tttttgtggg tagaatttga atccctcagc attgttcatc 1140 ggtagttttt cttttcatga tttgtgacaa atgcagcctc gtgcggagct tttttgtagg 1200 tagaagtgat caacc atg gac aac aac cca aac atc aac gag tgc atc ccg 1251 Met Asp Asn Asn Pro Asn Ile Asn Glu Cys Ile Pro 1 5 10 tac aac tgc ctc agc aac cct gag gtc gag gtg ctc ggc ggt gag cgc 1299 Tyr Asn Cys Leu Ser Asn Pro Glu Val Glu Val Leu Gly Gly Glu Arg 15 20 25 atc gag acc ggt tac acc ccc atc gac atc tcc ctc tcc ctc acg cag 1347 Ile Glu Thr Gly Tyr Thr Pro Ile Asp Ile Ser Leu Ser Leu Thr Gln 30 35 40 ttc ctg ctc agc gag ttc gtg cca ggc gct ggc ttc gtc ctg ggc ctc 1395 Phe Leu Leu Ser Glu Phe Val Pro Gly Ala Gly Phe Val Leu Gly Leu 45 50 55 60 gtg gac atc atc tgg ggc atc ttt ggc ccc tcc cag tgg gac gcc ttc 1443 Val Asp Ile Ile Trp Gly Ile Phe Gly Pro Ser Gln Trp Asp Ala Phe 65 70 75 ctg gtg caa atc gag cag ctc atc aac cag agg atc gag gag ttc gcc 1491 Leu Val Gln Ile Glu Gln Leu Ile Asn Gln Arg Ile Glu Glu Phe Ala 80 85 90 agg aac cag gcc atc agc cgc ctg gag ggc ctc agc aac ctc tac caa 1539 Arg Asn Gln Ala Ile Ser Arg Leu Glu Gly Leu Ser Asn Leu Tyr Gln 95 100 105 atc tac gct gag agc ttc cgc gag tgg gag gcc gac ccc act aac cca 1587 Ile Tyr Ala Glu Ser Phe Arg Glu Trp Glu Ala Asp Pro Thr Asn Pro 110 115 120 gct ctc cgc gag gag atg cgc atc cag ttc aac gac atg aac agc gcc 1635 Ala Leu Arg Glu Glu Met Arg Ile Gln Phe Asn Asp Met Asn Ser Ala 125 130 135 140 ctg acc acc gcc atc cca ctc ttc gcc gtc cag aac tac caa gtc ccg 1683 Leu Thr Thr Ala Ile Pro Leu Phe Ala Val Gln Asn Tyr Gln Val Pro 145 150 155 ctc ctg tcc gtg tac gtc cag gcc gcc aac ctg cac ctc agc gtg ctg 1731 Leu Leu Ser Val Tyr Val Gln Ala Ala Asn Leu His Leu Ser Val Leu 160 165 170 agg gac gtc agc gtg ttt ggc cag agg tgg ggc ttc gac gcc gcc acc 1779 Arg Asp Val Ser Val Phe Gly Gln Arg Trp Gly Phe Asp Ala Ala Thr 175 180 185 atc aac agc cgc tac aac gac ctc acc agg ctg atc ggc aac tac acc 1827 Ile Asn Ser Arg Tyr Asn Asp Leu Thr Arg Leu Ile Gly Asn Tyr Thr 190 195 200 gac cac gct gtc cgc tgg tac aac act ggc ctg gag cgc gtc tgg ggc 1875 Asp His Ala Val Arg Trp Tyr Asn Thr Gly Leu Glu Arg Val Trp Gly 205 210 215 220 cct gat tct aga gac tgg att cgc tac aac cag ttc agg cgc gag ctg 1923 Pro Asp Ser Arg Asp Trp Ile Arg Tyr Asn Gln Phe Arg Arg Glu Leu 225 230 235 acc ctc acc gtc ctg gac att gtg tcc ctc ttc ccg aac tac gac tcc 1971 Thr Leu Thr Val Leu Asp Ile Val Ser Leu Phe Pro Asn Tyr Asp Ser 240 245 250 cgc acc tac ccg atc cgc acc gtg tcc caa ctg acc cgc gaa atc tac 2019 Arg Thr Tyr Pro Ile Arg Thr Val Ser Gln Leu Thr Arg Glu Ile Tyr 255 260 265 acc aac ccc gtc ctg gag aac ttc gac ggt agc ttc agg ggc agc gcc 2067 Thr Asn Pro Val Leu Glu Asn Phe Asp Gly Ser Phe Arg Gly Ser Ala 270 275 280 cag ggc atc gag ggc tcc atc agg agc cca cac ctg atg gac atc ctc 2115 Gln Gly Ile Glu Gly Ser Ile Arg Ser Pro His Leu Met Asp Ile Leu 285 290 295 300 aac agc atc act atc tac acc gat gcc cac cgc ggc gag tac tac tgg 2163 Asn Ser Ile Thr Ile Tyr Thr Asp Ala His Arg Gly Glu Tyr Tyr Trp 305 310 315 tcc ggc cac cag atc atg gcc tcc ccg gtc ggc ttc agc ggc ccc gag 2211 Ser Gly His Gln Ile Met Ala Ser Pro Val Gly Phe Ser Gly Pro Glu 320 325 330 ttt acc ttt cct ctc tac ggc acg atg ggc aac gcc gct cca caa caa 2259 Phe Thr Phe Pro Leu Tyr Gly Thr Met Gly Asn Ala Ala Pro Gln Gln 335 340 345 cgc atc gtc gct cag ctg ggc cag ggc gtc tac cgc acc ctg agc tcc 2307 Arg Ile Val Ala Gln Leu Gly Gln Gly Val Tyr Arg Thr Leu Ser Ser 350 355 360 acc ctg tac cgc agg ccc ttc aac atc ggt atc aac aac cag cag ctg 2355 Thr Leu Tyr Arg Arg Pro Phe Asn Ile Gly Ile Asn Asn Gln Gln Leu 365 370 375 380 tcc gtc ctg gat ggc act gag ttc gcc tac ggc acc tcc tcc aac ctg 2403 Ser Val Leu Asp Gly Thr Glu Phe Ala Tyr Gly Thr Ser Ser Asn Leu 385 390 395 ccc tcc gct gtc tac cgc aag agc ggc acg gtg gat tcc ctg gac gag 2451 Pro Ser Ala Val Tyr Arg Lys Ser Gly Thr Val Asp Ser Leu Asp Glu 400 405 410 atc cca cca cag aac aac aat gtg ccc ccc agg cag ggt ttt tcc cac 2499 Ile Pro Pro Gln Asn Asn Asn Val Pro Pro Arg Gln Gly Phe Ser His 415 420 425 agg ctc agc cac gtg tcc atg ttc cgc tcc ggc ttc agc aac tcg tcc 2547 Arg Leu Ser His Val Ser Met Phe Arg Ser Gly Phe Ser Asn Ser Ser 430 435 440 gtg agc atc atc aga gct cct atg ttc tct tgg ata cac cgt agt gct 2595 Val Ser Ile Ile Arg Ala Pro Met Phe Ser Trp Ile His Arg Ser Ala 445 450 455 460 gag ttc aac aac atc att gca tcc gac agc att act caa ata ccc ttg 2643 Glu Phe Asn Asn Ile Ile Ala Ser Asp Ser Ile Thr Gln Ile 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Ser Ser Phe Thr Val Gly Ala 575 580 585 gac act ttc agc tca ggg aat gaa gtt tac atc gac agg ttt gaa ttg 3027 Asp Thr Phe Ser Ser Gly Asn Glu Val Tyr Ile Asp Arg Phe Glu Leu 590 595 600 att cca gtt act gca acc ctc gag gct gag tac aac ctt gag aga gcc 3075 Ile Pro Val Thr Ala Thr Leu Glu Ala Glu Tyr Asn Leu Glu Arg Ala 605 610 615 620 cag aag gct gtg aac gcc ctc ttt acc tcc acc aat cag ctt ggc ttg 3123 Gln Lys Ala Val Asn Ala Leu Phe Thr Ser Thr Asn Gln Leu Gly Leu 625 630 635 aaa act aac gtt act gac tat cac att gac caa gtg tcc aac ttg gtc 3171 Lys Thr Asn Val Thr Asp Tyr His Ile Asp Gln Val Ser Asn Leu Val 640 645 650 acc tac ctt agc gat gag ttc tgc ctc gac gag aag cgt gaa ctc tcc 3219 Thr Tyr Leu Ser Asp Glu Phe Cys Leu Asp Glu Lys Arg Glu Leu Ser 655 660 665 gag aaa gtt aaa cac gcc aag cgt ctc agc gac gag agg aat ctc ttg 3267 Glu Lys Val Lys His Ala Lys Arg Leu Ser Asp Glu Arg Asn Leu Leu 670 675 680 caa gac tcc aac ttc aaa gac atc aac agg cag cca gaa cgt ggt tgg 3315 Gln Asp Ser Asn Phe Lys Asp Ile Asn Arg Gln Pro Glu Arg Gly Trp 685 690 695 700 ggt gga agc acc ggg atc acc atc caa gga ggc gac gat gtg ttc aag 3363 Gly Gly Ser Thr Gly Ile Thr Ile Gln Gly Gly Asp Asp Val Phe Lys 705 710 715 gag aac tac gtc acc ctc tcc gga act ttc gac gag tgc tac cct acc 3411 Glu Asn Tyr Val Thr Leu Ser Gly Thr Phe Asp Glu Cys Tyr Pro Thr 720 725 730 tac ttg tac cag aag atc gat gag tcc aaa ctc aaa gcc ttc acc agg 3459 Tyr Leu Tyr Gln Lys Ile Asp Glu Ser Lys Leu Lys Ala Phe Thr Arg 735 740 745 tat caa ctt aga ggc tac atc gaa gac agc caa gac ctt gaa atc tac 3507 Tyr Gln Leu Arg Gly Tyr Ile Glu Asp Ser Gln Asp Leu Glu Ile Tyr 750 755 760 tcg atc agg tac aat gcc aag cac gag acc gtg aat gtc cca ggt act 3555 Ser Ile Arg Tyr Asn Ala Lys His Glu Thr Val Asn Val Pro Gly Thr 765 770 775 780 ggt tcc ctc tgg cca ctt tct gcc caa tct ccc att ggg aag tgt gga 3603 Gly Ser Leu Trp Pro Leu Ser Ala Gln Ser Pro Ile Gly Lys Cys Gly 785 790 795 gag cct aac aga tgc gct cca cac ctt gag tgg aat cct gac ttg gac 3651 Glu Pro Asn Arg Cys Ala Pro His Leu Glu Trp Asn Pro Asp Leu Asp 800 805 810 tgc tcc tgc agg gat ggc gag aag tgt gcc cac cat tct cat cac ttc 3699 Cys Ser Cys Arg Asp Gly Glu Lys Cys Ala His His Ser His His Phe 815 820 825 tcc ttg gac atc gat gtg gga tgt act gac ctg aat gag gac ctc gga 3747 Ser Leu Asp Ile Asp Val Gly Cys Thr Asp Leu Asn Glu Asp Leu Gly 830 835 840 gtc tgg gtc atc ttc aag atc aag acc caa gac gga cac gca aga ctt 3795 Val Trp Val Ile Phe Lys Ile Lys Thr Gln Asp Gly His Ala Arg Leu 845 850 855 860 ggc aac ctt gag ttt ctc gaa gag aaa cca ttg gtc ggt gaa gct ctc 3843 Gly Asn Leu Glu Phe Leu Glu Glu Lys Pro Leu Val Gly Glu Ala Leu 865 870 875 gct cgt gtg aag aga gca gag aag aag tgg agg gac aaa cgt gag aaa 3891 Ala Arg Val Lys Arg Ala Glu Lys Lys Trp Arg Asp Lys Arg Glu Lys 880 885 890 ctc gaa tgg gaa act aac atc gtt tac aag gag gcc aaa gag tcc gtg 3939 Leu Glu Trp Glu Thr Asn Ile Val Tyr Lys Glu Ala Lys Glu Ser Val 895 900 905 gat gct ttg ttc gtg aac tcc caa tat gat cag ttg caa gcc gac acc 3987 Asp Ala Leu Phe Val Asn Ser Gln Tyr Asp Gln Leu Gln Ala Asp Thr 910 915 920 aac atc gcc atg atc cac gcc gca gac aaa cgt gtg cac agc att cgt 4035 Asn Ile Ala Met Ile His Ala Ala Asp Lys Arg Val His Ser Ile Arg 925 930 935 940 gag gct tac ttg cct gag ttg tcc gtg atc cct ggt gtg aac gct gcc 4083 Glu Ala Tyr Leu Pro Glu Leu Ser Val Ile Pro Gly Val Asn Ala Ala 945 950 955 atc ttc gag gaa ctt gag gga cgt atc ttt acc gca ttc tcc ttg tac 4131 Ile Phe Glu Glu Leu Glu Gly Arg Ile Phe Thr Ala Phe Ser Leu Tyr 960 965 970 gat gcc aga aac gtc atc aag aac ggt gac ttc aac aat ggc ctc agc 4179 Asp Ala Arg Asn Val Ile Lys Asn Gly Asp Phe Asn Asn Gly Leu Ser 975 980 985 tgc tgg aat gtg aaa ggt cat gtg gac gtg gag gaa cag aac aat cag 4227 Cys Trp Asn Val Lys Gly His Val Asp Val Glu Glu Gln Asn Asn Gln 990 995 1000 cgt tcc gtc ctg gtt gtg cct gag tgg gaa gct gaa gtg tcc caa 4272 Arg Ser Val Leu Val Val Pro Glu Trp Glu Ala Glu Val Ser Gln 1005 1010 1015 gag gtt aga gtc tgt cca ggt aga ggc tac att ctc cgt gtg acc 4317 Glu Val Arg Val Cys Pro Gly Arg Gly Tyr Ile Leu Arg Val Thr 1020 1025 1030 gct tac aag gag gga tac ggt gag ggt tgc gtg acc atc cac gag 4362 Ala Tyr Lys Glu Gly Tyr Gly Glu Gly Cys Val Thr Ile His Glu 1035 1040 1045 atc gag aac aac acc gac gag ctt aag ttc tcc aac tgc gtc gag 4407 Ile Glu Asn Asn Thr Asp Glu Leu Lys Phe Ser Asn Cys Val Glu 1050 1055 1060 gaa gaa atc tat ccc aac aac acc gtt act tgc aac gac tac act 4452 Glu Glu Ile Tyr Pro Asn Asn Thr Val Thr Cys Asn Asp Tyr Thr 1065 1070 1075 gtg aat cag gaa gag tac gga ggt gcc tac act agc cgt aac aga 4497 Val Asn Gln Glu Glu Tyr Gly Gly Ala Tyr Thr Ser Arg Asn Arg 1080 1085 1090 ggt tac aac gaa gct cct tcc gtt cct gct gac tat gcc tcc gtg 4542 Gly Tyr Asn Glu Ala Pro Ser Val Pro Ala Asp Tyr Ala Ser Val 1095 1100 1105 tac gag gag aaa tcc tac aca gat ggc aga cgt gag aac cct tgc 4587 Tyr Glu Glu Lys Ser Tyr Thr Asp Gly Arg Arg Glu Asn Pro Cys 1110 1115 1120 gag ttc aac aga ggt tac agg gac tac aca cca ctt cca gtt ggc 4632 Glu Phe Asn Arg Gly Tyr Arg Asp Tyr Thr Pro Leu Pro Val Gly 1125 1130 1135 tat gtt acc aag gag ctt gag tac ttt cct gag acc gac aaa gtg 4677 Tyr Val Thr Lys Glu Leu Glu Tyr Phe Pro Glu Thr Asp Lys Val 1140 1145 1150 tgg atc gag atc ggt gaa acc gag gga acc ttc atc gtg gac agc 4722 Trp Ile Glu Ile Gly Glu Thr Glu Gly Thr Phe Ile Val Asp Ser 1155 1160 1165 gtg gag ctt ctc ttg atg gag gaa taa tga gatctatcga ttctagaagg 4772 Val Glu Leu Leu Leu Met Glu Glu 1170 1175 cctgaattct gcatgcgttt ggacgtatgc tcattcaggt tggagccaat ttggttgatg 4832 tgtgtgcgag ttcttgcgag tctgatgaga catctctgta ttgtgtttct ttccccagtg 4892 ttttctgtac ttgtgtaatc ggctaatcgc caacagattc ggcgatgaat aaatgagaaa 4952 taaattgttc tgattttgag tgcaaaaaaa aaggaatt 4990 <210> 8 <211> 1177 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Synthetic Construct <400> 8 Met Asp Asn Asn Pro Asn Ile Asn Glu Cys Ile Pro Tyr Asn Cys Leu 1 5 10 15 Ser Asn Pro Glu Val Glu Val Leu Gly Gly Glu Arg Ile Glu Thr Gly 20 25 30 Tyr Thr Pro Ile Asp Ile Ser Leu Ser Leu Thr Gln Phe Leu Leu Ser 35 40 45 Glu Phe Val Pro Gly Ala Gly Phe Val Leu Gly Leu Val Asp Ile Ile 50 55 60 Trp Gly Ile Phe Gly Pro Ser Gln Trp Asp Ala Phe Leu Val Gln Ile 65 70 75 80 Glu Gln Leu Ile Asn Gln Arg Ile Glu Glu Phe Ala Arg Asn Gln Ala 85 90 95 Ile Ser Arg Leu Glu Gly Leu Ser Asn Leu Tyr Gln Ile Tyr Ala Glu 100 105 110 Ser Phe Arg Glu Trp Glu Ala Asp Pro Thr Asn Pro Ala Leu Arg Glu 115 120 125 Glu Met Arg Ile Gln Phe Asn Asp Met Asn Ser Ala Leu Thr Thr Ala 130 135 140 Ile Pro Leu Phe Ala Val Gln Asn Tyr Gln Val Pro Leu Leu Ser Val 145 150 155 160 Tyr Val Gln Ala Ala Asn Leu His Leu Ser Val Leu Arg Asp Val Ser 165 170 175 Val Phe Gly Gln Arg Trp Gly Phe Asp Ala Ala Thr Ile Asn Ser Arg 180 185 190 Tyr Asn Asp Leu Thr Arg Leu Ile Gly Asn Tyr Thr Asp His Ala Val 195 200 205 Arg Trp Tyr Asn Thr Gly Leu Glu Arg Val Trp Gly Pro Asp Ser Arg 210 215 220 Asp Trp Ile Arg Tyr Asn Gln Phe Arg Arg Glu Leu Thr Leu Thr Val 225 230 235 240 Leu Asp Ile Val Ser Leu Phe Pro Asn Tyr Asp Ser Arg Thr Tyr Pro 245 250 255 Ile Arg Thr Val Ser Gln Leu Thr Arg Glu Ile Tyr Thr Asn Pro Val 260 265 270 Leu Glu Asn Phe Asp Gly Ser Phe Arg Gly Ser Ala Gln Gly Ile Glu 275 280 285 Gly Ser Ile Arg Ser Pro His Leu Met Asp Ile Leu Asn Ser Ile Thr 290 295 300 Ile Tyr Thr Asp Ala His Arg Gly Glu Tyr Tyr Trp Ser Gly His Gln 305 310 315 320 Ile Met Ala Ser Pro Val Gly Phe Ser Gly Pro Glu Phe Thr Phe Pro 325 330 335 Leu Tyr Gly Thr Met Gly Asn Ala Ala Pro Gln Gln Arg Ile Val Ala 340 345 350 Gln Leu Gly Gln Gly Val Tyr Arg Thr Leu Ser Ser Thr Leu Tyr Arg 355 360 365 Arg Pro Phe Asn Ile Gly Ile Asn Asn Gln Gln Leu Ser Val Leu Asp 370 375 380 Gly Thr Glu Phe Ala Tyr Gly Thr Ser Ser Asn Leu Pro Ser Ala Val 385 390 395 400 Tyr Arg Lys Ser Gly Thr Val Asp Ser Leu Asp Glu Ile Pro Pro Gln 405 410 415 Asn Asn Asn Val Pro Pro Arg Gln Gly Phe Ser His Arg Leu Ser His 420 425 430 Val Ser Met Phe Arg Ser Gly Phe Ser Asn Ser Ser Val Ser Ile Ile 435 440 445 Arg Ala Pro Met Phe Ser Trp Ile His Arg Ser Ala Glu Phe Asn Asn 450 455 460 Ile Ile Ala Ser Asp Ser Ile Thr Gln Ile Pro Leu Val Lys Ala His 465 470 475 480 Thr Leu Gln Ser Gly Thr Thr Val Val Arg Gly Pro Gly Phe Thr Gly 485 490 495 Gly Asp Ile Leu Arg Arg Thr Ser Gly Gly Pro Phe Ala Tyr Thr Ile 500 505 510 Val Asn Ile Asn Gly Gln Leu Pro Gln Arg Tyr Arg Ala Arg Ile Arg 515 520 525 Tyr Ala Ser Thr Thr Asn Leu Arg Ile Tyr Val Thr Val Ala Gly Glu 530 535 540 Arg Ile Phe Ala Gly Gln Phe Asn Lys Thr Met Asp Thr Gly Asp Pro 545 550 555 560 Leu Thr Phe Gln Ser Phe Ser Tyr Ala Thr Ile Asn Thr Ala Phe Thr 565 570 575 Phe Pro Met Ser Gln Ser Ser Phe Thr Val Gly Ala Asp Thr Phe Ser 580 585 590 Ser Gly Asn Glu Val Tyr Ile Asp Arg Phe Glu Leu Ile Pro Val Thr 595 600 605 Ala Thr Leu Glu Ala Glu Tyr Asn Leu Glu Arg Ala Gln Lys Ala Val 610 615 620 Asn Ala Leu Phe Thr Ser Thr Asn Gln Leu Gly Leu Lys Thr Asn Val 625 630 635 640 Thr Asp Tyr His Ile Asp Gln Val Ser Asn Leu Val Thr Tyr Leu Ser 645 650 655 Asp Glu Phe Cys Leu Asp Glu Lys Arg Glu Leu Ser Glu Lys Val Lys 660 665 670 His Ala Lys Arg Leu Ser Asp Glu Arg Asn Leu Leu Gln Asp Ser Asn 675 680 685 Phe Lys Asp Ile Asn Arg Gln Pro Glu Arg Gly Trp Gly Gly Ser Thr 690 695 700 Gly Ile Thr Ile Gln Gly Gly Asp Asp Val Phe Lys Glu Asn Tyr Val 705 710 715 720 Thr Leu Ser Gly Thr Phe Asp Glu Cys Tyr Pro Thr Tyr Leu Tyr Gln 725 730 735 Lys Ile Asp Glu Ser Lys Leu Lys Ala Phe Thr Arg Tyr Gln Leu Arg 740 745 750 Gly Tyr Ile Glu Asp Ser Gln Asp Leu Glu Ile Tyr Ser Ile Arg Tyr 755 760 765 Asn Ala Lys His Glu Thr Val Asn Val Pro Gly Thr Gly Ser Leu Trp 770 775 780 Pro Leu Ser Ala Gln Ser Pro Ile Gly Lys Cys Gly Glu Pro Asn Arg 785 790 795 800 Cys Ala Pro His Leu Glu Trp Asn Pro Asp Leu Asp Cys Ser Cys Arg 805 810 815 Asp Gly Glu Lys Cys Ala His His Ser His His Phe Ser Leu Asp Ile 820 825 830 Asp Val Gly Cys Thr Asp Leu Asn Glu Asp Leu Gly Val Trp Val Ile 835 840 845 Phe Lys Ile Lys Thr Gln Asp Gly His Ala Arg Leu Gly Asn Leu Glu 850 855 860 Phe Leu Glu Glu Lys Pro Leu Val Gly Glu Ala Leu Ala Arg Val Lys 865 870 875 880 Arg Ala Glu Lys Lys Trp Arg Asp Lys Arg Glu Lys Leu Glu Trp Glu 885 890 895 Thr Asn Ile Val Tyr Lys Glu Ala Lys Glu Ser Val Asp Ala Leu Phe 900 905 910 Val Asn Ser Gln Tyr Asp Gln Leu Gln Ala Asp Thr Asn Ile Ala Met 915 920 925 Ile His Ala Ala Asp Lys Arg Val His Ser Ile Arg Glu Ala Tyr Leu 930 935 940 Pro Glu Leu Ser Val Ile Pro Gly Val Asn Ala Ala Ile Phe Glu Glu 945 950 955 960 Leu Glu Gly Arg Ile Phe Thr Ala Phe Ser Leu Tyr Asp Ala Arg Asn 965 970 975 Val Ile Lys Asn Gly Asp Phe Asn Asn Gly Leu Ser Cys Trp Asn Val 980 985 990 Lys Gly His Val Asp Val Glu Glu Gln Asn Asn Gln Arg Ser Val Leu 995 1000 1005 Val Val Pro Glu Trp Glu Ala Glu Val Ser Gln Glu Val Arg Val 1010 1015 1020 Cys Pro Gly Arg Gly Tyr Ile Leu Arg Val Thr Ala Tyr Lys Glu 1025 1030 1035 Gly Tyr Gly Glu Gly Cys Val Thr Ile His Glu Ile Glu Asn Asn 1040 1045 1050 Thr Asp Glu Leu Lys Phe Ser Asn Cys Val Glu Glu Glu Ile Tyr 1055 1060 1065 Pro Asn Asn Thr Val Thr Cys Asn Asp Tyr Thr Val Asn Gln Glu 1070 1075 1080 Glu Tyr Gly Gly Ala Tyr Thr Ser Arg Asn Arg Gly Tyr Asn Glu 1085 1090 1095 Ala Pro Ser Val Pro Ala Asp Tyr Ala Ser Val Tyr Glu Glu Lys 1100 1105 1110 Ser Tyr Thr Asp Gly Arg Arg Glu Asn Pro Cys Glu Phe Asn Arg 1115 1120 1125 Gly Tyr Arg Asp Tyr Thr Pro Leu Pro Val Gly Tyr Val Thr Lys 1130 1135 1140 Glu Leu Glu Tyr Phe Pro Glu Thr Asp Lys Val Trp Ile Glu Ile 1145 1150 1155 Gly Glu Thr Glu Gly Thr Phe Ile Val Asp Ser Val Glu Leu Leu 1160 1165 1170 Leu Met Glu Glu 1175

Claims (36)

1. SEQ ID NO:2에서 나타낸 아미노산 위치 10~600의 아미노산 서열을 포함하는 살충단백질을 암호화하는 분리된 폴리뉴클레오티드.
2. 제 1항에 있어서, 상기 분리된 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO:1과 SEQ ID NO:3로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 분리된 폴리뉴클레오티드.
3. 제 2항에 있어서, 상기 분리된 폴리뉴클레오티드는 작물 식물내에서 상기 살충단백질의 발현에 이용되는 것을 특징으로 하는 분리된 폴리뉴클레오티드.
4. 제 3항에 있어서, 상기 작물 식물은 단자엽 작물 식물과 쌍자엽 작물 식물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 분리된 폴리뉴클레오티드.
5. 제 4항에 있어서, 상기 단자엽 식물은 옥수수, 밀, 귀리, 쌀, 사탕수수, 마일로, 메밀, 호밀, 풀(김의털, 큰조아재비, 브롬, 새발풀, St.오그스틴, 버뮤다, 겨이삭띠) 및 보리로 이루어진 식물군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 분리된 폴리뉴클레오티드.
6. 제 4항에 있어서, 상기 쌍자엽 식물은 자주개자리, 사과, 살구, 아스파라거스, 콩, 장과, 검은나무딸기, 월귤나무열매, 캐놀라, 당근, 꽃양배추, 샐러리, 버찌, 이집트콩, 감귤류나무, 목화, 광저기, 덩굴월귤열매, 오이, 조롱박, 가지, 새발풀, 포도, 레몬, 상추, 아마씨, 메론, 겨자, 호두나무, 오크라, 오렌지, 완두, 복숭아, 땅콩, 배, 자두, 감자, 대두, 호박, 딸기, 사탕무, 해바라기, 고구마, 담배, 토마토, 순무 및 야채로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 분리된 폴리뉴클레오티드.
7. SEQ ID NO:2에 나타낸 아미노산 위치 10~600의 아미노산 서열을 포함하는 분리되고 정제된 살충단백질.
8. 살충을 위한 효과적인 양의 제 7항에 따른 분리되고 정제된 살충단백질을 포함하는 조성물.
9. 숙주 세포 내에서, SEQ ID NO:2에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 살충단백질의 발현에 사용하기 위한 발현카세트로서, 작동가능하게 연결된, 상기 숙주세포 내에서 기능하는 프로모터 서열과 상기 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현카세트.
10. 제9항에 있어서, 상기 숙주세포는 박테리아세포, 균류세포, 포유동물세포, 및 식물세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 발현카세트.
11. 제10항에 있어서,

    (a) 상기 박테리아세포는 바실러스종 세포, 엔테로박테리아캐종 세포, 슈도모나스종 세포, 클로스트리디움종 세포, 리조비움종 세포, 및 아그로박테리움종 세포로 이루어진 군으로부터 선택되고 ;

    (b) 상기 식물세포는 쌍자엽 식물과 단자엽 식물로 이루어진 군으로부터 선택되고, 상기 쌍자엽 식물은 자주개자리, 사과, 살구, 아스파라거스, 콩, 장과, 검은나무딸기, 월귤나무열매, 캐놀라, 당근, 꽃양배추, 샐러리, 버찌, 이집트콩, 감귤류나무, 목화, 광저기, 덩굴월귤열매, 오이, 조롱박, 가지, 새발풀(ochard), 포도, 레몬, 상추, 아마씨, 메론, 겨자, 호두나무, 오크라, 오렌지, 완두, 복숭아, 땅콩, 배, 자두, 감자, 대두, 호박, 딸기, 사탕무, 해바라기, 고구마, 담배, 토마토, 순무 및 야채로 이루어진 군으로부터 선택되고, 상기 단자엽 식물은 옥수수, 밀, 귀리, 쌀, 사탕수수, 마일로, 메밀, 호밀, 풀(김의털, 큰조아재비, 브롬, 새발풀, St.오그스틴, 버뮤다, 겨이삭띠) 및 보리로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 발현카세트.
12. 제 9항에 있어서, 상기 숙주세포는 식물세포이고, 상기 발현카세트는 작동가능하게 연결된 발현 강화제 서열, 미번역 리더서열, 인트론서열, 엽록체 타깃팅 펩티드 암호화 서열, 및 전사종료 및 폴리아데닐화 서열로 이루어진 군으로부터 선택 되는 폴리뉴클레오티드를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 발현카세트.
13. 제9항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 발현카세트를 포함하는 벡터.
14. SEQ ID NO:2에 나타낸 아미노산 위치 10~600의 아미노산 서열로 나타내어지며, 식물 또는 식물세포 내에서 발현되는 경우 살충활성을 나타내는 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 인시류 곤충 만연에 대해 내성이 있는 유전자도입 식물 또는 식물세포.
15. 제 14항에 있어서, 상기 유전자도입 식물은 쌍자엽 식물과 단자엽 식물로 이루어진 군으로부터 선택되고, 상기 쌍자엽 식물은 자주개자리, 사과, 살구, 아스파라거스, 콩, 장과, 검은나무딸기, 월귤나무열매, 캐놀라, 당근, 꽃양배추, 샐러리, 버찌, 이집트콩, 감귤류나무, 목화, 광저기, 덩굴월귤열매, 오이, 조롱박, 가지, 새발풀, 포도, 레몬, 상추, 아마씨, 메론, 겨자, 호두나무, 오크라, 오렌지, 완두, 복숭아, 땅콩, 배, 자두, 감자, 대두, 호박, 딸기, 사탕무, 해바라기, 고구마, 담배, 토마토, 순무, 및 야채로 이루어진 군으로부터 선택되고, 상기 단자엽 식물은 옥수수, 밀, 귀리, 쌀, 사탕수수, 마일로, 메밀, 호밀, 풀(김의털, 큰조아재비, 브롬, 새발풀, St.오그스틴, 버뮤다, 겨이삭띠) 및 보리로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 유전자도입 식물 또는 식물세포.
16. 제 15항에 있어서, 상기 인시류 곤충은 잎말이나방, 야도충, 거염벌레, 나무좀, 도롱이벌레, 및 사료 먹는 벌레로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 유전자도입 식물 또는 식물세포.
17. 제 16항에 있어서, 상기 인시류 곤충은 가을거염벌레, 유럽 옥수수잎 나무좀, 큰담배밤나방 또는 목화씨벌레, 사우스웨스턴 옥수수잎 나무좀, 및 검은 야도충으로 이루어진 군으로부터 더 선택되는 것을 특징으로 하는 유전자도입 식물 또는 식물세포.
18. 제 15항에 있어서, 상기 유전자도입 식물 또는 식물세포의 자손이나 종자는 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 유전자도입 식물 또는 식물세포.
19. 작동가능하게 연결된, 식물 기능성 프로모터와, 인시류 살충 활성을 나타내는 SEQ ID NO:2에 나타낸 아미노산 위치 10~600의 아미노산 서열로 나타내어지는 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산으로 형질전환된 하나 이상의 식물세포들을 곤충의 먹이에 제공함으로써 식물에 대한 인시류 곤충 만연을 조절하기 위한 방법.
20. 제 12항에 있어서, 상기 발현카세트는 SEQ ID NO:5와 SEQ ID NO:7으로 이루 어진 군으로부터 선택되는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 발현카세트.
21. 생물학적 시료 내에서, SEQ ID NO:2에 나타낸 아미노산 위치 약 10~ 약 600의 아미노산 서열로 나타내어지는 Cry1A.105 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 동정하는 방법으로서, 상기 시료와, 엄격한 혼성화 조건하에서 상기 폴리뉴클레오티드에 혼성화하는 폴리뉴클레오티드 프로브를 접촉시키고, 상기 시료 내에 상기 폴리뉴클레오티드가 존재할 때 나타나는 특징인, 상기 폴리뉴클레오티드 프로브와 상기 폴리뉴클레오티드의 결합을 검출하는 것을 포함하는 방법.
22. 시료 내에서 SEQ ID NO:2에 나타낸 아미노산 위치 약 10~약 600의 아미노산 서열로 나타내어지는 Cry1A.105 단백질을 동정하는 방법으로서, 상기 시료를 상기 단백질에 대해 특이적으로 결합하는 항체와 접촉시키고, 상기 시료 내에 상기 단백질이 존재할 때 나타나는 특징인, 상기 결합을 검출하는 것을 포함하는 방법.
23. SEQ ID NO:2에 나타낸 아미노산 약 1~약 612의 아미노산 서열로 나타내어지는 살충단백질을 암호화하는 분리된 폴리뉴클레오티드.
24. SEQ ID NO:2에 나타낸 아미노산 약 1~약 610의 아미노산 서열로 나타내어지는 살충단백질을 암호화하는 분리된 폴리뉴클레오티드.
25. 제 23항에 있어서, SEQ ID NO:1에 나타낸 뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 약 90%의 동일성을 나타내는 분리된 폴리뉴클레오티드.
26. 제 23항에 있어서, SEQ ID NO:3에 나타낸 뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 약 90%의 동일성을 나타내는 분리된 폴리뉴클레오티드.
27. SEQ ID NO:2에 나타낸 아미노산 위치 10~600의 아미노산 세그먼트로부터 선택되는 약 500~약 600개의 연속되는 아미노산들을 포함하는 아미노산 세그먼트를 포함하는 혼성 살충단백질.
28. SEQ ID NO:2에 나타낸 아미노산 위치 약 10~약 600의 아미노산 서열로 나타내어지는 살충 효과량의 Cry1A.105 단백질을 포함하는 조성물로서, 식물세포, 박테리아세포, 균류세포, 콜로이드, 에멀젼, 종자코팅, 먹이 및 분말로 이루어진 군으로부터 선택되는 조성물.
29. 제 28항에 있어서, 상기 Cry1A.105 단백질은 약 0.5ppm ~ 약 200ppm의 양으로 존재하는 것을 특징으로 하는 조성물.
30. 제 29항에 있어서, 상기 Cry1A.105 단백질은 약 0.5ppm ~ 약 20ppm의 양으로 존재하는 것을 특징으로 하는 조성물.
31. 제 29항에 있어서, 상기 조성물은 식물세포 또는 식물세포군인 것을 특징으로 하는 조성물.
32. 제 31항에 있어서, 상기 살충 효과량의 Cry1A.105 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO:1에 나타낸 뉴클레오티드 위치 1401~1420 및 SEQ ID NO:1에 나타낸 뉴클레오티드 위치 1821~1840으로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열이거나 또는 이 서열에 상보적인 프로브를 사용하여 검출가능한 양으로 존재하는 것을 특징으로 하는 조성물.
33. 제 31항에 있어서, 상기 살충 효과량의 단백질은 인시류 속 식물해충의 먹이로 제공될 경우, 상기 해충을 조절하기에 충분하고, 상기 해충은 안티카르시아(Anticarsia), 슈도프루시아(Pseudoplusia), 라치프루시아(Rachiplusia), 헬리오티스(Heliothis), 헬리코베르파(Helicoverpa), 스포돕테라(Spodoptera), 에피노티아(Epinotia) 및 아르미게라(Armigera)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
34. 유전자도입 작물 식물에서 인시류 곤충이 생존하는 것을 억제하기 위해, SEQ ID NO:2에 나타낸 아미노산 위치 약 10~약 600의 아미노산 서열을 포함하는 살충 효과량의 Cry1A.105 단백질 살충제를 상기 인시류 곤충의 먹이에 포함하는 유전자도입 작물 식물을 성장시키는 것을 포함하는, 경작지에서 상기 유전자도입 작물식물을 인시류 곤충의 만연으로부터 보호하는 방법.
35. 제 34항에 있어서, 상기 유전자도입 작물 식물은 Cry1A.105와 같이 동일한 곤충종들에 대해 독성이 있는 추가의 살충제를 더 포함하고, 상기 추가의 살충제는 바실러스톡신, 크세노르하브더스톡신, 포토하브더스톡신, 및 상기 곤충 종들 내의 하나 이상의 필수유전자들의 억압을 위해 특이적인 dsRNA로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
36. 제34항 또는 제35항에 있어서, 상기 작물의 수확은 상기 살충제 또는 살충제들이 결여된 동질 작물의 수확에 비해 향상되는 것을 특징으로 하는 방법.