JP2004506432A - Ｂａｃｉｌｌｕｓｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ殺虫性結晶タンパク質由来の新規殺虫性毒素 - Google Patents

Abstract

植物での発現のために最適化された合成ヌクレオチド配列は、ハイブリッドＢａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓδ−エンドトキシンＨ０４の変異体（ｖａｒｙｉｎｇ ｆｏｒｍ）であって、Ｃｒｙ１ＡｂのドメインＩおよびＩＩおよびＣｒｙ１ＣのドメインＩＩＩを含むものをコードする。殺虫性毒素を含む組成物および製剤は昆虫害虫を制御することができる。本発明はさらに、このハイブリッド毒素を作成する方法、およびこのヌクレオチド配列を使用する方法であって、例えば、昆虫害虫を制御する微生物中で、および昆虫抵抗性を付与するためにトランスジェニック植物におけるものを記載する。

Description

【０００１】
本発明は、バチラス・チューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）殺虫性結晶タンパク質由来の新規殺虫性毒素、発現が当該毒素をもたらす核酸配列、および、作成方法および該毒素および対応する核酸配列を使用し、昆虫を制御する方法に関する。
【０００２】
昆虫害虫は、作物喪失の主要な原因である。米国だけでも、何１０億ドルが、種々の属の害虫発生のために毎年失われる。圃場作物での喪失に加えて、昆虫害虫はまた、野菜および果実育成者に、鑑賞用花きの生産者に負担をかけ、そして家庭園芸および自宅所有者にめいわくである。
【０００３】
昆虫害虫はおもに、化学的殺虫剤の徹底的な適用によって制御され、これらは、昆虫の成長の阻害、昆虫喫食または生殖の防止、または昆虫の死を通して有効である。良好な昆虫制御はこうして到達されるが、これらの化学物質はときに、他の有益な昆虫にまた影響を与えることがある。化学的殺虫剤の広い使用から生じる他の問題は、抵抗性昆虫変種の出現である。これは、種々の抵抗性処置戦略によって一部緩和されたが、代替的な害虫制御物質の増加しつつある必要性がある。
【０００４】
生物学的昆虫制御物質、例えば、バチラスチューリンゲンシス菌株が発現する殺虫性毒素はまた、満足な結果で適用され、化学的殺虫剤の代替品または補足品を提供した。バチラスチューリンゲンシスは、グラム陽性、好気性、内生胞子形成バクテリアに属する。バチラスの他の非常に近縁の種、例えば、Ｂ． ｃｅｒｅｕｓまたはＢ． ａｎｔｈｒａｃｉｓとことなり、これまで知られたバチラスチューリンゲンシス種の大部分は、それらの胞子形成の過程で、その結晶性構造のために一般にまた結晶体とも呼ばれる副芽胞封入体を生産する。この結晶体は、殺虫的に活性の結晶プロ毒素タンパク質であるいわゆるδ−エンドトキシンからなる。これらのタンパク質結晶は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｅｒｉｎｇｅｉｅｎｓｉｓの昆虫に対する毒性の原因である。δ−エンドトキシンは、その結晶体の経口摂取後までその殺虫性活性を示さず、このとき、後者は標的昆虫の腸液中で溶解する。ほとんどの場合、活性毒素成分は、昆虫の消化管からのプロテアーゼの作用によってタンパク質分解切断の結果としてプロ毒素から放出される。
【０００５】
種々のＢａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ菌株のδ−エンドトキシンは、ある種の標的昆虫について、特に種々のＬｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ、ＣｏｌｅｏｐｔｅｒａおよびＤｉｐｔｅｒａ幼虫について高特異性によって、およびこれらの幼虫に対する高度の活性によって特徴付けられている。Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｅｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓのδ−エンドトキシンを使用するさらなる利点は、該毒素がヒト、他の哺乳動物、鳥類および魚類に無害であることにある。
【０００６】
配列相同性および殺虫性特異性に基づいて、Ｂａｃｉｌｕｓ ｔｈｅｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ結晶性タンパク質は、種々のクラスに分類された。タンパク質のＣｒｙ１クラスが、最も研究され、これらは、１４０ｋＤａのプロ毒素として生産され、そしてＬｅｐｉｄｏｐｔｅｒａｎに対して活性である。ある程度は、結晶タンパク質の作用の様式は解明された。経口摂取後、結晶は、幼虫の中腸のアルカリ環境中に溶解する。溶解したタンパク質は次に、中腸プロテイナーゼ（例えば、トリプシン）によって、昆虫中腸の内皮細胞上のレセプターに結合する約６５ｋＤａのプロテイナーゼ抵抗性毒素フラグメントに加工され、そして細胞膜を貫通する。これは最終的に細胞の破裂および幼虫の死につながる。
【０００７】
特定の結晶タンパク質の活性スペクトルは、感受性昆虫の中腸内皮細胞上のレセプターの存在によって大部分決定される。このスペクトルは、結晶タンパク質の溶解の効率、およびそのインビボのタンパク質分解活性によって同時に決定される。昆虫が結晶タンパク質の一つヘの抵抗性を発達させた場合に、結晶タンパク質の、抵抗性昆虫の中腸内皮細胞ヘの結合が顕著に減少する点で、結晶タンパク質の、中腸内皮レセプターへの結合の重要性は、さらに実証される。
【０００８】
過去数年間、これらの結晶タンパク質のあるものをコードする遺伝子が単離され、そしてそれらのヘテロロガス宿主での発現が、経済的に重要な昆虫害虫の制御のためのもう一つの手段を提供することが示された。特に、トランスジェニック植物での殺虫性毒素、例えばＢａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｅｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ結晶性タンパク質の発現が、選択された昆虫害虫に対する有効な保護を提供し、そしてそのような毒素を発現するトランスジェニック植物が商業化され、農家が化学的昆虫制御物質の適用を減少させることを可能とした。さらに、特定の昆虫または昆虫クラスに対する殺虫性活性の程度を増強するように設計された選択された機能の組み合わせを有する組換え毒素を発現させること、または毒素タンパク質が活性である昆虫のスペクトルを拡張することがまた可能である。例えば、キメラ殺虫性タンパク質を、天然に見出されない新規な配列を有するように構築することができ、これはあるδ−エンドトキシンからの毒素部分と、異なるδ−エンドトキシンのプロ毒素（テイル）部分とを、組み合わせることによる。例えば、引用によりここに含ませるＷＯ９８／１５１７０参照。
【０００９】
結晶性タンパク質の毒性フラグメントは、３種の明瞭な構造ドメインからなると考えられる。ドメインＩという最もＮ末端側のドメインは、７つのらせんからなり、そして恐らく標的細胞膜に一部または全部が挿入される。ドメインＩＩは、いわゆるグリーク・キー−コンホメーション中に３つのβシートを含む。ドメインＩＩは、ほとんどの研究者によってレセプターと相互作用し、それによって毒性特異性を決定すると信じられる。実際に、ドメインＩＩ残基を、特異的毒性および高親和性結合と関係付ける多くの証拠がある。ドメインＩＩＩという最もＣ末端側のドメインは、いわゆるジェリーロール・コンホメーション中の２つのβシートからなり、そしてまた特異性を決定することに関係した。毒素間でドメインＩＩＩを、例えばコード領域間のインビボ組換えによって交換することは、特異的活性の変化という結果となることができる。そのようなハイブリッドを使用する結合実験は、ドメインＩＩＩが標的昆虫の推定レセプターへの結合に関係することを示し、このことはドメインＩＩＩがレセプター認識での役割を通して、特異性においてその役割を発揮し得ることを示唆する。
【００１０】
Ｃｒｙ１配列を投影するならば、ドメインＩはアミノ酸残基約２８ないし２６０、ドメインＩＩは約２６０ないし４６０、およびドメインＩＩＩは約４６０ないし６００にわたる。それぞれ引用によりここに含ませる、Ｎａｋａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．， Ａｇｒｉｃ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ５４（３）：７１５−７２４（１９９０）； Ｌｉ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３５３： ８１５−８２１（１９９１）； Ｇｅ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． ＣＨｅｍ． ２６６（２７）：１７９５４−１７９５８（１９９１）；およびＨｏｎｅｅ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ５（１１）： ２７９９−２８０６（１９９１）参照。引用によりここに含ませる米国特許番号５７３６１３１は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｅｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓハイブリッド毒素フラグメントであってそれらのＣ末端に第１Ｃｒｙタンパク質のドメインＩＩＩ、およびそのＣ末端に第２Ｃｒｙタンパク質のドメインＩおよびＩＩを含むものを記載する。そのようなハイブリッド結晶性タンパク質は、変化した殺虫性特異性を有する。例えば、Ｈ０４ハイブリッド毒素は、これはまたＤｅ Ｍａａｇｄ ｅｔ ａｌ．， Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ６２（５）：１５３７−１５４３（１９９６）に記載され、そのＮ末端にＣｒｙ１ＡｂのドメインＩおよびＩＩ、およびそのＣ末端にＣｒｙ１ＣのドメインＩＩＩを含む。Ｈ０４は、報告的には、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｅｘｉｇｕａ（シロイチモジヨトウ，ｂｅｅｔ ａｒｍｙｗｏｒｍ）に対して、親のＣｒｙ１Ａｂ毒素と比較して高度に毒性であり得、Ｃｒｙ１Ｃ親毒素よりも顕著により毒性である。それぞれ引用によりここに含ませる、Ｂｏｓｃｈ ｅｔ ａｌ．， ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ １１８： １２９−１３４（１９９４）； Ｂｏｓｃｈ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １２： ９１５−９１８（１９９４）；Ｄｅ Ｍａａｇｄ ｅｔ ａｌ．， Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ６２（８）： ２７５３−２７５７（１９９６）；およびＤｅ Ｍａａｇｄ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ３１（２）：４６３−４７１（１９９９）参照。
【００１１】
育種計画および遺伝子改変を介する昆虫抵抗性遺伝子の取りこみによる、以前の実施された成功にもかかわらず、新しくかつ有効な昆虫制御物質の、長く感じられるが未履行の必要性が残存する。経済的に重要な昆虫害虫、例えば、アワノメイガ（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｒｎ Ｂｏｒｅｒ）およびフォールアーミーワーム（Ｆａｌｌ Ａｒｍｙ Ｗｏｒｍ）へ標的化され、かつ、既存の昆虫制御物質へ抵抗性の昆虫種を有効に制御する制御物質が、特に必要である。さらに、適用が環境への負荷を最小とする物質が望ましい。
【００１２】
本発明は、植物での発現のために最適化された合成ヌクレオチド配列を含む、ハイブリッドＢａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ毒素をコードする新規遺伝子配列を提供することによって、前記必要性と取り組む。好ましい実施態様では、該新規遺伝子配列は、変異体（ｖａｒｙｉｎｇ ｆｏｒｍｓ）であるハイブリッドＢａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓデルタエンドトキシンＨ０４という、Ｃｒｙ１ＡｂのドメインＩおよびＩＩ、およびＣｒｙＣ１のドメインＩＩＩを含む毒素部分をコードする。該新規遺伝子配列によってコードされるハイブリッドＢａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｅｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ毒素は、経済的に重要な昆虫害虫、例えば、ｆａｌｌ ａｒｍｙｗｏｒｍ、ワタアカミムシ（ｐｉｎｋ ｂｏｌｌｗｏｒｍ）、オオタバコガ（ｔｏｂｏｃｃｏ ｂｕｄｗｏｒｍ）、アワノメイガ（Ｅｕｒｏｐｅａｎ ｃｏｒｎｂｏｒｅｒ）、およびコナガ（ｄｉａｍｏｎｄｂａｃｋ ｍｏｔｈ）に対して高活性である。ハイブリッドＢａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ毒素を多重昆虫制御戦略で使用して、環境ヘの最小の影響で、最大の効験を得ることができる。
【００１３】
本発明はさらに、本発明のヌクレオチド配列の発現から生じるハイブリッド殺虫性毒素、該ハイブリッド殺虫性毒素を含む組成物および製剤を記載し、これらは、昆虫害虫の生存の能力を阻害すること、または作物植物での昆虫関連の被害または喪失を限定することができる。本発明はさらに、ハイブリッド毒素を生産する方法、および例えばトランスジェニック植物において、昆虫抵抗性を付与するために、該ヌクレオチド配列を使用する方法、および該毒素を使用する方法、および例えば該毒素、組成物、または製剤を昆虫に汚染した領域に適用するための、または昆虫感受性領域または植物を予防的に処理し、有害昆虫に対する保護または抵抗性を付与する組成物または製剤を記載する。該ハイブリッド毒素を使用し、多重の昆虫制御戦略で使用し、環境ヘの最小の影響での最大の有効性を結果をもたらすことができる。
【００１４】
１態様にしたがって、本発明は、ｆａｌｌ ａｒｍｙｗｏｒｍ、ワタアキミムシ、オオタバコガ、アワノメイガおよびコナガからなる群より選択される昆虫を制御する方法であって、該昆虫に有効量の、Ｃｒｙ１Ｃ毒素からのドメインＩＩＩへ、アミノからカルボキシへの方向で結合された、Ｃｒｙ１Ａｂ毒素からのドメインＩおよびＩＩを含む、ハイブリッドＢａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ毒素を送達することを含む方法を提供する。好ましい実施態様では、該ハイブリッドＢａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ毒素は、配列番号２、４、６、８、または１０に少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む。より好ましい実施態様では、該ハイブリッドＢａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ毒素は、配列番号２、４、６、８、または１０を含む。
【００１５】
本発明の前記方法のさらなる実施態様では、該ハイブリッドＢａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ毒素は、さらに、Ｃ末端テイル領域、例えば、Ｃｒｙ１Ｃテイル領域またはＣｒｙ１Ａｂテイル領域を含む。該Ｃ末端テイル領域は、完全長であり得、または例えば、近似的に４０アミノ酸長にトランケートされ得る。
【００１６】
本発明の前記方法の好ましい実施態様では、該ハイブリッドＢａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ毒素の有効量を昆虫に送達することは、昆虫に、該ハイブリッドＢａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ毒素をコードするヌクレオチド配列を含む組換えＤＮＡで形質転換されたトランスジェニック植物組織を喫食させ、またはそれと接触させることを含み、ここで該ハイブリッドＢａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ毒素の、当該トランスジェニック植物組織での発現が、該昆虫ヘの抵抗性を付与する。好ましくは、当該ヌクレオチド配列は、配列番号１、３、５、７、または９に実質的に同一である
【００１７】
更なる視点にしたがって、本発明は：（ａ）Ｃｒｙ１Ｃ毒素からのドメインＩＩＩへ、アミノからカルボキシへの方向で結合された、Ｃｒｙ１ＡｂからのドメインＩおよびＩＩを含むＮ末端毒素部分；および（ｂ）Ｃｒｙ１ＡＢ毒素からのＣ末端テイル領域を含む、ハイブリッドＢａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ毒素をコードするヌクレオチド配列を含む単離核酸分子を提供する。好ましくは、該ハイブリッドＢａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ毒素は、配列番号６、８、または１０に少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む。より好ましくは、該ハイブリッドＢａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ毒素は、配列番号６、８、または１０を含む。なおより好ましくは、当該ヌクレオチド配列は、配列番号５、７、または９に少なくとも９０％同一である。最も好ましくは当該ヌクレオチド配列は、配列番号５、７、または９を含む。
【００１８】
本発明は、さらに、前記のような本発明の核酸分子に作動可能に連結されたヘテロロガスプロモーター配列を含むキメラ遺伝子；そのようなキメラ遺伝子を含む組換えベクター；そのようなキメラ遺伝子を含むトランスジェニック宿主細胞（例えば、植物細胞）；そのようなトランスジェニック植物細胞を含むトランスジェニック植物（例えば、トウモロコシ、ワタ、イネまたはキャベツ植物；およびそのようなトランスジェニック植物由来の種子を提供する。
【００１９】
なおさらなる側面では、本発明は、昆虫に対して植物を保護する方法であって、（ａ）植物において上昇されたレベルで関連コード配列の転写を促進する核酸プロモーター配列；および（ｂ）当該プロモーター配列に作動可能に連結された本発明に従う核酸分子を含む、キメラ遺伝子で形質転換された植物においてハイブリッドＢａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ毒素を発現させることを含む方法を提供し、ここで、当該植物での該ハイブリッドＢａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ毒素の発現が、昆虫に対して当該植物を保護する。
【００２０】
なおさらなる側面にしたがって、本発明は、昆虫に対して活性であるハイブリッドＢａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ毒素を生産する方法であって、（ａ）本発明に従うトランスジェニック宿主細胞を取得すること、および（ｂ）本発明の核酸分子を、当該トランスジェニック宿主細胞で発現させること、を含む方法を提供し、これは、昆虫に対して活性であるハイブリッドＢａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ毒素をもたらす。
【００２１】
なおさらなる側面にしたがって、本発明は、昆虫に対して抵抗性である植物を生産する方法であって、本発明に従う核酸分子を当該植物に導入することを含む方法を提供し、ここで、当該核酸分子は、昆虫を制御するのに有効な量で当該植物中で発現可能である。
【００２２】
更なる側面にしたがって、本発明は配列番号３、５、７、９、１１、１２、１３、１４、１５、１６、または１７を含む単離核酸分子；そのような核酸分子に作動可能に連結されたヘテロロガスプロモーター配列を含むキメラ遺伝子；そのようなキメラ遺伝子を含む組換えベクター；そのようなキメラ遺伝子を含むトランスジェニック宿主細胞（例えば、植物細胞）；そのようなトランスジェニック植物細胞を含むトランスジェニック植物（例えば、トウモロコシ、ワタ、イネ、またはキャベツ植物）；およびそのようなトランスジェニック植物由来の種子を提供する。
【００２３】
なおさらなる側面にしたがって、本発明は、ハイブリッドＢａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ毒素であって、Ｃｒｙ１Ｃ毒素からのドメインＩＩＩへ、アミノからカルボキシへの方向で結合された、Ｃｒｙ１Ａｂ毒素からのドメインＩおよびＩＩを含むＮ末端毒素部分；および（ｂ）Ｃｒｙ１Ａｂ毒素からのＣ末端テイル領域を含む毒素を提供する。好ましくは、本発明のハイブリッドＢａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ毒素は、配列番号６、８、または１０に少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む。より好ましくは、本発明のハイブリッドＢａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ毒素は、配列番号６、８、または１０を含む。
【００２４】
更なる側面にしたがって、本発明は、本発明のハイブリッドＢａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ毒素を、昆虫を制御するのに有効量で含む組成物を提供する。
本発明のその他の側面および利点は、本発明の以下の説明および非限定的実施例の研究から当業者に明かとなる。
【００２５】
配列表の配列の簡単な説明
配列番号１は、Ｄｅ Ｍａａｇｄ ｅｔ ａｌ．， Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ６２（５）：１５３７−１５４３（１９９６）に記載されるＨ０４ハイブリッド毒素をコードするヌクレオチド配列を示す。該毒素部分は、そのＮ末端に、Ｃｒｙ１ＡｂのドメインＩおよびＩＩ、およびそのＣ末端にＣｒｙ１ＣのドメインＩＩＩ、加えて完全長Ｃｒｙ１Ｃテイル部分を含む。
【００２６】
配列番号２は、配列番号１に示されるヌクレオチド配列によってコードされるＨ０４ハイブリッド毒素のアミノ酸配列であって、Ｃｒｙ１Ａｂの毒素ドメインＩおよびＩＩ、およびＣｒｙ１Ｃの毒素ドメインＩＩＩ、加えて完全長Ｃｒｙ１Ｃテイル部分を含む配列を示す。
【００２７】
配列番号３は、テイルを欠くＨ０４の毒素部分をコードする合成ヌクレオチド配列を示し、あたかも該トリプシン位が切断されたかのようである。
配列番号４は、配列番号３に示される合成ヌクレオチド配列によってコードされるＨ０４毒素部分のアミノ酸配列を示す。
【００２８】
配列番号５は、Ｈ０４の毒素部分、加えて完全長Ｃｒｙ１Ａｂテイル部分をコードする合成ヌクレオチド配列を示す。
配列番号６は、配列番号５に示される合成ヌクレオチド配列によってコードされるＨ０４＋Ｃｒｙ１Ａｂテイルのアミノ酸配列を示す。
【００２９】
配列番号７は、Ｈ０４の毒素部分、加えて完全長Ｃｒｙ１Ａｂテイル部分をコードするさらなる合成ヌクレオチド配列を示す。
配列番号８は、配列番号７に示される合成ヌクレオチド配列によってコードされたＨ０４＋Ｃｒｙ１Ａｂテイルのアミノ酸配列を示す。
【００３０】
配列番号９は、Ｈ０４の毒素部分、加えてＣｒｙ１Ａｂテイルの最初の４０アミノ酸をコードする合成ヌクレオチド配列を示す。
配列番号１０は、配列番号９に示される合成ヌクレオチド配列によってコードされたＨ０４＋４０アミノ酸であるトランケートされたＣｒｙ１Ａｂテイルのアミノ酸配列を示す。
【００３１】
配列番号１１は、構築物ｐＮＯＶ１３０８のヌクレオチド配列を示し、これは配列番号３に示すような、テイルを欠くＨ０４の毒素部分をコードする合成ヌクレオチド配列に作動可能に連結される構成的トウモロコシユビキチンプロモーターを含む。
【００３２】
配列番号１２は、構築物ｐＮＯＶ１４３６のヌクレオチド配列を示し、これは配列番号５に示すような、Ｈ０４の毒素部分、加えて完全長Ｃｒｙ１Ａｂテイル部分をコードする合成ヌクレオチド配列に作動可能に連結された根優先性トウモロコシＭＴＬプロモーターを含む。
【００３３】
配列番号１３は、構築物ｐＮＯＶ１４４１のヌクレオチド配列を示し、これは、配列番号５に示すような、Ｈ０４毒素部分、加えて完全長Ｃｒｙ１Ａｂテイル部分をコードする合成ヌクレオチド配列に作動可能に連結された構成的トウモロコシユビキチンプロモーターを含む。
【００３４】
配列番号１４は、構築物ｐＮＯＶ１３０５のヌクレオチド配列を示し、これは、配列番号７に示すような、Ｈ０４の毒素部分、加えて完全長Ｃｒｙ１Ａｂテイル部分をコードする合成ヌクレオチド配列に作動可能に連結された構成的トウモロコシユビキチンプロモーターを含む。
【００３５】
配列番号１５は、構築物ｐＮＯＶ１３１３のヌクレオチド配列を示し、これは、配列番号７に示すような、Ｈ０４の毒素部分、加えて完全長のＣｒｙ１Ａｂテイル部分をコードする合成ヌクレオチド配列に作動可能に連結された構成的トウモロコシユビキチンプロモーターを含む。
【００３６】
配列番号１６は、構築物ｐＮＯＶ１４３５のヌクレオチド配列を示し、これは、配列番号９に示すような、Ｈ０４の毒素部分、加えて最初の４０アミノ酸のＣｒｙ１Ａｂテイルをコードする合成ヌクレオチド配列に作動可能に連結された根優先性トウモロコＭＴＬプロモーターを含む。
【００３７】
配列番号１７は、構築物ｐＺＵ５７８のヌクレオチド配列を示し、これは、配列番号９に示すような、Ｈ０４の毒素部分、加えて最初の４０アミノ酸のＣｒｙ１Ａｂテイルをコードする合成ヌクレオチド配列に作動可能に連結されたアラビドプシスアクチン−２プロモーターを含む。
【００３８】
定義
本発明の毒素の「活性」は、経口的に活性の昆虫制御物質としての毒素機能が、毒性効果を有し、または昆虫喫食を崩壊または阻害する（ｄｅｔｅｒ）ことのできることを意味し、これは昆虫の死を引き起こし得、または得ない。本発明の毒素を昆虫に送達するとき、結果は典型的には昆虫の死であり、または昆虫は、該毒素を昆虫に利用可能とする源を喫食しない（常食としない）。
【００３９】
「と関連され（ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ）／作動可能に連結され」は、物理的または機能的に関連する２種の核酸配列を言及する。例えば、プロモーターまたは調節ＤＮＡ配列は、もし該２種の配列が作動可能に連結され、または調節ＤＮＡ配列がコードまたは構造ＤＮＡ配列の発現レベルに影響するように位置するならば、ＲＮＡまたはタンパク質をコードするＤＮＡ配列「と関連され」ているという。
【００４０】
「結合部位」は、分子上の部位であって、ここで部位および毒素の間の結合が可逆的であり、その結果部位および毒素の間のＫａが少なくとも１０^４ｄｍ^３モル^−１のオーダーにある部位を意味する。
「キメラ遺伝子」は、組換え核酸配列であって、ここでプロモーターまたは調節核酸配列が、ｍＲＮＡをコードする核酸配列またはタンパク質として発現される核酸配列と作動可能に連結され、またはそれと関連され、その結果該調節核酸配列が関連された核酸配列の転写または発現を調節することのできる配列である。該キメラ遺伝子の調節核酸配列は、天然に見出される関連された核酸配列に通常は作動可能に連結されていない。
【００４１】
「コード配列」は、ＲＮＡに転写される核酸配列、例えばｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、センスＲＮＡまたはアンチセンスＲＮＡである。好ましくは該ＲＮＡは次いで、生物中で翻訳されタンパク質を生産する。
【００４２】
相補的：「相補的」は、逆平行ヌクレオチド配列中の相補的塩基残基の間で水素結合を形成すると、互いに対形成することのできる逆平行ヌクレオチド配列を含む２種のヌクレオチド配列を意味する。
【００４３】
特定の核酸配列の「同類に修飾された変異」は、同一または本質的に同一のアミノ酸配列をコードするこれらの核酸配列を意味し、または該核酸配列がアミノ酸配列をコードしない場合、本質的に同一の配列を意味する。遺伝的コードの縮重のために、多数の機能的に同一の核酸は、任意の所定のポリペプチドをコードする。例えば、コドンＣＧＴ、ＣＧＣ、ＣＧＡ、ＣＧＧ、ＡＧＡ、およびＡＧＧはすべてアミノ酸アルギニンをコードする。こうして、アルギニンがコドンによって特定される場合のすべての位置で、コドンを、コードされるタンパク質を変化させることなく、任意の対応する記載されたコドンに変化させることができる。そのような核酸変異は「サイレント変異」であり、これらは「同類に修飾された変異」の１種である。
【００４４】
ここに記載するすべての核酸配列は、すべての可能なサイレント変異をまた記載する。ただし特に注意する場合は除く。当業者は、核酸中のそれぞれのコドン（通常メチオニンのみをコードするＡＴＧを除く）を修飾し、標準的技法によって機能的に同一の分子を得ることができることを認識する。よって、タンパク質をコードする核酸の、それぞれの「サイレント変異」は、それぞれ記載の配列中に内在する。
【００４５】
さらに、当業者は、コード配列中の、単一のアミノ酸または小パーセンテージのアミノ酸（典型的には５％以下、より典型的には１％以下）を変化、付加または欠失させる個々の置換、欠失、または付加が、該変化が化学的に類似するアミノ酸とのアミノ酸の置換を生じる場合には、「同類に修飾された変異」である。機能的に類似のアミノ酸を提供する同類置換表は、当業界で周知である。以下の５群それぞれは、互いに同類置換であるアミノ酸を含む：脂肪族：グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）；芳香族：フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；硫黄含有：メチオニン（Ｍ）、システイン（Ｃ）；塩基性：アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）、ヒスチジン（Ｈ）；酸性：アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）。またＣｒｅｉｇｈｔｏｎ（１９８４）Ｐｔｏｔｅｉｎｓ， Ｗ．Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ参照。加えて、コード配列中の単一アミノ酸または小パーセンテージのアミノ酸を変化、付加、欠失させる、個々の置換、欠失または付加は、また「同類に修飾された変異」である。
【００４６】
昆虫を「制御する」ことは、毒性効果によって、昆虫害虫の生存、成長、喫食、および／または生殖する能力を阻害すること、または昆虫関連の作物植物の被害または喪失を限定することを意味する。昆虫を「制御する」ことは、昆虫を殺すことを意味し得、または得ないが、それは好ましくは昆虫を殺すことを意味する。
【００４７】
に対応している：本発明の文脈では、「に対応している」または「に対応する」は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓの種々のδ−エンドトキシン類の核酸コード配列またはアミノ酸配列を互いにアラインメントするときに、ある種の数で表される位置「に対応する」核酸またはアミノ酸が、これらの位置とアラインメントするが、特定のδ−エンドトキシンのそれぞれの核酸コード配列またはアミノ酸配列に相対して、必ずしもこれらの正確な数で表される位置にはないものであることを意味する。
【００４８】
同様に、特定のδ−エンドトキシン（例えば、Ｃｒｙ１Ｂ）のコードまたはアミノ酸配列を引用δ−エンドトキシン（例えば、Ｃｒｙ１Ａｂ）のコードまたはアミノ酸配列とアラインメントするとき、Ｃｒｙ１Ｂ配列のある種の数で表される位置に「対応する」Ｃｒｙ１Ｂ配列の核酸またはアミノ酸配列は、Ｃｒｙ１Ａｂ配列のこれらの位置とアラインメントするものであるが、Ｃｒｙ１Ｂ毒素のそれぞれの核酸コード配列またはアミノ酸配列の必ずしもこれらの正確な数で表される位置にないものである。
【００４９】
毒素を「送達する」は、該毒素が昆虫と接触するに至り、毒性効果および昆虫の制御をもたらすことを意味する。該毒素を多くの認識されるやり方で、例えば、昆虫による消化によって、またはトランスジェニック植物発現、製剤化されたタンパク質組成物（複数もある）、噴霧可能タンパク質組成物（複数もある）、ベイトマトリクス、または任意の他の当業界認識される毒素送達系を介する昆虫との接触によって経口的に、送達することができる。
【００５０】
ここで使用する「発現カセット」は、適当な宿主細胞で特定のヌクレオチド配列の発現を指示することのできる核酸配列であって、終結シグナルに作動可能に連結される所望のヌクレオチド配列に作動可能に連結されるプロモーターを含む配列を意味する。それは典型的にはまた、ヌクレオチド配列の正しい翻訳に要する配列を含む。所望のヌクレオチド配列を含む発現カセットは、キメラであり得、その構成要素の少なくとも一つがその他の構成要素の少なくとも１つについてヘテロロガスであることを意味する。発現カセットはまた、天然に存在するがヘテロロガス発現のために有用な組換え形態で取得したものであり得る。典型的にはしかし、発現カセットは宿主についてヘテロロガスであり、すなわち発現カセットの特定の核酸配列は、宿主に天然に存在せず、そして形質転換事象によって宿主細胞または宿主細胞の祖先に導入されたに違いない。発現カセットのヌクレオチド配列の発現は、構成的プロモーターの、または宿主細胞がある特定の外部刺激に曝露されるときにのみ転写を開始する誘導的プロモーターの制御下であり得る。多細胞生物、例えば植物の場合には、プロモーターはまた特定組織、または器官、または発達の段階に特異的であることができる。
【００５１】
遺伝子：用語「遺伝子」は、生物学的機能と関連した任意のＤＮＡのセグメントを意味するために広く使用する。こうして、遺伝子は、コード配列および／またはそれらの発現に要する調節配列を含む。遺伝子はまた、例えば、他のタンパク質の認識配列を形成する予測できないＤＮＡセグメントを含む。遺伝子は、所望の源からのクローニングまたは既知のまたは予測される配列情報からの合成を含む種々の源から取得することができる。
【００５２】
「所望の遺伝子」は、植物に移入されるとき、植物に望まれる特性、例えば、抗生物質抵抗性、ウイルス抵抗性、昆虫抵抗性、病害抵抗性、または他の害虫ヘの抵抗性、除草剤耐性、改善された栄養価、産業加工での改善された成績、または変化した生殖能力を付与する任意の遺伝子をいう。「所望の遺伝子」はまた、植物で商業的に有益な酵素または代謝物の生産のために植物に移入されるものであり得る。
【００５３】
ここで使用するように、「Ｈ０４」は、Ｄｅ Ｍａａｇｄ ｅｔ ａｌ．， Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ６２（５）：１５３７−１５４３（１９９６）に記載されるハイブリッドＢｔ毒素であって、そのＮ末端にＣｒｙ１ＡｂのドメインＩおよびＩＩ、およびそのＣ末端にＣｒｙ１ＣのドメインＩＩＩを含む毒素フラグメントをいう。
【００５４】
ヘテロロガス核酸配列：ここで使用されるような、用語「ヘテロロガス核酸［またはＤＮＡ］配列」、「外生核酸［またはＤＮＡ］セグメント」または「ヘテロロガス遺伝子」は、それぞれ特定宿主細胞に対して外来の源に起源する配列をいい、またはもし同じ源からであれば、その本来の形態から修飾されている。こうして、宿主細胞のヘテロロガス遺伝子は、特定宿主細胞に対して内生であるが、例えばコドン最適化の使用を経由して修飾された遺伝子を含む。該用語はまた、非天然存在の多重コピーの天然に存在する配列を含む。こうして、該用語は該細胞に外来またはヘテロロガスである、または該細胞に対してホモロガス（相同）であるが該エレメントが通常は見出されない宿主細胞核酸内の位置にある核酸セグメントをいう。外生核酸セグメントを発現させ、外生ポリペプチドを得る。
【００５５】
「相同的」核酸［またはＤＮＡ］配列は、それが導入される宿主細胞と天然に関連する核酸［またはＤＮＡ］である。
「相同的組換え」は、相同核酸分子間で核酸フラグメントの相互の交換である。
「ホモプラスチド性（ｈｏｍｏｐｌａｓｔｉｄｉｃ）」は、ここでプラスチドのすべてが遺伝的に同一である植物、植物組織または植物細胞をいう。これは、プラスチドが形質転換、突然変異、他には遺伝的に変化されてないときは、植物の正常な状態である。種々の組織または発達の状態では、プラスチドは種々の形態、例えば、クロロプラスト、プロプラスチド、エチオプラスト、アミロプラスト、クロモプラストなどを取り得る。
【００５６】
用語「同一な」またはパーセント「同一性」は、２またはそれ以上の核酸またはタンパク質配列の文脈では、以下に記載の配列比較アルゴリズムのいずれかを使用して、または目視検査によって測定されるような、比較され、そして最大一致についてアラインメントされるときに、同じである、または具体的パーセンテージの同じであるアミノ酸残基またはヌクレオチドを有する２またはそれ以上の配列（複数もある）をいう。
「殺虫性」は、昆虫を、好ましくはそれらを殺すことによって制御することのできる毒性生物学的活性として定義する。
核酸配列が、引用核酸配列によってコードされるポリペプチドと同じアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするとき、引用核酸配列「とイソコードする」である。
【００５７】
「単離された」核酸分子または単離された酵素は、人間の手によってその天然環境から離れて存在し、そしてしたがって天然の産物ではない核酸分子または酵素である。単離核酸分子又は酵素は、精製形態で存在し得、または非天然環境、例えば組換え宿主細胞中に存在し得る。
【００５８】
ハイブリッド毒素における毒素ドメイン間、すなわち本発明に従うハイブリッド殺虫性毒素のドメインＩＩとＩＩＩの間の「接合（ｊｕｎｃｔｕｒｅ）」は、ハイブリッド中の相同的乗り換え領域または部位である。乗り換え部位の左側のアミノ酸は、１の親毒素に由来し、一方乗り換え部位の右側のアミノ酸は、他の親毒素に由来する。
成熟タンパク質：細胞内オルガネラに通常にターゲティングされるタンパク質であって、移行ペプチドが除去されたもの。
最小プロモーター：プロモーターエレメント、特にＴＡＴＡエレメントであって、上流活性化の不存在下、不活性であり、または大きく減少されたプロモーター活性を有するもの。好適な転写因子の存在下、最小プロモーターは機能して転写を可能とする。
【００５９】
ネイティブは：非形質転換細胞のゲノム中に存在する遺伝子をいう。
天然に存在する：用語「天然に存在する」は、人間によって人工的に生産されることと明瞭に区別されるような、天然に見出すことのできる対象を記載するために使用する。例えば、生物（ウイルスを含む）に存在するタンパク質またはヌクレオチド配列であって、天然の源から単離することのでき、かつ実験室で人間によって意図的に修飾されていないものは、天然に存在する。
【００６０】
核酸：用語「核酸」は、一本または二本鎖形態のいずれかであるデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドおよびそれらの重合体を意味する。特に限定しない限り、該用語は、引用核酸として類似の結合特性を有し、かつ天然に存在するヌクレオチドと類似の態様で代謝される天然ヌクレオチドの既知の類似物を含む核酸を包含する。特に指摘しない限り、特定の核酸配列はまた、同類に修飾されたそれらの変異体（例えば、縮重コドン置換）および相補的配列、並びに明示的に指摘される配列を暗に包含する。具体的には、縮重コドン置換は、第３位置の１または２以上の選択された（またはすべての）コドンが混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換されている配列を生成することによって達成し得る（Ｂａｔｚｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ． １９：５０８１（１９９１）； Ｏｈｔｓｕｋａ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６０：２６０５−２６０８（１９８５）； Ｒｏｓｓｏｌｉｎｉ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｐｒｏｂｅｓ ８： ９１−９８（１９９４））。用語「核酸」または「核酸配列」はまた、遺伝子、ｃＤＮＡ、および該遺伝子によってコードされるｍＲＮＡと相互交換可能に使用し得る。
「ＯＲＦ」はオープンリーディングフレームを意味する。
タンパク質の「一部」によって、当該タンパク質によって含まれるペプチド、およびその連続配列の少なくとも８０％を有するペプチドを意味する。
「植物」は、任意の発達段階の任意の植物、特に種子植物である。
「植物細胞」は、植物の構造的、および生理学的単位であり、プロトプラストおよび細胞壁を含む。植物細胞は、単離単一細胞または培養細胞の形態で、または高度に組織化された単位、例えば、植物組織、植物器官、または全植物体の一部としての形態であり得る。
【００６１】
「植物細胞培養（物）」は、植物単位の培養（物）、例えば、種々の発達段階の、プロトプラスト、細胞培養細胞、植物組織の細胞、花粉、花粉管、胚珠、胚のう、接合子および胚を意味する。
「植物材料」は、植物の、葉、茎、根、花または花部分、果実、花粉、卵細胞、接合子、種子、挿し木、細胞、または組織培養物または任意の他の植物の部分または産物である。
【００６２】
「植物器官」は、植物の明瞭かつ可視的に構成されたおよび分化した部分、例えば、根、茎、葉、花芽、または胚である。
ここで使用する「植物組織」は、構造または機能的単位に組織化された植物細胞の群を意味する。インプランタまたは培養の植物の任意の組織が含まれる。この用語は、全植物体、植物器官、植物種子、植物培養物および構造的および／または機能的単位に組織された植物細胞の任意の群を含み得るがこれらに限定されない。前列挙のまたはその他のこの定義によって含まれる植物組織の任意の具体的型と結合して、またはその不存在でのこの用語の使用は、任意の他の型の植物組織の排除を意図しない。
【００６３】
「プロモーター」は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩの結合部位を含むコード領域の上流の非翻訳ＤＮＡ配列であり、そしてＤＮＡの転写を開始する。該プロモーター領域はまた、遺伝子発現のレギュレーターとして作用する他のエレメントを含み得る。
「プロトプラスト」は、細胞壁を欠く、または細胞壁の一部のみを有する単離植物細胞である。
【００６４】
精製され：用語「精製され」は、核酸またはタンパク質に適用されるとき、該核酸またはタンパク質が、それが天然状態で関連する他の細胞内構成要素の本質的にないことを意味する。それは乾燥して、または水性溶液中にあることができるけれども均質状態であるのが好ましい。純粋性または均質性は、典型的には分析化学技法、例えば、ポリアクリルアミドゲル電気泳動または高速液体クロマトグラフィーを使用して決定される。調製品中に存在する卓越種であるタンパク質は、実質的に精製されている。用語「精製され」は、核酸またはタンパク質が、電気泳動ゲル中に本質的に１のバンドを生じることを意味する。実際には、核酸またはタンパク質が少なくとも約５０％純粋、より好ましくは少なくとも約８５％純粋、および最も好ましくは少なくとも約９９％純粋であることを意味する。
【００６５】
２種の核酸は、該２種の核酸のそれぞれからの配列が、後代核酸中で組み合わされているとき、「組換えられ」ている。２種の核酸は両方の核酸が組換えのための基質であるときに、「直接的に」組換えられる。２種の核酸は、該配列が中間体、例えば乗り換えオリゴヌクレオチドを使用して組換えられるとき、「間接的に組換えられ」る。間接的な組換えのために、たった１の配列が、組換えのための実際の基質であり、そしてある場合には、何らの配列が再組換えのための基質でない。
【００６６】
「調節エレメント」は、ヌクレオチド配列の発現を制御することに関係する配列をいう。調節エレメントは、所望のヌクレオチド配列および終結シグナルに作動可能に連結されたプロモーターを含む。これらはまた、典型的には、ヌクレオチド配列の正しい翻訳に要する配列を含む。
【００６７】
実質的に同一な：字句「実質的に同一な」は、２種の核酸またはアミノ酸配列の文脈では、以下の配列比較アルゴリズムを使用のいずれかを使用して、または目視観察によって測定されるように、最大の一致のために比較され、およびアラインメントされるときに、少なくとも６０％、好ましくは８０％、なおより好ましくは９５％、そして最も好ましくは少なくとも９９％ヌクレオチドまたはアミノ酸残基同一性を有する２またはより多い配列またはサブ配列をいう。好ましくは、実質的同一性は、少なくとも約５０残基長、より好ましくは少なくとも約１００残基長、そして最も好ましくは該配列が、少なくとも約１５０残基を超えて実質的に同一である配列の領域にわたり存在する。最も好ましい実施態様では、配列は、コード領域の完全長にわたり実質的に同一である。さらに、実質的に同一な核酸配列またはタンパク質配列は、実質的に同じ機能を示す。
【００６８】
配列比較のために、典型的には１配列は、試験配列が比較される引用配列として作用する。配列比較アルゴリズムを使用するとき、試験および引用配列を、コンピューターに入力し、サブ配列コーディネイトを、必要ならば指定し、そして配列アルゴリズムプログラムパラメーターを指定する。配列比較アルゴリズムは次いで、指定されたプログラムパラメーターに基づいて、引用配列に対する試験配列（複数もある）についてパーセント同一性を計算する。
【００６９】
比較のための配列の至適アラインメントを、例えば、Ｓｍｉｔｈ ＆ Ｗａｔｅｒｍａｎ， Ａｄｖ． Ａｐｐｌ． Ｍａｔｈ． ２： ４８２（１９８１）のローカル相同性アルゴリズムによって、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ＆ Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ４８：４４３（１９７０）の相同性アラインメントアルゴリズムによって、Ｐｅａｒｓｏｎ ＆ Ｌｉｐｍａｎ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ’ｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５：２４４４（１９８８）の類似性方法のためのサーチによって、これらのアルゴリズムのコンピューター化された手段（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐｃａｋａｇｅ， Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ， ５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ． Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩにおけるＧＡＰ， ＢＥＳＴＦＩＴ， ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ）によって、または目視検査（全般にＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，前掲参照）によって実ｂ行することができる。
【００７０】
パーセント配列同一性および配列類似性を決定するために好適であるアルゴリズムの１例は、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２１５： ４０３−４１０（１９９０）に記載されるＢＬＡＳＴアルゴリズムである。ＢＬＡＳＴ分析を実施するソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）によって公衆に利用可能である。
【００７１】
このアルゴリズムは、データベース配列中の同じ長さのワードでアラインメントされるときに、ある肯定的値閾値スコアＴをマッチまたは満たす、クエリー配列中の長さＷのショートワードを同定することによって高スコアリング配列対（ＨＳＰ）をまず同定することに関係する。Ｔは隣接ワードスコア閾値として言及する（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．， １９９０）。これらの当初隣接ワードヒットは、これらを含むより長いＨＳＰを見出すようにサーチを開始するためのシードとして作用する。該ワードヒットを次いで、累積アラインメントスコアが増加する限り、それぞれの配列にそって両方向で伸長する。累積スコアを、ヌクレオチド配列について、パラメーターＭ（マッチする残基の対のためのリワードスコア；常に＞０）およびＮ（ミスマッチである残基のためのペンルティスコア；常に＜０）を使用して計算する。アミノ酸配列について、スコアリングマトリクスはを使用して、累積スコアを計算する。それぞれの方向の該ワードヒットの伸長は、該累積アラインメントスコアがその最大値達成値から量Ｘで低下するときに、累積スコアが１または２以上の否定的スコアリング残基アラインメントの蓄積のために０またはそれ以下に達する、またはいずれかの配列の末端に到達するときに、停止する。該ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメーターＷ、ＴおよびＸは感度およびアラインメントのスピードを決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列のため）はデフォルトとして、１１のワード長（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）、１００のカットオフ、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、および両方の鎖の比較を使用する。アミノ酸配列のために、ＢＬＡＳＴＰプログラムを、デフォルトとして、３のワード長（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）、およびＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックスを使用する（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ＆ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９：１０９１５（１９８９）参照）。
【００７２】
パーセント配列同一性を計算することに加えて、ＢＬＡＳＴアルゴリズムはまた、２種の配列の間の類似性の統計的分析を実施する（例えば、Ｋａｒｌｉｎ ＆ Ａｌｔｓｃｈｕｌ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ’ｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０：５８７３−５７７８（１９９３）参照）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって提供される類似性の一つの測定は、最も小さい合計確率（Ｐ（Ｎ））であって、これは、２種のヌクレオチドまたはアミノ酸配列の間のどのマッチが偶然に起こるかの確率の指摘を提供する。例えば、試験核酸配列は、試験核酸配列の引用核酸配列に対する比較における最も小さい合計確率が約０．１より小、より好ましくは約０．０１より小、そして最も好ましくは約０．００１より小であるならば、引用配列に類似であると考えられる。
【００７３】
２種の核酸配列が実質的に同一であることのもう１つの指摘は、２分子がストリンジェント条件下で互いにハイブリダイズすることである。「に特異的にハイブリダイズする」という字句は、その配列が複雑な混合物（例えば、総細胞）ＤＮＡまたはＲＮＡ中に存在するときに、ストリンジェント条件下で特定のヌクレオチド配列に対してのみの分子の、結合、二重らせん形成、またはハイブリダイズすることをいう。「実質的に結合する」は、プローブ核酸と標的核酸の間の相補的ハイブリダイゼーションをいい、そしてハイブリダイゼーション媒体のストリンジェンシーを減少させることによって適応させることのできる少しのミスマッチを含み、標的核酸配列の望まれる検出を達成する。
【００７４】
「ストリンジェントハイブリダイゼーション条件」および「ストリンジェントハイブリダイゼーション洗浄条件」は、核酸ハイブリダイゼーション実験、例えば、サザンおよびノーザンハイブリダイゼーションの文脈では、配列に依存し、そして異なる環境パラメーター下で異なる。より長い配列は、より高い温度で特異的にハイブリダイズする。核酸のハイブリダイゼーションへの詳細な案内は、Ｔｉｊｉｓｓｅｎ（１９９３）Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｂｅｓ ｐａｒｔ Ｉ ｃｈａｐｔｅｒ ２’’Ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｐｒｏｂｅ ａｓｓａｙｓ’’ Ｅｌｓｅｖｉｅｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋに見出される。一般に、高度にストリンジェントなハイブリダイゼーションおよび洗浄条件は、定義されたイオン強度およびｐＨで具体的配列についての熱融解点（Ｔ_ｍ）よりも約５℃より低いように選択される。典型的には、「ストリンジェント条件」下で、プローブはその標的サブ配列にハイブリダイズするが他の配列にハイブリダイズしない。
【００７５】
Ｔ_ｍは、標的配列の５０％が完全にマッチするプローブにハイブリダイズする（定義されたイオン強度およびｐＨでの）温度である。非常にストリンジェントな条件は、特定のプローブのためのＴ_ｍに同等であるように選択される。サザンまたはノーザンブロットでのフィルター上で１００より多い相補的残基を有する、相補的核酸のハイブリダイゼーションのためのストリンジェントハイブリダイゼーション条件の例は、終夜実施されるハイブリダイゼーションで、５０％ホルムアミドと、１ｍｇのヘパリンで４２℃である。高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション洗浄条件の例は、０．１５Ｍ　ＮａＣｌ、７２℃、約１５分である。ストリンジェント洗浄条件の例は、０．２ｘＳＳＣ洗浄、６５℃、１５分間である（ＳＳＣバッファーの記載のために、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，前掲参照）。しばしば、高ストリンジェント洗浄に、バックグラウンドプローブシグナルを除去するための低ストリンジェンシー洗浄が先行する。例えば１００より多いヌクレオチドの２重らせんのための、中度ストリンジェンシー洗浄の例は、４−６ｘＳＳＣ、４０℃、１５分間である。短いプローブ（例えば、約１０ないし５０ヌクレオチド）について、ストリンジェント条件は典型的には、約１．０Ｍ　Ｎａイオンより低い塩濃度、典型的には約０．０１ないし１．０Ｍ　Ｎａイオン濃度（または他の塩）、ｐＨ７．０ないし８．３であり、そして温度は典型的には、少なくとも約３０℃である。ストリンジェントは条件はまた、脱安定化剤、例えば、ホルムアミドの添加で達成することができる。一般に、特定のハイブリダイゼーションアッセイでの関連のないプローブについて観察されるものより２ｘ（またはより高い）のシグナル対ノイズ比率は、特異的ハイブリダイゼーションの検出を指摘する。ストリンジェント条件下で互いにハイブリダイズしない核酸は、もしそれらがコードするタンパク質が実質的に同一であるならば、なお実質的に同一である。これは例えば、あるコピーの核酸が、遺伝的コードによって許容される最大コドン縮重を使用して創出されるとき起こる。
【００７６】
以下は、本発明の引用ヌクレオチド配列に実質的に同一である相同ヌクレオチド配列をクローニングするために使用し得る、ハイブリダイゼーション／洗浄条件のセットの例である：ある引用ヌクレオチド配列は該引用配列に好ましくは、該引用ヌクレオチド配列に、７％　ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０．５Ｍ　ＮａＰＯ_４、１ｍＭ　ＥＤＴＡ、５０℃中と、洗浄は２ｘＳＳＣ、０．１％　ＳＤＳ、５０℃で、より望ましくは７％　ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０．５Ｍ　ＮａＰＯ_４、１ｍＭ　ＥＤＴＡ、５０℃中と、洗浄は１ｘＳＳＣ、０．１％　ＳＤＳ、５０℃で、より望ましくはなお７％　ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０．５Ｍ　ＮａＰＯ_４、１ｍＭ　ＥＤＴＡ、５０℃中と、洗浄は０．５ｘＳＳＣ、０．１％　ＳＤＳ、５０℃で、好ましくは７％　ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０．５Ｍ　ＮａＰＯ_４、１ｍＭ　ＥＤＴＡ、５０℃中と、洗浄は０．１ｘＳＳＣ、０．１％　ＳＤＳ、５０℃で、より好ましくは７％　ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０．５Ｍ　ＮａＰＯ_４、１ｍＭ　ＥＤＴＡ、５０℃中と、洗浄は０．１ｘＳＳＣ、０．１％　ＳＤＳ、６５℃でハイブリダイズする。
【００７７】
２種の核酸配列またはタンパク質が実質的に同一であるさらなる指摘は、第１の核酸によってコードされるタンパク質が、第２の核酸によってコードされたタンパク質と免疫学的に交差反応し、または特異的に結合することであれう。こうして、タンパク質は例えば、２タンパク質が同類置換のみによって異なる場合、第２タンパク質に典型的に実質的に同一である。
【００７８】
「特異的に（または選択的に）抗体に結合する」または「と特異的に（または選択的に）免疫反応性である」という字句は、タンパク質またはペプチドに言及するときは、タンパク質および他の生物製剤（ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）の不均質集団の存在下でタンパク質の存在を決定する結合反応をいう。こうして、指定された免疫アッセイ条件下、特定された抗体は、特定のタンパク質に結合し、そしてサンプル中に存在する他のタンパク質に有意な量では結合しない。そのような条件下での抗体への特異的結合は、特定のタンパク質についてのその特異性について選択される抗体を要し得る。例えば、本発明の任意の核酸配列によってコードされるアミノ酸配列のあるタンパク質に対してレイズされた抗体は、多型性変異体を除き、そのタンパク質と特異的に免疫反応性であり、他のタンパク質と免疫反応性でない抗体を取得することができる。種々の免疫アッセイ形式を使用し、特定のタンパク質と特異的に免疫反応する抗体を選択し得る。例えば、固相ＥＬＩＳＡ免疫アッセイ、ウェスタンブロット、または免疫組織化学をルーチンに使用し、タンパク質と特異的に免疫反応するモノクローナル抗体を選択する。特異的免疫反応性を決定するために使用することのできる免疫アッセイ形式または条件の記載のために、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｕｂｉｌｉｃａｔｉｏｎ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ’’Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ’’）参照。典型的には、特異的または選択的反応は、少なくとも２倍バックグラウンドシグナルまたはノイズ、およびより典型的には１０ないし１００倍バックグラウンドより大である。
【００７９】
「サブ配列」は、それぞれ核酸またはアミノ酸（例えばタンパク質）のより長い配列の一部を含む核酸またはアミノ酸の配列をいう。
「合成」は、天然配列に存在しない構造的特徴を含むヌクレオチド配列をいう。例えば、双子葉および／または単子葉植物遺伝子のＧ＋Ｃ含量および正常なコドン分布により近時する人工的配列は合成であるといわれる。
【００８０】
「形質転換」は、宿主細胞または生物にヘテロロガス核酸を導入するためのプロセスである。特に、「形質転換」は、所望の生物のゲノムへのＤＮＡ分子の安定的組みこみを意味する。形質転換された細胞、組織または昆虫は、形質転換プロセスの最終産物のみならず、またそのトランスジェニック後代を含むと理解される。
【００８１】
「形質転換され／トランスジェニック／組換え体」は、ヘテロロガス核酸分子が導入された宿主生物、例えば、バクテリアまたは植物をいう。核酸分子は、宿主のゲノムに安定的に組みこむことができ、または核酸分子は染色体外分子としてまた存在することができる。そのような染色体外分子は自己複製できる。形質転換細胞、組織、または植物は、形質転換プロセスの最終産物のみならず、そのトランスジェニック後代を含むと理解される。「非形質転換」、「非トランスジェニック」または「非組換え体」宿主は、ヘテロロガス核酸分子を含まない広い型の生物、例えば、バクテリアまたは植物をいう。
【００８２】
ヌクレオチドは、以下の標準的省略形によるこれらの塩基によって示される：アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）、およびグアニン（Ｇ）。アミノ酸は同様に、以下の標準的省略形によって示される：アラニン（Ａｌａ；Ａ）、アルギニン（Ａｒｇ；Ｒ）、アスパラギン（Ａｓｎ；Ｎ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ；Ｄ）、システイン（Ｃｙｓ；Ｃ）、グルタミン（Ｇｌｎ；Ｑ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ；Ｅ）、グリシン（Ｇｌｙ；Ｇ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ；Ｈ）、イソロイシン（Ｉｌｅ；Ｉ）、ロイシン（Ｌｅｕ；Ｌ）、リジン（Ｌｙｓ；Ｋ）、メチオニン（Ｍｅｔ；Ｍ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ；Ｆ）、プロリン（Ｐｒｏ；Ｐ）、セリン（Ｓｅｒ；Ｓ）、トレオニン（Ｔｈｒ；Ｔ）、トリプトファン（Ｔｒｐ；Ｗ）、チロシン（Ｔｙｒ；Ｙ）、およびバリン（Ｖａｌ；Ｖ）。さらに、（Ｘａａ；Ｘ）は任意のアミノ酸を表す。
【００８３】
本発明は、発現が新規毒素を生じる新規核酸配列に、および昆虫害虫を制御するための毒素の作成および使用に関する。特に、本発明は、ハイブリッドＢａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓデルタ−エンドトキシンＨ０４の変異体（ｖａｒｙｉｎｇ ｆｏｒｍ）をコードする、植物での発現のために最適化された合成遺伝子配列であって、該毒素部分はＣｒｙ１ＡｂのドメインＩおよびＩＩ、およびＣｒｙ１ＣのドメインＩＩＩを含む配列に関係する。ネイティブＣｒｙ１ＡｂおよびＣｒｙ１Ｃ遺伝子から構築されるような、Ｈ０４ハイブリッド毒素をコードするハイブリッド遺伝子は、米国特許番号５７３６１３１およびＤｅ Ｍａａｇｄ ｅｔ ａｌ．， Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ６２（５）：１５３７−１５４３（１９９６）に記載される。本発明の合成Ｈ０４遺伝子を構築する好ましい方法は、ＷＯ９３／０７２７８に示される。新規遺伝子配列によってコードされるハイブリッドＢａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ毒素は、経済的に重要な昆虫害虫、例えば、ｆａｌｌ ａｒｍｙｗｏｒｍ、ワタアカミムシ（ｐｉｎｋ ｂｏｌｌｗｏｒｍ）、オオタバコガ（ｔｏｂｏｃｃｏ ｂｕｄｗｏｒｍ）、アワノメイガ（Ｅｕｒｏｐｅａｎ ｃｏｒｎｂｏｒｅｒ）、およびコナガ（ｄｉａｍｏｎｄｂａｃｋ ｍｏｔｈ）に対して高活性である。該ハイブリッドＢａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ毒素を多重昆虫制御戦略で使用し、環境に最小影響で最大有効性をもたらすことができる。
【００８４】
本発明は、本発明の殺虫性毒素をコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡ分子を包含する。本発明はさらに、この発明の核酸配列を含む組換え体ベクターを包含する。そのようなベクターでは、核酸配列は好ましくは、ヌクレオチド配列を発現することの可能な宿主細胞中でのヌクレオチド配列の発現のための調節エレメントを含む発現カセット中に含まれる。そのような調節エレメントは通常、プロモーターおよび終結シグナルを含み、そして好ましくはまた、本発明の核酸配列によってコードされるタンパク質の効率的翻訳を可能とするエレメントを含む。核酸配列を含むベクターは通常、特定宿主細胞の、好ましくは染色体外分子としての複製が可能であり、したがって宿主細胞での本発明の核酸配列を増幅するために使用する。ある実施態様では、そのようなベクターのための宿主細胞は、微生物、例えば、バクテリア、特にｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓまたはＥ． ｃｏｌｉ中である。さらなる実施態様では、そのような組換え体ベクターのための宿主細胞は、エンドファイト（ｅｎｄｏｐｈｙｔｅｓ）またはエピファイト（ｅｐｉｐｈｙｔｅｓ）である。好ましいそのような宿主細胞は、真核細胞、例えば、植物細胞である。植物細胞、例えば、トウモロコシ細胞は、もとも好ましい宿主細胞である。
【００８５】
特に好ましい実施態様では、本発明の殺虫性毒素は、植物中で発現される。この場合に、有効量の毒素を発現するトランスジェニック植物は、昆虫害虫からそれ自体を保護する。昆虫がそのようなトランスジェニック植物のを喫食を始めるとき、それはまた発現された毒素を消化する。これは、植物組織ヘのさらなるかみこみから昆虫を阻止し、またはなお害を及ぼしまたは昆虫を殺し得る。
【００８６】
本出願に記載の核酸配列を、慣行組換えＤＮＡ技法を使用して植物細胞に取りこませることができる。一般に、これは、当業界で既知である標準的クローニング手法を使用して、コード配列がヘテロロガスである（すなわち通常存在しない）発現系に本発明のコード配列を挿入することに関係する。このベクターは、挿入されるタンパク質コード配列の転写および翻訳のため必要なエレメントを含む。多数の当業界で既知のベクター系、例えば、プラスミド、バクテリオファージウイルス、および他の修飾ウイルスを使用できる。好適なベクターは、ウイルスベクター、例えば、ラムダベクター系、λｇｔ１１、λｇｔ１０、およびシャロン４；プラスミドベクター、例えば、ｐＢＩ１２１、ｐＢＲ３２２、ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＡＲシリーズ、ｐＫＫ２３３−３、ｐＵＣ８、ｐＵＣ９、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＬＧ３３９、ｐＲＫ２９０、ｐＫＣ３７、ｐＫＣ１０１、ｐＣＤＮＡＩＩ；および他の類似系を含み得るがこれらに限定されない。形質転換された細胞を、全植物体に再製し、その結果本発明のヌクレオチド配列がトランスジェニック植物に昆虫抵抗性を付与することができる。
【００８７】
本発明にしたがって形質転換された植物は、単子葉または双子葉植物、トウモロコシ、コムギ、オオムギ、ライムギ、カンショ、インゲンマメ、エンドウマメ、チコリ、レタス、キャベツ、カリフラワー、ブロコッリー、ターニップ、ラディシュ、ホウレンソウ、アスパラガス、タマネギ、ニンニク、ペッパー、セルリー、スカッシュ、パンプキン、アサ、ズッキーニ、リンゴ、ナシ、マルメロ、メロン（例えば、ウォーターメロン）、スモモ、サクランボ、モモ、ネクタリン、アンズ、イチゴ、ブドウ、ラズベリー、ブラックベリー、パイナップル、アボカド、パパイヤ、マンゴ、バナナ、ダイズ、トマト、ソルガム、サトウキビ、テンサイ、ヒマワリ、ナタネ、クローバー、タバコ、ニンジン、ワタ、アルファルファ、イネ、ジャガイモ、ナス、キュウリ、アラビドプシス、および樹木植物、例えば、針葉樹および落葉樹を含み得るがこれらに限定されない。ひとたび望まれるヌクレオチド配列が特定植物種に形質転換されると、その種中で増殖し、または伝統的育種技法を使用して同じ種、とくに商業的変種（品種）の他の変種（品種）に移し得る。
【００８８】
トランスジェニック植物でのそれらの発現のために、本発明のヌクレオチド配列は、修飾および最適化を要し得る。多くの場合、微生物由来の遺伝子は、修飾なしに高レベルで植物中で発現することができるけれども、トランスジェニック植物中での低レベル発現は、植物に好ましくないコドンを有する、微生物性ヌクレオチド配列に起因し得る。すべての生物はコドン用法について特異的な優先性を有することが当業界で知られ、そして本発明に記載のヌクレオチド配列のコドンを変化させ、それによってコードされるアミノ酸を維持しつつ、植物優先性を確保することができる。さらに、植物での高レベル発現は、ＧＣ含量について少なくとも３５％、好ましくは約４５％より大、より好ましくは約５０％より大、そして最も好ましくは約６０％より大を有するコード配列から最良に達成する。低ＧＣ含量を有する微生物性ヌクレオチド配列は、伝令を脱安定化し得るＡＴＴＴＡモチーフ、および不適当なポリアデニル化を生じ得るＡＡＴＡＡＡモチーフの存在のために、植物で貧弱に発現し得る。好ましい遺伝子配列は単子葉および双子葉植物種でともに十分に発現し得るけれども、単子葉または双子葉植物の、特異的なコドン優先性およびＧＣ含量優先性のために配列を修飾することができ、これらの優先性が異なることが示されたとおりである（Ｍｕｒｒａｙ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １７： ４７７−４９８（１９８９））。加えて、ヌクレオチド配列を、伝令トランケーションを引き起こし得る非正統的（ｉｌｌｅｇｉｔｉｍａｔｅ）スプライシング部位の存在についてスクリーニングする。ヌクレオチド配列内で作成されるベく要求されるすべての変化、例えば、前記のものは、部位特異的突然変異誘発、ＰＣＲ、および公開特許出願ＥＰ０３８５９６２、ＥＰ０３５９４７２およびＷＯ９３／０７２７８に記載される方法を使用する合成遺伝子構築の当業界で周知の技法を使用して作成する。
【００８９】
翻訳の効率的な開始のために、開始メチオニンに隣接する配列は修飾を要し得る。例えば、これらを植物で有効であると知られる配列の包含によって修飾することができる。Ｊｏｓｈｉは、植物のための適当なコンセンサス配列を示唆し（ＮＡＲ １５： ６６４３−６６５３（１９８７））、そしてＣｌｏｎｔｅｃｈはさらなるコンセンサス翻訳イニシエーターを示唆している（１９９３／１９９４カタログ２１０ページ）。これらのコンセンサスは、本発明のヌクレオチド配列での使用のために好適である。該配列を、ＡＴＧまでおよびＡＴＧ（一方第２アミノ酸は非修飾のまま）、または代替的にＡＴＧの次のＧＴＣまでおよびＣＴＧを含む（トランスジーンの第２アミノ酸を修飾する確率で）ヌクレオチド配列を含む構築に取りこませる。
【００９０】
トランスジェニック植物でのヌクレオチド配列の発現は、植物で機能性であると示されたプロモーターによって駆動される。プロモーターの選択は、発現についての時間的および場所的要求に依存して、およびまた標的種に依存して変化する。こうして、本発明のヌクレオチド配列の、葉、穂、花序（例えば、穂状花序、円錐花序、穂軸など）、根、および／または実生での発現が好ましい。多くの場合に、しかし、所望の害虫の１より多い型に対する保護を求め、そしてこうして、多重組織中での発現が望まれる。双子葉植物からの多くのプロモーターが単子葉植物で機能性で、そしてその逆であると示されたが、理想的には、双子葉植物プロモーターを双子葉植物での発現のために、そして単子葉植物プロモーターを単子葉植物での発現のために選択する。しかし、選択されたプロモーターの起源に制限はなく；望まれる細胞でのヌクレオチド配列の発現を駆動するのに作動性であることで十分である。
【００９１】
構成的に発現される好ましいプロモーターは、アクチンまたはユビキチンをコードする遺伝子からのプロモーターおよびＣａＭＶ　３５Ｓおよび１９Ｓプロモーターを含む。本発明のヌクレオチド配列をまた、化学的に調節されるプロモーターの制御下で発現させることができる。これは、作物植物が誘導的化学物質で処理されるときにのみ、殺虫性毒素が合成されるべきことを可能とする。遺伝子発現の化学物質誘導のための好ましい技法は、公開特許出願ＥＰ０３３２１０４および米国特許５６１４３９５に詳説される。化学物質誘導のための好ましいプロモーターは、タバコＰＲ−１ａプロモーターである。
【００９２】
プロモーターの好ましいカテゴリーは、傷誘導可能なものである。多くのプロモーターが記載され、これらは傷部位で発現され、そしてまた病原体感染の部位で発現される。理想的には、そのようなプロモーターは、感染の部位のみで局所的に活性であるべきであり、そしてこのやり方では、殺虫性毒素は、侵入する昆虫害虫を殺すための殺虫性毒素を合成するため必要である細胞にのみ蓄積する。この種類の好ましいプロモーターは、Ｓｔａｎｆｏｒｄ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｇｅｎ． Ｇｅｎｅｔ． ２１５： ２００−２０８（１９８９）、Ｘｕ ｅｔ ａｌ．， Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃ． Ｂｉｏｌ． ２２： ５７３−５８８（１９９３）、Ｌｏｇｅｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ １： １５１−１５８（１９８９）、Ｒｏｈｒｍｅｉｅｒ ＆ Ｌｅｈｌｅ， Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃ． Ｂｉｏｌ． ２２：７８３−７９２（１９９３）、Ｆｉｒｅｋ ｅｔ ａｌ．， Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃ． Ｂｉｏｌ． ２２：１２９−１４２（１９９３）、およびＷａｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｐｌａｎｔ Ｊ． ３：１９１−２０１（１９９３）によって記載されるものを含む。
【００９３】
好ましい組織特異的発現パターンは、緑色組織特異的、根特異的、茎特異的、および花特異的を含む。緑色組織での発現に好適なプロモーターは、光合成に関係する遺伝子を調節する多く、および単子葉および双子葉植物の両方からクローニングされた多くのものを含む。好ましいプロモーターは、ホスホエノールカルボキシラーゼ遺伝子からのトウモロコシＰＥＰＣプロモーター（Ｈｕｄｓｐｅｔｈ ＆ Ｇｒｕｌａ， Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃ． Ｂｉｏｌ． １２：５７９−５８９（１９８９））である。根特異的発現のための好ましいプロモーターは、Ｆｒａｍｏｎｄ （ＦＥＢＳ ２９０： １０３−１０６（１９９１）；ＥＰ０４５２２６９に記載されるトウモロコシメタロチオネイン様（ＭＴＬ）プロモーターである。好ましい茎特異的プロモーターは、米国特許５６２５１３６に記載されるものであり、そしてトウモロコシｔｒｐＡ遺伝子の発現を駆動する。
【００９４】
本発明の特に好ましい実施態様では、少なくとも１の本発明のヌクレオチド配列を、根に優先されるまたは根特異的様式で発現するトランスジェニック植物である。さらなる好ましい実施態様は、傷誘導的または病原体感染誘導的態様でヌクレオチド配列を発現するトランスジェニック植物である。
【００９５】
好適なプロモーターの選択に加えて、植物での殺虫性毒素の発現のための構築は、ヘテロロガスヌクレオチド配列の下流に付着されるべき適当な転写ターミネーターを要する。いくつかのそのようなターミネーターが利用可能かつ当業界で既知である（例えば、ＣａＭＶからのｔｍｌ、ｒｂｃＳからのＥ９）。植物で機能すると知られる任意の利用可能なターミネーターを本発明の内容で使用し得る。
【００９６】
多くの他の配列を、本発明で記載の発現カセット中に取り込むことができる。これらは、発現を増強すると知られた配列、例えばイントロン配列（例えば、Ａｄｈｌおよびｂｒｏｎｚｅ１からの）およびウイルスリーダー配列（例えば、ＴＭＶ、ＭＣＭＶおよびＡＭＶからの）配列を含む。
【００９７】
本発明のヌクレオチド配列の発現を、植物中の異なる細胞内局在化へターゲティングさせることが、好ましくあり得る。ある場合には、サイトソルでの局在化が望ましくあり得、一方他の場合に、あるサブセルラーオルガネラの局在化が好ましくあり得る。トランスジーンコード酵素サブセルラー局在化を、当業界周知技法を使用して企図する。典型的には、既知オルガネラターゲティング性遺伝子産物からのペプチドをコードするＤＮＡを操作し、該ヌクレオチド配列の上流に融合させる。おおくのそのような標的配列はクロロプラストについて知られ、そしてヘテロロガス構築においてその機能することが示された。本発明のヌクレオチド配列の発現をまた、宿主細胞の小胞体に、または液胞にターゲティングさせる。これを達成する技法は当業界で周知である。
【００９８】
植物形質転換に好適なベクターは、この明細書の他所に記載される。アグロバクテリウムに仲介される形質転換のために、少なくとも１つのＴ−ＤＮＡボーダー配列を有するバイナリーベクターまたはベクターが好適であり、一方ヂレクトジーントランスファーのために、任意のベクターが好適であり、そして所望の構築物のみを含む線形ＤＮＡが好ましくあり得る。ヂレクトジーントランスファーの場合に、単一ＤＮＡ種または共形質転換での形質転換を使用することができる（Ｓｃｈｏｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ４： １０９３−１０９６（１９８６））。ヂレクトジーントランスファーおよびアグロバクテリウムに仲介される形質転換の両方のために、形質転換は通常（しかし必須ではない）、抗生物質（カナマイシン、ハイグロマイシン、またはメトトレキセート）へ、または除草剤（バスタ）への抵抗性を提供し得る選択マーカーで企図される。そのようなマーカーの例は、ネオマイシンアホスホトランスフェラーゼ、ハイグロマイシンホルホトランスフェラーゼ、ジヒドロ葉酸レダクターゼ、ホスヒノスリシンアセチルトランスフェラーゼ、２，２−ジクロロプロピオン酸デハロゲナーゼ、アセトヒドロキシ酸シンターゼ、５−エノールピルビル−シキメート−ホスフェートシンターゼ、ハロアリールニトリラーゼ、プロトポルヒリノーゲンオキシダーゼ、アセチル補酵素Ａカルボキシラーゼ、ジヒドロプテロエートシンターゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、およびβグルクロニダーゼである。正の選択を提供するさらなる型のマーカーは、マンノース−６−ホスフェートイソメラーゼ（ＭＰＩ／ＰＭＩ）遺伝子であり、これはマンノースを代謝する能力を提供するマンノース−６−ホスフェートイソメラーゼ。植物形質転換のための選択またはスクリーニングマーカーの選択はしかし、本発明に重要ではない。
【００９９】
前記の組換えＤＮＡを、多くの当業界認識方法で植物細胞に導入することができる。当業者は、方法の選択が形質転換の標的とされる植物の型に依存し得ることを認識する。好適な植物細胞形質転換方法は、マイクロインジェクション（Ｃｒｏｓｓｗａｙ ｅｔ ａｌ．， ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ４： ３２０−３３４（１９８６））、エレクトロポレーション（Ｒｉｇｇｓ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８３：５６０２−５６０６（１９８６）、アグロバクテリウムに仲介される形質転換（Ｈｉｎｃｈｅｅ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：９１５−９２１（１９８８）；またトウモロコシ形質転換のためＩｓｈｉｄａ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４：７４５−７５０（Ｊｕｎｅ １９９６）参照）、ヂレクトジーントランスファー（Ｐａｓｚｋｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．， ＥＭＢＯ Ｊ． ３：２７１７−２７２２（１９８４）； Ｈａｙａｓｈｉｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．， Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．９３：８５７−８６３（１９９０）（イネ））、およびＡｇｒａｃｅｔｕｓ， Ｉｎｃ．， Ｍａｄｉｓｏｎ， Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ およびＤｕｐｏｎｔ， Ｉｎｃ．， Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎｍ， Ｄｅｌａｗａｒｅから入手可能な装置を使用するバリスチックパーティクルアクセラレーション（また例えば、Ｓａｎｆｏｒｄ ｅｔ ａｌ．， 米国特許４９４５０５０；およびＭｃＧａｂｅ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：９２３−９２６（１９８８）参照）を含む。またＷｅｉｓｓｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖ． Ｇｅｎｅｔ． ２２：４２１−４７７（１９８８）；Ｓａｎｆｏｒｄ ｅｔ ａｌ．， Ｐａｒｔｉｃｕｌａｔｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ５： ２７−３７ ９１９８７（タマネギ）；Ｓｖａｂ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８７：８５２６−８５３０（１９９０）（タバコクロロプラスト）；Ｃｈｒｉｓｔｏｕ ｅｔ ａｌ．， Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ． ８７：６７１−６７４（１９８８）（ダイズ）；ＭｃＣａｂｅ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：９２３−９２６（１９８８）（ダイズ）；Ｋｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８５：４３０５−４３０９（１９８８）（トウモロコシ）；Ｋｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６： ５５９−５６３（１９８８）（トウモロコシ）；Ｋｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ． ９１：４４０−４４４（１９８８）（トウモロコシ）；Ｆｒｏｍｍ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８：８３３−８３９（１９９０）；およびＧｏｒｄｏｎ−Ｋａｍｍ ｅｔ ａｌ．， Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ２： ６０３−６１８（１９９０）（トウモロコシ）；Ｋｏｚｉｅｌ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １１：１９４−２００（１９９３）（トウモロコシ）；Ｓｈｉｍａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３３８：２７４−２７７（１９８９）（イネ）；Ｃｈｒｉｓｔｏｕ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：９５７−９６２（１９９１）（イネ）；Ｄａｔｔａ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８： ７３６−７４０（１９９０）（イネ）；欧州特許出願ＥＰ０３３２５８１（オーチャードグラスおよび他のＰｏｏｉｄｅａｅ）；Ｖａｓｉｌ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １１：１５５３−１５５８（１９９３）（コムギ）；Ｗｅｅｋｓ ｔｅ ａｌ．， ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ． １０２：１０７７−１０８４（１９９３）（コムギ）；Ｗａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ． １０４：３７−４８（１９９４）（オオムギ）；Ｊａｈｎｅ ｅｔ ａｌ．， Ｔｈｅｏｒ． Ａｐｐｌ． Ｇｅｎｅｔ． ８９：５２５−５３３（１９９４）（オオムギ）；Ｕｍｂｅｃｋ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｏｎｏｌｏｇｙ ５：２６３−２９７（１９８７）（ワタ）；Ｃａｓａｓ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０：１１２１２−１１２１６（ｄｅｃ． １９９３）（ソルガム）；Ｓｏｍｅｒｓ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：１５８９−１５９４（Ｄｅｃ． １９９２）（エンバク）；Ｔｏｒｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．， Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｏｒｔｓ １４： ６３５−６４０（１９９５）（エンバク）；Ｗｅｅｋｓ ｔｅ ａｌ．， Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ． １０２：１０７７−１９８４（１９９３）（コムギ）；Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ， ＷＯ９４／１３８２２（コムギ）およびＮｅｈｒａ ｅｔ ａｌ．， Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌ ５：２８５−２９７（１９９４）（コムギ）参照。
【０１００】
マイクロプロジェクタイルボンバードメントによる組換えＤＮＡ分子のトウモロコシヘの導入のための実施態様の特に好ましい組は、Ｋｏｚｉｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １１：１９４−２００（１９９３）、Ｈｉｌｌ ｅｔ ａｌ．， Ｅｕｐｈｙｔｉｃａ ８５：１１９−１２３（１９９５）およびＫｏｚｉｅｌ ｅｔ ａｌ．， Ａｎｎａｌｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎｅｗ ｙｏｒｋ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ７９２：１６４−１７１（１９９６）に見出すことができる。追加的な好ましい実施態様は、ＥＰ０２９２４３５に開示されるようなトウモロコシのためのプロトプラスト形質転換方法である。植物の形質転換を、単一ＤＮＡ種または多重ＤＮＡ種（すなわち共導入）で企図することができ、そしてこれらの両方の技法は、本発明のコード配列での使用のために好適である。
【０１０１】
さらなる好ましい実施態様では、本発明のヌクレオチド配列を直接的にプラスチドゲノムに形質転換し得る。プラスチド形質転換の主要な利益は、プラスチドが、一般に実質的な修飾なくバクテリア遺伝子を発現することができ、そしてプラスチドは単一プロモーターの制御下で多重オープンリーディングフレームを発現することができることである。プラスチド形質転換技法は、米国特許５４５１５１３、５５４５８１７および５５４５８１８中に、ＰＣＴ出願ＷＯ９５／１６７８３中に、およびＭｃＢｒｉｄｅ ｅｔ ａｌ．， （１９９４）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１， ７３０１−７３０５中に詳細に記載される。クロロプラスト形質転換のための基本的技法は、好適な標的組織に所望の遺伝子と一緒に選択マーカーにフランキングなクローニングプラスチドＤＮＡの領域を、例えば、バイオリスチックまたはプロトプラスト形質転換（例えば塩化カルシウムまたはＰＥＧ仲介形質転換）を使用して、導入することに関係する。ターゲティング配列と呼ばれる１ないし１．５ｋｂフランキング領域は、プラスチドゲノムでの相同的組換えを容易化し、こうしてプラストームの特異的領域の置換または修飾を可能とする。当初に、スペクチノマイシンおよび／またはストレプトマイシンへの抵抗性を付与するクロロプラスト１６ＳｒＲＮＡおよびｒｐｓ１２遺伝子の点突然変異を、形質転換のための選択マーカーとして利用する（Ｓｖａｂ， Ｚ．， Ｈａｊｄｕｋｉｅｗｉｃｚ， Ｐ．， ａｎｄ Ｍａｌｉｇａ， Ｐ．（１９９０）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８７， ８５２６−８５３０；Ｓｔａｕｂ，Ｊ． Ｍ．， ａｎｄ Ｍａｌｉｇａ， Ｐ． （１９９２）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ４， ３９−４５）。これは、標的葉の１００ボンバードメントあたり近似的に１の頻度の安定的ホモプラスミック形質転換という結果である。これらのマーカー間のクローニング部位の存在は、外来遺伝子の導入のためのプラスチドターゲティングベクターの創出を可能とする（Ｓｔａｕｂ， Ｊ．Ｍ．， ａｎｄ Ｍａｌｉｇａ， Ｐ．（１９９３）ＥＭＢＯ Ｊ． １２， ６０１−６０６）。形質転換頻度の実質的増加を、優性選択マーカーである、スペクチノマイシン解毒化酵素アミノグリコシド−３’−アデニルトランスフェラーゼでの、劣性ｒＲＮＡまたはｒ−タンパク質抗生物質抵抗性遺伝子の置換によって取得する（Ｓｖａｂ， Ｚ．， ａｎｄ Ｍａｌｉｇａ， Ｐ． （１９９３）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０， ９１３−９１７）。以前に、このマーカーを使用して、緑藻Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉのプラスチドゲノムの高頻度形質転換に成功した（Ｇｏｌｄｓｃｈｍｉｄｔ−Ｃｌｅｒｍｏｎｔ， Ｍ．（１９９１）Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ． Ｒｅｓ． １９：４０８３−４０８９）。プラスチド形質転換に有用な他の選択マーカーは当業界で知られ、そして本発明にの範囲内に入る。典型的には、形質転換に続く近似的に１５−２０細胞分裂サイクルが、ホモプラスチド性状態に達するのに要求される。遺伝子が、それぞれの植物細胞中に存在する数千コピーの環状プラスチドゲノムのすべてに、相同的組換えによって挿入されるプラスチド発現は、核内発現される遺伝子を超える莫大コピー数の利益を利用し、総可溶性植物タンパク質の１０％を容易に越えることができる発現レベルを可能とする。好ましい実施態様では、本発明のヌクレオチド配列をプラスチドターゲティングベクターに挿入し、そして望まれる植物宿主のプラスチドゲノムに形質転換する。本発明のヌクレオチド配列を含むプラスチドゲノムについてホモプラスチド性の植物を取得し、そして好ましくはヌクレオチド配列の高レベル発現が可能である。
【０１０２】
実施例
本発明を以下の詳細な実施例を引用することによってさらに記載する。これらの実施例は、例示の目的に提供し、そして他に特定しない限り、限定することを意図しない。ここで使用される標準的組換えＤＮＡおよび分子クローニング技法は、当業界で周知であり、そしてＡｕｓｕｂｅｌ（ｅｄ．）， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．（１９９４）； Ｔ． Ｍａｎｉａｔｉｓ， Ｅ．Ｆ． Ｆｒｉｔｓｃｈ ａｎｄ Ｊ． Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ （１９８９）； ａｎｄ ｂｙ Ｔ．Ｊ． Ｓｉｌｈａｖｙ， Ｍ．Ｌ．Ｂｅｒｍａｎ， ａｎｄ Ｌ．Ｗ．Ｅｎｑｕｉｓｔ， Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｇｅｎｅ Ｆｕｓｉｏｎｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ（１９８４）によって記載される。
【０１０３】
実施例１：Ｈ０４毒素フラグメントの発現および精製
Ｈ０４ハイブリッド毒素遺伝子のトランケートされた形態（Ｄｅ Ｍａａｇｄ ｅｔ ａｌ．， Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ６２（５）： １５３７−１５４３（１９９６）に記載される）であって、本質的にＣｒｙ１ＡｂのドメインＩおよびＩＩおよびＣｒｙ１ＣのドメインＩＩＩからなるＢｔ毒素をコードするものを、発現ベクター、例えば、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ−というＢａｃｉｌｌｕｓシャトルベクター、またはＥ． ｃｏｌｉでの過剰発現のためのｐＥＴ２１ｂ（＋）にクローン化する。細胞を、５０マイクログラム／ｍｌ　アンシピリンを含むＬＢ培地中で、２４ないし４８時間、３７℃で振とう機（２５０ｒｐｍ）で成長させる。細胞を、１０分間７０００ｒｐｍの遠心分離によって収集する。ペレットを、Ｂｒｏｎｓｏｎソニファイアーで２秒間パルスで２分３０秒超音波処理する。完全な超音波処理を顕微鏡でチェックする。可溶性フラクションを、１００００ｒｐｍで１０分間の遠心分離によって除去する。結晶性タンパク質を含む得られたペレットを、０．５Ｍ　ＮａＣｌを含む２％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００で４−５回洗浄する。連続洗浄を、０．５Ｍ　ＮａＣｌ（４−５回）で実施し、そして最終的なペレットを蒸留水で洗浄する（２回）。得られたペレットを、１０ｍＭ　ジチオスレイトールを含む５０ｍＭ　Ｎａ_２ＣＯ_３バッファー中で３７℃で２時間可溶化させる。可溶化タンパク質を１２０００ｒｐｍ１０分間の遠心分離によって不溶性材料から分離する。タンパク質サンプルを、バイオアッセイのために５０ｍＭ　Ｎａ_２ＣＯ_３、ｐＨ９．０バッファーで透析する。
【０１０４】
実施例２：バイオアッセイ
ＬＣ５０を、例えば前記実施例１に記載のように生産された精製トランケートＨ０４タンパク質を使用して、ｆａｌｌ ａｒｍｙｗｏｒｍ、ワタアカミムシ（ｐｉｎｋ ｂｏｌｌｗｏｒｍ）、オオタバコガ（ｔｏｂｏｃｃｏ ｂｕｄｗｏｒｍ）、アワノメイガ（Ｅｕｒｏｐｅａｎ ｃｏｒｎｂｏｒｅｒ）、およびコナガ（ｄｉａｍｏｎｄｂａｃｋ ｍｏｔｈ）において実施する。結果は以下の通りである：
ＬＣ５０　ｆａｌｌ ａｒｍｙｗｏｒｍ１３３ｎｇ／ｃｍ^２
ＬＣ５０　ワタアカミムシ（ｐｉｎｋ ｂｏｌｌｗｏｒｍ）６９１ｎｇ／ｃｍ^２
ＬＣ５０　オオタバコガ（ｔｏｂｏｃｃｏ ｂｕｄｗｏｒｍ）２９９ｎｇ／ｃｍ^２
ＬＣ５０　アワノメイガ（Ｅｕｒｏｐｅａｎ ｃｏｒｎｂｏｒｅｒ）３１ｎｇ／ｃｍ^２
【０１０５】
実施例３：合成Ｈ０４遺伝子構築
Ｈ０４の毒素部分をコードする合成ヌクレオチド配列を、Ｄｅ Ｍａａｇｄ ｅｔ ａｌ．， Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ６２（５）：１５３７−１５４３（１９９６）（Ｃｒｙ１ＡｂのドメインＩおよびＩＩおよびＣｒｙ１ＣのドメインＩＩＩ）に記載のＨ０４ハイブリッド毒素フラグメントのアミノ酸配列を、トウモロコシ優先性コドン表（引用によりここに含ませるＭｕｒｒａｙ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １７：４７７−４９８， １９８９）を使用するプログラムのＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ ＧＣＧ ｇｒｏｕｐに見出される「Ｂａｃｋｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ」プログラムを使用してバック翻訳することによって設計する。好ましくは、最も頻繁に使用されるトウモロコシコドンを、ＷＯ９３／０７２７８に記載されるようにそれぞれのアミノ酸について使用する。
【０１０６】
Ｈ０４の毒素部分をコードする合成ヌクレオチド配列を、幾つかのフラグメント中に構築し得る。それぞれのフラグメントを、遺伝子の両方の鎖を表す６０−７５ヌクレオチド長の１０対のオリゴマーのハイブリダイゼーションによって構築する。近似的に１５ヌクレオチドのオーバーラップを、正確な配向およびアセンブリのために連続オリゴヌクレオチド対の間に設計する。オリゴヌクレオチドを、例えば、Ｇｅｎｏｓｙｓ Ｂｉｏｔｅｄｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．， ＴＸによって合成し得る。各対のオリゴマーをハイブリダイズさせ、そして例えば、売主によって特定された条件を使用して、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ， ｉｎｃ．， ＭＡからの酵素ポリヌクレオチドキナーゼを使用してホスホリル化する。キナーゼ化フラグメント対を次いでハイブリダイズさせ、そして例えばアンシピリン抵抗性遺伝子を含む高コピープラスミドベクターへライゲートさせ、そして例えば競合的ＤＨ５α細胞に形質転換する。細胞をアンシピリン含有培地上に置き、そして終夜３７℃でインキュベートする。コロニーを挿入されたＤＮＡについてスクリーニングする。ＤＮＡを配列決定し、そして正確な配列を含むクローンを選択する。フラグメントを次いで、制限消化、ライゲーションおよびフラグメント間の独特な制限部位を使用する形質転換によって結合する。
【０１０７】
配列番号３は、Ｈ０４（プロ毒素テイル領域のない）の６３１アミノ酸毒素部分をコードする合成ヌクレオチド配列を示し、そして配列番号４は、配列番号３に示される合成ヌクレオチド配列によってコードされるＨ０４毒素のアミノ酸配列を示す。配列番号１１は、配列番号３に示される合成Ｈ０４遺伝子配列に作動可能に連結された構成的トウモロコシユビキチンプロモーターを含む、構築物ｐＮＯＶ１３０８のヌクレオチド配列を示す。
【０１０８】
Ｈ０４ハイブリッドの毒素部分（Ｃｒｙ１ＡｂのドメインＩおよびＩＩおよびＣｒｙ１ＣのドメインＩＩＩ）のみをコードする前記合成遺伝子（配列番号３）に加えて、追加的合成Ｈ０４遺伝子を、Ｈ０４毒素部分の３’末端に融合された、米国特許５６２５１３６（引用によりここに含める）に記載の合成ｃｒｙ１Ａｂテイル領域の全部または一部で構築する。これらの、ｃｒｙ１Ａｂテイルのある合成Ｈ０４遺伝子配列は、以下に記載する：
【０１０９】
配列番号５は、Ｈ０４の毒素部分、加えて完全長Ｃｒｙ１Ａｂテイル部分をコードする合成ヌクレオチド配列を示し、そして配列番号６は、配列番号５に示される合成ヌクレオチド配列によってコードされた、Ｈ０４＋Ｃｒｙ１Ａｂテイルのアミノ酸配列を示す。配列番号１２は、配列番号５に示される合成Ｈ０４遺伝子配列に作動可能に連結された根優先性トウモロコシＭＴＬプロモーターを含む、構築物ｐＮＯＶ１４３６のヌクレオチド配列を示す。配列番号１３は、配列番号５に示される合成Ｈ０４遺伝子配列に作動可能に連結された構成的トウモロコシユビキチンプロモーターを含む、構築物ｐＮＯＶ１４４１のヌクレオチド配列を示す。
【０１１０】
配列番号７はＨ０４の毒素部分、加えて完全長Ｃｒｙ１Ａｂテイル部分をコードするさらなる合成ヌクレオチド配列を示し、そして配列番号８は、配列番号７に示される合成ヌクレオチド配列によってコードされる、Ｈ０４＋Ｃｒｙ１Ａｂテイルのアミノ酸配列を示す。配列番号１４は、配列番号７に示される合成Ｈ０４遺伝子配列に作動可能に連結された構成的トウモロコシユビキチンプロモーターを含む、構築物ｐＮＯＶ１３０５のヌクレオチド配列を示す。配列番号１５は、配列番号７に示される合成Ｈ０４遺伝子配列に作動可能に連結された構成的トウモロコシユビキチンプロモーターを含む、構築物ｐＮＯＶ１３１３のヌクレオチド配列を示す。
【０１１１】
配列番号９は、Ｈ０４の毒素、加えてＣｒｙ１Ａｂテイルの最初の４０アミノ酸のみをコードする合成ヌクレオチド配列を示し、そして配列番号１０は、配列番号９に示される合成ヌクレオチド配列によってコードされる、Ｈ０４＋４０アミノ酸がトランケートされたＣｒｙ１Ａｂテイルのアミノ酸配列を示す。配列番号１６は、配列番号９に示される合成Ｈ０４遺伝子配列に作動可能に連結された根優先性トウモロコシＭＴＬプロモーターを含む、構築物ｐＮＯＶ１４３５のヌクレオチド配列を示す。配列番号１７は、配列番号９に示される合成Ｈ０４遺伝子配列に作動可能に連結されたアラビドプシスアクチン−２プロモーターを含む、構築物ｐＺＵ５７８のヌクレオチド配列を示す。
【０１１２】
実施例４：コード配列および隣接配列の修飾
この出願に記載されるヌクエオチド配列を、トランスジェニック植物宿主での発現のために修飾することができる。ヌクレオチド配列を発現する、およびその細胞中で殺虫性毒素を生産する宿主植物は、昆虫攻撃に対する高められた抵抗性を有し、そしてこうしてそのような攻撃と関連する作物喪失に耐えるべくより操作される。
【０１１３】
微生物源に由来する遺伝子の植物でのトランスジェニック発現は、植物でのそれらの発現を達成しおよび最適化するために、それらの遺伝子の修飾を要求し得る。特に、別個の酵素をコードするが、ネイティブ微生物において同じ転写物中にコードされるバクテリアＯＲＦは、別個の転写物上で植物中で最良に発現される。これを達成するために、それぞれの微生物性ＯＲＦを個々に単離し、そして該ＯＲＦの５’末端に植物プロモーター配列、および該ＯＲＦの３’末端に植物転写ターミネーターを提供するカセット内にクローン化する。単離されたＯＲＦ配列は好ましくは、開始するＡＴＧコドンおよび停止するＳＴＯＰコドンを含むが、開始するＡＴＧおよび該ＳＴＯＰコドンの他に追加的配列を含み得る。加えて、ＯＲＦをトランケートし得るが、なお要求される活性を保持し得る；特に長いＯＲＦについて、トランスジェニック生物中での発現のために発現に好ましくあり得る活性を保持し得るトランケートバージョン。「植物プロモーター」および「植物転写ターミネーター」によって、植物細胞内で作動するプロモーターおよび転写ターミネーターを意味することを意図する。これは、非植物源、例えば、ウイルスに由来し得るプロモーターおよび転写ターミネータを含む（例はカリフラワーモザイクウイルス）。
【０１１４】
ある場合には、ＯＲＦコード配列および隣接配列への修飾を要しない。所望のＯＲＦを含むフラグメントを単離し、そして植物プロモーターの下流にそれを挿入することで十分である。例えば、Ｇａｆｆｎｅｙ ｅｔ ａｌ．， （Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６１：７５４−７５６（１９９３））は、ＣａＭＶ　３５ＳプロモーターおよびＣａＭＶ　ｔｍｌターミネーターの制御下でトランスジェニック植物中でＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｎａｈＧ遺伝子を発現させるのに成功し、ここで、コード配列の修飾なく、そしてＡＴＧの上流のＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ遺伝子のｘ　ｂｐがなお付着され、そしてＳＴＯＰコドンの下流にｙ　ｂｐが、ｎａｈＧ　ＯＲＦになお付着されている。好ましくは少しの（ａｓ ｌｉｔｔｌｅ）隣接微生物性配列は、ＡＴＧの上流に、およびＳＴＯＰコドンの下流に付着されたままであるべきである。実際上は、そのような構築は、制限部位の利用可能性に依存し得る。
【０１１５】
他の場合には、微生物性源由来の遺伝子の発現は、発現における問題を提供し得る。これらの問題は、当業界でよく特徴付けられ、そしてある種の源、例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓに由来する遺伝子に特に共通する。これらの問題を本発明のヌクレオチド配列に適用し得、そしてこれらの遺伝子の修飾を当業界で周知の技法を使用して企図することができる。以下の問題に遭遇し得る。
【０１１６】
１．コドン用法
植物での好ましいコドン用法は、ある種の微生物での好ましいコドン用法と異なる。クローン化微生物性ＯＲＦ内でのコドンの用法の、植物遺伝子（および特に標的植物由来の遺伝子）中での用法との比較は、好ましくは変化させるべき、ＯＲＦ内コドンの同定を可能とする。典型的には、植物進化は、単子葉植物では第３塩基位置でヌクレオチドＣおよびＧの強い優先性に向かう傾向があった。一方、双子葉植物はしばしばこの位置でヌクレオチドＡまたはＴを使用する。特定標的トランスジェニック種について好ましいコドン用法を取りこませるような遺伝子の修飾によって、ＧＣ／ＡＴ含量および非正統的スプライシングについての以下に記載の多くの問題を解消する。
【０１１７】
２．ＧＣ／ＡＴ含量
植物遺伝子は典型的には、３５％よりも多いＧＣ含量を有する。ＡおよびＴヌクレオチドに富むＯＲＦ配列は、植物で幾つかの問題を引き起こすることができる。第１に、ＡＴＴＴＡのモチーフは、伝令の脱安定化を引き起こすと信じられ、そして短命ｍＲＮＡの３’末端に見出される。第２に、不適当な位置でのポリアデニル化シグナル、例えば、ＡＡＴＡＡＡの存在は、転写の未成熟トランケーションを引き起こすと信じられる。加えて、単子葉植物は、スプライシング部位としてＡＴに富む配列を認識し得る（以下参照）。
【０１１８】
３．開始メチオニンに隣接する配列
植物は、これらの伝令が定義されたリボゾーム結合部位を有しない点で微生物と異なる。むしろ、リボゾームが伝令の５’末端に付着し、翻訳を開始する最初に利用可能なＡＴＧを走査すると信じられている。にもかかわらず、ＡＴＧに隣接するある種のヌクレオチドについての優先性があり、そして微生物遺伝子の発現を、該ＡＴＧでの真核細胞コンセンサス翻訳イニシエーターの包含によって高めることができると信じられる。Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（引用によりここに含まれる１９９３／１９９４ｃａｔａｌｇ，ｐａｇｅ ２１０）は、植物でのＥ． ｃｏｌｉ ｕｉｄＡ遺伝子の発現のコンセンサス翻訳イニシエーターとしてある配列を示唆した。さらに、Ｊｏｓｈｉ（引用によりここに含めるＮＡＲ １５：６６４３−６６５３（１９８７））は、ＡＴＧに隣接する多くの植物配列を比較し、そして別のコンセンサス配列を示唆した。植物中で微生物性ＯＲＦの発現において困難性が遭遇する状況では、開始ＡＴＧにこれらの配列のいずれかを含めることが、翻訳を改善し得る。そのような場合では、該コンセンサスの最後の３ヌクレオチドは、第２ＡＡ残基の修飾のため、修飾配列に含めるために適当ではないかもしれない。開始メチオニンに隣接する好ましい配列は、異なる植物種間で異なり得る。ＧｅｎＢａｎｋデータベース中にある１４のトウモロコシ遺伝子の概観は、以下の結果を提供した：
【０１１９】
１４のトウモロコシの遺伝子中の開始ＡＴＧの前の位置
【表１】

この分析を、該ヌクレオチド配列が取りこまれる望まれる植物種、および好ましいヌクレオチドを取りこませるように修飾されたＡＴＧに隣接する配列についてなすことができる。
【０１２０】
４．非正統的（ｉｌｌｅｇｉｔｉｍａｔｅ）スプライシング部位の除去
非植物源からクローン化され、および植物での発現のために最適化されていない遺伝子はまた、植物で５’または３’スプライシング部位として認識され得るモチーフを含み得、そして切断され、こうしてトランケートまたは欠失伝令を生成する。これらの部位を当業界で周知の技法を使用して除去することができる。
【０１２１】
コード配列および隣接配列の修飾のための技法は、当業界で周知である。微生物性ＯＲＦの当初発現が低く、そして前記のように配列に変更を作成するのが適当だとみなされる場合、そのとき合成遺伝子の構築を、当業界で周知の方法にしたがって達成できる。これらは、すべて引用によりここに含ませる例えば、公開特許開示ＥＰ０３８５９６２、ＥＰ０３５９４７２およびＷＯ９３／０７２７８に記載される。ほとんどの場合、トランスジェニック植物に移入する前に、一過性検定（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ａｓｓａｙ）プロトコル（これは当業界で周知である）を使用して、遺伝子構築物の発現をアッセイすることが好ましい。
【０１２２】
実施例５：植物発現カセットの構築
トランスジェニック植物での発現の意図されるコード配列を、まず植物で発現可能な好適なプロモーターの後方の発現カセットにアセンブルする。発現カセットはまたトランスジーンの発現のために要求又は選択された任意のさらなる配列を含み得る。そのような配列は、転写ターミネーター、発現を高めるｅｘｔｒａｎｅｏｕｓ配列、例えば、イントロン、ｖｉｔａｌ配列、及び特定のオルガネラ及び細胞区画への遺伝子産物のターゲティングの意図される配列を含むがこれらに限定されない。これらの発現カセットを次いで以下に記載の植物形質転換ベクターに容易に送達することができる。以下は典型的な発現カセットの種々の構成要素の記載である。
【０１２３】
１．プロモーター
発現カセットで使用されるプロモーターの選択は、トランスジェニック植物中のトランスジーンの位置的かつ時間的な発現パターンを決定する。選択したプロモーターは、特定細胞型中（例えば、植物表皮細胞、葉肉細胞、根皮層細胞）又は特定組織または器官（例えば、根、葉又は花）においてトランスジーンを発現する。その選択は、遺伝子産物の蓄積の望まれる位置を反映する。又は、選択されたプロモーターは、種々の誘導条件の下で遺伝子の発現を駆動し得る。プロモーターは、その強度、即ち転写を促進する能力が多様である。 利用される宿主細胞系に依存して、その遺伝子ネイティブのプロモーターを含む、多くの好適なプロモーターの中のいずれかを使用できる。以下は、発現カセット中で使用し得るプロモーターの非限定的な例である。
【０１２４】
ａ．構成的発現、ユビキチンプロモーター：
ユビキチンは、多くの細胞型で蓄積することが知られた遺伝子産物であり、そのプロモーターは、トランスジェニック植物（例えば、ヒマワリ Ｂｉｎｅｔ ｅｔ ａ１．， Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ ７９： ８７−９４（１９９１）； トウモロコシ−Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｌａｎｔ． Ｍｏｌｅｃ． Ｂｉｏｌ． １２： ６１９−６３２（１９８９）；及びアラビドプシス−Ｎｏｒｒｉｓ ｅｔ ａｌ．， Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２１： ８９５−９０６（１９９３））で使用するために幾つかの種からクローニングされた。トウモロコシユビキチンプロモーターは、トランスジェニック単子葉植物系で開発され、そして単子葉植物の形質転換のために構築されたその配列及びベクターは、引用によりここに含める特許出願公開 ＥＰ ０ ３４２ ９２６に開示されている。Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．（Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ． １２：４１９−４９５（１９９３））は、トウモロコシユビキチンプロモーター及び第一のイントロンを含むベクター （ｐＡＨＣ２５）、及びマイクロプロジェクタイルボンバードメントによって導入されるとき、多くの単子葉植物の細胞懸濁液中でのその高い活性を記載する。アラビドプシスユビキチンプロモーターは、本発明のヌクレオチド配列と共に使用のために理想的である。ユビキチンプロモーターは、単子葉植物及び双子葉植物両方のトランスジェニック植物における遺伝子発現に好適である。好適なベクターは、ｐＡＨＣ２５又はこの出願で記載された形質転換ベクターの全ての誘導体であり、適当なユビキチンプロモーター及び／又はイントロン配列の導入によって修飾される。
【０１２５】
ｂ．構成的発現、ＣａＭＶ ３５Ｓプロモーター：
プラスミドｐＣＧＮ１７６１の構築は、引用によりここに含める特許出願公開 ＥＰ ０ ３９２ ２２５ （実施例 ２３）に記載されている。ｐＣＧＮ１７６１は、「ダブル」ＣａＭＶ ３５Ｓ プロモーター及びｔｍｌ 転写ターミネーターを包含し、プロモーター及びターミネーターの間の独特なＥｃｏＲｌ部位を有し、そしてｐＵＣ型のバックボーンを有する。存在するＥｃｏＲＩ部位に加えてＮｏｔｌ及びＸｈｏｌ部位を含む、修飾ポリリンカーを有する、ｐＣＧＮ１７６１の誘導体を構築する。該誘導体はｐＣＧＮ１７６１ ＥＮＸと命名する。ｐＣＧＮ１７６１ ＥＮＸは、ｃＤＮＡ 配列又はコード配列（微生物性ＯＲＦ 配列を含む）の、トランスジェニック植物における３５Ｓプロモーターの制御下でのその発現の目的のために、そのポリリンカー内でのクローニングのために有用である。そのような構築物の、完全な３５Ｓプロモーター−コード配列−ｔｍｌターミネーター・カセットを、以下に記載のもののような形質転換ベクターに移入するため、プロモーターの５’側のＨｉｎｄＩＩＩ、ＳｐｈＩ、Ｓａｌｌ及びＸｂａｌによって、及びターミネーターの３’側のＸｂａｌ、ＢａｍＨＩ及びＢｇＩＩによって切除することができる。さらに、ダブル３５Ｓプロモーターフラグメントは、別のプロモーターで置換するために、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＳｐｈＩ、Ｓａｌｌ、ＸｂａｌもしくはＰｓｔｌで５’切除によって、そしてポリリンカー制限部位（ＥｃｏＲＩ、Ｎｏｔｌ又はＸｈｏｌ）の何れかで３’切除によって、除去することができる。所望であれば、クローニング部位の周辺の修飾は、翻訳を増強し得る配列の導入によって行い得る。これは特に、過剰発現が望まれる場合に有用である。例えば、ｐＣＧＮ１７６１ＥＮＸを、Ｕ．Ｓ．特許Ｎｏ．５，６３９，９４９の実施例３７で記載されるような翻訳開始部位の最適化によって修飾し得る。
【０１２６】
ｃ．構成的発現、アクチンプロモーター
アクチンの幾つかのアイソホームは、殆どの細胞型で発現することが知られ、そして結果的に、アクチンプロモーターは構成的プロモーターのためには良い選択である。特に、イネＡｃｔｌ遺伝子由来のプロモーターは、クローニングされ、そして特性把握されてきた（ＭｃＥｌｒｏｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ２： １６３−１７１（１９９０））。プロモーターの１．３ ｋｂフラグメントは、イネプロトプラストでの発現のために必要とされる全ての調節エレメントを含むことが見出された。さらに、Ａｃｔｌプロモーターを基にした多くの発現ベクターを、単子葉植物で使用するために特異的に構築した（ＭｃＥｌｒｏｙ ｅｔ ａｌ． Ｍｏｌ． Ｇｅｎ． Ｇｅｎｅｔ． ２３１： １５０−１６０（１９９１））。これらは、Ａｃｔｌ−イントロン１、Ａｄｈｌ５’フランキング配列及びＡｄｈｌ−イントロン１（トウモロコシのアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子由来）及びＣａＭＶ ３５Ｓプロモーター由来の配列を取りこむ。非常に高い発現を示すベクターは、３５Ｓ及びＡｃｔｌイントロン又はＡｃｔｌ ５’フランキング配列及びＡｃｔｌイントロンの融合体であった。開始ＡＴＧ（ＧＵＳレポーター遺伝子の）周辺配列の至適化によっても発現が増強する。ＭｃＥｌｒｏｙ ｅｔ ａｌ． Ｍｏｌ． Ｇｅｎ． Ｇｅｎｅｔ． ２３１： １５０−１６０（１９９１）によって記載されたプロモーター発現カセットは、遺伝子発現のために容易に修飾することができ、そして単子葉植物宿主で使用するのに特に好適である。例えば、プロモーター含有フラグメントをＭｃＥｌｒｏｙ構築物から除き、ｐＣＧＮ１７６１ ＥＮＸ中のダブル３５Ｓプロモーターを置換するために使用し、そのときこれは特定遺伝子配列の挿入に利用可能である。こうして構築した融合遺伝子を、適当な形質転換ベクターに移入することができる。別の報告では、その第一イントロンを有するイネＡｃｔｌプロモーターはまた、培養オオムギ細胞での高い発現を方向付けることが見出された （Ｃｈｉｂｂａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ． １２：５０６−５０９（１９９３））。
【０１２７】
ｄ． 誘導可能発現、ＰＲ−１プロモーター
ｐＣＧＮ１７６１ ＥＮＸでのダブル３５Ｓプロモーターを、好適に高発現レベルを生じる任意の別の、選択のプロモーターで置換し得る。実施例の方法によって、Ｕ． Ｓ．特許番号 ５，６１４，３９５に記載された、化学的調節可能プロモーターの１つ、例えば、タバコＰＲ−１ａプロモーターは、該ダブル３５Ｓプロモーターを置換し得る。代替的に、Ｌｅｂｅｌ ｅｔ ａｌ．， Ｐｌａｎｔ Ｊ． １６：２２３−２３３（１９９８）に記載のアラビドプシスＰＲ−１ａプロモーターを使用し得る。選択のプロモーターは、制限酵素によって、その源から好ましくは切除するが、また適当な末端制限部位を有するプライマーを使用してＰＣＲ増幅することも可能である。ＰＣＲ−増幅を行うなら、プロモーターは、標的ベクター内で増幅したプロモーターのクローニングの後、増幅エラーについてチェックするために、再び配列決定するべきである。化学的／病原体調節可能なタバコＰＲ−１ａプロモーターを、プラスミド ｐＣＩＢ１００４から切断し（構築のために、引用によりここに含めるＥＰ ０ ３３２ １０４の実施例２１を参照）、プラスミド ｐＣＧＮ１７６１ＥＮＸ （Ｕｋｎｅｓ ｅｔ ａｌ．， Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ４： ６４５−６５６（１９９２））に移入した。ｐＣＩＢ１００４を、Ｎｃｏｌで切断し、そして線状フラグメントの、得られた３’オーバーハングを、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼでの処理によって平滑にする。
【０１２８】
次いで、該フラグメントをＨｉｎｄｌｌｌで切断し、そして得られたＰＲ−１ａ プロモーター含有フラグメントをゲル精製し、そしてダブル３５Ｓ プロモーターを除いたｐＣＧＮ１７６１ＥＮＸへとクローニングする。これは、Ｘｈｏｌでの切断、Ｔ４ ポリメラーゼによる平滑末端化（ｂｌｕｎｔｉｎｇ）、その後のＨｉｎｄｌＩｌでの切断、そのなかにｐＣＩＢ１００４プロモーターフラグメントがクローニングされている、大ベクター−ターミネーターを含むフラグメントの単離によって行う。
【０１２９】
これによって、ＰＲ−１ａプロモーター及びｔｍｌ ターミネーター及び独特のＥｃｏＲＩ及びＮｏｔＩ部位のある介入ポリリンカーを有する、ｐＣＧＮ１７６１ＥＮＸ誘導体を生成する。選択されたコード配列を、このベクターに挿入することができ、そして該融合産物（即ち、プロモーター−遺伝子−ターミネーター）は以下に記載したものを含む、任意の選択された形質転換ベクターに連続的に移入することができる。Ｕ．Ｓ．特許番号５，５２３，３１１及び５，６１４，３９５に記載のベンゾチアジアゾール、イソニコチン酸、及びサリチル酸化合物を含む、種々の化学的調節剤を使用し、本発明にしたがって形質転換された植物において、選択されたコード配列の発現を誘導し得る。
【０１３０】
ｅ． 誘導可能発現、エタノール誘導可能プロモーター
ある種のアルコール又はケトン、例えばエタノールによって誘導し得るプロモーターを使用し、本発明のコード配列の誘導可能発現を付与し得る。そのようなプロモーターは、例えば、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ 由来のａｌｃＡ 遺伝子プロモーターである（Ｃａｄｄｉｃｋ ｅｔ ａｌ．，（１９９８）Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １６： １７７−１８０）。 Ａ． ｎｉｄｕｌａｎｓにおいて、ａｌｃＡ 遺伝子は、アルコールデヒドロゲナーゼＩをコードし、この発現は化学的インデューサーの存在下でＡｌｃＲ転写因子によって調節される。本発明の目的のために、最小３５Ｓプロモーター（Ｃａｄｄｉｃｋ ｅｔ ａｌ．， （１９９８）Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １６： １７７−１８０）に融合された、ａｌｃＡ遺伝子プロモーター配列を含んでいる、プラスミドｐａｌｃＡ：ＣＡＴ中のＣＡＴコード配列を、本発明のコード配列によって置換し、ａｌｃＡ遺伝子プロモーターの制御下での該コード配列を有する発現カセットを形成する。これは、当業界で周知の方法を使用して実施する。
【０１３１】
ｆ． 誘導性発現、グルココルチコイド−誘導可能プロモーター
ステロイドホルモンを基にした系を使用する本発明の核酸配列の発現の誘導も、考えられる。例えば、グルココルチコイドに仲介される誘導系を使用し（Ａｏｙａｍａ ａｎｄ Ｃｈｕａ，（１９９７）Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌ １１： ６０５−６１２）、そして遺伝子発現を、グルココルチコイドの適用、例えば、合成グルココルチコイド、好ましくはデキサメタゾンを、好ましくは０．１ｍＭ〜１ｍＭの濃度、より好ましくは１０ｍＭ〜１００ｍＭの濃度範囲で誘導する。本発明の目的のために、ルシフェラーゼ遺伝子配列を、本発明の核酸配列によって置換し、３５Ｓ最小プロモーターと融合したＧＡＬ４上流活性化配列の６コピーの制御下での本発明の核酸配列を有する発現カセットを形成する。これは、当業者には周知の方法で行われる。トランス作用因子は、ラットのグルココルチコイド受容体のホルモン結合ドメイン（Ｐｉｃａｒｄ ｅｔ ａｌ．，（１９８８）Ｃｅｌｌ ５４： １０７３−１０８０）に融合したヘルペスウイルスタンパク質ＶＰ１６（Ｔｒｉｅｚｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．， （１９８８）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖｅｌｐ．２：７１８−７２９）のトランス活性化ドメインと融合したＧＡＬ４ＤＮＡ結合ドメイン（Ｋｅｅｇａｎ ｅｔ ａｌ．，（１９８６）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３１： ６９９−７０４）を含む。融合タンパク質の発現は、当分野で既知の植物もしくは本明細書中に記載した植物中の発現に適する任意のプロモーターによって制御される。この発現カセットは、６ｘＧＡＬ４／最小プロモーターに融合した、本発明の核酸配列を含む植物中に含まれる。こうして、融合タンパク質の組織又は器官特異性が達成され、殺虫性毒物の誘導可能組織−または器官−特異性につながる。
【０１３２】
ｇ．根特異的発現
遺伝子発現の別のパターンは、根での発現である。好適な根のプロモータは、引用によりここに含めるｄｅ Ｆｒａｍｏｎｄ （ＦＥＢＳ ２９０： １０３−１０６（１９９１））によって、そしてまた米国特許５４６６７８５においても記載されている。この「ＭＴＬ」プロモーターを、選択された遺伝子の挿入のために好適なベクター、例えばｐＣＧＮ１７６１ ＥＮＸに移入し、そしてその後完全なプロモーター−遺伝子−ターミネーター・カセットを注目の形質転換ベクターに移入する。
【０１３３】
ｈ． 傷誘導可能プロモーター
傷誘導可能プロモーターはまた、遺伝子発現のために好適である。そのような多くのプロモーターは、記載されており（例えば、Ｘｕ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃ． Ｂｉｏｌ． ２２： ５７３−５８８（１９９３）； Ｌｏｇｅｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ １： １５１−１５８（１９８９）； Ｒｏｈｒｍｅｉｅｒ ＆ Ｌｅｈｌｅ， Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃ． Ｂｉｏｌ． ２２：７８３−７９２（１９９３）； Ｆｉｒｅｋ ｅｔ ａｌ．， Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃ． ２２： １２９−１４２（１９９３）； Ｗａｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｊ． ３：１９１−２０１（１９９３）、そして全てのものは、本発明で使用するのに好適である。Ｌｏｇｅｍａｎｎらは、双子葉植物ジャガイモｗｕｎ１遺伝子の５’上流配列を記載する。Ｘｕ らは、双子葉植物ジャガイモ由来の傷誘導性プロモーター（ｐｉｎ２）が、単子葉植物のイネにおいて活性であることを示す。さらに、Ｒｏｈｒｍｅｉｅｒ ＆ Ｌｅｈｌｅは、傷に誘導され、そして標準的技法を使用して同類の（ｃｏｇｎａｔｅ）プロモーターを単離するために使用することができる、トウモロコシＷｉｐＩ ｃＤＮＡのクローニングを記載している。同様に、Ｆｉｒｅｋ ｅｔ ａｌ．及び Ｗａｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ．は、局所傷部位及び病原体侵入部位で発現される、単子葉植物Ａｓｐａｒａｇｕｓ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ由来の傷に誘導される遺伝子を記載した。当業者に周知であるクローニング技法を使用して、これらプロモーターを好適なベクターに移入し、本発明に関する遺伝子に融合させ、そして植物傷部位でこれらの遺伝子を発現するために使用することが可能である。
【０１３４】
ｉ． 髄優先性発現：
引用によりここに含める特許出願ＷＯ ９３／０７２７８は、髄細胞で優先的に発現するトウモロコシｔｒｐＡ遺伝子の単離を記載する。該遺伝子配列および転写開始点から−１７２６塩基まで伸長するプロモーターが提示されている。標準的な分子生物学技法を使用して、このプロモーター又はその一部をベクター、例えば、ｐＣＧＮ１７６１に移入させることができ、ここで、それは３５Ｓプロモーターを置換し、そして髄に優先される態様で外来遺伝子の発現を駆動することができる。実際、髄に優先されるプロモーター又はその一部を含むフラグメントを、任意のベクターに移入させ、そしてトランスジェニック植物で利用するために修飾し得る。
【０１３５】
ｊ． 葉特異的発現：
ホスホエノールカルボキシラーゼ（ＰＥＰＣ）をコードするトウモロコシ遺伝子 が、Ｈｕｄｓｐｅｔｈ ＆ Ｇｒｕｌａによって記載されている（Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃ Ｂｉｏｌ １２： ５７９−５８９（１９８９））。標準的分子生物学技法を使用して、この遺伝子のためのプロモーターを使用して、トランスジェニック植物において葉特異的な態様で任意の遺伝子の発現を駆動することができる。
【０１３６】
ｋ． 花粉特異的な発現：
ＷＯ ９３／０７２７８ は、花粉細胞で発現するトウモロコシのカルシウム依存性のタンパク質キナーゼ （ＣＤＰＫ） 遺伝子の単離を記載している。該遺伝子配列及びプロモーターは、転写開始点から１４００塩基まで伸長する。標準的分子生物学技法を用いて、このプロモーター又はその一部を、ｐＣＧＮ１７６１のようなベクターに移入させることができ、ここでそれは３５Ｓプロモーターを置換し、そして花粉特異的な態様で、本発明の核酸配列の発現を駆動する３５Ｓプロモーターを置換し、そして花粉特異的態様で本発明の核酸配列の発現を駆動するために使用することができる。
【０１３７】
ｌ．化学的リガンドの存在下のレセプター仲介トランス活性化
引用によりここに含める米国特許５８８０３３３は、クラスＩＩホルモンレセプター、例えば、エクジソンレセプター（ＥｃＲ）およびウルトラスパイラクル（ＵＳＰ）による系を記載し、これらはヘテロダイマーとして一緒に機能し、適当な化学的リガンド、例えば、テブフェノジドの存在下、植物細胞中で、標的ポリペプチドの発現を調節する、
【０１３８】
２． 転写ターミネーター
種々の転写ターミネーターは、発現カセットでの使用ために利用できる。これらは、トランスジーンを超える転写の終結とその正確なポリアデニル化に関与する。適当な転写ターミネーターは、植物で機能することが既知であるものであり、そしてＣａＭＶ ３５Ｓ ターミネーター、ｔｍｌターミネーター、 ノパリンシンターゼターミネーター及びエンドウｒｂｃＳ Ｅ９ ターミネーターを含む。これらは、単子葉植物及び双子葉植物の両方で使用することができる。さらに、遺伝子のネガティブ転写ターミネーターを使用してもよい。
【０１３９】
３． 発現を高め又は調節するための配列
多くの配列は、転写ユニット内からの遺伝子発現を高めることが判っており、これらの配列は、トランスジェニック植物でそれらの発現を増加するために本発明の遺伝子と組み合わせて使用することも可能である。
【０１４０】
種々のイントロン配列は、特に単子葉植物細胞において、発現を増加させることが示されている。例えば、トウモロコシＡｄｈｌ遺伝子のイントロンは、トウモロコシ細胞中に導入する場合、その同類の（ｃｏｇｎａｔｅ）プロモーターの下で、野生型遺伝子の発現を顕著に高める。イントロン１は、クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ遺伝子との融合構築体において、発現を増加させ、特に有効であることが判った（Ｃａｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖｅｌｏｐ １： １１８３−１２００（１９８７））。同じ実験系において、トウモロコシのｂｒｏｎｚｅ １ 遺伝子由来のイントロンは、発現を増加する点で、類似の効果を示した。イントロン配列は、植物の形質転換ベクター、典型的には非翻訳リーダー内にルーチンに取りこませる。
【０１４１】
ウイルスに由来する多くの非翻訳リーダー配列は、発現を高めることが知られ、そしてこれらは、特に双子葉植物細胞において有効である。特に、タバコモザイクウイルス （ＴＭＶ，「Ｗ−配列」）、トウモロコシ退緑斑紋ウイルス（Ｍａｉｚｅ Ｃｈｌｏｒｏｔｉｃ Ｍｏｔｔ Ｖｉｒｕｓ）（ＭＣＭＶ）、アルファルファモザイクウイルス（Ａｌｆａｌｆａ Ｍｏｓａｉｃ Ｖｉｒｕｓ）（ＡＭＶ）からのリーダー配列が、発現を高める点で有効であることが示された （例えば、Ｇａｌｌｉｅ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １５： ８６９３−８７１１（１９８７）； Ｓｋｕｚｅｓｋｉ ｅｔ ａｌ．， Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃ． Ｂｉｏｌ． １５： ６５−７９（１９９０））。
【０１４２】
４． 細胞内の遺伝子産物のターゲティング
遺伝子産物をターゲティングさせるための種々の機構が、植物中に存在することが知られ、そしてこれら機構の機能するのを制御する配列は、いくらか詳細に特徴把握された。例えば、クロロプラストへ遺伝子産物をターゲティングさせることは、クロロプラストへの移入中に切断され、成熟したタンパク質を生成する、多様なタンパク質のアミノ酸末端に見出されているシグナル配列によって制御される（例えば、Ｃｏｍａｉ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６３： １５１０４−１５１０９（１９８８））。これらのシグナル配列は、ヘテロロガス遺伝子産物に融合され、ヘテロロガス産物のクロロプラスト内への移入をもたらすことができる （ｖａｎ ｄｅｎ Ｂｒｏｅｃｋ， ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３１３： ３５８−３６３（１９８５））。適当なシグナル配列についてコードするＤＮＡを、クロロプラストに局在すると知られているＲＵＢＩＳＣＯ タンパク質、ＣＡＢ タンパク質、ＥＰＳＰ合成酵素、ＧＳ２ タンパク質及び多くの他のタンパク質をコードするｃＤＮＡｓの５’末端から単離することができる（Ｕ．Ｓ特許番号５，６３９，９４９の実施例３７の「Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ｗｉｔｈ Ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ」の題名の章を参照）。
【０１４３】
他の遺伝子産物は、ミトコンドリア及びペルオキシソームのような他のオルガネラに局在化する（例えば、Ｕｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃ． Ｂｉｏｌ． １３： ４１１−４１８（１９８９））。これらの産物をコードするｃＤＮＡは、これらのオルガネラにヘテロロガス遺伝子産物をターゲティングさせることをもたらすように操作することができる。そのような配列の例は、核コードＡＴＰａｓｅ及びミトコンドアについて特異的なアスパルテートアミノトランスフェラーゼ・アイソホームである。細胞性のタンパク質ボディをターゲティングさせることが、Ｒｏｇｅｒｓ ｅｔ ａｌ．（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８２： ６５１２−６５１６（１９８５））によって記載されている。
【０１４４】
加えて、他の細胞区画に遺伝子産物をターゲティングさせることを引き起こす配列が特性分析された。アミノ末端配列は、ＥＲ、アポプラスト、アリューロン細胞由来の細胞外分泌へのターゲティングに関与する（Ｋｏｅｈｌｅｒ ＆ Ｈｏ， Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ２： ７６９−７８３（１９９０））。さらに、カルボキシ末端配列と組み合わされたアミノ末端配列は、遺伝子産物の液胞へのターゲティングに関与する （Ｓｈｉｎｓｈｉ ｅｔ ａｌ．， Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃ． Ｂｉｏｌ． １４： ３５７−３６８（１９９０））。
【０１４５】
所望のトランスジーン配列への上記の適切なターゲティング配列の融合によって、任意のオルガネラ又は細胞区画に、トランスジーン産物を方向付けることが可能である。クロロプラストへのターゲティングについて、例えば、ＲＵＢＩＳＣＯ 遺伝子、ＣＡＢ 遺伝子、ＥＰＳＰシンターゼ遺伝子、又はＧＳ２ 遺伝子由来のクロロプラストシグナル配列を、トランスジーンのアミノ末端ＡＴＧに読み枠で融合させる。選択されたシグナル配列は既知の切断部位を含むべきであり、そして構築すべき融合体は、切断に必要な切断部位の後ろの任意のアミノ酸を考慮に入れるべきである。幾つかの場合において、この要件は、切断部位とトランスジーンＡＴＧ間の少ない数のアミノ酸の付加、又はトランスジーン配列内の幾つのアミノ酸の置換によって満たされることもできる。
【０１４６】
クロロプラストへの移入のために構築された融合体を、Ｅｄｅｌｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．（Ｅｄｓ）Ｍｅｔｈｏｄ ｉｎ Ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｅｌｓｅｖｉｅｒ ｐｐ １０８１−１０９１（１９８２）中Ｂａｒｔｌｅｔｔ ｅｔ ａｌ．によって記載された技法およびＷａｓｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ． Ｇｅｎ． Ｇｅｎｅｔ． ２０５：４４６−４５３（１９８６）を使用して、インビトロで転写された構築のインビトロでの翻訳、次いでインビトロのクロロプラストの取り込みの効率について試験することができる。これらの構築技法は当業界で周知であり、そしてミトコンドリア及びペルオキシソムに等しく適用可能である。
【０１４７】
細胞性ターゲティングについての上記の機構を、それらの同類プロモーターと組み合わせてだけでなく、またヘテロロガスプロモーターと組み合わせて利用し、ターゲティングシグナルが由来するプロモーターの発現パターンと異なる発現パターンを有するプロモーターの転写調節下で、特異的細胞−ターゲティング目標をもたらすことができる。
【０１４８】
実施例６：植物形質転換ベクターの構築
植物形質転換のために利用可能である多くの形質転換ベクターが、植物形質転換技法分野での通常の技術を有するものに既知であり、そして本発明に関係する遺伝子を、任意のそのようなベクターと組み合わせて使用することができる。ベクターの選択は、好ましい形質転換技法及び形質転換のための標的種に依存する。ある種の標的種のために、種々の抗生物質又は除草剤選択マーカーが好ましくあり得る。形質転換にルーチンに使用される選択マーカーは、カナマイシン及び関連する抗生物質に対する抵抗性を付与する、ｎｐｔＩＩ遺伝子（Ｍｅｓｓｉｎｇ ＆ Ｖｉｅｒｒａ，Ｇｅｎｅ １９：２５９−２６８（１９８２）；Ｂｅｖａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３０４： １８４−１８７（１９８３））、除草剤ホスヒノスリシンに対する抵抗性を付与する、ｂａｒ遺伝子（Ｗｈｉｔｅ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ １８： １０６２（１９９０）； Ｓｐｅｎｃｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｔｈｅｏｒ． Ａｐｐｌ． Ｇｅｎｅｔ ７９： ６２５−６３１（１９９０））、抗生物質ハイグロマイシンに対する抵抗性を付与する、ｈｐｈ遺伝子（Ｂｌｏｃｈｉｎｇｅｒ ＆ Ｄｉｇｇｌｅｍａｎｎ， Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ ４： ２９２９−２９３１）、およびメトトレキセート（ｍｅｔｈａｔｒｅｘａｔｅ）に対する抵抗性を付与するｄｈｆｒ遺伝子（Ｂｏｕｒｏｕｉｓ ｅｔ ａｌ．， ＥＭＢＯ Ｊ． ２（７）： １０９９−１１０４（１９８３））及びグリフォサートに対する抵抗性を付与する、ＥＰＳＰＳ遺伝子（米国特許番号４，９４０，９３５及び５，１８８，６４２）、およびマンノースを代謝する能力を提供するマンノース−６−リン酸イソメラーゼ遺伝子（米国特許５７６７３７８および５９９４６２９）を含む。
【０１４９】
１．アグロバクテリウム形質転換に好適なベクター
多くのベクターは、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓを使用する形質転換に利用可能である。これらは典型的には、少なくとも１つのＴ−ＤＮＡボーダー配列を有し、そしてベクター例えばｐＢＩＮ１９（Ｂｅｖａｎ， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（１９９４））及びｐＸＹＺを含む。以下に、アグロバクテリウム形質転換に好適な、２種の典型的なベクターの構築を記載する。
【０１５０】
ａ．ｐＣＩＢ２００及びｐＣＩＢ２００１：
バイナリーベクターｐＣＩＢ２００及びｐＣＩＢ２００１を、アグロバクテリウムでの使用のために組換え体ベクターの構築のために使用し、そして以下の態様で構築する。ｐＴＪＳ７５ｋａｎをｐＴＪＳ７５（Ｓｃｈｍｉｄｈａｕｓｅｒ ＆ Ｈｅｌｉｎｓｋｉ， Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １６４： ４４６−４５５（１９８５））のＮａｒＩ消化によって作出し、テトラサイクリン抵抗性遺伝子の切除、次いでＮＰＴＩＩを有するｐＵＣ４ＫからのＡｃｃＩフラグメントの挿入を可能とする（Ｍｅｓｓｉｎｇ ＆ Ｖｉｅｒｒａ， Ｇｅｎｅ １９： ２５９−２６８（１９８２）； Ｂｅｖａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３０４：１８４−１８７ （１９８３）； ＭｃＢｒｉｄｅ ｅｔ ａｌ．， Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ １４： ２６６−２７６（１９９０））。ＸｈｏＩリンカーをレフト及びライトＴ−ＤＮＡボーダー、植物選択可能ｎｏｓ／ｎｐｔＩＩキメラ遺伝子及びｐＵＣポリリンカーを含むＰＣＩＢ７（Ｒｏｔｈｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ ５３： １５３−１６１（１９８７））のＥｃｏＲＶフラグメントにライゲートし、そしてＸｈｏＩ消化したフラグメントをＳａｌＩ消化ｐＴＪＳ７５ｋａｎにクローニングし、ｐＣＩＢ２００を作出する（ＥＰ ０ ３３２ １０４、実施例１９参照）。ｐＣＩＢ２００は、以下の独特なポリリンカー制限部位を含む：ＥｃｏＲＩ、ＳｓｔＩ、ＫｐｎＩ、ＢｇｌＩＩ、ＸｂａＩ、及びＳａｌＩ。
【０１５１】
ｐＣＩＢ２００１は追加的制限部位のポリリンカーへの挿入によって作出したｐＣＩＢ２００の誘導体である。ｐＣＩＢ２００１のポリリンカー中の独特な制限部位は、ＥｃｏＲＩ、ＳｓｔＩ、ＫｐｎＩ、ＢｇｌＩＩ、ＸｂａＩ、ＳａｌＩ、ＭｌｕＩ、ＢｃＩＩ、ＡｖｒＩＩ、ＨｐａＩ及びＳｔｕＩである。これらの独特な制限部位を含むことに加えて、ｐＣＩＢ２００１は、また植物及び細菌カナマイシン選択、アグロバクテリウム仲介形質転換のためのレフト及びライトＴ−ＤＮＡボーダー、Ｅ．ｃｏｌｉと他の宿主の間の移動のためのＲＫ−２に由来するｔｒｆＡ機能、及びまたＲＫ２からのＯｒｉＴ及びＯｒｉＶ機能を有する。ｐＣＩＢ２００１ポリリンカーは、植物発現カセット自身の調節シグナルを含む植物発現カセットのクローニングのために好適である。
【０１５２】
ｂ．ｐＣＩＢ１０及びそのハイグロマイシン選択誘導体：
バイナリベクターｐＣＩＢ１０は、植物での選択のためのカナマイシン抵抗性をコードしている遺伝子及びＴ−ＤＮＡライト及びレフトボーダー配列を含み、そしてＥ．ｃｏｌｉ及びアグロバクテリウムでの複製をそれに可能とする広宿主範囲プラスミドｐＲＫ２５２からの配列を組みこんでいる。その構築は、Ｒｏｔｈｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．（Ｇｅｎｅ ５３： １５３−１６１（１９８７））に記載されている。ｐＣＩＢ１０の種々の誘導体を構築し、これらは、Ｇｒｉｔｚ ｅｔ ａｌ．，（Ｇｅｎｅ ２５： １７９−１８８（１９８３））によって記載されたハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼのための遺伝子を組みこんでいる。これらの誘導体は、ハイグロマイシンのみ（ｐＣＩＢ７４３）、又はハイグロマイシン及びカナマイシン（ｐＣＩＢ７１５、ｐＣＩＢ７１７）におけるトランスジェニック植物細胞の選択を可能とする。
【０１５３】
２．非アグロバクテリウム形質転換のために好適なベクター
Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓを使用しない形質転換は、選ばれた形質転換ベクター中のＴ−ＤＮＡ配列の必要性を回避し、そして結果的にこれらの配列を欠くベクターは、Ｔ−ＤＮＡ配列を含む前記のもののようなベクターに加えて利用することができる。アグロバクテリウムによらない形質転換技法は、パーティクルボンバードメント、プロトプラスト取り込み（例えば、ＰＥＧ及びエレクトロポレーション）及びマイクロインジェクションによる形質転換を含む。ベクターの選択は、大部分は形質転換される種について好ましい選択に依存する。以下に、非アグロバクテリウム形質転換のため好適な典型的なベクターを記載する。
【０１５４】
ａ．ｐＣＩＢ３０６４
ｐＣＩＢ３０６４は、除草剤バスタ（又はホスヒノスリシン）による選択と組み合わせたヂレクトジーントランスファー技法に好適な、ｐＵＣに由来するベクターである。プラスミドｐＣＩＢ２４６は、Ｅ．ｃｏｌｉＧＵＳ遺伝子及びＣａＭＶ３５Ｓ転写ターミネーターへの作動可能な融合でＣａＭＶ３５Ｓプロモーターを含み、そしてＰＣＴ公開出願ＷＯ９３／０７２７８に記載されている。このベクターの３５Ｓプロモーターは、開始部位の５’側に２つのＡＴＧ配列を含む。これらの部位は、そのＡＴＧを除き、そして制限部位ＳｓｐＩ及びＰｖｕＩＩを生成するようなやり方で、標準的ＰＣＲ技法を使用して突然変異されている。新しい制限部位は、独特なＳａｌＩ部位から９６及び３７ｂｐはなれ、及び実際の開始部位から１０１及び４２ｂｐはなれている。得られたｐＣＩＢ２４６の誘導体をｐＣＩＢ３０２５と命名する。次いでＧＵＳ遺伝子をＳａｌＩ及びＳａｃＩでの消化によってｐＣＩＢ３０２５から切除し、末端を平滑化し、再ライゲートしそしてプラスミドｐＣＩＢ３０６０を生成する。
【０１５５】
プラスミドｐＪＩＴ８２をＪｏｈｎ Ｉｎｎｅｓ Ｃｅｎｔｒｅ， Ｎｏｒｗｉｃｈから取得し、そしてＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｖｉｒｉｄｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓからのｂａｒ遺伝子を含む４００ｂｐのＳｍａＩフラグメントを切除し、そしてｐＣＩＢ３０６０（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ ６： ２５１９−２５２３（１９８７））のＨｐａＩ部位に挿入する。これはｐＣＩＢ３０６４を生成し、これは除草剤選択のための、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター及びターミネーターの制御下のｂａｒ遺伝子、アンピシリン抵抗性の遺伝子（Ｅ．ｃｏｌｉでの選択のため）及び独特な制限部位ＳｐｈＩ、ＰｓｔＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、及びＢａｍＨＩを有するポリリンカーを含む。このベクターは、これら自身の調節シグナルを含む植物発現カセットのクローニングのために好適である。
【０１５６】
ｂ．ｐＳＯＧ１９及びｐＳＯＧ３５：
ｐＳＯＧ３５はメトトレキセートに対する抵抗性を付与する選択マーカーとしてＥ．ｃｏｌｉ遺伝子ジヒドロフォレートレダクターゼ（ＤＦＲ）を利用する、形質転換ベクターである。ＰＣＲを使用し、３５Ｓプロモーター（−８００ｂｐ）、トウモロコシＡｄｈ１遺伝子からのイントロン６（−５５０ｂｐ）及びｐＳＯＧ１０からのＧＵＳ非翻訳リーダー配列の１８ｂｐを増幅する。Ｅ．ｃｏｌｉジヒドロフォレートレダクターゼタイプＩＩ遺伝子をコードする２５０ｂｐフラグメントをまた、ＰＣＲによって増幅し、そしてこれら２種のＰＣＲフラグメントを、ｐＵＣ１９ベクターバックボーン及びノパリンシンターゼターミネーターを含むｐＢ１２２１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）からのＳａｃＩ−ＰｓｔＩフラグメントとアセンブルする。これらのフラグメントのアセンブリによって、イントロン６配列、ＧＵＳリーダー、ＤＨＦＲ遺伝子及びノパリンシンターゼターミネーターと融合されている３５Ｓプロモーターを含む、ｐＳＯＧ１９を生成する。トウモロコシ退緑斑紋ウイルス（ＭＣＭＶ）からのリーダー配列でのｐＳＯＧ１９中のＧＵＳリーダー配列の置換は、ベクターｐＳＯＧ３５を生成する。ｐＳＯＧ１９及びＰＳＯＧ３５は、アンシピリン抵抗性のｐＵＳ遺伝子を有し、そして外来物質のクローニングに利用可能なＨｉｄＩＩＩ、ＳｐｈＩ、ＰｓｔＩ及びＥｃｏＲＩ部位を有する。
【０１５７】
３．クロロプラスト形質転換のため好適なベクター
本発明のヌクレオチド配列の植物プラスチドでの発現のために、プラスチド形質転換ベクターｐＰＨ１４３（ＷＯ９７／３２０１１、実施例３６）を使用する。該ヌクレオチド配列をｐＰＨ１４３に挿入し、それによってＰＲＯＴＯＸコード配列を置換する。このベクターを次いで、プラスチド形質転換およびスペクチノマイシン抵抗性のための形質転換体の選択のために使用する。代替的に、該ヌクレオチド配列を、ｐＰＨ１４３に挿入し、その結果それはａａｄＨ遺伝子を置換する。この場合に、形質転換体をＰＲＯＴＯＸインヒビターに対する抵抗性について選択する。
【０１５８】
実施例７：形質転換
本発明の核酸配列が発現系の中にクローニングされると、これを植物細胞中に形質転換する。植物の形質転換及び再生の方法は当分野でよく知られている。例えば、Ｔｉプラスミドベクター、並びに直接的ＤＮＡ取り込み、リポソーム、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、及びマイクロプロジェクタイルが、外来ＤＮＡの送達に利用されてきた。さらに、アグロバクテリウム属の細菌を利用して植物細胞を形質転換することができる。以下は、双子葉植物及び単子葉植物の両者、並びに代表的プラスチド形質転換技法を形質転換するための代表的技術の記載である。
【０１５９】
１．双子葉植物の形質転換
双子葉植物の形質転換技法は当分野でよく知られており、アグロバクテリウムに基づく技法及びアグロバクテリウムを必要としない技法を含む。非アグロバクテリウム技法は、プロトプラスト又は細胞による外生遺伝的物質の直接取り込みを含むものである。これは、ＰＥＧ又はエレクトロポレーションにより仲介される取り込み、パーティクルボンバードメント（粒子衝突）により仲介される送達、又はマイクロインジェクションによって達成できる。これらの技法の例は、Ｐａｓｚｋｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．， ＥＭＢＯ Ｊ３： ２７１７−２７２２（１９８４）；Ｐｏｔｒｙｋｕｓ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｇｅｎ． Ｇｅｎｅｔ： １９９：１６９−１７７（１９８５）；Ｒｅｉｃｈ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｔｅｓｈｎｏｌｏｇｙ ４：１００１−１００４（１９８６）；及びＫｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３２７： ７０−７３（１９８７）により記載されている。それぞれの場合において、形質転換された細胞は、当分野で既知の標準技術を用いて全植物体に再生される。
【０１６０】
アグロバクテリウムにより仲介される形質転換は、その高い形質転換効率及び多くの異なる種に対する広範な用途の故に、双子葉植物の形質転換のための好ましい技術である。アグロバクテリウム形質転換は、典型的には、興味の持たれる外来ＤＮＡを有するバイナリーベクター（例えばｐＣＩＢ２００又はｐＣＩＢ２００１）を、共存するＴｉプラスミド上又は染色体のいずれかに宿主アグロバクテリウム菌株（例えば、ｐＣＩＢ２００及びｐＣＩＢ２００１のための菌株ＣＩＢ５４２（Ｕｋｎｅｓ ｅｔ ａｌ．， Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ５： １５９−１６９（１９９３））が持っているｖｉｒ遺伝子の補完に依存する（ｄｅｐｅｎｄ ｏｆ）かも知れない適当なアグロバクテリウム菌株に、移入させることを含む。アグロバクテリウムへの組換えバイナリーベクターの移入は、組換えバイナリーベクターを有するＥ．ｃｏｌｉであって、ｐＲＫ２０１３のようなプラスミドを持ち、組換えバイナリーベクターを標的アグロバクテリウム菌株に移動させることのできるヘルパーＥ．ｃｏｌｉ菌株を使用する、三元交配法によって達成する。別法として、この組換えバイナリーベクターは、ＤＮＡ形質転換によってアグロバクテリウムに移入させることができる（Ｈｏｅｆｇｅｎ ａｎｄ Ｗｉｌｌｍｉｔｚｅｒ， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １６： ９８７７（１９８８））。
【０１６１】
組換えアグロバクテリウムによる標的植物種の形質転換は、通常、アグロバクテリウムをその植物由来の外植体と共培養することを含み、当分野で周知のプロトコルに従うものである。形質転換された組織は、該バイナリープラスミドＴ−ＤＮＡボーダーの間に存在する抗生物質又は除草剤抵抗性マーカーを有する選択培地上で再生する。
或る遺伝子で植物細胞を形質転換するもう一つのアプローチは、不活性又は生物活性の粒子を植物組織及び細胞に推進させることを含む。この技術はすべてＳａｎｆｏｒｄの米国特許第４９４５０５０、５０３６００６、及び５１００７９２号に開示されている。一般に、この方法は、不活性又は生物活性粒子を、当該細胞の外表面を貫通させその内部への取り込みをもたらすのに有効な条件の下で、細胞へと推進させることを含む。不活性粒子を利用する場合、所望遺伝子を含むベクターで当該粒子を被覆することによって、このベクターを細胞内に導入することができる。別法として、ベクターによって標的細胞を取り巻き、その結果、該粒子の通り跡によってベクターを細胞内に運び入れることもできる。生物活性粒子（例えば、導入したいＤＮＡをそれぞれ含んでいる乾燥コウボ細胞、乾燥細菌又はバクテリオファージ）もまた植物細胞組織中に推進させることができる。
【０１６２】
２．単子葉植物の形質転換
殆どの単子葉植物種の形質転換もまた、現在では常法となっている。好ましい技術は、ＰＥＧ又はエレクトロポレーション技法を用いるプロトプラスト中へのヂレクトジーントランスファー、及びカルス組織中へのパーティクルボンバードメント（粒子衝突）を含む。形質転換は単一ＤＮＡ種又は多重ＤＮＡ種（即ち共形質転換）で企図することができ、これらの技術は共に本発明での使用に好適である。共形質転換は、完全なベクター構築を回避し、そして、所望の及び選択マーカーの遺伝子について連鎖していない遺伝子座を有するトランスジェニック植物を作出する利点を持ち得、それにより、もしそれが望ましいとされるならば、以後の世代で選択マーカーを除去することが可能となる。しかしながら、共形質転換を使用することの不利な点は、別々のＤＮＡ種が当該ゲノム中に組み込まれる頻度が１００％未満であることである（Ｓｃｈｏｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ４： １０９３−１０９６（１９８６））。
【０１６３】
特許出願ＥＰ０２９２４３５、ＥＰ０３９２２２５、及びＷＯ９３／０７２７８は、選抜された近交系トウモロコシからのカルス及びプロトプラストの調製、ＰＥＧ又はエレクトロポレーションを用いるプロトプラストの形質転換、及び形質転換されたプロトプラストからのトウモロコシ植物の再生のための技術を記載している。Ｇｏｒｄｏｎ−Ｋａｍｍ ｅｔ ａｌ．（Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ２： ６０３−６１８（１９９０））およびＦｒｏｍｍ ｅｔ ａｌ．（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８：８３３−８３９（１９９０））は、パーティクルボンバードメントを用いるＡ１８８に由来するトウモロコシ系統の形質転換のための技術を公表している。さらに、ＷＯ９３／０７２７８及びＫｏｚｉｅｌ ｅｔ ａｌ．（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １１： １９４−２００（１９９３））は、パーティクルボンバードメントによる選抜近交系トウモロコシの形質転換の技術を記載している。この技術は、授粉の１４−１５日後のトウモロコシ雌穂から切り取った１．５−２．５ｍｍ長の未熟なトウモロコシ胚、及びボンバードメントのためのＰＤＳ−１０００Ｈｅ Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃｓ装置を利用するものである。
【０１６４】
イネの形質転換もまた、プロトプラスト又はパーティクルボンバードメントを利用するヂレクトジーントランスファー技法によって実施することができる。プロトプラストにより仲介される形質転換が、Ｊａｐｏｎｉｃａ型及びＩｎｄｉｃａ型について記載されている（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ． Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ ７： ３７９−３８４（１９８８）；Ｓｈｉｍａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ３３８： ２７４−２７７（１９８９）； Ｄａｔｔａ ｅｔ ａｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８； ７３６−７４０（１９９０））。いずれの型もパーティクルボンバードメントを使用して常法により形質転換可能である（Ｃｈｒｉｓｔｏｕ ｅｔ ａｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９： ９５７−９６２（１９９１））。さらに、ＷＯ９３／２１３３５は、エレクトロポレーションによるイネの形質転換技法を記載している。
【０１６５】
特許出願ＥＰ０３３２５８１は、Ｐｏｏｉｄｅａｅプロトプラストの生成、形質転換及び再生のための技術を記載している。これらの技術によりＤａｃｔｙｌｉｓ及びコムギの形質転換が可能となる。さらに、Ｃ型長期再生可能カルスの細胞へのパーティクルボンバードメントを用いるコムギの形質転換が、Ｖａｓｉｌ ｅｔ ａｌ．（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １１：１５５３−１５５８（１９９３））によって、また、未熟な胚及び未熟な胚に由来するカルスのパーティクルボンバードメントを用いるコムギの形質転換がＶａｓｉｌ ｅｔ ａｌ．（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：６６７−６７４（１９９２））及びＷｅｅｋｓ ｅｔ ａｌ．（Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ． １０２： １０７７−１０８４（１９９３））により記載されている。しかしながらコムギの形質転換のための好ましい技術は、未熟な胚のパーティクルボンバードメントによるコムギの形質転換を含むものであって、遺伝子送達前の高シュクロース又は高マルトース段階のいずれかを含んでいる。ボンバードメントに先立ち、体細胞胚の誘導のため、３％シュクロース及び３ｍｇ／Ｌの２，４−Ｄを含有するＭＳ培地（Ｍｕｒａｓｈｉｇａ ａｎｄ Ｓｋｏｏｇ， Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉａ Ｐｌａｎｔａｒｕｍ １５： ４７３−４９７（１９６２））に任意の数の胚（長さ０．７５−１ｍｍ）を平板培養し、これを暗所で進める。選択されたボンバードメントの日に、胚を誘導培地から取り、浸透調節物質（即ち、所望濃度、典型的には１５％のシュクロース又はマルトースを含有する誘導培地）上に配置する。
【０１６６】
この胚を２−３時間原形質分離させ、次いでボンバードメントさせる。標的プレート当たり２０個の胚が典型的であるが、それが重要という訳ではない。適当な遺伝子を持つプラスミド（例えばｐＣＩＢ３０６４又はｐＳＧ３５）を、標準法を用いてマイクロメーターサイズの金粒子上に沈殿させる。胚の各プレートを、〜１０００ｐｓｉの爆発圧、標準８０メッシュスクリーンを用いるＤｕＰｏｎｔ Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃｓ（商標）ヘリウム装置で撃つ。ボンバードメント後、この胚を暗所に戻し、約２４時間回復させる（依然として浸透調節物質上で）。２４時間後、胚を浸透調節物質から取り、誘導培地上に戻し、ここで再生の前に約１ヶ月間保持する。およそ１ヶ月後、発達しつつある胚形成性カルスを発達させる胚の外植体を、適当な選択剤（ｐＣＩＢ３０６４の場合１０ｍｇ／Ｌ ｂａｓｔａ、そしてｐＳＯＧ３５の場合２ｍｇ／Ｌのメソトレキサート）をさらに含有する再生培地（ＭＳ ＋ １ｍｇ／Ｌ ＮＡＡ、５ｍｇ／Ｌ ＧＡ）に移す。およそ１ヶ月後、発達した苗条を、半分の強度のＭＳ、２％シュクロース、及び同濃度の選択剤を入れた、「ＧＡ７」として知られる、より大きな無菌容器に移す。
アグロバクテリウムを使用する単子葉植物の形質転換もまた記載されている。引用によりここに含めるＷＯ９４／００９７７及び米国特許第５５９１６１６号を参照されたい。
【０１６７】
３．プラスチドの形質転換
Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ ｃ．ｖ．’Ｘａｎｔｈｉ ｎｂ’の種子を、Ｔアガー上で１インチ円配列でプレートあたり７本発芽させ、そして本質的に記載のとおり（Ｓｖａｂ， Ｚ． ａｎｄ Ｍａｌｉｇａ， Ｐ． （１９９３）ＰＡＮＳ ９０， ９１３−９１７）、プラスミドｐＰＨ１４３およびｐＰＨ１４５からのＤＮＡでコートされた１μｍタングステン粒子（Ｍ１０， Ｂｉｏｒａｄ， Ｈｅｃｕｌｅｓ， ＣＡ）で、播種１２−１４日後にボンバードする。ボンバードした実生を、２日間Ｔ培地上でインキュベートし、その後、葉を切除しそして明光（３５０−５００μｍｏｌ光量子／ｍ^２／ｓ）中で背軸側を上にして、５００μｇ／ｍｌ　スペクチノマイシンジヒドロクロリド（Ｓｉｇｍａ， Ｗｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）を含むＲＭＯＰ培地（Ｓｖａｂ， Ｚ．， Ｈａｊｄｕｋｉｅｗｉｃｚ， Ｐ． ａｎｄ Ｍａｌｉｇａ， Ｐ． （１９９０）ＰＮＡＳ ８７， ８５２６−８５３０のプレート上に置く。ボンバードメント３ないし８週後に白化した葉の下に現れる抵抗性シュートを、同じ選択培地上にサブクローン化し、カルスを形成させるままにし、そして二次シュートを単離およびサブクローン化する。独立サブクローにおける形質転換したプラスチドゲノムコピーの完全な分離（ホモプラスミシティー）を、サザンブロッティングの標準的技法によって評価する（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， （１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ）。ＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩ消化した総細胞性ＤＮＡ（Ｍｅｔｔｌｅｒ， Ｉ． Ｊ． （１９８７）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ ５， ３４６−３４９）を、１％トリスボレート（ＴＢＥ）アガロースゲル上に分離し、ナイロン膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ）に移し、そしてｒｐｓ７／１２プラスチドターゲティング配列の一部を含むｐＣ８からの０．７ｋｂ　ＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩＤＮＡフラグメントに対応する、^３２Ｐ標識したランダムプライマー化ＤＮＡ配列で探索する。ホモプラスミックシュートをスペクチノマイシン含有ＭＳ／ＩＢＡ培地（ＭｃＢｒｉｄｅ， Ｋ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．， （１９９４）ＰＮＡＳ ９１， ７３０１−７３０５）上で無菌的に発根させ、そして温室に移す。
【０１６８】
実施例８：育種
本発明の核酸配列で形質転換して取得した植物は、単子葉および双子葉植物を含む任意の広範囲の植物種であることができ、しかし、本発明の方法で使用される植物は好ましくは、前記した農業的に重要な標的作物のリストから選択される。生産および品質について重要な他の特性と組み合わせた、本発明の遺伝子の発現を、育種を通して植物系統に取りこませる。育種アプローチおよび技法は、当業界で既知である。例えば、Ｗｅｌｓｈ Ｊ． Ｒ． Ｆｕｄａｍｅｎｔａｌｓ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， ＮＹ（１９８１）； Ｃｒｏｐ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ， Ｗｏｏｄ Ｄ． Ｒ．（Ｅｄ．）Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ａｇｒｏｎｏｍｙ Ｍａｄｉｓｏｎ， Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ（１９８１）； Ｍａｙｏ Ｏ．， Ｔｈｅ Ｔｈｅｏｒｙ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ， ２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｃｌａｒｅｎｄｏｎ Ｐｒｅｓｓ， Ｏｘｆｏｒｄ（１９８７）； Ｓｉｎｇｈ， Ｄ．Ｐ．， Ｂｒｅｅｄｉｎｇ ｆｏｒ Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｏ Ｄｉｓｅａｓｅｓ ａｎｄ Ｉｎｓｅｃｔ Ｐｅｓｔｓ， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ， ＮＹ（１９８６）； Ｗｒｉｃｋｅ ａｎｄ Ｗｅｂｅｒ， Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ Ｐｌａｎｔ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ， Ｗａｔｅｒ ｄｅ Ｇｒｕｙｔｅｒ ａｎｄ Ｃｏ．， Ｂｅｒｌｉｎ（１９８６）参照。
【０１６９】
前記トランスジェニック種子および植物ヘ、改変された遺伝的特性は、有性生殖または栄養成長によって受け渡され、そしてこうして維持することができ、そして後代植物で増殖する。一般に当該維持および増殖を、具体的目的、例えば耕耘、播種、または収穫に適合させるように開発された既知の農学的方法を使用する。特殊化プロセス、例えば、水耕または温室技法をまた適用できる。成長する作物は、昆虫または感染によって引き起こされる攻撃および被害並びに雑草植物による競合に脆弱であるから、手段を企図し、雑草、植物病害、昆虫、線虫、および他の有害条件を制御し、収量を向上させる。これらは、機械的手段、例えば、土壌の耕耘、雑草および感染した植物の除去、並びに農薬、例えば、除草剤、殺菌剤、殺配偶子剤（ｇａｍｅｔｏｃｉｄｅｓ）、殺線虫剤、成長調節物質、成熟剤および殺虫剤の適用を含み得る。
【０１７０】
本発明のトランスジェニック植物および種子の有利な遺伝的特性の使用はさらに、植物育種でなされ、これは改善された特性、例えば、害虫、除草剤、またはストレスの耐性、改善された栄養価、増加した収量、または倒伏または脱粒からのより少ない喪失を引き起こす改善された構造のある植物の開発を目的とする。種々の育種ステップは、よく定義された人間の介入、例えば、交雑すべき系統の選抜、親系統の受粉の制御、または適当な後代植物の選抜によって特徴付けられる。望まれる特性に依存して、種々の育種手段をとる。関連する技法は、当業界で周知であり、そして雑種形成、同系交配、戻し交雑育種、多系育種、変種ブレンド、種間交雑、異数体技法等を含み得るがこれらに限定されない。雑種形成技法はまた、植物の不稔化を含み、機械的、化学的、または生化学的手段によって雄性または雌性不稔植物を得る。雄性不稔植物の、異なる系統の花粉での交雑受粉は、雄性不稔だが雌性稔性植物のゲノムが斉一に両親系統の特性を取得することを確保する。こうして、本発明に従うトランスジェニック種子および植物を改善された植物系統の育種のために使用し、例えば、慣行方法、例えば、除草剤または農薬処理の有効性を増加させ、またはそれらの修飾された遺伝的特性のために当該方法を無しで済ますことを可能とする。代替的に、改善されたストレス耐性のある新しい作物を取得することができ、これはそれらの最適化された遺伝的「装置」のために、比較的不利な発達条件に耐えることができない植物産物よりもよりよい品質の収穫産物を得る。
【０１７１】
実施例９：種子生産
種子生産では種子の発芽の質および斉一性は、必須の産物特性であり、一方農家によって収穫されおよび販売される種子の発芽の質および斉一性は重要ではない。他の作物および雑草種子のない作物を維持すること、種子由来の病害を制御すること、および良好な発芽の種子を生産することは困難であるから、かなり徹底的および良く定義された種子生産実務が、純粋種子の育成、調質、および販売の分野で経験がある種子生産者によって開発された。こうして、農家自身の作物から収穫した種子を使用することのかわりに、特異的品質標準に合致する保証された種子を購入することは、農家にとって共通の実務である。種子として使用されるべき繁殖材料を、除草剤、殺虫剤、殺真菌剤、殺細菌剤、殺線虫剤、軟体動物駆除剤、またはその混合物を含む保護被覆で慣行的に処理する。慣行的に使用される保護剤被覆は、化合物、例えば、キャプタン、カルボキシン、チウラム（ＴＭＴＤ（登録商標））、メタラキシル（Ａｐｒｏｎ（登録商標））、およびピリミフォス−メチル（Ａｃｔｅｌｌｉｃ）（登録商標）を含む。望まれれば、これらの化合物を担体、界面活性剤、または細菌、真菌または動物害虫によって引き起こされる被害に対して保護するため製剤業界で慣行的に使用される適用促進性アジュバントとともに製剤化する。保護剤被覆を、液体製剤で繁殖材料を浸漬することによって、または組み合わせ湿潤または乾燥製剤での被覆によって適用し得る。適用の他の方法はまた、芽または果実に指向化される処理のように、可能である。
【０１７２】
実施例１０：トウモロコシ植物分析
アグロバクテリウム仲介形質転換によってプラスミドｐＮＯＶ１４３６、ｐＮＯＶ１４４１およびｐＮＯＶ１３１３で形質転換した植物は、アワノメイガおよびｆａｌｌ ａｒｍｙｗｏｒｍに対して１００％死を引き起こす。ＥＬＩＳＡデータを以下に示す：
【０１７３】
【表２】

【０１７４】
実施例１１：イネ植物分析
アグロバクテリウム仲介形質転換によってプラスミドｐＮＯＶ１３０５で形質転換したイネ植物は、アワノメイガおよびｆａｌｌ ａｒｍｙｗｏｒｍに対して１００％死を引き起こす。ＥＬＩＳＡデータを以下に示す：
【表３】

【０１７５】
実施例１２：キャベツ植物分析
アグロバクテリウム仲介形質転換によってプラスミドｐＺＵ５７８（配列番号１７）で形質転換したキャベツ植物を、コナガ（Ｐｌｕｔｅｌｌａ ｘｙｌｏｓｔｅｌｌａ（Ｄｉａｍｏｎｄｂａｃｋ ｍｏｔｈ））に対して試験した。トランスジェニックおよびコントロール植物に、１６匹の幼虫（１−３齢）を、収容したＰｌｕｔｅｌｌａ培養（キャベツ植物を有する）から絵筆で４枚の葉のそれぞれの上に４匹移して寄生させた。寄生された植物を、試験期間中１ｘ１ｘ１ｍケージに移した。コントロール植物は、非形質転換キャベツ植物（感受性コントロール）および商業的Ｂｔ殺虫剤Ｄｉｐｅｌで噴霧した非形質転換キャベツ植物（抵抗性コントロール）を含む。スコアー化（２週間後）は：被害なし（または小さい孔のみ＝抵抗性）；＋＝植物上の大孔（＝ｓｕｓｃ．）；＋＋多くの大孔で植物重度被害（＝ｓｕｓｃ．）である。Ｄｉｐｅｌ植物はいつも−のスコアであり、感受性コントロールは＋＋のスコアである。トランスジェニックおよびコントロール植物についての昆虫被害割合およびＥＬＩＳＡデータを以下に示す。
【０１７６】
【表４】

【表５】

【０１７７】
前開示実施態様は例示である。本発明のこの開示は当業者に本発明の多くの変形をもたらす。すべてのそのような自明および予測される変形は、本発明によって包含されること意図される。

Claims (42)

1. フォールアーミーワーム（ｆａｌｌ ａｒｍｙｗｏｒｍ）、ワタアカミムシ（ｐｉｎｋ ｂｏｌｌｗｏｒｍ）、オオタバコガ（ｔｏｂｏｃｃｏ ｂｕｄｗｏｒｍ）、アワノメイガ（Ｅｕｒｏｐｅａｎ ｃｏｒｎｂｏｒｅｒ）、およびコナガ（ｄｉａｍｏｎｄｂａｃｋ ｍｏｔｈ）からなる群より選択される昆虫を制御する方法であって、Ｃｒｙ１Ｃ毒素由来のドメインＩＩＩにアミノからカルボキシへの方向で結合されたＣｒｙ１Ａｂ毒素由来のドメインＩおよびＩＩを含むハイブリッドＢａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ毒素の有効量を、当該昆虫に送達することを含む方法。
2. 該ハイブリッドＢａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ毒素が配列番号２、４、６、８、または１０に少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１の方法。
3. 該ハイブリッドＢａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ毒素が配列番号２、４、６、８、または１０を含む、請求項２の方法。
4. 該ハイブリッドＢａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ毒素がＣ末端テイル領域をさらに含む、請求項１の方法。
5. 該Ｃ末端テイル領域がＣｒｙ１Ｃテイル領域である、請求項４の方法。
6. 該Ｃ末端テイル領域がＣｒｙ１Ａｂ領域である、請求項４の方法。
7. 該Ｃ末端テイル領域が近似的に４０アミノ酸長である、請求項４の方法。
8. 昆虫を、ハイブリッドＢａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ毒素をコードするヌクレオチド配列を含む組換えＤＮＡで形質転換された、トランスジェニック植物組織と接触させることを含む、有効量のハイブリッドＢａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ毒素を昆虫に送達する請求項１の方法であって、ここで当該トランスジェニック植物組織中の該ハイブリッドＢａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ毒素の発現が、該昆虫に対する抵抗性を付与する、方法。
9. 当該ヌクレオチド配列が配列番号１、３、５、７、または９に実質的に同一である請求項８の方法。
10. ハイブリッドＢａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ毒素をコードするヌクレオチド配列を含む単離核酸分子であって、
    （ａ）Ｃｒｙ１Ｃ毒素由来のドメインＩＩＩへアミノからカルボキシへの方向で結合されたＣｒｙ１Ａｂ毒素由来のドメインＩおよびＩＩを含むＮ末端毒素部分、および
    （ｂ）Ｃｒｙ１Ａｂ毒素由来のＣ末端テイル領域
    を含む核酸分子。
11. 該ハイブリッドＢａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ毒素が配列番号６、８、または１０に少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１０の核酸分子。
12. 該ハイブリッドＢａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ毒素が配列番号６、８、または１０を含む、請求項１１の核酸分子。
13. 当該ヌクレオチド配列が、配列番号５、７、または９に少なくとも９０％同一である請求項１０の核酸分子。
14. 当該ヌクレオチド配列が配列番号５、７、または９を含む請求項１３の核酸分子。
15. 請求項１０の核酸分子に作動可能に連結されたヘテロロガスプロモーター配列を含む、キメラ遺伝子。
16. 請求項１５のキメラ遺伝子を含む組換えベクター。
17. 請求項１５のキメラ遺伝子を含むトランスジェニック宿主細胞。
18. 植物細胞である、請求項１７のトランスジェニック宿主細胞。
19. 請求項１８のトランスジェニック植物細胞を含むトランスジェニック植物。
20. トウモロコシ、ワタ、イネ、またはキャベツである、請求項１９のトランスジェニック植物。
21. 請求項１９のトランスジェニック植物由来の種子。
22. （ａ）上昇されたレベルの関連コード配列の転写を植物において促進する核酸プロモーター配列、および
    （ｂ）当該プロモーター配列に作動可能に連結された請求項１０に記載の核酸分子、
    を含むキメラ遺伝子で植物において形質転換されたハイブリッドＢａｃｉｌｌｕｓ ｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ毒素を発現させることを含む、昆虫に対して植物を保護する方法であって、
    ここで当該植物におけるハイブリッドＢａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ毒素の発現が、昆虫に対して当該植物を保護する方法。
23. 昆虫に対して活性であるハイブリッドＢａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ毒素を生産する方法であって、
    （ａ）請求項１７のトランスジェニック宿主細胞を取得すること、
    （ｂ）当該トランスジェニック宿主細胞において該核酸分子を発現させ、昆虫に対して活性であるハイブリッドＢａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ毒素を生じる、ことを含む方法。
24. 請求項１０の核酸分子を植物に導入することを含む、昆虫に抵抗性の植物を生産する方法であって、当該核酸分子が、当該植物において昆虫を制御するのに有効量で当該核酸分子が発現可能である、方法。
25. 配列番号３、５、７、９、１１、１２、１３、１４、１５、１６、または１７を含む単離核酸分子。
26. 配列番号３、５、７、または９を含む請求項２５の核酸分子。
27. 配列番号１１、１２、１３、１４、１５、１６、または１７を含む請求項２５の核酸分子。
28. 請求項２６の核酸分子に作動可能に連結されたヘテロロガスプロモーター配列を含むキメラ遺伝子。
29. 請求項２８のキメラ遺伝子を含む組換えベクター。
30. 請求項２８のキメラ遺伝子を含むトランスジェニック宿主細胞。
31. 植物細胞である請求項３０のトランスジェニック宿主細胞。
32. 請求項３１のトランスジェニック植物細胞を含むトランスジェニック植物。
33. トウモロコシ、ワタ、イネまたはキャベツ植物である請求項３２のトランスジェニック植物。
34. 請求項３３のトランスジェニック植物由来の種子。
35. 請求項２７のＤＮＡ分子を含むトランスジェニック植物細胞。
36. 請求項３５のトランスジェニック植物細胞を含むトランスジェニック植物。
37. トウモロコシ、ワタ、イネまたはキャベツ植物である請求項３６のトランスジェニック植物。
38. 請求項３６のトランスジェニック植物由来の種子。
39. （ａ）Ｃｒｙ１Ｃ毒素由来のドメインＩＩＩにアミノからカルボキシへの方向で結合されたＣｒｙ１Ａｂ毒素由来のドメインＩおよびＩＩを含むＮ末端毒素部分、および
    （ｂ）Ｃｒｙ１Ａｂ毒素由来のＣ末端テイル領域
    を含むハイブリッドＢａｃｉｌｌｕｓ Ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ毒素。
40. 配列番号６、８、または１０に少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む請求項３９のハイブリッドＢａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ毒素。
41. 配列番号６、８、または１０を含む、請求項４０のハイブリッドＢａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ毒素。
42. 昆虫を制御するのに有効量の請求項３９のハイブリッドＢａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ毒素を含む組成物。