BR112017015270B1 - Método para controle de ervas daninhas, molécula de ácido nucleico, cassete de expressão, vetor e polipeptídeo tria mutante - Google Patents

Abstract

plantas ou partes de planta, semente, células, produtos, progênie, método para o controle de ervas–daninhas, métodos de produção de uma planta, molécula de ácido nucleico, cassete de expressão, vetor, polipeptídeo e método para a produção de um produto. a presente invenção diz respeito a uma planta ou parte de planta que compreende um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo tria tipo selvagem ou mutante, e a expressão do referido polinucleotídeo confere tolerância a herbicidas à planta ou parte de planta.

Description

[001] O presente pedido reivindica a prioridade do pedido europeu EP15151966.7, depositado em 21 de janeiro de 2015, cujo conteúdo integral é incorporado ao presente pela referência.

CAMPO DA INVENÇÃO

[002] A presente invenção refere-se em termos gerais aos métodos para conferir tolerância a herbicidas em plantas ao nível agrícola. Particularmente, a invenção diz respeito às plantas possuindo tolerância aumentada aos herbicidas, mais especificamente aos herbicidas que inibem a biossíntese de celulose interferindo na biossíntese da parede celular.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[003] Os micro-organismos respondem frequentemente à entrada de xenobióticos no ambiente, desenvolvendo mecanismos para usá-los como fontes de nutrientes e energia para seus crescimentos. Como a estrutura dos herbicidas com base em um anel s-triazina difere de compostos naturais (Esser et al., 1975), os micro-organismos lentamente evoluíram enzimas e vias capazes de degradá-los. A superfamília de amidohidrolase compreende um conjunto notável de enzimas que catalisam a hidrólise de uma ampla gama de substratos possuindo grupos funcionais de amida ou éster em centros de carbono e fósforo. Em todos os casos, a molécula de água nucleofílica é ativada através da complexação com um centro de metal mononuclear ou binuclear. Nos centros metálicos mononucleares, o substrato é ativado por uma transferência de prótons do sítio ativo, e a água é ativada pela ligação de metal e catálise de base geral. Os centros metálicos estão posicionados na extremidade C-terminal do núcleo barril-beta dentro de um domínio estrutural (beta-alfa) 8. Um exemplo proeminente é a atrazina clorohidrolase (AtzA) e um homohexâmero dependente de Fe(II) (Seffernick et al. 2002; Wackett et al. 2002a) catalisando a decloração hidrolítica da atrazina, um herbicida, produzindo o produto não herbicida 2- hidroxitrazina (de Souza et al. 1996; Seffernick et al. 2002; Sadowsky e Wackett 2000). O parente conhecido mais próximo da AtzA é a melamina desaminase (TriA de Pseudomonas sp. cepa NRRL B-12227, com 98% de identidade de sequência). Apesar de sua alta similaridade de sequência, AtzA e TriA são cataliticamente distintas; a TriA é uma desaminase com uma atividade declorinase em várias ordens abaixo de sua atividade desaminase fisiológica, enquanto a AtzA é uma declorinase sem atividade desaminase detectável. O trabalho anterior mostrou que três dos nove aminoácidos que diferem entre as duas proteínas (S331C, N328D e F84I; AtzA) são em grande parte responsáveis pelas diferenças de especificidade catalítica.

[004] A presente invenção provê novos métodos para aumentar a tolerância a herbicidas em plantas pela introdução de genes bacterianos que codificam proteínas-alvo que biodegradam o herbicida, em particular os inibidores da biossíntese de celulose denominados de azinas. A enzima bacteriana TriA foi projetada de forma a permanecer ou aumentar a atividade da amidohidrolase e expandir o bolso da enzima em direção a um substrato mais volumoso aceptor. Os inventores da presente invenção descobriram surpreendentemente que a superexpressão de formas da melamina desaminase TriA tipo selvagem ou mutante confere ás plantas uma tolerância/resistência a algumas classes de herbicidas em comparação com plantas ou células vegetais não transformadas e/ou não mutagenizadas, respectivamente. Mais especificamente, os inventores da presente invenção descobriram que a expressão de TriA confere tolerância/resistência às azinas.

[005] O problema da presente invenção pode ser visto como o fornecimento de novas características pela identificação de polipeptídeos alvo, a manipulação dos quais torna as plantas tolerantes a herbicidas.

[006] Três estratégias principais estão disponíveis para tornar as plantas tolerantes a herbicidas, ou seja, (1) desintoxicar o herbicida com uma enzima que transforma o herbicida, ou o seu metabolito ativo, em produtos não tóxicos, como, por exemplo, enzimas para a tolerância ao bromoxinil ou basta (EP242236, EP337899); (2) a mutação da enzima alvo em uma enzima funcional que é menos sensível ao herbicida, ou ao seu metabolito ativo, tal como, por exemplo, as enzimas para a tolerância ao glifosato (EP293356, Padgette S.R. et al., J. Biol.Chem, 266, 33, 1991); ou (3) superexpressando a enzima sensível de modo a produzir quantidades da enzima alvo na planta, que são suficientes em relação ao herbicida, levando em conta as constantes cinéticas desta enzima, de modo a ter enzima funcional suficientemente disponível apesar da presença de seu inibidor.

[007] O problema é resolvido pela matéria da presente invenção.

DESCRIÇÃO RESUMIDA DA INVENÇÃO

[008] Consequentemente, em um aspecto, a presente invenção provê uma planta ou parte de planta que compreende um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo TriA tipo selvagem ou mutado, e a expressão do referido polinucleotídeo confere à planta ou parte da planta tolerância a herbicidas.

[009] Em alguns aspectos, a presente invenção provê uma semente capaz de germinar em uma planta compreendendo, em pelo menos algumas de suas células, um polinucleotídeo operacionalmente ligado a um promotor operável em células vegetais, cujo promotor é capaz de expressar um polipeptídeo TriA tipo selvagem ou mutado codificado pelo polinucleotídeo, a expressão do polipeptídeo TriA tipo selvagem ou mutado confere à planta tolerância a herbicidas.

[010] Em um aspecto, a invenção provê uma célula vegetal capaz de regenerar uma planta que compreende, em pelo menos algumas de suas células, um polinucleotídeo operacionalmente ligado a um promotor operável em células vegetais, cujo promotor é capaz de expressar um polipeptídeo TriA tipo selvagem ou mutado codificado pelo polinucleotídeo, a expressão do polipeptídeo TriA tipo selvagem ou mutado confere à planta tolerância a herbicidas, em que a célula vegetal compreende o polinucleotídeo operacionalmente ligado a um promotor.

[011] Em outro aspecto, a presente invenção provê uma célula vegetal compreendendo um polinucleotídeo operacionalmente ligado a um promotor operável em uma célula, cujo promotor é capaz de expressar um polipeptídeo TriA tipo selvagem ou mutado codificado pelo polinucleotídeo, a expressão do polipeptídeo TriA tipo selvagem ou mutado confere à planta tolerância a herbicidas.

[012] Em outros aspectos, a presente invenção provê um produto vegetal preparado a partir de uma planta ou parte de planta, compreendendo, em pelo menos algumas de suas células, um polinucleotídeo operacionalmente ligado a um promotor operável em células vegetais, cujo promotor é capaz de expressar um polipeptídeo TriA tipo selvagem ou mutado codificado pelo polinucleotídeo, e a expressão do polipeptídeo TriA tipo selvagem ou mutado confere à planta tolerância a herbicidas.

[013] Em alguns aspectos, a presente invenção provê uma progênie ou planta descendente, capaz de regenerar uma planta que compreende, em pelo menos algumas de suas células, um polinucleotídeo operacionalmente ligado a um promotor operável em células vegetais, cujo promotor é capaz de conduzir a expressão de um polipeptídeo TriA tipo selvagem ou mutado codificado pelo polinucleotídeo, em que a progênie ou planta descendente compreende, em pelo menos algumas de suas células, o polinucleotídeo recombinante operacionalmente ligado ao promotor, cuja expressão do polipeptídeo TriA tipo selvagem ou mutado confere à progênie ou planta descendente tolerância a herbicidas.

[014] Em outros aspectos, a presente invenção provê um método para o controle de ervas daninhas em um local para crescimento de uma planta, cujo método compreende: (a) aplicação de uma composição herbicida compreendendo herbicidas no local; e (b) plantar uma semente no local, de modo que a semente é capaz de produzir uma planta que compreende, em pelo menos algumas de suas células, um polinucleotídeo operacionalmente ligado a um promotor operável em células vegetais, em que o promotor é capaz de expressar um polipeptídeo TriA tipo selvagem ou mutado codificado pelo polinucleotídeo, em que a expressão do polipeptídeo TriA tipo selvagem ou mutado confere à planta uma tolerância a herbicidas.

[015] Em alguns aspectos, a presente invenção provê um método para controlar ervas daninhas em um local de crescimento de uma planta, em que o método compreende: (a) aplicação de uma composição herbicida que compreende herbicidas ao local; em que o referido local é: (a) um local que contém: uma planta ou uma semente capaz de produzir a referida planta; ou (b) um local que, após a referida aplicação ser feita, deve conter a planta ou semente; em que a planta ou a semente compreende em pelo menos algumas de suas células um polinucleotídeo operacionalmente ligado a um promotor operável em células vegetais, cujo promotor é capaz de expressar um polipeptídeo TriA tipo selvagem ou mutado codificado pelo polinucleotídeo, em que a expressão do polipeptídeo TriA tipo selvagem ou mutado confere à planta tolerância a herbicidas.

[016] Em um aspecto, a etapa (a) ocorre antes, após, ou simultaneamente com a etapa (b).

[017] Em outros aspectos, a presente invenção provê um método de produção de uma planta que possui tolerância ao herbicida, cujo método compreende a regeneração de uma planta a partir de uma célula vegetal transformada com um polinucleotídeo recombinante operacionalmente ligado a um promotor operável em células vegetais, cujo promotor é capaz de expressar um polipeptídeo TriA tipo selvagem ou mutado codificado pelo polinucleotídeo, em que a expressão do polipeptídeo TriA tipo selvagem ou mutado confere à planta tolerância a herbicidas.

[018] Em um aspecto, a presente invenção provê método de produção de uma planta descendente que possui tolerância a herbicidas, cujo método compreende: o cruzamento de uma primeira planta tolerante ao herbicida com uma segunda planta para produzir uma planta descendente (progênie) tolerante ao herbicida, em que a primeira planta e a planta descendente compreendem, em pelo menos algumas de suas células, um polinucleotídeo operacionalmente ligado a um promotor operável em células vegetais, cujo promotor é capaz de conduzir a expressão do polipeptídeo TriA tipo selvagem ou mutado codificado pelo polinucleotídeo, em que a expressão do polipeptídeo TriA tipo selvagem ou mutado confere tolerância a herbicidas à planta.

[019] Além disso, a presente invenção diz respeito a um método para identificar um herbicida usando uma TriA tipo selvagem ou mutada da presente invenção codificada por um ácido nucleico que compreende a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 1, ou uma variante, homóloga, paráloga ou ortóloga desta.

[020] O referido método compreende as etapas de: a) geração de uma célula transgênica ou planta compreendendo um ácido nucleico que codifica uma TriA mutada da presente invenção, em que a TriA mutada da presente invenção é expressa; b) aplicação de um herbicida na célula ou planta transgênica de a) e em uma célula ou planta controle da mesma variedade; c) determinação do crescimento ou da viabilidade da célula ou planta transgênica e da célula ou planta controle após a aplicação do referido composto teste, e d) seleção dos compostos teste que conferem crescimento reduzido para a célula ou planta controle, em comparação com o crescimento da célula ou planta transgênica.

[021] Outro objeto refere-se a um método de identificação de uma sequência de nucleotídeos que codifica uma TriA mutada que é resistente ou tolerante a um herbicida, cujo método compreende: a) a geração de uma biblioteca de ácidos nucleicos codificantes de TriA mutada; b) a triagem de uma população de ácidos nucleicos codificantes da TriA mutada resultante pela expressão de cada um dos referidos ácidos nucleicos em uma célula ou planta e o tratamento da referida célula ou planta com um herbicida, c) a comparação dos níveis de tolerância ao herbicida fornecidos pela referida população de ácidos nucleicos codificantes da TriA mutada com o nível de tolerância ao herbicida fornecido por um ácido nucleico codificante da TriA controle, d) a seleção de pelo menos um ácido nucleico codificante da TriA mutada que proporciona um aumento significativo do nível de tolerância a um herbicida, em comparação com o nível de tolerância proporcionado pelo ácido nucleico que codifica uma TriA controle.

[022] Em um exemplo de realização preferido, o ácido nucleico codificante da TriA mutada selecionado na etapa d) proporciona, pelo menos, duas vezes ou mais a tolerância a um herbicida, em comparação com a tolerância proporcionada pelo ácido nucleico codificante da TriA controle.

[023] A resistência ou tolerância pode ser determinada pela geração de uma planta transgênica compreendendo uma sequência de ácido nucleico da biblioteca da etapa (a) e comparando a referida planta transgênica com uma planta controle.

[024] Outro objeto da invenção diz respeito a um ácido nucleico isolado, recombinante e/ou quimicamente sintetizado que codifica uma TriA mutada, cujo ácido nucleico compreende a sequência de SEQ ID NO: 1, ou uma variante desta, conforme definido a seguir.

[025] Um exemplo de realização preferido diz respeito a uma molécula de ácido nucleico recombinantemente produzida e/ou isolada e/ou sintética compreendendo uma molécula de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo TriA mutado selecionado a partir do grupo consistindo de: (a) uma molécula de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo TriA mutado compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 2, ou uma sequência variante, paráloga, ortóloga ou homóloga da mesma; (b) uma molécula de ácido nucleico compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 1, ou uma sequência variante, paráloga, ortóloga ou homóloga da mesma; (c) uma molécula de ácido nucleico que, como resultado da degenerescência do código genético, pode ser derivada de uma sequência polipeptídica de TriA de SEQ ID NO: 2, ou uma sequência variante, paráloga, ortóloga ou homóloga da mesma, e confere aumento da tolerância ou resistência ao herbicida, em comparação com uma célula vegetal, planta ou parte desta tipo selvagem correspondente, por exemplo, não transformada; (d) uma molécula de ácido nucleico possuindo 30% ou mais de identidade sequência, de preferência 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% ou mais de identidade sequência com a sequência da molécula de ácido nucleico de um polinucleotídeo compreendendo a molécula de ácido nucleico de SEQ ID NO: 1, ou uma sequência variante, paráloga, ortóloga ou homóloga desta, e confere tolerância ou resistência aumentada ao herbicida em comparação com uma célula vegetal, uma planta ou parte da mesma correspondente do tipo selvagem, por exemplo, não transformada; (e) uma molécula de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo TriA mutado com 30% ou mais de identidade, de preferência pelo menos 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96 %, 97%, 98%, 99%, 99,5% ou mais de identidade com a sequência de aminoácidos da sequência polipeptídica TriA de SEQ ID NO: 2; e confere tolerância ou resistência aumentada ao herbicida em comparação com uma célula vegetal, planta ou parte da mesma correspondente do tipo selvagem, por exemplo, não transformada; (f) molécula de ácido nucleico que hibridiza com uma molécula de ácido nucleico de (a), (b), (c), (d) ou (e) sob condições estringentes de hibridização e confere tolerância ou resistência aumentada ao herbicida, em comparação com uma célula vegetal, planta ou parte da planta correspondente do tipo selvagem, por exemplo, não transformada;

[026] em que a sequência de aminoácidos do polipeptídeo TriA mutado difere da sequência de aminoácidos de um polipeptídeo TriA tipo selvagem em uma ou mais posições correspondentes às seguintes posições da SEQ ID NO: 2: 70, 71, 88, 91, 92, 96, 126, 128, 155, 157, 167, 220.

[027] Outro objeto da presente invenção diz respeito a um cassete de expressão compreendendo a molécula de ácido nucleico da presente invenção e um promotor operável em células vegetais.

[028] De preferência, o promotor é um promotor específico para raiz a partir da Glycine max.

[029] Outro objeto diz respeito a um polipeptídeo TriA mutado isolado, recombinante e/ou quimicamente sintetizado, cujo polipeptídeo compreende a sequência apresentada na SEQ ID NO: 2, uma sequência variante, derivada, ortóloga, paráloga ou homóloga da mesma, conforme definido a seguir.

[030] Preferencialmente, a sequência de aminoácidos do polipeptídeo TriA mutado difere da sequência de aminoácidos de um polipeptídeo TriA tipo selvagem em uma ou mais posições correspondentes às seguintes posições da SEQ ID NO: 2: 70, 71, 88, 91, 92, 96, 126, 128, 155, 157, 167, 220.

[031] Em outros aspectos, a invenção provê uma planta ou parte de planta, compreendendo, em pelo menos algumas de suas células, um polinucleotídeo operacionalmente ligado a um promotor operável em células vegetais, cujo promotor é capaz de expressar um polipeptídeo TriA tipo selvagem ou mutado codificado pelo polinucleotídeo, em que a expressão do polipeptídeo TriA tipo selvagem ou mutado confere à planta tolerância a herbicidas, em que a planta ou parte de planta apresenta ainda uma segunda ou terceira característica de tolerância a herbicidas.

[032] Em outro exemplo de realização, a invenção diz respeito a uma célula vegetal transformada e expressando um ácido nucleico TriA tipo selvagem ou mutado de acordo com a presente invenção ou uma planta que foi mutada para se obter uma planta que expressa, de preferência superexpressa, o ácido nucleico TriA tipo selvagem ou mutado de acordo com a presente invenção, em que a expressão do referido ácido nucleico na célula vegetal resulta no aumento da resistência ou tolerância a um herbicida, em comparação com uma variedade tipo selvagem da célula vegetal.

[033] Em outro exemplo de realização, a invenção diz respeito a uma planta que compreende uma célula vegetal de acordo com a presente invenção, em que a expressão do ácido nucleico na planta resulta em um aumento da resistência da planta ao herbicida, em comparação com uma variedade da planta tipo selvagem.

[034] Preferencialmente, a expressão do ácido nucleico em plantas resulta no aumento da resistência das plantas ao herbicida, em comparação com uma variedade tipo selvagem da planta.

[035] Em outro exemplo de realização, a invenção refere-se a uma semente produzida por uma planta transgênica compreendendo uma célula vegetal da presente invenção, em que a semente é uma variedade geneticamente pura da semente para um aumento da resistência a um herbicida, em comparação com uma variedade tipo selvagem da semente.

[036] Em outro exemplo de realização, a invenção diz respeito a um método de produzir uma célula vegetal transgênica com uma resistência aumentada a um herbicida em comparação com uma variedade tipo selvagem da célula vegetal, em que o método compreende a transformação da célula vegetal com um cassete de expressão que compreende um polinucleotídeo operacionalmente ligado a um promotor operável em células vegetais, cujo promotor é capaz de expressar um polipeptídeo TriA tipo selvagem ou mutado codificado pelo polinucleotídeo.

[037] Em outro exemplo de realização, a invenção diz respeito a um método de produção de uma planta transgênica que compreende, (a) a transformação de uma célula vegetal com um cassete de expressão compreendendo o polinucleotídeo operacionalmente ligado a um promotor operável na célula vegetal, cujo promotor é capaz de expressar um polipeptídeo TriA tipo selvagem ou mutado codificado pelo polinucleotídeo, e (b) a geração de uma planta com resistência aumentada ao herbicida a partir da célula vegetal.

[038] Preferencialmente, o cassete de expressão compreende ainda uma região reguladora da iniciação da transcrição e uma região reguladora da iniciação da tradução que são funcionais na planta.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[039] Figura 1: exibe a reação química catalisada pela amidohidrolase TriA tipo selvagem e mutante.

[040] Figura 2: exibe a degradação de azina, melamina e atrazina selecionadas por TriA mutantes.

[041] Figura 3: exibe o desenvolvimento radicular de milho transformado com DSred ou uma TriA variante na ausência ou presença de 6- ciclopentil-N4-(2,3,4,5,6-pentafluorofenil)-1,3,5-triazina-2,4-diamina.

[042] Figura 4: exibe um exemplo para o desenvolvimento de plantas de soja transformadas com formas mutadas de TriA em combinação com um promotor específico da raiz e em referência ao tipo selvagem (variedade JAKE). As sementes T1 foram germinadas e tratadas em condições de pré- emergência com 6-ciclopentil-N4- (2,3,4,5,6-pentafluorofenil)-1,3,5-triazina-2,4- diamina nas taxas indicadas.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[043] Os artigos “um” e “uma” são utilizados na presente invenção para se referirem a um ou mais do que um (ou seja, pelo menos um) do objeto gramatical do artigo. Por exemplo, “um elemento” significa um ou mais elementos.

[044] Conforme utilizado no presente, a palavra “compreendendo”, ou variações como “compreende” ou “contendo”, será entendida como implicando a inclusão de um elemento declarado, inteiro ou etapa, ou grupo de elementos, inteiros ou etapas, mas não a exclusão de qualquer outro elemento, inteiro ou etapa, ou grupo de elementos, inteiros ou etapas.

[045] O termo “controle da vegetação indesejável ou de ervas daninhas” deve ser entendido como a morte das ervas daninhas e/ou o retardamento ou inibição de outro modo do crescimento normal das ervas daninhas. Ervas daninhas ou plantas daninhas, no sentido mais amplo, são entendidas como todas aquelas plantas que crescem em locais onde são indesejadas. As ervas daninhas da presente invenção incluem, por exemplo, ervas daninhas dicotiledôneas e monocotiledôneas. As ervas daninhas dicotiledôneas incluem, mas não estão limitadas às ervas daninhas do gênero: Sinapis, Lepidium, Galium, Stellaria, Matricaria, Anthemis, Galinsoga, Chenopodium, Urtica, Senecio, Amaranthus, Portulaca, Xanthium, Convolvulus, Ipomoea, Polygonum, Sesbania, Ambrosia, Cirsium, Carduus, Sonchus, Solanum, Rorippa, Rotala, Lindernia, Lamium, Veronica, Abutilon, Emex, Datura, Viola, Galeopsis, Papaver, Centaurea, Trifolium, Ranunculus, e Taraxacum. As ervas daninhas monocotiledôneas incluem, mas não estão limitadas às ervas daninhas do gênero: Echinochloa, Setaria, Panicum, Digitaria, Phleum, Poa, Festuca, Eleusine, Brachiaria, Lolium, Bromus, Avena, Cyperus, Sorghum, Agropyron, Cynodon, Monochoria, Fimbristyslis, Sagittaria, Eleocharis, Scirpus, Paspalum, Ischaemum, Sphenoclea, Dactyloctenium, Agrostis, Alopecurus, e Apera. Além disso, as ervas daninhas da presente invenção podem incluir, por exemplo, plantas de cultura que estão crescendo em uma localização indesejada. Por exemplo, uma planta de milho voluntária que está em um campo que compreende predominantemente de plantas de soja pode ser considerada uma erva daninha, se a planta de milho é indesejável no campo de plantas de soja.

[046] O termo “planta” é utilizado no seu sentido mais amplo, no que se refere ao material orgânico e destina-se a englobar organismos eucarióticos que são membros do reino Plantae, exemplos dos quais incluem, mas não se limitam às plantas vasculares, vegetais, grãos, flores, árvores, ervas, arbustos, gramíneas, trepadeiras, samambaias, musgos, fungos e algas, etc, bem como clones, deslocamentos, e partes de plantas utilizadas na propagação assexuada (por exemplo, estacas, tubulações, brotos, rizomas, caules subterrâneos, aglomerados, coroas, bulbos, cormos, tubérculos, rizomas, plantas/tecidos produzidos em cultura de tecidos, etc.). O termo “planta” abrange ainda as plantas inteiras, ancestrais e descendentes das plantas e partes de plantas, incluindo sementes, brotos, caules, folhas, raízes (incluindo tubérculos), flores, floretes, frutas, pedículos, pedúnculos, estame, anteras, estigma, estilo, ovário, pétala, sépala, carpelo, ponta da raiz, coifa, raiz fasciculada, folha fasciculada, sementes fasciculadas, grãos de pólen, microesporo, cotilédones, hipocótilo, epicótilo, xilema, floema, parênquima, endosperma, célula companheira, célula guarda, e quaisquer outros órgãos, tecidos e células vegetais conhecidos, e tecidos e órgãos, em que cada um dos acima mencionados compreendem o gene/ácido nucleico de interesse. O termo “planta” também abrange células vegetais, culturas em suspensão, o tecido do calo, embriões, regiões meristemáticas, gametófitos esporófitos, pólen e micrósporos, novamente em que cada um dos acima mencionados compreende o gene/ácido nucleico de interesse.

[047] As plantas que são particularmente úteis nos métodos da presente invenção incluem todas as plantas que pertencem à superfamília Viridiplantae, em particular as plantas monocotiledôneas e dicotiledôneas, incluindo forragem ou leguminosas forrageiras, plantas ornamentais, cultivares alimentares, árvores ou arbustos selecionados a partir da lista que compreende: Acer spp., Actinidia spp., Abelmoschus spp., Agave sisalana, Agropyron spp., Agrostis stolonifera, Allium spp., Amaranthus spp., Ammophila arenaria, Ananas comosus, Annona spp., Apium graveolens, Arachis spp, Artocarpus spp., Asparagus officinalis, Avena spp. (por exemplo, Avena sativa, Avena fatua, Avena byzantina, Avena fatua var. sativa, Avena hybrida), Averrhoa carambola, Bambusa sp., Benincasa hispida, Bertholletia excelsea, Beta vulgaris, Brassica spp. (por exemplo, Brassica napus, Brassica rapa ssp. [canola, colza, rabanete silvestre]), Cadaba farinosa, Camellia sinensis, Canna indica, Cannabis sativa, Capsicum spp., Carex elata, Carica papaya, Carissa macrocarpa, Carya spp., Carthamus tinctorius, Castanea spp., Ceiba pentandra, Cichorium endivia, Cinnamomum spp., Citrullus lanatus, Citrus spp., Cocos spp., Coffea spp., Colocasia esculenta, Cola spp., Corchorus sp., Coriandrum sativum, Corylus spp., Crataegus spp., Crocus sativus, Cucurbita spp., Cucumis spp., Cynara spp., Daucus carota, Desmodium spp., Dimocarpus longan, Dioscorea spp., Diospyros spp., Echinochloa spp., Elaeis (por exemplo, Elaeis guineensis, Elaeis oleifera), Eleusine coracana, Eragrostis tef, Erianthus sp., Eriobotrya japonica, Eucalyptus sp., Eugenia uniflora, Fagopyrum spp., Fagus spp., Festuca arundinacea, Ficus carica, Fortunella spp., Fragaria spp., Ginkgo biloba, Glycine spp. (por exemplo, Glycine max, Soja hispida ou Soja max), Gossypium hirsutum, Helianthus spp. (por exemplo, Helianthus annuus), Hemerocallis fulva, Hibiscus spp., Hordeum spp. (por exemplo, Hordeum vulgare), Ipomoea batatas, Juglans spp., Lactuca sativa, Lathyrus spp., Lens culinaris, Linum usitatissimum, Litchi chinensis, Lotus spp., Luffa acutangula, Lupinus spp., Luzula sylvatica, Lycopersicon spp. (por exemplo, Lycopersicon esculentum, Lycopersicon lycopersicum, Lycopersicon pyriforme), Macrotyloma spp., Malus spp., Malpighia emarginata, Mammea americana, Mangifera indica, Manihot spp., Manilkara zapota, Medicago sativa, Melilotus spp., Mentha spp., Miscanthus sinensis, Momordica spp., Morus nigra, Musa spp., Nicotiana spp., Olea spp., Opuntia spp., Ornithopus spp., Oryza spp. (por exemplo, Oryza sativa, Oryza latifolia), Panicum miliaceum, Panicum virgatum, Passiflora edulis, Pastinaca sativa, Pennisetum sp., Persea spp., Petroselinum crispum, Phalaris arundinacea, Phaseolus spp., Phleum pratense, Phoenix spp., Phragmites australis, Physalis spp., Pinus spp., Pistacia vera, Pisum spp., Poa spp., Populus spp., Prosopis spp., Prunus spp., Psidium spp., Punica granatum, Pyrus communis, Quercus spp., Raphanus sativus, Rheum rhabarbarum, Ribes spp., Ricinus communis, Rubus spp., Saccharum spp., Salix sp., Sambucus spp., Secale cereale, Sesamum spp., Sinapis sp., Solanum spp. (por exemplo, Solanum tuberosum, Solanum integrifolium ou Solanum lycopersicum), Sorghum bicolor, Spinacia spp., Syzygium spp., Tagetes spp., Tamarindus indica, Theobroma cacao, Trifolium spp., Tripsacum dactyloides, Triticosecale rimpaui, Triticum spp. (por exemplo, Triticum aestivum, Triticum durum, Triticum turgidum, Triticum hybernum, Triticum macha, Triticum sativum, Triticum monococcum ou Triticum vulgare), Tropaeolum minus, Tropaeolum majus, Vaccinium spp., Vicia spp., Vigna spp., Viola odorata, Vitis spp., Zea mays, Zizania palustris, Ziziphus spp., amaranto, alcachofra, aspargos, brócolis, couve de Bruxelas, repolho, canola, cenoura, couve-flor, aipo, couve, linhaça, couve crespa (kale), lentilha, colza, quiabo, cebola, batata, arroz, soja, morango, beterraba, cana-de-açúcar, girassol, tomate, abóbora (squash), chá e algas, dentre outros. De acordo com um exemplo de realização preferido da presente invenção, a planta é uma cultivar. Exemplos de cultivares incluem, entre outros, soja, girassol, canola, alfafa, colza, algodão, tomate, batata ou tabaco. Ainda preferencialmente, a planta é uma planta monocotiledônea, tal como cana de açucar. Ainda preferencialmente, a planta é um cereal, tal como arroz, milho, trigo, cevada, milho, centeio, sorgo ou aveia.

[048] De modo geral, o termo “herbicida” é utilizado na presente invenção para designar um ingrediente ativo que mata, controla ou modifica adversamente de outra forma o crescimento de plantas. A quantidade ou concentração preferida de herbicida é uma “quantidade eficaz” ou “concentração eficaz”. Por “quantidade eficaz” e “concentração eficaz” pretende-se dizer a quantidade e concentração, respectivamente, que é suficiente para matar ou inibir o crescimento de uma planta semelhante, tipo selvagem, tecido vegetal, célula vegetal ou célula hospedeira, mas que a referida quantidade ou concentração não mata ou inibe severamente o crescimento das plantas, tecidos vegetais, células vegetais, e células hospedeiras resistentes ao herbicida da presente invenção. Normalmente, a quantidade eficaz de um herbicida, é uma quantidade que é normalmente utilizada em sistemas de produção agrícola para matar as ervas daninhas de interesse. Tal quantidade é conhecida pelos técnicos hábeis no assunto. A atividade herbicida é exibida pelos herbicidas úteis para a presente invenção quando eles são aplicados diretamente sobre a planta ou local da planta em qualquer estágio de desenvolvimento, ou antes da plantação ou emergência da planta. O efeito observado depende da espécie de planta a ser controlada, do estágio de crescimento da planta, dos parâmetros de aplicação de diluição e tamanho de gota de pulverização, o tamanho de partícula de componentes sólidos, condições ambientais no momento de utilização, do composto específico utilizado, os adjuvantes e veículos específicos utilizados, tipo de solo, e similares, bem como a quantidade de produto químico aplicado. Estes e outros fatores podem ser ajustados tal como é conhecido no estado da técnica para promover a ação herbicida não seletiva ou seletiva. Em geral, os tratamentos herbicidas podem ser aplicados em modo PPI (Pre Plant Incorporated), PPSA (Post plant surface applied), pré- ou pós-emergência. O tratamento pós-emergência geralmente ocorre com uma vegetação indesejável relativamente imatura para atingir o controle máximo das ervas daninhas.

[049] Com o termo planta “tolerante ao herbicida” ou “resistente ao herbicida”, pretende-se dizer que uma planta é tolerante ou resistente a pelo menos um herbicida em níveis que normalmente matam ou inibem o crescimento de uma planta normal ou tipo selvagem. Os níveis de herbicida que normalmente inibiriam o crescimento de uma planta não tolerante são conhecidos e facilmente determinados pelos profissionais peritos na técnica. Os exemplos incluem as quantidades recomendadas pelos fabricantes para a aplicação. A taxa máxima é um exemplo de uma quantidade de herbicida que normalmente inibiria o crescimento de uma planta não tolerante. Para a presente invenção, os termos “tolerante a herbicidas” e “resistente a herbicidas” são utilizados de maneira indiferente e pretendem ter um significado e alcance equivalentes. Do mesmo modo. os termos “tolerância ao herbicida” e “resistência ao herbicida” são utilizados de maneira indiferente e pretendem ter um significado e alcance equivalentes. Do mesmo modo. os termos “tolerante” e “resistente” são utilizados de maneira indiferente e pretendem ter um significado e alcance equivalentes. Tal como utilizado na presente invenção, com relação a uma composição herbicida útil em diversos exemplos de realização do presente documento, termos como herbicidas, e termos similares, referem-se aos ingredientes herbicidas ativos agronomicamente aceitáveis (AI) reconhecidos no estado da técnica. Da mesma forma, termos como fungicida, nematicida, inseticida, e similares, referem-se a outros ingredientes ativos agronomicamente aceitáveis reconhecidos no estado da técnica.

[050] Quando utilizado em referência a uma enzima mutante específica, ou polipeptídeo, termos como tolerante a herbicidas e tolerância ao herbicida referem-se a capacidade de tais enzimas ou polipeptídeo em desempenhar a sua atividade fisiológica, na presença de uma quantidade de um herbicida A.I. que normalmente inativa ou inibe a atividade da versão tipo selvagem (não mutante) da referida enzima ou polipeptídeo. Por outro lado, quando usado especificamente em relação a uma enzima TriA, ele se refere especificamente à capacidade de metabolizar e, desse modo, inativar os herbicidas que inibem a biossíntese de celulose, os denominados inibidores da biossíntese de celulose (CBI). Por “proteína TriA tipo selvagem ou mutada tolerante a herbicida” ou “proteína TriA tipo selvagem ou mutada resistente a herbicida”, pretende-se dizer que tal proteína TriA exibe a atividade metabolizante maior, em relação à atividade metabolizante de uma proteína TriA tipo selvagem, quando na presença de pelo menos um herbicida que é conhecido por interferir com a biossíntese de celulose ou em uma concentração ou nível do herbicida que é conhecido por inibir a atividade de biossíntese de celulose. Além disso, a atividade TriA de tal proteína TriA tipo selvagem ou mutada resistente ao herbicida ou tolerante ao herbicida pode ser referida na presente invenção como atividade TriA “herbicida-resistente” ou “herbicida- tolerante”.

[051] Conforme utilizado na presente invenção, o termo “recombinante”, quando se refere ao ácido nucleico ou polipeptídeo, indica que este material foi alterado como resultado da aplicação em humanos de uma técnica recombinante, tal como, restrição e ligação de polinucleotídeo, sobreposição-extensão de polinucleotídeo, ou inserção ou transformação genômica. Um quadro de leitura aberto da sequência gênica é recombinante se a sequência de nucleotídeos foi removida a partir de seu texto natural e clonada em qualquer tipo de vetor de ácido nucleico artificial. O termo recombinante também pode referir-se a um organismo com um material recombinante, por exemplo, uma planta que compreende um ácido nucleico recombinante pode ser considerada uma planta recombinante.

[052] O termo “planta transgênica” refere-se a uma planta que compreende um polinucleotídeo heterólogo. Preferencialmente, o polinucleotídeo heterólogo é integrado de maneira estável no genoma, de modo que o polinucleotídeo é transmitido para as gerações sucessivas. O polinucleotídeo heterólogo pode estar integrado apenas no genoma ou como parte de um cassete de expressão recombinante. “Transgênico” é usado na presente invenção para se referir a qualquer célula, linhagem celular, calo, tecido, planta ou parte de planta, o genótipo que foi alterado pela presença de ácido nucleico heterólogo incluindo as células ou organismos transgênicos inicialmente alterados, bem como aqueles criados pela troca de material genético ou propagação assexuada a partir das células ou organismos transgênicos iniciais. Em alguns exemplos de realização, um organismo “recombinante” é um organismo “transgênico”. O termo “transgênico”, da forma com é utilizado na presente invenção, não pretende abranger alterações do genoma (cromossômicas ou extracromossômicas) por métodos convencionais de melhoramento genético de vegetais (por exemplo, por cruzamento) ou por eventos de ocorrência natural, tais como autofertilização, fertilização cruzada aleatória, infecção viral não recombinante, transformação por bactéria não recombinante, transposição não recombinante ou mutação espontânea.

[053] Conforme utilizado no presente, “mutagenizada” diz respeito a um organismo ou DNA do mesmo possuindo alteração(ões) na sequência biomolecular de seu material genético nativo, em comparação com a sequência do material genético de um organismo ou DNA correspondente do tipo selvagem, em que a(s) alteração(ões) no material genético foi(foram) induzida(s) e/ou selecionada(s) por ação humana. Exemplos de ação humana que podem ser usados para produzir um organismo mutagenizado ou DNA incluem, mas não estão limitados a, tratamento com um mutagênico químico, como EMS e a subsequente seleção com herbicida(s); ou tratamento de células vegetais com raios-x e subsequente seleção com herbicida(s). Qualquer método conhecido no estado da técnica pode ser utilizado para induzir mutações. Os métodos para a indução de mutações podem induzir as mutações em posições aleatórias no material genético ou podem induzir as mutações em locais específicos do material genético (ou seja, as técnicas de mutagênese podem ser direcionadas), tal como pelo uso da técnica genoplasty.

[054] Conforme utilizado na presente invenção, um “organismo geneticamente modificado” (OGM) é um organismo cujas características genéticas contêm alterações que foram produzidas pelo esforço humano causando a transfecção que resulta na transformação de um organismo alvo com o material genético a partir de outro organismo ou organismo “fonte”, ou com material genético sintético ou nativo modificado, ou um organismo que é um descendente deste organismo modificado que retém o material genético inserido. O organismo fonte pode ser de um tipo diferente de organismo (por exemplo, uma planta OGM pode conter material genético bacteriano) ou do mesmo tipo de organismo (por exemplo, uma planta OGM pode conter material genético de outra planta). Conforme utilizado na presente invenção no que diz respeito às plantas e outros organismos, “recombinante”, “transgênico”, e “OGM” são considerados sinônimos e indicam a presença de material genético de uma fonte diferente; em contraste, o termo “mutagenizada” é utilizado para se referir a uma planta ou outro organismo, ou o DNA dos mesmos, em que nenhum tipo de material transgênico está presente, mas cujo material genético nativo tornou- se mutado de modo a ser diferente de um organismo ou DNA correspondente tipo selvagem.

[055] Tal como utilizado na presente invenção, “tipo selvagem” ou “planta correspondente tipo selvagem” significa a forma típica de um organismo ou de seu material genético, como normalmente ocorre, sendo distinto, por exemplo, das formas mutagenizadas e/ou recombinantes. Da mesma forma, “célula controle” ou “planta, tecido vegetal, célula vegetal ou célula hospedeira, similar tipo selvagem” designa uma planta, tecido vegetal, célula vegetal ou célula hospedeira, respectivamente, que não tem as características de resistência ao herbicida e/ou polinucleotídeos específicos da invenção que estão aqui descritos. A utilização da expressão “tipo selvagem”, portanto, não pretende implicar que uma planta, tecido vegetal, célula vegetal, ou outra célula hospedeira não possui DNA recombinante no seu genoma, e/ou não possui características de resistência a herbicidas que são diferentes daquelas divulgadas na presente invenção.

[056] Conforme utilizado na presente invenção, “descendente” refere-se a qualquer geração de planta. Em alguns exemplos de realização, um descendente é a primeira, segunda, terceira, quarta, quinta, sexta, sétima, oitava, nona, ou décima geração de planta.

[057] Conforme utilizado na presente invenção, “progênie” refere- se a uma primeira geração de planta.

[058] O termo “semente” compreende sementes de todos os tipos, como, por exemplo, sementes verdadeiras, cariopses, aquênios, frutas,tubérculos, mudas e formas similares. No contexto da espécie Brassica e Sinapis, “semente” refere-se a(s) semente(s) verdadeira(s), a menos que especificado de outra forma. Por exemplo, a semente pode ser sementes de plantas transgênicas ou plantas obtidas por métodos tradicionais de reprodução. Exemplos de métodos de melhoramento tradicionais podem incluir cruzamentos, autopolinização, retrocruzamento, resgate de embriões, intra e exocruzamento, endogamia, seleção, propagação vegetativa, e outras técnicas tradicionais conhecidas no estado da técnica.

[059] Embora exemplificado com referência a certas plantas ou variedades de plantas e seus híbridos, em diversos exemplos de realização, os métodos descritos presentemente utilizando herbicidas podem ser utilizados com uma variedade de plantas de valor comercial. As linhagens de plantas tolerantes a herbicidas descritos como úteis na presente invenção podem ser empregadas em métodos de controle de ervas daninhas, seja de maneira direta ou indireta, ou seja, como culturas para tratamento com herbicida ou linhagens doadoras da característica de tolerância a herbicidas para desenvolvimento, para produzir outras variedades e/ou híbridos contendo tais traço ou características. Todas essas variedades ou híbridas resultantes, contendo a característica ancestral de tolerância a herbicidas podem ser referidas na presente divulgação como descendência ou descendentes da linhagem tolerante a herbicidas. Tais plantas resultantes podem ser referidas por reter “a(s) característica(s) de tolerância ao herbicida” da planta ancestral, ou seja, o que significa que elas possuem e expressam os componentes genéticos moleculares ancestrais responsáveis por tais características.

[060] Em um aspecto, a presente invenção provê uma planta ou parte de planta que compreende um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo TriA tipo selvagem ou mutado, e a expressão do referido polinucleotídeo confere à planta ou parte da planta tolerância a herbicidas.

[061] Em um exemplo de realização preferido, a planta foi previamente produzida por um processo que compreende a preparação de uma planta de forma recombinante pela introdução e superexpressão de um transgene TriA tipo selvagem ou mutado de acordo com a presente invenção e conforme descrito a seguir em maiores detalhes.

[062] Em outro exemplo de realização, o polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo TriA tipo selvagem ou mutado compreende a sequência de ácido nucleico apresentada na SEQ ID NO: 1, ou uma forma variante ou derivada da mesma.

[063] Em outros exemplos de realização, o polipeptídeo TriA tipo selvagem ou mutado de acordo com a presente invenção é uma variante funcional que possui, ao longo do comprimento total da forma variante, pelo menos cerca de 80%, ilustrativamente, pelo menos cerca de 80%, 90%, 95%, 98%, 99% ou mais de identidade de sequência de aminoácidos com a SEQ ID NO: 2.

[064] Em outro exemplo de realização, o polipeptídeo TriA tipo selvagem ou mutado para uso de acordo com a presente invenção é um fragmento funcional de um polipeptídeo possuindo a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 2.

[065] É reconhecido que as moléculas polinucleotídicas de TriA e os polipeptídeos TriA da invenção abrangem moléculas polinucleotídicas e polipeptídeos que compreendem uma sequência de nucleotídeos ou aminoácidos que é suficientemente idêntica à sequência nucleotídica apresentada nas SEQ ID NOs: 1 ou ao conjunto de sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 2. O termo “suficientemente idêntica” é utilizado na presente invenção para se referir a uma primeira sequência de aminoácidos ou nucleotídeos que contém um número suficiente ou mínimo de resíduos de aminoácidos ou nucleotídeos idênticos ou equivalentes (por exemplo, com uma cadeia lateral semelhante) a uma segunda sequência de aminoácidos ou nucleotídeos, de tal modo que a primeira e segunda sequência de aminoácidos ou nucleotídeos têm um domínio estrutural comum e/ou atividade funcional comum.

[066] De modo geral. “identidade de sequência” refere-se à extensão em que duas sequências de aminoácidos ou DNA otimamente alinhadas são invariantes ao longo de uma janela de alinhamento de componentes, por exemplo, nucleotídeos ou aminoácidos. Uma “fração de identidade” para segmentos alinhados de uma sequência teste e uma sequência de referência é o número de componentes idênticos que são partilhados pelas duas sequências alinhadas, dividido pelo número total de componentes no segmento da sequência de referência, ou seja, toda a sequência de referência ou uma parte menor definida da sequência de referência. “Porcentagem de identidade” é a fração de identidade vezes 100. O alinhamento ótimo de sequências para alinhar uma janela de comparação é bem conhecido pelos técnicos hábeis no assunto e pode ser realizada por ferramentas, tais como o algoritmo de homologia local de Smith e Waterman, o algoritmo de alinhamento de homologia de Needleman e Wunsch, o método de busca de similaridade de Pearson e Lipman, e preferencialmente por implementações informatizadas destes algoritmos, tais como GAP, BESTFIT, FASTA, e TFASTA disponível como parte do GCG. Wisconsin Package. (Accelrys Inc. Burlington, Mass.).

POLINUCLEOTÍDEOS E OLIGONUCLEOTÍDEOS

[067] Por “um polinucleotídeo isolado”, incluindo DNA, RNA, ou uma combinação destes, de cadeia simples ou dupla, na orientação sense ou antisense, ou em uma combinação de ambas as orientações, dsRNA ou outra forma similar, entende-se um polinucleotídeo que é pelo menos parcialmente separado a partir das sequências polinucleotídicas com as quais está associado ou ligado no seu estado nativo. Preferencialmente, o polinucleotídeo isolado é pelo menos 60% livre, de um modo preferido, pelo menos 75% livre, e mais preferencialmente, pelo menos 90% livre de outros componentes com os quais ele está naturalmente associado. Assim como o profissional hábil na técnica está ciente, um polinucleotídeo isolado pode ser um polinucleotídeo exógeno presente, por exemplo, em um organismo transgênico que não compreende naturalmente tal polinucleotídeo. Além disso, os termos “polinucleotídeo(s)”, “sequência(s) de ácidos nucleicos”, “sequência(s) de nucleotídeos”, “ácido(s) nucleico(s)”, “molécula(s) de ácido(s) nucleico(s)” são utilizados de maneira alternada e referem-se a nucleotídeos, quer seja ribonucleotídeos ou desoxirribonucleotídeos ou uma combinação de ambos, em uma forma polimérica não ramificada de qualquer comprimento.

[068] O termo “ácido nucleico TriA mutado” refere-se a um ácido nucleico TriA possuindo uma sequência que está mutada a partir de um ácido nucleico TriA tipo selvagem e que confere tolerância aumentada a um herbicida em uma planta na qual ele é expresso. Além disso, o termo “melamina desaminase mutada (TriA mutada)” refere-se à substituição de um aminoácido da sequência primária tipo selvagem de SEQ ID NO: 2, ou uma sequência variante, derivada, homóloga, ortóloga ou paráloga por outro aminoácido. A expressão “aminoácido mutado” será usado a seguir para designar o aminoácido que é substituído por outro aminoácido, designando, assim, o local da mutação na sequência primária da proteína.

[069] Em um exemplo de realização preferido, a sequência de nucleotídeos TriA codificante de uma TriA mutada compreende a sequência de SEQ ID NO: 1, ou uma variante ou derivada da mesma.

[070] Além disso, o especialista na técnica compreenderá que as sequências de nucleotídeos TriA abrangem sequências homólogas, parálogas e ortólogas de SEQ ID NO: 1, tal como definido a seguir.

[071] O termo “variante” com relação a uma sequência (por exemplo, uma sequência de ácido nucleico ou de polipeptídeos, como - por exemplo - uma sequência de nucleotídeos que regula a transcrição da invenção) é usado para se referir a sequências substancialmente similares. Para sequências de nucleotídeos que compreendem um quadro de leitura aberto, variantes incluem aquelas sequências que, por causa da degeneração do código genético, codificam sequências de aminoácidos idênticas às da proteína nativa. As variantes alélicas de ocorrência natural tal como estas podem ser identificadas com o uso de técnicas bem conhecidas da biologia molecular, como, por exemplo, a reação em cadeia da polimerase (PCR) e técnicas de hibridização. As sequências de nucleotídeos variantes incluem também as sequências de nucleotídeos derivadas sinteticamente, tal como aquelas geradas, por exemplo, usando a mutagênese sítio-dirigida, e de quadros de leitura abertos que codificam a proteína nativa compreendendo a SEQ ID NO: 2, bem como aquelas que codificam um polipeptídeo possuindo substituições de aminoácidos em relação à proteína nativa, por exemplo, a TriA mutada de acordo com a presente invenção. Geralmente, as sequências de nucleotídeos variantes da invenção terão pelo menos 30, 40, 50, 60 a 70%, por exemplo,preferencialmente 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, até 79%, geralmente pelo menos 80%, por exemplo, 81% - 84%, pelo menos 85%, por exemplo, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, a 98% e 99% de “identidade na sequência” de nucleotídeos com a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 1. A % de identidade de um polinucleotídeo é determinada pela análise de GAP (Needleman e Wunsch, 1970) (programa GCG) com uma penalidade pela criação de lacunas (gap) = 5, e uma penalidade pela extensão de lacuna (gap extension penalty) = 0,3. A menos que indicado de outra forma, a sequência de pesquisa é de pelo menos 45 nucleotídeos de comprimento, e a análise GAP alinha duas sequências através de uma região de pelo menos 45 nucleotídeos. Preferencialmente, a sequência de pesquisa é de pelo menos 150 nucleotídeos de comprimento, e a análise GAP alinha duas sequências através de uma região de pelo menos 150 nucleotídeos. Mais preferencialmente, a sequência de pesquisa é de pelo menos 300 nucleotídeos de comprimento, e a análise GAP alinha duas sequências através de uma região de pelo menos 300 nucleotídeos. Ainda mais preferencialmente, a análise GAP alinha duas sequências ao longo de todos os seus comprimentos.

POLIPEPTÍDEOS

[072] O termo “polipeptídeo substancialmente purificado” ou polipeptídeo “purificado” significa que o polipeptídeo foi separado a partir de um ou mais elementos dentre lipídeos, ácidos nucleicos, polipeptídeos, ou outras moléculas de outros contaminantes com os quais ele geralmente está associado em seu estado nativo. É preferido que o polipeptídeo substancialmente purificado seja pelo menos 60% livre, de um modo preferido pelo menos 75% livre, e mais preferencialmente pelo menos 90% livre de outros componentes com os quais ele está naturalmente associado. Assim como o profissional hábil na técnica reconhecerá, o polipeptídeo purificado pode ser um polipeptídeo produzido de forma recombinante. Os termos “polipeptídeo” e “proteína” são geralmente utilizados de forma intercambiável e referem-se a uma única cadeia de polipeptídeos, que pode ou não ser modificada pela adição de grupos não aminoácido. Deve ser compreendido que tais cadeias polipeptídicas podem se associar com outros polipeptídeos ou proteínas ou outras moléculas, tais como cofatores. Os termos “proteínas” e “polipeptídeos”, conforme utilizado na presente invenção, também inclui variantes, mutantes, modificações, análogo e/ou derivados dos polipeptídeos da invenção conforme descrito na presente divulgação.

[073] A % de identidade de um polipeptídeo é determinada pela análise de GAP (Needleman e Wunsch, 1970) (programa GCG) com uma penalidade pela criação de lacunas (gap) = 5, e uma penalidade pela extensão de lacuna (gap extension penalty) = 0,3. A sequência de pesquisa (query) é de pelo menos 25 aminoácidos de comprimento, e a análise GAP alinha duas sequências através de uma região de pelo menos 25 aminoácidos. De modo mais preferido, a sequência de pesquisa é de pelo menos 50 aminoácidos de comprimento, e a análise GAP alinha duas sequências através de uma região de pelo menos 50 aminoácidos. De modo mais preferido, a sequência de pesquisa é de pelo menos 100 aminoácidos de comprimento, e a análise GAP alinha duas sequências através de uma região de pelo menos 100 aminoácidos. De modo ainda mais preferido, a sequência de pesquisa é de pelo menos 250 aminoácidos de comprimento, e a análise GAP alinha duas sequências através de uma região de pelo menos 250 aminoácidos. Ainda mais preferencialmente, a análise GAP alinha duas sequências ao longo de todos os seus comprimentos.

[074] Com relação a um polipeptídeo definido, deve ser observado que a % de identidade apresentando valores mais elevados do que os fornecidos acima irá abranger exemplos de realização preferidos. Assim, quando aplicável, à luz das percentagens mínimas de identidade, é preferido que o polipeptídeo TriA da invenção compreenda uma sequência de aminoácidos que seja pelo menos 40%, mais preferivelmente pelo menos 45%, mais preferivelmente pelo menos 50%, mais preferivelmente pelo menos 55%, mais preferivelmente pelo menos 60%, mais preferivelmente pelo menos 65%, mais preferivelmente pelo menos 70%, mais preferivelmente pelo menos 75%, mais preferivelmente pelo menos 80%, mais preferivelmente pelo menos 85%, mais preferivelmente pelo menos 90%, mais preferivelmente pelo menos 91%, mais preferivelmente pelo menos 92%, mais preferivelmente pelo menos 93%, mais preferivelmente pelo menos 94%, mais preferivelmente pelo menos 95%, mais preferivelmente pelo menos 96%, mais preferivelmente pelo menos 97%, mais preferivelmente pelo menos 98%, mais preferivelmente pelo menos 99%, mais preferivelmente pelo menos 99,1%, mais preferivelmente pelo menos 99,2%, mais preferivelmente pelo menos 99,3%, mais preferivelmente pelo menos 99,4%, mais preferivelmente pelo menos 99,5%, mais preferivelmente pelo menos 99,6%, mais preferivelmente pelo menos 99,7%, mais preferivelmente pelo menos 99,8%, e ainda mais preferivelmente pelo menos 99,9% idêntica à SEQ ID NO: 2.

[075] Por polipeptídeo “variante” pretende-se dizer um polipeptídeo derivado da proteína de SEQ ID NO: 2 pela deleção (denominado truncamento) ou adição de um ou mais aminoácidos na extremidade N-terminal e/ou C-terminal da proteína nativa; deleção ou adição de um ou mais aminoácidos em um ou mais locais na proteína natural; ou substituição de um ou mais aminoácidos em um ou mais locais na proteína nativa. Tais variantes podem resultar, por exemplo, do polimorfismo genético ou da manipulação humana. Os métodos para tais manipulações são bem conhecidos no estado da técnica.

[076] Formas “derivadas” de uma proteína abrangem peptídeos, oligopeptídeos, polipeptídeos, proteínas e enzimas que têm substituições, deleções e/ou inserções de aminoácidos em relação à proteína não modificada em questão, e que possui atividade biológica e funcional semelhante à da proteína não modificada a partir do qual eles são derivados. Assim, as variantes e fragmentos funcionais dos polipeptídeos TriA, e moléculas de ácido nucleico que os codificam, estão também dentro do escopo da presente invenção, e a menos que especificamente descrito de outro modo, independentemente da origem do referido polipeptídeo e independentemente do fato ocorrerem naturalmente. Diversos ensaios para a funcionalidade de um polipeptídeo TriA podem ser empregados. Por exemplo, uma variante funcional ou fragmento do polipeptídeo TriA pode ser testado para determinar a sua capacidade de conferir detoxificação de herbicidas. A título de ilustração, a detoxificação de herbicidas pode ser definida como uma taxa catalítica suficiente para proporcionar um aumento determinável na tolerância a herbicidas em uma planta ou parte da planta que compreende um polinucleotídeo recombinante que codifica a forma variante, ou fragmento do polipeptídeo TriA, em que a planta ou parte da planta expressa a variante ou fragmento em até cerca de 0,5%, de forma ilustrativa, cerca de 0,05 a cerca de 0,5%, cerca de 0,1 a cerca de 0,4% e cerca de 0,2 a cerca de 0,3%, do total de proteína celular em relação a uma planta controle tratada de forma semelhante, mas que não expressa a forma variante ou o fragmento.

[077] Em um exemplo de realização preferido, o polipeptídeo TriA tipo selvagem ou mutado é uma forma variante ou fragmento funcional de melanina desaminase possuindo a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 2, em que a variante ou fragmento funcional tem pelo menos cerca de 80% de identidade de sequência de aminoácidos com a SEQ ID NO: 2.

[078] Em outros exemplos de realização, a variante funcional ou fragmento tem ainda uma taxa de detoxificação de herbicidas suficiente para proporcionar um aumento determinável na tolerância a herbicidas em uma planta ou parte da planta que compreende um polinucleotídeo recombinante que codifica a forma variante ou fragmento, em que a planta ou parte da planta expressa a forma variante ou fragmento em até cerca de 0,5% das proteínas celulares totais em uma planta controle tratada de forma semelhante que não expressa a forma variante ou o fragmento.

[079] “Homólogos” de uma proteína abrangem peptídeos, oligopeptídeos, polipeptídeos, proteínas e enzimas que têm substituições, deleções e/ou inserções de aminoácidos em relação à proteína não modificada em questão, e que possui atividade biológica e funcional semelhante à da proteína não modificada a partir do qual eles são derivados.

[080] Além disso, um técnico hábil na arte reconhecerá que as alterações podem ser introduzidas por mutação nas sequências nucleotídicas da invenção conduzindo assim a alterações na sequência de aminoácidos das proteínas codificadas sem alterar a atividade biológica das proteínas. Assim, por exemplo, uma molécula polinucleotídica isolada que codifica um polipeptídeo TriA mutado possuindo uma sequência de aminoácidos que difere da SEQ ID NO: 2 pode ser criada pela introdução de uma ou mais substituições, adições ou deleções de nucleotídeos na sequência de nucleotídeos correspondente, de tal modo que uma ou mais substituições, adições ou deleções de aminoácidos são introduzidas na proteína codificada. Podem ser introduzidas mutações por meio de técnicas-padrão conhecidas no estado da técnica, tal como a mutagênese sítio-dirigida e mutagênese mediada por PCR. Tais sequências de nucleotídeos variantes são também abrangidas pela presente invenção. Por exemplo, as substituições de aminoácidos conservadoras podem ser feitas em um ou mais resíduos de aminoácidos previstos de preferência não essenciais. Um resíduo de aminoácido “não essencial” é um resíduo que pode ser alterado a partir da sequência tipo selvagem de uma proteína sem alterar a atividade biológica, enquanto que um resíduo de aminoácido “essencial” é necessário para a atividade biológica.

[081] Uma deleção refere-se à remoção de um ou mais aminoácidos a partir de uma proteína.

[082] Uma inserção refere-se à introdução de um ou mais resíduos de aminoácidos em um local predeterminado de uma proteína. As inserções podem compreender fusões N-terminal e/ou C-terminal, bem como as inserções intra-sequências de um ou vários aminoácidos. Geralmente, as inserções dentro da sequência de aminoácidos serão menores do que as fusões N- ou C- terminais, na ordem de cerca de 1 a 10 resíduos. Exemplos de proteínas ou peptídeos de fusão N- ou C-terminal incluem o domínio de ligação ou o domínio de ativação de um ativador transcricional, como utilizado em sistemas híbridos de duas leveduras, proteínas de revestimento do fago, (histidina)-6-tag, glutationa S-transferase-tag, proteína A, proteína de ligação à maltose, diidrofolato-redutase, epítopo Tag^100, epítopo c-myc, epítopo-FLAG®, lacZ, CMP (calmodulina peptídeo de ligação), epítopo HA, epítopo da proteína C e epítopo VSV.

[083] Uma substituição refere-se à substituição de aminoácidos da proteína por outros aminoácidos que possuem propriedades semelhantes (tais como hidrofobicidade semelhante, hidrofilicidade semelhante, antigenicidade semelhante, ou com propensão para formar ou quebrar estruturas α- helicoidais ou estruturas em folhas-β). As substituições de aminoácidos são tipicamente de resíduos isolados, mas podem ser agrupadas dependendo das restrições funcionais colocadas sobre o polipeptídeo e podem variar de 1 a 10 aminoácidos; as inserções normalmente são de cerca de 1 a 10 resíduos de aminoácidos. Uma “substituição conservadoras de aminoácidos” é aquele em que o resíduo de aminoácido é substituído por um resíduo de aminoácido possuindo uma cadeia lateral semelhante. As famílias de resíduos de aminoácidos possuindo cadeias laterais semelhantes foram definidas no estado da técnica. Estas famílias incluem aminoácidos com cadeias laterais básicas (por exemplo, lisina, arginina, histidina), cadeias laterais ácidas (por exemplo, ácido aspártico, ácido glutâmico) e cadeias laterais polares não carregadas (por exemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína, triptofano), cadeias laterais apolares (por exemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina), cadeias laterais beta-ramificadas (por exemplo, treonina, valina, isoleucina), e as cadeias laterais aromáticas (por exemplo, tirosina, fenilalanina, triptofano, histidina). Estas substituições não seriam feitas para resíduos de aminoácidos conservados, ou para resíduos de aminoácidos que residem dentro de um motivo conservado. As tabelas de substituições conservadoras são bem conhecidas no estado da técnica (vide, por exemplo, Creighton (1984) Proteins. W.H. Freeman & Company (Eds)).

[084] As substituições, deleções e/ou inserções de aminoácidos podem facilmente ser feitas utilizando técnicas de síntese de peptídeos bem conhecidas no estado da técnica, tais como a síntese peptídica em fase sólida e similares, ou por manipulação de DNA recombinante. Os métodos para a manipulação de sequências de DNA para produzir a substituição, inserção ou deleção variantes de uma proteína são bem conhecidos no estado da técnica. Por exemplo, as técnicas para produzir mutações de substituição em locais predeterminados no DNA são bem conhecidas pelos técnicos hábeis no assunto e incluem a mutagênese M13, mutagênese in vitro T7-Gen (USB, Cleveland, OH), mutagênese sítio-dirigida QuickChange (Stratagene, San Diego , CA), mutagênese sítio-dirigida mediada por PCR ou outros protocolos de mutagênese sítio-dirigida.

[085] “Derivados” incluem adicionalmente os peptídeos, oligopeptídeos e polipeptídeos que podem compreender, quando comparados com a sequência de aminoácidos da proteína na forma que ocorrem naturalmente, tal como a proteína de interesse, as substituições de aminoácidos por resíduos de aminoácidos que não ocorrem naturalmente, ou adições de resíduos de aminoácidos que não ocorrem naturalmente. “Derivados” de uma proteína incluem também os peptídeos, oligopeptídeos e polipeptídeos que compreendem resíduos de aminoácidos naturalmente alterados (glicosilados, acilados, prenilados, fosforilados, miristoilados, sulfatados, e etc) ou resíduos de aminoácidos não naturais em comparação com a sequência de aminoácidos de um polipeptídeo na sua forma natural. Um derivado pode também compreender um ou mais substituintes não aminoácidos ou adições em relação à sequência de aminoácidos a partir da qual é derivada, por exemplo, uma molécula repórter ou outro ligante, ligado covalentemente ou não covalentemente à sequência de aminoácidos, tais como uma molécula repórter que está ligada para facilitar a sua detecção e resíduos de aminoácidos de ocorrência não natural em relação à sequência de aminoácidos de uma proteína de ocorrência natural. Além disso, “derivados” também incluem fusões de ocorrência natural da proteína com peptídeos de marcação, tais como FLAG, His6 ou tioredoxina (para uma revisão de peptídeos de marcação, vide Terpe, Appl. Microbiol. Biotechnol. 60, 523-533, 2003).

[086] “Ortólogos” e “parálogos” abrangem conceitos evolucionistas usados para descrever as relações ancestrais de genes. Parálogos são genes dentro da mesma espécie que foram originados por meio da duplicação de um gene ancestral; ortólogos são genes a partir de organismos distintos que foram originados por meio da especiação, e também são derivados a partir de um gene ancestral comum.

[087] As formas variantes, ortólogas e parálogas, da SEQ ID NO: 2 abrangidas pela presente invenção são mostradas, mas não se limitam aos polipeptídeos compreendendo as SEQ ID NOs: 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 ou 31.

[088] É bem conhecido no estado da técnica que parálogos e ortólogos podem partilhar domínios distintos que abrigam resíduos de aminoácidos adequados em determinados locais, tais como bolsas de ligação para substratos específicos ou motivos de ligação para a interação com outras proteínas.

[089] O termo “domínio” refere-se a um conjunto de aminoácidos conservados em posições específicas ao longo de um alinhamento de sequência de proteínas evolutivamente relacionadas. Enquanto aminoácidos em outras posições podem variar entre homólogos, os aminoácidos que são altamente conservados em posições específicas indicam aminoácidos que provavelmente são essenciais para estrutura, estabilidade ou função de uma proteína. Identificado pelo seu elevado grau de conservação em sequências alinhadas de uma família de proteínas homólogas, eles podem ser usados como identificadores para determinar se qualquer polipeptídeo em questão pertence a uma família de polipeptídeo anteriormente identificada.

[090] Os termos “motivo” ou “sequência de consenso” referem-se a uma pequena região conservada na sequência de proteínas evolutivamente relacionadas. Os motivos são frequentemente partes de domínios altamente conservados, mas pode também incluir apenas uma parte do domínio, ou pode estar localizado fora do domínio conservado (se todos os aminoácidos do motivo estão fora de um domínio definido).

[091] Existem bases de dados especializadas para a identificação de domínios, por exemplo, SMART (Schultz et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 5857-5864; Letunic et al. (2002) Nucleic Acids Res 30, 242-244), InterPro (Mulder et al., (2003) Nucl. Acids. Res. 31, 315-318), Prosite (Bucher e Bairoch (1994), A generalized profile syntax for biomolecular sequences motifs and its function in automatic sequence interpretation. (Em) ISMB-94; Proceedings 2nd International Conference on Intelligent Systems for Molecular Biology. Altman R., Brutlag D., Karp P., Lathrop R., Searls D., Eds., págs 53-61, AAAI Press, Menlo Park; Hulo et al., Nucl. Acids. Res. 32:D134-D137, (2004)), ou Pfam (Bateman et al., Nucleic Acids Research 30(1): 276-280 (2002)) Um conjunto de ferramentas para análise de sequências de proteína in silico está disponível no servidor de proteômica ExPASy (Instituto Suíço de Bioinformática (Gasteiger et al, ExPASy: the proteomics server for in-depth protein knowledge and analysis, Nucleic Acids Res. 31:3784-3788(2003)). Os domínios ou motivos também podem ser identificados utilizando técnicas de rotina, tal como por alinhamento de sequências.

[092] Os métodos para o alinhamento de sequências para comparação são bem conhecidos no estado da técnica, tais métodos incluem GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA e TFASTA. GAP utiliza o algoritmo de Needleman e Wunsch ((1970) J Mol Biol 48: 443-453) para encontrar o alinhamento global (isto é, que abrange as sequências completas) de duas sequências, que maximiza o número de correspondências e minimiza o número de lacunas (gaps). O algoritmo BLAST (Altschul et al. (1990) J Mol Biol 215: 40310) calcula a percentagem de identidade de sequência e executa uma análise estatística da similaridade entre as duas sequências. O programa de computador para a realização da análise BLAST está disponível ao público através do Centro Nacional de Informações sobre Biotecnologia (National Centre for Biotechnology Information - NCBI). Homólogos podem ser facilmente identificados utilizando, por exemplo, o algoritmo de alinhamento de múltiplas sequências ClustalW (versão 1,83), com os parâmetros de alinhamento em pares padrão, e um método de pontuação em percentagem (veja a Figura 1). As porcentagens globais de similaridade e identidade também podem ser determinadas utilizando um dos métodos disponíveis no pacote de software MatGAT (Campanella et al., BMC Bioinformatics. 2003 10 de julho; 4: 29. MatGAT: um aplicativo que gera matrizes de similaridade/identidade usando sequências de proteínas ou DNA). Uma edição manual em menor escala pode ser realizada para otimizar o alinhamento entre motivos conservados, tal como seria evidente para um técnico do assunto. Além disso, em vez de usar as sequências de comprimento total para a identificação de homólogos, domínios específicos também podem ser utilizados. Os valores de identidade de sequência podem ser determinados ao longo de toda a sequência de ácidos nucleicos ou aminoácidos ou ao longo de domínios selecionados ou motivo(s) conservado(s), utilizando os programas mencionados acima utilizando os parâmetros pré-definidos. Para alinhamentos locais, o algoritmo de Smith-Waterman é particularmente útil (Smith TF., Waterman M.S. (1981) J. Mol. Biol. Biol 147 (1); 195-7).

[093] As proteínas da invenção podem ser alteradas de várias maneiras incluindo substituições, deleções, truncamentos e inserções de aminoácidos. Os métodos para tais manipulações são bem conhecidos no estado da técnica. Por exemplo, sequências de aminoácido variantes podem ser preparadas por mutações no DNA. Os métodos para a mutagênese e alterações de sequências nucleotídicas são bem conhecidos no estado da técnica. Vide, por exemplo, Kunkel (1985) PNAS, 82: 488-492; Kunkel et al. (1987) Methods in Enzymol. 154: 367-382; Patente US 4.873.192; Walker e Gaastra, eds. (1983) Techniques in Molecular Biology (MacMillan Publishing Company, Nova Iorque) e as referências aí citadas. Orientações quanto às substituições de aminoácidos adequadas que não afetam a atividade biológica da proteína de interesse podem ser encontradas no modelo de Dayhoff et al. (1978) Atlas of Protein Sequence and Structure (Natl. Biomed. Res. Found., Washington, D. C), incorporada ao presente pela referência. Podem ser preferíveis as substituições conservadoras, tal como a troca de um aminoácido por outro que possui propriedades similares.

[094] Alternativamente, as sequências nucleotídicas variantes podem ser feitas pela introdução aleatória de mutações ao longo de toda ou de parte de uma sequência codificante, tal como por mutagênese de saturação, e os mutantes resultantes podem ser rastreados para identificar os mutantes que codificam proteínas que retêm a atividade. Por exemplo, após a mutagênese, a proteína codificada pode ser expressa de maneira recombinante e a atividade da proteína pode ser determinada utilizando técnicas de ensaio convencionais.

[095] Os inventores da presente invenção descobriram que a substituição de um ou mais dos resíduos fundamentais da enzima TriA de SEQ ID NO: 2, por exemplo, empregando um dos métodos descritos acima para mutar os ácidos nucleicos codificante da TriA, a tolerância ou resistência a determinados herbicidas poderia ser notavelmente aumentada. As substituições preferidas da TriA mutada são aquelas que aumentam a tolerância ao herbicida na planta, mas deixe a atividade biológica da desaminase substancialmente não afetada.

[096] Consequentemente, outro objeto da presente invenção refere-se a um polipeptídeo TriA compreendendo a SEQ ID NO: 2, uma forma variante, derivada, ortóloga, paráloga ou homóloga do mesmo, cujos resíduos de aminoácidos-chave são substituídos por qualquer outro aminoácido.

[097] Será compreendido pelo homem da técnica que os aminoácidos localizados em estreita proximidade com as posições de aminoácidos mencionadas abaixo também podem ser substituídos. Assim, em outro exemplo de realização, a variante de SEQ ID NO: 2, ou uma forma variante, derivada, ortóloga, paráloga ou homóloga dessa sequência, compreende uma TriA mutada, em que ±3, ±2 ou ±1 posições de aminoácido a partir de um aminoácido-chave são substituídas por qualquer outro aminoácido.

[098] Com base em técnicas bem conhecidas, um padrão de sequência altamente característica pode ser desenvolvida, por meio do qual as TriAs mutadas candidatas adicionais com a atividade desejada podem ser pesquisadas.

[099] A procura de outras TriAs mutadas candidatas pela aplicação de um padrão de sequência apropriada também é abrangida pela presente invenção. Será compreendido por um leitor perito na arte que o presente padrão de sequência não é limitado pelas distâncias exatas entre dois resíduos de aminoácidos adjacentes do referido padrão. Cada uma das distâncias entre dois vizinhos nos padrões acima pode, por exemplo, variar independentemente um do outro em até ± 10, ± 5, ± 3, ± 2 ou ± 1 posições de aminoácidos sem afetar substancialmente a atividade desejada.

[0100] Além disso, aplicando o método da mutagênese sítio- dirigida, por exemplo, mutagênese de saturação (vide, por exemplo, Schenk et al., Biospektrum 03/2006, páginas 277-279), os inventores da presente invenção identificaram e geraram substituições de aminoácidos específicos e suas combinações que - quando introduzidas em uma planta por meio da transformação e expressão do ácido nucleico codificante de TriA mutante -conferem resistência aumentada a herbicidas ou tolerância a herbicida na referida planta.

[0101] Assim, em um exemplo de realização particularmente preferido, a forma variante ou derivada da TriA mutada refere-se a um polipeptídeo TriA compreendendo a SEQ ID NO: 2, um sequência ortóloga, paráloga ou homóloga da mesma, em que a sequência de aminoácidos difere da sequência de aminoácidos tipo selvagem de um polipeptídeo TriA em uma ou mais posições correspondentes às seguintes posições da SEQ ID NO: 2: 70, 71, 88, 91, 92, 96, 126, 128, 155, 157, 167, 220.

[0102] Exemplos de diferenças nestas posições de aminoácidos incluem, mas não estão limitados a, um ou mais dos seguintes procedimentos: - o aminoácido corespondendo a posição 70 é outro que não a Aspargina; - o aminoácido corespondendo a posição 71 é outro que não a Glutamina; - o aminoácido corespondendo a posição 88 é outro que não a Leucina; - o aminoácido corespondendo a posição 91 é outro que não a Valina; - o aminoácido corespondendo a posição 92 é outro que não a Leucina; - o aminoácido corespondendo a posição 96 é outro que não a Glutamina; - o aminoácido corespondendo a posição 126 é outro que não a Aspargina; - o aminoácido corespondendo a posição 128 é outro que não o Ácido aspártico; - o aminoácido corespondendo a posição 155 é outro que não a Metionina; - o aminoácido corespondendo a posição 157 é outro que não a Fenilalanina; - o aminoácido corespondendo a posição 167 é outro que não a Tirosina; e - o aminoácido corespondendo a posição 220 é outro que não a Alanina.

[0103] Em alguns exemplos de realização, a enzima TriA mutada compreendendo a SEQ ID NO: 2, uma forma ortóloga, paráloga, ou homóloga da mesma, compreende um ou mais dos seguintes:

[0104] Em outro exemplo de realização preferido, a TriA mutada compreende uma sequência de SEQ ID NO: 2, uma forma variante, derivada, ortóloga, paráloga ou homóloga da mesma, em que:- o aminoácido correspondendo à posição 70 é Ala, Ile, Leu, Pro.

[0105] Em outro exemplo de realização preferido, a TriA mutada compreende uma sequência de SEQ ID NO: 2, uma forma variante, derivada, ortóloga, paráloga ou homóloga da mesma, em que:o aminoácido correspondendo à posição 71 é Leu, Ile.

[0106] Em outro exemplo de realização preferido, a TriA mutada compreende uma sequência de SEQ ID NO: 2, uma forma variante, derivada, ortóloga, paráloga ou homóloga da mesma, em que: o aminoácido correspondendo à posição 70 é Ile, Ala, Leu, Pro, Ser e o aminoácido correspondendo à posição 71 é Leu, Ile.

[0107] Em outro exemplo de realização preferido, a TriA mutada compreende uma sequência de SEQ ID NO: 2, uma forma variante, derivada, ortóloga, paráloga ou homóloga da mesma, em que:o aminoácido correspondendo à posição 70 é Ile, e o aminoácido correspondendo à posição 71 é Leu.

[0108] Em outro exemplo de realização preferido, a TriA mutada compreende uma sequência de SEQ ID NO: 2, uma forma variante, derivada, ortóloga, paráloga ou homóloga da mesma, em que:o aminoácido correspondendo à posição 70 é Ile, e o aminoácido correspondendo à posição 71 é Ile.

[0109] Em outro exemplo de realização preferido, a TriA mutada compreende uma sequência de SEQ ID NO: 2, uma forma variante, derivada, ortóloga, paráloga ou homóloga da mesma, em que: o aminoácido correspondendo à posição 70 é Ala, e o aminoácido correspondendo à posição 71 é Leu.

[0110] Em outro exemplo de realização preferido, a TriA mutada compreende uma sequência de SEQ ID NO: 2, uma forma variante, derivada, ortóloga, paráloga ou homóloga da mesma, em que: o aminoácido correspondendo à posição 70 é Ala e o aminoácido correspondendo à posição 71 é Ile.

[0111] Em outro exemplo de realização preferido, a TriA mutada compreende uma sequência de SEQ ID NO: 2, uma forma variante, derivada, ortóloga, paráloga ou homóloga da mesma, em que:o aminoácido correspondendo à posição 70 é Leu e o aminoácido correspondendo à posição 71 é Leu.

[0112] Em outro exemplo de realização preferido, a TriA mutada compreende uma sequência de SEQ ID NO: 2, uma forma variante, derivada, ortóloga, paráloga ou homóloga da mesma, em que: o aminoácido correspondendo à posição 70 é Leu e o aminoácido correspondendo à posição 71 é Ile.

[0113] Em outro exemplo de realização preferido, a TriA mutada compreende uma sequência de SEQ ID NO: 2, uma forma variante, derivada, ortóloga, paráloga ou homóloga da mesma, em que: o aminoácido correspondendo à posição 70 é Pro e o aminoácido correspondendo à posição 71 é Leu.

[0114] Em outro exemplo de realização preferido, a TriA mutada compreende uma sequência de SEQ ID NO: 2, uma forma variante, derivada, ortóloga, paráloga ou homóloga da mesma, em que: o aminoácido correspondendo à posição 70 é Pro e o aminoácido correspondendo à posição 71 é Ile.

[0115] Em outro exemplo de realização preferido, a TriA mutada compreende uma sequência de SEQ ID NO: 2, uma forma variante, derivada, ortóloga, paráloga ou homóloga da mesma, em que: o aminoácido correspondendo à posição 70 é Ser e o aminoácido correspondendo à posição 71 é Leu.

[0116] Em outro exemplo de realização preferido, a TriA mutada compreende uma sequência de SEQ ID NO: 2, uma forma variante, derivada, ortóloga, paráloga ou homóloga da mesma, em que: o aminoácido correspondendo à posição 70 é Ser e o aminoácido correspondendo à posição 71 é Ile.

[0117] Em outro exemplo de realização preferido, a TriA mutada compreende uma sequência de SEQ ID NO: 2, uma forma variante, derivada, ortóloga, paráloga ou homóloga da mesma, em que: o aminoácido correspondendo à posição 155 é Tre, Ser, Val.

[0118] Em outro exemplo de realização preferido, a TriA mutada compreende uma sequência de SEQ ID NO: 2, uma forma variante, derivada, ortóloga, paráloga ou homóloga da mesma, em que: o aminoácido correspondendo à posição 157 é Ile, Leu, Val.

[0119] Em outro exemplo de realização preferido, a TriA mutada compreende uma sequência de SEQ ID NO: 2, uma forma variante, derivada, ortóloga, paráloga ou homóloga da mesma, em que: o aminoácido correspondendo à posição 128 é Tre, Ile.

[0120] Em outro exemplo de realização preferido, a TriA mutada compreende uma sequência de SEQ ID NO: 2, uma forma variante, derivada, ortóloga, paráloga ou homóloga da mesma, em que: o aminoácido correspondendo à posição 96 é Tre, Met, Ser, Cis.

[0121] Em outro exemplo de realização preferido, a TriA mutada compreende uma sequência de SEQ ID NO: 2, uma forma variante, derivada, ortóloga, paráloga ou homóloga da mesma, em que: o aminoácido correspondendo à posição 70 é Pro e o aminoácido correspondendo à posição 157 é Ile, Leu, Val.

[0122] Em outro exemplo de realização preferido, a TriA mutada compreende uma sequência de SEQ ID NO: 2, uma forma variante, derivada, ortóloga, paráloga ou homóloga da mesma, em que: o aminoácido correspondendo à posição 70 é Pro e o aminoácido correspondendo à posição 157 é Ile.

[0123] Em outro exemplo de realização preferido, a TriA mutada compreende uma sequência de SEQ ID NO: 2, uma forma variante, derivada, ortóloga, paráloga ou homóloga da mesma, em que: o aminoácido correspondendo à posição 70 é Pro e o aminoácido correspondendo à posição 157 é Leu.

[0124] Em outro exemplo de realização preferido, a TriA mutada compreende uma sequência de SEQ ID NO: 2, uma forma variante, derivada, ortóloga, paráloga ou homóloga da mesma, em que: o aminoácido correspondendo à posição 70 é Pro e o aminoácido correspondendo à posição 157 é Val.

[0125] Em outro exemplo de realização preferido, a TriA mutada compreende uma sequência de SEQ ID NO: 2, uma forma variante, derivada, ortóloga, paráloga ou homóloga da mesma, em que: o aminoácido correspondendo à posição 70 é Pro e o aminoácido correspondendo à posição 96 é Tre, Met, Cis.

[0126] Em outro exemplo de realização preferido, a TriA mutada compreende uma sequência de SEQ ID NO: 2, uma forma variante, derivada, ortóloga, paráloga ou homóloga da mesma, em que: o aminoácido correspondendo à posição 70 é Pro e o aminoácido correspondendo à posição 96 é Tre.

[0127] Em outro exemplo de realização preferido, a TriA mutada compreende uma sequência de SEQ ID NO: 2, uma forma variante, derivada, ortóloga, paráloga ou homóloga da mesma, em que: o aminoácido correspondendo à posição 70 é Pro e o aminoácido correspondendo à posição 96 é Met.

[0128] Em outro exemplo de realização preferido, a TriA mutada compreende uma sequência de SEQ ID NO: 2, uma forma variante, derivada, ortóloga, paráloga ou homóloga da mesma, em que: o aminoácido correspondendo à posição 70 é Pro e o aminoácido correspondendo à posição 96 é Cis.

[0129] Em outro exemplo de realização preferido, a TriA mutada compreende uma sequência de SEQ ID NO: 2, uma forma variante, derivada, ortóloga, paráloga ou homóloga da mesma, em que: o aminoácido correspondendo à posição 70 é Ala, Pro, Val e o aminoácido correspondendo à posição 71 é Ala, Asn.

[0130] Em outro exemplo de realização preferido, a TriA mutada compreende uma sequência de SEQ ID NO: 2, uma forma variante, derivada, ortóloga, paráloga ou homóloga da mesma, em que: o aminoácido correspondendo à posição 70 é Ala e o aminoácido correspondendo à posição 71 é Ala.

[0131] Em outro exemplo de realização preferido, a TriA mutada compreende uma sequência de SEQ ID NO: 2, uma forma variante, derivada, ortóloga, paráloga ou homóloga da mesma, em que: o aminoácido correspondendo à posição 70 é Ala e o aminoácido correspondendo à posição 71 é Asn.

[0132] Em outro exemplo de realização preferido, a TriA mutada compreende uma sequência de SEQ ID NO: 2, uma forma variante, derivada, ortóloga, paráloga ou homóloga da mesma, em que: o aminoácido correspondendo à posição 70 é Pro e o aminoácido correspondendo à posição 71 é Ala.

[0133] Em outro exemplo de realização preferido, a TriA mutada compreende uma sequência de SEQ ID NO: 2, uma forma variante, derivada, ortóloga, paráloga ou homóloga da mesma, em que: o aminoácido correspondendo à posição 70 é Pro e o aminoácido correspondendo à posição 71 é Asn.

[0134] Em outro exemplo de realização preferido, a TriA mutada compreende uma sequência de SEQ ID NO: 2, uma forma variante, derivada, ortóloga, paráloga ou homóloga da mesma, em que: o aminoácido correspondendo à posição 70 é Val e o aminoácido correspondendo à posição 71 é Ala.

[0135] Em outro exemplo de realização preferido, a TriA mutada compreende uma sequência de SEQ ID NO: 2, uma forma variante, derivada, ortóloga, paráloga ou homóloga da mesma, em que: o aminoácido correspondendo à posição 70 é Val, e o aminoácido correspondendo à posição 71 é Asn.

[0136] Em outro exemplo de realização preferido, a TriA mutada compreende uma sequência de SEQ ID NO: 2, uma forma variante, derivada, ortóloga, paráloga ou homóloga da mesma, em que: o aminoácido correspondendo à posição 70 é Leu, e o aminoácido correspondendo à posição 71 é Ile, e o aminoácido correspondendo à posição 96 é Tre, Met.

[0137] Em outro exemplo de realização preferido, a TriA mutada compreende uma sequência de SEQ ID NO: 2, uma forma variante, derivada, ortóloga, paráloga ou homóloga da mesma, em que: o aminoácido correspondendo à posição 70 é Leu, e o aminoácido correspondendo à posição 71 é Ile, e o aminoácido correspondendo à posição 96 é Tre.

[0138] Em outro exemplo de realização preferido, a TriA mutada compreende uma sequência de SEQ ID NO: 2, uma forma variante, derivada, ortóloga, paráloga ou homóloga da mesma, em que:o aminoácido correspondendo à posição 70 é Leu, e o aminoácido correspondendo à posição 71 é Ile, e o aminoácido correspondendo à posição 96 é Met.

[0139] Em outro exemplo de realização preferido, a TriA mutada compreende uma sequência de SEQ ID NO: 2, uma forma variante, derivada, ortóloga, paráloga ou homóloga da mesma, em que:o aminoácido correspondendo à posição 70 é Leu, e o aminoácido correspondendo à posição 71 é Ile, o aminoácido correspondendo à posição 96 é Tre, Met, e o aminoácido correspondendo à posição 157 é Ile, Leu, Val.

[0140] Em outro exemplo de realização preferido, a TriA mutada compreende uma sequência de SEQ ID NO: 2, uma forma variante, derivada, ortóloga, paráloga ou homóloga da mesma, em que:o aminoácido correspondendo à posição 70 é Leu, e o aminoácido correspondendo à posição 71 é Ile, o aminoácido correspondendo à posição 96 é Tre, e o aminoácido correspondendo à posição 157 é Ile.

[0141] Em outro exemplo de realização preferido, a TriA mutada compreende uma sequência de SEQ ID NO: 2, uma forma variante, derivada,ortóloga, paráloga ou homóloga da mesma, em que:o aminoácido correspondendo à posição 70 é Leu, e o aminoácido correspondendo à posição 71 é Ile, o aminoácido correspondendo à posição 96 é Tre, e o aminoácido correspondendo à posição 157 é Leu.

[0142] Em outro exemplo de realização preferido, a TriA mutada compreende uma sequência de SEQ ID NO: 2, uma forma variante, derivada, ortóloga, paráloga ou homóloga da mesma, em que:o aminoácido correspondendo à posição 70 é Leu, e o aminoácido correspondendo à posição 71 é Ile, o aminoácido correspondendo à posição 96 é Tre, e o aminoácido correspondendo à posição 157 é Val.

[0143] Em outro exemplo de realização preferido, a TriA mutada compreende uma sequência de SEQ ID NO: 2, uma forma variante, derivada, ortóloga, paráloga ou homóloga da mesma, em que:o aminoácido correspondendo à posição 70 é Leu, e o aminoácido correspondendo à posição 71 é Ile, o aminoácido correspondendo à posição 96 é Met, e o aminoácido correspondendo à posição 157 é Ile.

[0144] Em outro exemplo de realização preferido, a TriA mutada compreende uma sequência de SEQ ID NO: 2, uma forma variante, derivada, ortóloga, paráloga ou homóloga da mesma, em que:o aminoácido correspondendo à posição 70 é Leu, e o aminoácido correspondendo à posição 71 é Ile, o aminoácido correspondendo à posição 96 é Met, e o aminoácido correspondendo à posição 157 é Leu.

[0145] Em outro exemplo de realização preferido, a TriA mutada compreende uma sequência de SEQ ID NO: 2, uma forma variante, derivada, ortóloga, paráloga ou homóloga da mesma, em que:o aminoácido correspondendo à posição 70 é Leu, e o aminoácido correspondendo à posição 71 é Ile, o aminoácido correspondendo à posição 96 é Met, e o aminoácido correspondendo à posição 157 é Val.

[0146] Em outro exemplo de realização preferido, a TriA mutada compreende uma sequência de SEQ ID NO: 2, uma forma variante, derivada, ortóloga, paráloga ou homóloga da mesma, em que:o aminoácido correspondendo à posição 71 é Leu, e o aminoácido correspondendo à posição 157 é Ile, Leu, Val.

[0147] Em outro exemplo de realização preferido, a TriA mutada compreende uma sequência de SEQ ID NO: 2, uma forma variante, derivada, ortóloga, paráloga ou homóloga da mesma, em que:o aminoácido correspondendo à posição 71 é Leu, e o aminoácido correspondendo à posição 157 é Ile.

[0148] Em outro exemplo de realização preferido, a TriA mutada compreende uma sequência de SEQ ID NO: 2, uma forma variante, derivada, ortóloga, paráloga ou homóloga da mesma, em que:o aminoácido correspondendo à posição 71 é Leu, e o aminoácido correspondendo à posição 157 é Leu.

[0149] Em outro exemplo de realização preferido, a TriA mutada compreende uma sequência de SEQ ID NO: 2, uma forma variante, derivada, ortóloga, paráloga ou homóloga da mesma, em que:o aminoácido correspondendo à posição 71 é Leu, e o aminoácido correspondendo à posição 157 é Val.

[0150] Em outro exemplo de realização preferido, a TriA mutada compreende uma sequência de SEQ ID NO: 2, uma forma variante, derivada, ortóloga, paráloga ou homóloga da mesma, em que:o aminoácido correspondendo à posição 71 é Leu, e o aminoácido correspondendo à posição 96 é Tre, Met, Cis.

[0151] Em outro exemplo de realização preferido, a TriA mutada compreende uma sequência de SEQ ID NO: 2, uma forma variante, derivada, ortóloga, paráloga ou homóloga da mesma, em que: o aminoácido correspondendo à posição 71 é Leu, e o aminoácido correspondendo à posição 96 é Tre.

[0152] Em outro exemplo de realização preferido, a TriA mutada compreende uma sequência de SEQ ID NO: 2, uma forma variante, derivada, ortóloga, paráloga ou homóloga da mesma, em que:o aminoácido correspondendo à posição 71 é Leu, e o aminoácido correspondendo à posição 96 é Met.

[0153] Em outro exemplo de realização preferido, a TriA mutada compreende uma sequência de SEQ ID NO: 2, uma forma variante, derivada, ortóloga, paráloga ou homóloga da mesma, em que:o aminoácido correspondendo à posição 71 é Leu, e o aminoácido correspondendo à posição 96 é Cis.

[0154] Em outro exemplo de realização preferido, a TriA mutada compreende uma sequência de SEQ ID NO: 2, uma forma variante, derivada, ortóloga, paráloga ou homóloga da mesma, em que:o aminoácido correspondendo à posição 71 é Ile, o aminoácido correspondendo à posição 157 é Ile, o aminoácido correspondendo à posição 155 é Val e o aminoácido correspondendo à posição 92 é Val.

[0155] Em outro exemplo de realização preferido, a TriA mutada compreende uma sequência de SEQ ID NO: 2, uma forma variante, derivada, ortóloga, paráloga ou homóloga da mesma, em que:o aminoácido correspondendo à posição 71 é Ile, o aminoácido correspondendo à posição 157 é Ile, o aminoácido correspondendo à posição 155 é Val e o aminoácido correspondendo à posição 92 é Val.

[0156] Em outro exemplo de realização preferido, a TriA mutada compreende uma sequência de SEQ ID NO: 2, uma forma variante, derivada, ortóloga, paráloga ou homóloga da mesma, em que:o aminoácido correspondendo à posição 88 é Ala, Val.

[0157] Em outro exemplo de realização preferido, a TriA mutada compreende uma sequência de SEQ ID NO: 2, uma forma variante, derivada, ortóloga, paráloga ou homóloga da mesma, em que:o aminoácido correspondendo à posição 88 é Ala, Val, e o aminoácido correspondendo à posição 92 é Ala.

[0158] Em outro exemplo de realização preferido, a TriA mutada compreende uma sequência de SEQ ID NO: 2, uma forma variante, derivada, ortóloga, paráloga ou homóloga da mesma, em que:o aminoácido correspondendo à posição 88 é Ala e o aminoácido correspondendo à posição 92 é Ala.

[0159] Em outro exemplo de realização preferido, a TriA mutada compreende uma sequência de SEQ ID NO: 2, uma forma variante, derivada, ortóloga, paráloga ou homóloga da mesma, em que:o aminoácido correspondendo à posição 88 é Val, e o aminoácido correspondendo à posição 92 é Ala.

[0160] Em outro exemplo de realização preferido, a TriA mutada compreende uma sequência de SEQ ID NO: 2, uma forma variante, derivada, ortóloga, paráloga ou homóloga da mesma, em que:o aminoácido correspondendo à posição 91 é Ala.

[0161] Em outro exemplo de realização preferido, a TriA mutada compreende uma sequência de SEQ ID NO: 2, uma forma variante, derivada, ortóloga, paráloga ou homóloga da mesma, em que:o aminoácido correspondendo à posição 91 é Ala e o aminoácido correspondendo à posição 92 é Ala, Val, Pro.

[0162] Em outro exemplo de realização preferido, a TriA mutada compreende uma sequência de SEQ ID NO: 2, uma forma variante, derivada, ortóloga, paráloga ou homóloga da mesma, em que:o aminoácido correspondendo à posição 91 é Ala e o aminoácido correspondendo à posição 92 é Ala.

[0163] Em outro exemplo de realização preferido, a TriA mutada compreende uma sequência de SEQ ID NO: 2, uma forma variante, derivada, ortóloga, paráloga ou homóloga da mesma, em que:o aminoácido correspondendo à posição 91 é Ala e o aminoácido correspondendo à posição 92 é Val.

[0164] Em outro exemplo de realização preferido, a TriA mutada compreende uma sequência de SEQ ID NO: 2, uma forma variante, derivada, ortóloga, paráloga ou homóloga da mesma, em que:o aminoácido correspondendo à posição 91 é Ala e o aminoácido correspondendo à posição 92 é Pro.

[0165] Em outro exemplo de realização preferido, a TriA mutada compreende uma sequência de SEQ ID NO: 2, uma forma variante, derivada, ortóloga, paráloga ou homóloga da mesma, em que:o aminoácido correspondendo à posição 92 é Ala, Val, Pro.

[0166] Em outro exemplo de realização preferido, a TriA mutada compreende uma sequência de SEQ ID NO: 2, uma forma variante, derivada, ortóloga, paráloga ou homóloga da mesma, em que:o aminoácido correspondendo à posição 96 é Tre, e o aminoácido correspondendo à posição 157 é Ile, Leu, Val.

[0167] Em outro exemplo de realização preferido, a TriA mutada compreende uma sequência de SEQ ID NO: 2, uma forma variante, derivada, ortóloga, paráloga ou homóloga da mesma, em que:o aminoácido correspondendo à posição 96 é Tre, e o aminoácido correspondendo à posição 157 é Ile.

[0168] Em outro exemplo de realização preferido, a TriA mutada compreende uma sequência de SEQ ID NO: 2, uma forma variante, derivada, ortóloga, paráloga ou homóloga da mesma, em que: o aminoácido correspondendo à posição 96 é Tre e o aminoácido correspondendo à posição 157 é Leu.

[0169] Em outro exemplo de realização preferido, a TriA mutada compreende uma sequência de SEQ ID NO: 2, uma forma variante, derivada, ortóloga, paráloga ou homóloga da mesma, em que:o aminoácido correspondendo à posição 96 é Tre, e o aminoácido correspondendo à posição 157 é Val.

[0170] Em outro exemplo de realização preferido, a TriA mutada compreende uma sequência de SEQ ID NO: 2, uma forma variante, derivada, ortóloga, paráloga ou homóloga da mesma, em que:o aminoácido correspondendo à posição 126 é Pro, Val.

[0171] Em outro exemplo de realização preferido, a TriA mutada compreende uma sequência de SEQ ID NO: 2, uma forma variante, derivada, ortóloga, paráloga ou homóloga da mesma, em que:o aminoácido correspondendo à posição 128 é Ala.

[0172] Em outro exemplo de realização preferido, a TriA mutada compreende uma sequência de SEQ ID NO: 2, uma forma variante, derivada, ortóloga, paráloga ou homóloga da mesma, em que:o aminoácido correspondendo à posição 155 é Val, e o aminoácido correspondendo à posição 157 é Ile, Leu, Val.

[0173] Em outro exemplo de realização preferido, a TriA mutada compreende uma sequência de SEQ ID NO: 2, uma forma variante, derivada, ortóloga, paráloga ou homóloga da mesma, em que:o aminoácido correspondendo à posição 155 é Val, e o aminoácido correspondendo à posição 157 é Ile.

[0174] Em outro exemplo de realização preferido, a TriA mutada compreende uma sequência de SEQ ID NO: 2, uma forma variante, derivada, ortóloga, paráloga ou homóloga da mesma, em que: o aminoácido correspondendo à posição 155 é Val, e o aminoácido correspondendo à posição 157 é Leu.

[0175] Em outro exemplo de realização preferido, a TriA mutada compreende uma sequência de SEQ ID NO: 2, uma forma variante, derivada, ortóloga, paráloga ou homóloga da mesma, em que:o aminoácido correspondendo à posição 155 é Val, e o aminoácido correspondendo à posição 157 é Val.

[0176] Em outro exemplo de realização preferido, a TriA mutada compreende uma sequência de SEQ ID NO: 2, uma forma variante, derivada, ortóloga, paráloga ou homóloga da mesma, em que:o aminoácido correspondendo à posição 155 é Val, e o aminoácido correspondendo à posição 70 é Pro.

[0177] Em outro exemplo de realização preferido, a TriA mutada compreende uma sequência de SEQ ID NO: 2, uma forma variante, derivada, ortóloga, paráloga ou homóloga da mesma, em que:o aminoácido correspondendo à posição 155 é Val, e o aminoácido correspondendo à posição 71 é Leu.

[0178] Em outro exemplo de realização preferido, a TriA mutada compreende uma sequência de SEQ ID NO: 2, uma forma variante, derivada, ortóloga, paráloga ou homóloga da mesma, em que:o aminoácido correspondendo à posição 155 é Val, e o aminoácido correspondendo à posição 96 é Tre, Met, Cis.

[0179] Em outro exemplo de realização preferido, a TriA mutada compreende uma sequência de SEQ ID NO: 2, uma forma variante, derivada, ortóloga, paráloga ou homóloga da mesma, em que:o aminoácido correspondendo à posição 155 é Val, e o aminoácido correspondendo à posição 96 é Tre.

[0180] Em outro exemplo de realização preferido, a TriA mutada compreende uma sequência de SEQ ID NO: 2, uma forma variante, derivada, ortóloga, paráloga ou homóloga da mesma, em que: o aminoácido correspondendo à posição 155 é Val, e o aminoácido correspondendo à posição 96 é Met.

[0181] Em outro exemplo de realização preferido, a TriA mutada compreende uma sequência de SEQ ID NO: 2, uma forma variante, derivada, ortóloga, paráloga ou homóloga da mesma, em que:o aminoácido correspondendo à posição 155 é Val, e o aminoácido correspondendo à posição 96 é Cis.

[0182] Em outro exemplo de realização preferido, a TriA mutada compreende uma sequência de SEQ ID NO: 2, uma forma variante, derivada, ortóloga, paráloga ou homóloga da mesma, em que:o aminoácido correspondendo à posição 167 é Ser.

[0183] Em outro exemplo de realização preferido, a TriA mutada compreende uma sequência de SEQ ID NO: 2, uma forma variante, derivada, ortóloga, paráloga ou homóloga da mesma, em que:o aminoácido correspondendo à posição 220 é Gli.

[0184] Está dentro do conhecimento do especialista no assunto identificar regiões conservadas e motivos compartilhados entre os homólogos, ortólogos e parálogos codificados pela SEQ ID NO: 1. Tendo identificados tais regiões conservadas que podem representar motivos de ligação adequados, os aminoácidos podem ser escolhidos para ser substituíveis por qualquer outro aminoácido, por exemplo, por aminoácidos conservados, preferencialmente pelas substituições de aminoácidos descritas acima usando a SEQ ID NO: 2 como referência.

[0185] Outro objeto refere-se a um método de identificação de uma sequência de nucleotídeos que codifica uma TriA mutada que é resistente ou tolerante a um herbicida, cujo método compreende: a) geração de uma biblioteca de ácidos nucleicos codificantes da TriA mutada, b) a triagem de uma população de ácidos nucleicos codificantes da TriA mutada resultante pela expressão de cada um dos referidos ácidos nucleicos em uma célula ou planta e o tratamento da referida célula ou planta com um herbicida, c) a comparação dos níveis de tolerância ao herbicida fornecidos pela referida população de ácidos nucleicos codificantes da TriA mutada com o nível de tolerância ao herbicida fornecido por um ácido nucleico codificante da TriA controle, d) a seleção de pelo menos um ácido nucleico codificante da TriA mutada que proporciona um aumento significativo do nível de tolerância a um herbicida, em comparação com o nível de tolerância proporcionado pelo ácido nucleico que codifica uma TriA controle.

[0186] Os níveis de tolerância a herbicidas também podem ser determinados medindo a taxa de detoxificação em uma célula, tecido ou planta.

[0187] A taxa de detoxificação é a taxa de degradação de herbicidas dentro de um determinado período de tempo em um tecido respectivo. A degradação e a formação do produto podem ser determinadas analiticamente, por exemplo, por cromatografia líquida (LC) acoplada a um espectrômetro de massa (MS) de alta resolução (HR). O produto pode ser determinado por comparação com padrões autênticos e/ou por elucidação da estrutura.

[0188] Em um exemplo de realização preferido, o ácido nucleico codificante da TriA mutada selecionado na etapa (d) proporciona, pelo menos, duas vezes ou mais a resistência ou tolerância de uma célula ou planta a um herbicida em comparação com a resistência ou tolerância proporcionada pelo ácido nucleico codificante da TriA de controle.

[0189] Em um exemplo de realização preferido, o ácido nucleico codificante da TriA mutada selecionado na etapa (d) proporciona, pelo menos, 2 vezes, pelo menos 5 vezes, pelo menos 10 vezes, pelo menos 20 vezes, pelo menos 50 vezes, pelo menos 100 vezes, pelo menos 500 vezes ou mais a resistência ou tolerância de uma célula vegetal ou planta a um herbicida em comparação com a resistência ou tolerância proporcionada pelo ácido nucleico codificante da TriA controle.

[0190] A resistência ou tolerância pode ser determinada pela geração de uma planta ou célula vegetal transgênica, preferencialmente uma célula vegetal transgênica, compreendendo uma sequência de ácido nucleico da biblioteca da etapa (a) e comparando a referida planta transgênica com uma planta ou célula hospedeira controle, preferencialmente uma célula vegetal.

[0191] Muitos métodos conhecidos pelos especialistas na matéria estão disponíveis para obtenção de ácidos nucleicos candidatos adequados para a identificação de uma sequência de nucleotídeos que codifica uma TriA mutada a partir uma variedade de diferentes organismos fonte potenciais, incluindo micróbios, plantas, fungos, algas, etc. culturas mistas bem como fontes ambientais de DNA, tal como o solo. Estes métodos incluem, dentre outros, a preparação de bibliotecas de cDNA ou de ADN genômico, a utilização de primers de oligonucleotídicos adequadamente degenerados, o uso de sondas baseadas em sequências conhecidas ou ensaios de complementação (por exemplo, para o crescimento em tirosina), bem como a utilização da mutagênese e embaralhamento (shuffling) a fim de fornecer sequências codificantes de TriA mutada recombinadas ou embaralhadas.

[0192] Os ácidos nucleicos compreendendo as sequências codificantes da TriA candidatas e de controle podem ser expressos em levedura, em uma cepa bactéria hospedeira, uma alga ou uma planta superior, tal como o tabaco ou Arabidopsis e os níveis relativos de tolerância inerente das sequências que codificam a TriA triadas de acordo com um fenótipo indicador visível da cepa ou planta transformada na presença de diferentes concentrações do herbicida selecionado. A dose resposta e as alterações relativas nas doses respostas associadas com estes fenótipos indicadores (formação de cor castanha, inibição do crescimento, efeito herbicida, etc.) são convenientemente expressas em termos de, por exemplo, GR50 (concentração para 50% de redução do crescimento) ou MIC (mínima concentração de inibição) em que os aumentos nos valores correspondem a aumentos na tolerância inerente da TriA expressa. Por exemplo, em um sistema de ensaio relativamente rápido baseada na transformação de uma bactéria tal como a E. coli, cada sequência codificante de TriA mutada pode ser expressa, por exemplo, como uma sequência de DNA sob o controle de um promotor controlável, tal como o promotor lacZ, e levando em conta, por exemplo, pela utilização de DNA sintético, questões tais como a utilização de códons preferencial de forma se a obter um nível de expressão comparável quanto possível de diferentes sequências TriA. Tais cepas de expressão de ácidos nucleicos compreendendo as sequências de TriA candidatas alternativas podem ser colocadas em placas com diferentes concentrações do herbicida derivado de cumarona selecionado em, opcionalmente, um meio suplementado com tirosina e os níveis relativos de tolerância inerente das enzimas TriA expressas podem ser estimados com base a extensão e valores de MIC para a inibição da formação de pigmentos castanhos, ocronóticos, ou pela medição da degradação do herbicida por LC- HRMS (cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massa de alta resolução).

[0193] Em outro exemplo de realização, os ácidos nucleicos candidatos, são transformados em material vegetal para gerar uma planta transgênica, regenerado em plantas férteis morfologicamente normais que são então medidas para a tolerância diferencial a herbicidas selecionados, conforme descrito na seção de Exemplos a seguir. Muitos métodos adequados para a transformação por meio de marcadores de seleção adequados, tais como canamicina, vetores binários, como aqueles a partir de Agrobacterium, e regeneração de plantas, por exemplo, a partir de discos foliares de tabaco são bem conhecidos no estado da técnica. Opcionalmente, uma população de plantas controle também é transformada com um ácido nucleico expressando a TriA. A média e a distribuição dos níveis de tolerância ao herbicida de uma variedade de eventos de transformação de plantas primárias ou seus descendentes para os herbicidas descritos acima são avaliadas da maneira normal com base em danos nas plantas, sintomas de branqueamento meristemáticos etc, a uma gama de diferentes concentrações de herbicidas. Estes dados podem ser expressos em termos de, por exemplo, valores de GR50 derivados a partir das curvas dose/resposta com a “dose” representada no eixo x e “percentagem de mortes”, “efeito herbicida”, “números de plantas verdes emergentes” etc. representada no eixo y, onde valores elevados GR50 correspondem a um aumento nos níveis de tolerância inerente da TriA expressa. Os herbicidas podem ser adequadamente aplicados pré-emergência ou pós- emergência.

[0194] Outro objeto da presente invenção diz respeito a um ácido nucleico isolado, recombinante e/ou quimicamente sintetizado que codifica uma TriA mutada, tal como descrito anteriormente, cujo ácido nucleico compreende a sequência de SEQ ID NO: 1, ou uma sequência variante ou derivada desta.

[0195] Em um exemplo de realização preferido, a TriA mutada codificada é uma variante da SEQ ID NO: 2, que inclui um ou mais dos seguintes: - o aminoácido corespondendo a posição 70 é outro que não a Aspargina; - o aminoácido corespondendo a posição 71 é outro que não a Glutamina; - o aminoácido corespondendo a posição 88 é outro que não a Leucina; - o aminoácido corespondendo a posição 91 é outro que não a Valina; - o aminoácido corespondendo a posição 92 é outro que não a Leucina; - o aminoácido corespondendo a posição 96 é outro que não a Glutamina; - o aminoácido corespondendo a posição 126 é outro que não a Aspargina; - o aminoácido corespondendo a posição 128 é outro que não o Ácido aspártico; - o aminoácido corespondendo a posição 155 é outro que não a Metionina; - o aminoácido corespondendo a posição 157 é outro que não a Fenilalanina; - o aminoácido corespondendo a posição 167 é outro que não a Tirosina; e - o aminoácido corespondendo a posição 220 é outro que não a Alanina.

[0196] Em outro aspecto, a presente invenção abrange uma progênie ou descendente de uma planta tolerante a herbicidas da presente invenção, assim como sementes derivadas de plantas tolerantes a herbicidas da invenção e as células derivadas das plantas tolerantes aos herbicidas da invenção.

[0197] Em alguns exemplos de realização, a presente invenção provê uma progênie ou planta descendente, capaz de regenerar uma planta que compreende, em pelo menos algumas de suas células, um polinucleotídeo operacionalmente ligado a um promotor operável em células vegetais, cujo promotor é capaz de conduzir a expressão de um polipeptídeo TriA tipo selvagem ou mutado codificado pelo polinucleotídeo, em que a progênie ou planta descendente compreende, em pelo menos algumas de suas células, o polinucleotídeo recombinante operacionalmente ligado ao promotor, cuja expressão do polipeptídeo TriA tipo selvagem ou mutado confere à progênie ou planta descendente tolerância a herbicidas.

[0198] Em um exemplo de realização, as sementes da presente invenção compreendem preferencialmente características de tolerância a herbicidas das plantas tolerantes a herbicidas. Em outros exemplos de realização, a semente é capaz de germinar em uma planta que compreende, em pelo menos algumas de suas células, um polinucleotídeo operacionalmente ligado a um promotor operável em células vegetais, cujo promotor é capaz de expressar um polipeptídeo TriA tipo selvagem ou mutado codificado pelo polinucleotídeo, cuja a expressão do polipeptídeo TriA tipo selvagem ou mutado confere tolerância a herbicidas à progênie ou planta descendente.

[0199] Em alguns exemplos de realização, as células vegetais da presente invenção são capazes de regenerar em uma planta ou parte de planta. Em outros exemplos de realização, as células vegetais não são capazes de regenerar uma planta ou parte de planta. Exemplos de células não capazes de regenerar uma planta incluem, mas não estão limitadas a células do; endosperma, revestimento de semente (testa & pericarpo), e capa da raiz.

[0200] Em outro exemplo de realização, a invenção provê uma célula vegetal capaz de regenerar uma planta que compreende, em pelo menos algumas de suas células, um polinucleotídeo operacionalmente ligado a um promotor operável em células vegetais, cujo promotor é capaz de expressar um polipeptídeo TriA tipo selvagem ou mutado codificado pelo polinucleotídeo, em que a expressão do polipeptídeo TriA tipo selvagem ou mutado confere tolerância a herbicidas à planta, e em que a célula vegetal compreende o polinucleotídeo operacionalmente ligado a um promotor.

[0201] Em outro exemplo de realização, a invenção provê uma célula vegetal, compreendendo um polinucleotídeo operacionalmente ligado a um promotor operável em uma célula vegetal, cujo promotor é capaz de expressar um polipeptídeo TriA tipo selvagem ou mutado codificado pelo polinucleotídeo, a expressão do polipeptídeo TriA tipo selvagem ou mutado confere tolerância a herbicidas à célula.

[0202] Em outro exemplo de realização, a invenção diz respeito a uma célula vegetal transformada por um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo TriA mutado de acordo com a presente invenção, em que a expressão do ácido nucleico na célula vegetal resulta em resistência aumentada ou tolerância aumentada a um herbicida em comparação com uma variedade tipo selvagem da célula vegetal. De preferência, o ácido nucleico que codifica o polipeptídeo TriA mutado compreende uma sequência polinucleotídica selecionada a partir do grupo consistindo de: a) um polinucleotídeo conforme mostrado na SEQ ID NO: 1, ou uma forma variante ou derivada do mesmo; B) um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo mostrado na SEQ ID NO: 2, ou uma forma variante ou derivada do mesmo; c) um polinucleotídeo compreendendo pelo menos 60 nucleotídeos consecutivos de a) ou b); e d) um polinucleotídeo complementar ao polinucleotídeo de a) até c).

[0203] Em alguns aspectos, a presente invenção provê um produto vegetal preparado a partir das plantas tolerantes a herbicidas. Em alguns exemplos de realização, exemplos de produtos vegetais incluem, sem limitação, grão, óleo e farinha. Em um exemplo de realização, um produto vegetal é grão vegetal (por exemplo, grão adequado para uso como alimento para animais ou processamento), óleo vegetal (por exemplo, óleo adequado para uso como alimento ou biodiesel), ou farelo vegetal (por exemplo, farinha adequada para uso na alimentação).

[0204] Em um exemplo de realização, a presente invenção provê um produto vegetal preparado a partir de uma planta ou parte de planta, em que a planta ou parte de planta compreende em pelo menos algumas de suas células um polinucleotídeo operacionalmente ligado a um promotor operável em células vegetais, cujo promotor é capaz de expressar um polipeptídeo TriA tipo selvagem ou mutado codificado pelo polinucleotídeo, e a expressão do polipeptídeo TriA tipo selvagem ou mutado confere à planta ou parte de planta tolerância a herbicidas.

[0205] Em outro exemplo de realização, a invenção diz respeito a um método de produzir uma célula vegetal transgênica com uma resistência aumentada a um herbicida em comparação com uma variedade tipo selvagem das células vegetal compreendendo, a transformação da célula vegetal com um cassete de expressão que compreende um polinucleotídeo operacionalmente ligado a um promotor operável em células vegetais, cujo promotor é capaz de expressar um polipeptídeo TriA tipo selvagem ou mutado codificado pelo polinucleotídeo.

[0206] Em outro exemplo de realização, a invenção diz respeito a um método de produção de uma planta transgênica que compreende, (a) a transformação de uma célula vegetal com um cassete de expressão compreendendo o polinucleotídeo operacionalmente ligado a um promotor operável na célula vegetal, cujo promotor é capaz de expressar um polipeptídeo TriA tipo selvagem ou mutado codificado pelo polinucleotídeo, e (b) a geração de uma planta com resistência aumentada ao herbicida a partir da célula vegetal.

[0207] Em alguns aspectos, a presente invenção provê um método para a produção de uma planta tolerante a herbicida. Em um exemplo de realização, o método compreende: a regeneração de uma planta a partir da célula vegetal transformada com um polinucleotídeo operacionalmente ligado a um promotor operável em uma célula vegetal, cujo promotor é capaz de expressar um polipeptídeo TriA tipo selvagem ou mutado codificado pelo polinucleotídeo, em que a expressão do polipeptídeo TriA tipo selvagem ou mutado confere à planta tolerância a herbicidas.

[0208] O termo “expressão/expressando” ou “expressão gênica” significa a transcrição de um gene específico ou genes específicos ou construção genética específica. O termo “expressão” “expressão gênica”, em particular, significa a transcrição de um gene ou genes ou construção genética em RNA estrutural (rRNA, tRNA) ou mRNA, com ou sem a subsequente tradução deste último em proteína. O processo inclui a transcrição do DNA e processamento do produto mRNA resultante.

[0209] Para obter o efeito desejado, ou seja, plantas que são tolerantes ou resistentes ao herbicida derivado do herbicida da presente invenção, será entendido que o pelo menos um ácido nucleico é “superexpresso” por métodos e meios conhecidos para os técnicos hábeis no assunto.

[0210] O termo “expressão aumentada” ou “superexpressão”, conforme utilizado no presente, significa qualquer forma de expressão que é adicional ao nível de expressão do tipo selvagem. Os métodos para a expressão crescente de genes ou produtos gênicos estão bem documentados na literatura prévia e incluem, por exemplo, a superexpressão conduzida por promotores apropriados, utilização de promotores de transcrição ou facilitadores (enhancers) da tradução. Os ácidos nucleicos isolados que servem como elementos promotores ou facilitadores podem ser introduzidos em uma posição apropriada (normalmente a montante) de uma forma não heteróloga de um polinucleotídeo, de modo a regular positivamente a expressão de um ácido nucleico que codifica o polipeptídeo de interesse. Por exemplo, os promotores endógenos podem ser alterados in vivo por deleção, mutação, e/ou substituição (vide, Kmiec, US 5.565.350,. Zarling et al, WO9322443), ou promotores isoladas podem ser introduzidos em uma célula vegetal com a orientação e distância adequada a partir de um gene da presente invenção de modo a controlar a expressão do gene. Se a expressão do polipeptídeo é desejada, geralmente é desejável incluir uma região de poliadenilação na extremidade 3' da região codificante do polinucleotídeo. A região de poliadenilação pode ser derivada do gene natural, de uma variedade de outros genes vegetais, ou de T-DNA. A sequência da extremidade 3' a ser adicionada pode ser derivada, por exemplo, do gene da nopalina sintase ou octopina sintase ou, alternativamente, a partir de outro gene vegetal, ou menos preferencialmente, a partir de qualquer outro gene de eucariotos. Uma sequência íntron pode ser acrescentada na região não traduzida 5' ou na sequência codificante da sequência de codificação parcial para aumentar a quantidade da mensagem madura que se acumula no citosol. Foi demonstrado que a inclusão de um íntron que pode sofrer splicing na unidade de transcrição em construções de expressão em plantas e em animais aumenta em até 1000 vezes a expressão do gene em ambos os níveis: mRNA e proteína. (Buchman e Berg, (1988) Mol. Cell Biol. 8:4395-4405; Callis et al. (1987) Dev Genes. 1:1183-1200). Tal íntron de aprimoramento da expressão gênica é tipicamente maior quando colocado próximo da extremidade 5' da unidade de transcrição. O uso de íntrons do milho Adh1-S íntron 1, 2, e 6, íntron Bronze-1 são conhecidos no estado da técnica. Para obter informações gerais, consulte: The Maize Handbook, capítulo 116, Freeling e Walbot, Eds, Springer, NY (1994).

[0211] Quando apropriado, as sequências de ácidos nucleicos podem ser otimizadas para aumentar a expressão na planta transformada. Por exemplo, podem ser fornecidas sequências codificantes que compreendem códons preferidos de plantas para expressão melhorada em uma planta. Vide, por exemplo, Campbell e Gowri (1990) Plant Physiol. 92: 1-11 para uma discussão da utilização preferencial de códon (codon usage) pelo hospedeiro. Também são conhecidos no estado da técnica métodos para a preparação de genes preferidos de plantas. Vide, por exemplo, Patente US 5.380.831, e US 5.436.391, e Murray et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:477-498, incorporados ao presente pela referência.

[0212] Consequentemente, ácidos nucleicos TriA tipo selvagem/mutados da invenção são fornecidos em cassetes de expressão para expressão na planta de interesse. O cassete irá conter sequências reguladoras operacionalmente ligadas a uma sequência de ácido nucleico da TriA mutada da invenção. O termo “elemento regulador”, conforme utilizado no presente refere- se a um polinucleotídeo que é capaz de regular a transcrição de um polinucleotídeo operacionalmente ligado. Ele inclui, mas não se limita a, promotores, facilitadores “enhancers”, íntrons, 5 'UTRs e 3' UTRs. Com o termo “operacionalmente ligado” pretende-se dizer uma ligação funcional entre um promotor e uma segunda sequência, em que a sequência promotora inicia e medeia transcrição da sequência de DNA correspondendo a segunda sequência. Geralmente, operacionalmente ligado significa que as sequências de ácidos nucleicos ligadas são contíguas e, quando necessário para unir duas regi~]oes codificantes de proteínas, contíguas e no mesmo quadro de leitura. O cassete pode adicionalmente conter pelo menos um gene adicional a ser cotransformado dentro do organismo. Alternativamente, o(s) gene(s) adicional(ais) pode(m) ser fornecido(s) em múltiplos cassetes de expressão.

[0213] Tal cassete de expressão é preferencialmente provido de uma diversidade de sítios de restrição para a inserção da sequência de ácido nucleico da TriA tipo selvagem ou mutada para estar sob a regulação transcricional das regiões reguladoras. O cassete de expressão pode adicionalmente conter genes marcadores de seleção. O cassete de expressão da presente invenção incluirá na direção 5'-3' da transcrição, uma região de iniciação de transcrição e tradução (ou seja, um promotor), uma sequência de ácido nucleico da TriA tipo selvagem ou mutada da invenção, e uma região de terminação da transcrição e tradução (ou seja, região de terminação) funcionais em plantas. O promotor pode ser nativo ou análogo, ou exógeno ou heterólogo, para a planta hospedeira e/ou para a sequência de ácido nucleico da TriA tipo selvagem ou mutada da invenção. Além disso, o promotor pode ser de sequência natural ou, alternativamente, uma sequência sintética. Sempre que o promotor é “exógeno” ou “estrangeiro” ou “heterólogo” para a planta hospedeira, pretende- se que o promotor não seja encontrado na planta nativa na qual o promotor é introduzido. Sempre que o promotor é “exógeno” ou “estrangeiro” ou “heterólogo” em relação à sequência de ácido nucleico da TriA tipo selvagem/mutada da invenção, pretende-se que o promotor não seja nativo ou de ocorrência natural para a sequência de ácido nucleico da TriA tipo selvagem/mutada operacionalmente ligada da invenção. Tal como utilizado na presente invenção, um gene quimérico compreende uma sequência codificante operacionalmente ligada a uma região de iniciação da transcrição que é heteróloga para a sequência codificadora. Embora possa ser preferível expressar os ácidos nucleicos da TriA tipo selvagem ou mutada da invenção utilizando promotores heterólogos, podem ser utilizadas sequências promotoras nativas. Tais construções alterariam os níveis de expressão da proteína TriA tipo selvagem ou mutada na planta ou célula vegetal. Assim, o fenótipo da célula vegetal ou planta é alterado.

[0214] A região terminadora pode ser nativa com a região de iniciação da transcrição, pode ser nativa com a sequência da TriA tipo selvagem/mutada operacionalmente ligada de interesse, pode ser nativa com a planta hospedeira, ou pode ser derivada de outra fonte (ou seja, exógena ou heteróloga para o promotor, para a sequência de ácido nucleico da TriA tipo selvagem ou mutada de interesse, a planta hospedeira, ou qualquer combinação dos mesmos). Regiões de terminação convenientes estão disponíveis do plasmídeo Ti de A. tumefaciens, tal como regiões de terminação da octopina sintase de nopalina sintase. Vide também Guerineau et al. (1991) MoI. Gen.Genet. 262: 141-144; Proudfoot (1991) Cell 64:671-674; Sanfacon et al. (1991) Genes Dev. 5: 141-149; Mogen et al. (1990) Plant Cell 2: 1261-1272; Munroe et al. (1990) Gene 91: 151-158; Ballas et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:78917903; e Joshi et al. (1987) Nucleic Acid Res. 15:9627-9639. Quando apropriado, o(s) gene(s) pode(m) ser otimizado(s) para aumentar a expressão na planta transformada. Ou seja, os genes podem ser sintetizados utilizando códons preferenciais de plantas para expressão melhorada. Vide, por exemplo, Campbell e Gowri (1990) Plant Physiol. 92: 1-11 para uma discussão da utilização preferencial de códon (codon usage) pelo hospedeiro. Estão disponíveis métodos no estado da técnica para a síntese de genes preferidos de plantas. Vide, por exemplo, Patente US 5.380.831, e US 5.436.391, e Murray et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:477-498, incorporados ao presente pela referência.

[0215] Assim, a presente invenção provê um cassete de expressão compreendendo uma molécula de ácido nucleico da TriA tipo selvagem/mutada de acordo com a presente invenção e um promotor operável em células vegetais.

[0216] Em um exemplo de realização preferido, o promotor é um promotor específico da raiz (raiz-específico).

[0217] Em um exemplo de realização particularmente preferido, o promotor é um promotor raiz-específico da Glycine max. (por exemplo, p- Glyma04g34080, vide os exemplos 8 e 9).

[0218] Ainda mais preferencialmente, o promotor compreende a sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 32.

[0219] Embora os polinucleotídeos da invenção possam encontrar uso como genes marcadores selecionáveis para a transformação de plantas, os cassetes de expressão da presente invenção podem incluir outro gene marcador selecionável para a seleção de células transformadas. Os genes marcadores selecionáveis, incluindo aqueles da presente invenção, são utilizados para a seleção de células ou tecidos transformados. Os genes marcadores incluem, mas não estão limitados a, genes que codificam a resistência aos antibióticos, tal como aqueles que codificam a neomicina-fosfotransferase II (NEO) e higromicina fosfotransferase (HPT), assim como genes que conferem resistência a compostos herbicidas, tais como glufosinato de amônio, bromoxinil, imidazolinonas , e 2,4-diclorofenoxiacetato (2,4-D). Vide, do modo geral, Yarranton (1992) Curr. Opin. Biotech. 3 :506-511 ; Christophers on et al (1992) Proc. Natl. Acad. ScL USA 89:6314-6318; Yao et al. (1992) Cell 71:63-72; Reznikoff (1992) MoI Microbiol 6:2419-2422; Barkley et al (1980) em The Operon, págs. 177-220; Hu et al (1987) Cell 48:555-566; Brown et al (1987) Cell 49:603-612; Figge et al (1988) Cell 52:713-722; Deuschle et al (1989) Proc. Natl Acad. AcL USA 86:5400-5404; Fuerst et al (1989) Proc. Natl Acad. ScL USA 86:2549-2553; Deuschle et al (1990) Science 248:480-483; Gossen (1993) Tese de Doutorado, University of Heidelberg; Reines et al (1993) Proc. Natl Acad. ScL USA 90: 1917-1921; Labow et al (1990) MoI Cell Biol 10:3343-3356; Zambretti et al (1992) Proc. Natl Acad. ScL USA 89:3952-3956; Bairn et al (1991) Proc. Natl Acad. ScL USA 88:5072-5076; Wyborski et al (1991) Nucleic Acids Res. 19:4647-4653; Hillenand-Wissman (1989) Topics MoI Struc. Biol 10: 143- 162; Degenkolb et al (1991) Antimicrob. Agents Chemother. 35: 1591-1595; Kleinschnidt et al (1988) Biochemistry 27: 1094-1104; Bonin (1993) Tese de Doutorado, University of Heidelberg; Gossen et al (1992) Proc. Natl Acad. ScL USA 89:5547- 5551; Oliva et al (1992) Antimicrob. Agents Chemother. 36:913919; Hlavka et al (1985) Handbook of Experimental Pharmacology, Vol. 78 (Springer-Verlag, Berlin); Gill et al (1988) Nature 334:721-724. Estas divulgações são incorporadas ao presente pela referência. A lista acima de genes marcadores selecionáveis não tem a intenção de ser limitativa. Qualquer gene marcador selecionável pode ser utilizado na presente invenção.

[0220] Além disso, modificações de sequência adicionais são conhecidas para aumentar a expressão de genes em uma célula hospedeira. Dentre estas, incluem a eliminação de sequências codificantes de sinais de poliadenilação espúrios, sinais de locais de splicing éxon-íntron, repetições similares a transposons, e outras sequências bem caracterizadas que podem ser deletérias para a expressão gênica. O conteúdo de G-C da sequência pode ser ajustado para níveis médios para um determinado hospedeiro celular, calculado pela referência de genes conhecidos expressos na célula hospedeira. Além disso, se desejado, as sequências podem ser prontamente modificadas para evitar estruturas de mRNA secundárias em grampos (hairpin) preditas. As sequências nucleotídicas para aumentar a expressão gênica podem também ser utilizadas em vetores de expressão para plantas. Estes incluem, por exemplo, os íntrons do gene Adh de milho, Adh1-S íntrons 1, 2 e 6 (Callis et al. Genes and Development 1: 1183-1200, 1987), e sequências líderes, (sequência W) a partir do vírus do Mosaico do Tabaco (TMV), Vírus do Mosqueado Clorótico do Milho (Maize Chlorotic Mottle Virus) e vírus do mosaico da alfalfa (Gallie et al. Nucleic Acid Res. 15:8693-8711, 1987 e Skuzeski et al. Plant MoI. Biol. 15:65-79, 1990). O primeiro íntron do locus shrunken-1 de milho foi demonstrado que aumenta a expressão de genes nas construções de genes quiméricos. As Patentes US 5.424.412 e US 5.593.874 divulgam a utilização de íntrons específicos em construções de expressão de genes, e Gallie et al. (Plant Physiol. 106:929-939, 1994) também demonstraram que os íntrons são úteis para a regulação da expressão gênica com base na especificidade do tecido. Para melhorar ainda mais ou para otimizar a expressão gênica, os vetores de expressão para plantas da invenção também podem conter sequências de DNA que contêm região de interação com a matriz (MARs). As células vegetais transformadas com tais sistemas de expressão modificados, então, podem exibir a superexpressão ou a expressão constitutiva de uma sequência de nucleotídeos da invenção.

[0221] A invenção provê ainda um vetor de expressão recombinante, isolado, compreendendo o cassete de expressão contendo um ácido nucleico TriA tipo selvagem ou mutado, conforme descrito acima, em que a expressão do vetor em uma célula hospedeira resulta no aumento da tolerância a um herbicida quando comparada com uma variedade da célula hospedeira tipo selvagem. Conforme utilizado no presente, o termo “vetor” refere-se a uma molécula de ácido nucleico capaz de transportar outro ácido nucleico ao qual ela foi ligada. Um tipo de vetor é um “plasmídeo”, que se refere a uma alça (loop) circular de DNA de fita dupla, ao qual, segmentos de DNA adicionais podem ser ligados. Outro tipo de vetor é um vetor viral, em que segmentos de DNA adicionais podem ser ligados dentro do genoma viral. Determinados vetores são capazes de realizar replicação autônoma na célula hospedeira a qual foram introduzidos (por exemplo, vetores bacterianos que possuem uma origem bacteriana de replicação e vetores mamíferos epissomais). Outros vetores (por exemplo, vetores mamíferos não epissomais) são integrados no genoma de uma célula hospedeira mediante a introdução na célula hospedeira, sendo, desta forma, replicado junto com o genoma hospedeiro. Adicionalmente, determinados vetores são capazes de direcionar a expressão de genes aos quais eles estão operacionalmente ligados. Tais vetores são referidos na presente invenção como “vetores de expressão”. Em geral, os vetores de expressão para uso em técnicas de DNA recombinante estão frequentemente presentes na forma de plasmídeos. De acordo com o presente relatório descritivo, os termos “plasmídeo” e “vetor” podem ser utilizados de forma alternada, sendo que o termo “plasmídeo” é a forma de vetor mais comumente utilizada. No entanto, a invenção destina-se a incluir essas outras formas de vetores de expressão, tais como vetores virais (por exemplo, retrovírus de replicação defeituosa, adenovírus, e vírus adeno- associados), que desempenham funções equivalentes.

[0222] Os vetores de expressão recombinantes da invenção compreendem um ácido nucleico da invenção em uma forma adequada para expressão do ácido nucleico em uma célula hospedeira, o que significa que o vetor de expressão recombinante inclui uma ou mais sequências reguladoras selecionadas com base nas células hospedeiras a serem utilizadas para a expressão, a qual está operacionalmente ligada à sequência de ácido nucleico a ser expressa. As sequências reguladoras incluem aquelas que controlam a expressão constitutiva de uma sequência de nucleotídeos em muitos tipos de células hospedeiras e aquelas que controlam a expressão da sequência de nucleotídeos apenas em determinadas células hospedeiras ou apenas sob certas condições. Será reconhecido pelos técnicos hábeis no assunto que o desenho do vetor de expressão pode depender de fatores como a escolha da célula hospedeira a ser transformada, o nível de expressão do polipeptídeo desejado, e etc. Os vetores de expressão da presente invenção podem ser introduzidos nas células hospedeiras para desse modo produzir polipeptídeos ou peptídeos, incluindo polipeptídeos de fusão ou peptídeos codificados por ácidos nucleicos como os descritos na presente invenção (por exemplo, polipeptídeos TriA mutados, polipeptídeos de fusão, etc).

[0223] Os vetores de expressão podem conter ainda sequências líderes 5' na construção de expressão. Tais sequências líderes podem atuar para aumentar (melhorar) a tradução. Os líderes de tradução são conhecidos no estado da técnica e incluem: Líderes do picornavirus, por exemplo, líder EMCV (região não codificante 5’ da encefalomiocardite) (Elroy-Stein et al. (1989) PNAS 86:6126-6130); líderes do potyvírus, por exemplo, líder TEV (vírus Etch do tabaco) (Gallie et al. (1995) Gene 165(2):233-238), líder MDMV (Maize Dwarf Mosaic Virus) (Virology 154:9-20), e proteína de ligação da cadeia pesada da imunoglobulina humana (BiP) (Macejak et al. (1991) Nature 353:90-94); líder não traduzido do mRNA da capa protéica do vírus do mosaico da alfafa (AMV RNA 4) (Jobling et al. (1987) Nature 325:622-625); líder do vírus do mosaico do tabaco (TMV) (Gallie et al. (1989) em Molecular Biology of RNA, ed. Cech (Liss, Nova Iorque), págs. 237-256); e Vírus do Mosqueado Clorótico do Milho (Maize Chlorotic Mottle Virus) (MCMV) (Lommel et al. (1991) Virology 81:382-385). Vide também, Della-Cioppa et al. (1987) Plant Physiol. 84:965-968.

[0224] Outros métodos conhecidos para melhorar a tradução também podem ser utilizados, por exemplo, íntrons e similares. Na preparação de um cassete de expressão, diversos fragmentos de ácido nucleico podem ser manipulados de modo a proporcionar as sequências de ácido nucleico na orientação correta e, conforme apropriado, no quadro de leitura correto. Para este fim, os adaptadores ou ligantes podem ser utilizados para unir os fragmentos de ácido nucleico ou outras manipulações podem estar envolvidas para proporcionar sítios de restrição convenientes, remoção de ácido nucleico supérfluo, remoção de sítios de restrição, ou outros similares. Para esta finalidade, a mutagênese in vitro, reparação de primers, restrição, hibridação, resubstituições, por exemplo, transições e transversões, podem estar envolvidos.

[0225] Uma série de promotores pode ser usada na prática da invenção. Os promotores podem ser selecionados com base no resultado desejado. Os ácidos nucleicos podem ser combinados com outros promotores constitutivos, tecido-preferencial, para a expressão em plantas.

[0226] Promotores constitutivos incluem, por exemplo, o “core” do promotor Rsyn7 e outros promotores constitutivos divulgados na WO 99/43838 e Patente US 6.072.050; o core do promotor CaMV 35S (Odell et al. Nature 313:810-812 (1985)); actina do arroz (McElroy et al. Plant Cell 2:163-171 (1990)); ubiquitina (Christensen et al. Plant Mol. Biol. 12:619-632 (1989) e Christensen et al. Plant Mol. Biol. 18:675-689 (1992)); pEMU (Last et al. Theor. Appl. Genet. 81:581-588 (1991)); MAS (Velten et al ., EMBO J. 3:27232730 (1984)); promotor ALS (Patente US 5.659.026), e similares. Outros promotores constitutivos incluem, por exemplo, aqueles citados nas Patentes US 5.608.149, US 5.608,144 US 5.604.121, US 5.569.597, US 5.466.785, US 5.399.680, US 5.268.463, US 5.608.142 e US 6.177.611.

[0227] Promotores tecido-preferenciais podem ser utilizados para melhorara a expressão direcionada dentro de um determinado tecido vegetal. Tais promotores tecido-preferenciais incluem, mas não estão limitados a, promotores folha-preferenciais , promotores raízes-preferenciais, promotores sementes-preferenciais, promotores caule-preferenciais. Alguns exemplos de promotores tecido-preferenciais estão descritos, por exemplo, em Yamamoto et al. (1997) Plant J. 12(2):255-265; Kawamata et al. (1997) Plant Cell Physiol. 38(7):792-803; Hansen et al. (1997) Mol. Gen Genet. 254(3):337-343; Russell et al. (1997) Transgenic Res. 6(2): 157-168; Rinehart et al. (1996) Plant Physiol. 1 12(3): 1331-1341; Van Camp et al. (1996) Plant Physiol. 112(2):525-535;Canevascini et al. (1996) Plant Physiol. 1 12(2):513- 524; Yamamoto et al. (1994) Plant Cell Physiol. 35(5):773-778; Lam (1994) Results Probl. Cell Differ. 20:181196; Orozco et al. (1993) Plant Mol Biol. 23(6): 1 129-1138; Matsuoka et al. (1993) Voc Natl. Acad. ScL USA 90(20):9586-9590; e Guevara-Garcia et al. (1993) Plant J 4(3):495-505.. Os promotores podem ser modificados, se necessário, para a expressão fraca.

[0228] Em um exemplo de realização preferido, o promotor é um promotor específico da raiz (raiz-específico).

[0229] Em um exemplo de realização particularmente preferido, o promotor compreende a sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 32.

[0230] Em alguns exemplos de realização, os ácidos nucleicos de interesse podem ser orientados para o cloroplasto para a expressão. Desta maneira, quando o ácido nucleico de interesse não é inserido diretamente no cloroplasto, o vetor de expressão irá conter, adicionalmente, uma sequência de direcionamento para o cloroplasto que compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica um peptídeo de trânsito para o cloroplasto para direcionar o produto do gene de interesse para os cloroplastos. Tais peptídeos de transito são conhecidos no estado da técnica. Com relação às sequências de direcionamento para os cloroplastos, “operacionalmente ligado” significa que a sequência de ácido nucleico que codifica um peptídeo de trânsito (ou seja, a sequência de direcionamento para o cloroplasto) está ligada à sequencia codificante desejada da invenção de modo a que as duas sequências são contíguas e estão no mesmo quadro de leitura. Vide, por exemplo, Von Heijne et al. (1991) Plant MoI. Biol. Rep. 9: 104-126; Clark et al. (1989) J. Biol. Chem. 264:17544-17550; Della-Cioppa et al. (1987) Plant Physiol. 84:965-968; Romer et al. (1993) Biochem. Biophys. Res. Commun. 196:1414-1421; e Shah et al. (1986) Science 233:478-481. Por exemplo, um peptídeo de trânsito para o cloroplasto conhecido no estado da técnica pode ser fundido com a sequência de aminoácidos de um polipeptídeo TriA da invenção, ligando operacionalmente uma sequência de direcionamento para o cloroplasto à extremidade 5' de uma sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo TriA.

[0231] As sequências de direcionamento para o cloroplasto são conhecidas no estado da técnica e incluem a subunidade pequena do cloroplasto da ribulose-1,5-bifosfato-carboxilase (Rubisco) (de Castro Silva Filho et al. (1996) Plant MoI. Biol. 30:769-780; Schnell et al. (1991) J. Biol. Chem. 266 (5) :3335-3342); EPSPS (Archer et al. (1990) J. Bioenerg. Biomemb. 22 (6) :789- 810); triptofano-sintase (Zhao et al. (1995) J. Biol. Chem. 270 (11) :6081-6087); plastocianina (Lawrence et al. (1997) J. Biol. Chem. 272 (33) :20357-20363); corismato sintase (Schmidt et al. (1993) J. Biol. Chem. 268 (36) :27447-27457); e proteína de ligação a/b da clorofila de captura de luz (LHBP) (Lamppa et al. (1988) J. Biol. Chem. 263: 14996-14999). Vide também, Von Heijne et al. (1991) Plant MoI. Biol. Rep. 9: 104- 126; Clark et al. (1989) J. Biol. Chem. 264:1754417550; Della-Cioppa et al. (1987) Plant Physiol. 84:965-968; Romer et al. (1993) Biochem. Biophys. Res. Commun. 196: 1414-1421; e Shah et al. (1986) Science 233:478-481.

[0232] Os métodos para a transformação de cloroplasto são conhecidos no estado da técnica. Vide, por exemplo, Svab et al. (1990) Proc. Natl. Acad. ScL USA 87:8526-8530; Svab and Maliga (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:913-917; Svab e Maliga (1993) EMBO J. 12:601-606. O método baseia-se na entrega por arma de partículas de DNA contendo um marcador de seleção e direcionamento do DNA para o genoma do plastidial através da recombinação homóloga. Além disso, a transformação plastidial pode ser realizada pela transativação de um transgene de origem plastidial silencioso pela expressão tecido-preferencial de uma RNA polimerase codificada no núcleo e direcionada para o plastídio. Tal sistema foi divulgado em McBride et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:73017305.

[0233] Os ácidos nucleicos de interesse a serem direcionados para o cloroplasto podem ser otimizados para a expressão no cloroplasto para explicar as diferenças na utilização preferencial de códon entre o núcleo da planta e esta organela. Desta maneira, os ácidos nucleicos de interesse podem ser sintetizados usando códons preferenciais para cloroplastos. Vide, por exemplo, a Patente US 5.380.831, incorporada ao presente pela referência.

[0234] Diversos vetores de transformação de plantas e métodos para a transformação de plantas estão disponíveis. Vide, por exemplo, An, G. et al. (1986) Plant PysioL, 81 :301-305; Fry, J., et al. (1987) Plant Cell Rep. 6:321325; Block, M. (1988) Theor. Appl. Genet .16: 161 -1 1 A; Hinchee, et al. (1990) Stadler. Genet. Symp.2032\2.203-2\2; Cousins, et al. (1991) Aust. J. Plant Physiol. 18:481-494; Chee, P. P. e Slightom, J. L. (1992) Gene.l l 8:255-260; Christou, et al. (1992) Trends. Biotechnol. 10:239-246; Halluin, et al. (1992) Bio/Technol. 10:309-314; Dhir, et al. (1992) Plant Physiol. 99:81-88; Casas et al. (1993) Proc. Nat. Acad Sd. USA 90: 1 1212-1 1216; Christou, P. (1993) In Vitro Cell. Dev. Biol.-Plant; 29P.119-124; Davies, et al. (1993) Plant Cell Rep. 12: 180- 183; Dong, J. A. e Mchughen, A. (1993) Plant ScL 91 : 139-148; Franklin, C. I. e Trieu, T. N. (1993) Plant. Physiol. 102: 167; Golovkin, et al. (1993) Plant ScL 90:41-52; Guo Chin ScL Bull. 38:2072-2078; Asano, et al. (1994) Plant Cell Rep. 13; Ayeres N. M. e Park, W. D. (1994) Crit. Rev. Plant. Sci. 13:219-239; Barcelo, et al. (1994) Plant. J. 5:583-592; Becker, et al. (1994) Plant. J. 5:299-307; Borkowska et al. (1994) Acta. Physiol Plant. 16:225-230; Christou, P. (1994) Agro. Food. Ind. Hi Tech. 5: 17-27; Eapen et al. (1994) Plant Cell Rep. 13:582586; Hartman, et al. (1994) Bio-Technology 12: 919923; Ritala, et al. (1994) Plant. Mol. Biol. 24:317-325; e Wan, Y. C. e Lemaux, P. G. (1994) Plant Physiol. 104:3748.

[0235] Em alguns exemplos de realização, os métodos da invenção envolvem a introdução de uma construção de polinucleotídeo em uma planta. Pelo termo “introdução” destina-se a apresentar a construção polinucleotídica à planta de tal maneira que a construção tem acesso ao interior de uma célula vegetal. Os métodos da presente invenção não dependem de um método específico de introdução de uma construção polinucleotídica em uma planta, apenas que a construção polinucleotídica tenha acesso ao interior de pelo menos uma célula vegetal. Os métodos para a introdução de construções de polinucleotídeos em plantas são bem conhecidos no estado da técnica e incluem, mas não estão limitados a, métodos de transformação estável, métodos de transformação transitória, e métodos mediados por vírus. O termo “introdução” termo ou “transformação” coforme referido no presente significa também a transferência de um polinucleotídeo exógeno em uma célula hospedeira, independentemente do método utilizado para a transferência. O tecido vegetal capaz de submetido a propagação clonal subsequente, seja por organogênese ou embriogênese, pode ser transformado com uma construção genética da presente invenção e uma planta inteira é regenerada do mesmo. O tecido específico escolhido irá variar dependendo dos sistemas de propagação clonal disponível para a, e melhor adaptada à espécie específica que está sendo transformada. Exemplos de tecidos alvo incluem discos de folhas, pólen, embriões, cotilédones, hipocótilos, megagametófitos, tecido de calos, tecido meristemático existente (por exemplo, meristemas apicais, gemas axilares e meristemas de raiz), e tecido de meristema induzido (por exemplo, meristema cotilédone e meristema hipocótilo). O polinucleotídeo pode ser introduzido de maneira transitória ou estável em uma célula hospedeira e pode ser mantido não integrado, por exemplo, como um plasmídeo. Alternativamente, ele pode ser integrado ao genoma do hospedeiro. A célula vegetal transformada resultante pode então ser usada para regenerar uma planta transformada de uma forma conhecida para os técnicos do assunto.

[0236] Por “transformação estável” pretende-se dizer que a construção polinucleotídica introduzida em uma planta se integra ao genoma da planta e é capaz de ser herdada pela descendente da mesma. Por “transformação transitória” pretende-se dizer que uma construção polinucleotídica introduzida em uma planta não se integra ao genoma da planta.

[0237] Para a transformação de plantas e células vegetais, as sequências de nucleotídeos da invenção estão inseridas utilizando técnicas padrão em qualquer vetor conhecido no estado da técnica que é adequado para a expressão das sequências nucleotídicas em uma célula vegetal ou planta. A seleção do vetor depende da técnica de transformação preferida e da espécie de planta alvo a ser transformada. Em um exemplo de realização da invenção, a sequência de nucleotídeos codificante está operacionalmente ligada a um promotor vegetal, por exemplo, um promotor conhecido no estado da técnica para a expressão de alto nível em uma célula vegetal, e esta construção é então introduzida em uma célula vegetal que é susceptível a herbicidas; e uma planta transformada é regenerada. Em alguns exemplos de realização, a planta transformada é tolerante à exposição a um nível de herbicidas que mataria ou que poderia ferir de maneira significativa uma planta regenerada a partir de uma célula não transformada. Este método pode ser aplicado a qualquer espécie de planta ou culturas.

[0238] As metodologias para a construção de vetores de expressão de plantas e introdução de ácidos nucleicos exógenos em plantas são geralmente conhecidas no estado da técnica. Por exemplo, o DNA exógeno (estranho) pode ser introduzido em plantas, utilizando vetores plasmidiais (Ti) indutores de tumores. Outros métodos utilizados para a entrega de DNA exógeno envolvem a utilização de transformação de protoplastos mediada por PEG, eletroporação, microinjeção capilar, e biobalística ou bombardeamento de microprojéteis para absorção direta de DNA. Tais métodos são conhecidos no estado da técnica. (Patente US 5.405.765 para Vasil et al.; Bilang et al. (1991) Gene 100: 247-250; Scheid et al., (1991) MoL Gen. Genet., 228: 104- 1 12; Guerche et al., (1987) Plant Science 52: 1 1 1 -1 16; Neuhause et al., (1987) Theor. Appl Genet. 75: 30-36; Klein et al., (1987) Nature 327: 70-73; Howell et al., (1980) Science 208: 1265; Horsch et al., (1985) Science 227: 1229-1231 ; DeBlock et al., (1989) Plant Physiology 91 : 694-701 ; Methods for Plant Molecular Biology (Weissbach & Weissbach, eds.) Academic Press, Inc. (1988) e Methods in Plant Molecular Biology (Schuler e Zielinski, eds.) Academic Press, Inc. (1989).

[0239] Outros métodos adequados para a introdução de sequências nucleotídicas em células vegetais incluem a microinjeção, tal como descrito, por exemplo, por Crossway et al.(1986) Biotechniques 4: 320-334, eletroporação, conforme descrito, por exemplo, por Riggs et al. (1986) Proc. Natl. Acad. ScL USA 83:5602- 5606, transformação mediada por Agrobacterium tal como descrito, por exemplo, por Townsend et al., Patente US 5.563.055, Zhao et al., Patente US 5.981.840, transferência direta de gene tal como descrito, por exemplo, por Paszkowski et al. (1984) EMBO J. 3:2717-2722, e aceleração de partícula balística tal como descrito, por exemplo, pelas Patentes US 4.945.050; US 5.879.918; US 5.886.244; e US 5.932.782; Tomes et al. (1995) “Direct DNA Transfer into Intact Plant Cells via Microprojectile Bombardment” em Plant Cell, Tissue, and Organ Culture: Fundamental Methods, ed. Gamborg and Phillips (Springer- Verlag, Berlin); McCabe et al. (1988) Biotechnology 6:923-926); e transformação Led (WO 00/28058). Vide também, Weissinger et al., (1988) Ann. Rev. Genet. 22:421-477; Sanford et al, (1987) Particulate Science and Technology 5:27-37 (cebola); Christou et al, (1988) Plant Physiol. 87:671-674 (soja); McCabe et al., (1988) Bio/Technology 6:923-926 (soja); Finer e McMullen (1991) In Vitro Cell Dev. Biol. 27P: 175-182 (soja); Singh et al, (1998) Theor. Appl. Genet. 96:319-324 (soja); Datta et al., (1990) Biotechnology 8:736-740 (rice); Klein et al., (1988) PNAS, 85:4305-4309 (milho); Klein et al., (1988) Biotechnology 6:559-563 (milho); Patentes US. US 5.240.855; US 5.322.783; e US 5.324.646; Tomes et al., (1995) “Direct DNA Transfer into Intact Plant Cells via Microprojectile Bombardment,” em Plant Cell, Tissue, and Organ Culture: Fundamental Methods, ed. Gamborg (Springer- Verlag, Berlin) (milho); Klein et al., (1988) Plant Physiol. 91 :440-444 (milho); Fromm et al., (1990) Biotechnology 8:833-839 (milho); Hooykaas-Van Slogteren et al., (1984) Nature (London) 31 1 :763-764; Bowen et al, Patente US 5.736.369 (cereais); Bytebier et al, (1987) PNAS 84:5345- 5349 (Liliaceae); De Wet et al., (1985) em The Experimental Manipulation of Ovule Tissues, ed. Chapman et al, (Longman, Nova Iorque), págs. 197-209 (pólen); Kaeppler et al., (1990) Plant Cell Reports 9:415-418 e Kaeppler et al., (1992) Theor. Apph Genet. 84:560-566 (transformação mediada por capilar); D'Halluin et al., (1992) Plant Cell 4: 1495-1505 (eletroporação); Li et al., (1993) Plant Cell Reports 12:250- 255 e Christou e Ford (1995) Annals of Botany 75:407-413 (arroz); Osjoda et al, (1996) Nature Biotechnology 14:745750 (milho via Agrobacterium tumefaciens); cada um deles incorporado ao presente pela referência.

[0240] As plantas transgênicas, incluindo plantas de cultivo transgênicas, são preferencialmente produzidas por meio da transformação mediada por Agrobacterium. Um método de transformação vantajoso é a transformação in planta. Para este fim, é possível, por exemplo, permitir que o Agrobacterium atue sobre as sementes de plantas, ou que o Agrobacterium seja inoculado no meristema de plantas. Provou ser particularmente vantajoso de acordo com a invenção permitir que uma suspensão de Agrobacterium transformados atue na planta intacta ou, pelo menos, sobre um primórdio floral. A planta é cultivada em seguida até que as sementes da planta tratada sejam obtidas (Clough e Bent, Plant J. (1998) 16, 735-743). Os métodos para a transformação de arroz mediada por Agrobacterium incluem métodos bem conhecidos para a transformação do arroz, tais como aqueles descritos em qualquer um dos seguintes: pedido de patente EP 1198985 A1, Aldemita e Hodges (Planta 199: 612-617, 1996); Chan et al .(Plant Mol. Biol 22 (3): 491-506, 1993), Hiei et al. (Plant J 6 (2): 271-282, 1994), cujas descrições são incorporadas ao presente pela referência como se integralmente expostas. No caso da transformação de milho, o método preferido é tal como o descrito em Ishida et al. (Nat. Biotechnol 14 (6): 745-50, 1996) ou Frame et al. (Plant Physiol 129 (1): 13-22, 2002), cujas descrições são incorporadas ao presente pela referência como se fossem integralmente expostas. Os referidos métodos são adicionalmente descritos a título de exemplo, em B. Jenes et al, Techniques for Gene Transfer, Em: Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, eds. S.D. Kung e R. Wu, Academic Press (1993) 128-143 e em Potrykus Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42 (1991) 205-225). O ácido nucleico ou construção a ser expressa é preferencialmente clonado em um vetor, que é adequado para a transformação do Agrobacterium tumefaciens, por exemplo, o pBIN19 (Bevan et al., Nucl.Acids Res. 12 (1984) 8711). A agrobacteria transformada por tal vetor pode então ser utilizada de maneira conhecida para a transformação de plantas, tal como as plantas utilizadas como modelo, como a Arabidopsis (a Arabidopsis thaliana está dentro do escopo da presente invenção não sendo considerada como uma cultivar), ou cultivares como, a título de exemplo, plantas de tabaco, por exemplo, mergulhando as folhas machucadas ou folhas cortadas em uma solução com Agrobacterium e em seguida a cultivando-as em meios adequados. A transformação de plantas por meio do Agrobacterium tumefaciens é descrita, por exemplo, por Hofgen e Willmitzer em Nucl.Acid Res. (1988) 16, 9877 ou é conhecido, inter alia, a partir de F.F. White, Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; Em: Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, eds. S.D. Kung e R. Wu, Academic Press, 1993, págs. 15-38.

[0241] Um método de transformação conhecido pelos especialistas na técnica é a imersão de uma planta em uma solução de Agrobacterium, em que o Agrobacterium contém o ácido nucleico TriA, seguido pelo melhoramento dos gametas transformados. A transformação de plantas mediada por Agrobacterium pode ser realizada utilizando, por exemplo, as cepas GV3101 (pMP90) (Koncz e Schell, 1986, Mol.Gen. Genet. 204:383-396) ou LBA4404 (Clontech) de Agrobacterium tumefaciens. A transformação pode ser realizada por técnicas de transformação e regeneração normais (Deblaere et al., 1994, Nucl. Acids. Res. 13:4777-4788; Gelvin, Stanton B. e Schilperoort, Robert A, Plant Molecular Biology Manual, 2a Ed. - Dordrecht : Kluwer Academic Publ., 1995. - in Sect., Ringbuc Zentrale Signatur: BT11-P ISBN 0-7923-2731-4; Glick, Bernard R. & Thompson, John E., Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Boca Raton : CRC Press, 1993 360 S., ISBN 0-8493-5164-2). Por exemplo, a semente de colza pode ser transformada pela transformação de cotilédones ou hipocótilo (Moloney et al, 1989, Plant Cell Report 8:238-242;. De Block et al, 1989, Plant Physiol. 91:694-701). O uso de antibióticos para a seleção de Agrobacterium e plantas depende do vetor binário e da cepa de Agrobacterium utilizados para a transformação. A seleção da colza é normalmente realizada utilizando a canamicina como marcador de seleção da planta. A transferência de genes mediada pelo Agrobacterium para o linho pode ser realizada utilizando, por exemplo, uma técnica descrita por Mlynarova et al., 1994, Plant Cell Report 13:282-285. Adicionalmente, a transformação da soja pode ser realizada utilizando, por exemplo, uma técnica descrita na patente Europeia 0424 047, Patente US 5.322.783, Patente Europeia 0397 687, Patente US 5.376.543, ou Patente US 5.169.770. A transformação do milho pode ser obtida pelo bombardeamento de partículas, captação de DNA mediada pelo polietilenoglicol, ou através da técnica de fibras de carboneto de silício. (Vide, por exemplo, Freeling e Walbot “The maize handbook” Springer Verlag: Nova Iorque (1993) ISBN 3-540-97826-7). Um exemplo específico da transformação do milho é encontrada na Patente US 5.990.387, e um exemplo específico de transformação do trigo pode ser encontrada no Pedido PCT WO 93/07256.

[0242] Em alguns exemplos de realização, os polinucleotídeos da presente invenção podem ser introduzidos em plantas pelo contacto da planta com um vírus ou ácidos nucleicos virais. Geralmente, tais métodos envolvem a incorporação de uma construção de polinucleotídeo da presente invenção em uma molécula de RNA ou DNA viral. Reconhece-se que os polipeptídeos da invenção podem ser inicialmente sintetizados como parte de uma poliproteína viral, o que mais tarde pode ser processado pela proteólise in vivo ou in vitro para produzir o polipeptídeo recombinante desejado. Adicionalmente, sabe-se que promotores da invenção também abrangem promotores utilizados para a transcrição por RNA polimerases virais. Métodos para a introdução de construções de polinucleotídeos em plantas e a expressão de uma proteína ali codificada, envolvendo moléculas de RNA ou DNA virais, são bem conhecidos no estado da técnica. Vide, por exemplo, as Patentes US 5.889.191; US 5.889.190; US 5.866.785; US 5.589.367 e US 5.316.931; incorporadas ao presente como referência. As células que foram transformadas podem ser crescidas em plantas, em de acordo com as formas convencionais. Vide, por exemplo, McCormick et al. (1986) Plant Cell Reports 5:81-84. Estas plantas podem então ser cultivadas, e ou polinizadas com a mesma cepa transformada ou com cepas diferentes, e o híbrido resultante possuindo a expressão constitutiva da característica fenotípica desejada é identificado. Duas ou mais gerações podem ser desenvolvidas para assegurar que a expressão das características fenotípicas desejadas seja mantida e herdada de forma estável, e então as sementes colhidas para assegurar que a expressão das características fenotípicas desejadas foram alcançadas.

[0243] A presente invenção pode ser utilizada para a transformação de qualquer espécie de planta, incluindo, mas não se limitando a, monocotiledôneas e dicotiledôneas. Exemplos de espécies de plantas de interesse incluem, mas não estão limitadas a, milho (Zea mays), Brassica sp. (por exemplo, B. napus, B. rapa, B. juncea), em particular as espécies de Brassica úteis como fontes de óleo de sementes, alfafa (Medicago sativa), arroz (Oryza sativa), centeio (Secale cereale), sorgo (Sorghum bicolor, Sorghum vulgare), milhete, por exemplo, milhete-peróla (Pennisetum glaucum), painço (Panicum miliaceum), milho-painço (Setaria italica), Capim-pé-de-galinha- gigante (Eleusine coracana)), girassol (Helianthus Anu), Açafrão-bastardo (Carthamus tinctorius), trigo (Triticum aestivum, T. turgidum ssp. durum), soja (Glycine max), tabaco (Nicotiana tabacum), batata (Solarium tuberosum), amendoim (Arachis hypogaea), algodão (Gossypium barbadense, Gossypium hirsutum), batata doce (Ipomoea batatus), mandioca (Manihot esculenta), café (Coffea spp.), coco (Cocos nucifera), abacaxi (Ananas comosus), árvores de citrinos (Citrus spp.), cacau (Theobroma cacao), chá-da-índia (Camellia sinensis), banana (Musa spp .), abacate (Persea americana), figo (Ficus casica), goiaba (Psidium guajava), manga (Mangifera indica), azeitona (Olea europaea),mamão (Carica papaya), caju (Anacardium occidentale), macadâmia (Macadamia integrifolia) , amêndoa (Prunus amygdalus), beterraba (Beta vulgaris), cana-de-açúcar (Saccharum spp.), aveia, cevada, vegetais, plantas ornamentais e coníferas. Preferencialmente, as plantas da presente invenção são plantas de cultura (por exemplo, girassol, Brassica sp., algodão, açúcar, beterraba, soja, amendoim, alfalfa, cártamo, tabaco, milho, arroz, trigo, centeio, cevada, triticale, sorgo, painço, etc).

[0244] Além da transformação de células somáticas, que depois têm de ser regeneradas em plantas intactas, também é possível transformar células de meristemas de plantas e, em particular, aquelas células que se desenvolvem em gametas. Neste caso, os gametas transformados acompanham o desenvolvimento natural das plantas, dando origem a plantas transgênicas. Assim, por exemplo, as sementes de Arabidopsis são tratadas com o Agrobacterium e são obtidas sementes a partir de plantas em desenvolvimento nas quais certa porção está transformada e, desse modo, são transgênicas [Feldman, K.A. e Marks, M.D. (1987) Mol Gen Genet 208:274-289; Feldmann K. (1992). Em: C Koncz, N-H Chua e J Shell, eds, Methods in Arabidopsis Research. Word Scientific, Singapura, págs. 274-289]. Os métodos alternativos são baseados na remoção repetida das inflorescências e incubação do sítio de excisão no centro da roseta com o Agrobacterium transformado, por de modo que as sementes transformadas podem igualmente ser obtidas em um momento posterior (Chang (1994). Plant J. 5: 551-558; Katavic (1994). Mol Gen Genet, 245: 363-370). No entanto, um método particularmente eficaz é o método de infiltração à vácuo com as suas modificações tal como o método de mergulho floral (floral dip). No caso de infiltração a vácuo da Arabidopsis, a planta inteira sob pressão reduzida é tratada com uma suspensão de Agrobacterium [Bechthold, N. (1993).CR Acad Sci Paris Life Sci., 316: 1194-1199], enquanto que no caso do método “floral dip” o tecido floral em desenvolvimento é brevemente incubado com uma suspensão de Agrobacterium tratada com surfactante [Clough, S.J. e Bent A.F. (1998) Plant J. 16, 735-743]. Certaproporção de sementes transgênicas é colhida em ambos os casos, e estas sementes podem ser distinguidas a partir de sementes não transgênicas por meio do crescimento sob as condições seletivas descritas acima. Além disso, a transformação estável de plastídios é vantajosa, pois os plastídios são herdados maternalmente o que na maioria das culturas reduz ou elimina o risco de fluxo de transgene através do pólen. A transformação do genoma do cloroplasto é geralmente conseguida através de um processo que foi mostrado esquematicamente em Klaus et al., 2004 [Nature Biotechnology 22 (2), 225-229]. Resumidamente as sequências a serem transformadas são clonadas juntamente com um gene marcador selecionável entre as sequências flanqueadoras homólogas ao genoma do cloroplasto. Estas sequências flanqueadoras homólogas direcionam a integração sítio-específica para o plastoma. A transformação plastidial foi descrita para diversas espécies diferentes de plantas e uma visão geral é dada em Bock (2001) Transgenic plastids in basic research and plant biotechnology. J Mol Biol. 2001 21; 312 (3):425-38 ou Maliga, P. (2003) Progress towards commercialization of plastid transformation technology. Trends Biotechnol. 21, 20-28. Um progresso biotecnológico adicional foi recentemente relatado na forma de marcador livre plastídios transformantes, os quais podem ser produzidos por um gene marcador cointegrado de maneira transitória (Klaus et al., 2004, Nature Biotechnology 22 (2), 225-229). As células vegetais geneticamente modificadas podem ser regeneradas por todos os métodos com os quais o trabalhador hábil está familiarizado. Métodos adequados podem ser encontrados nas publicações mencionadas acima por S.D. Kung e R. Wu, Potrykus ou Hofgen e Willmitzer.

[0245] Geralmente, após a transformação, as células vegetais ou agrupamentos de células são selecionados quanto à presença de um ou mais marcadores, que são codificados por genes que podem ser expressos em plantas cotransferidos com o gene de interesse, e em seguida o material transformado é regenerado em uma planta inteira. Para selecionar as plantas transformadas, o material vegetal obtido na transformação é, em geral, submetido a condições seletivas de modo que as plantas transformadas podem ser distinguidas a partir de plantas não transformadas. Por exemplo, as sementes obtidas da maneira que foi descrita acima podem ser plantadas e, após um período inicial de crescimento, submetidas a uma seleção adequada por pulverização. Outra possibilidade consiste em cultivar as sementes, se for o caso, após a esterilização, em placas de ágar utilizando um agente de seleção adequado, de modo que apenas as sementes transformadas podem crescer em plantas. Alternativamente, as plantas transformadas são pesquisadas quanto à presença de um marcador selecionável, conforme descritos acima.

[0246] Após a transferência de DNA e regeneração, as plantas putativamente transformadas podem também ser avaliadas, por exemplo, usando a análise de Southern, para a avaliação da presença do gene de interesse, do número de cópias e/ou organização genômica. Alternativamente ou adicionalmente, os níveis de expressão do DNA recentemente introduzido podem ser monitorados por meio da análise de Northern e/ou Western, sendo ambas as técnicas bem conhecidas pelos técnicos especialistas no assunto.

[0247] As plantas transformadas geradas podem ser propagadas por uma variedade de meios, como por propagação clonal ou técnicas clássicas de reprodução. Por exemplo, uma primeira geração (ou T1) da planta transformada pode ser autofecundada e a segunda geração homozigótica (ou T2) transformante selecionada, e as plantas T2 podem ser adicionalmente propagadas através de técnicas de melhoramento clássico. Os organismos transformados gerados podem assumir uma variedade de formas. Por exemplo, eles podem ser quimeras de células transformadas e células não transformadas; transformantes clonais (por exemplo, todas as células transformadas contêm o cassete de expressão); enxertos de tecidos transformados e não transformados (por exemplo, nas plantas, um porta-enxerto (rootstock) transformado enxertado em um enxerto (garfo) não transformado).

[0248] Preferencialmente, a expressão do ácido nucleico em plantas resulta no aumento da resistência das plantas a herbicidas, em comparação com uma variedade de planta tipo selvagem.

[0249] Em outro exemplo de realização, a invenção refere-se a uma planta que compreende uma célula vegetal de acordo com a presente invenção, em que a expressão do ácido nucleico na planta resulta em um aumento da resistência da planta ao herbicida, em comparação com uma variedade da planta tipo selvagem.

[0250] As plantas descritas na presente invenção podem ser tanto plantas de cultivo transgênicas como não transgênicas.

[0251] Além da definição geral fornecida acima, as expressões “transgênico” “transgene”, ou “recombinante” referem-se a uma sequência de ácido nucleico, cassete de expressão, construção gênica ou vetor compreendendo a sequência de ácido nucleico ou um organismo transformados com as sequências de ácidos nucleicos, cassetes ou vetores de expressão de acordo com a invenção, e todas as construções resultantes de métodos recombinantes, em que (a) as sequências de ácidos nucleicos que codificam proteínas úteis nos métodos da presente invenção, ou (b) sequência(s) de controle genético que está(ão) operacionalmente ligada(s) à sequência de ácido nucleico de acordo com a invenção, por exemplo, um promotor; ou (c) (a) e (b); não estão localizados no seu meio genético natural ou foram modificados por meio de métodos recombinantes, sendo possível que a modificação ocorra sob a forma de, por exemplo, uma substituição, adição, deleção, inversão ou inserção de um ou mais resíduos de nucleotídeos, a fim de permitir a expressão da TriA mutada da presente invenção. O ambiente genético natural é entendido como significando o locus genômico natural ou locus cromossômico na planta original ou presença em uma biblioteca genômica. No caso de uma biblioteca genômica, o ambiente genético natural da sequência de ácido nucleico é preferencialmente mantido, pelo menos em parte. O ambiente flanqueia a sequência de ácido nucleico pelo menos em um lado e tem um comprimento de sequência de pelo menos 50 bp, preferivelmente pelo menos 500 bp, muito preferivelmente pelo menos 1000 bp, muito preferivelmente pelo menos 5000 bp. A cassete de expressão de ocorrência natural - por exemplo a combinação de ocorrência natural do promotor natural das sequências de ácidos nucleicos com a sequência de ácido nucleico correspondente que codifica um polipeptídeo útil nos métodos da presente invenção, tal como definido acima - torna-se uma cassete de expressão transgênico quando este cassete de expressão é modificado por métodos não naturais, sintéticos (“artificiais”) tais como, por exemplo, o tratamento mutagênico. Os métodos adequados são descritos, por exemplo, na Patente EUA 5.565.350 ou pedido WO 00/15815.

[0252] Uma planta transgênica, para os propósitos da presente invenção é, portanto, entendida tal exemplificado acima, que os ácidos nucleicos da invenção não estão em seu locus natural no genoma da referida planta, sendo possível que os ácidos nucleicos sejam expressos de maneira heteróloga ou homóloga. Entretanto, conforme mencionado, transgênico também significa que, embora o ácido nucleico da invenção ou que é utilizado no método inventivo possa estar em sua posição natural no genoma de uma planta, a sequência foi alterada em relação à sequência natural, e/ou as sequências reguladoras foram modificadas em relação as sequências naturais. Transgênico é preferencialmente entendido como a expressão dos ácidos nucleicos de acordo com a invenção em um locus não natural no genoma, ou seja, ocorre a expressão homóloga ou, preferencialmente, a expressão heteróloga dos ácidos nucleicos. As plantas transgênicas preferidas são mencionadas no presente documento. Além disso, o termo “transgênico” refere-se a qualquer planta, célula vegetal, calos, tecidos vegetal, ou parte de planta, que contém a totalidade ou parte de pelo menos um polinucleotídeo recombinante. Em muitos casos, a totalidade ou parte do polinucleotídeo recombinante está integrada estavelmente em um cromossomo ou elemento extracromossômico estável, de modo que é transmitido para as gerações sucessivas. Para os propósitos da invenção, o termo “polinucleotídeo recombinante” refere-se a um polinucleotídeo que foi alterado, rearranjado ou modificado por engenharia genética. Exemplos incluem qualquer polinucleotídeo clonado, ou polinucleotídeos que estão ligados ou unidos às sequências heterólogas. O termo “recombinante” não se refere a alterações de polinucleotídeos que resultam de eventos que ocorrem naturalmente, tais como mutações espontâneas, ou mutagênese não espontânea seguida pela reprodução seletiva.

[0253] “Alelos” ou “variantes alélicos” são formas alternativas de um dado gene, localizadas na mesma posição cromossômica. Os variantes alélicos abrangem polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs), bem como pequenos polimorfismos de inserção/deleção (INDELs). O tamanho dos INDELs é normalmente inferior a 100 pb. SNPs e INDELs formam o maior conjunto de sequências variantes em cepas polimórficas que ocorrem naturalmente na maioria dos organismos.

[0254] O termo “variedade” refere-se a um grupo de plantas dentro de uma espécie definida que partilha um conjunto comum de características ou traços aceitos pelos peritos na técnica como sendo suficientes para distinguir uma variedade de cultivares ou outra cultivar ou variedade. Não há nenhuma implicação em qualquer termo que todas as plantas de uma determinada cultivar ou variedade será geneticamente idêntica tanto em relação a todos os genes quanto no nível molecular, ou que qualquer planta será homozigótica em todos os loci. Uma cultivar ou variedade é considerada “linhagem geneticamente pura” de um traço particular se, quando a cultivar ou variedade de linhagem geneticamente pura é autopolinizada, todos os descendentes contém o traço. Os termos “linhagem de cruzamento” ou “linhagem” refere-se a um grupo de plantas dentro de uma cultivar definida que partilha um conjunto de características ou traços comuns aceitos pelos peritos na técnica como sendo suficientes para distinguir uma linhagem de cruzamento ou linhagem de outra linhagem de cruzamento ou linhagem. Não há nenhuma implicação em qualquer termo que todas as plantas de uma linhagem de cruzamento ou linhagem será geneticamente idêntica tanto em relação a todos os genes quanto no nível molecular, ou que qualquer planta será homozigótica em todos os loci. Uma linhagem de cruzamento ou linhagem é considerada uma “linhagem geneticamente pura” de um traço particular se, quando a linhagem de cruzamento ou linhagem geneticamente pura é autopolinizada, todos os descendentes contém o traço. Na presente invenção, a característica resulta de uma mutação em um gene TriA de uma planta ou semente.

[0255] As plantas resistentes ao herbicida da invenção que compreendem os polinucleotídeos que codificam os polipeptídeos TriA mutados também encontram uso em métodos para aumentar a resistência ao herbicida de uma planta através do melhoramento (cruzamento) de plantas convencional que envolve a reprodução sexuada. Os métodos compreendem o cruzamento de uma primeira planta que é uma planta resistente ao herbicida da presente invenção com uma segunda planta que pode ser ou não resistente ao mesmo herbicida ou herbicidas como a primeira planta; ou pode ser resistente a um herbicida ou herbicidas diferente daquele da primeira planta. A segunda planta pode ser qualquer planta que é capaz de produzir plantas descendentes viáveis (ou seja, sementes), quando cruzada com a primeira planta. Normalmente, mas não necessariamente, a primeira e segunda plantas são da mesma espécie. Os métodos podem opcionalmente envolver a seleção de progênies vegetais que compreendem os polipeptídeos TriA mutados da primeira planta e a resistência ao herbicida característica da segunda planta. As plantas descendentes (progênie) produzidas por este método da presente invenção têm uma maior resistência a um herbicida quando comparada com a primeira ou segunda planta ou ambas. Quando a primeira e a segunda planta são resistentes a diferentes herbicidas, as plantas descendentes terão as características de tolerância ao herbicida combinadas da primeira e segunda planta. Os métodos da invenção podem envolver ainda uma ou mais gerações de retrocruzamento das plantas descendentes do primeiro cruzamento com uma planta da mesma linhagem ou genótipo, tal como a primeira ou segunda planta. Alternativamente, a progênie do primeiro cruzamento ou qualquer cruzamento subsequente pode ser cruzada com uma terceira planta que é de uma linhagem ou genótipo diferente do que a primeira ou a segunda planta.

[0256] A presente invenção também provê plantas, órgãos de plantas, tecidos vegetais, células vegetais, sementes, e células hospedeiras não humanas que são transformadas com a pelo menos uma molécula de polinucleotídeo, cassete de expressão ou vetor de transformação da invenção. Tais plantas transformadas, órgãos de plantas, tecidos vegetais, células vegetais, sementes, e células hospedeiras não humanas têm tolerância ou resistência aumentada a pelo menos um herbicida, em níveis de herbicida que matam ou inibem o crescimento de uma planta, tecido vegetal, célula vegetal ou célula hospedeira não humana não transformados, respectivamente. Preferencialmente, as plantas, tecidos vegetais, células vegetais e sementes transformadas da presente invenção são da cultivar Arabidopsis thaliana.

[0257] Em outro exemplo de realização, a invenção refere-se a uma semente produzida por uma planta transgênica compreendendo uma célula vegetal da presente invenção, em que a semente é uma variedade geneticamente pura da semente para um aumento da resistência a um herbicida, em comparação com uma variedade tipo selvagem da semente.

[0258] Em outros aspectos, as plantas tolerantes a herbicidas da presente invenção podem ser utilizadas como linhagens doadoras da característica de tolerância a herbicida para o desenvolvimento de doadores, como por melhoramento vegetal tradicional, para produzir outra variedade e/ou cultura de híbridos contendo tais características ou traços. Todas essas variedades ou híbridas resultantes, contendo a característica ancestral de tolerância a herbicidas podem ser referidas na presente divulgação como descendência ou descendentes da linhagem tolerante aos herbicidas.

[0259] Em outros exemplos de realização, a presente invenção provê um método para a produção de uma planta tolerante a herbicida. O método compreende: o cruzamento de uma primeira planta tolerante a herbicida com uma segunda planta para produzir uma progênie (planta descendente) tolerante a herbicida, em que a primeira planta e a progênie compreendem, em pelo menos algumas de suas células, um polinucleotídeo operacionalmente ligado a um promotor operável em células vegetais, em que o polinucleotídeo recombinante é eficaz nas células da primeira planta para expressar um polipeptídeo TriA tipo selvagem ou mutado codificado pelo polinucleotídeo, em que a expressão do polipeptídeo TriA tipo selvagem ou mutado confere à planta tolerância a herbicidas.

[0260] O melhoramento de planta tradicional pode ser empregado de modo que a característica de tolerância ao herbicida seja introduzida na progênie vegetal dela resultante. Em um exemplo de realização, a presente invenção proporciona um método para a produção de uma planta descendente tolerante a herbicida, cujo método compreende: o cruzamento da planta mãe (parental) com um planta tolerante a herbicida para introduzir características de tolerância a herbicida da planta tolerante a herbicida no germoplasma da progênie vegetal, em que a progênie vegetal apresenta uma tolerância aumentada ao herbicida quando comparada com a planta parental. Em outros exemplos de realização, o método compreende ainda a etapa de introgressão das características de tolerância ao herbicida por meio de técnicas tradicionais de melhoramento de plantas para a obtenção de uma planta descendente possuindo as características de tolerância ao herbicida.

[0261] Em outros aspectos, as plantas da presente invenção incluem aquelas plantas que, além de serem tolerantes a herbicidas inibidores da biossíntese de celulose, foram submetidas a novas modificações genéticas por meio de cruzamento, mutagênese ou modificações por engenharia genética, por exemplo, foram tornadas tolerantes a aplicações de herbicidas de outras classes específicas, tais como, inibidores AHAS; herbicidas de auxina; herbicidas branqueadores como inibidores da hidroxilfenilpiruvato dioxigenase (HPPD) ou inibidores da fitoeno dessaturase (PDS); inibidores EPSPS tais como glifosato; inibidores da glutamina sintetase (GS) tais como glufosinato; inibidores da biossíntese de lipídios, tais como inibidores da acetil-CoA carboxilase (ACCase); ou herbicidas oxinila (ou seja, bromoxinila ou ioxinila) como resultado de métodos convencionais de reprodução ou engenharia genética. Assim, as plantas tolerantes a herbicida da invenção podem ser tornadas resistentes a diversas classes de herbicidas através de múltiplas modificações genéticas, como a resistência ao glifosato e glufosinato ou ao glifosato e um herbicida de outra classe, tais como inibidores da HPPD, inibidores da AHAS, ou inibidores da ACCase. Estas tecnologias de resistência a herbicidas são, por exemplo, descritas em Pest Management Science (no volume, ano, página): 61, 2005, 246; 61, 2005, 258; 61, 2005, 277; 61, 2005, 269; 61, 2005, 286; 64, 2008, 326; 64, 2008, 332; Weed Science 57, 2009, 108; Australian Journal of Agricultural Research 58, 2007, 708; Science 316, 2007, 1185; e as referências aí citadas. Por exemplo, plantas tolerantes a herbicida da invenção, em alguns exemplos de realização, podem ser tolerantes aos inibidores da ACCase, tais como “dims” (por exemplo, cicloxidima, setoxidima, cletodima, ou tepraloxidina), “fops” (por exemplo, clodinafop, diclofop, fluazifop, haloxifop, ou quizalofop), e “dens” (tais como pinoxadene); aos herbicidas auxínicos, tais como a dicamba; aos inibidores de EPSPS, como o glifosato; outros inibidores da biossíntese de celulose; e inibidores de GS, tais como glufosinato.

[0262] Além destas classes de inibidores, as plantas tolerantes a herbicida da invenção também podem ser tolerantes a herbicidas de outros modos de ação, por exemplo, inibidores de clorofila/pigmento carotenoide, perturbadores da membrana celular, inibidores da fotossíntese, inibidores da divisão celular, inibidores de raiz, inibidores de brotos, e combinações dos mesmos.

[0263] Tais características de tolerância podem ser expressas, por exemplo: como proteínas HPPD tipo-selvagem ou mutantes, como proteínas PPO tipo-selvagem ou mutantes, proteínas AHASL mutantes, proteínas ACCase mutantes, proteínas EPSPS mutantes, ou proteínas da glutamina sintetase mutantes; ou como uma ariloxialcanoato dioxigenase (AAD ou DHT) mutante nativa, pura ou transgênica, haloarilnitrilase (BXN), ácido 2,2-dicloropropiônico desalogenase (DEH), glifosato-N- acetiltransferase (GAT), glifosato descarboxilase (GDC), glifosato oxidorredutase (GOX), glutationa-S-transferase (GST), fosfinotricina-acetiltransferase (PAT ou bar), ou proteínas CYP450s possuindo uma atividade herbicida degradante. As plantas tolerantes a herbicida da presente invenção podem também ser piramidadas com outras características, incluindo, mas não se limitando a, características pesticidas, como Bt Cry e outras proteínas com atividade pesticida para coleópteros, lepidópteros, nemátodos, ou outras pragas; características de nutrição ou nutracêutica, tais como teor de óleo modificado ou características de perfil óleo, alto teor de proteína ou alto teor de aminoácidos, e outros tipos de características conhecidas no estado da técnica.

[0264] Além disso, em outros exemplos de realização, também são abrangidas plantas tolerantes a herbicida cujas plantas são obtidas pelo uso de técnicas de DNA recombinante e/ou por meio de cruzamento e/ou outro modo selecionadas por tais características, capazes de sintetizar uma ou mais proteínas inseticidas, especialmente aquelas conhecidos a partir do gênero de bactérias Bacillus, particularmente do Bacillus thuringiensis, tal como as δ- endotoxinas, por exemplo, CryIA(b), CryIA(c), CryIF, CryIF(a2), CryIIA(b), CryIIIA, CryIIIB(b1) ou Cry9c; proteínas inseticidas vegetativas (VIP), por exemplo, VIP1, VIP2, VIP3 ou VIP3A; proteínas inseticidas de bactérias colonizadoras nematoides, por exemplo, Photorhabdus spp. ou Xenorhabdus spp.; toxinas produzidas por animais, tais como as toxinas do escorpião, toxinas aracnídeo, toxinas da vespa, ou outros neurotoxinas específicas de insetos; toxinas produzidas por fungos, tal como toxinas de estreptomices, lectinas de plantas, tais como as lectinas de ervilha ou de cevada; aglutininas; inibidores de proteinase, tais como os inibidores de tripsina, inibidores de serina protease, patatina, cistatina ou inibidores da papaína; proteínas inativadoras de ribossomos (RIP), como a ricina, RIP-milho, abrina, luffina, saporina ou briodina; enzimas do metabolismo de esteroides, tal como 3-hidroxiesteroide oxidase, ecdiesteroide-IDP-glicosil-transferase, oxidases de colesterol, inibidores da ecdisona ou HMG-CoA-redutase; bloqueadores de canais de íons, como bloqueadores dos canais de sódio ou cálcio; esterase hormônio juvenil; receptores de hormônio diurético (receptores helicocinina); estilbeno sintase, bibenzil sintase, quitinases ou glucanases. No contexto da presente invenção essas proteínas inseticidas ou toxinas também devem ser expressamente compreendidas como pré-toxinas, proteínas híbridas, truncada ou proteínas de outra forma modificada. As proteínas híbridas são caracterizadas por uma nova combinação de domínios de proteína, (vide, por exemplo, o documento WO 02/015701). Outros exemplos de tais toxinas ou plantas geneticamente modificadas capazes de sintetizar tais toxinas são divulgados, por exemplo, nos documentos EP-A 374 753, WO 93/007278, WO 95/34656, EP-A 427 529, EP-A 451 878, WO 03/18810 e WO 03/52073. Os métodos para a produção de tais plantas geneticamente modificadas são geralmente conhecidos pelos técnicos hábeis no assunto e são descritos, por exemplo, nas publicações mencionadas acima. Estas proteínas inseticidas contidas nas plantas geneticamente modificadas fornecem proteção para as plantas que produzem estas proteínas contra pragas prejudiciais pertencentes a todos os grupos taxonômicos de insetos artrópodes, especialmente os besouros (Coleoptera), insetos de duas asas (Diptera), mariposas (Lepidoptera) e parasitas nematoides (Nematoda).

[0265] Em alguns exemplos de realização, a expressão de uma ou mais proteínas toxinas (por exemplo, proteínas inseticidas) nas plantas tolerantes a herbicida é eficaz para o controle de organismos que incluem, por exemplo, membros das classes e ordens: Coleoptera tais como: gorgulho americano do feijão Acanthoscelides obtectus; o besouro da folha Agelastica alni; besouros (Agriotes lineatus, Agriotes obscurus, Agriotes bicolor); besouro do grão Ahasverus advena; Schafer Amphimallon solstitialis; besouro dos móveis Anobium punctatum; Anthonomus spp. (gorgulhos); besouro pigmeu Atomaria linearis; besouros do tapete (Anthrenus spp, Attagenus spp.); gorgulho do caupi Callosobruchus maculatus; besouro Carpophilus hemipterus; gorgulho seedpod do repolho Ceutorhynchus assimilis; gorgulho do caule da colza Ceutorhynchus picitarsis; larva dos fios Conoderus vespertinus e Conoderus falli; broca da banana Cosmopolites sordidus, larva da grama da Nova Zelândia Costelytra zealandica; besouro Cotinis nitida; gorgulho do girasol Cylindrocopturus adspersus; besouro da despensa Dermestes lardarius; larva das raízes do milho Diabrotica virgifera, Diabrotica virgifera virgifera, Diabrotica barberi; besouro do feijão mexicano Epilachna varivestis; broca Hylotropes bajulus; gorgulho da luzerna (alfafa) Hypera postica; Escaravelho aranha Brilhante Gibbium psylloides; besouro do fumo Lasioderma serricorne; escaravelho da batateira Leptinotarsa decemlineata; Besouros Lyctus (Lyctus spp., besouro do pólen Meligethes aeneus; cockshafer comum Melolontha melolontha; besouro aranha americano Mezium americanum; besouro aranha dourado Niptus hololeuc s; besouros de grãos Oryzaephilus surinamensis e Oryzaephilus mercator; gorgulho preto da videira Otiorhynchus sulcatus; escaravelho da mostarda Phaedon cochleariae, besouro-pulga Phyllotreta cruciferae; besouro pulga listrado Phyllotreta striolata; besouro pulga do repolho Psylliodes chrysocephala; Ptinus spp. (escaravelho-aranha); broca dos grãos menores Rhizopertha dominica; broca da ervilha Sitona lineatus; besouros arroz e do celeiro Sitophilus oryzae e Sitophilus granaries; gorgulhos vermelho das sementes de girassol Smicronyx fulvus; besouro Stegobium paniceum; bicho-da- farinha Tenebrio molitor, besouros da farinha Tribolium casteum e Tribolium confusum; besouros do armazém (Trogoderma spp.); besouro do girassol Zygogramma exclamationis; Dermaptera (tesourinhas), tais como tesourinha Europeia Forficula auricularia e o tesourinha listrado Labidura riparia; Dictyoptera tais como baratas orientais Blatta orientalis; milípede Oxidus gracilis; mosca da beterraba Pegomyia betae; Oscinella frita; mosca das frutaa (Dacus spp., Drosophila spp.); Isoptera (cupins), incluindo espécies das famílias Hodotermitidae, Kalotermitidae, Mastotermitidae, Rhinotermitidae,Serritermitidae, Termitidae, Termopsidae; praga das plantas manchadas Lygus lineolaris; pulgão do feijão preto Aphis fabae; afídeo do algodão ou melão Aphis gossypii; pulgão da maçã verde Aphis pomi; mosca Aleurocanthus spiniferus; mosca da batata-doce Bemesia tabaci; pulgão do repolho Brevicoryne brassicae; psilídeo da pêra Cacopsylla pyricola; pulgão Cryptomyzus ribis; filoxera de uva Daktulosphaira vitifoliae; psilídeo dos cítricos Diaphorina citri; cigarrinha da batata Empoasca fabae; cigarrinha do feijão Empoasca solana; cigarrinha da videira Empoasca vitis; o pulgão Eriosoma lanigerum; Eulecanium corni; afídeos da ameixa Hyalopterus arundinis; gafanhoto castanho Laodelphax striatellus; afídeo da batata Macrosiphum euphorbiae; afídeo Myzus persicae; cigarrinha do arroz Nephotettix cinticeps; cigarra marrons Nilaparvata lugens; pulgão do lúpulo Phorodon humuli; afídeo Rhopalosiphum padi; afídeo do grão Sitobion avenae; Lepidoptera, como Adoxophyes orana (traça tortrix); Archips podana (traça tortrix); Bucculatrix pyrivorella (traça da pêra); Bucculatrix thurberiella (perfurador do algodão); Bupalus piniarius (larca do pinheiro); Carpocapsa pomonella (lagartas); Chilo suppressalis (broca do arroz listrado); Choristoneura fumiferana (lagarta do álamo); Cochylis hospes (traça do girassol); Diatraea grandiosella (broca do milho do sudoeste); Eupoecilia ambiguella (traça Europeia da baga da uva); Helicoverpa armigera (lagarta do algodoeiro); Helicoverpa zea (lagarta do algodoeiro); Vires Heliothis cens (lagarta do tabaco), Homeosoma electellum (traça do girassol); Homona magnanima (traça tortrix oriental da árvore do chá); Lithocolletis blancardella (mineira marmoreada); Lymantria dispar (traça-cigana); Malacosoma neustria (falsa lagarta); Mamestra brassicae (lagarta da couve); Mamestra configurata (Lagarta Bertha); Brumata Operophtera (traça do inverno); Nubilalis Ostrinia (broca do milho européia), Panolis flammea (larvas de mariposa do pinheiro), Phyllocnistis citrella (minador-dos-citros); Pieris brassicae (borboleta branca do repolho); Rachiplusia ni (larva da soja); Spodoptera exígua (lagarta da beterraba); Spodoptera littoralis (lagarta do cartucho); Sylepta derogata; Trichoplusia ni (lagarta da couve); Orthoptera, como o grilo comum Acheta domesticus, gafanhotos (Anacridium spp.), gafanhoto-migratório Locusta migratoria, gafanhoto Melanoplus bivittatus, gafanhoto Melanoplus entialis, gafanhoto Melanoplus femurrubrum, gafanhoto migratório Melanoplus sanguinipes, grilo Neocurtilla hexadectyla, gafanhoto vermelho Nomadacris septemfasciata, Scapteriscus abbreviatus, Scapteriscus borellii, Grilo-toupeira Scapteriscus vicinus e o gafanhoto do deserto Schistocerca gregaria; sínfilos tais como sínfilos de jardim Scutigerella immaculata; Thysanoptera, como o tripe do tabaco Frankliniella fusca, tripe da flor Frankliniella intonsa, tripe da nectarina Frankliniella occidentalis, tripe do algodão Frankliniella schultzei, tripe Hercinothrips femoralis, tripe da soja Neohydatothrips variabilis, tripe das cítricas Pezothrips kellyanus, tripe do abacate Scirtothrips perseae, tripe do melão Thrips palmi, e tripe da cebola Thrips tabaci; e similares, combinações compreendendo um ou mais dos organismos citados acima.

[0266] Em alguns exemplos de realização, a expressão de uma ou mais proteínas toxinas (por exemplo, proteínas inseticidas) nas plantas tolerantes a herbicida é eficaz para controlar besouro-pulga, ou seja, os membros da tribo besouro-pulga da família Chrysomelidae, de preferência contra Phyllotreta spp., como Phyllotreta Cruciferae e/ou Phyllotreta triolata. Em outros exemplos de realização, a expressão de uma ou mais proteínas toxinas (por exemplo, proteínas inseticidas) nas plantas tolerantes a herbicida é eficaz para controlar o gorgulho Ceutorhynchus assimilis, a lagarta (Mamestra configurata), praga Lygus, ou traça das crucíferas.

[0267] Além disso, em outro exemplo de realização, também são abrangidas plantas tolerantes a herbicida que são selecionadas para tais características, por exemplo, pelo uso de técnicas de DNA recombinante e/ou por cruzamento e/ou por outro modo, rendendo plantas capazes de sintetizar uma ou mais proteínas que aumentam a resistência ou tolerância das plantas aos patógenos bacterianos, virais ou fúngicos. Os métodos para a produção de plantas geneticamente modificadas são conhecidos pelo profissional hábil na técnica.

[0268] Além disso, em outro exemplo de realização, também são abrangidas plantas tolerantes a herbicida que são selecionadas para tais características, por exemplo, pelo uso de técnicas de DNA recombinante e/ou por cruzamento e/ou por outro modo, rendendo plantas capazes de sintetizar uma ou mais proteínas que aumentam a produtividade (por exemplo, teor de óleo), tolerância à seca, salinidade ou outros fatores ambientais limitantes do crescimento ou tolerância a pragas e patógenos fúngicos, bacterianos ou virais dessas plantas.

[0269] Além disso, em outros exemplos de realização, também são abrangidas plantas tolerantes a herbicida que são selecionadas para tais características, por exemplo, pela utilização de técnicas de DNA recombinante e/ou por meio do cruzamento e/ou de outra forma, alteradas para conter uma quantidade modificada de uma ou mais substâncias ou novas substâncias, por exemplo, para melhorar a nutrição humana ou animal, por exemplo, culturas de oleaginosas que produzem ácidos graxos de cadeia longa ômega-3 ou ácidos graxos insaturados ômega-9 promotores da saúde (por exemplo, a colza Nexera®, Dow Agro Sciences , Canadá).

[0270] Além disso, em alguns exemplos de realização, também são abrangidas plantas tolerantes a herbicida que são selecionadas, por exemplo, pela utilização de técnicas de DNA recombinante e/ou por meio do cruzamento e/ou por outro modo, para tais características, alteradas para conterem maiores quantidades de vitaminas e/ou minerais, e/ou perfis melhorados de compostos nutracêuticos.

[0271] Em um exemplo de realização, as plantas tolerantes a herbicida da presente invenção, em relação a uma planta tipo selvagem, compreendem um aumento da quantidade de, ou perfil melhorado de, um composto selecionado a partir do grupo que consiste de: glucosinolatos (por exemplo, glucorafanina (4-metilsulfinilbutil-glucosinolatos), sulforafano, 3- indolilmetilo-glucosinolatos (glucobrassicina), l-metoxi-3-indolilmetilo-glucosinolatos (neoglucobrassicin)); fenólicos (por exemplo, flavonoides (por exemplo, quercetina, kaempferol), derivados de hidroxicinnamoíla (por exemplo, 1,2,2'-trisinapoilgentiobiose, 1,2-diferuloilgentiobiose, 1,2'-disinapoil-2-feruloilgentiobiose, 3-0-caffeoil-quinico (ácido neoclorogênico)); e vitaminas e minerais (por exemplo, vitamina C, vitamina E, caroteno, ácido fólico, niacina, riboflavina, tiamina, cálcio, ferro, magnésio, potássio, selênio e zinco).

[0272] Em outro exemplo de realização, as plantas tolerantes a herbicida da presente invenção, em relação a uma planta tipo selvagem, compreendem um aumento da quantidade de, ou perfil melhorado de, um composto selecionado a partir do grupo que consiste de: progoitrina; isotiocianatos; indóis (produtos da hidrólise do glicosinolato); glutationa; carotenoides como beta-caroteno, licopeno, e carotenoides xantofilas, tais como lutea e zeaxantina; fenólicos compreendendo os flavonoides, tais como os flavonoides (por exemplo, quercetina, rutina), os flavanos/taninos (tais como aqueles que compreendem as procianidinas, cumarina, proantocianidinas, catequinas e antocianinas); flavonas; fitoestrogenos, como coumestanos, lignanos, resveratrol, isoflavonas genisteína, por exemplo, daidzeína e gliciteína; lactonas de ácido resorcíclico; organosulfurados compostos; fitoesteróis; terpenoides como o carnosol, ácido rosmarínico, glicirrizina e saponinas; clorofila; clorfilina, açúcares, antocianinas, e baunilha.Em outros exemplos de realização, as plantas tolerantes a herbicida da presente invenção, em relação a uma planta tipo selvagem, compreendem um aumento da quantidade de, ou perfil melhorado de, um composto selecionado a partir do grupo que consiste de: vincristina, vinblastina, taxanos (por exemplo, taxol (paclitaxel), bacatina III, 10-desacetilbacatina III, 10-desacetiltaxol, xilosil taxol, 7-epitaxol, 7-epibacatina III, 10-desacetilcefalomanina, 7-epicefalomanina, taxotere, cefalomanina, cefalomanina xilosila, taxagifine, 8-benxoiloxi taxagifina, taxusin 9-acetiloxi, taxusin-9-hidroxi, taiwanxam, taxano Ia, taxano Ib, taxanos Ic, taxano Id, paclitaxel GMP, 9-di-hidro-13-acetilbacatina III, 10-desacetil-7- epitaxol, tetra-hidrocanabinol (THC), canabidiol (CBD), genisteína, diadzeína, codeína, morfina, quinina, shikonina, ajmalacina, serpentina, e similares.

[0273] Em outros aspectos, é fornecido um método para o tratamento de uma planta da presente invenção.

[0274] Em alguns exemplos de realização, o método compreende o contato da planta com uma composição agronomicamente aceitável. Em um exemplo de realização, a composição agronomicamente aceitável compreende um herbicida auxínico A. I.

[0275] Em outro aspecto, a presente invenção provê um método para a preparação de uma semente descendente. O método compreende a plantação de uma semente capaz de produzir uma planta da presente invenção. Em um exemplo de realização, o método compreende ainda o cultivo de uma planta descendente a partir da semente; e a colheita de uma semente descendente a partir da planta descendente. Em outros exemplos de realização, o método compreende ainda a aplicação de uma composição herbicida à planta descendente.

[0276] Em outro exemplo de realização, a invenção diz respeito às partes que podem ser coletadas (partes colhíveis) da planta transgênica de acordo com a presente invenção. Preferencialmente, as partes que podem ser coletadas compreendem o ácido nucleico TriA ou proteína TriA da presente invenção. As partes colhíveis podem ser sementes, raízes, folhas e/ou flores compreendendo o ácido nucleico TriA ou proteína TriA ou partes das mesmas. As partes preferidas de plantas de soja são os grãos de soja compreendendo o ácido nucleico TriA ou proteína TriA .

[0277] Em outro exemplo de realização, a invenção diz respeito aos produtos derivados de uma planta transgênica de acordo com a presente invenção, suas partes ou partes colhíveis da mesma que podem ser colhidas.Um produto vegetal preferido é forragem, farinha de semente, óleo ou semente revestida pelo tratamento de sementes. De um modo preferido, a farinha e/ou óleo compreendem os ácidos nucleicos TriA ou proteínas TriA.

[0278] Em outro exemplo de realização, a invenção diz respeito a um método para a produção de um produto, cujo método compreende; a) o cultivo das plantas da invenção ou plantas que podem ser obtidas pelos métodos da invenção e; b) a produção do referido produto a partir das, ou pelas plantas da invenção e/ou partes de planta, por exemplo, as sementes destas plantas.

[0279] Em um exemplo de realização adicional, o método compreende as etapas de; a) cultivo das plantas da invenção, b) remoção das partes que podem ser colhidas a partir das plantas conforme definido acima; e c) produção do referido produto a partir ou pelas partes colhíveis da planta.

[0280] O produto pode ser produzido no local onde a planta foi cultivada, ou as plantas e/ou partes destas podem ser removidas do local onde as plantas foram cultivadas para produzir o produto. Tipicamente, a planta é cultivada, as partes colhíveis desejadas são removidas da planta, se possível, em ciclos repetidos, e o produto é produzido a partir das partes colhíveis planta. A etapa de cultivo da planta pode ser realizada apenas uma vez a cada vez que o método da invenção realizado, ao mesmo tempo permitindo que as etapas de produção do produto sejam repetidas vezes realizadas, por exemplo, pela remoção repetida de partes colhíveis das plantas da invenção e, se necessário, o processamento adicional dessas partes para se chegar ao produto. Também é possível que a etapa de cultivo das plantas da invenção seja repetida e as plantas ou partes colhíveis das plantas sejam armazenadas até que a produção do produto seja então realizada uma única vez para as plantas ou partes de planta acumuladas. Além disso, as etapas de cultivo das plantas e a produção do produto podem ser realizadas com uma sobreposição em tempo, mesmo simultaneamente em uma grande extensão, ou sequencialmente. Geralmente, as plantas são cultivadas durante algum tempo antes que o produto seja produzido.

[0281] Em um exemplo de realização, os produtos produzidos pelos referidos métodos da presente invenção são produtos vegetais, tais como, mas não limitados a, um produto alimentício, alimento para animais, suplemento alimentar, suplementos para alimentação animal, fibra, cosmético e/ou farmacêutico. Os produtos alimentícios são considerados como composições utilizadas para a nutrição e/ou para a suplementação nutricional. Os alimentos para animais e suplementos para alimentação animal são, particularmente, considerados como produtos alimentares.

[0282] Em outro exemplo de realização, os métodos da invenção para a produção são usados para fazer produtos agrícolas, tais como, mas não limitados a, extratos vegetais, proteínas, aminoácidos, carboidratos, gorduras, óleos, polímeros, vitaminas, e similares.

[0283] É possível que um produto vegetal consista de um ou mais produtos agrícolas, em grande escala.

HERBICIDAS

[0284] Conforme descrito acima, a presente invenção provê ácidos nucleicos, polipeptídeos, conferindo às plantas tolerância aos compostos/herbicidas que interferem ou inibem a biossíntese da parede celular (celulose).

[0285] Exemplos de herbicidas que podem ser utilizados de acordo com a presente invenção, ou seja, aos quais as plantas de acordo com a presente invenção são tolerantes/resistentes, são os compostos conhecidos pelos técnicos hábeis o assunto como azinas. Exemplos de Azinas estão descritos em detalhes nos seguintes pedidos de patente exibidos na Tabela 1, que são integralmente incorporados ao presente pela referência.TABELA 1

[0286] Exemplos de herbicidas preferidos que podem ser utilizados de acordo com a presente invenção são as azinas possuindo a Fórmula (I).

[0287] Em que: A é fenila, que é substituída por dois a cinco substituintes selecionados a partir do grupo consistindo de halogênio, CN, NO2, alquila-C1-C6, haloalquila-C1-C6, alquenila-C2-C6, haloalquenila-C2-C6, alquinila-C2-C6, haloalquinila-C1-C6, OH, alcóxi-C1-C6, alquiltio-C1-C6, (alquil-C1-C6)sulfinila, (alquil-C1-C6)sulfonila, amino, (alquil-C1-C6)amino, di(alquil-C1-C6)amino, (alquil- C1-C6)-carbonila, (alcóxi-C1-C6)carbonila; R1 H, CN, alquila-C1-C6, haloalquila-C1-C6, alcóxi-C1-C6-alquila- C1-C6, alcóxi-C1-C6, (alquil-C1-C6)carbonila, (alcóxi-C1-C6)carbonila, (alquil-C1- C6)sulfonila ou fenilsulfonila, em que a fenila é não substituída ou substituída por um a cinco substituintes selecionados a partir do grupo consistindo de halogênio, CN, NO2, alquila-C1-C6, haloalquila-C1-C6 e alcóxi-C1-C6; R2 H, halogênio, CN, alquila-C1-C6, haloalquila-C1-C6, alquenila-C2-C6, C3-C6-alquinila, cicloalquila-C3-C6, cicloalquenila-C3-C6, OH, alcóxi-C1-C6 ou alcóxi-C1-C6-alquila-C1-C6; R3 H, halogênio, CN, alquila-C1-C6, haloalquila-C1-C6 ou alcóxi- C1-C6; R4 H, halogênio, CN, alquila-C1-C6 ou haloalquila-C1-C6; ou R3 e R4 juntamente com o átomo de carbono ao qual estão ligados formam uma porção selecionada a partir do grupo consistindo de carbonila, alquenila-C2-C6, cicloalquila-C3-C6, cicloalquenila-C3-C6 e heterociclila possuindo de três a seis membros no anel, em que a cicloalquila-C3-C6, cicloalquenila-C3-C6, ou heterociclila possuindo de três a seis membros são não substituídas ou substituídas por um a três substituintes selecionados a partir de halogênio, CN, alquila-C1-C6 e alcóxi- C1-C6; e R5 H, CN, alquila-C1-C6, haloalquila-C1-C6, alcóxi-C1-C6-alquila- C1-C6, alcóxi-C1-C6, (alquil-C1-C6)carbonila, (alcóxi-C1-C6)carbonila, (alquil-C1- C6)sulfonila ou fenilsulfonila, em que a fenila é não substituída ou substituída por um a cinco substituintes selecionados a partir do grupo consistindo de halogênio, CN, NO2, alquila-C1-C6, haloalquila-C1-C6 e alcóxi-C1-C6; incluindo seus sais agricolamente aceitáveis ou N-óxidos.

[0288] Preferencialmente a presente invenção provê azinas de Fórmula (I), em que A é 2-fluoro-fenila, que é substituída por um a quatro substituintes selecionados a partir do grupo consistindo de halogênio, CN, NO2, alquila-C1-C6, haloalquila-C1-C6, OH, alcóxi-C1-C6, alquiltio-C1-C6, (alquil-C1- C6)sulfinila, (alquil-C1-C6)sulfonila, amino, (alquil-C1-C6)amino, di(alquil-C1- C6)amino, (alquil-C1-C6)-carbonila e (alcóxi-C1-C6)-carbonila; R1 H, CN, alquila-C1-C6, haloalquila-C1-C6, alcóxi-C1-C6-alquila- C1-C6, alcóxi-C1-C6, (alquil-C1-C6)-carbonila, (alcóxi-C1-C6)carbonila, (alquil-C1- C6)sulfonila ou fenilsulfonila, em que a fenila é não substituída ou substituída por um a cinco substituintes selecionados a partir do grupo consistindo de halogênio, CN, NO2, alquila-C1-C6, haloalquila-C1-C6 e alcóxi-C1-C6; R2 H, halogênio, CN, alquila-C1-C6, haloalquila-C1-C6, alquenila-C2-C6, C3-C6-alquinila, cicloalquila-C3-C6, cicloalquenila-C3-C6, OH, alcóxi-C1-C6 ou alcóxi-C1-C6-alquila-C1-C6; R3 H, halogênio, CN, alquila-C1-C6, haloalquila-C1-C6 ou alcóxi- C1-C6; R4 H, halogênio, CN, alquila-C1-C6 ou haloalquila-C1-C6; ou R3 e R4 juntamente com o átomo de carbono ao qual estão ligados formam uma porção selecionada a partir do grupo consistindo de carbonila, alquenila-C2-C6, cicloalquila-C3-C6, cicloalquenila-C3-C6 e heterociclila possuindo de três a seis membros no anel, em que a cicloalquila-C3-C6, cicloalquenila-C3-C6 ou e heterociclila possuindo de três a seis membros no anel é não substituída ou substituída por um a três substituintes selecionados a partir de halogênio, CN, alquila-C1-C6 e alcóxi-C1-C6; e R5 H, CN, alquila-C1-C6, haloalquila-C1-C6, alcóxi-C1-C6-alquila- C1-C6, alcóxi-C1-C6, (alquil-C1-C6)carbonila, (alcóxi-C1-C6)carbonila, (alquil-C1- C6)sulfonila ou fenilsulfonila, em que a fenila é não substituída ou substituída por um a cinco substituintes selecionados a partir do grupo consistindo de halogênio, CN, NO2, alquila-C1-C6, haloalquila-C1-C6 e alcóxi-C1-C6; incluindo seus sais agricolamente aceitáveis ou N-óxidos.

[0289] Também são úteis para a presente invenção as composições agroquímicas compreendendo pelo menos um azina de fórmula (I) e os auxiliares habituais para a formulação de agentes de proteção de culturas.

[0290] A presente invenção também provê a utilização de azinas de fórmula (I) como herbicidas, ou seja, para o combate de plantas nocivas.

[0291] Se as azinas de fórmula (I) tal como descrito na presente invenção, são capazes de formar isômeros geométricos, por exemplo, isômeros E/Z, é possível o uso de isômeros puros e de suas misturas nas composições de acordo com a invenção.

[0292] Se as azinas de fórmula (I) tal como descrito na presente invenção, possuem um ou mais centros de quiralidade e, consequentemente, estão presentes como enantiômeros ou diastereômeros, é possível a utilização de ambos, enantiômeros e diastereômeros puros e de suas misturas, nas composições de acordo com a invenção.

[0293] Se as azinas de fórmula (I) tal como descrito na presente invenção, possuem grupos funcionais ionizáveis, elas também podem ser utilizadas na forma de seus sais agricolamente aceitáveis. Em geral, são adequados os sais de tais cátions e os sais de adição de ácido de tais ácidos, cujos ânions e cátions, respectivamente, não exercem efeito adverso algum sobre a atividade dos compostos ativos.

[0294] Os cátions preferidos são os íons dos metais alcalinos, preferencialmente de lítio, sódio e potássio, dos metais alcalinos terrosos, preferencialmente de cálcio e magnésio, e dos metais de transição, preferencialmente de manganês, cobre, zinco e ferro, adicionalmente amônio e amônio substituído no qual um a quatro átomos de hidrogênio são substituídos por alquila-C1-C4, hidroxi-alquila-C1-C4, alcóxi-C1-C4-alquila-C1-C4, hidroxialcóxi- C1-C4-alquila-C1-C4, fenila ou benzila, preferencialmente amônio, metilamônio, isopropilamônio, dimetilamônio, di-isopropilamônio, trimetilamônio, heptilamônio, dodecilamônio, tetradecilamônio, tetrametilamônio, tetraetilamônio, tetrabutilamônio, 2-hidroxietil-amônio (sal olamina), 2-(2-hidroxiet-1-oxi)et-1- ilamônio (sal diglicolamina), di(2-hidroxiet-1-il)-amônio (sal diolamina), tris(2- hidroxietil)amônio (sal trolamina), tris(2-hidroxipropil)amônio,benziltrimetilamônio, benziltrietilamônio, N,N,N-trimetiletanolamônio (sal de colina), além disso, íons fosfônio, íons sulfônio, preferencialmente tri(alquil-C1- C4)sulfônio, tal como trimetilsulfônio, e íons sulfoxônio, preferencialmente tri(alquil-C1-C4)sulfoxônio, e finalmente os sais de aminas polibásicas, tais como N,N-bis-(3-aminopropil)metilamina e dietilenetriamina.

[0295] Os ânions de sais de adição de ácido úteis são principalmente cloreto, brometo, fluoreto, iodeto, hidrogenosulfato, metilsulfato, sulfato, di-hidrogenofosfato, hidrogenofosfato, nitrato, bicarbonato, carbonato, hexafluorosilicato, hexafluorofosfato, benzoato e também os ânions de ácidos acanoides-C1-C4, preferencialmente formato, acetato, propionato e butirato.

[0296] As moléculas orgânicas mencionadas na definição das variáveis, por exemplo, R1 a R5, são - assim como o termo halogênio - termos coletivos para enumerações individuais dos membros individuais do grupo. O termo halogênio indica em cada caso flúor, cloro, bromo ou iodo. Todas as cadeias de hidrocarbonetos, ou seja, todas as cadeias de alquila, haloalquila, alquenila, alquinila, alcóxi, alquiltio, alquilsulfinila, alquilsulfonila, (alquil)amino, di(alquil)amino podem ser de cadeia linear ou ramificada, o sufíxo Cn-Cm indica em cada caso o número possível de átomos de carbono no grupo.

[0297] Exemplos de tais significados são os seguintes: - alquila-C1-C4: por exemplo, CH3, C2H5, n-propila, CH(CH3)2, n-butila, CH(CH3)-C2H5, CH2-CH(CH3)2 e C(CH3)3; - alquila-C1-C6 e também as porções alquila-C1-C6 de (alquil- C1-C6)carbonila, alcóxi-C1-C6-alquil-C1-C6: alquila-C1-C4 conforme mencionado acima, e também, por exemplo, n-pentila, 1-metilbutila, 2-metilbutila, 3- metilbutila, 2,2-dimetilpropila, 1-etilpropila, n-hexila, 1,1-dimetilpropila, 1,2- dimetilpropila, 1-metilpentila, 2-metilpentila, 3-metilpentila, 4-metilpentila, 1,1- dimetilbutila, 1,2-dimetilbutila, 1,3-dimetilbutila, 2,2-dimetilbutila, 2,3- dimetilbutila, 3,3-dimetilbutila, 1-etilbutila, 2-etilbutila, 1,1,2-trimetilpropila, 1,2,2- trimetilpropila, 1-etil-1-metilpropila ou 1-etil-2-metilpropila, preferencialmente metila, etila, n-propila, 1-metiletila, n-butila, 1,1-dimetiletila, n-pentila ou n- hexila; - haloalquila-C1-C4: um radical alquila-C1-C4 conforme mencionado acima que é parcialmente ou completamente substituído por flúor, cloro, bromo e/ou iodo, por exemplo, cloro-metila, diclorometila, triclorometila, fluorometila, difluorometila, trifluorometila, clorofluorometila, diclorofluorometila, clorodifluorometila, bromometila, iodometila, 2-fluoroetila, 2-cloroetila, 2- bromoetila, 2-iodoetila, 2,2-difluoroetila, 2,2,2-trifluoroetila, 2-cloro-2-fluoroetila, 2-cloro-2,2-difluoro-etila, 2,2-dicloro-2-fluoroetila, 2,2,2-tricloroetila, pentafluoroetila, 2-fluoropropila, 3-fluoropropila, 2,2-difluoropropila, 2,3- difluoropropila, 2-cloropropila, 3-cloropropila, 2,3-dicloro-propila, 2-bromopropila, 3-bromopropila, 3,3,3-trifluoropropila, 3,3,3-tricloropropila, 2,2,3,3,3- pentafluoropropila, heptafluoropropila, 1-(fluorometil)-2-fluoroetila, 1- (clorometil)-2-cloroetila, 1-(bromometil)-2-bromoetila, 4-fluorobutila, 4- clorobutila, 4-bromobutila, nonafluorobutila, 1,1,2,2,-tetrafluoroetil e 1- trifluorometil-1,2,2,2-tetrafluoroetila; - haloalquila-C1-C6: haloalquila-C1-C4 conforme mencionado acima, e também, por exemplo, 5-fluoropentila, 5-cloropentila, 5-bromopentila, 5-iodopentila, undecafluoropentila, 6-fluorohexila, 6-clorohexila, 6-bromohexila, 6-iodohexila e dodecafluorohexila; - cicloalquila-C3-C6: hidrocarbonetos monocíclicos saturados possuindo 3 a 6 membros no anel, tal como ciclopropila, ciclobutila, ciclopentila e ciclohexila; - alquenila-C2-C6: por exemplo, etenila, 1-propenila, 2- propenila, 1-metiletenila, 1-butenila, 2-butenila, 3-butenila, 1-metil-1-propenila, 2-metil-1-propenila, 1-metil-2-propenila, 2-metil-2-propenila, 1-pentenila, 2- pentenila, 3-pentenila, 4-pentenila, 1-metil-1-butenila, 2-metil-1-butenila, 3-metil- 1-butenila, 1-metil-2-butenila, 2-metil-2-butenila, 3-metil-2-butenila, 1-metil-3- butenila, 2-metil-3-butenila, 3-metil-3-butenila, 1,1-dimetil-2-propenila, 1,2- dimetil-1-propenila, 1,2-dimetil-2-propenila, 1-etil-1-propenila, 1-etil-2-propenila, 1-hexenila, 2-hexenila, 3-hexenila, 4-hexenila, 5-hexenila, 1-metil-1-pentenila, 2-metil-1-pentenila, 3-metil-1-pentenila, 4-metil-1-pentenila, 1-metil-2-pentenila, 2-metil-2-pentenila, 3-metil-2-pentenila, 4-metil-2-pentenila, 1-metil-3-pentenila, 2-metil-3-pentenila, 3-metil-3-pentenila, 4-metil-3-pentenila, 1-metil-4-pentenila, 2-metil-4-pentenila, 3-metil-4-pentenila, 4-metil-4-pentenila, 1,1-dimetil-2- butenila, 1,1-dimetil-3-butenila, 1,2-dimetil-1-butenila, 1,2-dimetil-2-butenila, 1,2- dimetil-3-butenila, 1,3-dimetil-1-butenila, 1,3-dimetil-2-butenila, 1,3-dimetil-3- butenila, 2,2-dimetil-3-butenila, 2,3-dimetil-1-butenila, 2,3-dimetil-2-butenila, 2,3- dimetil-3-butenila, 3,3-dimetil-1-butenila, 3,3-dimetil-2-butenila, 1-etil-1-butenila, 1-etil-2-butenila, 1-etil-3-butenila, 2-etil-1-butenila, 2-etil-2-butenila, 2-etil-3- butenila, 1,1,2-trimetil-2-propenila, 1-etil-1-metil-2-propenila, 1-etil-2-metil-1- propenila e 1-etil-2-metil-2-propenila; - cicloalquenila-C3-C6: 1-ciclopropenila, 2-ciclopropenila, 1- ciclobutenila, 2-ciclo-butenila, 1-ciclopentenila, 2-ciclopentenila, 1,3- ciclopentadienila, 1,4-ciclopentadienila, 2,4-ciclopentadienila, 1-ciclohexenila, 2- ciclohexenila, 3-ciclohexenila, 1,3-ciclohexa-dienila, 1,4-ciclohexadienila, 2,5- ciclohexadienila; - alquinila-C3-C6: por exemplo, 1-propinila, 2-propinila, 1- butinila, 2-butinila, 3-butinila, 1-metil-2-propinila, 1-pentinila, 2-pentinila, 3- pentinila, 4-pentinila, 1-metil-2-butinila, 1-metil-3-butinila, 2-metil-3-butinila, 3- metil-1-butinila, 1,1-dimetil-2-propinila, 1-etil-2-propinila, 1-hexinila, 2-hexinila, 3-hexinila, 4-hexinila, 5-hexinila, 1-metil-2-pentinila, 1-metil-3-pentinila, 1-metil- 4-pentinila, 2-metil-3-pentinila, 2-metil-4-pentinila, 3-metil-1-pentinila, 3-metil-4- pentinila, 4-metil-1-pentinila, 4-metil-2-pentinila, 1,1-dimetil-2-butinila, 1,1- dimetil-3-butinila, 1,2-dimetil-3-butinila, 2,2-dimetil-3-butinila, 3,3-dimetil-1- butinila, 1-etil-2-butinila, 1-etil-3-butinila, 2-etil-3-butinila e 1-etil-1-metil-2- propinila; - alcóxi-C1-C4: por exemplo, metoxi, etoxi, propoxi, 1- metiletoxi butoxi, 1-metilpropoxi, 2-metilpropoxi e 1,1-dimetiletoxi; - alcóxi-C1-C6 e também as porções alcóxi-C1-C6 de (alcóxi- C1-C6)carbonila, alcóxi-C1-C6-alquila-C1-C6: alcóxi-C1-C4 conforme mencionado acima, e também, por exemplo, pentoxi, 1-metilbutoxi, 2-metilbutoxi, 3- metoxilbutoxi, 1,1-dimetilpropoxi, 1,2-dimetilpropoxi, 2,2-dimetilpropoxi, 1- etilpropoxi, hexoxi, 1-metilpentoxi, 2-metilpentoxi, 3-metilpentoxi, 4-metilpentoxi, 1,1-dimetilbutoxi, 1,2-dimetilbutoxi, 1,3-dimetilbutoxi, 2,2-dimetilbutoxi, 2,3- dimetilbutoxi, 3,3-dimetilbutoxi, 1-etilbutoxi, 2-etilbutoxi, 1,1,2-trimetilpropoxi, 1,2,2-trimetilpropoxi, 1-etil-1-metil-propoxi e 1-etil-2-metilpropoxi; - alquiltio-C1-C4: por exemplo, metiltio, etiltio, propiltio, 1-metil- etiltio, butiltio, 1-metilpropiltio, 2-metilpropiltio e 1,1-dimetiletiltio; - alquiltio-C1-C6: alquiltio-C1-C4 conforme mencionado acima, e também, por exemplo, pentiltio, 1-metilbutiltio, 2-metil-butiltio, 3-metilbutiltio, 2,2-dimetil-propiltio, 1-etilpropiltio, hexiltio, 1,1-di-metilpropiltio, 1,2- dimetilpropiltio, 1-metilpentiltio, 2-metilpentiltio, 3-metil-pentiltio, 4-metilpentiltio, 1,1-dimetilbutiltio, 1,2-dimetilbutiltio, 1,3-dimetilbutiltio, 2,2-dimetilbutiltio, 2,3- dimetilbutiltio, 3,3-dimetilbutiltio, 1-etilbutiltio, 2-etilbutiltio, 1,1,2-trimetilpropiltio, 1,2,2-trimetilpropiltio, 1-etil-1-metilpropiltio e 1- etil-2-metilpropiltio; - alquilsulfinila-C1-C6 (alquil-C1-C6-S(=O)-): z.B. metilsulfinila, etilsulfinila, propilsulfinila, 1-metiletilsulfinila, butilsulfinila, 1-metilpropilsulfinila, 2- metilpropil-sulfinila, 1,1-di-metiletilsulfinila, pentilsulfinila, 1-metilbutil-sulfinila, 2- metilbutil-sulfinila, 3-metilbutilsulfinila, 2,2-dimetilpropilsulfinila, 1- etilpropilsulfinila, 1,1-dimetil-propilsulfinila, 1,2-dimetilpropilsulfinila, hexil- sulfinila, 1-metilpentilsulfinila, 2-metilpentilsulfinila, 3-metilpentilsulfinila, 4- metilpentil-sulfinila, 1,1-dimetil-butil-sulfinila, 1,2-dimetilbutilsulfinila, 1,3- dimetilbutil-sulfinila, 2,2-dimetil-butilsulfinila, 2,3-dimetilbutilsulfinila, 3,3- dimetilbutil-sulfinila, 1-etilbutilsulfinila, 2-etilbutil-sulfinila, 1,1,2-trimetil- propilsulfinila, 1,2,2-trimetilpropilsulfinila, 1-etil-1-metil-propil-sulfinila e 1-etil-2- metilpropilsulfinila; - alquil-C1-C6sulfonil (alquil-C1-C6-S(O)2-): por exemplo, metilsulfonila, etilsulfonila, propilsulfonila, 1-metiletilsulfonila, butilsulfonila, 1- metilpropil-sulfonila, 2-metil-propilsulfonila, 1,1-dimetiletilsulfonila, pentilsulfonila, 1-metilbutil-sulfonila, 2-metilbutilsulfonila, 3-metilbutilsulfonila, 1,1-dimetil- propilsulfonila, 1,2-di-metilpropilsulfonila, 2,2-dimetilpropilsulfonila, 1-etil- propilsulfonila, hexilsulfonila, 1-metilpentilsulfonila, 2-metilpentilsulfonila, 3- metilpentil-sulfonila, 4-metilpentilsulfonila, 1,1-dimetilbutilsulfonila, 1,2-di- metilbutil-sulfonila, 1,3-dimetilbutilsulfonila, 2,2-dimetilbutilsulfonila, 2,3-di-metil- butilsulfonila, 3,3-dimetilbutilsulfonila, 1-etilbutilsulfonila, 2-etil-butilsulfonila, 1,1,2-trimetil-propilsulfonila, 1,2,2-trimetilpropilsulfonila, 1-etil-1-metil- propilsulfonila e 1-etil-2-metilpropilsulfonila; - (alquil-C1-C4)amino: por exemplo, metilamino, etilamino-, propilamino, 1-metiletil-amino, butilamino, 1-metilpropilamino, 2-metilpropilamino ou 1,1-dimetiletilamino; - (alquil-C1-C6)amino: (C1-C4-alquilamino) conforme mencionado acima, e também, por exemplo, pentilamino, 1-metilbutil-amino, 2- metilbutil-amino, 3-metilbutilamino, 2,2-dimetilpropilamino, 1-etil-propilamino, hexilamino, 1,1-dimetilpropilamino, 1,2-dimetilpropilamino, 1-metil-pentilamino, 2-metilpentilamino, 3-metilpentilamino, 4-metilpentilamino, 1,1-dimetil-butil- amino, 1,2-dimetilbutilamino, 1,3-dimetilbutilamino, 2,2-dimetilbutilamino, 2,3- dimetilbutil-amino 3,3-dimetilbutil-amino, 1-etilbutilamino, 2-etilbutilamino, 1,1,2- trimetil-propilamino, 1,2,2-trimetil-propilamino, 1-etil-1-metilpropil-amino ou 1- etil-2-metilpropilamino; - di(C1-C4-alquil)amino: por exemplo, N,N-dimetilamino, N,N- dietilamino, N,N-di(1-metiletil)amino, N,N-dipropilamino, N,N-dibutilamino, N,N- di(1-metilpropil)-amino, N,N-di(2-metilpropil)amino, N,N-di(1,1-dimetiletil)amino, N-etil-N-metilamino, N-metil-N-propilamino, N-metil-N-(1-metil-etil)amino, N- butil-N-metilamino, N-metil-N-(1-metilpropil)-amino, N-metil-N-(2- metilpropil)amino, N-(1,1-dimetiletil)-N-metilamino, N-etil-N-propilamino, N-etil- N-(1-metil-etil)-amino, N-butil-N-etilamino, N-etil-N-(1-metilpropil)amino, N-etil-N- (2-metilpropil)amino, N-etil-N-(1,1-dimetiletil)amino, N-(1-metiletil)-N-propil- amino, N-butil-N-propilamino, N-(1-metil-propil)-N-propilamino, N-(2-metilpropil)- N-propilamino, N-(1,1-dimetiletil)-N-propilamino, N-butil-N-(1-metiletil)amino, N- (1-metiletil)-N-(1-metilpropil)amino, N-(1-metiletil)-N-(2-metil-propil)-amino, N- (1,1-dimetiletil)-N-(1-metiletil)amino, N-butil-N-(1-metilpropil)amino, N-butil-N-(2- metilpropil)amino, N-butil-N-(1,1-dimetiletil)amino, N-(1-metil-propil)--N-(2- metilpropil)amino, N-(1,1-dimetiletil)-N-(1-metilpropil)amino ou N-(1,1-dimetil- etil)-N-(2-metilpropil)amino; - di(alquil-C1-C6)amino: di(C1-C4-alquil)amino conforme mencionado acima, e também, por exemplo, N-metil-N-pentilamino, N-metil-N- (1-metilbutil)-amino-, N-metil-N-(2-metil-butil)amino, N-metil-N-(3-metil- butil)amino, N-metil-N-(2,2-dimetilpropil)amino, N-metil-N-(1-etilpropil)amino, N- metil-N-hexilamino, N-metil-N-(1,1-dimetil-propil)amino, N-metil-N-(1,2- dimetilpropil)amino, N-metil-N-(1-metilpentil)-amino, N-metil-N-(2- metilpentil)amino, N-metil-N-(3-metilpentil)amino, N-metil-N-(4- metilpentil)amino, N-metil-N-(1,1-dimetilbutil)amino, N-metil-N-(1,2- dimetilbutil)amino, N-metil-N-(1,3-dimetilbutil)amino, N-metil-N-(2,2-dimetil- butil)amino-, N-metil-N-(2,3-dimetilbutil)amino, N-metil-N-(3,3-dimetil- butil)amino, N-metil-N- (1-etilbutil)amino, N-metil-N-(2-etil-butil)amino, N-metil-N- (1,1,2-trimetilpropil)amino, N-metil-N- (1,2,2-trimetilpropil)amino, N-metil-N-(1- etil-1-metilpropil)amino-, N-metil-N- (1-etil-2-metilpropil)amino, N-etil-N- pentilamino-, N-etil-N-(1-metilbutil)amino, N-etil-N-(2-metilbutil)-amino-, N-etil-N- (3-metilbutil)amino, N-etil-N-(2,2-dimetilpropil)-amino-, N-etil-N-(1- etilpropil)amino, N-etil-N-hexilamino-, N-etil-N-(1,1-dimetilpropil)amino, N-etil-N- (1,2-dimetilpropil)-amino, N-etil-N-(1-metilpentil)amino, N-etil-N-(2-metil-pentil)- amino-, N-etil-N-(3-metilpentil)amino, N-etil-N-(4-metilpentil)-amino-, N-etil-N- (1,1-dimetilbutil)amino, N-etil-N-(1,2-dimetil-butil)-amino, N-etil-N-(1,3- dimetilbutil)amino, N-etil-N-(2,2-dimetil-butil)amino, N-etil-N-(2,3- dimetilbutil)amino, N-etil-N-(3,3-dimetilbutil)amino, N-etil-N-(1-etilbutil)-amino, N- etil-N-(2-etilbutil)amino, N-etil-N-(1,1,2-trimetilpropil)amino, N-etil-N-(1,2,2- trimetilpropil)amino, N-etil-N-(1-etil-1-metilpropil)amino-, N-etil-N-(1-etil-2- metilpropil)amino, N-propil-N-pentilamino, N-butil-N-pentilamino, N,N-di-pentil- amino, N-propil-N-hexilamino, N-butil-N-hexilamino, N-pentil-N-hexilamino ou N,N-dihexilamino; - heterociclila possuindo de três a seis membros: hidrocarboneto monocíclico saturado ou parcialmente insaturado possuindo três a seis membros no anel conforme mencionado acima que, além dos átomos de carbono, contém um ou dois heteroátomos selecionados a partir de O, S e N; por exemplo, 2-oxiranila, 2-oxetanila, 3-oxetanila, 2-aziridinila, 3- tietanila, 1-azetidinila, 2-azetidinila, por exemplo, 2-tetrahidrofuranila, 3-tetrahidrofuranila, 2- tetrahidrotienila, 3-tetra-hidrotienila, 2-pirrolidinila, 3-pirrolidinila, 3- isoxazolidinila, 4-isoxazolidinila, 5-isoxazolidinila, 3-isotiazolidinila, 4- isotiazolidinila, 5-isotiazolidinila, 3-pirazo-lidinila, 4-pirazolidinila, 5-pirazolidinila, 2-oxazolidinila, 4-oxazolidinila, 5-oxazoli-dinila, 2-tiazolidinila, 4-tiazolidinila, 5- tiazolidinila, 2-imidazolidinila, 4-imidazoli-dinila; por exemplo, 2,3-di-hidrofur-2-ila, 2,3-di-hidrofur-3-ila, 2,4-di- hidrofur-2-ila, 2,4-di-hidrofur-3-ila, 2,3-di-hidrothien-2-ila, 2,3-di-hidrothien-3-ila, 2,4-di-hidrothien-2-ila, 2,4-di-hidro-thien-3-ila, 4,5-di-hidropirrol-2-ila, 4,5-di- hidropirrol-3-ila, 2,5-di-hidropirrol-2-ila, 2,5-di-hidro-pirrol-3-ila, 4,5-di- hidroisoxazol-3-ila, 2,5-di-hidroisoxazol-3-ila, 2,3-di-hidro-isoxazol-3-ila, 4,5-di- hidroisoxazol-4-ila, 2,5-di-hidroisoxazol-4-ila, 2,3-di-hidro-isoxazol-4-ila, 4,5-di- hidroisoxazol-5-ila, 2,5-di-hidroisoxazol-5-ila, 2,3-di-hidro-isoxazol-5-ila, 4,5-di- hidroisotiazol-3-ila, 2,5-di-hidroisotiazol-3-ila, 2,3-di-hidro-isotiazol-3-ila, 4,5-di- hidro-isotiazol-4-ila, 2,5-di-hidroisotiazol-4-ila, 2,3-di-hidro-isotiazol-4-ila, 4,5-di- hidroiso-tiazol-5-ila, 2,5-di-hidroisotiazol-5-ila, 2,3-di-hidro-isotiazol-5-ila, 2,3-di- hidropirazol-2-ila, 2,3-di-hidropirazol-3-ila, 2,3-di-hidro-pirazol-4-ila, 2,3-di- hidropirazol-5-ila, 3,4-di-hidro-pirazol-3-ila, 3,4-di-hidropirazol-4-ila, 3,4-di- hidropirazol-5-ila, 4,5-di-hidropirazol-3-ila, 4,5-di-hidropirazol-4-ila, 4,5-di- hidropirazol-5-ila, 2,3-di-hidroimidazol-2-ila, 2,3-di-hidroimidazol-3-ila, 2,3-di- hidroimidazol-4-ila, 2,3-di-hidroimidazol-5-ila, 4,5-di-hidro-imidazol-2-ila, 4,5-di- hidroimidazol-4-ila, 4,5-di-hidroimidazol-5-ila, 2,5-di-hidroimidazol-2-ila, 2,5-di- hidroimidazol-4-ila, 2,5-di-hidroimidazol-5-ila, 2,3-di-hidrooxazol-3-ila, 2,3-di- hidro-oxazol-4-ila, 2,3-di-hidrooxazol-5-ila, 3,4-di-hidrooxazol-3-ila, 3,4-di- hidrooxazol-4-ila, 3,4-di-hidrooxazol-5-ila, 2,3-di-hidrotiazol-3-ila, 2,3-di- hidrotiazol-4-ila, 2,3-di-hidro-tiazol-5-ila, 3,4-di-hidrotiazol-3-ila, 3,4-di- hidrotiazol-4-ila, 3,4-di-hidro-tiazol-5-ila, 3,4-di-hidrotiazol-2-ila, 3,4-di-hidrotiazol-3-ila, 3,4-di-hidrotiazol-4-il; por exemplo, 2-piperidinila, 3-piperidinila, 4-piperidinila, 1,3-dioxan- 2-ila, 1,3-dioxan-4-ila, 1,3-dioxan-5-ila, 1,4-dioxan-2-ila, 1,3-ditian-2-ila, 1,3- ditian-4-ila, 1,4-ditian-2-ila, 1,3-ditian-5-ila, 2-tetrahidropiranila, 3- tetrahidropiranila, 4-tetrahidropiranila, 2-tetrahidrotiopiranila, 3- tetrahidrotiopiranila, 4-tetrahidro-tiopiranila, 3-hexahidropiridazinila, 4- hexahidropiridazinila, 2-hexahidropirimidinila, 4-hexahidropirimidinila, 5- hexahidropirimidinila, 2-piperazinila, tetrahidro-1,3-oxazin-2-ila, tetrahidro-1,3- oxazin-6-ila, 2-morfolinila, 3-morfolinila; por exemplo, 2H-piran-2-ila, 2H-piran-3-ila, 2H-piran-4-ila, 2H- piran-5-ila, 2H-piran-6-ila, 3,6-di-hidro-2H-piran-2-ila, 3,6-di-hidro-2H-piran-3-ila, 3,6-di-hidro-2H-piran-4-ila, 3,6-di-hidro-2H-piran-5-ila, 3,6-di-hidro-2H-piran-6- ila, 3,4-di-hidro-2H-piran-3-ila, 3,4-di-hidro-2H-piran-4-ila, 3,4-di-hidro-2H-piran- 6-ila, 2H-tiopiran-2-ila, 2H-tiopiran-3-ila, 2H-tiopiran-4-ila, 2H-tiopiran-5-ila, 2H- tiopiran-6-ila, 5,6-di-hidro-4H-1,3-oxazin-2-ila.

[0298] Os exemplos de realização preferidos mencionados a seguir devem ser considerados como sendo preferidos, seja de forma independente, ou em combinação entre eles.

[0299] De acordo com um exemplo de realização preferido da invenção, também é dada preferência às azinas de fórmula (I), em que as variáveis, de forma independente entre si ou em combinação entre si, têm os seguintes significados:

[0300] São preferidas as azinas de fórmula (I), em que A é fenila, que é substituída por dois a cinco substituintes selecionados a partir do grupo consistindo de halogênio, CN, NO2, alquila-C1-C6, haloalquila-C1-C6, OH, alcóxi-C1-C6, alquiltio-C1-C6, (alquil-C1-C6)sulfinila, (alquil- C1-C6)sulfonila, amino, (alquil-C1-C6)amino, di(alquil-C1-C6)amino, (alquil-C1-C6)- carbonila, (alcóxi-C1-C6)carbonila; particularmente é preferida a fenila que é substituída por dois a cinco substituintes selecionados a partir do grupo consistindo de halogênio, CN, alquila-C1-C6 e alcóxi-C1-C6; sendo preferivelmente selecionados a partir de halogênio e CN; também selecionados de modo preferido a partir do grupo consistindo de F, Cl, CN e CH3; selecionados de modo especialmente preferido a partir do grupo consistindo de F, Cl e CN; de modo especialmente preferido fenila, que é substituída por dois a quatro substituintes selecionados a partir do grupo consistindo de halogênio, CN, NO2, alquila-C1-C6, haloalquila-C1-C6, OH, alcóxi-C1-C6, alquiltio-C1-C6, (alquil-C1- C6)sulfinila, (alquil-C1-C6)sulfonila, amino, (alquil-C1-C6)amino, di(alquil-C1- C6)amino, (alquil-C1-C6)-carbonila, (alcóxi-C1-C6)carbonila; selecionados de modo particularmente preferido a partir do grupo consistindo de halogênio, CN, alquila-C1-C6 e alcóxi-C1-C6; selecionados de modo especialmente preferido a partir de halogênio e CN; também selecionados de modo especialmente preferido a partir do grupo consistindo de F, Cl, CN e CH3; selecionados de modo mais preferido a partir do grupo consistindo de F, Cl e CN; mais preferencialmente fenila, que é substituída por dois substituintes selecionados a partir do grupo consistindo de halogênio, CN, NO2, alquila-C1-C6, haloalquila-C1-C6, OH, alcóxi-C1-C6, alquiltio-C1-C6, (alquil-C1- C6)sulfinila, (alquil-C1-C6)sulfonila, amino, (alquil-C1-C6)amino, di(alquil-C1- C6)amino, (alquil-C1-C6)-carbonila, (alcóxi-C1-C6)carbonila; selecionados de modo particularmente preferido a partir do grupo consistindo de halogênio, CN, alquila-C1-C6 e alcóxi-C1-C6; selecionados de modo especialmente preferido a partir de halogênio e CN; também selecionados de modo especialmente preferido a partir do grupo consistindo de F, Cl, CN e CH3; selecionados de modo mais preferido a partir do grupo consistindo de F, Cl e CN; mais preferencialmente fenila, que é substituída por três substituintes selecionados a partir do grupo consistindo de halogênio, CN, NO2, alquila-C1-C6, haloalquila-C1-C6, OH, alcóxi-C1-C6, alquiltio-C1-C6, (alquil-C1- C6)sulfinila, (alquil-C1-C6)sulfonila, amino, (alquil-C1-C6)amino, di(alquil-C1- C6)amino, (alquil-C1-C6)-carbonila, (alcóxi-C1-C6)carbonila; selecionados de modo particularmente preferido a partir do grupo consistindo de halogênio, CN, alquila-C1-C6 e alcóxi-C1-C6; selecionados de modo especialmente preferido a partir de halogênio e CN; também selecionados de modo especialmente preferido a partir do grupo consistindo de F, Cl, CN e CH3; selecionados de modo mais preferido a partir do grupo consistindo de F, Cl e CN; também mais preferencialmente fenila, que é substituída por quatro substituinte selecionados a partir do grupo consistindo de halogênio, CN, NO2, alquila-C1-C6, haloalquila-C1-C6, OH, alcóxi-C1-C6, alquiltio-C1-C6, (alquil-C1- C6)sulfinila, (alquil-C1-C6)sulfonila, amino, (alquil-C1-C6)amino, di(alquil-C1- C6)amino, (alquil-C1-C6)-carbonila, (alcóxi-C1-C6)carbonila; selecionados de modo particularmente preferido a partir do grupo consistindo de halogênio, CN, alquila-C1-C6 e alcóxi-C1-C6; selecionados de modo especialmente preferido a partir de halogênio e CN; também selecionados de modo especialmente preferido a partir do grupo consistindo de F, Cl, CN e CH3; selecionados de modo mais preferido a partir do grupo consistindo de F, Cl e CN.

[0301] Também são preferidas as azinas de fórmula (I), em que A é em que: Ra e Re, independentemente um do outro, são halogênio, CN, NO2, alquila-C1-C6, haloalquila-C1-C6, OH, alcóxi-C1-C6, alquiltio-C1-C6, (alquil-C1- C6)sulfinila, (alquil-C1-C6)sulfonila, amino, (alquil-C1-C6)-amino, di(alquil-C1- C6)amino, (alquil-C1-C6)-carbonila, (alcóxi-C1-C6)carbonila; e Rb, Rc e Rd, independentemente um do outro, são hidrogênio, halogênio, CN, NO2, alquila-C1-C6, haloalquila-C1-C6, OH, alcóxi-C1-C6, alquiltio- C1-C6, (alquil-C1-C6)sulfinila, (alquil-C1-C6)sulfonila, amino, (alquil-C1-C6)amino, di(alquil-C1-C6)amino, (alquil-C1-C6)-carbonila, (alcóxi-C1-C6)carbonila; de modo particularmente preferido Ra e Re, independentemente um do outro, são halogênio, CN, alquila-C1-C6 ou alcóxi-C1-C6; e Rb, Rc e Rd, independentemente um do outro, são hidrogênio, halogênio, CN, NO2, alquila-C1-C6, haloalquila-C1-C6 ou alcóxi-C1-C6; de modo especialmente preferido Ra e Re, independentemente um do outro, são halogênio ou CN; e Rb, Rc e Rd, independentemente um do outro, são hidrogênio, halogênio, CN, alquila-C1-C6 ou alcóxi-C1-C6; de modo mais preferido Ra e Re são halogênio; e Rb, Rc e Rd, independentemente um do outro, são hidrogênio, halogênio ou CN; de modo mais preferido Ra e Re são halogênio; e Rb, Rc e Rd são hidrogênio; também de modo mais preferido Ra, Rb, Rd e Re são halogênio; e Rc hidrogênio; também de modo mais preferido Ra, Rb, Rc, Rd e Re são halogênio.

[0302] Também são preferidas as azinas de fórmula (I), em que A é em que: Ra é halogênio ou CN; - Rb e Rd são H, halogênio ou CN; - Rc é H ou halogênio; - Re é halogênio, CN ou alquila-C1-C6; de modo preferido Ra é halogênio; Rb, Rc e Rd são H ou halogênio; e Re é halogênio ou CN; de modo especialmente preferido; Ra, Rb, Rd e Re são halogênio; e Rc é H ou halogênio; de modo mais preferido; Ra, Rb, Rd e Re são F; e Rc é H ou F.

[0303] São especialmente preferidas as azinas de Fórmula (I), em que A é selecionado do grupo consistindo de (A.1.1), (A.1.2) e (A.1.3); mais preferivelmente selecionadas a partir do grupo consistindo de (A.1.2) e (A.1.3); em que: Ra e Re, independentemente um do outro, são halogênio, CN, NO2, alquila-C1-C6, haloalquila-C1-C6, OH, alcóxi-C1-C6, alquiltio-C1-C6, (alquil-C1- C6)sulfinila, (alquil-C1-C6)sulfonila, amino, (alquil-C1-C6)-amino, di(alquil-C1- C6)amino, (alquil-C1-C6)-carbonila, (alcóxi-C1-C6)carbonila; e Rb e Rd, independentemente um do outro, são halogênio, CN, NO2, alquila-C1-C6, haloalquila-C1-C6, OH, alcóxi-C1-C6, alquiltio-C1-C6, (alquil-C1- C6)sulfinila, (alquil-C1-C6)sulfonila, amino, (alquil-C1-C6)-amino, di(alquil-C1- C6)amino, (alquil-C1-C6)-carbonila, (alcóxi-C1-C6)carbonila; de modo particularmente preferido Ra e Re, independentemente um do outro, são halogênio, CN, alquila-C1-C6 ou alcóxi-C1-C6; e Rb e Rd, independentemente um do outro, são halogênio, CN, NO2, alquila-C1-C6, haloalquila-C1-C6 ou alcóxi-C1-C6; de modo especialmente preferido Ra e Re, independentemente um do outro, são halogênio ou CN; e Rb e Rd, independentemente um do outro, são halogênio, CN, alquila-C1-C6 ou alcóxi-C1-C6; de modo mais preferido Ra e Re são halogênio; e Rb e Rd, independentemente um do outro, são halogênio ou CN; também de modo mais preferido Ra, Rb, Rd e Re são halogênios.

[0304] Também são especialmente preferidas as azinas de formula (I), em que A éem que Ra, Rb, Rd e Re têm os significados, particularmente os significados preferidos, conforme definido acima.

[0305] Também são especialmente preferidas as azinas de fórmula (I), em que A éem que Ra, Rb e Re têm os significados, particularmente os significados preferidos, conforme definido acima.

[0306] Também são especialmente preferidas as azinas de fórmula (I), em que A éem que Ra e Re têm os significados, particularmente os significados preferidos, conforme definido acima.

[0307] Também são preferidas as azinas de fórmula (I), em que A é 2-fluoro-fenila, que é substituída por um a quatro substituintes selecionados a partir do grupo consistindo de halogênio, CN, NO2, alquila-C1-C6, haloalquila-C1-C6, OH, alcóxi-C1-C6, alquiltio-C1-C6, (alquil-C1- C6)sulfinila, (alquil-C1-C6)sulfonila, amino, (alquil-C1-C6)amino, di(alquil-C1- C6)amino, (alquil-C1-C6)-carbonila e (alcóxi-C1-C6)-carbonila; é particularmente preferido a 2-fluoro-fenila, que é substituída por um a quatro substituintes selecionados a partir do grupo consistindo de halogêneo, CN, alquila-C1- C6 e alcóxi-C1-C6; sendo preferivelmente selecionados a partir de halogênio e CN; também selecionados de modo preferido a partir do grupo consistindo de F, Cl, CN e CH3; selecionados de modo especialmente preferido a partir do grupo consistindo de F, Cl e CN; é especialmente preferida a 2-fluoro-fenila, que é substituída por um a três substituintes selecionados a partir do grupo consistindo de halogênio, CN, NO2, alquila-C1-C6, haloalquila-C1-C6, OH, alcóxi-C1-C6, alquiltio-C1-C6, (alquil-C1-C6)sulfinila, (alquil-C1-C6)sulfonila, amino, (alquil-C1-C6)amino, di(alquil-C1-C6)amino, (alquil-C1-C6)-carbonila e (alcóxi-C1-C6)-carbonila; selecionados de modo particularmente preferido a partir do grupo consistindo de halogênio, CN, alquila-C1-C6 e alcóxi-C1-C6; selecionados de modo especialmente preferido a partir de halogênio e CN; também selecionados de modo especialmente preferido a partir do grupo consistindo de F, Cl, CN e CH3; mais preferivelmente selecionada a partir do grupo consistindo de F, Cl e CN; mais preferencialmente 2-fluoro-fenila, que é substituída por um substituinte selecionados a partir do grupo consistindo de halogênio, CN, NO2, alquila-C1-C6, haloalquila-C1-C6, OH, alcóxi-C1-C6, alquiltio-C1-C6, (alquil-C1- C6)sulfinila, (alquil-C1-C6)sulfonila, amino, (alquil-C1-C6)amino, di(alquil-C1- C6)amino, (alquil-C1-C6)-carbonila e (alcóxi-C1-C6)carbonila; selecionados de modo particularmente preferido a partir do grupo consistindo de halogênio, CN, alquila-C1-C6 e alcóxi-C1-C6; selecionados de modo especialmente preferido a partir de halogênio e CN; também selecionados de modo especialmente preferido a partir do grupo consistindo de F, Cl, CN e CH3; mais preferivelmente selecionada a partir do grupo consistindo de F, Cl e CN; também mais preferencialmente 2-fluoro-fenila, que é substituída por dois substituintes; selecionados a partir do grupo consistindo de halogênio, CN, NO2, alquila-C1-C6, haloalquila-C1-C6, OH, alcóxi-C1-C6, alquiltio-C1-C6, (alquil-C1- C6)sulfinila, (alquil-C1-C6)sulfonila, amino, (alquil-C1-C6)amino, di(alquil-C1- C6)amino, (alquil-C1-C6)-carbonila e (alcóxi-C1-C6)carbonila; selecionados de modo particularmente preferido a partir do grupo consistindo de halogênio, CN, alquila-C1-C6 e alcóxi-C1-C6; selecionados de modo especialmente preferido a partir de halogênio e CN; também selecionados de modo especialmente preferido a partir do grupo consistindo de F, Cl, CN e CH3; mais preferivelmente selecionada a partir do grupo consistindo de F, Cl e CN; mais preferencialmente 2-fluoro-fenila, que é substituída por três substituintes; - selecionados a partir do grupo consistindo de halogênio, CN, NO2, alquila-C1-C6, haloalquila-C1-C6, OH, alcóxi-C1-C6, alquiltio-C1-C6, (alquil-C1- C6)sulfinila, (alquil-C1-C6)sulfonila, amino, (alquil-C1-C6)amino, di(alquil-C1- C6)amino, (alquil-C1-C6)-carbonila e (alcóxi-C1-C6)carbonila; - selecionados de modo particularmente preferido a partir do grupo consistindo de halogênio, CN, alquila-C1-C6 e alcóxi-C1-C6; - selecionados de modo especialmente preferido a partir de halogênio e CN; - também selecionados de modo especialmente preferido a partir do grupo consistindo de F, Cl, CN e CH3; selecionados de modo mais preferido a partir do grupo consistindo de F, Cl e CN.

[0308] Também são preferidas as azinas de fórmula (I), em que A é em que: Ra é halogênio, CN, NO2, alquila-C1-C6, haloalquila-C1-C6, OH, alcóxi-C1-C6, alquiltio-C1-C6, (alquil-C1-C6)sulfinila, (alquil-C1-C6)sulfonila, amino, (alquil-C1-C6)-amino, di(alquil-C1-C6)amino, (alquil-C1-C6)-carbonila, (alcóxi-C1- C6)carbonila; e Rb, Rc e Rd, independentemente um do outro, são hidrogênio, halogênio, CN, NO2, alquila-C1-C6, haloalquila-C1-C6, OH, alcóxi-C1-C6, alquiltio- C1-C6, (alquil-C1-C6)sulfinila, (alquil-C1-C6)sulfonila, amino, (alquil-C1-C6)amino, di(alquil-C1-C6)amino, (alquil-C1-C6)-carbonila, (alcóxi-C1-C6)carbonila; de modo particularmente preferido Ra é halogênio, CN, alquila-C1- C6 ou alcóxi-C1-C6; e Rb, Rc e Rd, independentemente um do outro, são hidrogênio, halogênio, CN, NO2, alquila-C1-C6, haloalquila-C1-C6 ou alcóxi-C1-C6; de modo especialmente preferido Ra é halogênio ou CN; e Rb, Rc e Rd, independentemente um do outro, são hidrogênio, halogênio, CN, alquila-C1-C6 ou alcóxi-C1-C6; de modo mais preferido Ra é halogênio; e Rb, Rc e Rd, independentemente um do outro, são hidrogênio, halogênio ou CN; de modo mais preferido Ra é halogênio; e Rb, Rc e Rd são hidrogênio; também de modo mais preferido Ra, Rb e Rd são halogênio; e Rc é hidrogênio; também de modo mais preferido Ra, Rb, Rc e Rd são halogênio.

[0309] Também são preferidas as azinas de fórmula (I), em que A é em que: Ra é halogênio, CN ou alquila-C1-C6; Rb e Rd são H, halogênio ou CN; e Rc é H ou halogênio; de modo especialmente preferido Ra é halogênio ou CN; e Rb, Rc e Rd são H ou hidrogênio; de modo mais especialmente preferido Ra, Rb e Rd são halogênio; e Rc é H ou halogênio; -Também de modo especialmente preferido Ra, Rb e Rd são halogênio; e Rc é H, F, Br ou I; de modo mais preferido Ra, Rb e Rd são F; e Rc é F, Br ou I; de modo mais preferido Ra, Rb e Rd são F; e Rc é H ou F.

[0310] São especialmente preferidas as azinas de Fórmula (I), em que A é selecionado do grupo consistindo de (A.1a.1), (A.1a.2) e (A.1a.3); mais preferivelmente selecionadas a partir do grupo consistindo de (A.1.2) e (A.1.3); em que: Ra é halogênio, CN, NO2, alquila-C1-C6, haloalquila-C1-C6, OH, alcóxi-C1-C6, alquiltio-C1-C6, (alquil-C1-C6)sulfinila, (alquil-C1-C6)sulfonila, amino, (alquil-C1-C6)-amino, di(alquil-C1-C6)amino, (alquil-C1-C6)-carbonila, (alcóxi-C1- C6)carbonila; e Rb e Rd, independentemente um do outro, são halogênio, CN, NO2, alquila-C1-C6, haloalquila-C1-C6, OH, alcóxi-C1-C6, alquiltio-C1-C6, (alquil-C1- C6)sulfinila, (alquil-C1-C6)sulfonila, amino, (alquil-C1-C6)-amino, di(alquil-C1- C6)amino, (alquil-C1-C6)-carbonila, (alcóxi-C1-C6)carbonila; de modo particularmente preferido Ra é halogênio, CN, alquila-C1- C6 ou alcóxi-C1-C6; e Rb e Rd, independentemente um do outro, são halogênio, CN, NO2, alquila-C1-C6, haloalquila-C1-C6 ou alcóxi-C1-C6; de modo especialmente preferido Ra é halogênio ou CN; e Rb e Rd, independentemente um do outro, são halogênio, CN, alquila-C1-C6 ou alcóxi-C1-C6; de modo mais preferido Ra é halogênio; e Rb e Rd, independentemente um do outro, são halogênio ou CN; de modo mais preferido Ra, Rb e Rd são halogênio.

[0311] Também são especialmente preferidas as azinas de fórmula (I), em que A é em que Ra, Rb e Rd têm os significados, particularmente os significados preferidos, conforme definido acima.

[0312] Também são especialmente preferidas as azinas de fórmula (I), em que A éem que Ra e Rb têm os significados, particularmente os significados preferidos, conforme definido acima.

[0313] Também são especialmente preferidas as azinas de formula (I), em que A éem que Ra tem os significados, particularmente os significados preferidos, conforme definido acima.

[0314] Também são preferidas as azinas de fórmula (I), em que R1 H, CN, alquila-C1-C6, haloalquila-C1-C6, alcóxi-C1-C6-alquila- C1-C6, alcóxi-C1-C6, (alquil-C1-C6)carbonila ou (alquil-C1-C6)sulfonila; sendo particularmente preferido H, CN, alquila-C1-C6, alcóxi-C1-C6- alquila-C1-C6, alcóxi-C1-C6, (alquil-C1-C6)carbonila ou (alquil-C1-C6)sulfonila; sendo especialmente preferido H, CN, CH3, CH2OCH3, OCH3, COCH3 ou SO2CH3; sendo hidrogênio o mais preferido.

[0315] Também são preferidas as azinas de fórmula (I), em que R2 é H, halogênio, alquila-C1-C6 ou haloalquila-C1-C6; sendo particularmente preferido halogênio, alquila-C1-C6 ou haloalquila-C1-C6; e também particularmente preferido H, F, Cl, CH3 ou CF3.

[0316] Também são preferidas as azinas de fórmula (I), em que R3 e R4 são independentemente um do outro, H, halogênio, alquila- C1-C6 ou haloalquila-C1-C6; ou juntamente com o átomo de carbono ao qual estão ligados formam uma porção selecionada a partir do grupo consistindo de cicloalquila-C3-C6, cicloalquenila-C3-C6 e heterociclila possuindo de três a seis membros no anel, em que a cicloalquila-C3-C6, cicloalquenila-C3-C6 ou a heterociclila possuindo de três a seis membros no anel é não substituída ou substituída por um a três substituintes selecionados a partir de halogênio, CN, alquila-C1-C6 e alcóxi-C1-C6; independentemente um do outro, sendo particularmente preferido H, halogênio, alquila-C1-C6 ou haloalquila-C1-C6; ou juntamente com o átomo de carbono ao qual estão ligados formam uma porção selecionada a partir do grupo consistindo de cicloalquila-C3-C6 e cicloalquenila-C3-C6, em que a C3-C6-cicloalquila ou C3-C6-cicloalquenil é não substituída ou substituída por um a três substituintes selecionados a partir de halogênio, CN, alquila-C1-C6 e alcóxi-C1-C6; independentemente um do outro, sendo especialmente preferido H, halogênio, alquila-C1-C6 ou haloalquila-C1-C6; independentemente um do outro, sendo mais preferido H, halogênio ou alquila-C1-C6.

[0317] Também são preferidas as azinas de fórmula (I), em que R2 é H, halogênio, alquila-C1-C6; e R3 e R4 são independentemente um do outro, H, halogênio, alquila- C1-C6, ou juntamente com o átomo de carbono ao qual estão ligados formam uma C3-C6-cicloalquila; de modo particularmente preferido R2 é H, halogênio ou alquila-C1-C6; R3 é alquila-C1-C6; R4 é H, halogênio ou alquila-C1-C6; R3 e R4 juntamente com o átomo de carbono ao qual estão ligados formam uma cicloalquila-C3-C6; de modo particularmente preferido R2 é halogênio ou alquila- C1-C6; R3 é alquila-C1-C6; R4 é alquila-C1-C6; de modo mais preferido R2 é halogênio; e R3 e R4 são alquil-C1-C6.

[0318] Também são preferidas as azinas de fórmula (I), em que R5 H, CN, alquila-C1-C6, haloalquila-C1-C6, alcóxi-C1-C6-alquila- C1-C6, alcóxi-C1-C6, (alquil-C1-C6)carbonila ou (alquil-C1-C6)sulfonila; sendo particularmente preferido H, CN, alquila-C1-C6, alcóxi-C1-C6- alquila-C1-C6, alcóxi-C1-C6, (alquil-C1-C6)carbonila ou (alquil-C1-C6)sulfonila; sendo especialmente preferido H, CN, CH3, CH2OCH3, OCH3, COCH3 ou SO2CH3; sendo hidrogênio o mais preferido.

[0319] Também são preferidas as azinas de fórmula (I), em que A é fenila, que é substituída por dois a cinco substituintes selecionados a partir do grupo consistindo de halogênio, CN, alquila-C1-C6 e alcóxi-C1-C6; sendo preferivelmente selecionados a partir de halogênio e CN; também selecionados de modo preferido a partir do grupo consistindo de F, Cl, CN e CH3; selecionados de modo especialmente preferido a partir do grupo consistindo de F, Cl e CN; particularmente é preferida a fenila que é substituída por dois a cinco substituintes selecionados a partir do grupo consistindo de halogênio, CN, NO2, alquila-C1-C6, haloalquila-C1-C6, OH, alcóxi-C1-C6, alquiltio-C1-C6, (alquil-C1- C6)sulfinila, (alquil-C1-C6)sulfonila, amino, (alquil-C1-C6)amino, di(alquil-C1- C6)amino, (alquil-C1-C6)-carbonila, (alcóxi-C1-C6)carbonila; selecionados de modo particularmente preferido a partir do grupo consistindo de halogênio, CN, alquila-C1-C6 e alcóxi-C1-C6; selecionados de modo especialmente preferido a partir de halogênio e CN; também selecionados de modo especialmente preferido a partir do grupo consistindo de F, Cl, CN e CH3; mais preferivelmente selecionada a partir do grupo consistindo de F, Cl e CN; de modo especialmente preferido, fenila, que é substituída por dois substituintes selecionados a partir do grupo consistindo de halogênio, CN, NO2, alquila-C1-C6, haloalquila-C1-C6, OH, alcóxi-C1-C6, alquiltio-C1-C6, (alquil-C1- C6)sulfinila, (alquil-C1-C6)sulfonila, amino, (alquil-C1-C6)amino, di(alquil-C1- C6)amino, (alquil-C1-C6)-carbonila, (alcóxi-C1-C6)carbonila; selecionados de modo particularmente preferido a partir do grupo consistindo de halogênio, CN, alquila-C1-C6 e alcóxi-C1-C6; selecionados de modo especialmente preferido a partir de halogênio e CN; também selecionados de modo especialmente preferido a partir do grupo consistindo de F, Cl, CN e CH3; mais preferivelmente selecionada a partir do grupo consistindo de F, Cl e CN; sendo mais especialmente preferido uma fenila, que é substituída por três substituintes selecionados a partir do grupo consistindo de halogênio, CN, NO2, alquila-C1-C6, haloalquila-C1-C6, OH, alcóxi-C1-C6, alquiltio-C1-C6, (alquil-C1- C6)sulfinila, (alquil-C1-C6)sulfonila, amino, (alquil-C1-C6)amino, di(alquil-C1- C6)amino, (alquil-C1-C6)-carbonila, (alcóxi-C1-C6)carbonila; selecionados de modo particularmente preferido a partir do grupo consistindo de halogênio, CN, alquila-C1-C6 e alcóxi-C1-C6; selecionados de modo especialmente preferido a partir de halogênio e CN; também selecionados de modo especialmente preferido a partir do grupo consistindo de F, Cl, CN e CH3; mais preferivelmente selecionada a partir do grupo consistindo de F, Cl e CN; mais preferencialmente fenila, que é substituída por quatro substituintes selecionados a partir do grupo consistindo de halogênio, CN, NO2, alquila-C1-C6, haloalquila-C1-C6, OH, alcóxi-C1-C6, alquiltio-C1-C6, (alquil-C1- C6)sulfinila, (alquil-C1-C6)sulfonila, amino, (alquil-C1-C6)amino, di(alquil-C1- C6)amino, (alquil-C1-C6)-carbonila, (alcóxi-C1-C6)carbonila; selecionados de modo particularmente preferido a partir do grupo consistindo de halogênio, CN, alquila-C1-C6 e alcóxi-C1-C6; selecionados de modo especialmente preferido a partir de halogênio e CN; também selecionados de modo especialmente preferido a partir do grupo consistindo de F, Cl, CN e CH3; mais preferivelmente selecionada a partir do grupo consistindo de F, Cl e CN; R1 H, CN, alquila-C1-C6, haloalquila-C1-C6, alcóxi-C1-C6-alquila- C1-C6, alcóxi-C1-C6, (alquil-C1-C6)carbonila ou (alquil-C1-C6)sulfonila; sendo particularmente preferido H, CN, alquila-C1-C6, alcóxi- C1-C6-alquila-C1-C6, alcóxi-C1-C6, (alquil-C1-C6)carbonila ou (alquil-C1- C6)sulfonila; sendo especialmente preferido H, CN, CH3, CH2OCH3, OCH3, COCH3 ou SO2CH3; sendo hidrogênio o mais preferido.

[0320] R2 é H, halogênio, alquila-C1-C6 ou haloalquila-C1-C6; sendo particularmente preferido halogênio, alquila-C1-C6 ou haloalquila-C1-C6; e também particularmente preferido H, F, CH3 ou CF3.

[0321] R3 e R4 são independentemente um do outro, H, halogênio, alquila-C1-C6 ou haloalquila-C1-C6; ou juntamente com o átomo de carbono ao qual estão ligados formam uma porção selecionada a partir do grupo consistindo de cicloalquila-C3-C6, cicloalquenila-C3-C6 e heterociclila possuindo de três a seis membros no anel, em que a cicloalquila-C3-C6, cicloalquenila-C3-C6 ou a heterociclila possuindo de três a seis membros no anel é não substituída ou substituída por um a três substituintes selecionados a partir de halogênio, CN, alquila-C1-C6 e alcóxi-C1-C6; independentemente um do outro, é particularmente preferido H, halogênio, alquila-C1-C6 ou haloalquila-C1-C6; ou juntamente com o átomo de carbono ao qual estão ligados formam uma porção selecionada a partir do grupo consistindo de cicloalquila-C3-C6 e cicloalquenila-C3-C6, em que a C3-C6-cicloalquila ou C3-C6-cicloalquenil é não substituída ou substituída por um a três substituintes selecionados a partir de halogênio, CN, alquila-C1-C6 e alcóxi-C1-C6; independentemente um do outro, sendo especialmente preferido H, halogênio, alquila-C1-C6 ou haloalquila-C1-C6; independentemente um do outro, sendo mais preferido H, halogênio ou alquila-C1-C6; e; R5 H, CN, alquila-C1-C6, haloalquila-C1-C6, alcóxi-C1-C6-alquila- C1-C6, alcóxi-C1-C6, (alquil-C1-C6)carbonila ou (alquil-C1-C6)sulfonila; sendo particularmente preferido H, CN, alquila-C1-C6, alcóxi- C1-C6-alquila-C1-C6, alcóxi-C1-C6, (alquil-C1-C6)carbonila ou (alquil-C1- C6)sulfonila; sendo especialmente preferido H, CN, CH3, CH2OCH3, OCH3, COCH3 ou SO2CH3; sendo hidrogênio o mais preferido.

[0322] Uma preferência particular é dada às azinas de fórmula (I.a), que correspondem a azinas de Fórmula (I) em que A é (A.1) e R1 e R5 são H:em que as variáveis Ra, Rb, Rc, Rd, Re, R2, R3 e R4 têm os significados, em especial os significados preferidos, conforme definido acima.

[0323] É dada preferência especial as azinas das fórmulas (I.a.1) à (I.a.1406) da Tabela A, onde as definições das variáveis Ra, Rb, Rc, Rd, Re, R2, R3 e R4 são de particular importância para os compostos de acordo com a invenção, não só em combinação entre si, como também sozinhos:TABELA A

[0324] Os compostos herbicidas úteis para a presente invenção podem ser adicionalmente utilizados em conjunto com herbicidas adicionais para os quais a planta de colheita é naturalmente tolerante ou que foi tornada tolerante por mutagênese conforme descrito acima, ou para os quais a planta é resistente pela expressão de um ou mais transgenes adicionais conforme mencionado acima. Os herbicidas úteis para a presente invenção são frequentemente melhor aplicados juntamente com um ou mais herbicidas para a obtenção do controle de uma variedade mais ampla de vegetação indesejável. Quando usado juntamente com outros herbicidas (designados a seguir de composto B), os compostos reivindicados na presente invenção podem ser formulados com o(s) outro(s) herbicida(s) em mistura de tanque com o(s) outro(s) herbicida(s), ou aplicados sequencialmente com o(s) outro(s) herbicida(s).

[0325] O composto herbicida B adicional (componente B) é particularmente selecionado a partir dos herbicidas de classe b1) a b15): b1) inibidores da biossíntese de lipídeo; b2) inibidores da acetolactato sintase (Inibidores ALS); b3) inibidores da fotossíntese; b4) inibidores da protoporfirinogênio-IX, b5) herbicidas branqueadores (bleachers); b6) inibidores da enolpiruvil chiquimato 3-fosfato sintase (Inibidores EPSP); b7) inibidor da glutamina sintetases; b8) inibidores da 7,8-dihidropteroato sintase (inibidores DHP); b9) inibidores da mitose; b10) inibidores da síntese de ácidos graxos de cadeia muito longa (inibidores VLCFA); b11) inibidores da biossíntese de celulose; b12) herbicidas desacopladores; b13) herbicidas auxínicos; b14) inibidores do transporte de auxina; e b15) outros herbicidas selecionados a partir do grupo que consiste de bromobutida, clorflurenol, clorflurenol-metílico, cinmetilina, cumiluron, dalapon, dazomet, difenzoquat, difenzoquat-metilsulfato, dimetipin, DSMA, dimron, endotal e seus sais, etobenzanid, flamprop, flamprop- isopropílico, flamprop-metílico, flamprop-M-isopropílico, flamprop-M-metílico, flurenol, flurenol-butila, flurprimidol, fosamina, fosamina-amônio, indanofan, indaziflam, hidrazida malêica, mefluidide, metam, metiozolina (CAS 403640-27-7), metil-azida, brometo de metila, metil-dimron, iodeto de metila, MSMA, ácido oleico, oxaziclomefona, ácido pelargônico, piributicarb, quinoclamina, triaziflam, tridifano e 6 cloro-3-(2-ciclopropil-6-metilfenoxi)-4-piridazinol (CAS 499223-49-3) e seus sais e ésteres; incluindo os seus sais agricolamente aceitáveis ou derivados tais como éteres, ésteres ou amidas.

[0326] É dada preferência às composições de acordo com a presente invenção que compreendem pelo menos um herbicida B selecionado a partir dos herbicidas de classe b1, b6, b9, b10 e b11.

[0327] Exemplos de herbicidas B que podem ser utilizados em combinação com os compostos de fórmula (I) de acordo com a presente invenção são: - b1) a partir do grupo dos inibidores da biossíntese de lipídeo: herbicidas-ACC tais como aloxidim, aloxidim-sódico, butroxidim, cletodim, clodinafop, clodinafop-propargila, cicloxidim, cihalofop, cihalofop butílico, diclofop, cihalofope metílico, fenoxaprop, etil-fenoxaprop, fenoxaprop-P, fenoxaprop-P etílico, fluazifop, butil-fluazifop, fluazifop-P, fluazifop-P butílico, haloxifop, metil-haloxifop, haloxifop-P, haloxifop-P metílico, metamifop, pinoxaden, profoxidim, propaquizafop, quizalofop, quizalofop etílico, tefuril- quizalofop, quizalofop-P, quizalofop-P-etílico, tefuril-quizalofop-P, setoxidim, tepraloxidim, tralcoxidim, 4-(4'-Cloro-4-ciclo-propil-2'-fluoro[1,1'-bifenil]-3-il)-5-hidroxi- 2,2,6,6-tetrametil-2H-piran-3(6H)-ona (CAS 1312337-72-6); 4-(2',4'-Dicloro-4- ciclopropil[1,1'-bifenil]-3-il)-5-hidroxi-2,2,6,6-tetrametil-2H-piran-3(6H)-ona (CAS 1312337-45-3); 4-(4'-Cloro-4-etil-2'-fluoro[1,1'-bifenil]-3-il)-5-hidroxi-2,2,6,6- tetrametil-2H-piran-3(6H)-ona (CAS 1033757-93-5); 4-(2',4'-Dicloro-4-etil[1,1'- bifenil]-3-il)-2,2,6,6-tetrametil-2H-piran-3,5(4H,6H)-diona (CAS 1312340-84-3); 5-(Acetiloxi)-4-(4'-cloro-4-ciclopropil-2'-fluoro[1,1'-bifenil]-3-il)-3,6-dihidro- 2,2,6,6-tetrametil-2H-piran-3-ona (CAS 1312337-48-6); 5-(Acetiloxi)-4-(2',4'- dicloro-4-ciclopropil- [1,1'-bifenil]-3-il)-3,6-dihidro-2,2,6,6-tetrametil-2H-piran-3- ona; 5-(Acetiloxi)-4-(4'-cloro-4-etil-2'-fluoro[1,1'-bifenil]-3-il)-3,6-dihidro-2,2,6,6- tetrametil-2H-piran-3-ona (CAS 1312340-82-1); 5-(Acetiloxi)-4-(2',4'-dicloro-4- etil[1,1'-bifenil]-3-il)-3,6-dihidro-2,2,6,6-tetrametil-2H-piran-3-ona (CAS 1033760-55-2); éster metílico do ácido 4-(4'-cloro-4-ciclopropil-2'-fluoro[1,1'-bifenil]-3-il)- 5,6-dihidro-2,2,6,6-tetrametil-5-oxo-2H-piran-3-il carbônico (CAS 1312337-51-1); éster metílico do ácido 4-(2',4'-dicloro -4-ciclopropil- [1,1'-bifenil]-3-il)-5,6-dihidro- 2,2,6,6-tetrametil-5-oxo-2H-piran-3-il carbônico; éster metílico do ácido 4-(4'- cloro-4-etil-2'-fluoro[1,1'-bifenil]-3-il)-5,6-dihidro-2,2,6,6-tetrametil-5-oxo-2H- piran-3-il carbônico (CAS 1312340-83-2); éster metílico do ácido 4-(2',4'-dicloro- 4-etil-[1,1'-bifenil]-3-il)-5,6-dihidro-2,2,6,6-tetrametil-5-oxo-2H-piran-3-il carbônico (CAS 1033760-58-5); e herbicidas não-ACC tal como benfuresato, butilato, cicloato, dalapon, dimepiperato, EPTC, esprocarb, etofumesato, flupropanato, molinato, orbencarb, pebulato, prosulfocarb, TCA, tiobencarb, tiocarbazila, trialato e vernolato; - b2) a partir do grupo dos inibidores de ALS: sulfoniluréias tais como amidosulfuron, azimsulfuron, bensulfuron, bensulfuron-metil, clorimuron, clorimuron-etílico, clorsulfuron, cinosulfuron, ciclosulfamuron, etametsulfuron, etametsulfuron-metil, etoxisulfuron, flazasulfuron, flucetosulfuron, flupirsulfuron, flupirsulfuron-metil-sódico, foramsulfuron, halosulfuron, halosulfuron-metil, imazosulfuron, iodosulfuron, iodosulfuron-metil-sódico, iofensulfuron, iofensulfuron-sódio, mesosulfuron, metazosulfuron, metsulfuron, metsulfuron-metil, nicosulfuron, ortosulfamuron, oxasulfuron, primisulfuron, primisulfuron-metil, propirisulfuron, prosulfuron, pirazosulfuron, pirazosulfuron-etílico, rimsulfuron, sulfometuron, sulfometuron- metil, sulfosulfuron, tifensulfuron, tifensulfuron-metil, triasulfuron, tribenuron, tribenuron-metil, trifloxisulfuron, triflusulfuron, triflusulfuron-metil e tritosulfuron, imidazolinonas, tais como imazametabenz, imazametabenz-metil, imazamox, imazapic, imazapir, imazaquin e imazetapir, herbicidas triazolopirimidina e sulfonanilidas tais como cloransulam, cloransulam-metil, diclosulam, flumetsulam, florasulam, metosulam, penoxsulam, pirimisulfan e piroxsulam, pirimidinilbenzoatos, tais como bispiribaque, bispiribaque-sódico, piribenzoxim, piriftalid, piriminobaque, piriminobaque-metil, piritiobaque, piritiobaque-sódico, 4-[[[2-1-metil-etil éster do ácido [(4,6-dimetoxi-2- pirimidinil)oxi]fenil]metil]amino]-benzóico (CAS 420138-41-6), éster propílico do ácido 4-[[[2-[(4,6-dimetoxi-2-pirimidinil)oxi]fenil]-metil]amino]-benzóico (CAS 420138-40-5), N-(4-bromofenil)-2-[(4,6-dimetoxi-2- pirimidinil)oxi]benzenometanamina (CAS 420138-01-8), herbicidas sulfonilaminocarbonil-triazolinona, tais como flucarbazona, flucarbazona-sódica, propoxicarbazona, propoxicarbazona- sódica, tiencarbazona e tiencarbazona-metil; e triafamona; dentre estes, um exemplo de realização preferido da invenção diz respeito àquelas composições que compreendem pelo menos um herbicida imidazolinona; - b3) a partir do grupo dos inibidores da fotossíntese: micarbazona, inibidores do sistema fotossensível II, por exemplo, herbicidas triazina, incluindo clorotriazina, triazinonas, triazindionas, metiltiotriazinas e piridazinonas tais como ametrina, atrazina, cloridazona, cianazina, desmetrina, dimetametrina, hexazinona, metribuzina, prometon, prometrina, propazina, simazina, simetrina, terbumeton, terbutilazina, terbutrina e trietazina, aril-uréias, tais como clorobromuron, clorotoluron, cloroxuron, dimefuron, diuron, fluometuron, isoproturon, isouron, linuron, metamitron, metabenztiazuron, metobenzuron, metoxuron, monolinuron, neburon, siduron, tebuthiuron e tiadiazuron, fenila carbamatos tais como desmedifam, carbutilato, fenmedifam, fenmedifam- etil, herbicidas nitrila tais como bromofenoxim, bromoxinil e seus sais e ésteres, ioxinila e seus sais e ésteres, uracilas tais como bromacila, lenacila e terbacila, e bentazon e bentazon-sódico, piridato, piridafol, pentanoclor e propanila e inibidores do fotossistema I tais como diquate, diquate- dibrometo, paraquate, paraquate-dicloreto e paraquate-dimetilsulfato. Dentre estes, um exemplo de realização preferido da invenção diz respeito àquelas composições que compreendem pelo menos um herbicida ariluréia; Entre estes, um exemplo de realização também preferido da invenção dis respeito àquelas composições compreendendo pelo menos um herbicida triazina. Entre estes, um exemplo de realização também preferido da invenção dis respeito àquelas composições compreendendo pelo menos um herbicida nitrila; - b4) a partir do grupo de Inibidores de Protoporfirinogênio-IX- oxidase: acifluorfen, acifluorfen-sódico, azafenidin, bencarbazona, benzfendizona, bifenox, butafenacila, carfentrazona, carfentrazona-etil, clometoxifen, cinidon-etil, fluazolato, flufenpir, flufenpir-etil, flumicloraque, flumicloraque-pentílico, flumioxazin, fluoroglicofen, fluoroglicofen-etil, flutiacet, flutiacet-metil, fomesafen, halosafen, lactofen, oxadiargil, oxadiazon, oxifluorfen, pentoxazona, profluazol, piraclonila, piraflufen, piraflufen-etil, saflufenacila, sulfentrazona, tidiazimin, tiafenacila, acetato de [3-[2-cloro-4-fluoro-5-(1-metil-6-trifluorometil-2,4-dioxo-1,2,3,4- tetrahidropirimidin-3-il)fenoxi]-2-piridyloxi]etila (CAS 353292-31-6; S-3100), N-etil-3-(2,6-dicloro-4-trifluoro-metilfenoxi)-5-metil-1H-pirazol-1- carboxamida (CAS 452098-92-9), N-tetrahidrofurfuril-3-(2,6-dicloro-4- trifluorometilfenoxi)-5-metil-1H-pirazol-1-carboxamida (CAS 915396-43-9), N-etil-3-(2-cloro-6-fluoro-4-trifluorometil-fenoxi)-5-metil-1H-pirazol-1- carboxamida (CAS 452099-05-7), N-tetrahidro-furfuril-3-(2-cloro-6-fluoro-4- trifluoro-metilfenoxi)-5-metil-1H-pirazol-1-carboxamida (CAS 452100-03-7), 3-[7-fluoro-3-oxo-4-(prop-2-inil)-3,4-di-hidro-2H-benzo[1,4]oxazin-6-il]-1,5- dimetil-6-tioxo-[1,3,5]triazinan-2,4-diona, 1,5-dimetil-6-tioxo-3-(2,2,7- trifluoro-3-oxo-4-(prop-2-inil)-3,4-di-hidro-2H-benzo[b][1,4]oxazin-6-il)-1,3,5- triazinane-2,4-diona (CAS 1258836-72-4), 2-(2,2,7-Trifluoro-3-oxo-4-prop-2- inil-3,4-di-hidro-2H-benzo[1,4]oxazin-6-il)-4,5,6,7-tetrahidro-isoindol-1,3- diona, 1-Metil-6-trifluoro-metil-3-(2,2,7-tri-fluoro-3-oxo-4-prop-2-inil-3,4-di- hidro-2H-benzo[1,4]oxazin-6-il)-1H-pirimidina-2,4-diona, (E)-4-[2-cloro-5-[4- cloro-5-(difluorometoxi)-1H-metil-pirazol-3-il]-4-fluoro-fenoxi]-3-metoxi-but- 2-enoato metílico [CAS 948893-00-3], e 3-[7-cloro-5-fluoro-2-(trifluorometil)- 1H-benzimidazol-4-il]-1-metil-6-(trifluorometil)-1H-pirimidina-2,4-diona (CAS 212754-02-4); - b5) a partir do grupo de Herbicidas Branqueadores (Bleacher): inibidores de PDS: beflubutamid, diflufenican, fluridona, flurocloridona, flurtamona, norflurazon, picolinafen, e 4-(3-trifluorometil- fenoxi)-2-(4-trifluorometilfenil)-pirimidina (CAS 180608-33-7), inibidores de HPPD: benzobiciclon, benzofenap, clomazona, fenquintriona, isoxaflutol, mesotriona, pirasulfotol, pirazolinato, pirazoxifen, sulcotriona, tefuriltriona, tembotriona, topramezona e biciclopirona, bleacher com alvo desconhecido: aclonifen, amitrol e flumeturon; - b6) a partir do grupo dos inibidores de EPSP sintase: Glifosato, glifosato-isopropilamônio, glifosato-potássico e glifosato de trimésio (Sulfosato); - b7) a partir do grupo dos inibidores da glutamina sintase: bilanafos (bialafos), bilanafos-sódico, glufosinato, glufosinato-P e glufosinato-amônico; - b8) a partir do grupo dos inibidores da DHP sintase: asulam; - b9) a partir do grupo dos inibidores da mitose: compostos do grupo K1: dinitroanilinas tais como benfluralina, butralina, dinitramina, etalfluralina, flucloralina, oryzalina, pendimetalina, prodiamina e trifluralina, fosforamidatos tais como amiprofos, amiprofos- metil, e butamifos, herbicidas de ácido benzóico tais como clortal, clortal- dimetil, piridinas, tais como ditiopir e tiazopir, benzamidas tais como propizamida e tebutam; compostos do grupo K2: clorprofam, profam e carbetamida, dentre estes, compostos do grupo K1, especialmente as dinitroanilinas são preferidas; - b10) a partir do grupo dos inibidores de VLCFA: cloroacetamidas tais como acetoclor, alaclor, butaclor, dimetaclor, dimetenamida, dimetenamida-P, metazaclor, metolaclor, metolaclor-S, petoxamida, pretilaclor, propaclor, propisoclor e tenilclor, oxiacetanilidas tais como flufenacet e mefenacet, acetanilidas tais como difenamid, naproanilida, napropamida e napropamida-M, tetrazolinonas como fentrazamida, e outros herbicidas como anilofos, cafenstrol, fenoxasulfona, ipfencarbazona, piperofos, piroxasulfona e compostos isoxazolina das fórmulas II.1, II.2, II.3, II.4, II.5, II.6, II.7, II.8 e II.9 os compostos isoxazolina de fórmula (I) I são conhecidos no estado da técnica, por exemplo, WO 2006/024820, WO 2006/037945, WO 2007/071900 e WO 2007/096576; dentre os inibidores de VLCFA, é dada preferência às cloroacetamidas e oxacetamidas; - b11) a partir do grupo dos inibidores da biossíntese de celulose: clortiamida, diclobenila, flupoxam, isoxaben e 1 -Ciclohexil-5- pentafluorfeniloxi-14-[1,2,4,6]tiatriazin-3-ilamina; - b12) a partir do grupo dos herbicidas desacopladores: Dinoseb, dinoterb e DNOC e seus sais; - b13) a partir do grupo dos herbicidas auxinicos: 2.4- D e seus sais e ésteres tais como clacifos, 2,4-DB e seus sais e ésteres, aminociclopiraclor e seus sais e ésteres, aminopiralide e seus sais tais como aminopiralide-dimetilamônio, aminopiralide-tris(2- hidroxipropil)amônio e seus ésteres, benazolin, benazolin-etil, cloramben e seus sais e ésteres, clomeprop, clopiralid e seus sais e ésteres, dicamba e seus sais e ésteres, diclorprop e seus sais e ésteres, diclorprop-P e seus sais e ésteres, fluroxipir, fluroxipir-butometila, fluroxipir-meptila, halauxifen e seus sais e ésteres (CAS 943832-60-8); MCPA e seus sais e ésteres, MCPA- tioetila, MCPB e seus sais e ésteres, mecoprop e seus sais e ésteres, mecoprop-P e seus sais e ésteres, picloram e seus sais e ésteres, quincloraque, quinmeraque, TBA (2,3,6) e seus sais e ésteres e triclopir e seus sais e ésteres; a) b14) a partir do grupo dos inibidores do transporte de auxina: diflufenzopir, diflufenzopir-sódico, naptalam e naptalam-sódico; b) b15) a partir do grupo dos outros herbicidas: bromobutida, clorflurenol, clorflurenol-metil, cinmetilin, cumiluron, ciclopirimorato (CAS 499223-49-3) e seus sais e ésteres, dalapon, dazomet, difenzoquat, difenzoquat-metilssulfato, dimetipin, DSMA, dimron, endotal e seus sais, etobenzanid, flamprop, flamprop-isopropila, flamprop-metila, flamprop-M- isopropila, flamprop-M-metila, flurenol, flurenol-butila, flurprimidol, fosamina, fosamina-amônio, indanofan, indaziflam, hidrazida maleica, mefluidide, metam, metiozolin (CAS 403640-27-7), azida de metila, brometo de metila, metil-dimron, iodeto de metila, MSMA, ácido oleico, oxaziclomefona, ácido pelargônico, piributicarb, quinoclamina, triaziflam e tridifane.

[0328]Os compostos ativos B e C possuindo um grupo carboxila podem ser utilizados na forma do ácido, na forma de um sal agricolmente adequado como mencionado acima ou então sob a forma de um derivado agricolmente aceitável nas composições de acordo com a invenção.

[0329] No caso do dicamba, os sais adequados incluem aqueles em que o contra-íon é um cátion aceitável para o cultivo. Por exemplo, sais aceitáveis de dicamba são dicamba-sódio, dicamba-potássio, dicamba- metilamônio, dicamba-dimetilamônio, dicamba-isopropilamônio, dicamba- diglicolamina, dicamba-olamina, dicamba-diolamina, dicamba-trolamina, dicamba-N,N-bis-(3-aminopropil)metilamina e dicamba-dietilenetriamina. Exemplos de um éster adequado são dicamba-metil e dicamba-butotil.

[0330]Sais adequados de 2,4-D são 2,4-D-amônio, 2,4-D- dimetilamônio, 2,4-D-dietilamônio, 2,4-D-dietanolamônio (2,4-D-diolamina), 2,4-D-trietanol-amônio, 2,4-D-isopropilamônio, 2,4-D-tri-isopropanolamônio, 2,4-D-heptilamônio, 2,4-D-dodecilamônio, 2,4-D-tetradecilamônio, 2,4-D- trietilamônio, 2,4-D-tris(2-hidroxipropil)amônio, 2,4-D-tris(isopropil)-amônio, 2,4-D-trolamina, 2,4-D-lítio, 2,4-D-sódio. Exemplos de éster adequados de 2,4-D são 2,4-D-butotila, 2,4-D-2-butoxipropila, 2,4-D-3-butoxipropila, 2,4-D- butila, 2,4-D-etila, 2,4-D-etilhexila, 2,4-D-isobutila, 2,4-D-iso-octila, 2,4-D- isopropila, 2,4-D-meptila, 2,4-D-metila, 2,4-D-octila, 2,4-D-pentila, 2,4-D- propila, 2,4-D-tefurila e clacifos.

[0331]Sais adequados de 2,4-DB são, por exemplo, 2,4-DB- sódio, 2,4-DB-potássio e 2,4-DB-dimetil-amônio. Ésteres adequados de 2,4- DB são, por exemplo, 2,4-DB-butila e 2,4-DB-isoctila.

[0332]Sais adequados de diclorprop são, por exemplo, diclorprop-sódio, diclorprop-potássio e diclorprop-dimetilamônio. Exemplos de éster adequados de diclorprop são diclorprop-butotila e diclorprop- isoctila.

[0333]Sais e ésteres adequados de MCPA incluem MCPA- butotila, MCPA-butila, MCPA-dimetilamônio, MCPA-diolamina, MCPA-etila, MCPA-tioetila, MCPA-2-etilhexila, MCPA-isobutila, MCPA-isoctila, MCPA- isopropila, MCPA-isopropilamônio, MCPA-metila, MCPA-olamina, MCPA- potássio, MCPA-sódio e MCPA-trolamina.

[0334] Um sal adequado de MCPB é MCPB-sódio. Um éster adequado de MCPB é MCPB-etila.

[0335]Sais adequados de clopiralid são clopiralid-potássio, clopiralid-olamina e clopiralid-tris-(2-hidroxipropil)amônio. Exemplos de um éster adequado de clopiralid é clopiralid-metila.

[0336]Exemplos de ésteres adequados de fluroxipir são fluroxipir-meptila e fluroxipir-2-butoxi-1-metiletila, em que fluroxipir-meptila é preferido.

[0337]Sais adequados de picloram são picloram-dimetilamônio, picloram-potássio, picloram-tri-isopropanolamônio, picloram-tri-isopropilamônio e picloram-trolamina. Um éster adequado de picloram é picloram-isoctila.

[0338] Um sal adequado de triclopir é triclopir-trietilamônio. Ésteres adequados de triclopir são, por exemplo, triclopir-etila e triclopir- butotila.

[0339]Sais e ésteres adequados de cloramben incluem cloramben-amônio, cloramben-diolamina, cloramben-metila, cloramben- metilamônio e cloramben-sódio. Sais e ésteres adequados de 2,3,6-TBA incluem 2,3,6-TBA-dimetilamônio, 2,3,6-TBA-lítio, 2,3,6-TBA-potássio e 2,3,6-TBA-sódio.

[0340]Sais e ésteres adequados de aminopiralide incluem aminopiralide-potássio, aminopiralide-dimetilamônio, e amino-piralid-tris(2- hidroxipropil)amônio.

[0341]Sais adequados de glifosato são, por exemplo, glifosato- amônio, glifosato-diamônio, glifoste-dimetilamônio, glifosato-isopropilamônio, glifosato-potássio, glifosato-sódio, glifosato-tremésico bem como os sais etanolamina e dietanolamina, preferencialmente glifosato- diamônio, glifosato-isopropilamônio e glifosato-tremésico (sulfosato).

[0342]Um sal adequado de glufosinato é, por exemplo, glufosinato-amônico.

[0343]Um sal adequado de glufosinato-P é, por exemplo, glufosinato-P-amônico.

[0344]Sais e ésteres adequados de bromoxinil são, por exemplo, bromoxinil-butirato, bromoxinil-heptanoato, bromoxinil-octanoato, bromoxinil-potássico e bromoxinil-sódico.

[0345]Sais e ésteres adequados de ioxonil são, por exemplo, ioxonil-octanoato, ioxonil-potássio e ioxonil-sódio.

[0346]Sais e ésteres adequados de mecoprop incluem mecoprop-butotila, mecoprop-dimetilamônio, mecoprop-diolamina,mecoprop-etadila, mecoprop-2-etil-hexila, mecoprop-isoctila, mecoprop- metila, mecoprop-potássio, mecoprop-sódio e mecoprop-trolamina.

[0347]Sais adequados de mecoprop-P são, por exemplo, mecoprop-P-butotila, mecoprop-P-dimetilamônio, mecoprop-P-2-etil-hexila, mecoprop-P-isobutila, mecoprop-P-potássio e mecoprop-P-sódio.

[0348]Um sal adequado de diflufenzopir é, por exemplo, diflufenzopir-sódio.

[0349]Um sal adequado de naptalam é, por exemplo, naptalam- sódico.

[0350]Os sais e ésteres adequados de aminociclopiraclor são, por exemplo, aminociclopiraclor-dimetilamônio, aminociclopiraclor-metila, aminociclopiraclor-tri-isopropanolamônio, aminociclopiraclor-sódico e aminociclopiraclor-potássico.

[0351]Um sal adequado de quincloraque é, por exemplo,quincloraque-dimetilamônio.

[0352] Um sal adequado de quinmeraque é, por exemplo,quincloraque-dimetilamônio.

[0353] Um sal adequado de imazamox é, por exemplo,imazamox-amônio.

[0354]Sais adequados de imazapique são, por exemplo, imazapique-amônio e imazapique-isopropilamônio.

[0355]Sais adequados de imazapir são, por exemplo, imazapir- amônio e imazapir-isopropilamônio.

[0356] Um sal adequado de imazaquin é, por exemplo,imazaquin-amônio.

[0357]Sais adequados de imazetapir são, por exemplo,imazetapir-amônio e imazetapir-isopropilamônio.

[0358] Um sal adequado de topramezona é, por exemplo, topramezona-sódica.

[0359]Os compostos herbicidas B particularmente preferidos são os herbicidas B conforme definido acima; em particular os herbicidas B.1 - B.189 listados abaixo na tabela B:TABELA B

[0360] Além disso, pode ser útil aplicar os compostos de fórmula (I) em combinação com agentes de proteção (fitoprotetores) e, opcionalmente, com um ou mais heribicides adicionais. Os fitoprotetores são compostos químicos que previnem ou reduzem os danos em plantas úteis, sem ter um impacto importante sobre a ação herbicida dos compostos de fórmula (I) em relação às plantas indesejáveis. Eles podem ser aplicados antes da semeadura (por exemplo, sobre a semente, brotos ou mudas) ou podem ser aplicados na pré- emergência ou pós-emergência das plantas úteis. Os fitoprotetores e o composto diaminotriazina de fórmula (I) e/ou os herbicidas B podem ser aplicados de maneira simultânea ou sucessiva.

[0361] Os fitoprotetores adequados são, por exemplo, ácidos (quinolin-8-oxi)acéticos, ácidos 1-fenil-5-haloalquil-1H-1,2,4-triazol-3-carboxílicos, ácidos 1-fenil-4,5-dihidro-5-alquil-1H-pirazol-3,5-dicarboxílicos, ácidos 4,5-dihidro-5,5-diaril-3-isoxazol carboxílicos, dicloroacetamidas, alfa- oximinofenilacetonitrilas, acetofenonoximas, 4,6-dihalo-2-fenilpirimidinas, N-[[4- (aminocarbonil)fenil]sulfonil]-2-benzóico amidas, ácidos 1,8-anidrido naftálico, 2- halo-4-(haloalquil)-5-tiazol carboxílicos, fosfortiolatos e N-alquil-O-fenil- carbamatos e seus sais agricolamente aceitáveis e seus derivados agricolamente aceitáveis tais como amidas, ésteres, e tioésteres, contanto que eles tenham um grupo ácido.

[0362] Exemplos de fitoprotetores C preferidos são benoxacor, cloquintocet, ciometrinila, ciprosulfamida, diclormid, diciclonon, dietolato, fenclorazol, fenclorim, flurazol, fluxofenim, furilazol, isoxadifen, mefenpir, mefenato, anidrido naftálico, oxabetrinila, 4 (dicloroacetil)-1-oxa-4- azaspiro[4.5]decano (MON4660, CAS 71526-07-3), 2,2,5-trimetil-3-(dicloroacetil)-1,3-oxazolidina (R 29148, CAS 52836-31 -4) e N-(2- Metoxibenzoil)-4-[(metilaminocarbonil)amino]benzenosulfonamida (CAS 129531-12-0).

[0363] Os fitoprotetores C particularmente preferidos são os seguintes compostos de C.1 a C.17:

[0364] Os compostos ativos B de grupos b1) a b15) e os compostos ativos C são herbicidas e fitoprotetores conhecidos, vide, por exemplo, The Compendium of Pesticide Common Names (http://www.alanwood.net/pesticides/); Farm Chemicals Handbook 2000 volume 86, Meister Publishing Company, 2000; B. Hock, C. Fedtke, R. R. Schmidt, Herbizide [Herbicides], Georg Thieme Verlag, Stuttgart 1995; W. H. Ahrens, Herbicide Handbook, 7B edição, Weed Science Society of America, 1994; e K. K. Hatzios, Herbicide Handbook, Suplemento para a 7a edição, Weed Science Society of America, 1998. 2,2,5-Trimetil-3-(dicloroacetil)-1,3-oxazolidina [CAS No. 52836-31-4] também referido como R-29148. 4-(Dicloroacetil)-1-oxa-4- azaspiro[4.5]decano [CAS No. 71526-07-3] também referido como AD-67 e MON 4660.

[0365] A atribuição dos compostos ativos aos respectivos mecanismos de ação é baseada no atual conhecimento. Se diversos mecanismos de ação se aplicam a um composto ativo, esta substância a atribuaída a apenas um mecanismo de ação.

[0366] Geralmente é preferido utilizar os compostos da invenção em combinação com herbicidas que são seletivos para a cultura a ser tratada e que complementam o espectro de ervas daninhas controladas por estes compostos na taxa de aplicação utilizada. É ainda geralmente preferido aplicar os compostos da invenção e outros herbicidas complementares ao mesmo tempo, ou como uma formulação combinada ou como uma mistura de tanque.

[0367] Em outro exemplo de realização, a presente invenção diz respeito a um método para identificar um herbicida usando uma TriA mutada codificada por um ácido nucleico que compreende a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 1, ou uma forma variante ou derivada desta.

[0368] O referido método compreende as etapas de: c) gerar uma planta ou célula transgênica compreendendo um ácido nucleico que codifica uma TriA mutada, em que a TriA mutada é expressa; d) aplicação de um herbicida na célula ou planta transgênica de a) e em uma célula ou planta controle da mesma variedade; e) determinação do crescimento ou da viabilidade da célula ou planta transgênica e da célula ou planta controle após a aplicação do referido herbicida, e f) seleção dos herbicidas que conferem crescimento reduzido para a célula ou planta controle, em comparação com o crescimento da célula ou planta transgênica.

[0369] Conforme descrito acima, a presente invenção ensina composições e métodos para aumentar a tolerância ao herbicida em uma cultivar ou semente, em comparação com uma variedade da planta ou semente tipo selvagem. Em um exemplo de realização preferido, a tolerância ao herbicida de uma cultura ou semente é aumentada de modo a que a planta ou a semente pode resistir a uma aplicação do herbicida de aproximadamente 1-1000 g ia ha- 1, mais preferivelmente 1-200 g ia ha-1, ainda mais preferivelmente 1-150 g ia ha- 1, e mais preferivelmente 10-100 g ia ha-1. Conforme utilizado no presente, “resistir” ou “suportar” uma aplicação do herbicida significa que a planta não é morta nem lesionada por tal aplicação. Será entendido pelo técnico no assunto que a taxa de aplicação pode variar, dependendo das condições ambientais, tais como temperatura ou humidade, e dependendo do tipo de herbicida escolhido (ingrediente ativo - ai).

[0370] Os métodos pós-emergente de controle de plantas daninhas úteis em diversos exemplos de realização do presente documento utilizam taxas de aplicação de herbicidas de cerca > 0,3x; em alguns exemplos de realização, esta taxa pode ser de, por exemplo, > 0,3x,> 0,4x, > 0,5x, > 0,6x, > 0,7x, > 0,8x, > 0,9x, ou > 1x de herbicidas. Em um exemplo de realização, as plantas tolerantes a herbicida da presente invenção têm uma tolerância à aplicação pós- emergante de herbicidas a uma quantidade de aproximadamente 25 a cerca de 200 g ia/ha. Em alguns exemplos de realização, a planta tolerante a herbicida é uma dicotiledônea (por exemplo, soja, algodão), a aplicação pós-emergente dos herbicidas é feita em uma quantidade de cerca de 25-250 g ai/ha. Em outro exemplo de realização, a planta tolerante a herbicida é uma monocotiledônea (por exemplo, milho, arroz ou sorgo), a aplicação pós-emergente dos herbicidas é feita em uma quantidade de cerca de 200 g ai/ha. Em outros exemplos de realização, a planta tolerante a herbicida é uma Brassica (por exemplo, canola), a aplicação pós-emergente dos herbicidas é feita em uma quantidade de cerca de 25 g ai/ha. Nos métodos de controle de ervas daninhas pós-emergentes da presente invenção, em alguns exemplos de realização, o método pode utilizar taxas de aplicação de herbicidas cerca de 7 a 10 dias após a emergência das plantas. Em outro exemplo de realização, a taxa de aplicação dos herbicidas pode exceder em 8x; em alguns exemplos de realização, a taxa de aplicação dos herbicidas pode ser de até 4x, embora mais normalmente ela será de 2,5 vezes ou menos, ou cerca de 2x ou menos, ou cerca de 1x ou menos.

[0371] Além disso, a presente invenção provê métodos que envolvem o uso de pelo menos um herbicida, opcionalmente em combinação com um ou mais compostos herbicidas B, e, opcionalmente, com um fitoprotetor C, tal como descrito em detalhes acima.

[0372] Nestes métodos, o herbicida pode ser aplicado por qualquer método conhecido no estado da técnica, incluindo, mas não se limitado ao tratamento de sementes, tratamento do solo, e tratamento foliar. Antes da aplicação, o herbicida pode ser convertido nas formulações habituais, por exemplo, soluções, emulsões, suspensões, pó fino, pó, pastas e granulados. A forma de uso depende da finalidade específica; em cada caso, deve-se garantir uma distribuição fina e uniforme do composto de acordo com a invenção.

[0373] Ao fornecer plantas com maior tolerância ao herbicida, uma ampla variedade de formulações pode ser utilizada para proteger as plantas de ervas daninhas, de modo a aumentar o crescimento das plantas e reduzir a competição por nutrientes. Um herbicida pode ser usado sozinho para o controle de ervas daninhas na pré-emergência, pós-emergência, pré-plantio e plantio em áreas que rodeiam as cultivares descritas no presente, ou pode ser utilizada uma formulação de herbicida que contenha outros aditivos. O herbicida também pode ser utilizado como um tratamento de semente. Aditivos encontrados em uma formulação herbicida incluem outros herbicidas, detergentes, adjuvantes, agentes de espalhamento, agentes de adesão, agentes estabilizantes, ou similares. A formulação do herbicida pode ser uma preparação seca ou úmida e pode incluir, mas não está limitado a, pó fluido, concentrados emulsionáveis e concentrados líquidos. Os herbicidas e as formulações de herbicidas podem ser aplicados de acordo com métodos convencionais, por exemplo, pela pulverização, irrigação, polvilhamento, ou métodos similares.

[0374] As formulações adequadas estão descritas em detalhes nas publicações PCT/EP2009/063387 e PCT/EP2009/063386, que são incorporadas ao presente pela referência.

[0375] Tal como divulgado no presente, os ácidos nucleicos TriA da invenção encontram uso na melhoria da tolerância a herbicidas TriA de plantas que compreendem em seu genoma um gene que codifica uma proteína TriA tipo selvagem ou mutada que promove tolerância ao herbicida. Tal gene pode ser um gene endógeno ou um transgene, conforme descrito acima. Adicionalmente, em certos exemplos de realização, os ácidos nucleicos da presente invenção podem ser empilhados com qualquer combinação de sequências polinucleotídicas de interesse, a fim de criar plantas com um fenótipo desejado. Por exemplo, os ácidos nucleicos da presente invenção podem ser empilhados com outros polinucleotídeos que codificam polipeptídeos com atividade pesticida e/ou inseticida, tais como, por exemplo, proteínas toxinas de Bacillus thuringiensis (descritos nas Patentes US 5.366.892; US 5.747.450; US 5.737.514; US 5.723.756; US 5.593.881 e Geiser et al (1986) Gene 48: 109). 5-enolpiruvilchiquimato-3-fosfato sintase (EPSPS), glifosato acetil transferase (GAT), citocromo P450, fosfinotricina acetiltransferase (PAT), acetohidroxiácido sintase (AHAS; EC 4.1.3.18, também conhecido como acetolactato sintase ou ALS), hidroxifenil piruvato dioxigenase (HPPD), fitoeno-dessaturase (PD), protoporfirinogênio oxidase (PPO) e ezimas que degradam dicamba tal como divulgado no documento WO 02/068607, ou derivativos de ácido enzimas degradantes de fenoxiacético e ácido fenoxipropiônico conforme revelado nas Publicações WO 2008141154 ou WO 2005107437. As combinações geradas podem também incluir múltiplas cópias de qualquer um dos polinucleotídeos de interesse.

[0376] Consequentemente, as plantas tolerantes a herbicidas da invenção podem ser utilizadas em conjunto com um herbicida ao qual elas são tolerantes. Os herbicidas podem ser aplicados às plantas da invenção utilizando quaisquer técnicas conhecidas pelos técnicos hábeis no assunto. Os herbicidas podem ser aplicados em qualquer ponto do processo de cultivo das plantas. Por exemplo, os herbicidas podem ser aplicados no período pré-plantação, durante a plantação, pré-emergência, pós-emergência ou combinações dos mesmos. Os herbicidas podem ser aplicados às sementes e secos para formar uma camada sobre as sementes.

[0377] Em alguns exemplos de realização, as sementes são tratadas com um fitoprotetor, seguido por uma aplicação pós-emergente de um herbicida. Em um exemplo de realização, a aplicação pós-emergência dos herbicidas é de cerca de 7 a 10 dias após a plantação de sementes tratadas com o fitoprotetor. Em alguns exemplos de realização, o agente protetor é cloquintocet, diclormida, fluxofenim, ou combinações dos mesmos.

MÉTODOS DE CONTROLE DE ERVAS DANINHAS OU VEGETAÇÃO INDESEJADA

[0378] Em outros aspectos, a presente invenção provê um método para controlar ervas daninhas em um local de crescimento de uma planta ou parte desta planta, em que o método compreende: a aplicação de uma composição que compreende um herbicida ao local.

[0379] Em alguns aspectos, a presente invenção provê um método para controlar ervas daninhas em um local de crescimento de uma planta, em que o método compreende: a aplicação de uma composição herbicida compreendendo herbicidas ao local; em que o referido local é: (a) um local que contém: uma planta ou uma semente capaz de produzir a referida planta; ou (b) um local que, após a referida aplicação ser feita, deve conter a planta ou semente; em que a planta ou a semente compreende em pelo menos algumas de suas células um polinucleotídeo operacionalmente ligado a um promotor operável em células vegetais, cujo promotor é capaz de expressar um polipeptídeo TriA tipo selvagem ou mutado codificado pelo polinucleotídeo, em que a expressão do polipeptídeo TriA tipo selvagem ou mutado confere à planta tolerância a herbicidas.

[0380] As composições herbicidas da presente invenção podem ser aplicadas, por exemplo, como tratamentos foliares, tratamento do solo, tratamento de sementes, ou rega. A aplicação pode ser feita, por exemplo, por pulverização, polvilhamento, difusão, ou qualquer outro modo útil conhecido no estado da técnica.

[0381] Em um exemplo de realização, os herbicidas podem ser usados para controlar o crescimento de ervas daninhas que podem ser encontrados em crescimento na vizinhança das plantas tolerante a herbicidas da invenção. Em exemplos de realização deste tipo, um herbicida pode ser aplicado em um lote na qual as plantas resistentes a herbicidas da invenção estão crescendo na vizinhança de ervas daninhas. Um herbicida ao qual a planta tolerante a herbicidas da presente invenção é tolerante pode então ser aplicado ao terreno a uma concentração suficiente para matar ou inibir o crescimento das ervas daninhas. As concentrações de herbicida suficientes para matar ou inibir o crescimento das ervas daninhas são conhecidas no estado da técnica e estão descritas acima.

[0382] Em outros exemplos de realização, a presente invenção provê um método para controlar ervas daninhas na vizinhança de uma planta tolerante a herbicida da invenção. O método compreende a aplicação de uma quantidade eficaz de um herbicida nas ervas daninhas e na planta tolerante a herbicida auxínico, em que a planta tem uma maior tolerância ao herbicida quando comparada com uma planta tipo selvagem. Em alguns exemplos de realização, as plantas tolerantes a herbicida da invenção são, preferencialmente, culturas de plantas, incluindo, mas não se limitando a, girassol, alfalfa, Brassica sp., soja, algodão, cártamo, amendoim, tabaco, tomate, batata, trigo, arroz, milho, sorgo, cevada, centeio, milho e sorgo.

[0383] Em outros aspectos, o(s) herbicida(s) (por exemplo, herbicidas) também pode(m) ser utilizado(s) na forma de tratamento de semente. Em alguns exemplos de realização, uma concentração eficaz ou uma quantidade eficaz de herbicida(s), ou uma composição compreendendo uma concentração eficaz ou quantidade eficaz de herbicida(s) pode ser aplicada diretamente às sementes antes ou durante a semeadura das sementes. As formulações para tratamento de sementes podem adicionalmente compreender aglutinantes e opcionalmente colorantes.

[0384] Os aglutinantes ou ligantes podem ser adicionados para melhorar a adesão dos materiais ativos sobre as sementes após o tratamento. Em exemplos de realização, os aglutinantes ou ligantes adequados são tensoativos de copolímeros em bloco EO/PO, mas também polivinilalcóois, polivinilpirrolidonas, poliacrilatos, polimetacrilatos, polibutenos, poliisobutilenos, poliestireno, polietilenoaminas, polietilenoamidas, polietilenoiminas (Lupasol®, Polymin®), poliéteres, poliuretanos, polivinilacetato, tilose e copolímeros derivados desses polímeros. Opcionalmente, também podem ser incluídos corantes na formulação. Os corantes ou tintas apropriadas para formulações para tratamento de sementes são Rodamina B, C.I. pigmento Vermelho 112, C.I. solvente Vermelho 1, pigmento azul 15:4, pigmento azul 15:3, pigmento azul 15:2, pigmento azul 15:1, pigmento azul 80, pigmento amarelo 1, pigmento amarelo 13, pigmento vermelho 1:12, pigmento vermelho 48:2, pigmento vermelho 48:1, pigmento vermelho 57:1, pigmento vermelho 53:1, pigmento laranja 43, pig-ment laranja 34, pigmento laranja 5, pigmento verde 36, pigmento verde 7, pigmento branco 6, pigmento marron 25, violeta básico 10, violeta básico 49, vermelho ácido 51, vermelho ácido 52, vermelho ácido 14, azul ácido 9, amarelo ácido 23, vermelho básico 10, vermelho básico 108.

[0385] O termo tratamento de sementes compreende todas as técnicas de tratamento de sementes adequadas e conhecidas no estado da técnica, tais como tratamento de sementes, revestimento de sementes, polvilhamento de sementes, imersão de sementes e peletização de sementes. Em um exemplo de realização, a presente invenção provê um método de tratamento do solo pela aplicação, em particular, na linha de semeadura: seja em uma formulação granular contendo os herbicidas como uma composição/formulação (por exemplo, formulação granular), opcionalmente com um ou mais veículos sólidos ou líquidos, agricolamente aceitáveis e/ou, opcionalmente, com um ou mais agentes tensoativos agricolamente aceitáveis. Este método é vantajosamente utilizado, por exemplo, em canteiros de cereais, milho, algodão e girassol.

[0386] A presente invenção também compreende sementes revestidas com ou contendo uma formulação de tratamento de sementes compreendendo herbicidas e pelo menos outro herbicida, tal como, por exemplo, um inibidor de AHAS selecionado a partir do grupo que consiste de amidossulfuron, azimsulfuron, bensulfuron, clorimuron, clorsulfuron, cinossulfuron, ciclossulfamuron, etametsulfuron, etoxissulfuron, flazassulfuron, flupirsulfuron, foramsulfuron, halossulfuron, imazossulfuron, iodossulfuron, mesossulfuron, metsulfuron, nicosulfuron, oxassulfuron, primissulfuron, prossulfuron, pirazosulfuron, rimsulfuron, sulfometuron, sulfossulfuron, tifensulfuron, triassulfuron, tribenuron, trifloxisulfuron, triflussulfuron, tritossulfuron, imazametabenzo, imazamox, imazapic, imazapir, imazaquin, imazetapir, cloransulam, diclosulam, florassulame, flumetsulam, metosulam, penoxsulam, bispiribac, piriminobaque, propoxicarbazona, flucarbazona, piribenzoxim, piriftalide e piritiobaque.

[0387] Termo “revestido com e/ou contendo” geralmente significa que o ingrediente ativo está na maior parte da superfície do produto de propagação no momento da aplicação, embora uma parte maior ou menor do ingrediente possa penetrar no produto de propagação, dependendo do método de aplicação. Quando o referido produto de propagação é (re)plantado, ele pode absorver o ingrediente ativo.

[0388] Em alguns exemplos de realização, a aplicação do tratamento de sementes com herbicidas ou com uma formulação compreendendo os herbicidas é realizado por pulverização ou polvilhamento das sementes antes da semeadura das plantas e antes da emergência das plantas.

[0389] Em outros exemplos de realização, no tratamento de sementes, as formulações correspondentes são aplicadas tratando as sementes com uma quantidade eficaz de herbicida ou uma formulação compreendendo os herbicidas.

[0390] Em outros aspectos, a presente invenção provê um método para combater a vegetação indesejada ou controlar ervas daninhas compreendendo o contato das sementes das plantas tolerantes a herbicida da invenção com antes da semeadura e/ou após a pré-germinação com herbicidas. O método pode compreender ainda a semeadura das sementes, por exemplo, no solo em um campo ou em um meio de envasamento em estufa. O método encontra particular uso no combate à vegetação indesejada ou controle de ervas daninhas na proximidade imediata da semente. O controle da vegetação indesejável é entendido como a morte das ervas daninhas e/ou o retardamento ou inibição de outro modo do crescimento normal das ervas daninhas. Ervas daninhas ou plantas daninhas, no sentido mais amplo, são entendidas como todas aquelas plantas que crescem em locais onde são indesejadas.

[0391] As ervas daninhas da presente invenção incluem, por exemplo, ervas daninhas dicotiledôneas e monocotiledôneas. As ervas daninhas dicotiledôneas incluem, mas não estão limitadas às ervas daninhas do gênero: Sinapis, Lepiclium, Galium, Stellaria, Matricaria, Anthemis, Galinsoga, Chenopodium, Urtica, Senecio, Amaranthus, Portulaca, Xanthium, Convolvulus, Ipomoea, Polygonum, Sesbania, Ambrosia, Cirsium, Carduus, Sonchus, Solarium, Rorippa, Rotala, Lindernia, Lamium, Veronica, Abutilon, Emex, Datura, Viola, Galeopsis, Papaver, Centaurea, Trifolium, Ranunculus, e Taraxacum. As ervas daninhas monocotiledôneas incluem, mas não estão limitadas às ervas daninhas do gênero: Echinochloa, Setaria, Panicum, Digitaria, Phleum, Poa, Festuca, Eleusine, Brachiaria, Lolium, Bromus, Avena, Cyperus, Sorghum, Agropyron, Cynodon, Monochoria, Fimbristyslis, Sagittaria, Eleocharis, Scirpus, Paspalum, Ischaemum, Sphenoclea, Dactyloctenium, Agrostis, Alopecurus, e Apera.

[0392] Além disso, as ervas daninhas da presente invenção podem incluir, por exemplo, plantas de cultura que estão crescendo em uma localização indesejada. Por exemplo, uma planta de milho voluntária que está em um campo que compreende predominantemente de plantas de soja pode ser considerada uma erva daninha, se a planta de milho é indesejável no campo de plantas de soja.

[0393] Em outros exemplos de realização, no tratamento de sementes, as formulações correspondentes são aplicadas tratando as sementes com uma quantidade eficaz de herbicida ou uma formulação compreendendo o herbicida.

[0394] Ainda em outros aspectos, o tratamento do local, planta, partes da planta, ou sementes da presente invenção compreende a aplicação de uma composição agronomicamente aceitável que não contém um ingrediente ativo (AI). Em um exemplo de realização, o tratamento compreende a aplicação de uma composição agronomicamente aceitável que não contém um herbicida A.I. Em alguns exemplos de realização, o tratamento compreende a aplicação de uma composição agronomicamente aceitável que não contém um herbicida A.L., em que a composição compreende um ou mais dos veículos, diluentes, excipientes, reguladores do crescimento vegetal agronomicamente aceitáveis, e similares. Em outros exemplos de realização, o tratamento compreende a aplicação de uma composição agronomicamente aceitável que não contém um herbicida A.I., em que a composição compreende um adjuvante. Em um exemplo de realização, o adjuvante é um tensoativo, agente espalhador, adesivo, agente de penetração, agente de controle de dispersão, óleo agrícola, emulsificante, agente de compatibilidade, ou combinações dos mesmos.

[0395] Deve ser compreendido que a descrição anterior refere-se a exemplos de realização preferidos da presente invenção e que numerosas alterações podem ser feitas sem nos afastarmos do escopo da invenção. A invenção é adicionalmente ilustrada pelos seguintes exemplos, que não devem ser interpretados de forma alguma como impondo limitações ao seu escopo. Pelo contrário, deve ser claramente entendido que pode-se recorrer a vários outros exemplos de realização, modificações e equivalentes destes, os quais, após a leitura da presente descrição, podem sugerir para os técnicos peritos no assunto sem se afastar do espírito do presente invenção e/ou do escopo das reivindicações anexas.

EXEMPLOS EXEMPLO 1 CEPAS BACTERIANAS

[0396]As cepas de Escherichia coli TOP10 (Life Technologies, EUA) e BL21 (DE3) Gold (Agilent Technologies, Alemanha) foram utilizadas como receptoras nos experimentos de transformação. A transformação foi feita tal como descrito por Maniatis et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Habor Laboratory Press, Cold Spring Habor; NY (1982). O Agrobacterium tumefaciens foi utilizado para introduzir a região de T-DNA na Arabidopsis, milho e soja.

[0397]As culturas bacterianas foram cultivadas rotineiramente em caldo de Luria (LB) ou a 37 °C em LB misturado com ágar (15% p/v). O LB também foi suplementado com antibiótico canamicina e/ou cloranfenicol quando necessário. O DNA plasmidial foi preparado usando o kit GeneJet Plasmid Miniprep (Thermo Scientific, EUA). TriA e suas variantes foram geradas pela síntese de genes (Eurofins, Alemanha). Os genes sintetizados que abrigam os sítios de restrição XhoI e NcoI foram clonados no vetor PET24d N-HIS com resistência à canamicina. O plasmídeo Chaperona pGro7 (chaperonas groEL e groES) com resistência ao cloranfenicol foi obtido a partir da TaKaRa (Japão).

EXEMPLO 2 SÍNTESE DE GENES, DIGESTÃO DE RESTRIÇÃO E CLONAGEM

[0398]A síntese de genes e uma clonagem apropriada no vetor pMK-RQ foi feita pela Eurofins (Alemanha). As enzimas de restrição foram compradas a partir da New England Restriction enzymes e utilizadas de acordo com instruções do fabricante.

EXEMPLO 3 PURIFICAÇÃO DE PROTEÍNAS

[0399]TriA e suas variantes foram produzidas em E. coli BL21 (DE3) Gold (Agilent Technologies, Alemanha). Portanto, a E. coli foi transformada com o vetor de expressão pET24d N-HIS tag adequado e o plasmídeo chaperona pGro7 (chaperonas groEL e groES). As cepas bacterianas cresceram a 30 °C em 100 mL de LB durante 20 h e a expressão da proteína foi induzida com IPTG a 0,1 mM e 25 °C durante 20 horas. As células foram coletadas por centrifugação a 3000 rpm a 4 °C durante 20 min, resuspensas em reagente de extração de proteína Bug Buster (Novagen, Alemanha) de acordo com instruções do fabricante. Os lisados foram clarificados por centrifugação. Amostras de albumina de soro bovino (5, 10 e 20 g) foram carregadas em cada gel analisado por densitometria para proporcionar um padrão interno. As determinações de proteínas foram verificadas usando corante de análise de proteína Coomassie, de acordo com instruções do fabricante (Thermo Scientific, EUA). As enzimas marcadas com HIS (HIS-tagged) foram purificadas por cromatografia de afinidade por íons metálicos utilizando o kit Ni-IDA 1000 (Macherey-Nagel, Alemanha), seguindo as instruções do fabricante. A pureza da proteína foi acessada por SDS-PAGE usando géis pré-moldados NuPAGE Novex 4-12% de Bis-Tris (Life Technologies, EUA) corados com Coomassie Brilliant Blue (Serva, Alemanha). As concentrações de proteínas foram estimadas medindo a absorbância a 280 nm usando o kit Lambda Bio+ (Perkin Elmer, EUA).

EXEMPLO 4 CINÉTICA ENZIMÁTICA

[0400]A suspensão celular contendo o gene triA foi incubada com diversas azinas, melamina e atrazina e o filtrado da cultura foi analisado por UPLC-HR-MS. Os substratos foram obtidos a partir da Sigma-Aldrich ou sintetizados internamente. Os padrões sintéticos e produtos da reação enzimática foram analisados por UPLC-HR-MS (Thermo/Dionex UPLC UltiMate3000 acoplado a um espectrômetro de massa QXative de alta resolução). Uma coluna Waters Acquity HSS T3 (2,1mm; 100mm; 1,8 μM) foi utilizada com uma fase móvel de água/acetonitrila (ácido fórmico a 0,1%) com uma velocidade de fluxo de 0,6 μL min-1. As enzimas foram usadas dissolvidas a 25 mM de tampão fosfato de sódio (pH 7,2) com uma concentração de substrato na faixa de 1 nM a 10 nM a 30 ° C. Ao longo do tempo, o pico de azina original desapareceu enquanto o Metabólito-OH formado (produto da reação) aumentou. O produto foi identificado pela determinação da fórmula exata e pela análise dos fragmentos MS-MS precisos. Além disso, para alguns dos produtos formados, os padrões autênticos foram coeluídos. A degradação foi calculada contra as células possuindo o vetor vazio como controle.

EXEMPLO 5 EVOLUÇÃO DIRECIONADA DA AMIDOHIDROLASE

[0401]As azinas foram encaixadas no local ativo do modelo triA (com base na estrutura cristalina trzN), pela superimposição das moléculas sobre a melamina. Com base nisso, identificaram-se os resíduos que formam o sítio ativo e o bolso de ligação do substrato. As principais regiões responsáveis pela coordenação do íon metálico do sítio ativo; resíduos conhecidos como essenciais para a atividade da amidohidrolase; resíduos que formam a “base” hidrofóbica do sítio ativo ou são essenciais para interações da atividade hidrolase com o anel aromático do substrato, não foram alteradas. No entanto, os amino foram modificados para expandir o bolso da enzima. O modelo foi usado, por um lado, para predizer alvos de aminoácidos afastados do sítio ativo que podem influenciar a aceitação de trizinas em geral, por outro lado, o modelo foi usado para identificar o espaço que necessita de aminoácido no bolso da enzima que poderia ser alterado para aminoácidos menores possuindo uma hidrofobicidade semelhante, para conseguir uma acomodação de azinas mais volumosas sem alterar a atividade enzimática.

EXEMPLO 6 GERAÇÃO DE MODELOS DE PLANTAS TOLERANTES A HERBICIDA

[0402] A geração de Plantas Arabidopsis tolerantes à azina possuindo sequências de amidohidrolase tipo selvagem ou mutadas Para a transformação da Arabidopsis thaliana, sequências da amidohidrolase tipo selvagem ou mutantes baseadas na sequência de SEQ ID NO: 1, codificante da SEQ ID NO: 2, são clonadas com técnicas de clonagem convencionais, conforme descrito em Sambrook et al. (Molecular cloning (2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press), em um vetor binário contendo um cassete de gene marcador de resistência (AHAS) e a sequência da amidohidrolase mutada (marcado como GOI) entre o promotor da ubiquitina (PcUbi) e a sequência terminadora da nopalina sintase (NOS). Os plasmídeos binários são introduzidos para Agrobacterium tumefaciens para transformação das plantas. As plantas de Arabidopsis thaliana são transformadas com as sequências da amidohidrolase tipo selvagem ou mutadas pelo método de mergulho floral (floral dip) conforme descrito por McElver e Singh (WO 2008/124495). As plantas de Arabidopsis transgênicas são submetidas à análise TaqMan para análise do número de loci de integração.

EXEMPLO 7 TESTE PARA PLANTAS MODELO TOLERANTES A HERBICIDA

[0403] Para a seleção de plantas resistentes a azina são utilizadas plantas de Arabidopsis thaliana expressando triA e suas variantes. As linhagens de Arabidopsis thaliana selecionadas foram analisadas quanto à resistência às azinas, tal como 6-ciclopentil-N4-(2,3,4,5,6-pentafluorofenil)-1,3,5-triazina-2,4-diamina em placas de 48 poços. Em seguida, sementes T2 tiveram suas superfícies esterilizadas por meio da agitação durante 5 minutos em etanol + água (70+30 em volume), lavagem uma vez com etanol + água (70+30 em volume) e duas vezes com uma solução estéril de água deionizada. As sementes são resuspensas em 0,1% de ágar dissolvido em água (p/v). Quatro a cinco sementes por poço foram semeadas em meio nutritivo sólido constituído de solução nutriente Murashige Skoog de força média, pH 5,8 (meio de Murashige e Skoog (1962) Physiologia 40 Plantarum 15: 473-497). Os compostos são dissolvidos em dimetil sulfóxido (DMSO) e adicionados ao meio antes da solidificação (concentração final de DMSO - 0,1%). As placas multi poços são incubadas em uma câmara de crescimento a 22 °C, 75% de umidade relativa e 110 μmol Phot * m-2 * s-1 com fotoperíodo 14:10 hrs de luz:escuro. A inibição do crescimento foi avaliada de sete a dez dias após a semeadura em comparação com plantas tipo selvagem. Os fatores de tolerância são calculados com base nos valores de IC50 de inibição do crescimento das plantas Arabidopsis transformadas contra não transformadas. Adicionalmente, as plantas transgênicas de Arabidopsis T2 ou T3 são testadas quanto à tolerância melhorada a herbicidas inibidores da biossíntese de celulose em estudos de estufa.

EXEMPLO 8 GERAÇÃO E TESTE DE CULTURAS COM TOLERÂNCIA A HERBICIDA

[0404] Os vetores binários são gerados conforme descrito no Exemplo 9. Soja da cultivar Jake são transformadas conforme descrito anteriormente por Siminszky et al, Phytochem Rev. 5:445-458 (2006). Após a regeneração, os transformantes são transplantados para o solo em pequenos vasos, colocados em câmaras de crescimento (16 hr dia / 8 horas noite; a 25 °C dia/23 °C noite, 65% de umidade relativa; 130-150 mE m-2 s-1) e subsequentemente testado para a presença de T-DNA por meio de análise Taqman. Após algumas semanas, eventos transgênicos positivos de cópia única, saudáveis, são transplantados para vasos maiores e deixados crescer na câmara de crescimento. Um broto ideal para corte é de cerca de 3-4 polegadas de altura, com pelo menos dois nós presentes. Cada estaca é feita a partir do transformante inicial (planta-mãe) e mergulhado no hormônio de enraizamento em pó (ácido indol-3-butírico, IBA). A estaca caulinar é então colocada em bandejas tipo “oasis wedges” dentro de uma bio-cúpula. A planta mãe é levada até a maturidade na estufa e suas sementes são coletadas. As estacas tipo selvagem também são coletadas simultaneamente para servirem como controles. As estacas são mantidas na biocúpula durante 5-7 dias. 7-10 dias após a transferência para cunhas de crescimento hidropônico (oasis wedges), as raízes são tratadas via solução nutritiva com o herbicida. Sintomas típicos da fitotoxicidade, como raiz em forma cônica, são avaliadas 3-4 dias após o tratamento. Achados como pouca ou nenhuma lesão nas plantas transgênicas em comparação com as plantas tipo selvagem são interpretados como tolerância a herbicidas.

[0405] Os embriões de milho imaturos foram transformados de acordo com o procedimentos estabelecidos em Peng et al. (Documento WO2006/136596). As plantas são testadas quanto à presença de T-DNA por meio de análise Taqman com o alvo sendo o terminador que está presente em todas as construções. As plantas com aspecto saudável são enviadas para a estufa para o endurecimento e o subsequente teste de pulverização. As plantas são transplantadas individualmente em solo Metromix 360 em vasos de 4 polegadas. Uma vez na estufa (ciclo dia/noite de 27 °C/21 °C, com 14 horas de duração da claridade suportada por lâmpadas de sódio de alta pressão de 600W) as plantas são deixadas crescer durante 14 dias. Plantas de milho transgênicas são cultivadas com sementes T1 para testes de tolerância a herbicidas. 14 dias após a transferência, as raízes são tratadas através de solução nutritiva com o herbicida. Sintomas típicos da fitotoxicidade, como raiz em forma cônica, são avaliadas 3-4 dias após o tratamento. Achados como pouca ou nenhuma lesão nas plantas transgênicas em comparação com as plantas tipo selvagem são interpretados como tolerância a herbicidas. Para o tratamento pós-emergência, as plantas teste são primeiramente cultivadas até uma altura de 3 a 15 cm, dependendo do hábito de planta, e só depois tratadas com os herbicidas. Para esta finalidade, as plantas-teste são semeadas diretamente, cultivadas nos mesmos recipientes, ou elas são primeiramente cultivadas separadamente e transplantadas para os recipientes de ensaio alguns dias antes do tratamento. As avaliações de lesões causadas pelo herbicida são tomadas 2 e 3 semanas após o tratamento. A lesão da planta é classificada e uma escala de 0% a 100%, sendo 0% nenhuma lesão e 100% a morte. Os resultados são apresentados nas Tabelas 2, 3 e 4, e nas Figuras 3 e 4.TABELA 2TABELA 3 TABELA 4

[0406] A legenda dos valores da Tabela 3 se aplica também à Tabela 4.

EXEMPLO 9 CONSTRUÇÃO DE VETORES BINÁRIOS

[0407] Métodos de clonagem, por exemplo, utilização de endonucleases de restrição para cortar DNA de fita dupla em locais específicos, eletroforese em gel de agarose, purificação de fragmentos de DNA, transferência de ácidos nucleicos para membranas de nitrocelulose e nylon, união de fragmentos de DNA, transformação de células de E. coli e cultura de bactérias foram realizados tal como descrito em Sambrook et al.(1989) (Cold Spring Harbor Laboratory Press: ISBN 0-87965-309-6). A reação em cadeia da polimerase foi realizada utilizando a DNA polimerase Phusion™ High-Fidelity DNA Polymerase (NEB, Frankfurt, Alemanha) de acordo com as instruções do fabricante. De modo geral, os primers utilizados na PCR foram concebidos de tal forma que pelo menos 20 nucleotídeos da extremidade 3' do primer anelam perfeitamente com o molde para a amplificação. Os sítios de restrição foram adicionados anexando os nucleotídeos correspondentes dos sítios de reconhecimento na extremidade 5' do primer. Uma PCR de fusão, por exemplo, a descrita por K. Heckman e L.R. Pease, Nature Protocols (2207) 2, 924-932 foi utilizada como método alternativo para unir dois fragmentos de interesse, por exemplo, um promotor a um gene ou um gene a um terminador. A Síntese de Genes, por exemplo, a descrita por Czar et al. (Trends in Biotechnology, 2009, 27 (2): 63-72), foi realizada pela Life Technologies usando seu serviço Geneart®.

[0408] Os genes foram avaliados quanto ao uso de códons e a presença de sítios de restrição que possam impedir os procedimentos de clonagem. Os genes necessários foram códon-otimizados usando protocolos padrão para máxima expressão em planta de cultivo (por exemplo, vide Puigbo et al., 2007 e Gasper et al., 2012), e foi feita a remoção de sítios de restrição indesejados. Os genes foram sintetizados pela GeneArt (Regensburg) ou amplificados por PCR usando a DNA Polimerase Phusion™ High-Fidelity (NEB, Frankfurt, Alemanha) de acordo com as instruções do fabricante a partir do cDNA. Em ambos os casos, introduziu-se um sítio de restrição NcoI e/ou AscI na extremidade 5', e um sítio de restrição PacI na extremidade 3' para permitir a clonagem destes genes entre elementos funcionais, tais como promotores e terminadores utilizando estes sítios de restrição. Os módulos do promotor- terminador ou os módulos promotor-íntron-terminador foram criados por síntese completa pela GeneArt (Regensburg) ou pela união dos elementos de expressão correspondentes usando a PCR de fusão e clonagem do produto da PCR no vetor TOPO-vector pCR2.1 (Invitrogen) seguindo as instruções do fabricante. Ao juntar sequências de terminação com as sequências promotoras ou promotor- íntron, seja através da síntese de cassetes inteiros ou pela utilização da PCR de fusão, as sequências de reconhecimento para as endonucleases de restrição foram adicionadas a cada lado dos módulos e os sítios de reconhecimento para as endonucleases de restrição NcoI, AscI e PacI foram introduzidos entre o promotor e o terminador ou entre os íntrons e o terminador. Para obter os módulos de expressão final, os genes amplificados pela PCR foram clonados entre o promotor e o terminador ou entre o íntron e o terminador através de sítios de restrição NcoI e/ou PacI.

[0409] Alternativamente, a síntese de genes, por exemplo, a descrita por Czar et al. (Trends in Biotechnology, 2009, 27 (2): 63-72), pode ser realizada pela Life Technologies usando seu serviço Geneart®. Métodos padrão como clonagem, restrição, análise molecular, transformação de células de E. coli e cultura de bactérias podem ser realizados conforme descrito em Sambrook et al. (1989) (Cold Spring Harbor Laboratory Press: ISBN 0-87965-309-6). A reação em cadeia da polimerase pode ser realizada utilizando a DNA polimerase Phusion™ High-Fidelity DNA Polymerase (NEB, Frankfurt, Alemanha) de acordo com as instruções do fabricante. A PCR de fusão pode ser feita conforme descrito por K. Heckman e L.R. Pease, Nature Protocols (2207) 2, 924-932. Em ambos os casos, um sítio de restrição NcoI e/ou AscI na extremidade 5' e um sítio de restrição PacI na extremidade 3' podem ser introduzidos para permitir a clonagem destes genes entre os elementos funcionais. Os módulos do promotor- terminador ou os módulos promotor-íntron-terminador foram criados por síntese completa pela GeneArt (Regensburg) ou pela união dos elementos de expressão correspondentes usando a PCR de fusão e clonagem do produto da PCR no vetor TOPO-vector pCR2.1 (Invitrogen) seguindo as instruções do fabricante. Ao juntar sequências de terminação com as sequências promotoras ou promotor-íntron, seja através da síntese de cassetes inteiros ou pela utilização da PCR de fusão, as sequências de reconhecimento para as endonucleases de restrição podem ser adicionadas a cada lado dos módulos; e os sítios de reconhecimento para as endonucleases de restrição NcoI, AscI e PacI podem ser introduzidos entre o promotor e o terminador ou entre os íntrons e o terminador. Para obter os módulos de expressão final, os genes amplificados pela PCR podem ser clonados entre o promotor e o terminador ou entre o íntron e o terminador através de sítios de restrição NcoI e/ou PacI. Os genes de interesse podem ser códon-otimizados usando protocolos padrão para expressão máxima em plantas de cultivo (por exemplo, vide Puigbo et al., 2007 e Gasper et al., 2012), bm como podem ser submetidos à remoção de sítios de restrição indesejados e sintetizados pela GeneArt (Regensburg, Alemanha).

REFERÊNCIAS

[0410] Esser HO, Dupuis G, Ebert E,Marco GJ, Vogel C (1975) s- Triazines. Em: Kearney PC, Kaufman DJ (eds) Herbicides, chemistry, degradation and mode of action. Marcel Dekker, Nova Iorque, págs 129-208.

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[0412] Wackett et al.; Biodegradation of atrazine and related s- triazine compounds: from enzymes to field studies, Apágslied Microbiology and Biotechnology; 58 (1), 39-45, 2002.

[0413] de Souza ML, Sadowsky MJ, Wackett LP (1996) Atrazine chlorohydrolase from Pseudomonas sp strain ADP: Gene sequence, enzyme purification, and protein characterization. Journal of Bacteriology 178: 4894-4900.

[0414] Sadowsky et al.; US 6369299, Transgenic plants expressing bacterial atrazine degrading gene AtzA.

[0415] Padgette S. R. et al., Site directed mutagenesis of a conserved region of the 5-Enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase actives- site.; J.Biol. Chem., 266, 33, 1991.

[0416] Maniatis et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Habor Laboratory Press, Cold Spring Habor; N.Y. (1982).

[0417] Gasper P., Oliveira J-L., Frommlet J., Santos M.A.S., Moura G. (2012) EuGene: maximizing synthetic gene design for heterologous expression. Bioinformatics 28(20), 2683-2684.

[0418] Murashige e Skoog 1962 Physiologia 40 Plantarum 15: 473497, Molecular cloning Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001).

[0419] Komori T., Imayama T., Kato N., Ishida Y., Ueiki J., Komari T. (2007) Current Status of Binary Vectors and Sub-binary Vectors. Plant Physiology 145, 1155-1160.

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[0421] Siminszky B., Plant cytochrome P450-mediated herbicide metabolism, Phytochem Rev. 5:445-458, 2006.

Claims (8)

1. MÉTODO PARA CONTROLE DE ERVAS DANINHAS, em um local de crescimento de uma planta, o método caracterizado por compreender: (a) aplicação de uma composição herbicida compreendendo herbicidas no local; e (b) plantar uma semente no local, em que a semente compreende um polinucleotídeo de SEQ ID NO: 1 que codifica um polipeptídeo TriA mutante, em que a variante mutada difere da sequência de aminoácidos de tipo selvagem nas seguintes substituições de aminoácidos na SEQ ID NO: 2: N70A, Q96M, D128I, M155V, N70LQ71I, N70SQ71L, L88AL92A, ou Q71I_L92V_M155V_F157I, em que a semente é capaz de produzir uma planta que compreende, em pelo menos algumas de suas células, o polinucleotídeo operacionalmente ligado a um promotor operável em células vegetais, o promotor é capaz de expressar o polipeptídeo TriA mutante codificado pelo polinucleotídeo, a expressão do polipeptídeo TriA mutante confere à planta tolerância a herbicidas.

2. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela composição herbicida ser aplicada nas ervas daninhas e na planta produzida pela semente.

3. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo herbicida compreender um composto que inibe biossíntese de celulose.

4. MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLEICO, produzida recombinantemente e/ou isolada e/ou sintética, caracterizada por compreender: uma molécula de ácido nucleico de SEQ ID NO: 1 que codifica um polipeptídeo TriA mutado, em que a variante mutada difere da sequência de aminoácidos de tipo selvagem nas seguintes substituições de aminoácidos na SEQ ID NO: 2: N70A, Q96M, D128I, M155V, N70LQ71I, N70SQ71L, L88AL92A, ou Q71I_L92V_M155V_F157I, e em que expressão da molécula de ácido nucleico em uma célula vegetal, uma planta ou uma parte da planta confere tolerância ou resistência aumentada ao herbicida, em comparação com uma célula vegetal, uma planta ou uma parte da planta do tipo selvagem, não transformada, correspondente.

5. CASSETE DE EXPRESSÃO, caracterizado por compreender a molécula de ácido nucleico, conforme definida na reivindicação 4, e um promotor operável em células vegetais.

6. CASSETE, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo promotor ser um promotor raiz-específico.

7. VETOR, caracterizado por compreender a molécula de ácido nucleico, conforme definida na reivindicação 4, ou o cassete de expressão, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 5 a 6.

8. POLIPEPTÍDEO TRIA MUTANTE, isolado, recombinante e/ou sintetizado quimicamente, caracterizado por compreender uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, em que a sequência de aminoácidos do polipeptídeo TriA mutante operacionalmente ligado a um promotor operável em células vegetais, a expressão do polipeptídeo TriA mutado confere à planta tolerância a herbicidas e tem atividade melamina desaminase, e a sequência de aminoácidos do polipeptídeo TriA mutado possui as seguintes substituições de aminoácidos em SEQ ID NO:2 N70A, Q96M, D128I, M155V, N70LQ71I,N70SQ71L, L88AL92A, ou Q71I_L92V_M155V_F157I.