CN102954959B

CN102954959B - 一种基于酶促氨基水解反应的三聚氰胺比色检测方法

Info

Publication number: CN102954959B
Application number: CN201110251219.5A
Authority: CN
Inventors: 周佳海; 黄维雪; 张志民
Original assignee: Shanghai Institute of Organic Chemistry of CAS
Current assignee: Shanghai Institute of Organic Chemistry of CAS
Priority date: 2011-08-29
Filing date: 2011-08-29
Publication date: 2016-09-14
Anticipated expiration: 2031-08-29
Also published as: CN102954959A

Abstract

本发明涉及一种基于酶促氨基水解反应的三聚氰胺比色检测方法。具体地，本发明提供了一种定量检测样品中三聚氰胺的方法，包括步骤：样品纯化、酶解反应、显色反应、和绘制标准曲线等。该方法测试过程简单、快速、易操作，不需要复杂的专用设备及专业的技术人员，测试结果直观清楚，可直接进行目测判断，也可精确定量，重复性高，不易受杂质干扰，还可有效富集低含量样品中的三聚氰胺，且符合高通量测试的条件，满足了国内一般消费者对三聚氰胺简便检测的需求。

Description

一种基于酶促氨基水解反应的三聚氰胺比色检测方法

技术领域

本发明涉及检测领域，具体地涉及一种基于酶促氨基水解反应的三聚氰胺比色检测方法。

背景技术

三聚氰胺(Melamine)，结构如式I化合物所示，是一种三嗪类含氮杂环有机化合物，化学式为C₃H₆N₆，俗称密胺、蛋白精。

三聚氰胺是一种重要的化工原料，用于制造塑料。但是它具有毒性，不允许用作食品添加剂。当三聚氰胺被长期反复摄入后，会造成严重的肾脏和膀胱的损伤，有时候这种损伤是致命的。但是由于三聚氰胺价格低廉，高氮含量，导致它被非法的加入到食品和饲料中来虚假的提高蛋白质含量，比如婴儿奶粉，牛奶，以及其他食品中。随着国家对食品安全问题的关注和近年来中国奶业的三聚氰胺丑闻发生，三聚氰胺问题成为影响乳和乳制品安全的重要因素之一。

目前，国内发布了国家标准GB/T22388-2008《原料乳与乳制品中三聚氰胺检测方法》，该标准包括了三种检测方法：高效液相色谱法、液相色谱-质谱/质谱法和气相色谱-质谱联用法。虽然这些国家标准所介绍的方法适用于对不同对象和样品浓度的检测，但测试时都需要昂贵的实验室设备和专业技术人员对样品进行繁琐处理和分析，并且以上方法每台仪器一次只能测量一个样品，难以进行大量样品的高通量检测。因为价格和通量的问题，以上方法只能对有限的样品进行比较精确的测量。

此外，本领域尚缺乏高通量的、检测低浓度或极低浓度三聚氰胺的、且操作简便的检测方法。

因此，本领域迫切需要研发一种样品处理、测试过程简单易操作，测试结果分析简易，且能满足高通量测试需求的三聚氰胺的检测方法。

发明内容

本发明的目的是一种三聚氰胺的检测方法，该方法具有样品处理、测试过程简单易操作，测试结果分析简易且能满足高通量测试需求的特点。

本发明的另一目的是提供一种适合检测低浓度或极低浓度三聚氰胺的、且操作简便的检测方法。

本发明提供了一种定量检测待测样品中三聚氰胺的方法，包括步骤：

(1)将液态的含三聚氰胺的样品上样于阳离子柱，并用含氨水的醇溶液为洗脱液进行洗脱，得到含三聚氰胺的洗脱液；

(2)去除含氨水的醇溶液，得到经浓缩的三聚氰胺；

(3)将浓缩的三聚氰胺溶解在惰性溶剂中，在氨基水解酶的催化下反应，得到含式II化合物和氨的溶液；

(4)通过比色法检测上述溶液中氨的浓度，从而换算得出所述待测样品中三聚氰胺的含量或浓度。

在另一优选例中，所述阳离子柱为固体萃取柱，包括：Strata XC SPE、WatersOasis MCX、Cleanet PCX。

在另一优选例中，所述阳离子柱的纯化回收率为70％-90％。

在另一优选例中，所述惰性溶剂为水。

在另一优选例中，所述比色法是靛酚蓝比色法。

在另一优选例中，步骤(3)所述反应时间为5-40min，较佳地为10-30min，更佳地为15-20min。

在另一优选例中，在步骤(4)中，包括步骤：将测定的氨摩尔浓度或摩尔数按1∶1比例换算为酶解反应之前的三聚氰胺的摩尔浓度或摩尔数。

在另一优选例中，在步骤(4)中，通过比色法测得的吸光度与标准品或标准曲线比较，从而换算得到样品中三聚氰胺的含量或浓度。

在另一优选例中，所述标准曲线是通过以下方法获得：

(a)配置浓度在0-200ppm内的0-10份三聚氰胺水溶液，在氨基水解酶的催化下反应5-40min，得到水解后含式II化合物和氨的溶液，其中，三聚氰胺溶液中三聚氰胺的摩尔数和所述溶液中氨的摩尔数为1∶1；

(b)通过比色法测量将上述步骤得到的溶液的吸光度；

(c)绘制吸光度和三聚氰胺浓度的标准曲线。

在另一优选例中，基于标准曲线和测得的吸光度，以及阳离子柱的回收率，得出样品中三聚氰胺的量或浓度。

在另一优选例中，所述含氨水的醇溶液包括：含氨水的甲醇溶液、含氨水的乙醇溶液、或其组合。

在另一优选例中，所述含氨水的醇溶液中氨水与醇的体积比例为1∶100-1∶5；较佳地为1∶50-1∶10；最佳地为1∶30-1∶15，并且氨水的氨浓度为15wt％至饱和浓度，较佳地，氨水的氨浓度为20-30wt％，更佳地为25-28wt％。

在另一优选例中，步骤(2)中，通过氮气吹干或者烘干去除含氨水的醇溶液。

在另一优选例中，所述步骤(1)中液态的含三聚氰胺的样品是经酸化处理的。

在另一优选例中，所述待测样品用以下步骤进行前处理：将液态待测样品进行酸化、溶解和离心，去除沉淀，从而得到液态的、经酸化的含三聚氰胺的样品；或将固态、半固体、或凝胶状的待测样品进行溶解和/或萃取，并酸化、和离心，去除沉淀，从而得到液态的、经酸化的含三聚氰胺的样品。

在另一优选例中，所述待测样品的酸化处理为用乙酸、或三氯乙酸进行酸化。

在另一优选例中，所述待测样品的溶解所用溶剂为：水、乙腈、或其组合。

在另一优选例中，所述待测样品为：饮料、食物、饲料、土壤、水源、或其组合。

更佳地，所述的待测样品包括乳制品、牛奶、羊奶、豆奶、或酸奶。

在另一优选例中，所述待测样品中，三聚氰胺的浓度为0.001-100ppm，较佳地0.01-50ppm，更佳地0.1-20ppm。

在另一优选例中，所述方法可直接目测或用分光光度计测量浓度为5-100ppm的样品。当浓度为较稀时(如0.001-5ppm)可通过样品浓缩制备后测量；当浓度较高时(如高于100ppm)可稀释相应倍数后测量。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了重组蛋白的聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)图，其中泳道1为含有6个组氨酸(His)标签的Tri A；泳道2为酶切后的Tri A。

图2显示了实施例7中样品(3A)、样品(3B)、标准品(3C)和标准品(3D)在630nm处的吸光度值(OD₆₃₀)对照图。

图3显示了100ppm的三聚氰胺标准品的HPLC图。

图4显示了含100ppm三聚氰胺的牛奶经固相萃取(SPE)柱纯化后得到的三聚氰胺的HPLC图。

图5显示了三聚氰胺的0，5，10，20，40，80，100ppm水溶液的经酶解反应后的各样品的显色反应结果和未经酶解反应的100ppm的三聚氰胺标准品水溶液的显色反应结果的目测对照图。

图6显示了浓度在0-100ppm之间的三聚氰胺溶液的浓度及其在630nm处的吸光度值的线性关系。

图7显示了实施例8中样品(8A)、样品(8B)、样品(8C)和标准品(8D)在630nm处的吸光度值对照图。

图8显示了编码有氨基水解酶基因的核苷酸序列，其中，双下划线部分分别是Bam HI和XhoI两个连接位点的密码子，单下划线部分是终止密码子。

图9显示了氨基水解酶的氨基酸序列。

具体实施方式

本发明人通过长期而深入的研究，意外地发现，在处理含三聚氰胺的样品时，用含氨水的醇溶液作为洗脱剂洗脱吸附在纯化柱上的三聚氰胺，该洗脱液居然不会引入额外的氨干扰后续的比色法检测，而且非常易于浓缩，能很好地富集样品中三聚氰胺的浓度，有利于检测三聚氰胺浓度较低的样品。在此基础上，发明人完成了本发明。

此外，发明人还意外发现，将氨基水解酶催化三聚氰胺的反应控制在一段特定时间(如5-40min)时，三聚氰胺水解所形成的氨和水解前三聚氰胺的摩尔比例维持或基本维持在1∶1，故特别适合定量检测三聚氰胺。

本发明所述该方法的纯化条件(例如酶的纯化柱、洗脱液及其所用的量等)、检测方法(如显色剂、酶标仪)和计算方法(如曲线拟合)，不限于下面的解释。本发明方法还可以任选将在本说明书中描述的或本领域已知的各种方法组合起来，这样的组合可由本发明所属领域的技术人员容易的进行。

洗脱液

术语“洗脱液”，是指通过离子交换柱纯化样品时，将样品从柱上洗脱下来的所用的溶液。

本发明所用的“洗脱液”是含氨水的醇溶液。

所述含氨水的醇溶液包括：含氨水的甲醇溶液、含氨水的乙醇溶液、或其组合。所述含氨水的醇溶液中氨水与醇的体积比例1∶100-1∶5；较佳地为1∶50-1∶10；最佳地为1∶30-1∶15。

可用于本发明的氨水浓度没有特别限制，通常氨水的氨浓度为15wt％至饱和浓度，较佳地，氨水的氨浓度为20-30wt％，更佳地为25-28wt％。

氨基水解酶

三聚氰胺也存在于天然的环境中，常被一些细菌用作氮源。这些细菌可以产生氨基水解酶使三聚氰胺发生氨基水解反应。

可用于本发明的氨基水解酶没有限制，可以是任何催化水解三聚氰胺的氨基的酶。所述的酶可以是天然的或重组的。

一种优选的氨基水解酶来源于嗜酸菌属西瓜种(Acidovorax citrulli)，例如源于燕麦嗜酸菌属西瓜亚种(Acidovorax avenae subsp.Citrulli)菌株NRRL B-12227的氨基水解酶(TriA)。该酶可购得或用常规方法制备。该氨基水解酶负责催化三聚氰胺三个氨基中前两个氨基的水解。

试验表明，氨基水解酶催化第一个氨基水解的速度非常快，远高于催化后续氨基的水解速度。

本发明选用上述氨基水解酶催化待测样品中的三聚氰胺水解脱氨，将制备好的样品中加入所述氨基水解酶后，于室温放置较短时间第一步反应可反应完全，并且在一段时间(自水解开始5-40min分钟内，较佳地8-30分钟，更佳地10-25分钟)，水解所形成的氨与三聚氰胺的摩尔数比例维持或基本维持1∶1。

氨基水解酶的基因改造、表达和纯化

将编码有氨基水解酶的基因进行密码子的优化后(或者直接用氨基水解酶的天然编码序列)，通过人工全合成方法制备后，通过Bam HI和XhoI位点连接到市售的载体pET21a中。

以BL21(DE3)为表达菌株，于特定温度(如16℃)下，在异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)的诱导下产生氮端带有6个组氨酸(His)标签的重组Tri A。

将获得的菌体高压破菌后离心，取上层清夜通过Ni-NTA纯化。

在上述纯化后的蛋白溶液中加入适量的TEV酶，于特定温度(如室温)下边透析边酶切。

待透析酶切完全后，将蛋白溶液再次通过Ni-NTA纯化，收集洗脱液浓缩。

用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)观察纯化后的Tri A，把获得的蛋白超滤浓缩为1mg/mL，保存于4℃以备使用。

样品纯化

(1)将样品移入离心管中，加入有机酸(如乙酸)，室温振荡和孵育一段时间后，加入惰性溶剂(如乙腈)溶解并振荡。将得到的混合物离心，移取所有上清液到试管中，即为待纯化样品。依次加入惰性溶剂(如甲醇)和含有有机酸的溶液(如含有乙酸和乙腈的水溶液)活化阳离子柱。

(2)将上述步骤得到的待纯化样品上样于经过活化的阳离子柱内，经过洗柱后用加入含氨水的醇溶液洗脱，收集洗脱液，吹干或烘干后得到浓缩的三聚氰胺。

(3)加入蒸馏水溶解经浓缩的三聚氰胺，得到待测样品。

酶解反应

将上述步骤得到的三聚氰胺在氨基水解酶的催化下反应一段时间(5-40min)，得到含式II化合物和氨的溶液，并且，在所述时间范围内，起始反应的三聚氰胺的量与水解反应后得到的氨的量的比例为1∶1。

显色反应

在上述步骤得到的溶液中加入水杨酸溶液混匀后，立即加入亚硝基铁氰化钠/次氯酸钠溶液。室温孵育一段时间(如5-20分钟)后，用酶标仪在某一特定波长(如630nm)下读取吸光度值，即测定该特定波长处的吸光度。

绘制标准曲线

标准曲线的绘制可以包含如下两种情况：

配置不同浓度的三聚氰胺溶液(如水或者不含三聚氰胺的牛奶)，每个不同浓度的溶液加入经基因、改造和纯化的氨基水解酶制剂，在室温放置相同的时间(如15min)后，加入水杨酸溶液混匀后，立即加入亚硝基铁氰化钠/次氯酸钠溶液，室温孵育10分钟。用酶标仪测量上述特定波长(如630nm)处的吸光度，以三聚氰胺溶液浓度(ppm)为X轴，测得对应的吸光度为Y轴，绘制标准曲线，拟合并求得公式。此方法获得的标准曲线可用于判断和测试不需要纯化的待测样品中三聚氰胺的浓度。若样品需要纯化，可结合纯化时所用阳离子柱的回收率来测定样品中三聚氰胺的浓度。

另外，也可配置不同浓度三聚氰胺溶液(如水或者不含三聚氰胺的牛奶)时，在上述标准曲线的绘制步骤之前，可先将待测样品通过样品纯化步骤纯化，然后按如上步骤操作：对每个不同浓度的溶液进行酶解反应和显色反应，然后以三聚氰胺溶液浓度(ppm)为X轴，测得对应的吸光度为Y轴，绘制标准曲线，拟合并求得公式。此方法获得的标准曲线可直接获得待测样品中的三聚氰胺的浓度。

不同浓度的三聚氰胺样品在经过上述过程处理后，呈现出不同深度的蓝绿色，而没加入氨基水解酶的三聚氰胺没有显色反应。因此，在实际样品测量中，如没有酶标仪，也可通过和标样进行颜色的比较，判断样品中三聚氰胺的浓度范围。

本发明的主要优点在于：

(1)本发明提供了一种定量检测样品中三聚氰胺的检测方法。该方法中，本发明所用的氨基水解酶在较短的时间内可将三聚氰胺分子中的一个“C-N”键进行水解，并产生氨，且水解所形成的氨与三聚氰胺的比例基本维持1∶1，然后通过比色法检测氨的浓度，从而能够精确定量样品中三聚氰胺的量。

(2)在洗脱时，虽然可用3-(N-吗啡啉)丙磺酸和3-(N-吗啡啉)丙磺酸钠(MOPS和Na-MOPS)的缓冲液溶液作为洗脱液，但3-(N-吗啡啉)丙磺酸和3-(N-吗啡啉)丙磺酸钠缓冲液溶液的配制较为繁琐，需要精确定量3-(N-吗啡啉)丙磺酸和3-(N-吗啡啉)丙磺酸钠的比例，以使溶液保持一定的pH值；此外，易引入杂质，干扰后续的显色反应和吸光度检测。与此相反，本发明提供的检测方法中，在处理样品时，用含氨水的醇溶液作为洗脱剂洗脱吸附在阳离子柱上的三聚氰胺，无需精确定量，成分简单，配置方便，极大程度地减小了引入干扰杂质的几率，减少了对后续比色法检测过程的干扰，且该洗脱剂挥发性很好，能较好地富集样品中三聚氰胺的浓度，有利于检测三聚氰胺浓度较低的样品。

(3)该方法测试过程简单、快速、易操作，不需要复杂的专用设备及专业的技术人员，测试结果直观清楚，可直接进行目测判断，也可精确定量，重复性高，不易受杂质干扰，还可有效富集低含量样品中的三聚氰胺，且符合高通量测试的条件，满足了国内一般消费者对三聚氰胺简便检测的需求。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：ColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

主要仪器：

Strata XC SPE：货号：SBAL-8B-S029-UBJ，美国菲罗门公司。

酶标仪：型号：雷杜RT-6000，杰韦弗实业有限公司。

Venusil XBP Si：货号：VSi952505-0，Agela Technologies。

实施例1：氨基水解酶的基因改造、表达和纯化

虽然用氨基水解酶的天然编码序列也可实现重组表达，但表达量较低，故在本实施例中采用密码子经优化的基因进行重组表达。

将编码有氨基水解酶的基因进行密码子优化(优化后的核苷酸序列如SEQ IDNO.：1所示或见图8，其ORF位于第7-1428位，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.：2所示或见图9)。优化后的序列通过人工全合成方法制备，然后通过Bam HI和XhoI位点连接到市售的载体pET21a中。

以常规的市售的大肠杆菌BL21(DE3)为表达菌株，于16℃下，在0.1mM异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)的诱导下产生氮端带有6个组氨酸(His)标签的重组Tri A(见图1，泳道1)，在表达过程中加入1 mM的氯化亚铁，增加蛋白的可溶性，其中大约10％的Tri A为可溶性蛋白。

将获得的菌体高压破菌后16000rpm离心45min，取上层清液缓慢流过Ni-NTA，经洗脱后，收集含氨基水解酶的洗脱液。

在上述酶的洗脱液中加入适量的TEV酶，室温边透析边酶切。透析液的组分包括：pH7.0的25mM的羟乙基哌嗪乙硫磺酸(HEPES)缓冲溶液、100mM氯化钠和0.2g/L氯化亚铁。

待透析酶切完全后，将上述酶溶液再次流过Ni-NTA，收集洗脱液浓缩。氨基水解酶的产量大概为1mg/L LB培养液，聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)显示Tri A中含有部分的杂质(见图1，泳道2)，但对后续的检测没有大的影响。把获得的蛋白超滤浓缩为1mg/mL，保存于4℃以备使用。

实施例2：样品纯化

(1)室温下移取10mL样品(样品包括：分别添加5ppm、10ppm、15ppm、50ppm三聚氰胺的牛奶)到50mL离心管中，加入75 μ L无水乙酸，漩涡振荡30秒，室温孵育5分钟后，加入15mL乙腈并漩涡振荡30秒。将得到的混合物于5000rpm下，离心10分钟，移取所有上清液到另一试管中，作为待测试样品。

(2)加入2mL甲醇活化Strata XC SPE柱后，再加入2mL含有60％乙腈和0.5％乙酸的蒸馏水溶液。

(3)将步骤(1)得到的待测试样品加入到经过活化的Strata XC SPE柱内，依次加入2mL0.5％乙酸水溶液，2mL0.5％乙酸甲醇溶液和2mL100％甲醇洗柱，最后用加入1mL氨水甲醇溶液(氨水(25wt％)∶甲醇的体积比为5∶95)洗脱吸附在Strata XCSPE柱上的三聚氰胺，收集洗脱液于试管中，在50-65℃水浴中氮气吹干可挥发的成分浓缩后，得到经纯化的三聚氰胺。

(4)加入1mL蒸馏水到装有纯化的三聚氰胺的试管中，振荡10秒以溶解，得到待测样品。

实施例3：酶解反应

(1)加入100μ L实施例2得到的待测样品到96孔板中；

(2)在每孔中加入实施例1得到的氨基水解酶混合物5 μ L，轻敲微孔板混合均匀；

(3)室温孵育20分钟。

实施例4：显色反应

(1)在每孔中加入50 μ L水杨酸水溶液(含5wt％水杨酸和5wt％柠檬酸钠)，混匀后，立即加入20 μ L亚硝基铁氰化钠/次氯酸钠水溶液(含1wt％亚硝基铁氰化钠，0.05M次氯酸钠和1M NaOH)；

(2)室温孵育10分钟；

(3)用酶标仪在630nm下读取吸光度值。

实施例5：绘制标准曲线

用三聚氰胺标准品分别配成0，5，10，20，40，80，100ppm水溶液，各取100μ l，加入96孔板，每个浓度三个重复。每孔加入实施例1中纯化得到的氨基水解酶混合物5 μ L，在室温放置15分钟。另取一份三聚氰胺100ppm水溶液，加入5 μ L不含氨基水解酶蛋白的缓冲液(含pH7.0的25mM HEPES，100mM氯化钠和0.2g/L氯化亚铁)，在室温放置15分钟。

然后，将每份样品进行显色反应(步骤如实施例4所述)。

结果表明：

(1)目测结果如图5所示，不同浓度的三聚氰胺加入氨基水解酶后，呈现不同深度的蓝绿色，而没加入氨基水解酶的三聚氰胺没有显色反应。因此，在实际样品测量中，如没有酶标仪，也可通过和标样进行颜色的比较，判断样品中三聚氰胺的浓度范围。

(2)用酶标仪测量630nm处的吸光度，以三聚氰胺溶液浓度(ppm)为X轴，测得对应的吸光度为Y轴，绘制标准曲线。结果如图6所示，该标准曲线为直线，所得线性公式为y＝0.016x+0.060，R²＝0.997，因此，三聚氰胺的溶液在5-100ppm浓度下与对应的吸光度之间有较好的线性关系。

实施例6：测定三聚氰胺通过SPE柱纯化效果

样品(2A)：10mL牛奶中加入终浓度为10ppm的三聚氰胺，对样品进行纯化处理(步骤如实施例2所述)，得到1mL100ppm的三聚氰胺水溶液样品。

标准品(2B)：100ppm的三聚氰胺水溶液。

对纯化后的样品(2A)和标准品(2B)分别进行HPLC检测。所用色谱柱是VenusilXBP Si(f4.6×150 mm，5 μ m)，流动相：乙腈∶水＝80∶20，流速：1.0ml/min，检测波长：210nm。

结果如图3和图4所示：纯化后的样品(2A)的峰形和保留时间与标准品(2B)的一致。这表明，对样品进行纯化后得到的三聚氰胺，杂质含量几乎没有。根据峰面积计算，三聚氰胺得率约为80％。

实施例7：验证样品通过处理可去除氨等干扰杂质

样品(3A)：10mL牛奶(不含三聚氰胺)中加入终浓度为含氨量2ppm的NH₄Cl，对上述溶液进行纯化处理后，得到1mL的待测溶液样品。其中，纯化处理方法如实施例2所述，不同点在于：用1mL氨水甲醇溶液(氨水(28wt％)∶甲醇的体积比为5∶95)进行洗脱。

样品(3B)：10mL牛奶(不含三聚氰胺)中不加任何添加剂，纯化处理同样品(3A)，得到1mL的待测溶液样品。

标准品(3C)：含氨量为20ppm的NH₄Cl标准品，不进行任何处理。

标准品(3D)：去离子水(空白对照)。

将上述样品和标准品进行酶解反应和显色反应处理(步骤如实施例3和实施例4所述)，结果如图2所示：样品(3A)、样品(3B)和标准品(3D)几乎没有显色反应，而标准品(3C)具有明显的显色反应。

结果表明：

(1)未处理时样品中含有的氨等干扰杂质在样品纯化过程中几乎完全被除去；

(2)令人意外的时，虽然在样品纯化过程中用含氨水的甲醇溶液作为洗脱液，但通过吹干或烘干的简单操作就可完全去除氨，不会引入游离氨，从而不会对进一步的显色反应造成任何干扰。

实施例8：牛奶中三聚氰胺的检测

样品(8A)：10mL牛奶中加入终浓度为5ppm的三聚氰胺，对样品进行纯化处理(步骤如实施例2所述)，得到1mL 50ppm的三聚氰胺溶液待测样品，加入5μL不含氨基水解酶蛋白的缓冲液(含pH7.0的25mM HEPES，100mM氯化钠和0.2g/L氯化亚铁)，室温放置20min；

样品(8B)：10mL牛奶中加入终浓度为5ppm的三聚氰胺，对样品进行纯化处理(步骤如实施例2所述)得到1mL50ppm的三聚氰胺溶液待测样品，所述样品经过酶解反应(步骤如实施例3所述)；

样品(8C)：10mL牛奶中不加任何添加物，对样品进行纯化处理(步骤如实施例2所述)得到1mL的溶液待测样品，所述样品经过酶解反应(步骤如实施例3所述)；

标准品(8D)：50ppm的三聚氰胺水溶液，所述样品经过酶解反应(步骤如实施例3所述)。

将上述样品和标准品进行显色反应处理(步骤如实施例4所述)，结果如图7显示：

(1)样品(8A)和样品(8C)只有微量显色，样品(8B)具有明显的显色反应，说明氨基水解酶对三聚氰胺具有很好的酶催化作用，进而可以很好的进行显色反应。

(2)样品(8B)和标准品(8D)比较，可得柱纯化三聚氰胺的回收比例为80％。

实施例9：标准曲线的验证

配置三份待测样品，三聚氰胺的终浓度分别为5ppm、10ppm、15ppm。按照样品纯化(实施例2)后，分别获得1mL浓度浓缩后的水溶液，对该溶液进行酶解反应(实施例3)和显色反应(实施例4)进行处理后，用酶标仪在630nm下读取各自的吸光度值，根据实施例5的标准曲线y＝0.016x+0.060以及纯化柱的回收率为80％进行换算后获得三聚氰胺的浓度依次为4.955ppm、10.015ppm、和15.030ppm。结果表明本发明提供的方法的准确率高，根据本法所得到的三聚氰胺的浓度与准确值的误差极小。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims

1.一种定量检测待测样品中三聚氰胺的方法，其特征在于，包括步骤：

(2)去除含氨水的醇溶液，得到经浓缩的三聚氰胺；其中，所述的去除是50-65℃水浴中氮气吹干；

(3)将浓缩的三聚氰胺溶解在惰性溶剂中，在氨基水解酶的催化下反应，得到含式Ⅱ化合物和氨的溶液；步骤(3)所述反应时间为5-40min；

(4)通过比色法检测上述溶液中氨的浓度，将测定的氨摩尔浓度或摩尔数按1：1比例换算为酶解反应之前的三聚氰胺的摩尔浓度或摩尔数，从而换算得出所述待测样品中三聚氰胺的含量或浓度；

所述含三聚氰胺的样品的浓度为0.001-100ppm；

且所述比色法是靛酚蓝比色法；

且所述的氨基水解酶是来源于嗜酸菌属西瓜种(Acidovorax citrulli)的氨基水解酶。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述反应时间为10-30min。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(4)中，通过比色法测得的吸光度与标准品或标准曲线比较，从而换算得到样品中三聚氰胺的含量或浓度。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述标准曲线是通过以下方法获得：

(a)配置浓度在0-200ppm内的0-10份三聚氰胺水溶液，在氨基水解酶的催化下反应5-40min，得到水解后含式Ⅱ化合物和氨的溶液，其中，三聚氰胺溶液中三聚氰胺的摩尔数和所述溶液中氨的摩尔数为1：1；

(b)通过比色法测量将上述步骤得到的溶液的吸光度；

(c)绘制吸光度和三聚氰胺浓度的标准曲线。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述含氨水的醇溶液包括：含氨水的甲醇溶液、含氨水的乙醇溶液、或其组合。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述含氨水的醇溶液中氨水与醇的体积比例为1：100-1：5，并且氨水的氨浓度为15wt％至饱和浓度。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，通过氮气吹干或者烘干去除含氨水的醇溶液。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中液态的含三聚氰胺的样品是经酸化处理的。

9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述待测样品为：饮料、食物、饲料、土壤、水源、或其组合。

10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述待测样品中，三聚氰胺的浓度为0.01-50ppm。