BR112021003797A2

BR112021003797A2 - proteínas inseticidas e métodos para seu uso

Info

Publication number: BR112021003797A2
Application number: BR112021003797-7A
Authority: BR
Inventors: Ellaine Anne Mariano FOX; Naga Kishore Kakani; Kay Walter; Takashi Yamamoto; Yi Zheng
Original assignee: Pioneer Hi-Bred International, Inc.
Priority date: 2018-08-29
Filing date: 2019-08-22
Publication date: 2021-05-25
Also published as: MX2021002290A; US11878999B2; WO2020046701A1; AU2019332792A1; EP3844283A1; US20210347830A1; CN112689677A; CA3106444A1; AR116025A1

Abstract

PROTEÍNAS INSETICIDAS E MÉTODOS PARA SEU USO. A presente invenção se refere ao campo da biologia molecular. São fornecidos novos genes que codificam proteínas pesticidas. Estas proteínas pesticidas e as sequências de ácidos nucleicos que codificam as mesmas são úteis no preparo de formulações pesticidas e na produção de plantas transgênicas resistentes a pragas. São fornecidos métodos para criar ou alterar proteínas pesticidas para atividade pesticida alterada ou melhorada.

Description

“PROTEÍNAS INSETICIDAS E MÉTODOS PARA SEU USO” REFERÊNCIA À LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS SUBMETIDA ELETRONICAMENTE

[0001] A cópia oficial da listagem de sequências é submetida eletronicamente através de EFS-Web como uma listagem de sequências em formato ASCII com um arquivo nomeado "6806_SeqList", criado em 19 de agosto de 2019, e que tem um tamanho de 825 quilobytes e é depositado simultaneamente com o relatório descritivo. A listagem de sequências contida neste documento em formato ASCII faz parte do relatório descritivo e está incorporada ao presente documento em sua totalidade a título de referência.

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS

[0002] Este pedido reivindica o benefício do Pedido de Patente Provisório dos Estados Unidos no 62/724,276, depositado em 29 de agosto de 2018, que é incorporado ao presente documento em sua totalidade a título de referência.

CAMPO

[0003] Esta revelação refere-se ao campo da biologia molecular. São fornecidos genes inovadores que codificam proteínas pesticidas. Estas proteínas pesticidas e as sequências de ácidos nucleicos que codificam as mesmas são úteis no preparo de formulações pesticidas e na produção de plantas resistentes a pragas transgênicas. São fornecidos métodos para criar ou alterar proteínas pesticidas para atividade pesticida alterada ou melhorada.

ANTECEDENTES

[0004] O controle biológico de pragas de inseto de significância agrícola com o uso de um agente microbiano,

como fungos, bactérias ou outras espécies de inseto, fornece uma alternativa ecologicamente correta e comercialmente atrativa aos pesticidas químicos sintéticos. De modo geral, o uso de biopesticidas apresenta um risco mais baixo de poluição e riscos ambientais, e biopesticidas fornecem especificidade para o alvo maior do que é característico de inseticidas químicos de largo espectro tradicionais. Além disso, os biopesticidas normalmente custam menos para produzir e melhoram, desse modo, o rendimento econômico para uma variedade ampla de culturas.

[0005] Certas espécies de micro-organismos do gênero Bacillus são conhecidas por terem atividade pesticida contra uma gama de pragas de insetos incluindo Lepidóptera, Diptera, Coleóptera, Hemiptera e outras. Bacillus thuringiensis (Bt) e Bacillus popilliae estão entre os agentes de biocontrole mais bem-sucedidos descobertos até hoje. A patogenicidade para insetos também foi atribuída a cepas de B. larvae, B. lentimorbus, B. sphaericus e B. cereus. Os inseticidas microbianos, particularmente aqueles obtidos de cepas de Bacillus, têm exercido uma função importante na agricultura como alternativas ao controle químico de pragas.

[0006] As plantas de culturas foram desenvolvidas com resistência a insetos aprimorada modificando-se geneticamente as plantas de cultura para produzir proteínas pesticidas a partir de Bacillus. Por exemplo, plantas de milho e algodão foram geneticamente modificadas para produzir proteínas pesticidas isoladas de cepas de Bacillus thuringiensis. Essas culturas geneticamente modificadas são agora amplamente usadas na agricultura e forneceram ao agricultor uma alternativa ecológica aos métodos tradicionais de controle de insetos. Embora tenham demonstrado ser muito bem-sucedidas comercialmente, estas plantas de cultura resistentes a insetos geneticamente modificadas podem proporcionar resistência a apenas uma estreita gama de pragas de insetos economicamente importantes. Em alguns casos, os insetos podem desenvolver resistência a compostos inseticidas diferentes, o que gera a necessidade de identificar agentes de controle biológico alternativos para controle de pragas.

[0007] Consequentemente, permanece uma necessidade de novas proteínas pesticidas com diferentes alcances de atividade inseticida contra pragas de inseto, por exemplo, proteínas inseticidas que são ativas contra uma variedade de insetos na ordem Lepidóptera e a ordem Coleóptera, incluindo, porém sem limitação, pragas de inseto que desenvolveram resistência a inseticidas existentes.

SUMÁRIO

[0008] Em um aspecto, são fornecidos composições e métodos para conferir atividade pesticida a bactérias, plantas, células, tecidos e sementes de planta. As composições incluem moléculas de ácido nucleico que codificam sequências para polipeptídeos pesticidas e inseticidas, vetores que compreendem essas moléculas de ácido nucleico e células hospedeiras que compreendem os vetores. As composições também incluem as sequências de polipeptídeos pesticidas e anticorpos para esses polipeptídeos. As composições também compreendem bactérias,

plantas, células de plantas, tecidos e sementes transformados.

[0009] Em outro aspecto, são fornecidas moléculas de ácido nucleico isoladas ou recombinantes que codificam um polipeptídeo de toxina Cry embaralhado incluindo substituições, deleções, inserções de aminoácidos e fragmentos dos mesmos. São fornecidas moléculas de ácido nucleico isolado ou recombinante com capacidade para codificar polipeptídeos de toxina Cry embaralhados de SEQ ID NOS: 57 a 112 e 275 a 278, bem como substituições, deleções, inserções de aminoácidos, fragmentos dos mesmos e combinações dos mesmos. Em certas concretizações, são fornecidos polinucleotídeos que codificam polipeptídeos inseticidas, em que os polinucleotídeos compreendem uma sequência de ácidos nucleicos conforme apresentado em qualquer uma das SEQ ID NOS: 57 a 112, 214 a 246 e 275 a

278. As sequências de ácidos nucleicos que são complementares a uma sequência de ácidos nucleicos das concretizações ou que se hibridizam a uma sequência das concretizações também são abrangidas. As sequências de ácidos nucleicos podem ser usadas em construtos de DNA ou cassetes de expressão para transformação e expressão em organismos, incluindo micro- organismos e plantas. As sequências de nucleotídeos ou aminoácidos podem ser sequências sintéticas que foram projetadas para expressão em um organismo que inclui, porém sem limitação, um micro-organismo ou uma planta.

[0010] Em outro aspecto, polipeptídeos de toxina Cry embaralhados são abrangidos. Também são fornecidos polipeptídeos de toxina Cry embaralhados isolados ou recombinantes de SEQ ID NO: 57 a 112 e 275 a 278, bem como substituições, deleções, inserções de aminoácidos, fragmentos dos mesmos e combinações dos mesmos.

[0011] Em outro aspecto, são fornecidos métodos para produzir os polipeptídeos e para usar esses polipeptídeos para controlar ou exterminar pragas de Lepidópteros, Coleópteros, nematódeos, fungos e/ou Dípteros. As plantas transgênicas das concretizações expressam uma ou mais dentre as sequências pesticidas reveladas no presente documento. Em várias concretizações, a planta transgênica compreende adicionalmente um ou mais genes adicionais para resistência a inseto, por exemplo, um ou mais genes adicionais para controlar pragas de Coleópteros, Lepidópteros, Hemiptera ou nematódeos. Será entendido por uma pessoa versada na técnica que a planta transgênica pode compreender qualquer gene que confere um traço agronômico de interesse.

[0012] Em outro aspecto, também estão incluídos métodos para detectar os ácidos nucleicos e polipeptídeos das concretizações em uma amostra. É fornecido um kit para detectar a presença de um polipeptídeo de toxina Cry embaralhado ou detectar a presença de um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo de toxina Cry embaralhado em uma amostra. O kit pode ser fornecido juntamente com todos os reagentes e amostras de controle necessários para executar um método para detectar o agente pretendido, assim como instruções para uso.

[0013] Em outro aspecto, as composições e métodos das concretizações são úteis para a produção de organismos com tolerância ou resistência a pragas aprimorada. Esses organismos e composições que compreendem os organismos são desejáveis para propósitos agrícolas. As composições das concretizações também são úteis para gerar proteínas alteradas ou melhoradas que têm atividade pesticida ou para detectar a presença de polipeptídeos de toxina Cry embaralhados.

[0014] Em outro aspecto, métodos para embaralhar polipeptídeos de toxina Cry que compreendem trocar domínios de alça alfa do domínio 1 (Dm1) de uma primeira toxina Cry para uma segunda toxina Cry são fornecidos. Em algumas concretizações, o polipeptídeo de toxina Cry embaralhado tem um espectro de atividade alterado. Em outra concretização, o polipeptídeo de toxina Cry embaralhado tem uma quantidade alterada da atividade pesticida. Em algumas concretizações, o polipeptídeo de toxina Cry embaralhado tem um modo de ação ou sítio de ação alterado. Em algumas concretizações, o embaralhamento compreende trocar as alças alfa 2, 3, 4, 5 e/ou 6 de uma primeira toxina Cry para uma segunda toxina Cry. Em algumas concretizações, a toxina Cry é uma toxina Cry nativa. Em algumas concretizações, a toxina Cry é uma toxina Cry embaralhada ou híbrida.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0015] A Figura 1 mostra diferentes fragmentos de domínio de toxina Cry de Bt de holótipo (Dm1, Dm2 e Dm3) que foram otimizados para expressão de E. coli e sintetizados e usados para reações de embaralhamento e modelados para PCR de fragmento. As sequências de borda são mostradas para as junções de Dm1, Dm2 e Dm3 (SEQ ID NOs: 266 e 267, respectivamente).

[0016] A Figura 2 mostra um desenho esquemático de biblioteca de 12 construtos que foram sintetizados conforme descrito no Exemplo 2 para troca de alças alfa 3-5 de várias toxinas Cry embaralhadas. Na Biblioteca 1, fragmentos de Dm1 alfa de Cry1Jc, Cry1Ca e Cry1Ah foram misturados com fragmentos de Dm3 de Cry1Jc, Cry1Ac e Cry1Ca juntamente com Dm2 de Cry1Jc. Seis construtos foram sintetizados. Na Biblioteca 2, fragmentos de Dm1 alfa de Cry1Ja, Cry1Ca e Cry1Ah foram misturados com fragmentos de Dm3 de Cry1Ja, Cry1Ac e Cry1Ca juntamente com Dm2 de Cry1Ja. Seis construtos foram sintetizados.

[0017] A Figura 3 mostra um projeto de biblioteca para embaralhar diversos domínios híbridos 1 (Dm1) com o domínio (Dm2) 2 de Cry1Ea 2 e o domínio 3 (Dm3) de Cry1Ca em três diferentes pontos de intersecção que têm diferentes comprimentos de Dm3 de Cry1Ca. Dm1s híbridos se diferem na região alfa 3-5. Juntamente com 9 Dm1s híbridos, três híbridos de Dm1 do tipo Cry1Ea foram projetados. Fragmentos de Dm1 e Dm1 alfa de diferentes toxinas Cry foram misturados com o fragmento de fusão de Dm2-Dm3 de Cry1Ea e Cry1Ca para criar diferentes variantes de toxina Cry inovadoras. Dm2s de Cry1Ea e Cry1Ca foram fundidos em diferentes pontos de intersecção; WTHRS (biblioteca ECF2, SEQ ID NO: 251), ITQIP (biblioteca ECF3, SEQ ID NO: 252) e GFTGG (biblioteca ECF4, SEQ ID NO: 253).

[0018] A Figura 4 mostra uma representação de um alinhamento de diversas toxinas Cry com sete diferentes regiões de intersecção entre Dm2 e Dm3 ou apenas dentro de Dm3, que são usadas como sítios de recombinação para fusões de Dm3 em cadeias principais de Dm1-Dm2 de C16, C18 e C21. O embaralhamento de Dm3 foi feito fundindo-se Dm3s à cadeia principal de Dm1-Dm2 em diferentes pontos de intersecção (fusão). Os pontos de intersecção são identificados como F2 a F8 (SEQ ID NOs: 251 a 257).

[0019] A Figura 5 mostra um modelo de homologia de IPRS-C16 com diferentes domínios identificados. As hélices alfa embaralhadas (tanto individuais quanto combinações) são indicadas em preto, e o restante da proteína (resto do Dm1, Dm2 e Dm3) é colorido de cinza. O embaralhamento alfa foi feito em IPRS-C16 e IPRS-C21.

[0020] A Figura 6 mostra um modelo de homologia (imagem de vista superior) de IPRS-C16 que mostra o fragmento embaralhado de Dm1 (Alfa-3, Alfa-4 e parte do fragmento Alfa- 5) colorido de preto. Diferentes domínios e hélices alfa são identificados. A localização das hélices foi determinada com base no alinhamento de múltiplas toxinas Cry e informações estruturais de raios X de toxinas Cry conhecidas.

[0021] A Figura 7 mostra uma lista de todas as variantes de IPRS-C geradas com o uso de embaralhamento de fragmento de toxina Cry diferente. A composição de domínio de todas as variantes é indicada. Os pontos de intersecção de fusão de Dm2 e Dm3 (F) foram também indicados. As atividades específicas (IC50 e LC50) de todas essas variantes foram determinadas contra CEW, FAW e ECB e listadas conforme testado. As variantes na tabela são divididas com base em sua atividade contra FAW, CEW ou ambos.

[0022] A Figura 8 mostra um fragmento de Dm1 (alça alfa 3 - parte da alça alfa 5) embaralhado nos exemplos 1,

2 e 3. As áreas sombreadas são sequências-âncora em que o fragmento embaralhado foi fundido à cadeia principal. Usualmente, o motivo de sequência-âncora 5' é QIEQL (SEQ ID NO:247), e o motivo de sequência-âncora 3' é ANLHL (SEQ ID NO:250). A diversidade em cada uma dessas posições de sequência-âncora foi também listada abaixo do motivo de sequência-âncora normal nas colunas.

[0023] A Figura 9 mostra os fragmentos de Dm1 (alças alfa 3, 4, 5, 3-4, 4-5 e 3-5) embaralhados conforme descrito nos Exemplos. As áreas sombreadas são sequências-âncora em que o fragmento embaralhado foi fundido à cadeia principal. Usualmente, os motivos de sequência-âncora 5' são QIEQL (SEQ ID NO: 247, para embaralhamento de hélice alfa-3, 4&5 e 3&5), DPXNP (SEQ ID NO: 248, para embaralhamento de alfa-4, 4&5) e SLQPG (SEQ ID NO: 249, para embaralhamento de alfa-5). Os motivos de sequência-âncora 3' são DPXNP (SEQ ID NO: 248, para embaralhamento de alfa-3), SLQPG (SEQ ID NO: 249, para embaralhamento de alfa-3&4) e GQRWG (SEQ ID NO: 268, para embaralhamento de alfa-5, 4&5 e 3&5). A diversidade em cada uma dessas posições de sequência-âncora foi também listada abaixo do motivo de sequência-âncora normal nas colunas.

[0024] A Figura 10 mostra a variante de IPRS produzida (com SEQ ID NOs associadas) conforme descrito nos Exemplos.

[0025] A Figura 11 mostra a alça alfa de toxina Cry (com as SEQ ID NOs associadas) que pode ser usada para troca de alça alfa.

[0026] A Figura 12 mostra toxinas Cry patenteadas que mostra atividade inseticida (com SEQ ID NOs associadas)

que podem ser usadas para embaralhamento conforme descrito no presente documento.

[0027] A Figura 13 mostra as regiões de Dm3 de toxina Cry (com SEQ ID NOs associadas) que mostraram atividade alterada quando trocadas por outra toxina Cry.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[0028] Conforme usado no presente documento, as formas singulares "um", "uma", "o" e "a" incluem referentes no plural, a menos que o contexto determine claramente de outro modo. Desse modo, por exemplo, a referência a "uma célula" inclui uma pluralidade de tais células, e a referência à "proteína" inclui referência a uma ou mais proteínas e equivalentes das mesmas e assim por diante. Todos os termos técnicos e científicos usados no presente documento têm o mesmo significado que o comumente entendido por uma pessoa de habilidade comum na técnica à qual esta divulgação pertence, a menos que claramente indicado de outro modo.

[0029] A presente revelação refere-se a composições e métodos para controlar pragas. Os métodos envolvem transformar organismos com sequências de ácidos nucleicos que codificam polipeptídeos de toxina Cry embaralhados. Em particular, as sequências de ácidos nucleicos das concretizações são úteis para preparar plantas e micro- organismos que têm atividade pesticida. Desse modo, bactérias, plantas, células de plantas, tecidos de planta e sementes transformados são fornecidos. As composições incluem ácidos nucleicos e proteínas pesticidas de espécies bacterianas. As sequências de ácidos nucleicos encontram uso na construção de vetores de expressão para a transformação subsequente em organismos de interesse, como sondas para o isolamento de outros genes homólogos (ou parcialmente homólogos) e para a geração de polipeptídeos de toxina Cry embaralhados alterados utilizando-se aspectos de certos métodos conhecidos na técnica, como mutagênese sítio- dirigida, troca de domínio ou embaralhamento de DNA. Os polipeptídeos de toxina Cry embaralhados encontram uso no controle ou extermínio de populações de pragas de lepidópteros, coleópteros, dípteros, fungos, hemípteros e nematódeos e para produzir composições com atividade pesticida. Os insetos-praga de interesse incluem, porém sem limitação, espécies de Lepidoptera que incluem, porém sem limitação: Lagarta da espiga, (CEW) (Helicoverpa zea), Broca europeia do milho (ECB) (Ostrinia nubialis), traça das crucíferas, por exemplo, Helicoverpa zea Boddie; lagarta falsa-medideira, por exemplo, Pseudoplusia includens Walker; e lagarta da soja, por exemplo, Anticarsia gemmatalis Hübner, e espécies de Coleoptera que incluem, mas sem limitação, Lagarta-da-raiz do milho do oeste (Diabrotica virgifera) - WCRW, Lagarta-da-raiz do milho do sul (Diabrotica undecimpunctata howardi) – SCRW e Lagarta-da-raiz do milho do norte (Diabrotica barberi) - NCRW.

[0030] “Toxina pesticida” ou “proteína pesticida” é usado no presente documento para referência a uma toxina que tem atividade tóxica contra uma ou mais pragas. Por exemplo, as pragas podem incluir membros das ordens Lepidoptera, Diptera, Hemiptera e Coleoptera ou do filo Nematoda ou uma proteína que tem homologia a tal proteína. Proteínas pesticidas foram isoladas de organismos, incluindo, por exemplo, Bacillus sp., Bacillus thurengiensis ("Bt"), Pseudomonas sp., Photorhabdus sp., Xenorhabdus sp., Clostridium bifermentans e Paenibacillus popilliae.

[0031] Em algumas concretizações, um polipeptídeo de toxina Cry embaralhado inclui uma sequência de aminoácidos deduzida da sequência de ácidos nucleicos de comprimento completo revelada no presente documento e sequências de aminoácidos que são mais curtas do que as sequências de comprimento completo, devido ao uso de um sítio de início a jusante alternativo ou devido ao processamento que produz uma proteína mais curta que tem atividade pesticida. O processamento pode ocorrer no organismo em que a proteína é expressa ou na praga após a ingestão da proteína.

[0032] Em outro aspecto, são fornecidos métodos para embaralhar um polipeptídeo de toxina Cry que compreende trocar ou embaralhar domínios de alça alfa do domínio 1 (Dm1) de uma primeira toxina Cry para uma segunda toxina Cry, criando uma região de alça alfa heteróloga na segunda toxina Cry embaralhada.

[0033] Em algumas concretizações, os métodos e as composições revelados no presente documento referem-se ao embaralhamento ou troca de todo ou partes de um domínio 3 (Dm3) de uma primeira toxina Cry (uma porção heteróloga) para uma segunda toxina Cry, criando uma região de domínio heterólogo 3 na segunda toxina Cry embaralhada ou trocada. Em algumas concretizações, o domínio 3 embaralhado ou trocado ocorre em qualquer um dos pontos de intersecção conforme apresentado nas SEQ ID NOs: 250 a 257. Em algumas concretizações, a porção heteróloga do domínio 3 compreende um fragmento derivado de uma toxina Cry1If, Cry1Cb, Cry1Fa, Cry 9Eb, Cry1Ae, Cry1Ja, Cry1Da, Cry1Bb ou Cry1Ca ou qualquer uma das SEQ ID NOs: 259 a 265 ou 268 a 270.

[0034] Em algumas concretizações, o polipeptídeo de toxina Cry embaralhado tem um espectro de atividade alterado. Em outra concretização, o polipeptídeo de toxina Cry embaralhado tem uma quantidade alterada da atividade pesticida. Em algumas concretizações, o polipeptídeo de toxina Cry embaralhado tem um modo de ação ou sítio de ação alterado. Em algumas concretizações, a toxina Cry embaralhada tem uma solubilidade alterada.

[0035] Em algumas concretizações, o embaralhamento compreende trocar ou embaralhar as alças alfa 2, 3, 4, 5 e/ou 6 inteiras ou porções das mesmas de uma primeira toxina Cry para uma segunda toxina Cry, que cria uma região de alça alfa heteróloga. Em algumas concretizações s, a toxina Cry é uma toxina Cry nativa. Em algumas concretizações, a toxina Cry é uma toxina Cry embaralhada ou híbrida derivada de uma toxina Cry nativa. Em algumas concretizações, a troca ou o embaralhamento de alça alfa ocorre em um motivo da sequência que compreende pelo menos 90% ou que tem pelo menos 95% de identidade de sequência com qualquer uma das SEQ ID NOs: 247 a 250.

[0036] Em outra concretização, a troca ou o embaralhamento de alça alfa ocorre em um motivo da sequência que compreende a variante da SEQ ID NO: 247, em que a variante compreende 1) uma histidina ou arginina na posição 1 da SEQ ID NO: 247; 2) uma valina, metionina ou leucina na posição 2 da SEQ ID NO: 247; 3) uma leucina na posição 3 da SEQ ID

NO: 247; 4) uma arginina, ácido glutâmico, leucina ou serina na posição 4 da SEQ ID NO: 247; ou 5) uma isoleucina na posição 5 da SEQ ID NO: 247.

[0037] Em outra concretização, a troca ou o embaralhamento de alça alfa ocorre em um motivo da sequência que compreende a variante da SEQ ID NO: 250, em que a variante compreende 1) uma valina na posição 1 da SEQ ID NO: 250; 2) uma fenilalanina na posição 2 da SEQ ID NO: 250; ou 3) uma fenilalanina na posição 3 da SEQ ID NO: 250.

[0038] Em outra concretização, a troca ou o embaralhamento de alça alfa ocorre em um motivo da sequência que compreende a variante da SEQ ID NO: 248, em que a variante compreende 1) uma asparagina, serina, treonina ou arginina na posição 1 da SEQ ID NO: 248; 2) uma arginina na posição 2 da SEQ ID NO: 248; 3) um ácido aspártico, glicina ou alanina na posição 4 da SEQ ID NO: 248; 4) uma arginina, ácido glutâmico, leucina ou serina na posição 4 da SEQ ID NO: 248; ou 5) uma alanina, serina, treonina, ácido glutâmico ou valina na posição 5 da SEQ ID NO: 248.

[0039] Em outra concretização, a troca ou o embaralhamento de alça alfa ocorre em um motivo da sequência que compreende a variante da SEQ ID NO: 249, em que a variante compreende 1) uma arginina, alanina, treonina, lisina ou glicina na posição 1 da SEQ ID NO: 249; 2) uma treonina, serina, valina, isoleucina ou ácido glutâmico na posição 2 da SEQ ID NO: 249; 3) uma serina, isoleucina, prolina, alanina, arginina, treonina, glicina ou asparagina na posição 3 da SEQ ID NO: 249; 4) uma asparagina, glutamina, ácido glutâmico, glicina, ácido aspártico, serina ou treonina na posição 4 da SEQ ID NO: 249; ou 5) uma fenilalanina, ácido glutâmico, tirosina ou glutamina na posição 5 da SEQ ID NO: 249.

[0040] Em outra concretização, a troca ou o embaralhamento de alça alfa ocorre em um motivo da sequência que compreende a variante da SEQ ID NO: 258, em que a variante compreende 1) um ácido glutâmico, alanina, serina, arginina, lisina ou treonina na posição 2 da SEQ ID NO: 258; 2) uma alanina, glicina ou ácido glutâmico na posição 3 da SEQ ID NO: 258; ou 3) uma serina ou fenilalanina na posição 4 da SEQ ID NO: 258.

[0041] Assim, são fornecidas no presente documento sequências de ácidos nucleicos isoladas ou recombinantes que codificam polipeptídeos de toxina Cry embaralhados que conferem atividade pesticida. São também fornecidas as sequências de aminoácidos de polipeptídeos de toxina Cry embaralhados. Os polipeptídeos que resultam da tradução desses genes de toxina Cry embaralhados permite que as células controlem ou exterminem pragas que ingerem os mesmos.

[0042] Os membros das classes de proteínas inseticidas de B. thuringiensis são conhecidos por uma pessoa versada na técnica (consultar Crickmore, et al., Microbiology and Molecular Biology Reviews (1998) Volume 62: 807 a 813; e Crickmore, et al., "Bacillus thuringiensis toxin nomenclature" (2016), em btnomenclature.info/ que pode ser acessado na rede mundial de computadores com o uso do prefixo "www"). Conforme usado no presente documento, uma "toxina Cry de Bt" ou uma "toxina Cry" refere-se a uma proteína de inclusão parasporal (cristal) de B. thuringiensis que exibe algum efeito tóxico experimentalmente verificável para um organismo-alvo ou qualquer proteína que tenha similaridade de sequência óbvia com uma proteína Cry conhecida (Crickmore, et al., Microbiology and Molecular Biology Reviews (1998) Volume 62: 807). Proteínas de Toxina Cry Embaralhadas e Variantes e Fragmentos Das Mesmas

[0043] Os polipeptídeos de toxina Cry embaralhados são abrangidos pela revelação. "polipeptídeo de toxina Cry embaralhado" e "proteína de toxina Cry embaralhada" conforme usado no presente documento refere-se de forma intercambiável a um polipeptídeo (ou polipeptídeos) que tem atividade inseticida incluindo, porém sem limitação, atividade inseticida contra um ou mais insetos-praga das ordens Lepidóptera e/ou Coleóptera e foi embaralhado a partir de um ou mais polipeptídeos de toxina Cry de Bacillus thurengiensis nativos. Em algumas concretizações, o polipeptídeo de toxina Cry embaralhado compreende uma toxina Cry embaralhada, em que o embaralhamento compreende uma troca de alça alfa heteróloga no domínio 1 ("Dm1") ou um fragmento heterólogo do domínio 3 ("Dm 3"). Uma variedade de polipeptídeos de toxina Cry embaralhados é contemplada. As fontes de polipeptídeos de toxina Cry embaralhados ou proteínas relacionadas incluem espécies bacterianas selecionadas a partir da, porém sem limitação, espécie de Bacillus thurengiensis (Bt).

[0044] "Suficientemente idêntico" é usado no presente documento para referência a uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos cerca de 70%, 71%, 72%, 73%,

74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade de sequência. Em uma concretização, o polipeptídeo de toxina Cry embaralhado tem pelo menos cerca de 40%, 45%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou identidade de sequência maior em comparação com qualquer uma das SEQ ID NOs: 57 a 112, 214 a 246 e 275 a 278. O termo "cerca de" quando usado no presente documento em contexto com identidade de sequência em porcentagem significa +/- 1,0%.

[0045] Uma "proteína recombinante" é usada no presente documento para se referir a uma proteína que não está mais em seu ambiente natural, por exemplo, in vitro ou em uma célula hospedeira de planta ou bacteriana recombinante.

[0046] "Substancialmente isento de material celular", conforme usado no presente documento, refere-se a um polipeptídeo que inclui preparações de proteína que têm menos de cerca de 30%, 20%, 10% ou 5% (em peso seco) de proteína não pesticida (também denominada no presente documento uma "proteína contaminante").

[0047] "Fragmentos" ou "porções biologicamente ativas" incluem fragmentos de polipeptídeo que compreendem sequências de aminoácidos suficientemente idênticas a um polipeptídeo de toxina Cry embaralhado e que exibem atividade inseticida. "Fragmentos" ou "porções biologicamente ativas"

de polipeptídeos de toxina Cry embaralhados incluem fragmentos que compreendem sequências de aminoácidos suficientemente idênticas à sequência de aminoácidos apresentada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 57 a 112, 214 a 246 e 275 a 278 em que o polipeptídeo de toxina Cry embaralhado tem atividade inseticida. Tais porções biologicamente ativas podem ser preparadas por técnicas recombinantes e avaliadas em relação à atividade inseticida. Em algumas concretizações, o fragmento do polipeptídeo de toxina Cry embaralhado é um truncamento N-terminal e/ou C- terminal de pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 ou mais aminoácidos do terminal N e/ou terminal C em relação a qualquer uma das SEQ ID NOs: 57 a 112, 214 a 246 e 275 a 278, por exemplo, por proteólise, por inserção de um códon de início, por deleção dos códons que codificam os aminoácidos deletados e inserção concomitante de um códon de início e/ou inserção de um códon de parada. Em algumas concretizações, o fragmento de polipeptídeo de toxina Cry embaralhado é um truncamento N-terminal de pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 aminoácidos do terminal N de qualquer uma das SEQ ID NOs: 57 a 112, 214 a 246 e 275 a

278. Em algumas concretizações, o fragmento do polipeptídeo de toxina Cry embaralhado é um truncamento N-terminal e/ou C-terminal de pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34 ou mais aminoácidos do terminal

N e/ou terminal C em relação a qualquer uma das SEQ ID NOs: 57 a 112, 214 a 246 e 275 a 278.

[0048] "Variantes", conforme usado no presente documento, refere-se a proteínas ou polipeptídeos que têm uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais idêntica à sequência de aminoácidos progenitora.

[0049] Em algumas concretizações, um polipeptídeo de toxina Cry embaralhado compreende uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos cerca de 40%, 45%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade de sequência com o comprimento completo ou fragmento da sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOs: 57 a 112, 214 a 246 e 275 a 278, em que o polipeptídeo de toxina Cry embaralhado tem atividade inseticida.

[0050] Em algumas concretizações, um polipeptídeo de toxina Cry embaralhado compreende uma sequência de aminoácidos de qualquer uma ou mais dentre as SEQ ID NOS: 57 a 112, 214 a 246 e 275 a 278 que tem 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70,71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83,

84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95 ou mais substituições de aminoácidos em comparação ao aminoácido na posição correspondente de qualquer uma ou mais das respectivas SEQ ID NOS: 57 a 112, 214 a 246 e 275 a 278.

[0051] Métodos para tais manipulações são geralmente conhecidos na técnica. Por exemplo, variantes da sequência de aminoácidos de um polipeptídeo de toxina Cry embaralhado podem ser preparadas por mutações no DNA. Isso pode ser também realizado por uma dentre diversas formas de mutagênese, tal como, por exemplo, tecnologia de quebra de fita dupla específica para sítio e/ou em evolução dirigida. Em alguns aspectos, as alterações codificadas na sequência de aminoácidos não afetarão substancialmente a função da proteína. Tais variantes terão uma atividade pesticida desejada. Entretanto, entende-se que a capacidade de um polipeptídeo de toxina Cry embaralhado para conferir atividade pesticida ou outra propriedade física de polipeptídeo pode ser melhorada ou alterada pelo uso de tais técnicas mediante as composições desta revelação.

[0052] As substituições de aminoácido conservativas podem ser feitas em um ou mais resíduos de aminoácidos não essenciais previstos. Um resíduo de aminoácido "não essencial" é um resíduo que pode ser alterado a partir da sequência do tipo selvagem de um polipeptídeo de toxina Cry embaralhado sem alterar a atividade biológica. Uma "substituição de aminoácido conservativa" é aquela na qual o resíduo de aminoácido é substituído por um resíduo de aminoácido que tem uma cadeia lateral similar. As famílias de resíduos de aminoácido que têm cadeias laterais similares foram definidas na técnica. Estas famílias incluem: aminoácidos com cadeias laterais básicas (por exemplo, lisina, arginina, histidina); cadeias laterais ácidas (por exemplo, ácido aspártico, ácido glutâmico); resíduos negativamente carregados polares e suas amidas (por exemplo, ácido aspártico, asparagina, ácido glutâmico, glutamina); cadeias laterais polares não carregadas (por exemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína); resíduos alifáticos pequenos, não polares ou levemente polares (por exemplo, Alanina, serina, treonina, prolina, glicina); cadeias laterais não polares (por exemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofano); resíduos não polares alifáticos grandes (por exemplo, metionina, leucina, isoleucina, valina, cisteína); cadeias laterais com ramificação beta (por exemplo, treonina, valina, isoleucina); cadeias laterais aromáticas (por exemplo, tirosina, fenilalanina, triptofano, histidina); cadeias laterais aromáticas grandes (por exemplo, tirosina, fenilalanina, triptofano).

[0053] As substituições de aminoácidos podem ser feitas em regiões não conservadas que retêm função. Em geral, tais substituições não serão feitas para resíduos de aminoácidos conservados ou para resíduos de aminoácidos que residem em um motivo conservado, em que tais resíduos são essenciais para atividade da proteína. Os exemplos de resíduos que são conservados e que podem ser essenciais para a atividade de proteína incluem, por exemplo, resíduos que são idênticos entre todas as proteínas contidas em um alinhamento de toxinas semelhantes ou relacionadas às sequências das concretizações (por exemplo, resíduos que são idênticos em um alinhamento de proteínas homólogas). Os exemplos de resíduos que são conservados, mas que podem permitir substituições de aminoácido conservativas e ainda podem reter atividade incluem, por exemplo, resíduos que têm apenas substituições conservativas entre todas as proteínas contidas em um alinhamento de toxinas semelhantes ou relacionadas às sequências das concretizações (por exemplo, resíduos que têm apenas substituições conservativas entre todas as proteínas contidas no alinhamento das proteínas homólogas). Entretanto, o técnico versado no assunto entenderá que as variantes funcionais podem ter alterações conservadas ou não conservadas muito pequenas nos resíduos conservados.

[0054] Alternativamente, alterações podem ser feitas à sequência de proteína de muitas proteínas no terminal amino ou carbóxi sem afetar substancialmente a atividade. Isso pode incluir inserções, deleções ou alterações introduzidas por métodos moleculares modernos, como PCR, incluindo amplificações de PCR que alteram ou estendem a sequência de codificação de proteína em virtude da inclusão de sequências de codificação de aminoácidos nos oligonucleotídeos utilizados na amplificação de PCR. Alternativamente, as sequências de proteínas adicionadas podem incluir sequências de codificação de proteínas inteiras, como aquelas usadas comumente na técnica para gerar fusões de proteínas. Tais proteínas de fusão são frequentemente usadas para (1) aumentar a expressão de uma proteína de interesse (2)

introduzir um domínio de ligação, atividade enzimática ou epítopo para facilitar a purificação da proteína, a detecção da proteína ou outros usos experimentais conhecidos na técnica (3) direcionar a secreção ou tradução de uma proteína para uma organela subcelular, como o espaço periplasmático de bactérias Gram-negativas, mitocôndrias ou cloroplastos de plantas ou o retículo endoplasmático de células eucarióticas, sendo que o último resulta frequentemente em glicosilação da proteína.

[0055] As sequências de nucleotídeos e de aminoácidos variantes da revelação também abrangem as sequências derivadas de procedimentos mutagênicos e recombinogênicos, como embaralhamento de DNA. Com tal procedimento, uma ou mais regiões de codificação de polipeptídeos de toxina Cry embaralhados diferentes podem ser usadas para criar um novo polipeptídeo de toxina Cry embaralhado que possui as propriedades desejadas. Dessa maneira, as bibliotecas de polinucleotídeos recombinantes são geradas a partir de uma população de polinucleotídeos de sequência relacionada que compreendem regiões de sequência que têm identidade de sequência substancial e podem ser recombinadas de modo homólogo in vitro ou in vivo. Por exemplo, com o uso dessa abordagem, os motivos de sequência que codificam um domínio de interesse podem ser embaralhados entre um gene pesticida e outros genes pesticidas conhecidos para obter um gene novo que codifica uma proteína com uma propriedade de interesse melhorada, como uma atividade inseticida aumentada. As estratégias para tal embaralhamento de DNA são conhecidas na técnica. Consultar, por exemplo,

Stemmer, (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:10.747 a

10.751; Stemmer, (1994) Nature 370:389 a 391; e as Patentes nos US 5,605,793 e 5,837,458.

[0056] A troca de domínio como embaralhamento é outro mecanismo para gerar polipeptídeos de toxina Cry embaralhados alterados. Os domínios podem ser trocados entre polipeptídeos de toxina Cry embaralhados, o que resulta em toxinas híbridas ou quiméricas com atividade inseticida ou espectro-alvo alterados. Os métodos para gerar proteínas recombinantes e testar as mesmas quanto à atividade pesticida são conhecidos na técnica (consultar, por exemplo, Naimov, et al., (2001) Appl. Environ. Microbiol. 67:5.328 a 5.330; de Maagd, et al., (1996) Appl. Environ. Microbiol. 62:1.537 a 1.543; Ge, et al., (1991) J. Biol. Chem. 266:17.954 a

17.958; Schnepf, et al., (1990) J. Biol. Chem. 265:20.923 a

21.010; Rang, et al., 91999) Appl. Environ. Microbiol. 65:2.918 a 2.925).

[0057] Em algumas concretizações, o polipeptídeo de toxina Cry embaralhado tem uma propriedade física modificada. Conforme usado no presente documento, o termo "propriedade física" refere-se a qualquer parâmetro adequado para descrever as características físico-químicas de uma proteína. Conforme usado no presente documento, "propriedade física de interesse" e "propriedade de interesse" são usados de modo intercambiável para referência a propriedades físicas de proteínas que estão sendo investigadas e/ou modificadas. Os exemplos de propriedades físicas incluem, porém sem limitação, carga de superfície de rede e distribuição de carga na superfície de proteína,

hidrofobicidade de rede e distribuição de resíduo hidrofóbico na superfície de superfície de proteína, densidade de carga de superfície, densidade de hidrofobicidade de superfície, contagem total de grupos de ionizáveis em superfície, tensão de superfície, tamanho de proteína e sua distribuição na solução, temperatura de derretimento, capacidade de transporte térmica e segundo coeficiente virial. Os exemplos de propriedades físicas também incluem o polipeptídeo de toxina Cry embaralhado ter expressão aumentada, solubilidade aumentada, fitotoxicidade diminuída e digestibilidade de fragmentos proteolíticos em um intestino de inseto. Modelos para digestão por fluidos gástricos simulados são conhecidos por um indivíduo versado na técnica (Fuchs, R.L. e J.D. Astwood. Food Technology 50: 83 a 88, 1996; Astwood, J.D., et al Nature Biotechnology 14:

1.269 a 1.273, 1996; Fu TJ et al J. Agric Food Chem. 50:

7.154 a 7.160, 2002).

[0058] Em algumas concretizações, as variantes incluem polipeptídeos que diferem em sequência de aminoácidos devido à mutagênese. As proteínas variantes abrangidas pela revelação são biologicamente ativas, isto é, continuam a ter uma atividade biológica desejada (isto é, atividade pesticida) da proteína nativa. Em alguma concretização a variante terá pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80% ou mais da atividade inseticida da proteína nativa. Em algumas concretizações, as variantes podem ter atividade melhorada relativamente à proteína nativa.

[0059] Os genes bacterianos têm frequentemente múltiplos códons de início de metionina em proximidade com o início do quadro de leitura aberto. Normalmente, o início da tradução em um ou mais desses códons de início levará à geração de uma proteína funcional. Esses códons de início podem incluir códons ATG. Entretanto, as bactérias, como Bacillus sp., também reconhecem o códon GTG como um códon de início, e proteínas que iniciam a tradução em códons GTG contêm uma metionina no primeiro aminoácido. Em ocasiões raras, a tradução em sistemas bacterianos pode iniciar em um códon TTG, embora, nesse caso, o TTG codifique uma metionina. Adicionalmente, não é normalmente determinado a priori quais desses códons são usados naturalmente na bactéria. Desse modo, é entendido que o uso de um dos códons de metionina alternativos também pode levar à geração de proteínas pesticidas. Essas proteínas pesticidas são abrangidas na presente revelação e podem ser usadas nos métodos da presente revelação. Será entendido que, quando expressas em plantas, será necessário alterar o códon de início alternativo para ATG para tradução apropriada.

[0060] Em algumas concretizações, um polipeptídeo de toxina Cry embaralhado compreende uma sequência de aminoácidos de qualquer uma ou mais dentre as SEQ ID NOS: 57 a 112 e 275 a 278.

[0061] Em algumas concretizações, são fornecidos polipeptídeos quiméricos que compreendem regiões de pelo menos dois polipeptídeos de toxina Cry embaralhados diferentes da revelação.

[0062] Em algumas concretizações, são fornecidos polipeptídeos quiméricos que compreendem regiões de pelo menos dois diferentes polipeptídeos de toxina Cry embaralhados selecionados dentre qualquer uma ou mais dentre as SEQ ID NOS: 57 a 112, 214 a 246 e 275 a 278.

[0063] Em algumas concretizações, o polipeptídeo (ou polipeptídeos) de toxina Cry embaralhado quimérico é fornecido compreendendo uma região N-terminal de um primeiro polipeptídeo de toxina Cry embaralhado da revelação fundido de maneira funcional a uma região C-terminal de um segundo polipeptídeo de toxina Cry embaralhado da revelação.

[0064] Em outras concretizações, o polipeptídeo de toxina Cry embaralhado pode ser expresso como uma proteína precursora com uma sequência interveniente que catalisa o splicing de proteínas pós-tradução em múltiplas etapas. O splicing de proteínas envolve a remoção de uma sequência interveniente de um polipeptídeo com a união concomitante das sequências de flanqueamento para render um polipeptídeo novo (Chong, et al., (1996) J. Biol. Chem., 271:22.159 a

22.168). Essa sequência interveniente ou elemento de splicing de proteína, denominados inteínas, catalisam sua própria excisão através das três reações coordenadas nas junções de splicing do N-terminal e C-terminal: uma redisposição de acila da cisteína ou serina N-terminal; uma reação de transesterficação entre os dois terminais para formar um intermediário de tioéster ou éster ramificado e clivagem de ligação de peptídeo acoplada à ciclização da asparagina C-terminal de inteína para libertar a inteína (Evans, et al., (2000) J. Biol. Chem., 275:9.091 a 9.094.

[0065] Em outra concretização, proteínas de fusão são fornecidas, as quais incluem em sua sequência de aminoácidos uma sequência de aminoácidos que compreende um polipeptídeo de toxina Cry embaralhado da revelação. Os métodos para projeto e construção de proteínas de fusão (e polinucleotídeos que codificam as mesmas) são conhecidos por aqueles versados na técnica. Polinucleotídeos que codificam um polipeptídeo de toxina Cry embaralhado podem ser fundidos a sequências de sinal que direcionarão a localização do polipeptídeo de toxina Cry embaralhado a compartimentos particulares de uma célula procariótica ou eucariótica e/ou direcionarão a secreção do polipeptídeo de toxina Cry embaralhado das concretizações de uma célula procariótica ou eucariótica.

[0066] Por exemplo, em E. coli, pode-se desejar direcionar a expressão da proteína ao espaço periplasmático. Os exemplos de sequências ou proteínas de sinal (ou fragmentos das mesmas) aos quais o polipeptídeo de toxina Cry embaralhado pode ser fundido a fim de direcionar a expressão do polipeptídeo ao espaço periplásmico de bactérias incluem, porém sem limitação, a sequência de sinal pelB, a sequência de sinal de proteína de ligação de maltose (MBP), MBP, a sequência de sinal ompA, a sequência de sinal de subunidade B de enterotoxina lábil ao calor de E. coli periplásmica e a sequência de sinal da fosfatase alcalina. Diversos vetores estão comercialmente disponíveis para a construção de proteínas de fusão que direcionarão a localização de uma proteína, como a série de vetores pMAL (particularmente a série pMAL-p) disponível junto à New

England Biolabs. Em uma concretização específica, o polipeptídeo de toxina Cry embaralhado pode ser fundido à sequência de sinal de pectato liase pelB para aumentar a eficácia de expressão e purificação de tais polipeptídeos em bactérias Gram-negativas (consultar as Patentes nos U.S. 5,576,195 e 5,846,818).

[0067] As fusões de peptídeo/polipeptídeo de trânsito de plastídeo de planta são conhecidas na técnica. Os peptídeos de trânsito de apoplasto, como sinal de secreção de alfa-amilase de arroz ou cevada também são conhecidos na técnica. O peptídeo de trânsito de plastídeo é geralmente fundido de modo N-terminal ao polipeptídeo a ser alvejado (por exemplo, o parceiro de fusão). Em uma concretização, a proteína de fusão consiste essencialmente no peptídeo de trânsito de plastídeo e no polipeptídeo de toxina Cry embaralhado a ser alvejado. Em outra concretização, a proteína de fusão compreende o peptídeo de trânsito de plastídeo e o polipeptídeo a ser alvejado. Em tais concretizações, o peptídeo de trânsito de plastídeo está preferencialmente no terminal N da proteína de fusão. No entanto, resíduos de aminoácidos adicionais podem ser N- terminais ao peptídeo de trânsito de plastídeo, desde que a proteína de fusão seja pelo menos parcialmente alvejada a um plastídeo. Em uma concretização específica, o peptídeo de trânsito de plastídeo está na metade N-terminal, terço N- terminal ou quarto N-terminal da proteína de fusão. A maior parte ou a totalidade do peptídeo de trânsito de plastídeo é geralmente clivada da proteína de fusão por inserção no plastídeo. A posição de clivagem pode variar ligeiramente entre espécies de plantas, em diferentes estágios de desenvolvimento de plantas, como resultado de condições intercelulares específicas ou da combinação particular de peptídeo de transição/parceiro de fusão usado. Em uma concretização, a clivagem do peptídeo de transição de plastídeo é homogênea, de modo que o sítio de clivagem seja idêntico em uma população de proteínas de fusão. Em outra concretização, o peptídeo de trânsito de plastídeo não é homogêneo, de modo que o sítio de clivagem varia por 1 a 10 aminoácidos em uma população de proteínas de fusão. O peptídeo de trânsito de plastídeo pode ser fundido de modo recombinante a uma segunda proteína em uma de diversas maneiras. Em algumas concretizações, o polipeptídeo de toxina Cry embaralhado é fundido a um peptídeo sinal heterólogo ou peptídeo de trânsito heterólogo.

[0068] Em algumas concretizações, são fornecidas proteínas de fusão que compreendem um polipeptídeo de toxina Cry embaralhado ou polipeptídeo de toxina Cry quimérico da revelação representado por uma fórmula selecionada dentre o grupo que consiste em: R1-L-R2, R2-L- R1, R1- R2 ou R2- R1 em que R1 é um polipeptídeo de toxina Cry embaralhado ou polipeptídeo de toxina Cry embaralhado quimérico da revelação, e R2 é uma proteína de interesse. Em algumas concretizações, R1 e R2 são um polipeptídeo de toxina Cry embaralhado ou polipeptídeo de toxina Cry embaralhado quimérico da revelação. O polipeptídeo R1 é fundido, diretamente ou através de um segmento ligante (L), ao polipeptídeo R2. O termo "diretamente" define fusões nas quais os polipeptídeos são unidos sem um peptídeo ligante.

Desse modo, "L" representa uma ligação química ou segmento polipeptídico ao qual tanto R1 quanto R2 são fundidos em quadro, muito comumente L é um peptídeo linear ao qual R1 e R2 são ligados por ligações amida que ligam o terminal carbóxi de R1 ao terminal amino de L e o terminal carbóxi de L ao terminal amino de R2. "Fundido em quadro" significa que não há terminação ou interrupção de tradução entre os quadros de leitura de R1 e R2. O grupo ligante (L) é geralmente um polipeptídeo com entre 1 e 500 aminoácidos de comprimento.

Os ligantes que unem as duas moléculas são preferencialmente projetados para (1) permitir que as duas moléculas se enovelem e atuem independentemente entre si, (2) não ter uma propensão para desenvolver uma estrutura secundária ordenada, o que poderia interferir nos domínios funcionais das duas proteínas, (3) ter característica hidrofóbica ou carregada mínima, que poderia interagir com os domínios funcionais das proteínas, e (4) fornecer separação estérica de R1 e R2, de modo que R1 e R2 possam interagir simultaneamente com seus receptores correspondentes em uma célula única.

Tipicamente, os aminoácidos de superfície em regiões de proteína flexíveis incluem Gly, Asn e Ser.

Seria esperado que virtualmente qualquer permutação de sequências de aminoácidos que contém Gly, Asn e Ser satisfaça os critérios acima para uma sequência ligante.

Outros aminoácidos neutros, como Thr e Ala, também podem ser usados na sequência ligante.

Aminoácidos adicionais também podem ser incluídos nos ligantes devido à adição de sítios de restrição exclusivos na sequência ligante para facilitar a construção das fusões.

[0069] Em algumas concretizações, os ligantes compreendem sequências selecionadas a partir do grupo de fórmulas: (Gly3Ser)n, (Gly4Ser)n, (Gly5Ser)n, (GlynSer)n ou (AlaGlySer)n em que n é um número inteiro. Um exemplo de um ligante altamente flexível é a região espaçadora rica em (GlySer) presente dentro da proteína pIII dos bacteriófagos filamentosos, por exemplo, bacteriófagos M13 ou fd (Schaller, et al., 1975). Essa região fornece uma região espaçadora flexível longa entre dois domínios da proteína de superfície pIII. Também são incluídos os ligantes nos quais uma sequência de reconhecimento de endopeptidase é incluída. Tal sítio de clivagem pode ser valioso para separar os componentes individuais da fusão para determinar se são apropriadamente enovelados e ativos in vitro. Os exemplos de várias endopeptidases incluem, porém sem limitação, Plasmina, Enteroquinase, Calicreína, Uroquinase, Ativador do plasminogênio tecidual, clostripaína, Quimosina, Colagenase, Protease de Veneno de Víbora de Russell, Enzima de clivagem pós-prolina, protease V8, Trombina e fator Xa. Em algumas concretizações, o ligante compreende os aminoácidos do veículo de expressão de múltiplos genes (MGEV), que é clivado por proteases vacuolares conforme revelado na Publicação de Pedido de Patente Número US 2007/0277263. Em outras concretizações, os segmentos de peptídeo de ligante da região de dobradiça de imunoglobulinas de cadeia pesada IgG, IgA, IgM, IgD ou IgE fornecem uma relação angular entre os polipeptídeos ligados. São especialmente úteis aquelas regiões de dobradiça em que as cisteínas são substituídas por serinas. Os ligantes da presente revelação incluem sequências derivadas da região de dobradiça gama 2b de IgG de murino em que as cisteínas foram mudadas para serinas. As proteínas de fusão não são limitadas pela forma, tamanho ou número de sequências ligantes empregadas, e a única exigência do ligante é que funcionalmente não interfira de modo adverso no enovelamento e na função das moléculas individuais da fusão. Moléculas de Ácidos Nucleicos e Variantes e Fragmentos das Mesmas

[0070] As moléculas de ácido nucleico isoladas ou recombinantes que compreendem sequências de ácidos nucleicos que codificam polipeptídeos de toxina Cry ou porções biologicamente ativas dos mesmos, assim como moléculas de ácido nucleico suficientes para uso como sondas de hibridização para identificar moléculas de ácido nucleico que codificam as proteínas com regiões de homologia de sequência são fornecidas. Conforme usado no presente documento, o termo "molécula de ácido nucleico" refere-se a moléculas de DNA (por exemplo, DNA recombinante, cDNA, DNA genômico, DNA plastídeo, DNA mitocondrial) e moléculas de RNA (por exemplo, mRNA) e análogos do DNA ou RNA gerado com o uso de análogos de nucleotídeo. A molécula de ácido nucleico pode ser de fita única ou de fita dupla, mas preferencialmente é DNA de fita dupla.

[0071] Uma molécula de ácido nucleico "isolada" (ou DNA) é usada no presente documento para se referir a uma sequência de ácidos nucleicos (ou DNA) que não está mais em seu ambiente natural, por exemplo, in vitro. Uma molécula de ácido nucleico (ou DNA) “recombinante” é usada no presente documento para se referir a uma sequência de ácidos nucleicos (ou DNA) que está em uma célula hospedeira vegetal ou bacteriana recombinante. Em algumas concretizações, um ácido nucleico "isolado" ou "recombinante" está livre de sequências (preferencialmente sequências de codificação de proteína) que flanqueiam naturalmente o ácido nucleico (isto é, sequências localizadas nas extremidades 5′ e 3′ do ácido nucleico) no DNA genômico do organismo a partir do qual o ácido nucleico é derivado. Para os propósitos da revelação, "isolado" ou "recombinante", quando usado para referência a moléculas de ácido nucleico, exclui cromossomos isolados. Por exemplo, em várias concretizações, as moléculas de ácido nucleico recombinantes que codificam polipeptídeos de toxina Cry podem conter menos de cerca de 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0,5 kb ou 0,1 kb de sequências de ácidos nucleicos que flanqueiam naturalmente a molécula de ácido nucleico no DNA genômico da célula a partir da qual o ácido nucleico é derivado.

[0072] Em algumas concretizações, uma molécula de ácido nucleico isolada que codifica polipeptídeos de toxina Cry tem uma ou mais alterações na sequência de ácidos nucleicos em comparação com a sequência de ácidos nucleicos nativa ou genômica. Em algumas concretizações, a alteração na sequência de ácidos nucleicos nativa ou genômica inclui, porém sem limitação: alterações na sequência de ácidos nucleicos devido à degeneração do código genético; alterações na sequência de ácidos nucleicos devido à substituição, inserção, deleção e/ou adição de aminoácido em comparação à sequência nativa ou genômica; remoção de um ou mais íntrons; deleção de uma ou mais regiões regulatórias a montante ou a jusante; e deleção da região não traduzida 5' e/ou 3' associada à sequência de ácidos nucleicos genômico. Em algumas concretizações, a molécula de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo de toxina Cry é uma sequência não genômica.

[0073] Uma variedade de polinucleotídeos que codifica polipeptídeos de toxina Cry ou proteínas relacionadas é contemplada. Tais polinucleotídeos são úteis para a produção de polipeptídeos de toxina Cry em células hospedeiras quando ligados de maneira funcional a uma sequência promotora, de terminação de transcrição e/ou de poliadenilação adequada. Tais polinucleotídeos também são úteis como sondas para isolar polinucleotídeos homólogos ou substancialmente homólogos que codificam polipeptídeos de toxina Cry ou proteínas relacionadas. Polinucleotídeos que codificam polipeptídeos

[0074] Uma fonte de polinucleotídeos que codificam polipeptídeos de toxina Cry ou proteínas relacionadas é uma bactéria Bacillus que pode conter um polinucleotídeo de toxina Cry de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1 a 56, 181 a 213 e 271 a 274, que codifica um polipeptídeo de toxina Cry das SEQ ID NOs: 57 a 112, 214 a 246 e 271 a 274, respectivamente. Os polinucleotídeos de qualquer uma ou mais dentre as SEQ ID NOS: 1 a 56, 181 a 213 e 271 a 274 podem ser usados para expressar os polipeptídeos de toxina Cry em hospedeiros bacterianos recombinantes que incluem, porém sem limitação,

células hospedeiras bacterianas de Agrobacterium, Bacillus, Escherichia, Salmonella, Lysinibacillus, Acetobacter, Pseudomonas e Rhizobium. Os polinucleotídeos também são úteis como sondas para isolar polinucleotídeos homólogos ou substancialmente homólogos que codificam polipeptídeos de toxina Cry ou proteínas relacionadas. Tais sondas podem ser usadas para identificar polinucleotídeos homólogos ou substancialmente homólogos, ou porções dos mesmos, derivados de Bacillus thurengiensis.

[0075] Os polinucleotídeos que codificam os polipeptídeos de toxina Cry podem também ser sintetizados de novo a partir de uma sequência de polipeptídeos de toxina Cry. A sequência do gene de polinucleotídeo pode ser deduzida de uma sequência de polipeptídeo de toxina Cry através do uso do código genético. Programas de computador, como "BackTranslate" (GCG™ Package, Acclerys, Inc. San Diego, Califórnia), podem ser usados para converter uma sequência de peptídeos na sequência de nucleotídeo correspondente que codifica o peptídeo. Os exemplos de sequências de polipeptídeos de toxina Cry que podem ser usadas para obter sequências de codificação de nucleotídeos correspondentes incluem, porém sem limitação, os polipeptídeos de toxina Cry das SEQ ID NOS: 57 a 112, 214 a 246 e 275 a 278. Além disso, sequências de polinucleotídeos de toxina Cry sintéticos da revelação podem ser projetadas de modo a serem expressas em plantas.

[0076] Em algumas concretizações, a molécula de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo de toxina Cry é um polinucleotídeo que tem a sequência apresentada em qualquer uma dentre as SEQ ID NOS: 1 a 56, 181 a 213 e 271 a 274, e variantes, fragmentos e complementos das mesmas. "Complemento" é usado no presente documento para se referir a uma sequência de ácidos nucleicos que é suficientemente complementar a uma dada sequência de ácidos nucleicos para poder hibridizar com a dada sequência de ácidos nucleicos para desse modo formar um dúplex estável. "Variantes de sequência de polinucleotídeos" é usado no presente documento para se referir a uma sequência de ácidos nucleicos que, exceto pela degenerescência do código genético, codifica o mesmo polipeptídeo.

[0077] Em algumas concretizações, a molécula de ácido nucleico que codifica o polipeptídeo de toxina Cry é uma sequência de ácidos nucleicos não genômica. Conforme usado no presente documento, uma "sequência de ácidos nucleicos não genômica" ou "molécula de ácido nucleico não genômica" ou "polinucleotídeo não genômico" refere-se a uma molécula de ácido nucleico que tem uma ou mais alterações na sequência de ácidos nucleicos em comparação a uma sequência de ácidos nucleicos nativa ou genômica. Em algumas concretizações, a alteração para uma molécula de ácido nucleico nativa ou genômica inclui, porém sem limitação: alterações na sequência de ácidos nucleicos devido à degeneração do código genético; otimização da sequência de ácidos nucleicos para expressão em plantas; alterações na sequência de ácidos nucleicos para introduzir pelo menos uma substituição, inserção, deleção e/ou adição de aminoácido em comparação à sequência nativa ou genômica; remoção de um ou mais íntrons associados à sequência de ácidos nucleicos genômica; inserção de um ou mais íntrons heterólogos; deleção de uma ou mais regiões regulatórias a montante ou a jusante associadas à sequência de ácidos nucleicos genômica; inserção de uma ou mais regiões regulatórias a montante ou a jusante heterólogas; deleção da região não traduzida 5' e/ou 3' associada à sequência de ácidos nucleicos genômica; inserção de uma região não traduzida 5' e/ou 3' heteróloga; e modificação de um sítio de poliadenilação. Em algumas concretizações, a molécula de ácido nucleico não genômica é uma sequência de ácidos nucleicos sintética.

[0078] Em algumas concretizações, a molécula de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo de toxina Cry revelado no presente documento é um polinucleotídeo não genômico que tem uma sequência de nucleotídeos que tem pelo menos 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade de sequência com a sequência de ácidos nucleicos de qualquer uma das SEQ ID NOS: 1 a 56, 181 a 213 e 271 a 274, em que o polipeptídeo de toxina Cry tem atividade inseticida.

[0079] Em algumas concretizações, a molécula de ácido nucleico codifica uma variante do polipeptídeo de toxina Cry que compreende uma ou mais substituições de aminoácidos na sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOS: 57 a 112, 214 a 246 e 275 a 278.

[0080] Também são fornecidas moléculas de ácidos nucleicos que codificam produtos de transcrição e/ou tradução que são subsequentemente submetidos à splicing para produzir finalmente polipeptídeos de toxina Cry funcionais.

O splicing pode ser alcançado in vitro ou in vivo e pode envolver splicing cis ou trans.

O substrato para splicing podem ser polinucleotídeos (por exemplo, transcritos de RNA) ou polipeptídeos.

Um exemplo de splicing cis de um polinucleotídeo é quando um íntron inserido em uma sequência de codificação é removido e as duas regiões de éxons de flanqueamento são submetidas a splicing para gerar uma sequência de codificação de polipeptídeo de toxina Cry.

Um exemplo de splicing trans seria quando um polinucleotídeo é criptografado separando-se a sequência de codificação em dois ou mais fragmentos que podem ser separadamente transcritos e, então, submetidos à splicing para formar a sequência de codificação pesticida de comprimento completo.

O uso de uma sequência intensificadora de splicing, que pode ser introduzida em um construto, pode facilitar o splicing em splicing cis ou trans de polipeptídeos (Patentes Número US 6,365,377 e 6,531,316). Assim, em algumas concretizações, os polinucleotídeos não codificam diretamente um polipeptídeo de toxina Cry de comprimento completo, mas, em vez disso, codificam um fragmento ou fragmentos de um polipeptídeo de toxina Cry.

Esses polinucleotídeos podem ser usados para expressar um polipeptídeo de toxina Cry funcional através de um mecanismo que envolve splicing, em que o splicing pode ocorrer ao nível do polinucleotídeo (por exemplo, íntron/éxon) e/ou do polipeptídeo (por exemplo, inteína/exteína). Isso pode ser útil, por exemplo, no controle da expressão da atividade pesticida, visto que um polipeptídeo pesticida funcional será apenas expresso se todos os fragmentos exigidos forem expressos em um ambiente que permite processos de splicing para gerar o produto funcional. Em outro exemplo, a introdução de uma ou mais sequências de inserção em um polinucleotídeo pode facilitar a recombinação com um polinucleotídeo de homologia baixa; o uso de um íntron ou inteína para a sequência de inserção facilita a remoção da sequência interveniente, restaurando, assim, a função da variante codificada.

[0081] Moléculas de ácidos nucleicos que são fragmentos dessas sequências de ácidos nucleicos que codificam polipeptídeos de toxina Cry também são abrangidas pelas concretizações. "Fragmento de nucleotídeo", conforme usado no presente documento, refere-se a uma porção da sequência de ácidos nucleicos que codifica um polipeptídeo de toxina Cry. Um fragmento de nucleotídeo de uma sequência de ácidos nucleicos pode codificar uma porção biologicamente ativa de um polipeptídeo de toxina Cry, ou o mesmo pode ser um fragmento que pode ser usado como uma sonda de hibridização ou iniciador de PCR com o uso de métodos revelados abaixo. As moléculas de ácidos nucleicos que são fragmentos de uma sequência de ácidos nucleicos que codifica um polipeptídeo de toxina Cry compreendem pelo menos cerca de 150, 180, 210, 240, 270, 300, 330, 360, 400, 450 ou 500 nucleotídeos contíguos ou até o número de nucleotídeos presentes em uma sequência de ácidos nucleicos de comprimento completo que codifica um polipeptídeo de toxina Cry revelado no presente documento, dependendo do uso pretendido. "Nucleotídeos contíguos" é usado no presente documento para se referir a resíduos de nucleotídeo que são imediatamente adjacentes um ao outro. Os fragmentos das sequências de ácidos nucleicos das concretizações irão codificar fragmentos de proteína que retêm a atividade biológica do polipeptídeo de toxina Cry e, por isso, retêm a atividade inseticida. "Retém atividade inseticida" é usado no presente documento para se referir a um polipeptídeo que tem pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 70%, 80%, 90%, 95% ou mais da atividade inseticida de qualquer um dos polipeptídeos de toxina Cry de comprimento completo apresentados nas SEQ ID NOS: 57 a 112, 214 a 246 e 275 a 278. Em algumas concretizações, a atividade inseticida é contra uma espécie de Lepidópteros. Em uma concretização, a atividade inseticida é contra uma espécie de Coleópteros. Em algumas concretizações, a atividade inseticida é contra uma ou mais pragas de insetos do complexo da lagarta da raiz do milho: lagarta da raiz do milho, Diabrotica virgifera; lagarta da raiz do milho setentrional, D. barberi: verme da raiz do milho do sul ou broca-de-raiz; Diabrotica undecimpunctata howardi, Diabrotica speciosa e o verme de raiz do milho mexicano, D. virgifera zeae. Em uma concretização, a atividade inseticida é contra uma espécie de Diabrotica.

[0082] Em algumas concretizações, o polipeptídeo de toxina Cry é codificado por uma sequência de ácidos nucleicos suficientemente homóloga a qualquer uma das sequências de ácidos nucleicos das SEQ ID NOS: 1 a 56, 181 a 213 e 271 a

274.

[0083] "A porcentagem (%) de identidade de sequência" em relação a uma sequência de referência (sequência do banco de dados) é determinada como a porcentagem de resíduos de aminoácido ou nucleotídeos em uma sequência candidata (sequência inserida) que é idêntica aos respectivos resíduos de aminoácido ou nucleotídeos na sequência de referência, depois do alinhamento das sequências e da introdução de intervalos, se necessário, para se alcançar a porcentagem máxima de identidade de sequência, e não considerando quaisquer substituições conservativas de aminoácido como parte da identidade de sequência. O alinhamento com propósitos de determinação da porcentagem de identidade de sequência pode ser alcançado de vários modos que estão dentro da habilidade da técnica, por exemplo, com o uso de software de computador publicamente disponível, tal como BLAST, BLAST-2. Os indivíduos versados na técnica podem determinar parâmetros adequados para alinhar sequências, incluindo quaisquer algoritmos necessários para se alcançar o alinhamento máximo ao longo do comprimento das sequências sendo comparadas. A identidade percentual entre as duas sequências é uma função do número de posições idênticas compartilhadas pelas sequências (por exemplo, identidade percentual de sequência de busca = número de posições idênticas/número total de posições de sequência de busca ×100).

[0084] Em algumas concretizações, um polinucleotídeo de toxina Cry codifica um polipeptídeo de toxina Cry que compreende uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos cerca de 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%,

90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade de sequência ao longo do comprimento inteiro da sequência de aminoácidos de qualquer uma dentre as SEQ ID NOS: 57 a 112, 214 a 246 e 275 a 278.

[0085] Em algumas concretizações, são fornecidos polinucleotídeos que codificam polipeptídeos quiméricos que compreendem regiões de pelo menos dois polipeptídeos de toxina Cry diferentes da revelação.

[0086] Em algumas concretizações, são fornecidos polinucleotídeos que codificam polipeptídeos quiméricos que compreendem uma Região N-terminal de um primeiro polipeptídeo de toxina Cry da revelação fundida de maneira funcional a uma Região C-terminal de um segundo polipeptídeo de toxina Cry da revelação.

[0087] As concretizações também abrangem moléculas de ácidos nucleicos que codificam variantes do polipeptídeo de toxina Cry. "Variantes" das sequências de ácidos nucleicos que codificam o polipeptídeo de toxina Cry incluem aquelas sequências que codificam os polipeptídeos de toxina Cry revelados no presente documento, mas que diferem conservativamente devido à degenerescência do código genético assim como aquelas que são suficientemente idênticas conforme discutido acima. As variantes alélicas de ocorrência natural podem ser identificadas com o uso de técnicas de biologia molecular bem conhecidas, tais como reação em cadeia da polimerase (PCR) e técnicas de hibridização conforme descrito abaixo. As sequências de ácidos nucleicos variantes também incluem sequências de ácidos nucleicos sinteticamente derivadas que foram geradas,

por exemplo, com o uso de mutagênese sítio-dirigida, mas que ainda codificam os polipeptídeos de toxina Cry revelados conforme discutido abaixo.

[0088] A presente revelação fornece polinucleotídeos isolados ou recombinantes que codificam qualquer um dos polipeptídeos de toxina Cry revelados no presente documento. Aqueles que têm habilidade comum na técnica prontamente perceberão que, devido à degenerescência do código genético, existe uma multiplicidade de sequências de nucleotídeos que codificam os polipeptídeos de toxina Cry da presente revelação.

[0089] O versado na técnica compreenderá ainda que podem ser introduzidas alterações por mutação das sequências de ácidos nucleicos, levando, assim, a alterações na sequência de aminoácidos dos polipeptídeos de toxina Cry codificados, sem alterar a atividade biológica das proteínas. Portanto, as moléculas de ácidos nucleicos variantes podem ser criadas introduzindo uma ou mais substituições, adições e/ou deleções de nucleotídeos nas sequências de ácidos nucleicos correspondentes reveladas no presente documento, de modo que uma ou mais substituições, adições ou deleções de aminoácidos sejam introduzidas na proteína codificada. As mutações podem ser introduzidas por técnicas padrão, como mutagênese sítio-dirigida e mutagênese mediada por PCR. Tais sequências de ácidos nucleicos variantes são também abrangidas pela presente revelação.

[0090] Alternativamente, as sequências de ácidos nucleicos variantes podem ser preparadas introduzindo-se mutações aleatoriamente ao longo de toda ou parte da sequência de codificação, como por mutagênese por saturação, e os mutantes resultantes podem ser triados quanto à capacidade para conferir atividade pesticida para identificar mutantes que retêm a atividade. Após a mutagênese, a proteína codificada pode ser expressa de modo recombinante e a atividade da proteína pode ser determinada com o uso de técnicas de ensaio padrão.

[0091] Os polinucleotídeos da revelação e fragmentos dos mesmos são opcionalmente usados como substratos para uma variedade de reações de recombinação e recombinação recursiva, além de métodos de clonagem padrão, conforme estabelecido em, por exemplo, Ausubel, Berger e Sambrook, isto é, para produzir homólogos de polipeptídeo pesticida adicionais e fragmentos dos mesmos com propriedades desejadas. Uma variedade de tais reações é conhecida. Métodos para produzir uma variante de qualquer ácido nucleico listado no presente documento que compreendem recombinar recursivamente tal polinucleotídeo com um segundo polinucleotídeo (ou mais), formando, assim, uma biblioteca de polinucleotídeos variantes, são também concretizações da revelação, assim como as bibliotecas produzidas, as células que compreendem as bibliotecas e qualquer polinucleotídeo recombinante produzido por tais métodos. Adicionalmente, tais métodos compreendem opcionalmente selecionar um polinucleotídeo variante de tais bibliotecas com base na atividade pesticida, em que tal combinação recursiva é feita in vitro ou in vivo.

[0092] Uma variedade de protocolos geradores de diversidade, incluindo protocolos de recombinação recursiva de ácido nucleico, está disponível e completamente descrita na técnica. Os procedimentos podem ser usados separadamente, e/ou em combinação para produzir uma ou mais variantes de um ácido nucleico ou conjunto de ácidos nucleicos, assim como variantes de proteínas codificadas. Individual e coletivamente, esses procedimentos fornecem maneiras amplamente aplicáveis e robustas para gerar ácidos nucleicos diversificados e conjuntos de ácidos nucleicos (incluindo, por exemplo, bibliotecas de ácidos nucleicos) úteis, por exemplo, para a modificação ou evolução rápida de ácidos nucleicos, proteínas, trajetórias, células e/ou organismos com características novas e/ou melhoradas.

[0093] Embora distinções e classificações sejam feitas no decorrer da discussão por motivos de clareza, será notado que as técnicas normalmente não são mutuamente exclusivas. De fato, os vários métodos podem ser usados isoladamente ou em combinação, em paralelo ou em série, para acessar diversas variantes de sequência.

[0094] O resultado de qualquer um dos procedimentos de geração de diversidade descritos no presente documento pode ser a geração de um ou mais ácidos nucleicos, os quais podem ser selecionados ou triados quanto a ácidos nucleicos com ou que conferem propriedades desejáveis ou que codificam proteínas com ou que conferem propriedades desejáveis. Após a diversificação por um ou mais dos métodos no presente documento ou disponíveis de outro modo para uma pessoa versada na técnica, quaisquer ácidos nucleicos que sejam produzidos podem ser selecionados quanto a uma atividade ou propriedade desejada, por exemplo, atividade pesticida ou tal atividade a um pH desejado, etc. Isso pode incluir identificar qualquer atividade que possa ser detectada, por exemplo, em um formato automatizado ou automatizável, por qualquer um dentre os ensaios da técnica, consultar, por exemplo, a discussão de triagem de atividade inseticida, infra. Uma variedade de propriedades relacionadas (ou até mesmo não relacionadas) pode ser avaliada, em série ou em paralelo, ao critério do praticante.

[0095] As descrições de uma variedade de procedimentos de geração de diversidade para gerar sequências de ácidos nucleicos modificados, por exemplo, aquelas que codificam polipeptídeos que têm atividade pesticida ou fragmentos dos mesmos, são encontradas nas publicações a seguir e nas referências citadas nas mesmas: Soong, et al., (2000) Nat Genet 25(4):436 a 439; Stemmer, et al., (1999) Tumor Targeting 4:1 a 4; Ness, et al., (1999) Nat Biotechnol 17:893 a 896; Chang, et al., (1999) Nat Biotechnol 17:793 a 797; Minshull e Stemmer, (1999) Curr Opin Chem Biol 3:284 a 290; Christians, et al., (1999) Nat Biotechnol 17:259 a 264; Crameri, et al., (1998) Nature 391:288 a 291; Crameri, et al., (1997) Nat Biotechnol 15:436 a 438; Zhang, et al., (1997) PNAS USA 94:4.504 a 4.509; Patten, et al., (1997) Curr Opin Biotechnol 8:724 a 733; Crameri, et al., (1996) Nat Med 2:100 a 103; Crameri, et al., (1996) Nat Biotechnol 14:315 a 319; Gates, et al., (1996) J Mol Biol 255:373 a 386; Stemmer, (1996) "Sexual PCR and Assembly PCR" em: The Encyclopedia of Molecular Biology. VCH Publishers, Nova Iorque. páginas 447 a 457; Crameri e Stemmer, (1995) BioTechniques 18:194 a 195; Stemmer, et al.,

(1995) Gene, 164:49 a 53; Stemmer, (1995) Science 270: 1510; Stemmer, (1995) Bio/Technology 13:549 a 553; Stemmer, (1994) Nature 370:389 a 391 e Stemmer, (1994) PNAS USA 91:10.747 a

10.751.

[0096] Métodos de mutação para gerar diversidade incluem, por exemplo, mutagênese sítio-dirigida (Ling, et al., (1997) Anal Biochem 254(2):157 a 178; Dale, et al., (1996) Methods Mol Biol 57:369 a 374; Smith, (1985) Ann Rev Genet 19:423 a 462; Botstein e Shortle, (1985) Science 229:1.193 a 1.201; Carter, (1986) Biochem J 237:1 a 7 e Kunkel, (1987) "The efficiency of oligonucleotide directed mutagenesis" em "Nucleic Acids & Molecular Biology" (Eckstein e Lilley, editores, Springer Verlag, Berlim)); mutagênese com o uso de modelos que contêm uracila (Kunkel, (1985) PNAS USA 82:488 a 492; Kunkel, et al., (1987) Methods Enzymol 154:367 a 382 e Bass, et al., (1988) Science 242:240 a 245); mutagênese direcionada a oligonucleotídeos (Zoller e Smith, (1983) Methods Enzymol 100:468 a 500; Zoller e Smith, (1987) Methods Enzymol 154:329 a 350 (1987); Zoller e Smith, (1982) Nucleic Acids Res 10:6.487 a 6.500), mutagênese de DNA modificado por fosforotiato (Taylor, et al., (1985) Nucl Acids Res 13:8.749 a 8.764; Taylor, et al., (1985) Nucl Acids Res 13:8.765 a 8.787 (1985); Nakamaye e Eckstein, (1986) Nucl Acids Res 14:9.679 a 9.698; Sayers, et al., (1988) Nucl Acids Res 16:791 a 802 e Sayers, et al., (1988) Nucl Acids Res 16:803 a 814); mutagênese com o uso de DNA de dúplex incompleto (Kramer, et al., (1984) Nucl Acids Res 12:9.441 a 9.456; Kramer e Fritz, (1987) Methods Enzymol

154:350 a 367; Kramer, et al., (1988) Nucl Acids Res 16:7.207 e Fritz, et al., (1988) Nucl Acids Res 16:6.987 a 6.999).

[0097] Os métodos adequados adicionais incluem reparo de ponto de emparelhamento errôneo (Kramer, et al., (1984) Cell 38:879 a 887), mutagênese com o uso de cepas hospedeiras deficientes para reparo (Carter, et al., (1985) Nucl Acids Res 13:4.431 a 4.443 e Carter, (1987) Methods in Enzymol 154:382 a 403), mutagênese por deleção (Eghtedarzadeh e Henikoff, (1986) Nucl Acids Res 14:5.115), seleção de restrição e purificação de restrição (Wells, et al., (1986) Phil Trans R Soc Lond A 317:415 a 423), mutagênese por síntese de gene total (Nambiar, et al., (1984) Science 223:1.299 a 1.301; Sakamar e Khorana, (1988) Nucl Acids Res 14:6.361 a 6.372; Wells, et al., (1985) Gene 34:315 a 323 e Grundström, et al., (1985) Nucl Acids Res 13:3.305 a 3.316), reparo de quebra de fita dupla (Mandecki, (1986) PNAS USA, 83:7.177 a 7.181 e Arnold, (1993) Curr Opin Biotech 4:450 a 455). Detalhes adicionais de muitos dentre os métodos acima podem ser encontrados em Methods Enzymol Volume 154, que também descreve os controles úteis para a resolução de problemas com vários métodos de mutagênese.

[0098] As sequências de nucleotídeos das concretizações podem também ser usadas para isolar as sequências correspondentes de uma fonte bacteriana, incluindo, porém sem limitação, uma espécie Pseudomonas. Dessa maneira, métodos, tais como PCR, hibridização e semelhantes, podem ser usados para identificar tais sequências com base em sua homologia de sequência com as sequências apresentadas no presente documento. As sequências que são selecionadas com base em sua identidade de sequência com as sequências inteiras estabelecidas no presente documento ou com os fragmentos das mesmas são abrangidas pelas concretizações. Tais sequências incluem sequências que são ortólogos das sequências reveladas. O termo "ortólogos" refere-se a genes derivados de um gene ancestral comum e que são encontrados em diferentes espécies como resultado da especiação. Os genes encontrados em espécies diferentes são considerados ortólogos quando suas sequências de nucleotídeo e/ou suas sequências de proteínas codificadas compartilham identidade substancial, conforme definido em outra parte no presente documento. As funções de ortólogos são, com frequência, altamente conservadas entre espécies.

[0099] Em uma abordagem de PCR, os iniciadores oligonucleotídicos podem ser projetados para uso em reações de PCR para amplificar sequências de DNA correspondentes a partir de cDNA ou de DNA genômico extraído de qualquer organismo de interesse. Métodos para projetar iniciadores de PCR e clonagem de PCR são geralmente conhecidos na técnica e são revelados em Sambrook, et al., (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2ª edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, Nova Iorque), mais adiante no presente documento, "Sambrook". Consultar também Innis et al., eds. (1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Academic Press, Nova Iorque); Innis e Gelfand, editores (1995) PCR Strategies (Academic Press, Nova Iorque); e Innis e Gelfand, editores (1999) PCR Methods Manual (Academic Press, Nova Iorque). Os métodos conhecidos de PCR incluem, porém sem limitação, métodos que usam iniciadores emparelhados, iniciadores encaixados, iniciadores específicos únicos, iniciadores degenerados, iniciadores específicos para genes, iniciadores específicos para vetores, iniciadores com emparelhamento parcialmente errôneo e semelhantes.

[0100] Para identificar polipeptídeos de toxina Cry potenciais de coleções bacterianas, os lisados de célula bacteriana podem ser triados com anticorpos gerados contra polipeptídeos de toxina Cry com o uso de métodos Western blotting e/ou ELISA. Esse tipo de ensaio pode ser realizado em um modo de alto rendimento. As amostras positivas podem ser adicionalmente analisadas por várias técnicas, como purificação e identificação de proteína com base em anticorpos. Os métodos para gerar anticorpos são bem conhecidos na técnica, conforme discutido abaixo.

[0101] Alternativamente, o método de identificação de proteína baseado em espectrometria de massa pode ser usado para identificar homólogos de polipeptídeos de toxina Cry com o uso de protocolos da literatura (Scott Patterson, (1998), 10.22, 1 a 24, Current Protocol in Molecular Biology publicado por John Wiley & Son Inc). Especificamente, o método de identificação de proteína baseado em LC-MS/MS é usado para associar os dados de MS de determinado lisato celular ou amostras enriquecidas de peso molecular desejadas (retiradas de gel SDS-PAGE de faixas de peso molecular relevantes para polipeptídeos de toxina Cry) com informações de sequência de um polipeptídeo de toxina Cry revelado no presente documento. Qualquer correspondência em sequências de peptídeos indica o potencial para ter as proteínas homólogas nas amostras. As técnicas adicionais (purificação de proteína e biologia molecular) podem ser usadas para isolar a proteína e identificar as sequências dos homólogos.

[0102] Em métodos de hibridização, toda ou parte da sequência de ácidos nucleicos pesticida pode ser usada para triar cDNA ou bibliotecas genômicas. Métodos para construção de tais bibliotecas de cDNA e genômicas são geralmente conhecidos na técnica e são revelados em Sambrook e Russell, (2001), supra. As chamadas sondas de hibridização podem ser fragmentos de DNA genômico, fragmentos de cDNA, fragmentos de RNA ou outros oligonucleotídeos e podem ser identificadas com um grupo detectável, como 32P ou qualquer outro marcador detectável, como outros radioisótopos, um composto fluorescente, uma enzima ou um cofator enzimático. As sondas para hibridização podem ser produzidas marcando-se oligonucleotídeos sintéticos com base nas sequências de ácidos nucleicos que codificam o polipeptídeo de toxina Cry conhecidas reveladas no presente documento. Iniciadores degenerados projetados com base em nucleotídeos ou resíduos de aminoácidos conservados na sequência de ácidos nucleicos ou sequência de aminoácidos codificada podem adicionalmente ser usados. A sonda compreende tipicamente uma região de sequência de ácidos nucleicos que se hibridiza sob condições estringentes a pelo menos cerca de 12, pelo menos cerca de 25, pelo menos cerca de 50, 75, 100, 125, 150, 175 ou 200 nucleotídeos consecutivos de sequências de ácidos nucleicos que codificam polipeptídeos de toxina Cry da revelação ou um fragmento ou variante dos mesmos. Os métodos para a preparação de sondas para condições de estringência e hibridização são geralmente conhecidos na técnica e são revelados em Sambrook e Russell, (2001), supra, incorporado no presente documento a título de referência. Anticorpos

[0103] Anticorpos para um polipeptídeo de toxina Cry das concretizações ou para variantes ou fragmentos do mesmo são também abrangidos. Os anticorpos da revelação incluem anticorpos policlonais e monoclonais assim como fragmentos dos mesmos que retêm sua habilidade para se ligar a um polipeptídeo de toxina Cry. É dito que um anticorpo, anticorpo monoclonal ou fragmento do mesmo tem capacidade para se ligar a uma molécula se tiver capacidade para reagir especificamente com a molécula para ligar, assim, a molécula ao anticorpo, anticorpo monoclonal ou fragmento do mesmo. O termo "anticorpo" (Ab) ou "anticorpo monoclonal" (Mab) é destinado a incluir as moléculas intatas, assim como fragmentos ou regiões ligantes ou domínios das mesmas (como, por exemplo, fragmentos Fab e F(ab).sub.2) que têm capacidade para se ligar a hapteno. Tais fragmentos são tipicamente produzidos por clivagem proteolítica, como papaína ou pepsina. Alternativamente, os fragmentos de ligação de hapteno podem ser produzidos através da aplicação de tecnologia de DNA recombinante ou através de química sintética. Os métodos para a preparação dos anticorpos da presente revelação são geralmente conhecidos na técnica. Por exemplo, consultar, Antibodies, A Laboratory Manual, Ed Harlow e David Lane (editores) Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (1988), assim como as referências citadas no mesmo. Os trabalhos de referência padrão que estabelecem os princípios gerais de imunologia incluem: Klein, J. Immunology: "The Science of Cell-Noncell Discrimination", John Wiley & Sons, N.I. (1982); Dennett, et al., Monoclonal Antibodies, Hybridoma: A New Dimension in Biological Analyses, Plenum Press, N.Y. (1980) e Campbell, "Monoclonal Antibody Technology", em Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Volume 13, Burdon, et al., (editores), Elsevier, Amsterdã (1984). Consultar também as Patentes Número US 4,196,265; 4,609,893; 4,713,325; 4,714,681; 4,716,111; 4,716,117 e 4,720,459. Os anticorpos contra polipeptídeos de toxina Cry ou porções de ligação a antígeno dos mesmos podem ser produzidos por uma variedade de técnicas, incluindo metodologia de anticorpo monoclonal convencional, por exemplo, a técnica de hibridização de célula somática padrão de Kohler e Milstein, (1975) Nature 256:495. Outras técnicas para produzir anticorpo monoclonal também podem ser empregadas, como transformação viral ou oncogênica de linfócitos B. Um sistema animal para preparar hibridomas é um sistema murino. Protocolos de imunização e técnicas para isolamento de esplenócitos imunizados para fusão são conhecidos na técnica. Os parceiros de fusão (por exemplo, células de mieloma murino) e procedimentos de fusão também são conhecidos. O anticorpo e anticorpos monoclonais da revelação podem ser preparados utilizando-se um polipeptídeo de toxina Cry como antígenos.

[0104] Um kit para detectar a presença de um polipeptídeo de toxina Cry ou detectar a presença de uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo de toxina Cry em uma amostra é fornecido. Em uma concretização,

o kit fornece reagentes com base em anticorpo para detectar a presença de um polipeptídeo de toxina Cry em uma amostra de tecido. Em outra concretização, o kit fornece sondas de ácidos nucleicos marcadas úteis para detectar a presença de um ou mais polinucleotídeos que codificam o polipeptídeo de toxina Cry. O kit é fornecido juntamente com reagentes e controles apropriados para executar um método de detecção, assim como instruções para uso do kit. Identificação e isolamento de receptor

[0105] Receptores para os polipeptídeos de toxina Cry das concretizações ou para variantes ou fragmentos dos mesmos são também abrangidos. Os métodos para identificar receptores são conhecidos na técnica (consultar Hofmann, et. al., (1988) Eur. J. Biochem. 173:85 a 91; Gill, et al., (1995) J. Biol. Chem. 27.277 a 27.282) e podem ser empregados para identificar e isolar o receptor que reconhece o polipeptídeo de toxina Cry com o uso das vesículas de membrana de borda em escova de insetos suscetíveis. Além do método de identificação radioativa listado nas literaturas citadas, o polipeptídeo de toxina Cry pode ser identificado com corante fluorescente e outras identificações comuns, como estreptavidina. Vesículas de membrana de borda em escova (BBMV) de insetos suscetíveis, tais como lagarta falsa- medideira e percevejos, podem ser preparadas de acordo com os protocolos listados nas referências de Hofmann e Gill acima e separadas em gel de SDS-PAGE e transferidas para membrana adequada. O polipeptídeo de toxina Cry identificado pode ser incubado com a membrana engarrafada de BBMV, e o polipeptídeo de toxina Cry identificado pode ser identificado com os repórteres identificados. A identificação de banda (ou bandas) de proteína que interage com o polipeptídeo de toxina Cry pode ser detectada por meio de sequenciamento de fase gasosa de aminoácido N-terminal ou método de identificação de proteína baseado em espectrometria de massa (Patterson, (1998) 10.22, 1 a 24, Current Protocol in Molecular Biology publicado por John Wiley & Son Inc). Assim que a proteína é identificada, o gene correspondente pode ser clonado da biblioteca de DNA genômico ou cDNA dos insetos suscetíveis, e a afinidade de ligação pode ser medida diretamente com o polipeptídeo de toxina Cry. A função de receptor para atividade inseticida pelo polipeptídeo de toxina Cry pode ser verificada pelo tipo de RNAi do método de knockout de gene (Rajagopal, et al., (2002) J. Biol. Chem. 277:46.849 a 46.851). Construtos de Nucleotídeos, Cassetes de Expressão e Vetores

[0106] O uso do termo "construtos de nucleotídeo" no presente documento não é destinado a limitar as concretizações aos construtos de nucleotídeo que compreendem DNA. Aqueles de habilidade comum na técnica reconhecerão que construtos de nucleotídeos, particularmente polinucleotídeos e oligonucleotídeos compostos por ribonucleotídeos e combinações de ribonucleotídeos e desoxirribonucleotídeos podem também ser empregados nos métodos revelados no presente documento. Os construtos de nucleotídeos, ácidos nucleicos e sequências de nucleotídeos das concretizações abrangem adicionalmente todas as formas complementares de tais construtos, moléculas e sequências. Adicionalmente, os construtos de nucleotídeos, moléculas de nucleotídeos e sequências de nucleotídeos das concretizações abrangem todos os construtos, moléculas e sequências de nucleotídeos que podem ser empregados nos métodos das concretizações para transformação de plantas incluindo, porém sem limitação, aqueles compreendidos de desoxirribonucleotídeos, ribonucleotídeos e combinações dos mesmos. Tais desoxirribonucleotídeos e ribonucleotídeos incluem tanto moléculas de ocorrência natural como análogos sintéticos. Os construtos de nucleotídeos, ácidos nucleicos e sequências de nucleotídeos das concretizações também abrangem todas as formas de construtos de nucleotídeos incluindo, porém sem limitação, formas de fita única, formas de fita dupla, grampos, estruturas de haste e alça e semelhantes.

[0107] Uma concretização adicional refere-se a um organismo transformado, como um organismo selecionado dentre células de planta e inseto, bactérias, levedura, baculovírus, protozoários, nematódeos e algas. O organismo transformado compreende uma molécula de DNA das concretizações, um cassete de expressão que compreende a molécula de DNA ou um vetor que compreende o cassete de expressão, que pode ser incorporado de modo estável ao genoma do organismo transformado.

[0108] As sequências das concretizações são fornecidas em construtos de DNA para expressão no organismo de interesse. O construto incluirá sequências regulatórias 5' e 3' ligadas de maneira funcional a uma sequência das concretizações. O termo “ligado de maneira funcional”, conforme usado no presente documento, refere-se a uma ligação funcional entre um promotor e uma segunda sequência, em que a sequência promotora inicia e medeia a transcrição da sequência de DNA correspondente à segunda sequência. De modo geral, ligado de maneira funcional significa que as sequências de ácidos nucleicos que estão ligadas são contíguas e, quando necessário, para unir duas regiões de codificação de proteína no mesmo quadro de leitura. O construto pode conter adicionalmente pelo menos um gene adicional a ser cotransformado no organismo. Alternativamente, o gene (ou genes) adicional pode ser fornecido em múltiplos construtos de DNA.

[0109] Tal construto de DNA é dotado de uma pluralidade de sítios de restrição para a inserção da sequência de gene de polipeptídeo de toxina Cry da revelação estar sob a regulação transcricional das regiões regulatórias. O construto de DNA pode conter adicionalmente genes marcadores selecionáveis.

[0110] O construto de DNA incluirá geralmente, na direção de transcrição de 5' para 3': uma região de iniciação de transcrição e tradução (isto é, um promotor), uma sequência de DNA concretizações e uma região de terminação de transcrição e de tradução (isto é, região de terminação) funcionais no organismo que serve como um hospedeiro. A região de iniciação de transcrição (isto é, o promotor) pode ser nativa, análoga, estranha ou heteróloga ao organismo hospedeiro e/ou à sequência das concretizações. Adicionalmente, o promotor pode ser a sequência natural ou, alternativamente, uma sequência sintética. O termo "estranho", conforme usado no presente documento, indica que o promotor não é encontrado no organismo nativo no qual o promotor é introduzido. Quando o promotor ou qualquer outra sequência de aminoácidos ou nucleotídeos é "estranha" ou "heteróloga" à sequência das concretizações, entende-se que a sequência de aminoácidos ou nucleotídeos não é a sequência de nucleotídeos ou promotora nativa ou de ocorrência natural para a sequência funcional ligada de maneira funcional das concretizações. Conforme usado no presente documento, um gene quimérico compreende uma sequência de codificação ligada de maneira funcional a uma região de iniciação de transcrição que é heteróloga à sequência de codificação. Quando o promotor é uma sequência nativa ou natural, a expressão da sequência ligada de maneira funcional é alterada a partir da expressão de tipo selvagem, o que resulta em uma alteração do fenótipo.

[0111] Em algumas concretizações, o construto de DNA compreende um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo de toxina Cry das concretizações. Em algumas concretizações, o construto de DNA compreende um polinucleotídeo que codifica uma proteína de fusão que compreende um polipeptídeo de toxina Cry das concretizações.

[0112] Em algumas concretizações, o construto de DNA também pode incluir uma sequência intensificadora da transcrição. Conforme usado no presente documento, o termo um "intensificador" refere-se a uma sequência de DNA que pode estimular a atividade promotora e pode ser um elemento inato do promotor ou um elemento heterólogo inserido para intensificar o nível ou a especificidade para tecidos de um promotor. Vários intensificadores são conhecidos na técnica incluindo, por exemplo, íntrons com propriedades de intensificação de expressão de gene em plantas (Publicação de Pedido de Patente Número US 2009/0144863, o íntron de ubiquitina (isto é, o íntron de ubiquitina de milho 1 (consultar, por exemplo, a sequência de NCBI S94464)), o intensificador ômega ou o intensificador de iniciador ômega (Gallie, et al., (1989) "Molecular Biology of RNA" editora Cech (Liss, Nova Iorque) 237 a 256 e Gallie, et al., (1987) Gene 60:217 a 225), o intensificador de CaMV 35S (consultar, por exemplo, Benfey, et al., (1990) EMBO J. 9:1.685 a 1.696), e os intensificadores da Patente número US 7,803,992 também podem ser usados. A lista acima de intensificadores de transcrição não é destinada a ser limitante. Qualquer intensificador de transcrição apropriado pode ser usado nas concretizações.

[0113] A região de terminação pode ser nativa com a região de iniciação da transcrição, pode ser nativa com a sequência de DNA de interesse ligada de maneira funcional, pode ser nativa com o hospedeiro vegetal ou pode ser derivada de outra fonte (isto é, estranha ou heteróloga ao promotor, a sequência de interesse, hospedeiro vegetal ou qualquer combinação dos mesmos).

[0114] As regiões de terminação convenientes estão disponíveis a partir do plasmídeo de Ti de A. tumefaciens, como as regiões de terminação de octopina sintase e nopalina sintase. Consultar também Guerineau, et al., (1991) Mol. Gen. Genet. 262:141 a 144; Proudfoot, (1991) Cell 64:671 a 674; Sanfacon, et al., (1991) Genes Dev. 5:141 a 149; Mogen, et al., (1990) Plant Cell 2:1.261 a 1.272; Munroe, et al.,

(1990) Gene 91:151 a 158; Ballas, et al., (1989) Nucleic Acids Res. 17:7.891 a 7.903 e Joshi, et al., (1987) Nucleic Acid Res. 15:9.627 a 9.639.

[0115] Quando adequado, um ácido nucleico pode ser otimizado para expressão aumentada no organismo hospedeiro. Portanto, quando o organismo hospedeiro for uma planta, os ácidos nucleicos sintéticos podem ser sintetizados com o uso de códons preferenciais para plantas para uma expressão melhorada. Consultar, por exemplo, Campbell e Gowri, (1990) Plant Physiol. 92:1 a 11 para uma discussão sobre o uso preferencial para hospedeiro. Por exemplo, embora as sequências de ácidos nucleicos das concretizações possam ser expressas tanto em espécies vegetais monocotiledôneas quanto dicotiledôneas, as sequências podem ser modificadas para tomar em consideração as preferências específicas e preferências do teor de GC de monocotiledôneas ou dicotiledôneas, visto que foi mostrado que essas preferências se diferem (Murray et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:477 a 498). Assim, o milho preferencial para um aminoácido particular pode ser derivado de sequências de genes conhecidas. O uso de milho para 28 genes de plantas de milho é listado na Tabela 4 de Murray, et al., supra. Métodos estão disponíveis na técnica para sintetizar genes preferenciais para plantas. Consultar, por exemplo, Murray, et al., (1989) Nucleic Acids Res. 17:477 a 498, e Liu H et al. Mol Bio Rep 37:677 a 684, 2010, incorporados ao presente documento a título de referência. Uma tabela de uso de Zea maize pode também ser encontrada em kazusa.ou.jp//cgi- bin/show.cgi?species=4577, que pode ser acessado com o uso do prefixo www. Uma tabela de uso de Glycine max pode ser encontrada em kazusa.ou.jp//cgi- bin/show.cgi?species=3847&aa=1&style=N, que pode ser acessado com o uso do prefixo www.

[0116] Em algumas concretizações, a molécula de ácido nucleico recombinante que codifica um polipeptídeo de toxina Cry tem códons otimizados de milho.

[0117] As concretizações de sequência adicionais são conhecidas por acentuarem a expressão de genes em um hospedeiro celular. As mesmas incluem a eliminação de sequências que codificam sinais de poliadenilação espúria, sinais de sítio de splicing de éxon-íntron, repetições semelhantes a transposons e outras sequências bem caracterizadas que podem ser prejudiciais para a expressão de gene. O teor de GC da sequência pode ser ajustado para níveis médios para um determinado hospedeiro celular, conforme calculado em referência a genes conhecidos expressos na célula hospedeira. O termo "célula hospedeira", conforme usado no presente documento, refere-se a uma célula que contém um vetor e suporta a replicação e/ou expressão do vetor de expressão pretendida. As células hospedeiras podem ser células procarióticas, como E. coli, ou células eucarióticas, como células de levedura, inseto, anfíbio ou mamífero ou células de plantas monocotiledôneas ou dicotiledôneas. Um exemplo de uma célula hospedeira monocotiledônea é uma célula hospedeira de milho. Quando possível, a sequência é modificada para evitar estruturas de mRNA secundárias em forma de grampo previstas.

[0118] Os cassetes de expressão podem conter adicionalmente sequências líderes 5'. Tais sequências-líder podem atuar para aprimorar a tradução. Líderes de tradução são conhecidos na técnica e incluem: líderes de picornavírus, por exemplo, líder de EMCV (região de não codificação 5' de Encefalomiocardite) (Elroy-Stein, et al., (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:6.126 a 6.130); líderes de potivírus, por exemplo, líder de TEV (Vírus "Etch" do Tabaco) (Gallie, et al., (1995) Gene 165(2):233 a 238), líder de MDMV (Vírus do Mosaico do Nanismo de Maís), proteína de ligação de cadeia pesada de imunoglobulina humana (BiP) (Macejak, et al., (1991) Nature 353:90 a 94); líder não traduzido do mRNA da proteína de revestimento do vírus do mosaico da alfafa (AMV RNA 4) (Jobling, et al., (1987) Nature 325:622 a 625); líder do vírus do mosaico do tabaco (TMV) (Gallie, et al., (1989) em Molecular Biology of RNA, editor Cech (Liss, Nova Iorque), páginas 237 a 256) e líder do vírus de mancha clorótica do maís (MCMV) (Lommel, et al., (1991) Virology 81:382 a 385). Consultar também Della-Cioppa, et al., (1987) Plant Physiol. 84:965 a 968. Tais construtos também podem conter uma "sequência de sinal" ou "sequência líder" para facilitar o transporte de cotradução ou pós-tradução do peptídeo para determinadas estruturas intracelulares, como o cloroplasto (ou outro plastídeo), retículo endoplasmático ou aparelho de Golgi.

[0119] “Sequência de sinal", conforme usado no presente documento, refere-se a uma sequência que é conhecida ou que há suspeitas de resultar em transporte de peptídeo de cotradução ou pós-tradução através da membrana de célula. Em eucariotas, isso envolve tipicamente a secreção no aparelho de Golgi com alguma glicosilação resultante.

As toxinas inseticidas de bactérias são frequentemente sintetizadas como protoxinas, que são ativadas de modo proteolítico no intestino da praga-alvo (Chang, (1987) Methods Enzymol. 153:507 a 516). Em algumas concretizações, a sequência de sinal está localizada na sequência nativa ou pode ser derivada de uma sequência das concretizações. "Sequência- líder", conforme usado no presente documento, refere-se a qualquer sequência que, quando traduzida, resulta em uma sequência de aminoácidos suficiente para acionar o transporte de cotradução da cadeia peptídica para uma organela subcelular.

Desse modo, isso inclui sequências- líder que alvejam o transporte e/ou glicosilação pela passagem para o retículo endoplasmático, passagem para vacúolos, plastídeos incluindo cloroplastos, mitocôndrias e semelhantes.

As proteínas codificadas nucleares alvejadas ao compartimento de lúmen de tilacoide de cloroplasto têm um peptídeo de transição bipartido característico, composto por um peptídeo sinal de alvejamento estromal e um peptídeo sinal de alvejamento de lúmen.

As informações de alvejamento estromal estão na porção amino-proximal do peptídeo de trânsito.

O peptídeo sinal de alvejamento para o lúmen está na porção carboxil-proximal do peptídeo de trânsito e contém todas as informações para alvejamento para o lúmen.

Um pesquisa recente em proteômica do cloroplasto de plantas superiores alcançou a identificação de inúmeras proteínas do lúmen codificadas de modo nuclear (Kieselbach et al.

FEBS LETT 480:271 a 276, 2000; Peltier et al.

Plant Cell 12:319 a 341, 2000; Bricker et al. Biochim. Biophys Acta 1503:350 a 356, 2001), cujo peptídeo sinal de alvejamento para o lúmen pode ser potencialmente usado de acordo com a presente revelação. Cerca de 80 proteínas de Arabidopsis, assim como proteínas homólogas de espinafre e ervilha, são relatadas por Kieselbach et al., Photosynthesis Research, 78:249 a 264, 2003. Em particular, a Tabela 2 desta publicação, que está incorporada à descrição do presente documento a título de referência, revela 85 proteínas do lúmen do cloroplasto, identificadas por seu número de acesso (também consultar a Publicação de Pedido de Patente no US 2009/09044298).

[0120] Os peptídeos de transição de cloroplasto (CTP) adequados são bem conhecidos por um indivíduo versado na técnica e também incluem CTs quiméricos que compreendem, porém sem limitação, um domínio N-terminal, um domínio central ou um domínio C-terminal de um CTP de Oryza sativa 1-desoxi-D xilose-5-fosfato sintase, Superóxido dismutase de Oryza sativa, amido sintase solúvel em Oryza sativa, enzima de ácido málico dependente de NADP-Oryza sativa, Oryza sativa-Fosfo-2-deidro-3-deoxiheptonato aldolase 2, Oryza sativa-L-Ascorbato peroxidase 5, Oryza sativa-fosfoglucano água diquinase, Zea Mays ssRUBISCO, Zea Mays-beta- glucosidase, Zea Mays-malato desidrogenase, triorredoxina tipo M Zea Mays (consultar a Publicação de Pedido de Patente no US 2012/0304336).

[0121] O gene de polipeptídeo de toxina Cry a ser alvejado ao cloroplasto pode ser otimizado para expressão no cloroplasto para responder por diferenças no uso entre o núcleo vegetal e esta organela. Dessa maneira, os ácidos nucleicos de interesse podem ser sintetizados com o uso de sequências preferenciais para cloroplasto.

[0122] No preparo do cassete de expressão, os vários fragmentos de DNA podem ser manipulados de modo a fornecer as sequências de DNA na orientação apropriada e, conforme apropriado, no quadro de leitura apropriado. Com essa finalidade, adaptadores ou ligantes podem ser empregados para unir os fragmentos de DNA, ou outras manipulações podem estar envolvidas para fornecer sítios de restrição convenientes, remoção de DNA supérfluo, remoção de sítios de restrição ou similares. Para esse propósito, mutagênese in vitro, reparo de iniciadores, restrição, anelamento, ressubstituições, por exemplo, transições e transversões, podem estar envolvidos.

[0123] Vários promotores podem ser usados na prática das concretizações. Os promotores podem ser selecionados com base no resultado desejado. Os ácidos nucleicos podem ser combinados com promotores constitutivos, preferenciais para tecidos, induzíveis ou outros para expressão no organismo hospedeiro. Os promotores constitutivos adequados para uso em uma célula hospedeira vegetal incluem, por exemplo, o promotor de núcleo do promotor Rsyn7 e outros promotores constitutivos revelados no documento no WO 1999/43838 e na Patente no U.S. 6,072,050; o promotor CaMV 35S de núcleo (Odell, et al., (1985) Nature 313:810 a 812); actina de arroz (McElroy, et al., (1990) Plant Cell 2:163 a 171); ubiquitina (Christensen, et al., (1989) Plant Mol. Biol. 12:619 a 632 e Christensen, et al., (1992) Plant Mol. Biol. 18:675 a 689); pEMU (Last, et al., (1991) Theor. Appl. Genet. 81:581 a 588);

MAS (Velten, et al., (1984) EMBO J. 3:2.723 a 2.730); promotor ALS (Patente no U.S. 5,659,026) e semelhantes. Outros promotores constitutivos incluem, por exemplo, aqueles discutidos nas Patentes nos US 5,608,149; 5,608,144; 5,604,121; 5,569,597; 5,466,785; 5,399,680; 5,268,463; 5,608,142 e 6,177,611.

[0124] Dependendo do resultado desejado, pode ser benéfico expressar o gene a partir de um promotor induzível. Promotores induzíveis por ferimento são de interesse particular para regular a expressão das sequências de nucleotídeo das concretizações em plantas. Tais promotores induzíveis por ferimento podem responder a danos causados por alimentação de insetos e incluem o gene inibidor de proteinase de batata (pin II) (Ryan (1990) Ann. Rev. Phytopath. 28:425 a 449; Duan, et al., (1996) Nature Biotechnology 14:494 a 498); wun1 e wun2, Patente no U.S. 5,428,148; win1 e win2 (Stanford, et al., (1989) Mol. Gen. Genet. 215:200 a 208); sistemina (McGurl, et al., (1992) Science 225:1570 a 1573); WIP1 (Rohmeier, et al., (1993) Plant Mol. Biol. 22:783 a 792; Eckelkamp, et al., (1993) FEBS Letters 323:73 a 76); gene MPI (Corderok, et al., (1994) Plant J. 6(2):141 a 150) e semelhantes.

[0125] Adicionalmente, os promotores induzíveis por patógenos podem ser empregados nos métodos e construtos de nucleotídeo das concretizações. Tais promotores induzíveis por patógenos incluem aqueles de proteínas relacionadas à patogênese (proteínas PR), que são induzidos após infecção por um patógeno; por exemplo, proteínas PR, proteínas SAR, beta-1,3-glucanase, quitinase, etc. Consultar, por exemplo,

Redolfi et al. (1983) Neth. J. Plant Pathol. 89:245 a 254; Uknes, et al., (1992) Plant Cell 4: 645 a 656 e Van Loon, (1985) Plant Mol. Virol. 4:111 a 116. Consultar também o documento WO 1999/43819.

[0126] São de interesse os promotores que são expressos no local ou próximos ao sítio de infecção de patógeno. Consultar, por exemplo, Marineau, et al., (1987) Plant Mol. Biol. 9:335 a 342; Matton, et al., (1989) Molecular Plant-Microbe Interactions 2:325 a 331; Somsisch, et al., (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:2.427 a 2.430; Somsisch, et al., (1988) Mol. Gen. Genet. 2:93 a 98 e Yang, (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:14.972 a 14.977. Também consultar Chen, et al., (1996) Plant J. 10:955 a 966; Zhang, et al., (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 91:2.507 a 2.511; Warner, et al., (1993) Plant J. 3:191 a 201; Siebertz, et al., (1989) Plant Cell 1:961 a 968; Patente no U.S. 5,750,386 (induzível por nematódeos) e as referências citadas nos mesmos. É de interesse particular o promotor induzível para o gene PRms de maís, cuja expressão é induzida pelo patógeno Fusarium moniliforme (consultar, por exemplo, Cordero, et al., (1992) Physiol. Mol. Plant Path. 41:189 a 200).

[0127] Os promotores regulados quimicamente podem ser usados para modular a expressão de um gene em uma planta através da aplicação de um regulador químico exógeno. Dependendo do objetivo, o promotor pode ser um promotor quimicamente induzível, em que a aplicação da substância química induz a expressão de gene ou um promotor quimicamente reprimível, em que a aplicação da substância química reprime a expressão de gene. Os promotores quimicamente induzíveis são conhecidos na técnica e incluem, porém sem limitação, o promotor In2-2 de maís, que é ativado por meio de agentes fitoprotetores de herbicidas benzenossulfonamidas, o promotor GST de maís, que é ativado por compostos eletrofílicos hidrofóbicos que são usados como herbicidas pré-emergentes, e o promotor PR-1a do tabaco, que é ativado por ácido salicílico. Outros promotores de interesse regulados quimicamente incluem promotores responsivos a esteroides (consultar, por exemplo, o promotor induzível por glicocorticoide em Schena et al., (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:1.0421 a 1.0425 e McNellis et al., (1998) Plant J. 14(2):247 a 257) e promotores induzíveis por tetraciclina e repressíveis por tetraciclina (consultar, por exemplo, Gatz et al., (1991) Mol. Gen. Genet. 227:229 a 237 e as Patentes número US 5,814,618 e 5,789,156).

[0128] Promotores preferenciais para tecidos podem ser utilizados para alvejar a expressão de um polipeptídeo de toxina Cry em um tecido vegetal particular. Os promotores preferenciais para tecidos incluem aqueles discutidos em Yamamoto et al. (1997) Plant J. 12(2)255 a 265; Kawamata et al. (1997) Plant Cell Physiol. 38(7):792 a 803; Hansen et al. (1997) Mol. Gen Genet. 254(3):337 a 343; Russell et al. (1997) Transgenic Res. 6(2):157 a 168; Rinehart et al. (1996) Plant Physiol. 112(3):1.331 a 1.341; Van Camp et al. (1996) Plant Physiol. 112(2):525 a 535; Canevascini et al. (1996) Plant Physiol. 112(2):513 a 524; Yamamoto et al. (1994) Plant Cell Physiol. 35(5):773 a 778; Lam (1994) Results Probl. Cell Differ. 20:181 a 196; Orozco, et al., (1993) Plant Mol Biol. 23(6):1.129 a 1.138; Matsuoka, et al., (1993) Proc

Natl. Acad. Sci. USA 90(20):9.586 a 9.590 e Guevara-Garcia, et al., (1993) Plant J. 4(3):495 a 505. Tais promotores podem ser modificados, se necessário, para expressão fraca.

[0129] Promotores preferenciais para folha são conhecidos na técnica. Consultar, por exemplo, Yamamoto, et al., (1997) Plant J. 12(2):255 a 265; Kwon, et al., (1994) Plant Physiol. 105:357 a 367; Yamamoto, et al., (1994) Plant Cell Physiol. 35(5):773 a 778; Gotor, et al., (1993) Plant J. 3:509 a 518; Orozco, et al., (1993) Plant Mol. Biol. 23(6):1.129 a 1.138 e Matsuoka, et al., (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90(20):9.586 a 9.590.

[0130] Promotores preferenciais para raízes ou específicos para raízes são conhecidos e podem ser selecionados a partir dos muitos disponíveis na literatura ou isolados de novo de várias espécies compatíveis. Consultar, por exemplo, Hire, et al., (1992) Plant Mol. Biol. 20(2):207 a 218 (gene de glutamina sintetase específico para raiz de soja); Keller e Baumgartner, (1991) Plant Cell 3(10):1.051 a 1.061 (elemento de controle específico para raiz no gene GRP 1.8 de Vagem); Sanger, et al. (1990) Plant Mol. Biol. 14(3):433 a 443 (promotor específico para raiz do gene de manopina sintase (MAS) de Agrobacterium tumefaciens) e Miao, et al. (1991) Plant Cell 3(1):11 a 22 (clone de cDNA completo que codifica glutamina sintetase (GS) citosólica, que é expresso em raízes e nódulos de raiz de soja). Consultar também Bogusz et al., (1990) Plant Cell 2(7):633 a 641, em que são descritos dois promotores específicos para raiz isolados de genes de hemoglobina da não leguminosa fixadora de nitrogênio Parasponia andersonii e da não leguminosa não fixadora de nitrogênio relacionada Trema tomentosa. Os promotores desses genes foram ligados a um gene-repórter de β-glucuronidase e introduzidos tanto na não leguminosa Nicotiana tabacum quanto na leguminosa Lotus corniculatus, e em ambos os casos a atividade promotora específica de raiz foi preservada. Leach e Aoyagi (1991) descrevem sua análise dos promotores dos genes indutores de raiz rolC e rolD altamente expressos de Agrobacterium rhizogenes (consultar Plant Science (Limerick) 79(1):69 a 76). Concluiu-se que o intensificador e os determinantes de DNA preferenciais para tecidos estão dissociados nesses promotores. Teeri, et al., (1989) usaram fusão genética a lacZ para mostrar que o gene de T-DNA de Agrobacterium que codifica octopina sintase é especialmente ativo na epiderme da ponta de raiz e que o gene de TR2' é específico para raiz na planta intata e estimulado por ferimento no tecido foliar, uma combinação especialmente desejável de características para uso com um gene inseticida ou larvicida (consultar, EMBO J. 8(2):343 a 350). O gene TR1' fundido a nptII (neomicina fosfotransferase II) apresentou características semelhantes. Os promotores preferenciais para raiz adicionais incluem o promotor de gene de VfENOD-GRP3 (Kuster, et al., (1995) Plant Mol. Biol. 29(4):759 a 772) e o promotor rolB (Capana, et al., (1994) Plant Mol. Biol. 25(4):681 a

691. Consultar também as Patentes Número US 5,837,876; 5,750,386; 5,633,363; 5,459,252; 5,401,836; 5,110,732 e 5,023,179. As sequências regulatórias preferenciais para raiz de Arabidopsis thaliana são reveladas no documento no US20130117883.

[0131] Os promotores "preferenciais para semente" incluem tanto os promotores "específicos para semente" (aqueles promotores ativos durante o desenvolvimento de semente, como promotores de proteínas de armazenamento de semente), assim como promotores de "germinação de semente" (aqueles promotores ativos durante a germinação de semente). Consultar Thompson et al., (1989) BioEssays 10:108. Tais promotores preferenciais para semente incluem, porém sem limitação, Cim1 (mensagem induzida por citoquinina); cZ19B1 (zeína de 19 kDa de maís); e milps (mio-inositol-1-fosfato sintase) (consultar a Patente número US 6,225,529). Gama- zeína e Glb-1 são promotores específicos para endosperma. Para dicotiledôneas, promotores específicos para semente incluem, porém sem limitação, inibidor de tripsina Kunitz 3 (KTi3) (Jofuku e Goldberg, (1989) Plant Cell 1:1.079 a

1.101), β-faseolina de feijão, napina, β-conglicinina, glicinina 1, lectina de soja, cruciferina e similares. Para monocotiledôneas, os promotores específicos para semente incluem, porém sem limitação, zeína de 15 kDa de maís, zeína de 22 kDa, zeína de 27 kDa, g-zeína, ceroso, shrunken 1, shrunken 2, globulina 1, etc. Consultar também o documento WO 2000/12733, em que os promotores com preferência para semente de genes end1 e end2 são revelados. Em dicotiledôneas, os promotores específicos para semente incluem, porém sem limitação, promotor de revestimento de semente de Arabidopsis, pBAN; e os promotores de semente iniciais de Arabidopsis, p26, p63 e p63tr (Patentes Número US 7,294,760 e 7,847,153). Um promotor que tem expressão "preferencial" em um tecido particular é expresso nesse tecido em um grau maior do que em pelo menos um outro tecido de planta. Alguns promotores preferenciais para tecidos mostram expressão quase exclusivamente no tecido particular.

[0132] Quando expressão de nível baixo for desejada, promotores fracos serão usados. Geralmente, o termo "promotor fraco" conforme usado no presente documento refere-se a um promotor que aciona a expressão de uma sequência de codificação em um nível baixo. Por expressão de nível baixo, níveis entre cerca de 1/1.000 transcrições a cerca de 1/100.000 transcrições a cerca de 1/500.000 transcrições são pretendidos. Alternativamente, é reconhecido que o termo "promotores fracos" também abrange os promotores que acionam a expressão apenas em algumas células e não em outras para gerar um nível baixo total de expressão. Quando um promotor aciona a expressão em níveis inaceitavelmente altos, porções da sequência promotora podem ser deletadas ou modificadas para diminuir os níveis de expressão.

[0133] Tais promotores constitutivos fracos incluem, por exemplo, o promotor nuclear do promotor de Rsyn7 (documento no WO 1999/43838 e Patente número US 6,072,050), o promotor nuclear do CaMV 35S e semelhantes. Outros promotores constitutivos incluem, por exemplo, aqueles discutidos nas Patentes número US 5,608,149; 5,608,144; 5,604,121; 5,569,597; 5,466,785; 5,399,680; 5,268,463; 5,608,142 e 6,177,611.

[0134] A lista acima de promotores não é destinada a ser limitante. Qualquer promotor apropriado pode ser usado nas concretizações.

[0135] Geralmente, o cassete de expressão compreenderá um gene marcador selecionável para a seleção de células transformadas.

Os genes marcadores selecionáveis são utilizados para a seleção de células ou tecidos transformados.

Os genes marcadores incluem os genes que codificam a resistência a antibióticos, como aqueles que codificam a neomicina fosfotransferase II (NEO) e higromicina fosfotransferase (HPT), assim como genes que conferem resistência aos compostos herbicidas, como glufosinato de amônio, bromoxinila, imidazolinonas e 2,4- diclorofenoxiacetato (2,4-D). Os exemplos adicionais de genes marcadores selecionáveis adequados incluem, porém sem limitação, genes que codificam resistência a cloranfenicol (Herrera Estrella, et al., (1983) EMBO J. 2:987 a 992); metotrexato (Herrera Estrella, et al., (1983) Nature 303:209 a 213 e Meijer, et al., (1991) Plant Mol.

Biol. 16:807 a 820); estreptomicina (Jones, et al., (1987) Mol.

Gen.

Genet. 210:86 a 91); espectinomicina (Bretagne-Sagnard, et al., (1996) Transgenic Res. 5:131 a 137); bleomicina (Hille, et al., (1990) Plant Mol.

Biol. 7:171 a 176); sulfonamida (Guerineau, et al., (1990) Plant Mol.

Biol. 15:127 a 136); bromoxinil (Stalker, et al., (1988) Science 242:419 a 423); glifosato (Shaw, et al., (1986) Science 233:478 a 481 e Pedidos de Patente de número de série U.S. 10/004,357 e 10/427,692); fosfinotricina (DeBlock, et al., (1987) EMBO J. 6:2.513 a 2.518). Consultar, de modo geral, Yarranton, (1992) Curr.

Opin.

Biotech. 3:506 a 511; Christopherson, et al., (1992) Proc.

Natl.

Acad.

Sci.

USA 89:6.314 a 6.318; Yao, et al., (1992) Cell 71:63 a 72; Reznikoff, (1992) Mol.

Microbiol. 6:2.419 a 2.422; Barkley, et al., (1980) em The Operon, páginas 177 a 220; Hu, et al., (1987) Cell 48:555 a 566; Brown, et al., (1987) Cell 49:603 a 612; Figge, et al., (1988) Cell 52:713 a 722; Deuschle, et al., (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:5.400 a 5.404; Fuerst, et al., (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:2.549 a 2.553; Deuschle, et al., (1990) Science 248:480 a 483; Gossen, (1993) Tese de doutorado, University of Heidelberg; Reines, et al., (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:1.917 a 1.921; Labow, et al., (1990) Mol. Cell. Biol. 10:3.343 a 3.356; Zambretti, et al., (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:3.952 a 3.956; Baim, et al., (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:5.072 a 5.076; Wyborski, et al., (1991) Nucleic Acids Res. 19:4.647 a 4.653; Hillenand-Wissman, (1989) Topics Mol. Struc. Biol. 10:143 a 162; Degenkolb, et al., (1991) Antimicrob. Agents Chemother. 35:1.591 a 1.595; Kleinschnidt, et al., (1988) Biochemistry 27:1.094 a 1.104; Bonin, (1993) Tese de doutorado, University of Heidelberg; Gossen, et al., (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5.547 a 5.551; Oliva, et al., (1992) Antimicrob. Agents Chemother. 36:913 a 919; Hlavka, et al., (1985) Handbook of Experimental Pharmacology, Volume 78 (Springer- Verlag, Berlim) e Gill, et al., (1988) Nature 334:721 a 724.

[0136] A lista acima de genes marcadores selecionáveis não é destinada a ser limitante. Qualquer gene marcador selecionável pode ser usado nas concretizações. Transformação de Planta

[0137] Os métodos das concretizações envolvem introduzir um polipeptídeo ou polinucleotídeo em uma planta. "Introduzir" significa, conforme usado no presente documento, apresentar à planta o polinucleotídeo ou polipeptídeo de tal maneira que a sequência ganhe acesso ao interior de uma célula da planta. Os métodos das concretizações não dependem de um método específico para introduzir um polinucleotídeo ou polipeptídeo em uma planta, apenas que o polinucleotídeo (ou polinucleotídeos) ou o polipeptídeo (ou polipeptídeos) ganhe acesso ao interior de pelo menos uma célula da planta. Métodos para introduzir polinucleotídeo (ou polinucleotídeos) ou polipeptídeo (ou polipeptídeos) em plantas são conhecidos na técnica, incluindo, porém sem limitação, métodos de transformação estável, métodos de transformação transiente e métodos mediados por vírus.

[0138] “Transformação estável”, conforme usado no presente documento, significa que o construto de nucleotídeos introduzido em uma planta integra o genoma da planta e tem capacidade para ser herdado pela progênie da mesma. "Transformação transiente" significa, conforme usado no presente documento, que um polinucleotídeo é introduzido na planta e não se integra no genoma da planta ou um polipeptídeo é introduzido em uma planta. "Planta" refere- se, conforme usado no presente documento, a plantas inteiras, órgãos de plantas (por exemplo, folhas, caules, raízes, etc.), sementes, células de plantas, propágulos, embriões e progênie dos mesmos. As células vegetais podem ser diferenciadas ou não diferenciadas (por exemplo, calo, células de cultura em suspensão, protoplastos, células foliares, células radiculares, células de floema e pólen).

[0139] Os protocolos de transformação, assim como protocolos para introduzir sequências de nucleotídeos em plantas, podem variar dependendo do tipo de planta ou célula vegetal, isto é, monocotiledônea ou dicotiledônea, alvejada para transformação.

Métodos adequados de introdução de sequências de nucleotídeos em células de planta e subsequente inserção no genoma de planta incluem microinjeção (Crossway, et al., (1986) Biotechniques 4:320 a 334), eletroporação (Riggs, et al., (1986) Proc.

Natl.

Acad.

Sci.

USA 83:5.602 a 5.606), transformação mediada por Agrobacterium ((Patentes número US 5,563,055 e 5,981,840), transferência de genes direta (Paszkowski, et al., (1984) EMBO J. 3:2.717 a 2.722) e aceleração balística de partículas (consultar, por exemplo, as Patentes número US 4,945,050; 5,879,918; 5,886,244 e 5,932,782; Tomes, et al., (1995) em Plant Cell, Tissue, and Organ Culture: Fundamental Methods, ed.

Gamborg e Phillips, (Springer-Verlag, Berlin) e McCabe, et al., (1988) Biotechnology 6:923 a 926) e transformação Lecl (WO 00/28058). Para transformação de batata, consultar Tu, et al., (1998) Plant Molecular Biology 37:829 a 838 e Chong, et al., (2000) Transgenic Research 9:71 a 78. Procedimentos de transformação adicionais podem ser encontrados em Weissinger, et al., (1988) Ann.

Rev.

Genet. 22:421 a 477; Sanford, et al., (1987) Particulate Science and Technology 5:27 a 37 (cebola); Christou, et al., (1988) Plant Physiol. 87:671 a 674 (soja); McCabe, et al., (1988) Bio/Technology 6:923 a 926 (soja); Finer e McMullen, (1991) In Vitro Cell Dev.

Biol. 27P:175 a 182 (soja); Singh, et al., (1998) Theor.

Appl.

Genet. 96:319 a 324 (soja); Datta, et al., (1990)

Biotechnology 8:736 a 740 (arroz); Klein, et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:4305 a 4309 (maís); Klein, et al., (1988) Biotechnology 6:559 a 563 (maís); Patentes número US 5,240,855; 5,322,783 e 5,324,646; Klein, et al., (1988) Plant Physiol. 91:440 a 444 (maís); Fromm, et al., (1990) Biotechnology 8:833 a 839 (maís); Hooykaas-Van Slogteren, et al., (1984) Nature (Londres) 311:763 a 764; Patente US número 5,736,369 (cereais); Bytebier, et al., (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:5345 a 5349 (Liliaceae); De Wet, et al., (1985) em The Experimental Manipulation of Ovule Tissues, ed. Chapman, et al., (Longman, Nova Iorque), páginas 197 a 209 (pólen); Kaeppler, et al., (1990) Plant Cell Reports 9:415 a 418 e Kaeppler, et al., (1992) Theor. Appl. Genet. 84:560 a 566 (transformação mediada por fibras); D'Halluin, et al., (1992) Plant Cell 4:1495 a 1505 (eletroporação); Li, et al., (1993) Plant Cell Reports 12:250 a 255 e Christou e Ford, (1995) Annals of Botany 75:407 a 413 (arroz); Osjoda, et al., (1996) Nature Biotechnology 14:745 a 750 (maís por meio de Agrobacterium tumefaciens).

[0140] Em concretizações específicas, as sequências das concretizações podem ser fornecidas a uma planta com o uso de uma variedade de métodos de transformação transiente. Tais métodos de transformação transiente incluem, porém sem limitação, a introdução da proteína do polinucleotídeo de toxina Cry ou suas variantes e fragmentos diretamente na planta ou a introdução do transcrito de polipeptídeo de toxina Cry na planta. Tais métodos incluem, por exemplo, microinjeção ou bombardeamento de partículas. Consultar, por exemplo, Crossway, et al., (1986) Mol Gen. Genet. 202:179 a

185; Nomura, et al., (1986) Plant Sci. 44:53 a 58; Hepler, et al., (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. 91:2.176 a 2.180 e Hush, et al., (1994) The Journal of Cell Science 107:775 a

784. Em alternativa, o polinucleotídeo de toxina Cry pode ser transientemente transformado na planta com o uso de técnicas conhecidas na arte. Tais técnicas incluem um sistema de vetor viral e a precipitação do polinucleotídeo de uma maneira que impeça a liberação subsequente do DNA. Portanto, a transcrição a partir do DNA ligado à partícula pode ocorrer, mas a frequência com que a mesma é liberada para se integrar ao genoma é muito reduzida. Tais métodos incluem o uso de partículas revestidas com polietilimina (PEI; Sigma no P3143).

[0141] São conhecidos na técnica métodos para a inserção alvejada de um polinucleotídeo em uma localização específica no genoma da planta. Em uma concretização, a inserção do polinucleotídeo em uma localização genômica desejada é alcançada com o uso de um sistema de recombinação específico para sítio. Consultar, por exemplo, os documentos WO 1999/25821, WO 1999/25854, WO 1999/25840, WO 1999/25855 e WO 1999/25853. Brevemente, o polinucleotídeo das concretizações pode ser contido em cassete de transferência flanqueado por dois sítios de recombinação não idênticos. O cassete de transferência é introduzido em uma planta que incorporou de modo estável em seu genoma um sítio-alvo que é flanqueado por dois sítios de recombinação não idênticos que correspondem aos sítios do cassete de transferência. Uma recombinase apropriada é fornecida, e o cassete de transferência é integrado no sítio-alvo. O polinucleotídeo de interesse é, assim, integrado em uma posição cromossômica específica no genoma de planta.

[0142] Os vetores de transformação de planta podem ser compreendidos por um ou mais vetores de DNA necessários para alcançar a transformação da planta. Por exemplo, é uma prática comum na técnica utilizar os vetores de transformação de planta que são compreendidos por mais de um segmento de DNA contíguo. Esses vetores são frequentemente chamados na técnica de "vetores binários". Os vetores binários, assim como vetores com plasmídeos auxiliares, são mais frequentemente usados para transformação mediada por Agrobacterium, em que o tamanho e complexidade dos segmentos de DNA necessários para alcançar transformação eficiente são bem maiores, e isso é vantajoso para separar funções em moléculas de DNA separadas. Os vetores binários contêm tipicamente um vetor plasmídico que contém as sequências de atuação cis exigidas para a transferência de T-DNA (como borda esquerda e borda direita), um marcador selecionável que é modificado geneticamente para ter capacidade para expressão em uma célula de planta e um "gene de interesse" (um gene modificado geneticamente para ter capacidade para expressão em uma célula de planta para a qual a geração de plantas transgênicas é desejada). Também estão presentes nesse vetor plasmídico as sequências exigidas para replicação bacteriana. As sequências de atuação cis são dispostas de maneira a permitir a transferência eficaz para células de plantas e expressão nas mesmas. Por exemplo, o gene marcador selecionável e o gene pesticida são localizados entre as bordas esquerda e direita. Frequentemente, um segundo vetor plasmídico contém os fatores de atuação trans que medeiam a transferência de T-DNA de Agrobacterium para células de plantas. Esse plasmídeo contém frequentemente as funções de virulência (genes Vir) que permitem a infecção de células de plantas por Agrobacterium, e transferência de DNA por clivagem em sequências de borda e transferência de DNA mediada por Vir, conforme é entendido na técnica (Hellens e Mullineaux, (2000) Trends in Plant Science 5:446 a 451). Diversos tipos de cepas de Agrobacterium (por exemplo, LBA4404, GV3101, EHA101, EHA105, etc.) podem ser usados para transformação de plantas. O segundo vetor plasmídico não é necessário para transformar as plantas por outros métodos, como microprojeção, microinjeção, eletroporação, polietilenoglicol, etc.

[0143] Em geral, os métodos de transformação de planta envolvem transferir o DNA heterólogo para células de plantas-alvo (por exemplo, embriões imaturos ou maduros, culturas de suspensão, calo não diferenciado, protoplastos, etc.), seguidos pela aplicação de um nível de limiar máximo de seleção apropriada (dependendo do gene marcador selecionável) para recuperar as células de plantas transformadas a partir de um grupo de massa de célula não transformada. Após a integração de DNA estranho heterólogo em células de plantas, é aplicado um nível de limiar máximo de seleção adequada no meio para exterminar as células não transformadas e separar e proliferar as células transformadas de modo putativo que sobrevivem a esse tratamento de seleção transferindo as mesmas de modo regular para um meio fresco. Pela passagem contínua e o desafio com seleção apropriada, são identificadas e proliferadas as células que são transformadas com o vetor plasmídico. Os métodos moleculares e bioquímicos podem, então, ser usados para confirmar a presença do gene de interesse heterólogo integrado no genoma da planta transgênica.

[0144] Explantes são tipicamente transferidos para um suprimento fresco do mesmo meio e cultivados de modo rotineiro. Subsequentemente, as células transformadas são diferenciadas em brotos após colocação em meio de regeneração suplementado com um nível de limiar máximo de agente de seleção. Os brotos são, então, transferidos para um meio de enraizamento seletivo para recuperar o broto ou plântula enraizado. A plântula transgênica cresce, então, formando uma planta madura e produz sementes férteis (por exemplo, Hiei, et al., (1994) The Plant Journal 6:271 a 282; Ishida, et al., (1996) Nature Biotechnology 14:745 a 750). Explantes são tipicamente transferidos para um suprimento fresco do mesmo meio e cultivados de modo rotineiro. Uma descrição geral das técnicas e métodos para gerar plantas transgênicas é encontrada em Ayres e Park, (1994) Critical Reviews in Plant Science 13:219 a 239 e Bommineni e Jauhar, (1997) Maydica 42:107 a 120. Visto que o material transformado contém muitas células, tanto células transformadas quanto não transformadas estão presentes em qualquer parte de calo ou tecido ou grupo de células-alvo em questão. A capacidade para exterminar células não transformadas e permitir que células transformadas proliferem resulta em culturas de plantas transformadas. Frequentemente, a capacidade para remover células não transformadas é uma limitação à recuperação rápida de células de plantas transformadas e geração bem-sucedida de plantas transgênicas.

[0145] As células que foram transformadas podem se desenvolver em plantas, de acordo com maneiras convencionais. Consultar, por exemplo, McCormick, et al., (1986) Plant Cell Reports 5:81 a 84. Essas plantas podem, então, ser cultivadas e ser polinizadas com a mesma cepa transformada ou cepas diferentes, e o híbrido resultante que tem expressão constitutiva ou induzível da característica fenotípica desejada identificada. Duas ou mais gerações podem ser cultivadas para garantir que a expressão da característica fenotípica desejada seja mantida de modo estável e herdada e, então, as sementes são recolhidas para garantir que a expressão da característica fenotípica desejada tenha sido alcançada.

[0146] As sequências de nucleotídeos das concretizações podem ser fornecidas à planta colocando-se a planta em contato com um vírus ou ácidos nucleicos virais. Geralmente, tais métodos envolvem incorporar o construto de nucleotídeos de interesse dentro de uma molécula de RNA ou DNA viral. É reconhecido que as proteínas recombinantes das concretizações podem ser inicialmente sintetizadas como parte de uma poliproteína viral que pode ser posteriormente processada por proteólise in vivo ou in vitro para produzir o polipeptídeo de toxina Cry desejado. Também é reconhecido que tal poliproteína viral, que compreende pelo menos uma porção da sequência de aminoácidos de um polipeptídeo de toxina Cry das concretizações, pode ter a atividade pesticida desejada. Tais poliproteínas virais e as sequências de nucleotídeos que codificam as mesmas são abrangidas pelas concretizações. Os métodos para dotar plantas de construtos de nucleotídeo e produzir as proteínas codificadas nas plantas que envolvem moléculas de RNA ou DNA viral são conhecidos na técnica. Consultar, por exemplo, as Patentes no U,S, 5,889,191; 5,889,190; 5,866,785; 5,589,367 e 5,316,931.

[0147] Os métodos para transformação de cloroplastos são conhecidos na técnica. Consultar, por exemplo, Svab, et al., (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:8.526 a 8.530; Svab e Maliga, (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:913 a 917; Svab e Maliga, (1993) EMBO J. 12:601 a 606. O método depende da entrega de canhão de partículas de DNA que contém um marcador selecionável e direcionamento do DNA ao genoma plastídeo através de recombinação homóloga. Adicionalmente, a transformação de plastídeos pode ser realizada pela transativação de um transgene originado por plastídeo silencioso por expressão preferida para tecidos de uma RNA polimerase codificada de modo nuclear e direcionada para plastídeo. Tal sistema foi relatado em McBride, et al., (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:7.301 a 7.305.

[0148] As concretizações referem-se ainda ao material de propagação de planta de uma planta transformada das concretizações incluindo, porém sem limitação, sementes, tubérculos, cormos, bulbos, folhas e estacas de raízes e rebentos.

[0149] As concretizações podem ser usadas para transformação de quaisquer espécies de planta, incluindo, porém sem limitação, monocotiledôneas e dicotiledôneas.

Exemplos de plantas de interesse incluem, porém sem limitação, milho (Zea mays), Brassica sp. (por exemplo, B. napus, B. rapa, B. juncea), particularmente aquelas espécies de Brassica úteis como fontes de óleo de semente, alfafa (Medicago sativa), arroz (Oryza sativa), centeio (Secale cereale), sorgo (Sorghum bicolor, Sorghum vulgare), milhete (por exemplo, milhete-pérola (Pennisetum glaucum), milho miúdo (Panicum miliaceum), milho painço (Setaria italica), capim-pé-de-galinha-gigante (Eleusine coracana)), girassol (Helianthus annuus), cártamo (Carthamus tinctorius), trigo (Triticum aestivum), soja (Glycine max), tabaco (Nicotiana tabacum), batata (Solanum tuberosum), amendoins (Arachis hypogaea), algodão (Gossypium barbadense, Gossypium hirsutum), batata doce (Ipomoea batatus), mandioca (Manihot esculenta), café (Coffea spp.), coco (Cocos nucifera), abacaxi (Ananas comosus), árvores de citrinos (Citrus spp.), cacau (Theobroma cacao), chá (Camellia sinensis), banana (Musa spp.), abacate (Persea americana), figueira (Ficus casica), goiaba (Psidium guajava), manga (Mangifera indica), oliveira (Olea europaea), papaia (Carica papaya), caju (Anacardium occidentale), macadâmia (Macadamia integrifolia), amêndoa (Prunus amygdalus), beterraba sacarina (Beta vulgaris), cana-de-açúcar (Saccharum spp.), aveia, cevada, legumes, plantas ornamentais e coníferas.

[0150] Legumes incluem tomates (Lycopersicon esculentum), alface (por exemplo, Lactuca sativa), feijões verdes (Phaseolus vulgaris), feijões-de-lima (Phaseolus limensis), ervilhas (Lathyrus spp.) e membros do gênero Cucumis, como pepino (C. sativus), cantalupo (C.

cantalupensis) e melão (C. melo). Plantas ornamentais incluem azaleia (Rhododendron spp.), hidrângea (Macrophylla hydrangea), hibisco (Hibiscus rosasanensis), rosas (Rosa spp.), tulipas (Tulipa spp.), narcisos (Narcissus spp.), petúnias (Petunia hybrida), craveiro (Dianthus caryophyllus), poinsétia (Euphorbia pulcherrima) e crisântemo. Coníferas que podem ser empregadas na prática das concretizações incluem, por exemplo, pinheiros, como pinheiro (Pinus taeda), pinheiro-americano (Pinus elliotii), pinheiro ponderosa (Pinus ponderosa), pinheiro de Lodgepole (Pinus contorta) e pinheiro de Monterey (Pinus radiata); pinheiro do Oregon (Pseudotsuga menziesii); cicuta ocidental (Tsuga canadensis); abeto Sitka (Picea glauca); sequoia (Sequoia sempervirens); abetos verdadeiros, como abeto (Abies amabilis) e abeto balsâmico (Abies balsamea); e cedros, como cedro vermelho ocidental (Thuja plicata) e cedro amarelo do Alasca (Chamaecyparis nootkatensis). As plantas das concretizações incluem plantas de cultura (por exemplo, milho, alfafa, girassol, Brassica, soja, algodão, cártamo, amendoim, sorgo, trigo, milhete, tabaco, etc.), como plantas de milho e soja.

[0151] Gramados incluem, porém sem limitação: poa- anual (Poa annua); azevém anual (Lolium multiflorum); poa canadiana (Poa compressa); festuca-encarnada (Festuca rubra); Agrostide-ténue (Agrostis tenuis); erva-fina (Agrostis palustris); grama de trigo do deserto ("crested wheatgrass") (Agropyron desertorum); capim-mombaça (Agropyron cristatum); festuca rígida (Festuca longifolia); erva-de-febra (Poa pratensis); panasco (Dactylis glomerata);

azevém perene (Lolium perenne); festuca-encarnada (Festuca rubra); germínia rubra (Agrostis alba); poa-comum (Poa trivialis); festuca ovina (Festuca ovina); bromo (Bromus inermis); festuca alta (Festuca arundinacea); rabo-de-gato (Phleum pratense); Agrostis-de-cão ("velvet bentgrass") (Agrostis canina); "weeping alkaligrass" (Puccinellia distans); erva-trigo ocidental (Agropyron smithii); grama Bermuda (Cynodon spp.); grama Santo Agostinho (Stenotaphrum secundatum); Grama Zoysia (Zoysia spp.); grama-Bahia (Paspalum notatum); grama tapete (Axonopus affinis); grama centípede (Eremochloa ophiuroides); grama Kikuio (Pennisetum clandesinum); capim-arame-da-praia (Paspalum vaginatum); grama azul (Bouteloua gracilis); grama americana (Buchloe dactyloids); "sideoats gramma" (Bouteloua curtipendula).

[0152] As plantas de interesse incluem plantas de grãos que fornecem sementes de interesse, plantas oleaginosas e leguminosas. Sementes de interesse incluem sementes de grãos, tais como milho, trigo, cevada, arroz, sorgo, centeio, milheto, etc. Plantas oleaginosas incluem algodão, soja, cártamo, girassol, Brassica, milho, alfafa, palma, coco, linho, rícino, oliva, etc. Plantas leguminosas incluem feijão e ervilhas. Os feijões incluem guar, feijão de alfarroba, feno-grego, soja, feijão de jardim, caupi, feijão mungo, feijão-de-lima, feijão-fava, lentilhas, grão- de-bico, etc.

[0153] Após a introdução de DNA estranho heterólogo em células de plantas, a transformação ou integração de gene heterólogo no genoma de planta é confirmada por vários métodos, como análise de ácidos nucleicos, proteínas e metabólitos associados ao gene integrado.

[0154] A análise por PCR é um método rápido para triar células transformadas, tecido ou brotos quanto à presença de gene incorporado no estágio inicial antes de transplante para o solo (Sambrook e Russell, (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY). É executada PCR com o uso de iniciadores de oligonucleotídeos específicos para o gene de interesse ou fundo de vetor de Agrobacterium, etc.

[0155] A transformação da planta pode ser confirmada por análise de Southern blot de DNA genômico (Sambrook e Russell, (2001) supra). Na análise por Northern blot, o RNA é isolado de tecidos específicos de transformante, fracionado em um gel de agarose de formaldeído e transferido para um filtro de náilon de acordo com procedimentos padrões que são usados de modo rotineiro na técnica (Sambrook e Russell, (2001) supra). A expressão de RNA codificada pelo gene pesticida é, então, testada hibridizando-se o filtro para uma sonda radioativa derivada de um gene pesticida por métodos conhecidos na técnica (Sambrook e Russell, (2001) supra). A transferência de Western, os ensaios bioquímicos e semelhantes podem ser executados nas plantas transgênicas para confirmar a presença de proteína codificada pelo gene pesticida por procedimentos padrão (Sambrook e Russell, 2001, supra) com o uso de anticorpos que se ligam a um ou mais epítopos presentes no polipeptídeo de toxina Cry.

Métodos para Introduzir Tecnologias de Edição de Genoma em Plantas

[0156] Em algumas concretizações, as composições de polinucleotídeo de toxina Cry reveladas podem ser introduzidas no genoma de uma planta com o uso de tecnologias de edição de genoma, ou polinucleotídeos de toxina Cry anteriormente introduzidos no genoma de uma planta podem ser editados com o uso de tecnologias de edição de genoma. Por exemplo, os polinucleotídeos revelados podem ser introduzidos em uma localização desejada no genoma de uma planta através do uso de tecnologias de quebra de fita dupla, como TALENs, meganucleases, nucleases de dedo de zinco, CRISPR-Cas e semelhantes. Por exemplo, os polinucleotídeos revelados podem ser introduzidos em uma localização desejada em um genoma com o uso de um sistema CRISPR-Cas, para o propósito de inserção específica para sítios. A localização desejada em um genoma de planta pode ser qualquer sítio-alvo desejado para inserção, tal como uma região genômica favorável para reprodução, ou pode ser um sítio alvo localizado em uma janela genômica com um traço de interesse existente. Os traços de interesse existente poderiam ser um traço endógeno ou um traço anteriormente introduzido.

[0157] Em algumas concretizações, quando o polinucleotídeo de toxina Cry revelado foi anteriormente introduzido em um genoma, tecnologias de edição de genoma podem ser usadas para alterar ou modificar a sequência de polinucleotídeo introduzida. As modificações específicas para sítio que podem ser introduzidas nas composições de polinucleotídeo de toxina Cry reveladas incluem aquelas produzidas com o uso de qualquer método para introduzir modificações específicas para sítio, incluindo, porém sem limitação, através do uso de oligonucleotídeos de reparo de gene (por exemplo, Publicação no U.S. 2013/0019349) ou através do uso de tecnologias de quebra de fita dupla, tais como TALENs, meganucleases, nucleases de dedo de zinco, CRISPR-Cas e semelhantes. Tais tecnologias podem ser usadas para modificar o polinucleotídeo anteriormente introduzido através de inserção, deleção ou substituição de nucleotídeos dentro do polinucleotídeo introduzido. Alternativamente, tecnologias de quebra de fita dupla podem ser usadas para adicionar sequências de nucleotídeos adicionais ao polinucleotídeo introduzido. As sequências adicionais que podem ser adicionadas incluem elementos de expressão adicionais, como sequências intensificadoras e promotoras. Em outra concretização, tecnologias de edição de genoma podem ser usadas para posicionar proteínas ativas como inseticida adicionais em proximidade com as composições de polinucleotídeo de toxina Cry reveladas no presente documento dentro do genoma de uma planta, a fim de gerar pilhas moleculares de proteínas ativas como inseticida.

[0158] Um “sítio-alvo alterado”, “sequência-alvo alterada”, “sítio-alvo modificado” e “sequência-alvo modificada” são usados de forma intercambiável no presente documento e se referem a uma sequência-alvo conforme revelado no presente documento que compreende pelo menos uma alteração em comparação com a sequência-alvo não alterada. Tais "alterações" incluem, por exemplo: (i) substituição de pelo menos um nucleotídeo, (ii) uma deleção de pelo menos um nucleotídeo, (iii) uma inserção de pelo menos um nucleotídeo ou (iv) qualquer combinação de (i) a (iii). Empilhamento de traços em planta transgênica

[0159] As plantas transgênicas podem compreender um empilhamento de um ou mais polinucleotídeos inseticidas revelados no presente documento com um ou mais polinucleotídeos adicionais resultando na produção ou supressão de múltiplas sequências de polipeptídeos. As plantas transgênicas que compreendem empilhamentos de sequências de polinucleotídeos podem ser obtidas por qualquer um ou ambos os métodos de reprodução tradicionais ou através de métodos de modificação genética. Esses métodos incluem, porém sem limitação, o melhoramento de linhagens individuais, sendo que cada uma compreende um polinucleotídeo de interesse, transformação de uma planta transgênica que compreende um gene revelado no presente documento com um gene subsequente e a cotransformação de genes em uma única célula vegetal. Conforme usado no presente documento, o termo "empilhado" inclui ter os múltiplos traços presentes na mesma planta (isto é, ambos os traços são incorporados no genoma nuclear, um traço é incorporado no genoma nuclear e um traço é incorporado no genoma de um plastídeo ou ambos os traços são incorporados no genoma de um plastídeo). Em um exemplo não limitante, "traços empilhados" compreendem uma pilha molecular em que as sequências são fisicamente adjacentes entre si. Um traço, conforme usado no presente documento, refere-se ao fenótipo derivado de uma sequência particular ou grupos de sequências. A cotransformação de genes pode ser executada com o uso de vetores de transformação únicos que compreendem múltiplos genes ou genes portados separadamente em múltiplos vetores. Se as sequências forem empilhadas transformando-se geneticamente as plantas, as sequências de polinucleotídeo de interesse podem ser combinadas em qualquer momento e em qualquer ordem. Os traços podem ser introduzidos simultaneamente em um protocolo de cotransformação com os polinucleotídeos de interesse fornecidos por qualquer combinação de cassetes de transformação. Por exemplo, se forem introduzidas duas sequências, as duas sequências podem ser contidas em cassetes de transformação separadas (trans) ou contidas no mesmo cassete de transformação (cis). A expressão das sequências pode ser acionada pelo mesmo promotor ou por diferentes promotores. Em certos casos, pode ser desejável introduzir um cassete de transformação que suprimirá a expressão do polinucleotídeo de interesse. Isso pode ser combinado com qualquer combinação de outros cassetes de supressão ou cassetes de superexpressão para gerar a combinação desejada de traços na planta. É adicionalmente reconhecido que as sequências de polinucleotídeos podem ser empilhadas em uma localização genômica desejada com o uso de um sistema de recombinação específica de sítio. Consultar, por exemplo, os documentos WO 1999/25821, WO 1999/25854, WO 1999/25840, WO 1999/25855 e WO 1999/25853, todos os quais estão incorporados ao presente documento a título de referência.

[0160] Em algumas concretizações, um ou mais dentre os polinucleotídeos que codificam o polipeptídeo de toxina Cry (ou polipeptídeos IPD101) revelado no presente documento, isoladamente ou empilhados com um ou mais traços adicionais de resistência a inseto, podem ser empilhados com um ou mais traços de entrada adicionais (por exemplo, resistência a herbicidas, resistência a fungos, resistência a vírus, tolerância a estresse, resistência a doenças, esterilidade masculina, resistibilidade de caule e semelhantes) ou traços de saída (por exemplo, aumento de rendimento, amidos modificados, perfil de óleo melhorado, aminoácidos balanceados, alto teor de lisina ou metionina, aumento da digestibilidade, qualidade de fibra melhorada, resistência à seca e semelhantes). Assim, as concretizações de polinucleotídeo podem ser usadas para fornecer um pacote agronômico completo de qualidade de cultura aprimorada com a capacidade para controlar flexivelmente e com baixo custo qualquer número de pragas agronômicas.

[0161] Transgenes úteis para empilhamento incluem, porém sem limitação: transgenes que conferem resistência a um herbicida; transgenes que conferem ou contribuem para uma característica de grão alterada; genes que controlam a esterilidade masculina; genes que criam um sítio para integração de DNA específica de sítio; genes que afetam a resistência a estresse abiótico; genes que conferem rendimento aumentado, genes que conferem digestibilidade de planta; e transgenes que conferem resistência a insetos ou doença.

[0162] Os exemplos de transgenes que conferem resistência a insetos incluem genes que codificam uma proteína de Bacillus thuringiensis, um derivado da mesma ou um polipeptídeo sintético modelado na mesma. Consultar, por exemplo, Geiser, et al., (1986) Gene 48:109, que revelam a clonagem e sequência de nucleotídeos de um gene de delta- endotoxina Bt. Além disso, moléculas de DNA que codificam genes delta-endotoxina podem ser adquiridas junto à American Type Culture Collection (Rockville, Md.), por exemplo, com os Número de Acesso ATCC® 40098, 67136, 31995 e 31998. Outros exemplos não limitantes de transgenes de Bacillus thuringiensis que são modificados geneticamente são dados nas seguintes patentes e pedidos de patente: Patentes número US 5,188,960; 5,689,052; 5,880,275; 5,986,177; 6,023,013, 6,060,594, 6,063,597, 6,077,824, 6,620,988, 6,642,030, 6,713,259, 6,893,826, 7,105,332; 7,179,965, 7,208,474; 7,227,056, 7,288,643, 7,323,556, 7,329,736, 7,449,552, 7,468,278, 7,510,878, 7,521,235, 7,544,862, 7,605,304, 7,696,412, 7,629,504, 7,705,216, 7,772,465, 7,790,846, 7,858,849 e os documentos números WO 1991/14778; WO 1999/31248; WO 2001/12731; WO 1999/24581 e WO 1997/40162.

[0163] Os genes que codificam proteínas pesticidas podem também ser empilhados incluindo, porém sem limitação: proteínas inseticidas de Pseudomonas sp., tais como PSEEN3174 (Monalysin, (2011) PLoS Pathogens, 7:1-13), de cepas de Pseudomonas protegens CHA0 e Pf-5 (anteriormente fluorescens) (Pechy-Tarr, (2008) Environmental Microbiology 10:2.368 a 2.386: número de acesso ao GenBank EU400157); de Pseudomonas taiwanensis (Liu, et al., (2010) J. Agric. Food Chem. 58:12.343 a 12.349) e de Pseudomonas pseudoalcaligenes (Zhang, et al., (2009) Annals of Microbiology 59:45 a 50 e Li, et al., (2007) Plant Cell Tiss. Organ Cult. 89:159 a 168); proteínas inseticidas de Photorhabdus sp. e

Xenorhabdus sp. (Hinchliffe, et al., (2010) The Open Toxinology Journal 3:101 a 118 e Morgan, et al., (2001) Applied and Envir.

Micro. 67:2.062 a 2.069), Patente número US 6,048,838 e Patente número US 6,379,946; um polipeptídeo PIP-1 do documento número US 9,688,730; um polipeptídeo AfIP- 1A e/ou AfIP-1B do documento número US 9,475,847; um polipeptídeo PIP-47 da Publicação número US20160186204; um polipeptídeo IPD045, um polipeptídeo IPD064, um polipeptídeo IPD074, um polipeptídeo IPD075 e um polipeptídeo IPD077 da Publicação PCT WO 2016/114973; um polipeptídeo IPD080 do documento PCT de número de série PCT/US17/56517; um polipeptídeo IPD078, um polipeptídeo IPD084, um polipeptídeo IPD085, um polipeptídeo IPD086, um polipeptídeo IPD087, um polipeptídeo IPD088 e um polipeptídeo IPD089 do documento de número de série PCT/US17/54160; polipeptídeo PIP-72 da Publicação de Patente número US20160366891; um polipeptídeo PtIP-50 e um polipeptídeo PtIP-65 da Publicação número US20170166921; um polipeptídeo IPD098, um polipeptídeo IPD059, um polipeptídeo IPD108, um polipeptídeo IPD109 do documento de número de série US 62/521084; um polipeptídeo PtIP-83 da Publicação número US20160347799; um polipeptídeo PtIP-96 da Publicação número US20170233440; um polipeptídeo IPD079 da Publicação PCT número WO2017/23486; um polipeptídeo IPD082 da Publicação PCT número WO 2017/105987, um polipeptídeo IPD090 do documento de número de série PCT/US17/30602, um polipeptídeo IPD093 do documento de número de série US 62/434020; um polipeptídeo IPD103 do documento de número de série PCT/US17/39376; um polipeptídeo IPD101 do documento de número de série US 62/438179; um polipeptídeo IPD121 do documento de número de série US 62/508,514; e δ-endotoxinas, incluindo, porém sem limitação, as classes Cry1, Cry2, Cry3, Cry4, Cry5, Cry6, Cry7, Cry8, Cry9, Cry10, Cry11, Cry12, Cry13, Cry14, Cry15, Cry16, Cry17, Cry18, Cry19, Cry20, Cry21, Cry22, Cry23, Cry24, Cry25, Cry26, Cry27, Cry 28, Cry 29, Cry 30, Cry31, Cry32, Cry33, Cry34, Cry35,Cry36, Cry37, Cry38, Cry39, Cry40, Cry41, Cry42, Cry43, Cry44, Cry45, Cry 46, Cry47, Cry49, Cry50, Cry51, Cry52, Cry53, Cry 54, Cry55, Cry56, Cry57, Cry58, Cry59, Cry60, Cry61, Cry62, Cry63, Cry64, Cry65, Cry66, Cry67, Cry68, Cry69, Cry70, Cry71, e Cry 72 de genes de δ- endotoxina e dos genes Cyt1 e Cyt2 citolíticos de B. thuringiensis.

[0164] Os exemplos de δ-endotoxinas também incluem, mas sem limitação, proteínas Cry1A de Patentes no U.S. 5,880,275 e 7,858,849; uma toxina DIG-3 ou DIG-11 (deleção N-terminal de 2 variantes de hélice α 1 e/ou hélice α de proteínas Cry, como Cry1A) de Patentes no U,S, 8,304,604 e 8,304,605, Cry1B de Pedido de Patente U.S. de número de série 10/525.318; Cry1C de Patente no U.S. 6,033,874; Cry1F de Patentes no U.S. 5,188,960, 6,218,188; quimeras Cry1A/F de Patentes no U.S. 7,070,982; 6,962,705 e 6,713,063); uma proteína Cry2, como proteína Cry2Ab da Patente no U.S. 7,064,249); uma proteína Cry3A que inclui, mas sem limitação, uma proteína inseticida híbrida manipulada (eHIP) criada fundindo-se as combinações únicas de regiões variáveis e blocos conservados de pelo menos duas proteínas Cry diferentes (Publicação de Pedido de Patente no U.S. 2010/0017914); uma proteína Cry4; uma proteína Cry5; uma proteína Cry6; proteínas Cry8 de Patentes no U.S. 7,329,736, 7,449,552, 7,803,943, 7,476,781, 7,105,332, 7,378,499 e 7,462,760; uma proteína Cry9, como membros das famílias Cry9A, Cry9B, Cry9C, Cry9D, Cry9E, e Cry9F; uma proteína Cry15 de Naimov, et al., (2008) Applied and Environmental Microbiology 74:7.145 a 7.151; uma Cry22, uma proteína Cry34Ab1 das Patentes no U.S. 6,127,180, 6,624,145 e 6,340,593; uma proteína CryET33 e CryET34 das Patentes no U.S. 6,248,535, 6,326,351, 6,399,330, 6,949,626, 7,385,107 e 7,504,229; homólogos de CryET33 e CryET34 da Publicação de Patente no U.S. 2006/0191034, 2012/0278954, e Publicação PCT no WO 2012/139004; uma proteína Cry35Ab1 das Patentes no U.S. 6,083,499, 6,548,291 e 6,340,593; uma proteína Cry46, uma proteína Cry51, uma toxina binária Cry; uma TIC901 ou toxina relacionada; TIC807 do documento no U.S. 2008/0295207; ET29, ET37, TIC809, TIC810, TIC812, TIC127, TIC128 de PCT no US 2006/033867; AXMI-027, AXMI-036 e AXMI-038 da Patente no U.S. 8,236,757; AXMI-031, AXMI-039, AXMI-040, AXMI-049 de US7,923,602; AXMI-018, AXMI-020, e AXMI-021 do documento no WO 2006/083891; AXMI-010 do documento no WO 2005/038032; AXMI-003 do documento no WO 2005/021585; AXMI-008 do documento no US 2004/0250311; AXMI-006 do documento no US 2004/0216186; AXMI-007 do documento no US 2004/0210965; AXMI- 009 do documento no US 2004/0210964; AXMI-014 do documento no US 2004/0197917; AXMI-004 do documento no US 2004/0197916; AXMI-028 e AXMI-029 do documento no WO 2006/119457; AXMI- 007, AXMI-008, AXMI-0080rf2, AXMI-009, AXMI-014 e AXMI-004 do documento no WO 2004/074462; AXMI-150 da Patente no U.S. 8,084,416; AXMI-205 do documento no US20110023184; AXMI-011,

AXMI-012, AXMI-013, AXMI-015, AXMI-019, AXMI-044, AXMI-037, AXMI-043, AXMI-033, AXMI-034, AXMI-022, AXMI-023, AXMI-041, AXMI-063, e AXMI-064 do documento no US 2011/0263488; AXMI- R1 e proteínas relacionadas do documento no US 2010/0197592; AXMI221Z, AXMI222z, AXMI223z, AXMI224z e AXMI225zdo documento no WO 2011/103248; AXMI218, AXMI219, AXMI220, AXMI226, AXMI227, AXMI228, AXMI229, AXMI230 e AXMI231 do documento no WO11/103247; AXMI-115, AXMI-113, AXMI-005, AXMI-163 e AXMI-184 da Patente no U.S. 8,334,431; AXMI-001, AXMI-002, AXMI-030, AXMI-035 e AXMI-045 do documento no US 2010/0298211; AXMI-066 e AXMI-076 do documento no US2009/0144852; AXMI128, AXMI130, AXMI131, AXMI133, AXMI140, AXMI141, AXMI142, AXMI143, AXMI144, AXMI146, AXMI148, AXMI149, AXMI152, AXMI153, AXMI154, AXMI155, AXMI156, AXMI157, AXMI158, AXMI162, AXMI165, AXMI166, AXMI167, AXMI168, AXMI169, AXMI170, AXMI171, AXMI172, AXMI173, AXMI174, AXMI175, AXMI176, AXMI177, AXMI178, AXMI179, AXMI180, AXMI181, AXMI182, AXMI185, AXMI186, AXMI187, AXMI188, AXMI189 da Patente no U.S. 8,318,900; AXMI079, AXMI080, AXMI081, AXMI082, AXMI091, AXMI092, AXMI096, AXMI097, AXMI098, AXMI099, AXMI100, AXMI101, AXMI102, AXMI103, AXMI104, AXMI107, AXMI108, AXMI109, AXMI110, AXMI111, AXMI112, AXMI114, AXMI116, AXMI117, AXMI118, AXMI119, AXMI120, AXMI121, AXMI122, AXMI123, AXMI124, AXMI1257, AXMI1268, AXMI127, AXMI129, AXMI164, AXMI151, AXMI161, AXMI183, AXMI132, AXMI138, AXMI137 do documento no US 2010/0005543; e proteínas Cry, como Cry1A e Cry3A que têm sítios proteolíticos modificados da Patente no U.S. 8,319,019; e uma proteína de toxina Cry1Ac, Cry2Aa e Cry1Ca de estirpe de Bacillus thuringiensis VBTS 2528 da Publicação de Pedido de Patente no U.S. 2011/0064710. Outras proteínas Cry são bem conhecidas por um versado na técnica (consultar Crickmore, et al., “Bacillus thuringiensis toxin nomenclature” (2011), em lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/ que pode ser acessado na rede mundial de computadores com o uso do prefixo “www”). A atividade inseticida de proteínas Cry é bem conhecida por um versado na técnica (para análise, consultar van Frannkenhuyzen, (2009) J.

Invert.

Path. 101:1 a 16). O uso de proteínas Cry como traços de planta transgênica é bem conhecido por um versado na técnica, e as plantas transgênicas Cry incluindo, porém sem limitação, Cry1Ac, Cry1Ac+Cry2Ab, Cry1Ab, Cry1A.105, Cry1F, Cry1Fa2, Cry1F+Cry1Ac, Cry2Ab, Cry3A, mCry3A, Cry3Bb1, Cry34Ab1, Cry35Ab1, Vip3A, mCry3A, Cry9c e CBI-Bt, receberam aprovação regulamentadora (consultar, Sanahuja, (2011) Plant Biotech Journal 9:283 a 300 e o banco de dados de culturas CERA (2010) GM Center for Environmental Risk Assessment (CERA), ILSI Research Foundation, Washington D.C. em cera- gmc.org/index.php?action=gm_crop_database que pode ser acessado pela rede mundial de computadores com o uso do prefixo "www"). Mais de uma proteína pesticida bem conhecida por um versado na técnica também pode ser expressa em plantas como Vip3Ab e Cry1Fa (US2012/0317682), Cry1BE e Cry1F (US2012/0311746), Cry1CA e Cry1AB (US2012/0311745), Cry1F e CryCa (US2012/0317681), Cry1DA e Cry1BE (US2012/0331590), Cry1DA e Cry1Fa (US2012/0331589), Cry1AB e Cry1BE (US2012/0324606) e Cry1Fa e Cry2Aa, Cry1I ou Cry1E

(US2012/0324605). As proteínas pesticidas também incluem lipases que incluem lipídio acil hidrolases da Patente número US 7,491,869, e colesterol oxidases, tal como de Streptomyces (Purcell et al. (1993) Biochem Biophys Res Commun 15:1.406 a 1.413). As proteínas pesticidas também incluem toxinas VIP (proteínas inseticidas vegetativas) das Patentes número US 5,877,012, 6,107,279, 6,137,033, 7,244,820, 7,615,686 e 8,237,020 e semelhantes.

Outras proteínas VIP são bem conhecidas por um versado na técnica (consultar lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/vip.html que pode ser acessado na rede mundial de computadores com o uso do prefixo "www"). As proteínas pesticidas também incluem proteínas de complexo de toxina (TC), obteníveis a partir de organismos, tais como Xenorhabdus, Photorhabdus e Paenibacillus (consultar as Patentes número US 7,491,698 e 8,084,418). Algumas proteínas TC têm atividade inseticida "autônoma", e outras proteínas TC melhoram a atividade das toxinas autônomas produzidas pelo mesmo dado organismo.

A toxicidade de uma proteína TC "autônoma" (de Photorhabdus, Xenorhabdus ou Paenibacillus, por exemplo) pode ser melhorada por um ou mais "potenciadores" de proteína TC derivados de um organismo-fonte de um gênero diferente.

Há três tipos principais de proteínas TC.

Conforme referido no presente documento, as proteínas de Classe A ("Proteína A") são toxinas autônomas.

As proteínas de Classe B ("Proteína B") e as proteínas de Classe C ("Proteína C") melhoram a toxicidade das proteínas de Classe A.

Os exemplos de proteínas de Classe A são TcbA, TcdA, XptA1 e XptA2. Os exemplos de proteínas de Classe B são TcaC, TcdB, XptB1Xb e

XptC1Wi. Os exemplos de proteínas de Classe C são TccC, XptC1Xb e XptB1Wi. As proteínas pesticidas também incluem proteínas de veneno de aranha, cobra e escorpião. Os exemplos de peptídeos de veneno de aranha incluem, porém sem limitação, peptídeos de licotoxina-1 e mutantes dos mesmos (Patente no US 8,334,366).

[0165] Os transgenes adicionais que conferem resistência a insetos podem regular descendentemente a expressão de genes-alvo em espécies de praga de inseto por moléculas de ácido ribonucleico (RNA) interferentes através de interferência de RNA. Interferência de RNA refere-se ao processo de silenciamento de genes pós-transcrição específico para sequências em animais mediado por RNAs de interferência curtos (siRNAs) (Fire, et al., (1998) Nature 391:806). Os transgenes de RNAi podem incluir, porém sem limitação, a expressão de moléculas de dsRNA, siRNA, miRNA, iRNA, RNA antissenso ou RNA senso que regulam descendentemente a expressão dos genes-alvo em insetos- praga. A Publicação PCT WO 2007/074405 descreve métodos para inibir a expressão de genes-alvo em pragas invertebradas, incluindo besouro da batata do Colorado. A Publicação PCT WO 2005/110068 descreve métodos para inibir a expressão de genes-alvo em pragas invertebradas, incluindo, em particular, verme da raiz do milho ocidental, como um meio para controlar a infestação de insetos. Além disso, a Publicação PCT WO 2009/091864 descreve composições e métodos para a supressão de genes-alvo de espécies de inseto-praga, incluindo pragas do gênero Lygus.

[0166] Transgenes de RNAi são fornecidos para alvejar a subunidade de ATPase H vacuolar, úteis para controlar uma população de pragas de Coleópteros e infestação conforme descrito na Publicação de Pedido de Patente no U.S. 2012/0198586. A Publicação PCT WO 2012/055982 descreve um ácido ribonucleico (RNA ou RNA de fita dupla) que inibe ou regula de modo decrescente a expressão de um gene-alvo que codifica: uma proteína ribossômica de inseto, tal como a proteína ribossômica L19, a proteína ribossômica L40 ou a proteína ribossômica S27A; uma subunidade de proteassoma de inseto, tal como a proteína Rpn6, a Pros 25, a proteína Rpn2, a proteína de subunidade beta 1 de proteassoma ou a proteína Pros beta 2; um β-coatômero de inseto da vesícula COPI, o γ- coatômero da vesícula COPI, a proteína de β'-coatômero ou o ζ-coatômero da vesícula COPI; um proteína Tetraspanina 2 A de inseto que é uma proteína de domínio de transmembrana putativa; uma proteína de inseto que pertence à família de actina, tal como Actina 5C; uma proteína ubiquitina-5E de inseto; uma proteína Sec23 de inseto que é um ativador de GTPase envolvido em transporte de proteína intracelular; uma proteína plissada de inseto que é uma miosina não convencional que está envolvida em atividade motora; uma proteína crooked neck de inseto que está envolvida na regulação de splicing de mRNA alternativo nuclear; uma proteína de subunidade G de H+-ATPase vacuolar de inseto e uma Tbp-1 de inseto, tal como uma proteína de ligação de Tat.

A Publicação PCT WO 2007/035650 descreve um ácido ribonucleico (RNA ou RNA de fita dupla) que inibe ou regula de modo decrescente a expressão de um gene-alvo que codifica

Snf7. A Publicação de Pedido de Patente no US 2011/0054007 descreve elementos de silenciamento de polinucleotídeos que alvejam RPS10. A Publicação PCT WO 2016/205445 descreve elementos de silenciamento de polinucleotídeo que reduzem a fecundidade, com polinucleotídeos-alvo, incluindo NCLB, MAEL, BOULE e VgR.

A Publicação de Pedido de Patente no US 2014/0275208 e US2015/0257389 descreve elementos de silenciamento de polinucleotídeo que alvejam RyanR e PAT3. As publicações PCT WO 2016/138106, WO 2016/060911, WO 2016/060912, WO 2016/060913 e WO 2016/060914 descrevem elementos de silenciamento de polinucleotídeo que alvejam moléculas de ácido nucleico de subunidade de coatômero COPI que conferem resistência às pragas Coleóptera e Hemíptera.

As Publicações de Pedido de Patente no US 2012/029750, US 20120297501 e 2012/0322660 descrevem ácidos ribonucleicos interferentes (RNA ou RNA de fita dupla) que funcionam mediante absorção por uma espécie de inseto-praga para regular de modo decrescente a expressão de um gene-alvo no dito inseto-praga, em que o RNA compreende pelo menos um elemento de silenciamento, em que o elemento de silenciamento é uma região de RNA de fita dupla que compreende fitas complementares aneladas, em que uma fita compreende ou consiste em uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos parcialmente complementar a uma sequência de nucleotídeos alvo dentro do gene-alvo.

A Publicação de Pedido de Patente no U.S. 2012/0164205 descreve alvos potenciais para ácidos ribonucleicos de fita dupla interferentes para inibir pragas invertebradas incluindo: uma Sequência Homóloga Chd3, uma Sequência Homóloga de Beta-Tubulina, uma Sequência Homóloga de ATPase V de 40 kDa, uma Sequência Homóloga de EF1α, uma Sequência Homóloga p28 de Subunidade de Proteassoma 26S, uma Sequência Homóloga de Hidrolase de Epóxido de Hormônio Juvenil, uma Sequência Homóloga de Proteína de Canal de Cloreto Dependente de Inchaço, uma Sequência Homóloga de Proteína Glicose-6-Fosfato 1-Desidrogenase, uma Sequência Homóloga de Proteína Act42A, uma Sequência Homóloga de Fator 1 de Ribosilação de ADP, uma Sequência Homóloga de Proteína de Fator IIB de Transcrição, umas Sequências Homólogas de Quitinase, uma Sequência Homóloga de Enzima de Conjugação de Ubiquitina, uma Sequência Homóloga de Gliceraldeído-3- Fosfato Desidrogenase, uma Sequência Homóloga de Ubiquitina B, um Homólogo de Esterase de Hormônio Juvenil e uma Sequência Homóloga de Alfa Tubulina. Uso em Controle Pesticida

[0167] Os métodos gerais para empregar cepas que compreendem uma sequência de ácidos nucleicos das concretizações ou uma variante da mesma em controle de pesticida ou na modificação genética de outros organismos como agentes pesticidas são conhecidos na técnica.

[0168] Os hospedeiros de micro-organismos que são conhecidos por ocuparem a "fitosfera" (filoplano, filosfera, rizosfera e/ou rizoplana) de uma ou mais culturas de interesse podem ser selecionados. Esses micro-organismos são selecionados de modo a terem capacidade para competir com sucesso no ambiente específico com os micro-organismos do tipo selvagem, fornecem manutenção e expressão estáveis do gene (ou genes) que expressa um ou mais dos polipeptídeos de toxina Cry e, desejavelmente, fornecem proteção melhorada do pesticida contra degradação e inativação ambiental.

[0169] Alternativamente, o polipeptídeo de toxina Cry é produzido introduzindo um gene heterólogo em um hospedeiro celular. A expressão do gene heterólogo resulta, direta ou indiretamente, na produção intracelular e manutenção do pesticida. Estas células são então tratadas em condições que prolongam a atividade da toxina produzida na célula quando a célula é aplicada ao ambiente da praga-alvo (ou pragas-alvo). O produto resultante retém a toxicidade da toxina. Esses polipeptídeos de toxina Cry naturalmente encapsulados podem então ser formulados de acordo com técnicas convencionais para a aplicação no ambiente hospedando uma praga-alvo, por exemplo, solo, água e folhagem de plantas. Consultar, por exemplo, o documento no EPA 0192319 e as referências citadas no mesmo. Composições Pesticidas

[0170] Em algumas concretizações, os ingredientes ativos podem ser aplicados na forma de composições e podem ser aplicados na área de cultura ou planta a ser tratada, simultaneamente ou em sucessão, com outros compostos. Esses compostos podem ser fertilizantes, exterminadores de gramíneas, crioprotetores, tensoativos, detergentes, sabonetes pesticidas, óleos inativos, polímeros e/ou formulações de veículos de liberação prolongada ou biodegradáveis que permitem a dosagem a longo prazo de uma área visada após uma única aplicação da formulação. Os mesmos também podem ser herbicidas seletivos, inseticidas químicos, virucidas, microbiocidas, amebicidas, pesticidas,

fungicidas, bactericidas, nematocidas, moluscicidas ou misturas de diversas dessas preparações, se desejado, juntamente com carreadores agricolamente aceitáveis adicionais, tensoativos ou adjuvantes de promoção de aplicação empregados de modo costumeiro na técnica da formulação. Os carreadores e adjuvantes adequados podem ser sólidos ou líquidos e correspondem às substâncias empregadas de modo comum na tecnologia de formulação, por exemplo, substâncias minerais naturais ou regeneradas, solventes, dispersantes, agentes umectantes, acentuadores de pegajosidade, ligantes ou fertilizantes. De modo similar, as formulações podem ser preparadas em “iscas” comestíveis ou fabricadas em “armadilhas” para pragas para permitir alimentação ou ingestão da formulação pesticida por uma praga-alvo.

[0171] Os métodos de aplicação de um ingrediente ativo ou uma composição agroquímica que contém pelo menos um dos polipeptídeos de toxina Cry produzidos através das cepas bacterianas incluem aplicação em folha, revestimento de semente e aplicação em solo. O número de aplicações e a taxa de aplicação dependem da intensidade da infestação pela praga correspondente.

[0172] A composição pode ser formulada como um pó, poeira, pélete, grânulo, aspersão, emulsão, coloide, solução ou semelhantes e pode ser preparada por meios convencionais, tais como dessecação, liofilização, homogeneização, extração, filtração, centrifugação, sedimentação ou concentração de uma cultura de células que compreende o polipeptídeo. Em todas as tais composições que contêm pelo menos um tal polipeptídeo pesticida, o polipeptídeo pode estar presente em uma concentração de cerca de 1% a cerca de 99% em peso.

[0173] As pragas de Lepidópteros, Diptera, Heteroptera, nematódeos, Hemiptera ou Coleópteros podem ser exterminadas ou reduzidas em números em uma dada área pelos métodos da revelação ou podem ser aplicados de modo profilático em uma área ambiental para impedir a infestação por uma praga suscetível. Preferencialmente, a praga ingere ou entra em contato com uma quantidade eficaz para pesticida do polipeptídeo. "Quantidade eficaz como pesticida", conforme usado no presente documento, refere-se a uma quantidade do pesticida que tem a capacidade para exterminar pelo menos uma praga ou reduzir de modo notável o crescimento, alimentação ou desenvolvimento fisiológico normal de praga. Essa quantidade irá variar dependendo de fatores tais como, por exemplo, as pragas-alvo específicas a serem controladas, o ambiente específico, a localização, a planta, cultura ou local agrícola a ser tratado, as condições ambientais e o método, taxa, concentração, estabilidade e quantidade de aplicação da composição polipeptídica eficaz como pesticida. As formulações também podem variar em relação a condições climáticas, considerações ambientais e/ou frequência de aplicação e/ou severidade de infestação da praga.

[0174] As composições pesticidas descritas podem ser feitas formulando-se a célula bacteriana, cristal e/ou suspensão de esporo ou componente de proteína isolada com o carreador aceitável de modo agrícola desejado. As composições podem ser formuladas antes da administração em meios apropriados, como liofilizadas, secas por congelamento, dessecadas ou em um carreador aquoso, meio ou diluente adequado, tal como solução salina ou outro tampão.

As composições formuladas podem estar na forma de uma poeira ou material granular ou uma suspensão em óleo (vegetal ou mineral) ou água ou emulsões de óleo/água ou como um pó umectante ou em combinação com qualquer outro material carreador adequado para aplicação agrícola.

Os carreadores agrícolas adequados podem ser sólidos ou líquidos e são bem conhecidos na técnica.

O termo "carreador agricolamente aceitável" abrange todos os adjuvantes, componentes inertes, dispersantes, tensoativos, acentuadores de pegajosidade, ligantes, etc. que são comumente usados na tecnologia de formulação de pesticida; esses são bem conhecidos por aqueles versados na técnica de formulação de pesticida.

As formulações podem ser misturadas com um ou mais adjuvantes sólidos ou líquidos e preparadas por vários meios, por exemplo, por mistura de modo homogêneo, mescla e/ou trituração da composição pesticida com adjuvantes adequados com o uso de técnicas de formulação convencionais.

As formulações e métodos de aplicação adequados são descritos na Patente no US 6,468,523. As plantas também podem ser tratadas com uma ou mais composições químicas, incluindo um ou mais herbicidas, inseticidas ou fungicidas.

As composições químicas exemplificativas incluem: Herbicidas de Frutas/Vegetais: Atrazina, Bromacil, Diuron, Glifosato, Linuron, Metribuzina, Simazina, Trifluralina, Fluazifope, Glufosinato, Halossulfurom Gowan, Paraquate, Propizamida,

Setoxidim, Butafenacil, Halossulfurom, Indaziflam; Inseticidas de frutas/vegetais: Aldicarb, Bacillus thuriengiensis, Carbaril, Carbofurano, Clorpirifos, Cipermetrina, Deltametrina, Diazinon, Malation, Abamectina, Ciflutrina/beta-ciflutrina, Esfenvalerato, Lambda- cialotrina, Acequinocil, Bifenazato, Metoxifenozida, Novaluron, Cromafenozida, Tiacloprida, Dinotefurano, FluaCripirim, Tolfenpirad, Clotianidina, Espirodiclofeno, Gama-cialotrina, Espiromesifeno, Espinosad, Rinaxipir, Ciazipir, Espinoteram, Triflumuron, Espirotetramate, Imidacloprida, Flubendiamida, Tiodicarb, Metaflumizona, Sulfoxaflor, Ciflumetofeno, Cianopirafeno, Imidacloprida, Clotianidina, Tiametoxam, Espinotoram, Tiodicarb, Flonicamida, Metiocarb, benzoato de Emamectina, Indoxacarb, Fostiazato, Fenamifos, Cadusafos, Piriproxifeno, Fenbutatina-óxido, Hexitiazox, Metomil, 4-[[(6- Cloropiridin-3-il)metil](2,2-difluoretil)amino]furan-2(5H)- ona; Fungicidas de Frutas/Vegetais: Carbendazim, Clorotalonil, EBDCs, Enxofre, Tiofanato metílico, Azoxistrobina, Cimoxanil, Fluazinam, Fosetil, Iprodiona, Cresoxim metílico, Metalaxil/mefenoxam, Trifloxistrobina, Etaboxam, Iprovalicarb, Trifloxistrobina, Fenexamida, Fumarato de oxpoconazol, ciazofamida, Fenamidona, Zoxamida, Picoxistrobina, Piraclostrobina, Ciflufenamida, Boscalida; Herbicidas de Cereais: Isoproturon, Bromoxinil, Ioxinil, Fenóxidos, Clorossulfuron, Clodinafop, Diclofop, Diflufenican, Fenoxaprop, Florasulam, Fluoroxipir, Metsulfuron, Triassulfuron, Flucarbazona, Iodossulfuron, Propoxicarbazona, Picolinafeno, Mesossulfuron,

Beflubutamida, Pinoxadeno, Amidossulfuron, Tifensulfuron Metila, Tribenuron, Flupirsulfuron, Sulfossulfuron, Pirassulfotol, Piroxsulam, Flufenacet, Tralcoxidim, Piroxassulfona; Fungicidas de Cereais: Carbendazim, Clorotalonil, Azoxistrobina, Ciproconazol, Ciprodinil, Fenpropimorf, Epoxiconazol, Cresoxim metílico, Quinoxifeno, Tebuconazol, Trifloxistrobina, Simeconazol, Picoxistrobina, Piraclostrobina, Dimoxistrobina, Protioconazol, Fluoxastrobina; Inseticidas de Cereais: Dimetoato, Lambda- cialotrina, Deltametrina, alfa-Cipermetrina, β-ciflutrina, Bifentrina, Imidacloprida, Clotianidina, Tiametoxam, Tiacloprida, Acetamiprida, Dinetofurano, Clorpirifos, Metamidofos, Oxidemeton metílico, Pirimicarb, Metiocarb; Herbicidas de Maís: Atrazina, Alaclor, Bromoxinil, Acetoclor, Dicamba, Clopiralida, (S-)Dimetenamida, Glufosinato, Glifosato, Isoxaflutol, (S-)Metolaclor, Mesotriona, Nicossulfuron, Primissulfuron, Rimsulfuron, Sulcotriona, Foramsulfuron, Topramezona, Tembotriona, Saflufenacil, Tiencarbazona, Flufenacet, Piroxassulfona; Inseticidas de Maís: Carbofurano, Clorpirifos, Bifentrina, Fipronil, Imidacloprida, Lambda-Cialotrina, Teflutrina, Terbufos, Tiametoxam, Clotianidina, Espiromesifeno, Flubendiamida, Triflumuron, Rinaxipir, Deltametrina, Tiodicarb, β-Ciflutrina, Cipermetrina, Bifentrina, Lufenuron, Triflumoron, Teflutrina, Tebupirimifos, Etiprol, Ciazipir, Tiacloprida, Acetamiprida, Dinetofurano, Avermectina, Metiocarb, Espirodiclofeno, Espirotetramate; Fungicidas de Maís: Fenitropano, Tiram, Protioconazol, Tebuconazol, Trifloxistrobina; Herbicidas de Arroz:

Butaclor, Propanil, Azimsulfuron, Bensulfuron, Cialofop, Daimuron, Fentrazamida, Imazossulfuron, Mefenacet, Oxaziclomefona, Pirazossulfuron, Piributicarb, Quinclorac, Tiobencarb, Indanofano, Flufenacet, Fentrazamida, Halossulfuron, Oxaziclomefona, Benzobiciclon, Piriftalida, Penoxsulam, Bispiribac, Oxadiargil, Etoxissulfuron, Pretilaclor, Mesotriona, Tefuriltriona, Oxadiazona, Fenoxaprop, Pirimissulfano; Inseticidas de arroz: Diazinon, Fenitrotiona, Fenobucarb, Monocrotofos, Benfuracarb, Buprofezina, Dinotefurano, Fipronil, Imidacloprida, Isoprocarb, Tiacloprida, Cromafenozida, Tiacloprida, Dinotefurano, Clotianidina, Etiprol, Flubendiamida, Rinaxipir, Deltametrina, Acetamiprida, Tiametoxam, Ciazipir, Espinosad, Espinotoram, Benzoato de Emamectina, Cipermetrina, Clorpirifos, Cartap, Metamidofos, Etofenprox, Triazofos, 4-[[(6-Cloropiridin-3-il)metil](2,2-difluoretil) amino]furan-2(5H)-ona, Carbofurano, Benfuracarb; Fungicidas de Arroz: Tiofanato metílico, Azoxistrobina, Carpropamida, Edifenfos, Ferimzona, Iprobenfos, Isoprotiolano, Pencicuron, Probenazol, Piroquilon, Triciclazol, Trifloxistrobina, Diclocimet, Fenoxanil, Simeconazol, Tiadinil; Herbicidas de Algodão: Diuron, Fluometuron, MSMA, Oxifluorfeno, Prometrina, Trifluralina, Carfentrazona, Cletodim, Fluazifop-butila, Glifosato, Norflurazon, Pendimetalina, Piritiobac sódico, Trifloxissulfuron, Tepraloxidim, Glufosinato, Flumioxazina, Tidiazuron; Inseticidas de Algodão: Acefato, Aldicarb, Clorpirifos, Cipermetrina, Deltametrina, Malation, Monocrotofos, Abamectina, Acetamiprida, Benzoato de Emamectina, Imidacloprida,

Indoxacarb, Lambda-Cialotrina, Espinosad, Tiodicarb, Gama- Cialotrina, Espiromesifeno, Piridalil, Flonicamida, Flubendiamida, Triflumuron, Rinaxipir, Beta-Ciflutrina, Espirotetramat, Clotianidina, Tiametoxam, Tiacloprida, Dinetofurano, Flubendiamida, Ciazipir, Espinosad, Espinotoram, gama Cialotrina, 4-[[(6-Cloropiridin-3-il) metil](2,2-difluoretil)amino]furan-2(5H)-ona, Tiodicarb, Avermectina, Flonicamida, Piridalil, Espiromesifeno, Sulfoxaflor, Profenofos, Triazofos, Endossulfano; Fungicidas de algodão: Etridiazol, Metalaxil, Quintozeno; Herbicidas de Soja: Alaclor, Bentazona, Trifluralina, Clorimuron Etílico, Cloransulam Metílico, Fenoxaprop, Fomesafeno, Fluazifop, Glifosato, Imazamox, Imazaquin, Imazetapir, (S-)Metolaclor, Metribuzina, Pendimetalina, Tepraloxidim, Glufosinato; Inseticidas de soja: Lambda-cialotrina, Metomil, Paration, Tiocarb, Imidacloprida, Clotianidina, Tiametoxam, Tiacloprida, Acetamiprida, Dinetofurano, Flubendiamida, Rinaxipir, Ciazipir, Espinosad, Espinotoram, Benzoato de Emamectina, Fipronil, Etiprol, Deltametrina, β-Ciflutrina, gama e lambda Cialotrina, 4-[[(6-Cloropiridin-3-il)metil] (2,2-difluoretil)amino]furan-2(5H)-ona, Espirotetramat, Espinodiclofeno, Triflumuron, Flonicamida, Tiodicarb, beta- Ciflutrina; Fungicidas de Soja: Azoxistrobina, Ciproconazol, Epoxiconazol, Flutriafol, Piraclostrobina, Tebuconazol, Trifloxistrobina, Protioconazol, Tetraconazol; Herbicidas de Beterraba sacarina: Cloridazon, Desmedifam, Etofumesato, Fenmedifam, Trialato, Clopiralida, Fluazifop, Lenacil, Metamitron, Quinmerac, Cicloxidim, Triflussulfuron, Tepraloxidim, Quizalofope; Inseticidas de beterraba sacarina: Imidacloprida, Clotianidina, Tiametoxam, Tiacloprida, Acetamiprida, Dinetofurano, Deltametrina, β- Ciflutrina, gama/lambda Cialotrina, 4-[[(6-Cloropiridin-3- il)metil](2,2-difluoretil)amino]furan-2(5H)-ona, Teflutrina, Rinaxipir, Ciaxipir, Fipronil, Carbofurano; Herbicidas de canola: Clopiralida, Diclofop, Fluazifop, Glufosinato, Glifosato, Metazaclor, Trifluralina Etametsulfuron, Quinmerac, Quizalofop, Cletodim, Tepraloxidim; Fungicidas de Canola: Azoxistrobina, Carbendazim, Fludioxonil, Iprodiona, Procloraz, Vinclozolina; Inseticidas de Canola: Organofosfatos de carbofurano, Piretroides, Tiacloprida, Deltametrina, Imidacloprida, Clotianidina, Tiametoxam, Acetamiprida, Dinetofurano, β-Ciflutrina, gama e lambda Cialotrina, tau-Fluvaleriato, Etiprol, Espinosad, Espinotoram, Flubendiamida, Rinaxipir, Ciazipir, 4-[[(6- Cloropiridin-3-il)metil](2,2-difluoretil)amino]furan-2(5H)- ona.

[0175] Em algumas concretizações, o herbicida é Atrazina, Bromacil, Diuron, Clorsulfuron, Metsulfuron, Tifensulfuron Metil, Tribenuron, Acetoclor, Dicamba, Isoxaflutol, Nicosulfuron, Rimsulfuron, Piritiobaque- sódico, Flumioxazin, Clorimuron-Etil, Metribuzin, Quizalofop, S-metolaclor, Hexazinona ou combinações dos mesmos.

[0176] Em algumas concretizações, o inseticida é Esfenvalerato, Clorantraniliprol, Metomil, Indoxacarbe, Oxamil ou combinações dos mesmos.

Atividade pesticida e inseticida

[0177] "Praga" inclui, porém sem limitação, insetos, fungos, bactérias, nematódeos, ácaros, carrapatos e semelhantes. Pragas de insetos incluem insetos selecionados dentre as ordens Coleoptera, Diptera, Hymenoptera, Lepidoptera, Mallophaga, Homoptera, Hemiptera, Orthroptera, Thysanoptera, Dermaptera, Isoptera, Anoplura, Siphonaptera, Trichoptera, etc., particularmente Lepidoptera e Coleoptera.

[0178] Aqueles versados na técnica reconhecerão que nem todos os compostos são igualmente eficazes contra todas as pragas. Os compostos das concretizações exibem atividade contra insetos-praga, que podem incluir pragas agronômicas, florestais, de estufas, viveiros, plantas ornamentais, alimentos e fibras, de saúde pública e animal, de estrutura doméstica e comercial, domésticas e de produtos armazenados de importância econômica.

[0179] Larvas da ordem Lepidóptera incluem, porém sem limitação, lagartas-militares, larvas cortadoras, lagartas falsa-medideiras e lagartas da maçã-do-algodoeiro na família Noctuidae Spodoptera frugiperda JE Smith (lagarta-militar do outono); S. exigua Hübner (lagarta- militar da beterraba); S. litura Fabricius (lagarta cortadora do tabaco, lagarta-rosca de tabaco); Mamestra configurata Walker (lagarta-militar bertha); M. brassicae Linnaeus (traça do repolho); Agrotis ipsilon Hufnagel (lagarta-rosca); A. orthogonia Morrison (lagarta-rosca ocidental); A. subterranea Fabricius (lagarta-rosca granulada); Alabama argillacea Hübner (Curuquerê-do- algodoeiro); Trichoplusia ni Hübner (falsa-medideira da couve); Pseudoplusia includens Walker (falsa-medideira da soja); Anticarsia gemmatalis Hübner (lagarta-da-soja); Hypena scabra Fabricius (verme-de-trevo verde); Heliothis virescens Fabricius (lagarta da maça); Pseudaletia unipuncta Haworth (lagarta-militar); Athetis mindara Barnes e Mcdunnough (lagarta-rosca de pele áspera); Euxoa messoria Harris (lagarta-rosca de lado escuro); Earias insulana Boisduval (lagarta capulho espinhosa); E. vittella Fabricius (lagarta capulho pontilhada); Helicoverpa armigera Hübner (lagarta capulho americana); H. zea Boddie (lagarta de espiga de milho ou lagarta de capulho de algodão); Melanchra picta Harris (lagartas zebra); Egira (Xylomyges) curialis Grote (lagarta-rosca de citros); brocas, traça-das-paredes, lagartas cone e skeletonizers da famíliaPyralidae Ostrinia nubilalis Hübner (broca de milho europeia); Amyelois transitella Walker (lagarta de laranja naval); Anagasta kuehniella Zeller (Traça do trigo mediterrâneo); Cadra cautella Walker (traça-do-cacau); Chilo suppressalis Walker (broca de caule de arroz); C. partellus, (broca de sorgo); Corcyra cephalonica Stainton (traça de arroz); Crambus caliginosellus Clemens (lagarta de rede de raiz de milho); C. teterrellus Zincken (lagarta que tece teia de gramíneas); Cnaphalocrocis medinalis Guenée (traça tortricídea de arroz); Desmia funeralis Hübner (dobrador de folha de uva); Diaphania hyalinata Linnaeus (lagarta de melão); D. nitidalis Stoll (lagarta de picles); Diatraea grandiosella Dyar (broca de milho sudoeste), D. saccharalis Fabricius (broca de cana-de-açúcar); Eoreuma loftini Dyar (broca de arroz mexicano); Ephestia elutella Hübner (traça do tabaco

(cacau); Galleria mellonella Linnaeus (traça grande da cera); Herpetogramma licarsisalis Walker (lagarta de rede de céspede); Homoeosoma electellum Hulst (traça de girassol); Elasmopalpus lignosellus Zeller (broca-do-colo); Achroia grisella Fabricius (traça da cera); Loxostege sticticalis Linnaeus (lagarta de rede de beterraba); Orthaga thyrisalis Walker (mariposa teia da árvore do chá); Maruca testulalis Geyer (broca de feijão); Plodia interpunctella Hübner (Mariposa de refeição Indiana); Scirpophaga incertulas Walker (broca do tronco amarelo); Udea rubigalis Guenée (traça do aipo); e lagartas enroladeiras, lagartas de broto, lagartas de semente e lagartas de fruta na família Tortricidae Acleris gloverana Walsingham (lagarta de broto de cabeça preta do oeste); A. variana Fernald (lagarta de broto de cabeça preta do leste); Archips argyrospila Walker (lagarta enroladeira de árvore frutífera); A. rosana Linnaeus (lagarta enroladeira europeia); e outras espécies Archips, Adoxophyes orana Fischer von Rösslerstamm (traça tortricídea dos frutos de verão); Cochylis hospes Walsingham (mariposa bandeada de girassol); Cydia latiferreana Walsingham (traça da avelaneira); C. pomonella Linnaeus (Bichado das 5 pomoideas); Platynota flavedana Clemens (lagarta enroladeira de folha variegado); P. stultana Walsingham (lagarta enroladeira de folha de onívoro); Lobesia botrana Denis & Schiffermüller (Eudémis); Spilonota ocellana Denis & Schiffermüller (traça vermelha dos 10 gomos); Endopiza viteana Clemens (mariposa de bagas de uva); Eupoecilia ambiguella Hübner (Cochilis); Bonagota salubricola Meyrick (Lagarta enroladeira da maçã);

Grapholita molesta Busck (Traça oriental do pessegueiro); Suleima helianthana Riley (mariposa de broto de girassol); Argyrotaenia spp.; Choristoneura spp.

[0180] Outras pragas agronômicas selecionadas da ordem Lepidóptera incluem, porém sem limitação, Alsophila pometaria Harris (locustas); Anarsia lineatella Zeller (broca do pêssego); Anisota senatoria J.E. Smith (lagarta de carvalho de listras laranjas); Antheraea pernyi Guérin- Méneville (Traça de Tussah de Carvalho Chinesa); Bombyx mori Linnaeus (Mariposa-de-seda); Bucculatrix thurberiella Busck (Lagarta mineradora das folhas); Colias eurytheme Boisduval (lagarta de alfafa); Datana integerrima Grote & Robinson (lagarta de nogueira); Dendrolimus sibiricus Tschetwerikov (Mariposa-de-seda siberiana), Ennomos subsignaria Hübner (lagarta de olmo); Erannis tiliaria Harris (mede-palmo de tília); Euproctis chrysorrhoea Linnaeus (mariposa de cauda marrom); Harrisina americana Guérin-Méneville (esqueletizador de folha de uva); Hemileuca oliviae Cockrell (lagarta de faixa); Hyphantria cunea Drury (larva de teias de outono); Keiferia lycopersicella Walsingham (oxiúro de tomate); Lambdina fiscellaria fiscellaria Hulst (lagarta- enroladora de cicuta do leste); L. fiscellaria lugubrosa Hulst (lagarta-enroladora de cicuta do oeste); Leucoma salicis Linnaeus (mariposa de cetim); Lymantria dispar Linnaeus (mariposa-cigana); Manduca quinquemaculata Haworth (mariposa falcão de 5 manchas, mandarová de tomate); M. sexta Haworth (mandarová de tomate, mandarová de tabaco); Operophtera brumata Linnaeus (traça de inverno); Paleacrita vernata Peck (lagarta de gangrena de primavera); Papilio cresphontes Cramer (larva de borboleta rabo de andorinha gigante); Phryganidia californica Packard (lagarta de carvalho da Califórnia); Phyllocnistis citrella Stainton (minerador de folha de citros); Phyllonorycter blancardella Fabricius (minerador de folha manchado); Pieris brassicae Linnaeus (borboleta grande branca); P. rapae Linnaeus (borboleta pequena branca); P. napi Linnaeus (borboleta branca com verde raiado); Platyptilia carduidactyla Riley (mariposa plumosa de alcachofra); Plutella xylostella Linnaeus (mariposa de costas de diamante); Pectinophora gossypiella Saunders (lagarta coroaulho rosa); Pontia protodice Boisduval e Leconte (lagarta de repolho do sul); Sabulodes aegrotata Guenée (lagarta enroladora de omnívoros); Schizura concinna J.E. Smith (lagarta arqueada vermelha); Sitotroga cerealella Olivier (mariposa Angoumois dos cereais); Thaumetopoea pityocampa Schiffermuller (mariposa processionária do pinheiro); Tineola bisselliella Hummel (traça doméstica de riscas); Tuta absoluta Meyrick (lagarta mineira do tomate); Yponomeuta padella Linnaeus (mariposa arminho); Heliothis subflexa Guenée; Malacosoma spp. e Orgyia spp.

[0181] São de interesse larvas e adultos da ordem Coleoptera, incluindo gorgulhos das famílias Anthribidae, Bruchidae e Curculionidae (incluindo, porém, sem limitação: Anthonomus grandis Boheman (gorgulho do algodão); Lissorhoptrus oryzophilus Kuschel (gorgulho aquático americano); Sitophilus granarius Linnaeus (gorgulho dos cereais); S. oryzae Linnaeus (gorgulho do arroz); Hypera punctata Fabricius (gorgulho da folha de trevo);

Cylindrocopturus adspersus LeConte (gorgulho do caule de girassol); Smicronyx fulvus LeConte (gorgulho vermelho da semente de girassol); S. sordidus LeConte (gorgulho cinzento da semente de girassol); Sfenophorus maidis Chittenden (gorgulho do maís)); besouros-pulga, besouros do pepino, larvas da raiz, besouros da folha, besouros da batata e lagartas das folhas na família Chrysomelidae (incluindo, porém sem limitação: Leptinotarsa decemlineata Say (escaravelho da batateira); Diabrotica virgifera virgifera LeConte (verme de raiz do milho ocidental); D. barberi Smith e Lawrence (verme da raiz do milho setentrional); D. undecimpunctata howardi Barber (verme da raiz do milho meridional); Chaetocnema pulicaria Melsheimer (besouro-pulga do milho); Phyllotreta cruciferae Goeze (besouro-pulga crucífero); Phyllotreta striolata (besouro-pulga listrado); Colaspis brunnea Fabricius (colaspis da uva); Oulema melanopus Linnaeus (besouro da folha de cereal); Zygogramma exclamationis Fabricius (besouro do girassol)); besouros da família Coccinellidae (incluindo, mas sem limitação: Epilachna varivestis Mulsant (besouro mexicano do feijão)); Escaravelhos e outros besouros da família Scarabaeidae (incluindo, porém sem limitação: Popillia japonica Newman (escaravelho japonês); Cyclocephala borealis Arrow (escaravelho mascarado do norte, escaravelho branco); C. immaculata Olivier (escaravelho mascarado do sul, escaravelho branco); Rhizotrogus majalis Razoumowsky (escaravelho europeu); Phyllophaga crinita Burmeister (larva branca); Ligyrus gibbosus De Geer (besouro da cenoura)); besouros de carpete da família Dermestidae; larvas-arame da família Elateridae, Eleodes spp., Melanotus spp.; Conoderus spp.; Limonius spp.; Agriotes spp.; Ctenicera spp.; Aeolus spp.; besouros da casca da família Scolytidae e besouros da família Tenebrionidae.

[0182] São de interesse os adultos e os imaturos da ordem Diptera, incluindo lagartas mineiras Agromyza parvicornis Loew (lagarta mineira da folha do milho); moscas (incluindo, porém sem limitação: Contarinia sorghicola Coquillett (mosca do sorgo); Mayetiola destructor Say (mosca Hessian); Sitodiplosis mosellana Géhin (mosca do trigo); Neolasioptera murtfeldtiana Felt, (mosca da semente do girassol)); moscas dos frutos (Tephritidae), Oscinella frit Linnaeus (moscas dos frutos); vermes (incluindo, porém sem limitação: Delia platura Meigen (verme da semente do milho); D. coarctata Fallen (mosca do bulbo do trigo) e outra Delia spp., Meromyza americana Fitch (verme do caule do trigo); Musca domestica Linnaeus (moscas domésticas); Fannia canicularis Linnaeus, F. femoralis Stein (moscas menores domésticas); Stomoxys calcitrans Linnaeus (moscas estáveis)); moscas da face, moscas de corno, moscas de sopro, Chrysomya spp.; Phormia spp. e outras pragas de moscas, moscas dos cavalos Tabanus spp.; moscas da família Gastrophilus spp.; Oestrus spp.; besouros do gado Hypoderma spp.; moscas dos veados Chrysops spp.; Melophagus ovinus Linnaeus (keds) e outra Brachycera, mosquitos Aedes spp.; Anopheles spp.; Culex spp.; moscas negras Prosimulium spp.; Simulium spp.; moscas mordedoras, moscas da areia, esciarídeos e outros Nematocera.

[0183] Então incluídos como insetos de interesse adultos e ninfas das ordens Hemíptera e Homóptera, tais como, porém sem limitação, adelgídeo da família Adelgidae, insetos de planta da família Miridae, cicadas da família Cicadidae, cigarrinhas, Empoasca spp.; da família Cicadellidae, cigarrinhas de plantas das famílias Cixiidae, Flatidae, Fulgoroidea, Issidae e Delphacidae, cigarrinhas de árvore da família Membracidae, psilídeos da família Psyllidae, moscas- brancas da família Aleyrodidae, afídeos da família Aphididae, pfiloxera da família Phylloxeridae, cochonilhas- farinhentas da família Pseudococcidae, escalas das famílias Asterolecanidae, Coccidae, Dactylopiidae, Diaspididae, Eriococcidae Ortheziidae, Phoenicococcidae e Margarodidae, percevejo-de-renda da família Tingidae, percevejos da família Pentatomidae, percevejos-de-cincha, Blissus spp.; e outros percevejos de semente da família Lygaeidae, cigarrinhas da família Cercopidae, percevejos de polpa da família Coreidae e percevejos vermelhos e manchadores de algodão da família Pyrrhocoridae.

[0184] Os membros agronomicamente importantes da ordem Homóptera incluem adicionalmente, porém sem limitação: Acyrthisiphon pisum Harris (afídeo de ervilha); Aphis craccivora Koch (afídeo do feijão-frade); A. fabae Scopoli (afídeo do feijão preto); A. gossypii Glover (afídeo do algodão, afídeo do melão); A. maidiradicis Forbes (afídeo da raiz de milho); A. pomi De Geer (afídeo da maçã); A. spiraecola Patch (afídeo de Spiraea); Aulacorthum solani Kaltenbach (afídeo de Dedalis); Chaetosiphon fragaefolii Cockerell (afídeo do morango); Diuraphis noxia

Kurdjumov/Mordvilko (afídeo do trigo russo); Dysaphis plantaginea Paaserini (afídeo cinzento da macieira); Eriosoma lanigerum Hausmann (afídeo lanígero das macieiras); Brevicoryne brassicae Linnaeus (afídeo do repolho); Hyalopterus pruni Geoffroy (afídeo farinhento da ameixa); Lipaphis erysimi Kaltenbach (afídeo do nabo); Metopolophium dirrhodum Walker (afídeo do cereal); Macrosiphum euphorbiae Thomas (afídeo da batata); Myzus persicae Sulzer (afídeo do pessegueiro, afídeo verde do pessegueiro); Nasonovia ribisnigri Mosley (afídeo da alface); Pemphigus spp. (afídeos da raiz e afídeos de galha); Rhopalosiphum maidis Fitch (afídeo da folha do milho); R. padi Linnaeus (afídeo- da-cerejeira-brava); Schizaphis graminum Rondani (pulgão dos cereais); Sipha flava Forbes (afídeo amarelo da cana-de- açúcar); Sitobion avenae Fabricius (afídeo inglês dos grãos); Therioaphis maculata Buckton (afídeo manchado da alfafa); Toxoptera aurantii Boyer de Fonscolombe (afídeo preto dos citrinos) e T. citricida Kirkaldy (afídeo marrom dos citrinos); Adelges spp. (adelgídeos); Phylloxera devastatrix Pergande (filoxera de nogueira-pecã); Bemisia tabaci Gennadius (mosca-branca do tabaco, mosca-branca da batata doce); B. argentifolii Bellows & Perring (mosca- branca da folha de prata); Dialeurodes citri Ashmead (mosca- branca dos citrinos); Trialeurodes abutiloneus (mosca-branca de asa listrada) e T. vaporariorum Westwood (mosca-branca de estufa); Empoasca fabae Harris (cigarrinha da batata); Laodelphax striatellus Fallen (cigarrinha menor marrom); Macrolestes quadrilineatus Forbes (cigarrinha de áster); Nephotettix cinticeps Uhler (cigarrinha verde); N.

nigropictus Stål (cigarrinha do arroz); Nilaparvata lugens Stål (cigarrinha marrom); Peregrinus maidis Ashmead (cigarrinha do milho); Sogatella furcifera Horvath (cigarrinha de costas brancas); Sogatodes orizicola Muir (delfacídeo do arroz); Typhlocyba pomaria McAtee (cigarrinha branca da macieira); Erythroneoura spp. (cigarrinhas da uva); Magicicada septendecim Linnaeus (cigarra periódica); Icerya purchasi Maskell (pulgão branco); Quadraspidiotus perniciosus Comstock (pulgão de São José); Planococcus citri Risso (cochonilha dos citrinos); Pseudococcus spp. (outro complexo de cochonilha); Cacopsylla pyricola Foerster (psilídeo da pera); Trioza diospyri Ashmead (psilídeo do caqui).

[0185] Espécies agronomicamente importantes de interesse da ordem Hemiptera incluem, porém sem limitação: Acrosternum hilare Say (percevejo verde); Anasa tristis De Geer (escaravelho da abóbora); Blissus leucopterus leucopterus Say (escaravelho das gramíneas); Corythuca gossypii Fabricius (escaravelho da renda de algodão); Cyrtopeltis modesta Distant (escaravelho do tomate); Dysdercus suturellus Herrich-Schäffer (percevejo manchador de algodão); Euschistus servus Say (percevejo marrom); E. variolarius Palisot de Beauvois (percevejo manchado); Graptostethus spp. (complexo de escaravelhos de semente); Leptoglossus corculus Say (escaravelho de semente de pinheiro de pé em folha); Lygus lineolaris Palisot de Beauvois (escaravelho manchado da planta); L. Hesperus Knight (escaravelho ocidental manchado da planta); L. pratensis Linnaeus (escaravelho comum de prado); L.

rugulipennis Poppius (escaravelho europeu manchado da planta); Lygocoris pabulinus Linnaeus (capsídeo verde comum); Nezara viridula Linnaeus (percevejo verde do sul); Oebalus pugnax Fabricius (percevejo do arroz); Oncopeltus fasciatus Dallas (escaravelho grande da asclépia); Pseudatomoscelis seriatus Reuter (pulga do algodão).

[0186] Além disso, as concretizações podem ser eficazes contra Hemiptera como Calocoris norvegicus Gmelin (escaravelho do morango); Orthops campestris Linnaeus; Plesiocoris rugicollis Fallen (capsídeo da maçã); Cyrtopeltis modestus Distant (escaravelho do tomate); Cyrtopeltis notatus Distant (mosca); Spanagonicus albofasciatus Reuter (pulga de marca branca); Diaphnocoris chlorionis Say (escaravelho de espinheiro-da-Virgínia); Labopidicola allii Knight (escaravelho da planta de cebola); Pseudatomoscelis seriatus Reuter (pulga do algodão); Adelphocoris rapidus Say (escaravelho rápido da planta); Poecilocapsus lineatus Fabricius (escaravelho da planta de quatro linhas); Nysius ericae Schilling (escaravelho falso das gramíneas); Nysius raphanus Howard (escaravelho falso das gramíneas); Nezara viridula Linnaeus (percevejo verde do sul); Eurygaster spp.; Coreidae spp.; Pyrrhocoridae spp.; Tinidae spp.; Blostomatidae spp.; Reduviidae spp. e Cimicidae spp.

[0187] Também estão incluídos adultos e larvas da ordem Acari (ácaros), como Aceria tosichella Keifer (ácaro do enrolamento do trigo); Petrobia latens Müller (ácaro marrom do trigo); ácaros-aranha e ácaros vermelhos da família Tetranychidae, Panonychus ulmi Koch (ácaro vermelho europeu); Tetranychus urticae Koch (ácaro-aranha de duas manchas); (T. mcdanieli McGregor (ácaro McDaniel); T. cinnabarinus Boisduval (ácaro-aranha carmim); T. turkestani Ugarov & Nikolski (ácaro-aranha do morango); ácaros planos da família Tenuipalpidae, Brevipalpus lewisi McGregor (ácaro plano dos citrinos); ácaros da ferrugem e do broto da família Eriophyidae e outros ácaros de alimentação foliar e ácaros importantes na saúde humana e animal, isto é, os ácaros de poeira da família Epidermoptidae, ácaros do folículo da família Demodicidae, ácaros dos grãos da família Glycyphagidae, carrapatos da ordem Ixodidae. Ixodes scapularis Say (carrapato do veado); I. holocyclus Neumann (carrapato australiano de paralisia); Dermacentor variabilis Say (carrapato do cachorro americano); Amblyomma americanum Linnaeus (carrapato estrela) e ácaro da sarna e coceira nas famílias Psoroptidae, Pyemotidae e Sarcoptidae.

[0188] As pragas de insetos da ordem Thysanura são de interesse, como Lepisma saccharina Linnaeus (traça-dos- livros); Thermobia domestica Packard (tesourinha).

[0189] Pragas de artrópodes adicionais abrangidas incluem: aranhas da ordem Araneae como Loxosceles reclusa Gertsch e Mulaik (aranha reclusa marrom) e a Latrodectus mactans Fabricius (aranha viúva negra) e centopeias da ordem Scutigeromorpha como Scutigera coleoptrata Linnaeus (centopeia doméstica).

[0190] Pragas de insetos de interesse incluem a superfamília de percevejos e outros insetos relacionados incluindo, porém sem limitação, espécies pertencentes à família Pentatomidae (Nezara viridula, Halyomorpha halys,

Piezodorus guildini, Euschistus servus, Acrosternum hilare, Euschistus heros, Euschistus tristigmus, Acrosternum hilare, Dichelops furcatus, Dichelops melacanthus, e Bagrada hilaris (Pulgão Bagrada)), à família Plataspidae (Megacopta cribraria - Plataspídeo do feijão) e à família Cydnidae (Scaptocoris castanea - Percevejo das raízes) e espécies lepidópteras incluindo, porém sem limitação: traça-das- crucíferas, por exemplo, Helicoverpa zea Boddie; lagarta falsa medideira, por exemplo, Pseudoplusia includens Walker e lagarta-da-soja, por exemplo, Anticarsia gemmatalis Hübner.

[0191] Os métodos para medir a atividade pesticida são bem conhecidos na técnica. Consultar, por exemplo, Czapla e Lang, (1990) J. Econ. Entomol. 83:2.480 a 2.485; Andrews, et al., (1988) Biochem. J. 252:199 a 206; Marrone, et al., (1985) J. of Economic Entomology 78:290 a 293 e a Patente nº US 5,743,477. Geralmente, a proteína é misturada e usada em ensaios de alimentação. Consultar, por exemplo Marrone, et al., (1985) J. of Economic Entomology 78:290 a 293. Tais ensaios podem incluir colocar plantas em contato com uma ou mais pragas e determinar a habilidade da planta para sobreviver e/ou causar o extermínio das pragas.

[0192] Nematódeos incluem nematódeos parasitários como nematódeos das galhas radiculares, formadores de cistos e formadores de lesões, incluindo Heterodera spp., Meloidogyne spp. e Globodera spp.; particularmente membros dos nematódeos do cisto, incluindo, porém sem limitação, Heterodera glycines (nematódeo formador de cistos da soja); Heterodera schachtii (nematódeos do cisto da beterraba);

Heterodera avenae (nematódeo formador de cistos de cereais); e Globodera rostochiensis e Globodera pailida (nematódeos do cisto da batata). Os nematódeos das lesões incluem Pratylenchus spp. Tratamento de Sementes

[0193] Para proteger e aprimorar as tecnologias de produção de rendimento e traço, as opções de tratamento de semente podem fornecer flexibilidade de plano de cultura adicional e controle rentável contra insetos, ervas daninhas e doenças. O material de semente pode ser tratado, tipicamente com tratamento de superfície, com uma composição que compreende combinações de herbicidas químicos ou biológicos, fitoprotetores herbicidas, inseticidas, fungicidas, inibidores e intensificadores de germinação, nutrientes, reguladores e ativadores de crescimento de planta, bactericidas, nematocidas, avicidas e/ou moluscicidas. Estes compostos são tipicamente formulados juntamente com carreadores, tensoativos ou adjuvantes de promoção de aplicação adicionais empregados de modo costumeiro na técnica da formulação. Os revestimentos podem ser aplicados impregnando-se o material de propagação com uma formulação líquida ou por revestimento com uma formulação úmida ou seca combinada. Os exemplos dos vários tipos de compostos que podem ser usados como tratamentos de semente são fornecidos em "The Pesticide Manual: A World Compendium", C.D.S. Tomlin Ed., publicado pelo British Crop Production Council.

[0194] Alguns tratamentos de sementes que podem ser usados em sementes de cultura incluem, porém sem limitação,

um ou mais dentre ácido abscísico, acibenzolar-S-metila, avermectina, amitrol, azaconazol, azospirilo, azadiractina, azoxistrobina, Bacilus spp. (incluindo um ou mais dentre as espécies cereus, firmus, megaterium, pumilis, sphaericus, subtilis e/ou thuringiensis), Bradirhizobium spp. (incluindo um ou mais dentre betae, canariense, elkanii, iriomotense, japonicum, liaonigense, pachyrhizi e/ou yuanmingense), captana, carboxina, quitosano, clotianidina, cobre, ciazipir, difenoconazol, etidiazol, fipronil, fludioxonil, fluoxastrobina, fluquinconazol, flurazol, fluxofenim, proteína harpina, imazalil, imidacloprida, ipconazol, isoflavenoides, lipo-quito-oligossacarídeo, mancozeb, manganês, maneb, mefenoxam, metalaxil, metconazol, miclobutanil, PCNB, penflufeno, penicílio, pentiopirad, permetrina, picoxistrobina, protioconazol, piraclostrobina, rinaxipir, S-metolaclor, saponina, sedaxano, TCMTB, tebuconazol, tiabendazol, tiametoxam, tiocarb, tiram, tolclofos-metila, triadimenol, tricoderma, trifloxistrobina, triticonazol e/ou zinco. Revestimento de semente PCNB refere-se ao Número de Registro EPA 00293500419, que contém quintozeno e terrazol. TCMTB refere-se a 2- (tiocianometiltio)benzotiazol.

[0195] As variedades de semente e sementes com traços transgênicos específicos podem ser testadas para determinar quais opções de tratamento de semente e taxas de aplicação podem complementar tais variedades e traços transgênicos a fim de aprimorar o rendimento. Por exemplo, uma variedade com potencial de rendimento satisfatório, mas a suscetibilidade à ferrugem do milho pode se beneficiar a partir do uso de um tratamento de semente que fornece a proteção contra ferrugem do milho, uma variedade com potencial de rendimento satisfatório, mas a suscetibilidade a nematódeo de cisto pode se beneficiar a partir do uso de um tratamento de semente que fornece proteção contra nematódeo de cisto, e assim por diante. De modo semelhante, uma variedade que abrange um traço transgênico que confere resistência a inseto pode se beneficiar a partir do segundo modo de ação conferido pelo tratamento de semente, uma variedade que abrange um traço transgênico que confere resistência a herbicida pode se beneficiar a partir de um tratamento de semente com um fitoprotetor que aprimora a resistência de plantas àquele herbicida, etc. Adicionalmente, o estabelecimento de raiz satisfatório e a emergência inicial resultantes do uso apropriado de um tratamento de semente podem resultar em um uso de nitrogênio mais eficaz, uma habilidade melhor para resistir à seca e um aumento geral em potencial de rendimento de uma variedade ou variedades que contêm um certo traço quando combinadas com um tratamento de semente. Métodos para exterminar um inseto-praga e controlar uma população de insetos

[0196] Em algumas concretizações, métodos são fornecidos para exterminar uma praga de inseto que compreendem colocar a praga de inseto, simultânea ou sequencialmente, em contato com uma quantidade eficaz como inseticida de um polipeptídeo de toxina Cry recombinante da revelação. Em algumas concretizações, são fornecidos métodos para exterminar um inseto-praga que compreendem colocar o inseto-praga em contato com uma quantidade eficaz como inseticida de uma ou mais dentre as proteínas pesticidas recombinantes das SEQ ID NOS: 57 a 112, 214 a 246 e 275 a 278, ou uma variante ou fragmento ativo como inseticida das mesmas.

[0197] Em algumas concretizações, são fornecidos métodos para controlar uma população de inseto-praga que compreendem colocar a população de insetos-praga, simultânea ou sequencialmente, em contato com uma quantidade eficaz como inseticida de um ou mais dentre os polipeptídeos de toxina Cry recombinantes da revelação. Em algumas concretizações, são fornecidos métodos para controlar uma população de insetos-praga que compreendem colocar a população de insetos-praga em contato com uma quantidade eficaz como inseticida de um ou mais dentre os polipeptídeos de toxina Cry recombinantes das SEQ ID NOS: 57 a 112, 214 a 246 e 275 a 278, ou uma variante ou fragmento ativo como inseticida dos mesmos. Conforme usado no presente documento, "controlar uma população de pragas" ou "controla uma praga" refere-se a qualquer efeito em uma praga que resulta na limitação do dano que a praga causa. Controlar uma praga inclui, mas sem limitação, exterminar a praga, inibir o desenvolvimento da praga, alterar a fertilidade ou crescimento da praga de tal maneira que a praga faça menos danos à planta, diminuir o número de descendentes produzidos, produzir pragas menos adaptadas, produzir pragas mais suscetíveis a ataque de predadores ou impedir as pragas de se alimentarem da planta.

[0198] Em algumas concretizações, são fornecidos métodos para controlar uma população de insetos-praga resistente a uma proteína pesticida que compreendem colocar a população de inseto-praga, simultânea ou sequencialmente, em contato com uma quantidade eficaz como inseticida de um ou mais dentre os polipeptídeos de toxina Cry recombinantes da revelação. Em algumas concretizações, são fornecidos métodos para controlar uma população de insetos-praga resistente a uma proteína pesticida que compreendem colocar a população de insetos-praga em contato com uma quantidade eficaz como inseticida de um ou mais dentre os polipeptídeos de toxina Cry recombinantes das SEQ ID NOs: 57 a 112, 214 a 246 e 275 a 278, ou uma variante ou fragmento ativo como inseticida dos mesmos.

[0199] Em algumas concretizações, são fornecidos métodos para proteger uma planta contra um inseto-praga que compreendem expressar na planta ou célula da mesma pelo menos um polinucleotídeo recombinante que codifica um polipeptídeo de toxina Cry da revelação. Em algumas concretizações, são fornecidos métodos para proteger uma planta contra um inseto- praga que compreendem expressar, na planta ou célula da mesma, um polinucleotídeo recombinante que codifica um ou mais polipeptídeos de toxina Cry das SEQ ID NOS: 57 a 112, 214 a 246 e 275 a 278, ou variantes ou fragmentos ativos como inseticida dos mesmos. Estratégias de Gerenciamento de Resistência a Insetos (IRM)

[0200] A expressão de δ-endotoxinas de B. thuringiensis em plantas de milho transgênicas demonstrou ser um meio eficaz para controlar pragas de insetos importantes para a agricultura (Perlak, et al., 1990; 1993). Entretanto, em certos casos, os insetos evoluíram de modo que se tornassem resistentes a δ-endotoxinas de B. thuringiensis expressas em plantas transgênicas. Tal resistência, se disseminada, limitaria claramente o valor comercial de germoplasma que contém genes codificadores de tais δ-endotoxinas de B. thuringiensis.

[0201] Uma maneira para aumentar a eficácia dos inseticidas transgênicos contra pragas-alvo e reduzir de modo contemporâneo o desenvolvimento de pragas resistentes a inseticidas é usar refúgios (uma seção de culturas/milho não inseticidas) não transgênicos (isto é, proteínas não inseticidas) com culturas transgênicas que produzem uma proteína inseticida única ativa contra pragas-alvo. A Agência de Proteção Ambiental dos Estados Unidos (epa.gov/oppbppdl/biopesticides/pips/bt_corn_refuge_2006.ht m, que pode ser acessado com o uso do prefixo www) publica as exigências para o uso com culturas transgênicas que produzem uma proteína Bt única ativa contra pragas-alvo. Além disso, a National Corn Growers Association, em seu site da web: (ncga.com/inseto-resistência-management-fact-sheet- bt-corn, que pode ser acessado com o uso do prefixo www) também fornece orientação similar em relação a exigências de refúgio. Devido a perdas para insetos dentro da área de refúgio, refúgios maiores podem reduzir o rendimento geral.

[0202] Outra maneira para aumentar a eficácia dos inseticidas transgênicos contra pragas-alvo e reduzir ao mesmo tempo o desenvolvimento de pragas resistentes a inseticidas consiste em ter um depósito de genes inseticidas que são eficazes contra grupos de insetos-praga e que manifestam seus efeitos através de modos de ação diferentes.

[0203] A expressão em uma planta de duas ou mais composições inseticidas tóxicas para a mesma espécie de inseto, em que cada inseticida é expresso em níveis eficazes, será outra maneira para alcançar o controle do desenvolvimento de resistência. Isso tem base no princípio de que a evolução de resistência contra dois modos separados de ação é muito mais improvável do que contra apenas um. Roush, por exemplo, destaca estratégias com duas toxinas, também chamadas de "formação de pirâmide" ou "empilhamento" para o gerenciamento de culturas transgênicas inseticidas. (The Royal Society. Phil. Trans. R. Soc. Lond. B. (1998) 353:1.777 a 1.786). O empilhamento ou formação de pirâmide de duas proteínas diferentes, cada uma eficaz contra as pragas-alvo e com pouca ou nenhuma resistência cruzada, pode permitir uso de um refúgio menor. A Agência de Proteção Ambiental dos Estados Unidos exige significativamente menos refúgio estruturado (geralmente 5%) de milho não Bt a ser plantado em relação aos produtos de traço único (geralmente 20%). Há várias maneiras para fornecer os efeitos de IRM de um refúgio, incluindo vários padrões de plantio geométricos nos campos e misturas de sementes em bolsas, conforme discutido adicionalmente por Roush.

[0204] Em algumas concretizações, os polipeptídeos de toxina Cry da revelação são úteis como uma estratégia de gerenciamento de resistência a insetos em combinação (isto é, em pirâmide) com outras proteínas pesticidas ou outros transgenes (isto é, um traço de RNAi) incluindo, porém sem limitação, toxinas Bt, proteínas inseticidas de Xenorhabdus sp. ou Photorhabdus sp., outras proteínas ativas como inseticida e semelhantes.

[0205] São fornecidos métodos para controlar infestação (ou infestações) de insetos Lepidópteros e/ou Coleópteros em uma planta transgênica que promovem gerenciamento de resistência a insetos, que compreendem expressar na planta pelo menos duas proteínas inseticidas diferentes que têm modos de ação diferentes.

[0206] Em algumas concretizações, os métodos para controlar a infestação de insetos Lepidópteros e/ou Coleópteros em uma planta transgênica e promover gerenciamento de resistência a insetos compreendem a apresentação de pelo menos uma das proteínas inseticidas de polipeptídeo de toxina Cry a insetos na ordem Lepidóptera e/ou Coleóptera.

[0207] Em algumas concretizações, os métodos para controlar infestação de insetos Lepidópteros e/ou Coleópteros em uma planta transgênica e promover gerenciamento de resistência a inseto compreendem a apresentação de pelo menos um dos polipeptídeos de toxina Cry das SEQ ID NOS: 57 a 112, 214 a 246 e 275 a 278 ou variantes ou fragmentos ativos como inseticida dos mesmos, inseticidas para insetos na ordem Lepidóptera e/ou Coleóptera.

[0208] Também são fornecidos métodos para reduzir a probabilidade de emergência de resistência a insetos Lepidópteros e/ou Coleópteros a plantas transgênicas que expressam, nas plantas, proteínas inseticidas para controlar as espécies de inseto que compreendem a expressão de pelo menos um dentre um polipeptídeo de toxina Cry inseticida paras as espécies de inseto em combinação com uma segunda proteína inseticida para as espécies de inseto que têm modos de ação diferentes. Métodos para Aumentar o Rendimento de Planta

[0209] Os métodos para aumentar o rendimento de planta são fornecidos. Os métodos compreendem fornecer uma planta ou célula vegetal que expressa um polinucleotídeo que codifica a sequência de polipeptídeos pesticida revelada no presente documento e cultivar a planta ou uma semente da mesma em um campo infestado com uma praga contra a qual o polipeptídeo tem atividade pesticida. Em algumas concretizações, o polipeptídeo tem atividade pesticida contra uma praga de Lepidópteros, Coleópteros, Dípteros, Hemípteros ou nematódeos, e o campo é infestado com uma praga de Lepidópteros, Hemípteros, Coleópteros, Dípteros ou nematódeos.

[0210] Conforme definido no presente documento, o "rendimento" da planta refere-se à qualidade e/ou quantidade de biomassa produzida pela planta. "Biomassa", conforme usado no presente documento, refere-se a qualquer produto de planta medido. Um aumento na produção de biomassa é qualquer melhora no rendimento do produto de planta medido. Aumentar o rendimento de planta tem diversas aplicações comerciais. Por exemplo, aumentar a biomassa de folha de planta pode aumentar o rendimento de vegetais com folhas para consumo humano ou animal. Adicionalmente, o aumento de biomassa de folha pode ser usado para aumentar a produção de produtos farmacêuticos ou industriais derivados de planta. Um aumento do rendimento pode compreender qualquer aumento estatisticamente significativo incluindo, porém sem limitação, pelo menos um aumento de 1%, pelo menos um aumento de 3%, pelo menos um aumento de 5%, pelo menos um aumento de 10%, pelo menos um aumento de 20%, pelo menos de 30%, pelo menos de 50%, pelo menos de 70%, pelo menos de 100% ou um aumento maior do rendimento em comparação com uma planta que não expressa a sequência pesticida.

[0211] Em métodos específicos, o rendimento de planta é aumentado como resultado da resistência a pragas melhorada de uma planta que expressa pelo menos um polipeptídeo de toxina Cry revelado no presente documento. A expressão do polipeptídeo (ou polipeptídeos) de toxina Cry resulta em uma capacidade reduzida de uma praga para infestar ou alimentar-se na planta, melhorando, assim, o rendimento de planta. Métodos de Processamento

[0212] São fornecidos, ainda, métodos para processar uma planta, parte de plantas ou semente para obter um alimento ou produto alimentício proveniente de uma planta, parte de plantas ou semente que compreende pelo menos um polinucleotídeo de toxina Cry. As plantas, partes de planta ou sementes fornecidas no presente documento podem ser processadas para render óleo, produtos de proteína e/ou subprodutos que são derivados obtidos por processamento que têm valor comercial. Os exemplos não limitantes incluem sementes transgênicas que compreendem uma molécula de ácido nucleico que codifica um ou mais polipeptídeos de toxina Cry que podem ser processados para render óleo se soja, produtos de soja e/ou subprodutos de soja.

[0213] "Processar" refere-se a quaisquer métodos físicos e químicos usados para obter qualquer produto de soja e incluem, porém sem limitação, condicionamento térmico, floculação e trituração, extrusão, extração de solvente ou embebição aquosa e extração de sementes inteiras ou parciais.

[0214] Os exemplos a seguir são oferecidos a título de ilustração e não como limitação.

EXEMPLOS Exemplo 1: Síntese de vários fragmentos de domínio de toxina Cry

[0215] Fragmentos de domínios inteiros (Dm1, Dm2 e Dm3) de 42 toxinas Cry de holótipo foram otimizados para expressão de E. coli e sintetizados (consultar a Figura 1). Todos os fragmentos de domínio foram clonados na subclonagem pUC19 para expressão. Esses fragmentos foram usados como materiais de partida para muitas das bibliotecas de embaralhamento de blocos. Todas as informações de proteína de toxina Cry de holótipo foram obtidas a partir do NCBI Gen Bank, Crickmore, et al., "Bacillus thuringiensis toxin nomenclature" (2011), em lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/ que pode ser acessado na rede mundial de computadores com o uso do prefixo "www", e btnomenclature.info/ que pode ser acessado na rede mundial de computadores com o uso do prefixo "www". A Tabela

1 lista os fragmentos de toxina de holótipo que foram sintetizados. Tabela 1. Fragmentos Sintetizados de Toxina de Bt de Holótipo Lista de holótipo de Cry1 e Cry9 (tipo selvagem) sintetizado como fragmentos de domínio Cry1Aa Cry1Bf Cry1Gb Cry9Aa Cry1Ab Cry1Bg Cry1Gc Cry9Ba Cry1Ac Cry1Bh Cry1Ha Cry9Bb Cry1Ad Cry1Ca Cry1Hb Cry9Ca Cry1Ae Cry1Cb Cry1Ia Cry9Da Cry1Af Cry1Da Cry1Ib Cry9Db Cry1Ag Cry1Db Cry1Ic Cry9Ea Cry1Ah Cry1Dc Cry1Id Cry9Eb Cry1Ai Cry1Ea Cry1Ie Cry9Ec Cry1Ba Cry1Eb Cry1If Cry9Ed Cry1Bb Cry1Fa Cry1Ka Cry1Bd Cry1Fb Cry1La Cry1Be Cry1Ga Cry1Ma Exemplo 2: Montagem de Cadeia principal e Inserto de Vetor

[0216] Os produtos de PCR para os insertos (Domínio 1, 2 ou 3, ou fragmentos de subdomínio) foram amplificados com o uso de DNA Polimerase de Alta Fidelidade Q5 (NEB M0491L), ao mesmo tempo que as cadeias principais de plasmídeo foram amplificadas com o uso de DNA Polimerase de Alta Fidelidade Phusion (ThermoFisher F530L ou NEB M0530L), após as instruções para temperaturas e ciclos recomendados no respectivo protocolo da DNA polimerase.

[0217] Todas as bibliotecas foram clonadas em vetor pMAL pVER6805 para serem expressas como uma configuração de His-MBP-toxina. Após a produção dos fragmentos de PCR de inserto (Dm1, 2 e 3), a cadeia principal de vetor (8 a 9 kb de comprimento excluindo a porção de inseto) contendo His + MBP e elementos de vetor essenciais adicionais foram produzidos por PCR inverso.

[0218] Insertos e cadeias principais foram montados em plasmídeos primariamente com NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix (NEB E2621L), com o uso de reações de 10 ul, que foram reduzidas do protocolo de 20 ul original, e após a duração e a temperatura de incubação recomendadas.

[0219] As reações de montagem NEBuilder foram diluídas 1:2 com água desionizada, e 1 ul foi usado na transformação de 50 ul de células BL21(DE3) eletrocompetentes (Lucigen E. cloni EXPRESS 60300-2) diluídas 1:8. Alternativamente, o Kit GeneArt Seamless Cloning and Assembly (Invitrogen A13288) foi ocasionalmente usado para a montagem de insertos e cadeias principais, seguindo as direções para a reação. Para a transformação, 10 ul da reação foram adicionados a 50 ul de células TOP10 Quimicamente Competentes Invitrogen OneShot (incluídas com o kit). As culturas foram cultivadas, e o DNA de plasmídeo foi preparado com o uso de um Kit Miniprep (Qiagen 27104). O DNA de plasmídeo foi, então, usado para transformar 50 ul de células BL21-Gold (DE3) quimicamente competentes (Agilent 230132).

[0220] As células BL21 foram colocadas em placas de ágar LB com seleção de carbenicilina a 100 ug/ml e cultivadas de um dia para o outro a 37 °C. Culturas iniciadoras de 150 a 160 ul de LB carb (100 ug/ml) foram inoculadas e cultivadas de um dia para o outro, agitando-se a 37 °C. Culturas de Magic Media (Invitrogen K6803) foram cultivadas em formato de placa de poços profundos com 1 ml de Magic Media inoculado com 20 ul de cultura iniciadora. As placas de Magic Media foram cultivadas a 25 °C por 8 horas, então, 16 °C por 64 horas, agitando-se a 250 rpm. As placas foram centrifugadas a 4.000 rpm por 15 minutos. O sobrenadante foi descartado, uma esfera de aço foi adicionada a cada poço, e as placas foram armazenadas a -80 °C de um dia para o outro.

[0221] As placas foram submetidas a vórtice até os péletes de célula terem sido ressuspensos e, então, agitados 250 rpm a 37 °C por 1,5 a 2 horas. Após o armazenamento a - 80 °C de um dia para o outro, as placas foram descongeladas, e as esferas de aço removidas com um ímã grande, seguido de uma centrifugação a 4.000 rpm por 20 minutos a 4 °C.

[0222] Para preparar as amostras para análise por Western, 7,5 ul de sobrenadante mais 7,5 ul de água desionizada foram combinados com 5 ul de tampão de carregamento de amostras E-PAGE (incluído com géis 6% de 96 poços E-PAGE Invitrogen EP09606) com beta mercaptoetanol 4% adicionado. As amostras foram aquecidas a 70 °C por 10 minutos e centrifugadas por 5 min a 4.000 rpm a 4 °C. Um gel E-PAGE de 96 poços foi, então, carregado com 5 ul de amostras mais 15 ul de água desionizada, juntamente com 5 ul de Padrão Pré-manchado SeeBlue E-PAGE (Invitrogen LC5700) mais 15 ul de água desionizada. O gel foi passado no programa EP do dispositivo de gel E-Base (Invitrogen EBM03 e EBD03) por 20 minutos.

[0223] O sistema iBlot2 (Invitrogen IB21001) foi usado para transferir as proteínas do gel para uma membrana de nitrocelulose (Invitrogen IB23001) de acordo com as direções do fabricante. A membrana foi bloqueada com Tampão Bloqueador SuperBlock T20 (TBS) (ThermoFisher 37536) por uma hora à temperatura ambiente e, então, incubada de um dia para o outro a 4 °C com anticorpo de Proteína de Ligação- Fosfatase Alcalina Anti-Maltose Monoclonal Sigma produzido em camundongo (A3963-5ML) diluído 1:2.000 em SuperBlock T20. Após 3 lavagens de 10 minutos com TBS-T (Tween-20 0,05%), os blots foram desenvolvidos com o Kit Bio-Rad Alkaline Phosphatase Conjugate Substrate (170-6432) de acordo com o protocolo do fabricante. As proteínas que pareceram ter bons perfis de expressão foram, então, avançadas para triagem por ensaio de insetos.

[0224] Para a produção das proteínas que foram avançadas após a triagem de expressão, estoques de glicerol foram estampados em LB carb (100 ug/ml) e incubados a 30 °C ou 37 °C de um dia para o outro. As colônias dessas placas foram usadas para inocular 3 ml de culturas iniciadoras de LB carb (100 ug/ml) cultivadas a 37 °C de um dia para o outro. Culturas de Magic Media (Invitrogen K6803) de 100 ml a 200 ml foram inoculadas com 1 ml a 2 ml de culturas iniciadoras, respectivamente (isto é, 1% de volume final) e agitadas a 25 °C por 8 horas, então, 16 °C por 64 horas a 250 rpm. As culturas foram centrifugadas a 9.000 rpm por 10 min a 4 °C.

[0225] As proteínas inseticidas embaralhadas (polipeptídeos ou proteínas "IPRS") foram expressas em um vetor pMAL modificado (número de catálogo E8000S da New England Biolabs) como uma fusão com MBP (proteína de ligação a maltose). O vetor pMAL foi modificado para ligar um marcador 6X His à extremidade N-terminal de MBP após metionina na posição 1. O plasmídeo contendo o gene da proteína inseticida foi clonado em E. coli BL21 (DE3). As células BL21 foram cultivadas em MagicMedia™ (Life Technologies) em placas de 96 poços fundos ou frascos em um agitador funcionando a 250 rpm a 37 °C durante 8 h seguido por 16 °C durante 64 h. Durante a incubação a 16 °C, a proteína de fusão MBP-toxina foi acumulada na célula BL21 como uma proteína solúvel.

[0226] Para purificar a proteína de fusão, as células de E. coli foram recolhidas por centrifugação e tratadas em uma solução de lisozima constituída por 2 mg/ml de lisozima em 50 ml de tampão fosfato de sódio a pH 8 contendo NaCl a 300 mM, endonuclease 2 U/ml (Epicentre) e 5 mM de MaCl2 durante 3 horas a 37 °C com agitação suave. As células de E. coli tratadas com lisozima foram então rompidas com Triton X100 1%, e o lisado transparente contendo as toxinas foi preparado por centrifugação a 4.000 rpm, 30 min (placas de 96 poços) ou 9.000 rpm (amostras produzidas em frasco). As proteínas da toxina MBP marcadas com His foram purificadas do lisado claro por cromatografia de afinidade utilizando agarose NiNTA da Qiagen™ seguindo o procedimento padrão do fabricante. Para as amostras de lisado claro feitas em placas de 96 poços, foram utilizadas placas de filtro de 96 poços fundos da Pall Corporation™ (25 Harbor Park Drive Port Washington, NI 11050) como colunas de cromatografia de afinidade. As proteínas de toxina purificadas eluídas de agarose de NiNTA foram passadas através de Sephadex G25 para alterar o tampão de fosfato para HEPES-NaOH a 25 mM, pH 8 e usadas em bioensaio de insetos para determinar o inseticida. A MBP foi digerida com Fator Xa (New England Biolabs) 1/100 (p/p) a 25 ⁰C de um dia para o outro e removida das toxinas por cromatografia em coluna Superdex 200 utilizando a diferença de tamanho e uma fraca afinidade de MBP para Superdex.

[0227] As concentrações de proteína foram determinadas por eletroforese capilar com o dispositivo LabChip™ GXII (Caliper LifeSciences). A análise de proteínas foi repetida pelo menos 3 vezes até que as concentrações finais foram consideradas confiáveis dentro do desvio predeterminado, inferior a 10%.

[0228] A atividade das variantes do polipeptídeo de IPRS contra grandes pragas de milho, Broca Europeia do Milho (ECB, Ostrinia nubilalis), Lagarta-da-Espiga do milho (ECW, Helicoverpa zea) e Lagarta-do-Cartucho (FAW, Spodoptera frugiperda), foi determinada por ensaio alimentar descrito por Cong, R., et al. Proceedings of the 4th Pacific Rim Conferences on Biotechnology of Bacillus thuringiensis and its environmental impact, páginas 118 a 123, ed. por R. J. Akhurst, C. E. Beard e P. Hughes, publicado em 2002, em Canberra, Austrália. Resumidamente, os ensaios foram conduzidos em uma dieta artificial contendo as proteínas inseticidas. As proteínas inseticidas foram preparadas conforme descrito no Exemplo 1, e 10 μl de amostras de proteína foram misturados com 40 μl da dieta artificial de inseto fundida (40 a 50 °C) preparada com base em Southland Premix formulada para insetos Lepidópteros (Southland Products, Lake Village, AR) com agarose de fusão a baixa temperatura. A mistura de proteína dieta inseticida foi colocada em cada poço de uma placa de microtitulação de 96 poços. Uma ou mais larvas de insetos neonatos foram colocadas em cada poço para alimentação durante 4 dias para CEW e FAW e 5 dias para ECB a 28 °C. Exemplo 3: Embaralhamento de alça alfa 3-5 de Cry1J (para ocorrências de IPRS C21 e C51)

[0229] O embaralhamento de domínio 1 (Dm1) inteiro frequentemente resultou em expressão muito pouco solúvel. Em vez disso, os dados sugerem que a região que abrange as alças alfa 3 a 5 de Dm tem 1) interação mínima com o resto da proteína; e 2) é exposta a solvente, foi embaralhada (Consultar as Tabelas 2, 3, e 10, e Figuras 5 e 6). Portanto, foi previsto que o embaralhamento das regiões de alça alfa 3-5 tem um impacto na solubilidade dos polipeptídeos embaralhados, assim como atividades inseticidas potencialmente alteradas. Como uma biblioteca de prova de conceito, duas bibliotecas pequenas foram produzidas. Em cada biblioteca, a região de alça alfa 3-5 de Cry1Jc e Cry1Ja foi trocada por ambas as regiões de alça alfa 3-5 de Cry1Ca e Cry1Ah. A região consenso entre QIEQL (SEQ ID NO: 247, na extremidade da alça alfa 2B) e ANLHL (SEQ ID NO: 251, no meio da alça alfa 5) do Dm1 foi selecionada para embaralhamento. Essas extensões de cinco aminoácidos (SEQ ID NOs: 247 e 251) são altamente conservadas dentre diversas toxinas Cry1 (consultar as Figuras 8 e 9). As regiões consenso entre as alças alfa 3 e 4 (SEQ ID NO: 248) e alças alfa 4 e 5 (SEQ ID NO: 249) foram também identificadas para troca de alça alfa quimérica potencial. Além da troca de alça alfa 3-5, o Domínio 3 de Cry1Jc e Cry1Ja foi também trocado pelo Domínio 3 de Cry1Ac e Cry1Ca (consultar as Figuras 8 e 9). O tamanho de biblioteca total foi de 6 com 12 construtos no total para duas cadeias principais (consultar a Figura 2). Todos os 12 construtos para a biblioteca foram sintetizados conforme descrito no Exemplo

2. As regiões de sequência de aminoácidos de alça alfa 3-5 de várias toxinas Cry usadas no embaralhamento são apresentadas nas SEQ ID NOs: 159 a 180 (codificadas pelas sequências de DNA conforme apresentado nas SEQ ID NOs: 137 a 158, respectivamente).

[0230] A fim de expressar esses genes como proteínas de fusão de MBP, os mesmos foram clonados em vetor pMal. As sequências de toxina foram amplificadas por PCR a partir dos vetores pUC19. A cadeia principal de vetor foi obtida por vetor pMal de PCR inversa. Então, as cadeias principais de vetor e inserto foram ligadas com o uso do kit de clonagem baseada em homologia Geneart e NEBuilder. Esses doze clones foram transformados em células de E. Coli BL21 e procedidos para purificação de proteína diretamente sem verificação para expressão.

[0231] As proteínas foram purificadas, quantificadas e submetidas para ensaio de insetos contra CEW e FAW. O teste inicial foi feito para um ensaio de Sim/Não para avaliar a atividade. Com base nos resultados iniciais, os clones selecionados foram submetidos para um ensaio de resposta à dosagem para atividade específica. Depois, o clone (ou clones) ativo foi testado quanto a sua atividade contra outras pragas de lepidópteros (SBL, VBC e ECB) para determinar seu espectro de atividade (Consultar a Tabela 2). Tabela 2. Espectro de atividade de clones ativos *N.A. significa não ativo conforme testado; N.M. significa nenhuma mortalidade conforme testado; e N.D. Significa não determinado Exemplo 4: Embaralhamento de alça alfa 3-5 de Dm1 e Dm3 na cadeia principal de Cry1Ea para ocorrências de IPRS: IPRS-C13, IPRS-14, IPRS-15, IPRS-16, IPRS-17, IPRS-19 e IPRS-31

[0232] Com base no sucesso da biblioteca de alça alfa 3-5 da cadeia principal 1Jc, uma biblioteca foi projetada para embaralhar diversos domínios de domínio híbrido 1 (Dm1) com domínio 2 (Dm2) de Cry1Ea e domínio 3 (Dm3) de Cry1Ca em três pontos de interseção diferentes que têm diferentes comprimentos do domínio híbrido 3. Os Dm1s híbridos são similares uns aos outros, exceto a região alfa 3-5. Juntamente com 9 Dm1s híbridos, três Dm1s híbridos foram também usados no embaralhamento.

[0233] Onze Dm1s (Dois Dm1s do tipo Cry1Ea e 9 Dm1s híbridos) e três fragmentos de Dm2 de Cry1Ea-Dm3 de Cry1Ca (Dm2 de Cry1Ea e Dm3 de Cry1Ca fundidos em três pontos de intersecção diferentes) foram sintetizados. Três bibliotecas (ECF2, 3 e 4) foram construídas (consultar a Figura 3). Na biblioteca ECF2, 11 Dm1s foram embaralhados com Dm2 de Cry1Ea e Dm3 de Cry1Ca. Dm2 de Cry1Ea foi fundido a Dm3 de Cry1Ca na região de intersecção 1 em Dm3 (SEQ ID NO: 251). Na biblioteca ECF3, 11 Dm1s foram embaralhados com Dm2 de Cry1Ea e Dm3 de Cry1Ca. Dm2 de Cry1Ea foi fundido a Dm3 de Cry1Ca na região de intersecção consenso 2 em Dm3 (SEQ ID NO: 252). Na biblioteca ECF4, 11 Dm1s foram embaralhados com Dm2 de Cry1Ea e Dm3 de Cry1Ca. Dm2 de Cry1Ea foi fundido a Dm3 de Cry1Ca na região de intersecção consenso 3 em Dm3 (SEQ ID NO: 253).

[0234] A fim de expressar esses genes como proteínas de fusão de MBP, todas as três bibliotecas foram feitas no vetor pMal. Os Dm1s e três fragmentos de Dm2-Dm3 foram amplificados por PCR a partir dos vetores pUC19. A cadeia principal de vetor foi obtida por PCR inversa da cadeia principal do vetor pMal. Então, as cadeias principais de vetor e inserto (Dm1, Dm2-Dm2) foram montadas com o uso do kit de clonagem baseada em homologia Geneart e NEBuilder.

[0235] Todos os 33 clones (11 clones/biblioteca) tiveram a sequência confirmada e foram transformados em células de E. coli BL21 e verificados para expressão com o uso de western blot. Todos os 22 clones que foram expressos cultivados em 200 ml de culturas e proteínas foram purificados, quantificados e submetidos a ensaio de insetos contra FAW. Os clones selecionados com base nos resultados de teste inicial foram submetidos para um ensaio de resposta de dose para obter atividade específica. Posteriormente, o clone mais ativo sob condições de teste (IPRS-C16, SEQ ID NO: 62) foi testado quanto a sua atividade contra outras pragas de lepidópteros (SBL, VBC e ECB), juntamente com determinados outros, para determinar seus espectros de atividade (consultar as Tabelas 3 e 4). Tabela 3. Espectro de atividade de clones embaralhados *N.A. significa não ativo conforme testado; e N.D. Significa não determinado Exemplo 5: Embaralhamento de fragmento de Dm3 em C16 e C21

[0236] Acredita-se que o domínio 3 (Dm3) está envolvido no reconhecimento de receptor secundário. Portanto, o embaralhamento de Dm3 foi feito em IPRS-C16 (SEQ ID NO: 62), IPRS-C18 (SEQ ID NO: 66) e IPRS-C21 (SEQ ID NO: 88) para gerar variantes exclusivas e que têm potencialmente diferentes sítios de ação (SOA). Com base no alinhamento de diversas toxinas Cry, sete regiões de intersecção diferentes entre Dm2 e Dm3, que são geralmente conservadas, foram usadas como sítios de recombinação para fusão de Dm3 em cadeias principais de Dm1-Dm2 de IPRS-C16, IPRS-C18 e IPRS-C21.

[0237] 53 domínios-3 de toxina Cry diferentes foram selecionados como fontes de diversidade. Sete fragmentos (regiões consenso de intersecção 1 a 7, SEQ ID NOs: 251 a 257; Consultar a Tabela 5 e a Figura 4) de cada domínio foram amplificados por PCR e agrupados com base no ponto de intersecção (cada agrupamento contendo 53 fragmentos de

PCR). Dois conjuntos de agrupamentos de fragmento de PCR de Dm3, cada conjunto contendo 7 fragmentos de Dm3 individuais, foram feitos. Um conjunto foi feito para cadeia principal de IPRS-C21 e outro conjunto para as cadeias principais de IPRS- C16 e IPRS-C18. Os agrupamentos correspondentes que formam cada conjunto são idênticos exceto pela homologia de região de intersecção (Figura 4).

[0238] Sete cadeias principais de vetor (intersecções 1 a 7, também nomeadas F2 a F8 respectivamente) foram feitas por PCR inversa excluindo a região a ser trocada com o uso de iniciadores de PCR específicos para cadeia principal. Já que IPRS-C16 e IPRS-C18 têm Dm3s idênticos, iniciadores comuns foram usados para essas duas cadeias principais.

[0239] Cada agrupamento de Dm3 específico foi montado com cadeia principal de vetor de PCR inversa correspondente para obter todas as variantes na cadeia principal de vetor pMal a ser expressa como proteínas de fusão de MBP. Todas as variantes foram redispostas após a confirmação de sequência. Apenas aqueles clones que foram expressos em fração solúvel em E. coli foram adicionalmente purificados e testados quanto a sua atividade de inseto. As variantes de Dm3 de IPRS-C16 e IPRS-C18 foram inicialmente triados contra FAW, e as variantes de IPRS-C21 foram triadas contra CEW. As variantes ativas foram testadas quanto a seu espectro de atividade em outras pragas de lepidópteros (consultar a Tabela 4 e a Figura 7). As variantes de Dm3 retinham atividade, mas tinham atividade diminuída conforme testado contra seu respectivo inseto-alvo (IPRS-C16 e IPRS- C18: FAW, IPRS-C21: CEW) em comparação a seus progenitores. Tabela 4. Espectro de atividade de troca de Dm3 em outras pragas de lepidópteros *N.A. significa não ativo conforme testado; N.M. significa nenhuma mortalidade conforme testado; N.D. Significa não determinado; e F número é o ponto de intersecção. Tabela 5. Pontos de intersecção de fragmentos de Dm3 de toxina Cry: sequência consenso de aminoácidos na Ponto de

SEQ ID qual o fragmento de Dm3 é fundido às intersecção NO: cadeias principais C16 e C18 de Dm2-Dm3 251 WTHHS F2 252 ITQIP F3 253 GFTGG F4 254 RYASS F5 255 KTMEI F6 256 TFRYT F7 257 PFSFR F8

Exemplo 6: Embaralhamento de alça alfa 3-5 e Dm3 Sequencial na Cadeia Principal de MP1068

[0240] MP1068 (SEQ ID NO: 214) é uma toxina Cry patenteada. A mesma tem 63% de homologia a Cry1Ac. Seu Dm1 é 84% similar a Cry1Ac, Dm2 é exclusivo com 45% de homologia a Cry1Nb, e Dm3 tem 79% de homologia a Cry1Bh. Já que Dm2 de MP1068 é bastante exclusivo, variantes baseadas em Dm2 de MP1068 como cadeia principal foram criadas. Inicialmente, a região de toxina MP1068 foi expressa como proteína de fusão MBP, mas as tentativas não foram bem-sucedidas na medida em que toda a proteína expressa estava em fração insolúvel. Para superar o problema de expressão solúvel, o embaralhamento foi realizado no fragmento de alça alfa 3-5, que é exposto a solventes (consultar as Figuras 5 e 6), para gerar variantes de MP1068 com atividade de inseto seguido de embaralhamento de Dm3 nessa cadeia principal para melhorar a atividade.

[0241] MP1068 na cadeia principal de vetor pMal foi obtido por iniciadores específicos para cadeia principal de PCR inversa. Essa cadeia principal de vetor tem todos os componentes de vetor ao longo da toxina MP1068 exceto pela região de alça alfa 3-5. 23 fragmentos de alça alfa 3-5 foram amplificados por PCR a partir de fragmentos de Dm1 sintetizados (Tabela 5). Quantidades iguais de todos os fragmentos de alça alfa 3-5 foram agrupadas e purificadas em gel. O agrupamento de fragmentos de PCR de alça alfa 3-5 e a cadeia principal de vetor MP1068 foram montados com o uso do kit de montagem baseado em homologia Geneart (Invitrogen). A reação montada foi transformada em células BL21 e colocada em placas. Três placas de 96 poços de colônias foram coletadas e diretamente testadas quanto a sua expressão solúvel. Todos os clones expressos foram redispostos e enviados para sequenciamento para remover sequências redundantes.

[0242] Os dados de sequenciamento revelaram que havia 9 variantes de MP1068 exclusivas com diferentes sequências de alça alfa 3-5 trocadas. Todas as 9 variantes foram testadas em um ensaio de dieta quanto a sua atividade de inseto contra CEW, FAW e ECB (Tabela 6 e Figura 7). Tabela 6. Atividade de inseto de variante trocada alfa MP1068 *N.A. significa não ativo conforme testado; N.M. significa nenhuma mortalidade conforme testado; e N.D. Significa não determinado

[0243] IPRS-C23 foi selecionada com a cadeia principal para embaralhamento de Dm3 adicional (consultar o Exemplo 5) na medida em que foi mais ativa em comparação aos dois outros clones ativos conforme testado. Seis Dm3s, de Cry1Ca, Cry1Cb, Cry1Da, MP258 (consultar o documento no US 20160194364 A1, SEQ ID NO: 16, incorporado ao presente documento a título de referência), Cry1Bb e Cry1Ja, foram selecionados como uma fonte de diversidade. Cinco fragmentos de (pontos de intersecção 1-4, também denominados pontos de intersecção F2 a F5) de cada Dm3 foram obtidos por amplificação por PCR. Os fragmentos individuais (por exemplo, F2s de todos os Dm3s na diversidade) foram agrupados em 5 agrupamentos de Dm3 (agrupamentos F2 a F5). A cadeia principal de vetor foi obtida por PCR inversa excluindo a região a ser trocada. A fim de facilitar a montagem baseada em homologia, as extremidades da cadeia principal de vetor e os insertos (agrupamentos de Dm3) tinham uma sobreposição de sequências idênticas de 15 pb. Os agrupamentos de inserto e as cadeias principais de vetor foram purificados em gel e montados com o uso dos kits de montagem Gene Art ou NEB builder. A reação de montagem foi, então, transformada em células BL21, e as colônias coletadas foram triadas por sequenciamento. Os clones exclusivos individuais foram redispostos e verificados quanto à expressão com o uso de blotting e gel E-Page de 96 poços Bio-Rad. Os clones que expressam toxinas híbridas em fração solúvel foram cultivados em cultura de 150 ml de magic media e purificados por purificação Ni-NTA padrão e testados quanto a sua atividade de inseto.

[0244] Todos os 30 clones possíveis foram purificados e testados quanto a sua atividade contra CEW, FAW e ECB, e 10 revelaram ser variantes ativas conforme testado, 6 dessas 10 variantes ativas mostraram atividade melhorada contra todos os três insetos testados (Tabela 7). Tabela 7. Atividade de embaralhamento de Dm3 de C23

*N.A. significa não ativo conforme testado; N.M. significa nenhuma mortalidade conforme testado; N.D. Significa não determinado; e F número é o ponto de intersecção Exemplo 7: Embaralhamento de Dm1 e Dm3 sequencial na cadeia principal de (C45, 46, 47, 48 e C49)

[0245] GS062 (SEQ ID NO: 224) é uma toxina patenteada com 62% de homologia a Cry1Da. A análise de domínio revelou que a mesma é uma toxina híbrida com o domínio-1 sendo do tipo Cry1Ac (77%), Dm2 sendo do tipo Cry1Ca (80%) e Dm3 sendo do tipo Cry1Hb (79%). GS062 foi ativa apenas em ECB, mas não em CEW e FAW conforme testado. GS062 nativa era Dm1 embaralhado por família na cadeia principal de GS062 para melhorar a atividade de ECB e, então, Dm3 embaralhado para adicionar especificidade de CEW ou FAW.

[0246] Dm1s inteiros de diversas toxinas Cry1 patenteadas foram amplificados por PCR a partir de suas respectivas toxinas Cry progenitoras. Todos os fragmentos amplificados por PCR foram agrupados e purificados em gel para remover quaisquer resíduos de clones progenitores. Então, fragmentos de Dm1 agrupados foram deixados recombinar com o uso de uma PCR com diversidade de aminoácido natural representando vários fragmentos de Dm1. Quatro reações de montagem de 50 µl contendo oligos de biblioteca agrupados 0,5 a 1,0 µM e fragmentos Dm1 foram montadas em uma reação de Herculase II (Stratagene). Uma reação de PCR subsequente para amplificar o gene completamente estendido de aproximadamente 1 Kb foi executada adicionando-se 0,5 µM de iniciadores de flanqueamento com homologia de 30 pb à cadeia principal de vetor pMal contendo Dm2, Dm3 de GS062.

[0247] A cadeia principal de vetor foi obtida pela PCR inversa da toxina GS062 no vetor pMal. Iniciadores de PCR inversa foram projetados de modo a excluir Dm1 de GS062 do fragmento de PCR, então, o fragmento de cadeia principal de vetor de PCR inversa incluiria todos os componentes de vetor pMal juntamente com MBP, Dm2 e Dm3 de GS062.

[0248] Misturas de Dm1 resgatadas foram montadas com o uso do kit de montagem de fragmento de DNA Invitrogen Geneart. A reação de montagem foi transformada em células quimicamente competentes Invitrogen Top10. Após a análise de sequências, todas as colônias foram agrupadas e tornadas uma preparação de plasmídeo misturada. O plasmídeo misturado foi transformado em células BL21 competentes Lucigen Electro para expressão de proteína.

[0249] Aproximadamente 3.000 colônias de E. coli (BL21) foram coletadas e triadas por expressão de proteína MBP-toxina de comprimento completo com o uso de Western blotting. Aproximadamente 400 clones que expressam toxina híbrida em fração solúvel em E. coli foram coletados e redispostos. A proteína foi purificada a partir desses clones e submetida a sua atividade de ECB em um ensaio de Sim/Não.

Então, 40 clones ativos, com base na atividade de ECB, dentre os 400 clones triados foram redispostos e sequenciados. Mediante sequenciamento, os clones redundantes (clones com a mesma sequência) foram removidos, e apenas 16 clones exclusivos foram redispostos, purificados e testados quanto a sua atividade específica em ECB e SBL em uma forma de resposta à dosagem.

[0250] Devido à falta de homologia suficiente entre os Dm1s selecionados para embaralhamento, muitos clones têm Dm1 inteiro ou Dm1 com mutações aleatórias trocados pela cadeia principal de GS062 (Dm2-Dm3). Os Dm1s dessas 16 ocorrências vêm de MP477 (SEQ ID NO: 223), GS128 (SEQ ID NO: 244) e GS002 (SEQ ID NO: 235). Esses 16 clones foram testados quanto a sua atividade de ECB e SBL em forma de resposta à dosagem. Nenhum desses 16 clones rendeu qualquer número de atividade específica mensurável (IC ou LC50) em ECB conforme testado, mas 1 clone com Dm1 de GS002 mostrou boa atividade de SBL (Tabela 8). Tabela 8. Atividade de Dm1 trocado por cadeia principal de GS062 *N.A. significa não ativo conforme testado; N.M. significa nenhuma mortalidade conforme testado; e N.D. Significa não determinado

[0251] IPRS-C49 não mostrou nenhuma atividade em CEW e FAW conforme testado, mas foi altamente ativa em SBL,

moderadamente ativa em VBC e ligeiramente ativa em ECB (Consultar a Tabela 8).

[0252] IPRS-C49 (SEQ ID NO: 112) foi selecionada com a cadeia principal para embaralhamento de Dm3 adicional (consultar o Exemplo 3) na medida em que foi mais ativa em comparação aos três outros clones ativos. Seis Dm3s, de Cry1Ca, Cry1Cb, Cry1Da, Cry1Ab, Cry1Ac e Cry1Be, foram selecionados como fontes de diversidade.

[0253] Todos os 30 clones possíveis foram purificados e testados quanto a sua atividade contra CEW e FAW. Quatro variantes foram ativas em CEW, mas não em FAW conforme testado. Duas das quatro variantes ativas foram selecionadas para estudos de espectro de atividade de lepidópteros adicionais e mostraram atividade melhorada contra ECB, SBL e VBC (Tabela 9). Tabela 9. Atividade de variante embaralhada de Dm3 de C49.

*N.A. significa não ativo conforme testado; N.M. significa nenhuma mortalidade conforme testado; N.D. Significa não determinado; e F número é o ponto de intersecção

[0254] Embaralhamento similar foi concluído com o uso de GS047 (SEQ ID NO: 228). Todos os 30 clones possíveis foram purificados e testados quanto a sua atividade contra CEW e FAW. Quatro variantes foram ativas em FAW. Todas as quatro mostraram atividade de FAW conforme testado (SEQ ID NOs: 275 a 278, codificadas pelas SEQ ID NOs: 271 a 274 respectivamente). Exemplo 8: Trocas de alça alfa de Dm1 (embaralhamento de alça alfa 3, 4, 5, 3-4, 4-5 e 3-5) em C16 e C21

[0255] Com base no sucesso da estratégia de embaralhamento de fragmento de alça alfa 3-5 (empregada em diferentes estratégias de embaralhamento de blocos), hélices alfa individuais e combinação de hélices alfa embaralhadas foram testadas para mostrarem qual hélice ou hélices alfa podem melhorar a atividade ou expressão solúvel. O fragmento de alça alfa 3-5 embaralhado em bibliotecas anteriores incluiu a alça alfa 3, 4 e apenas uma porção da alça alfa 5. Nessa biblioteca, alça alfa 3 embaralhada, alça alfa 4 e alça alfa 5 inteira individualmente ou em combinação em duas variantes embaralhadas de blocos C16 e C21. O fragmento de alça alfa 3-5 embaralhado nessa biblioteca era ligeiramente maior do que os fragmentos de alça alfa 3-5 embaralhados em todas as bibliotecas anteriores (consultar as Figuras 8 e 9).

[0256] As alças alfa 3, 4, 5, 3-4, 4-5 e 3-5 foram amplificadas por PCR a partir de 45 fragmentos de Dm1 sintetizados (consultar a Figura 11). Diferentes fragmentos de alça alfa de Cry1Ca foram obtidos a partir de C21 que continha o fragmento de alça alfa 3-5 de Cry1Ca. Seis diferentes agrupamentos de fragmentos de alça alfa individuais ou combinatórios por cadeia principal (agrupamento de alça alfa 3, agrupamento 4, agrupamento 5, agrupamento 3-4, agrupamento 4-5 e agrupamento 3-5) foram feitos. Os fragmentos alfa de Cry1Ea e Cry1Ca não foram incluídos nos agrupamentos correspondendo a C16 e C21 respectivamente para evitar a geração de cadeias principais progenitoras. Todos os agrupamentos foram digeridos com Dpn- 1 e purificados em gel para evitar contaminação de progenitores. A Tabela 10 mostra que diferentes hélices alfa de domínio 1 foram amplificadas por PCR. Diferentes fragmentos alfa de Cry1Ca foram obtidos como C21 que contém fragmento de alça alfa 3-5 de Cry1Ca.

[0257] As cadeias principais de vetor C16 e C21 para as regiões de alça alfa 3, 4, 5, 3-4, 4-5 e 3-5 correspondentes foram geradas por PCR inversa, excluindo a região a ser embaralhada com o uso de iniciadores específicos para cadeia principal.

[0258] Doze reações de montagem (seis agrupamentos/cadeia principal) foram realizadas. As cadeias principais purificadas em gel foram montadas com o respectivo agrupamento de fragmentos de hélice alfa para obter todas as variantes no vetor pMal a ser expresso como proteínas de fusão de MBP. Todas as variantes exclusivas foram redispostas após a confirmação de sequência, e apenas aqueles clones que foram expressos em fração solúvel foram adicionalmente purificados e testados quanto a sua atividade de inseto. As variantes baseadas em C16 foram testadas contra FAW, e as variantes C21 foram testadas contra CEW, na medida em que C16 e C21 são ativas em FAW e CEW respectivamente. Quatorze variantes ativas foram isoladas (8 da cadeia principal C16 e 6 da cadeia principal C21). A tabela 10 mostra a atividade testada das variantes.

Tabela 10. Atividade inseticida de variantes de alça alfa 3, 4, 5, 3-4, 4-5, e 3-5 de C16 e C21

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Polipeptídeo inseticida caracterizado pelo fato de que compreende uma região de alça alfa heteróloga, em que o polipeptídeo inseticida é derivado de uma toxina Cry.

2. Polipeptídeo inseticida, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a região de alça alfa heteróloga possui pelo menos uma sequência consenso de borda que compreende uma sequência de aminoácidos que possui pelo menos 90% de identidade de sequência com qualquer uma das SEQ ID NOs: 247, 248, 249, 250 ou 258.

3. Polipeptídeo inseticida, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a pelo menos uma sequência consenso de borda que possui pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 247 compreende i. uma histidina ou arginina na posição 1 da SEQ ID NO: 247; ii. uma valina, metionina ou leucina na posição 2 da SEQ ID NO: 247; iii. uma leucina na posição 3 da SEQ ID NO: 247; iv. uma arginina, ácido glutâmico, leucina ou serina na posição 4 da SEQ ID NO: 247; ou v. uma isoleucina na posição 5 da SEQ ID NO: 247.

4. Polipeptídeo inseticida, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a região de alça alfa heteróloga é exposta a um solvente.

5. Polipeptídeo inseticida, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo inseticida compreende um polipeptídeo derivado de Cry1 de classe Bt.

6. Polipeptídeo inseticida, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo inseticida compreende uma sequência de aminoácidos que possui pelo menos 90% de identidade de sequência com qualquer uma das sequências conforme apresentado nas SEQ ID NOs: 57 a 112.

7. Polinucleotídeo isolado caracterizado pelo fato de que codifica o polipeptídeo inseticida conforme definido na reivindicação 1.

8. Polinucleotídeo isolado, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo isolado compreende uma sequência de ácidos nucleicos que possui pelo menos 90% de identidade de sequência com qualquer uma das sequências conforme apresentado nas SEQ ID NOs: 1 a 56.

9. Construto de DNA caracterizado pelo fato de que compreende o polinucleotídeo conforme definido na reivindicação 7.

10. Célula hospedeira caracterizada pelo fato de que compreende o construto de DNA conforme definida na reivindicação 9.

11. Célula hospedeira, de acordo com a reivindicação 10, caracterizada pelo fato de que a célula hospedeira é uma célula vegetal.

12. Célula hospedeira, de acordo com a reivindicação 10, caracterizada pelo fato de que a célula hospedeira é uma célula bacteriana.

13. Planta transgênica caracterizada pelo fato de que compreende o construto de DNA conforme definida na reivindicação 9.

14. Método para alterar a atividade de um polipeptídeo inseticida caracterizado pelo fato de que compreende: a. Embaralhar uma região de alça alfa de um primeiro polipeptídeo inseticida a uma região de alça alfa correspondente do domínio 1 de um segundo polipeptídeo inseticida criando um polipeptídeo inseticida heterólogo; e b. Triar o polipeptídeo heterólogo por atividade inseticida alterada; em que o polipeptídeo inseticida é derivado de uma toxina Cry.

15. Método, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que a região de alça alfa compreende pelo menos uma das alças alfa 3, 4 ou 5.

16. Método, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que a região de alça alfa compreende uma sequência de borda que possui pelo menos 90% de identidade de sequência com qualquer uma das SEQ ID NOs: 247, 248, 249, 250 ou 258.

17. Método, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente modificar uma planta para codificar o peptídeo heterólogo que tem atividade inseticida alterada.

18. Método, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que a região de alça alfa se origina de uma toxina Cry, e adicionalmente em que a toxina Cry possui uma sequência de aminoácidos que compreende uma sequência que possui pelo menos 95% de identidade de sequência com qualquer uma das SEQ ID NOs: 159 a 180 ou 214 a 246.

19. Polinucleotídeo isolado caracterizado pelo fato de que compreende um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo inseticida, em que o polipeptídeo inseticida compreende uma região de alça alfa heteróloga no domínio 1, e em que o polipeptídeo inseticida é derivado de uma toxina Cry.

20. Polinucleotídeo isolado, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente um promotor heterólogo ligado de maneira funcional ao polinucleotídeo isolado.

21. Polinucleotídeo isolado, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo inseticida compreende adicionalmente um polinucleotídeo heterólogo que codifica a região de alça alfa heteróloga.

22. Cassete de expressão caracterizado pelo fato de que compreende o polinucleotídeo isolado conforme definido na reivindicação 19.

23. Construto de DNA caracterizado pelo fato de que compreende o cassete de expressão conforme definido na reivindicação 22.

24. Célula hospedeira caracterizada pelo fato de que compreende o construto de DNA conforme definida na reivindicação 23.

25. Célula hospedeira, de acordo com a reivindicação 24, caracterizada pelo fato de que a célula hospedeira é uma célula bacteriana.

26. Célula hospedeira, de acordo com a reivindicação 24, caracterizada pelo fato de que a célula hospedeira é uma célula vegetal.

27. Método para alterar a atividade inseticida de um polipeptídeo inseticida caracterizado pelo fato de que compreende: i. Embaralhar o domínio 3 de uma proteína inseticida derivada de uma toxina Cry, em que o embaralhamento compreende uma intersecção no domínio 3 em uma sequência consenso, em que a sequência de intersecção possui pelo menos 90% de identidade de sequência com qualquer uma das SEQ ID NOs: 251 a 257; e ii. Triar o polipeptídeo inseticida embaralhado por atividade inseticida alterada.

28. Método, de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo inseticida embaralhado compreende um fragmento heterólogo do domínio 3.

29. Método, de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pelo fato de que a porção heteróloga do domínio 3 compreende um fragmento derivado de uma toxina Cry1If, Cry1Cb, Cry1Fa, Cry 9Eb, Cry1Ae, Cry1Ja, Cry1Da, Cry1Bb ou Cry1Ca.

30. Método, de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pelo fato de que a porção heteróloga do domínio 3 compreende um fragmento que possui pelo menos 95% de identidade de sequência com qualquer uma das SEQ ID NOs: 159 a 180, 214 a 246, 259 a 265 ou 268 a 270.

31. Método, de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente modificar uma planta para codificar o peptídeo heterólogo que tem atividade inseticida alterada antes da dita etapa de triagem.

32. Polipeptídeo inseticida recombinante caracterizado pelo fato de que possui pelo menos 95% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOs: 57 a 112 ou 214 a 246, ou fragmentos das mesmas, em que o polipeptídeo inseticida recombinante tem atividade inseticida.

33. Composição caracterizada pelo fato de que compreende pelo menos um polipeptídeo inseticida recombinante conforme definido na reivindicação 32.

34. Polinucleotídeo recombinante caracterizado pelo fato de que codifica o polipeptídeo inseticida conforme definido na reivindicação 32.

35. Polinucleotídeo recombinante, de acordo com a reivindicação 34, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo possui códons otimizados para a expressão em uma cultura agricolamente importante.

36. Polinucleotídeo recombinante, de acordo com a reivindicação 34, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo recombinante compreende uma sequência de ácidos nucleicos que possui pelo menos 95% de identidade de sequência com qualquer uma das SEQ ID NOs: 1 a 56 ou 181 a

213.

37. Polinucleotídeo recombinante, de acordo com a reivindicação 34, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo recombinante é ligado de maneira funcional a um promotor heterólogo.

38. Construto de DNA caracterizado pelo fato de que compreende o polinucleotídeo recombinante conforme definido na reivindicação 34 ligado de maneira funcional a um elemento regulatório heterólogo.

39. Célula hospedeira caracterizada pelo fato de que é transformada com o construto de DNA conforme definida na reivindicação 38.

40. Célula hospedeira, de acordo com a reivindicação 39, caracterizada pelo fato de que a célula hospedeira é uma célula bacteriana ou uma célula vegetal.

41. Célula hospedeira, de acordo com a reivindicação 40, caracterizada pelo fato de que a célula vegetal é uma monocotiledônea ou uma dicotiledônea.

42. Planta transgênica caracterizada pelo fato de que compreende o polinucleotídeo conforme definido na reivindicação 34.

43. Planta transgênica caracterizada pelo fato de que compreende o construto de DNA conforme definida na reivindicação 38.

44. Método para inibir o crescimento ou morte de uma população de praga ou inseto-praga caracterizado pelo fato de que compreende colocar a população de praga ou inseto- praga em contato com um polipeptídeo inseticida que compreende uma região de alça alfa heteróloga no domínio 1,

em que o polipeptídeo inseticida é derivado de uma toxina Cry.

45. Método para inibir o crescimento ou morte de uma população de praga ou inseto-praga caracterizado pelo fato de que compreende expressar em uma planta o polinucleotídeo, conforme definido na reivindicação 34.

46. Método, de acordo com a reivindicação 44, caracterizado pelo fato de que a população de praga ou inseto-praga é resistente a pelo menos uma proteína inseticida Cry.

47. Construto de DNA caracterizado pelo fato de que compreende um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo que possui pelo menos 95% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOs: 57 a 112, 214 a 246 e 275 a 278; e um elemento regulatório heterólogo, em que o elemento regulatório heterólogo é ligado de maneira funcional ao polinucleotídeo.

48. Construto de DNA, de acordo com a reivindicação 47, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo compreende uma sequência de ácidos nucleicos que possui pelo menos 95% de identidade de sequência com qualquer uma das SEQ ID NOs: 1 a 56, 181 a 213 ou 271 a 274.

49. Planta transgênica caracterizada pelo fato de que compreende o construto de DNA conforme definida na reivindicação 47.