EA020327B1 - Гены токсинов и способы их применения - Google Patents

Abstract

Предлагаются композиции и способы придания пестицидной активности бактериям, растениям, клеткам, тканям и семенам растений. Предлагаются композиции, содержащие кодирующую последовательность для полипептида дельта-эндотоксина. Кодирующие последовательности могут быть использованы в ДНК-конструкциях или экспрессирующих кассетах для трансформации и экспрессии в растениях и бактериях. Композиции также содержат трансформированные бактерии, растения, клетки, ткани и семена растений. В частности, предлагаются выделенные молекулы нуклеиновых кислот дельта-эндотоксинов. Кроме того, изобретение охватывает аминокислотные последовательности, соответствующие полинуклеотидам, и антитела, специфически связывающиеся с этими аминокислотными последовательностями. В частности, настоящее изобретение относится к выделенным молекулам нуклеиновых кислот, содержащим нуклеотидные последовательности, кодирующие аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 61-121 и 133-141, или нуклеотидную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 1-60, 124-132 и 142-283, а также их варианты и фрагменты.

Description

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к области молекулярной биологии. Описаны новые гены, которые кодируют пестицидные белки. Эти белки и последовательности нуклеиновых кислот, которые их кодируют, можно использовать для получения пестицидных составов и для получения трансгенных растений, устойчивых к вредителям.

Уровень техники

ВасШик Шигтдкпкй представляет собой грамположительную спорообразующую почвенную бактерию, отличающуюся своей способностью продуцировать кристаллические включения, которые особенно токсичны для некоторых отрядов и видов насекомых, но безвредны для растений и других, не являющихся мишенью организмов. По этой причине композиции, включающие штаммы ВасШик Шигтдкпкй или их инсектицидные белки, могут быть использованы в качестве приемлемых с экологической точки зрения инсектицидов для контроля насекомых-вредителей сельскохозяйственных культур или насекомых-переносчиков большого числа заболеваний человека или животных.

Кристаллические (Сгу) белки (δ-эндотоксины) бактерии ВасШик Шигшдкпкк обладают выраженной инсектицидной активностью преимущественно в отношении личинок бабочек, двукрылых насекомых и жуков. Также было показано, что эти белки активны против отрядов вредителей Нушепор1ега. Нотор1ега. Р1Н1нгар(ега, Майорйада и Асап, а также других отрядов беспозвоночных, таких как ЫешаШе1ш1пШек, Р1а1уйе1шшШек и Багсотакйдогрйога (Рейе1коп (1993) Т1е ВасШик Тйигтдкпкк Гашйу 1гее. В руководстве Абуапсеб Епдшеегеб Рек!к1бек, Магсе1 Эеккег, 1пс., Ыеет Уогк, Ν.Υ.) эти белки первоначально классифицировали как Сгу1-СгуУ, на основании главным образом их инсектицидной активности. Основными классами являлись ЬерШор1ега-специфичные (I), Ьер1бор!ега- и Э1р1ега-специфичные (II), Со1еор!ега-специфичные (III), Э|р1ега-специфичные (IV) и специфичные к нематодам (V) и (VI). Белки дополнительно классифицировали на подсемейства; более близкородственным белкам в каждом семействе присваивали буквы разделов, такие как СМА, СгуГВ, СМС и т.д. Еще более близкородственным белкам в каждом разделе давали названия, такие как СгуЮ, Сгу!С2 и т.п.

Недавно для генов Сгу была предложена новая номенклатура на основании гомологии аминокислотной последовательности вместо специфичности к насекомым-мишеням (Спскшоге е! а1. (1998) МкгоЫо1. Мо1. Вю1. Реу. 62:807-813). В новой классификации каждый токсин имеет уникальное обозначение, включающее основной таксономический уровень (арабская цифра), вторичный таксономический уровень (заглавная буква), третичный таксономический уровень (строчная буква) и четвертичный таксономический уровень (другая арабская цифра). В новой классификации в основном таксономическом уровне римские цифры заменили арабскими цифрами. Белки, последовательность которых гомологична менее чем на 45%, имеют разные основные таксономические уровни, а критерии для вторичных и третичных таксономических уровней составляют 78 и 95% соответственно.

Кристаллический белок не проявляет инсектицидной активности до тех пор, пока он не будет поглощен насекомыми и солюбилизирован в его средней кишке. В пищеварительном тракте насекомого протоксин гидролизуется протеазами до активной токсичной молекулы (Нойе и \У1Ше1еу (1989) МкгоЫо1. Кеу. 53:242-255). Этот токсин связывается с рецепторами на апикальной поверхности щеточной каемки средней кишки мишеневых личинок и встраивается в апикальную мембрану, образуя ионные каналы или поры, приводящие к гибели личинки.

δ-Эндотоксины, как правило, имеют пять доменов с консервативными последовательностями и три консервативных структурных домена (см., например, статью бе Маадб е! а1. (2001) Тгепбк СепеБск 17:193-199). Первый консервативный структурный домен состоит из семи α-спиралей и участвует во встраивании в мембрану и образование пор. Домен II состоит из трех β-складчатых слоев, расположенных в конфигурации греческий ключ, и домен III состоит из двух антипараллельных β-складчатых слоев в расположении рулет с вареньем (бе Маадб е! а1., 2001, выше). Домены II и III участвуют в распознавании и связывании рецептора и поэтому имеют детерминанты специфичности к токсину.

Интенсивное применение инсектицидов на основе В. Шшгпдкпкк уже привело к достижению устойчивости в популяциях на полях капустной моли Р1и!е11а ху1ок!е11а (Еегге и Vаη Рю (2002) Аппи. Реу. Еп!ошо1. 47:501-533). Самым распространенным механизмом устойчивости является снижение связывания токсина со своим(и) специфическим(и) рецептором(ами) средней кишки. Это к тому же может приводить к перекрестной резистентности с другими токсинами, которые также используют этот рецептор (Еегге и Vап Рю (2002)).

Сущность изобретения

Настоящее изобретение относится к композициям и способам придания устойчивости бактериям, растениям, клеткам, тканям и семенам растений к вредителям. Композиции включают молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие последовательности полипептидов δ-эндотоксинов, векторы, содержащие эти молекулы нуклеиновых кислот, и клетки-хозяева, содержащие векторы. Композиции также включают полипептидные последовательности эндотоксина и антитела против этих полипептидов. Нуклеотидные последовательности могут быть использованы в ДНК-конструкциях или экспрессионных кассетах для трансформации и экспрессии в организмах, в том числе микроорганизмах и растениях. Нуклеотид

- 1 020327 ные или аминокислотные последовательности могут быть синтетическими последовательностями, которые были получены для экспрессии в организме, в том числе, но ими не ограничиваясь, в микроорганизме или растении. Композиции также содержат трансформированные бактерии, растения, клетки, ткани и семена растений.

В частности, изобретение относится к выделенным молекулам нуклеиновых кислот, соответствующим последовательностям нуклеиновых кислот δ-эндотоксинов. Кроме того, изобретение относится к аминокислотным последовательностям, соответствующим этим полинуклеотидам. В частности, настоящее изобретение относится к выделенной молекуле нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность БЕЦ ΙΌ N0: 61-121 и 133-141 или нуклеотидную последовательность БЕЦ ΙΌ N0: 1-60 и 124-132, а также их варианты и фрагменты. Изобретение также относится к нуклеотидным последовательностям, которые комплементарны нуклеотидной последовательности по изобретению или которые гибридизуются с последовательностью по изобретению.

Композиции и способы по изобретению можно использовать для получения организмов, обладающих устойчивостью к пестицидам, конкретно бактерий и растений. Эти организмы и композиции, полученные из них, предпочтительны для целей сельского хозяйства. Композиции по изобретению также можно использовать для получения измененных или улучшенных белков δ-эндотоксинов, которые обладают пестицидной активностью, или для определения наличия белков или нуклеиновых кислот δэндотоксинов в продуктах или организмах.

Подробное описание

Настоящее изобретение относится к композициям и способам регуляции устойчивости к вредителям у организмов, конкретно растений или растительных клеток. Способы включают трансформацию организмов нуклеотидной последовательностью, кодирующей белок δ-эндотоксин по изобретению. В частности, нуклеотидные последовательности по изобретению можно использовать для получения растений и микроорганизмов, которые обладают пестицидной активностью. Таким образом, настоящее изобретение относится к трансформированным бактериям, растениям, клеткам растений, тканям и семенам растений. Композиции представляют собой нуклеиновые кислоты и белки δ-эндотоксинов бактерии ВасШик 11шппщепк1к. Последовательности можно использовать для конструирования векторов экспрессии для последующей трансформации в интересующие организмы в качестве зондов для выделения других генов δ-эндотоксинов и для получения измененных пестицидных белков способами, известными в данной области, например обмен доменами или перетасовка ДНК. Белки можно использовать для контроля или уничтожения популяций бабочек, жуков и нематод-вредителей и для получения композиций с пестицидной активностью.

Под δ-эндотоксином понимают токсин бактерии ВасШик Шитшд1епк1к, который обладает токсичностью в отношении одного или нескольких вредителей, включая, но ими не ограничиваясь, члены отрядов БерШор1ега. Э|р1ега и Со1еор!ета, или представители типа №ша!оба, или белок, который гомологичен такому белку. В некоторых случаях белки δ-эндотоксины были выделены из других организмов, в том числе из С1ок1пШит Ы£етшеп1апк и РаешЬасШик рорИНае. Белки δ-эндотоксины включают аминокислотные последовательности, полученные из полноразмерных нуклеотидных последовательностей, описанных в настоящем документе, и аминокислотные последовательности, которые короче полноразмерных последовательностей либо вследствие использования альтернативного сайта начала транскрипции, либо вследствие процессинга, при котором продуцируется более короткий белок, обладающий пестицидной активностью. Процессинг может происходить в организме, в котором белок экспрессируется, или у вредителя после попадания белка в организм.

К δ-эндотоксинам относятся белки, обозначаемые как сгу1-сгу43, су11 и су!2, и Су1-подобный токсин. На сегодняшний день существует более 250 известных видов δ-эндотоксинов с широким диапазоном специфичностей и токсичностей. Для расширенного перечня см. статью Спскшоге е! а1. (1998), ΜίстоЬю1. Мо1. Вю1. Веу. 62:807-813, и регулярные обновления доступны на сайте Спскшоге е! а1. (2003) ВасШик Шиппщепк1к !охт потепс1а!ите \\л\лу.Ью1к.кикх.ас.ик/Ноте/№П Спсктоге/Ы/тбех.

В настоящем документе представлены новые выделенные нуклеотидные последовательности, которые придают пестицидную активность. Также в документе описаны аминокислотные последовательности белков δ-эндотоксинов. Белок, полученный после трансляции этого гена, дает возможность клеткам контролировать или уничтожать вредителей при попадании этого белка в организм.

Выделенные молекулы нуклеиновых кислот и их варианты и фрагменты

Один из аспектов изобретения относится к выделенным или рекомбинантным молекулам нуклеиновых кислот, содержащим нуклеотидные последовательности, кодирующие белки и полипептиды δэндотоксины или их биологически активные участки, а также к молекулам нуклеиновых кислот, достаточным для применения в качестве гибридизационных зондов для идентификации нуклеиновых кислот, кодирующих δ-эндотоксины. Под используемым в настоящем документе термином молекула нуклеиновой кислоты понимают молекулы ДНК (например, рекомбинантную ДНК, кДНК или геномную ДНК) и молекулы РНК (например, мРНК) и аналоги ДНК или РНК, полученные с использованием аналогов нук

- 2 020327 леотидов. Молекула нуклеиновой кислоты может быть одноцепочечной или двухцепочечной, но предпочтительно представляет собой двухцепочечную ДНК.

Выделенная или очищенная молекула нуклеиновой кислоты, или белок, или их биологически активный участок, по существу, свободны от другого клеточного материала или культуральной среды при получении методами рекомбинантных ДНК, или, по существу, свободны от химических предшественников или других химических веществ при химическом синтезе. Предпочтительно выделенная нуклеиновая кислота свободна от последовательностей (предпочтительно последовательностей, кодирующих белок), которые в природных условиях фланкируют нуклеиновую кислоту (т.е. последовательностей, расположенных на 5'- и 3'-концах нуклеиновой кислоты) в геномной ДНК организма, из которого получена нуклеиновая кислота. Для целей изобретения выделенная в случае использования в отношении молекул нуклеиновых кислот исключает выделенные хромосомы. Например, в большом числе вариантов осуществления выделенная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая δ-эндотоксин, может содержать менее чем около 5, 4, 3, 2, 1, 0,5 или 0,1 т.п.н. нуклеотидных последовательностей, которые в природных условиях фланкируют молекулу нуклеиновой кислоты в геномной ДНК клетки, из которой нуклеиновая кислота получена. К белку δ-эндотоксину, который, по существу, свободен от клеточного материала, относятся препараты белка, имеющие меньше чем около 30, 20, 10 или 5% (сухой массы) белка, отличающегося от δ-эндотоксина (также обозначаемого в настоящем документе как контаминантный белок).

К нуклеотидным последовательностям, кодирующим белки по настоящему изобретению, относятся последовательность 8ЕЦ ΙΌ N0: 1-60 и 124-132, а также ее варианты, фрагменты и комплементарные последовательности. Под комплементарной последовательностью понимают нуклеотидную последовательность, которая в достаточной степени комплементарна заданной нуклеотидной последовательности, так что она может гибридизоваться с ней, образуя стабильный дуплекс.

Аминокислотная последовательность белка δ-эндотоксина, кодируемого нуклеотидной последовательностью, соответствует последовательностям 8ЕЦ ΙΌ N0: 61-121 и 133-141.

Молекулы нуклеиновых кислот, которые представляют собой фрагменты нуклеотидных последовательностей, кодирующих δ-эндотоксин, входят в состав настоящего изобретения. Под фрагментом понимают участок нуклеотидной последовательности, кодирующей белок δ-эндотоксин. Фрагмент нуклеотидной последовательности может кодировать биологически активный участок белка δ-эндотоксина, или он может представлять собой фрагмент, который может быть использован в качестве зонда для гибридизации или ПЦР-праймера, используя способы, описанные ниже. Молекулы нуклеиновых кислот, которые представляют собой фрагменты нуклеотидной последовательности δ-эндотоксина, содержат по меньшей мере около 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200, 1250, 1300, 1350,

1400, 1450, 1500, 1550, 1600, 1650, 1700, 1750, 1800, 1850, 1900, 1950, 2000, 2050, 2100, 2150, 2200, 2250,

2300, 2350, 2400, 2450, 2500, 2550, 2600, 2650, 2700, 2750, 2800, 2850, 2900, 2950, 3000, 3050, 3100, 3150,

3200, 3250, 3300, 3350 последовательных нуклеотидов или вплоть до количества нуклеотидов, присутствующего в полноразмерной нуклеотидной последовательности, кодирующей δ-эндотоксин, описанной в настоящем документе, в зависимости от заданной цели. Под последовательными нуклеотидами понимают нуклеотидные остатки, которые непосредственно соседствуют друг с другом. Фрагменты нуклеотидных последовательностей по настоящему изобретению кодируют белковые фрагменты, которые сохраняют биологическую активность белка δ-эндотоксина и, следовательно, сохраняют пестицидную активность. Под сохраняют активность понимают, по меньшей мере, активность приблизительно 30%, по меньшей мере приблизительно 50%, по меньшей мере приблизительно 70, 80, 90, 95% или выше белка δэндотоксина у фрагмента. Способы измерения пестицидной активности хорошо известны в данной области. См., например, статьи Схар1а аиб Байд (1990) 1. Есоп. Еп1ошо1. 83:2480-2485; Аибтете е! а1. (1988) Вюсйет. 1. 252:199-206; Маггоие е! а1. (1985) 1. о£ Есоиошю Еи!ото1оду 78:290-293; и патент США 5743477, все они приводятся в настоящем документе в качестве ссылок в полном объеме.

Фрагмент кодирующей нуклеотидной последовательности δ-эндотоксина, который кодирует биологически активный участок белка по изобретению, должен кодировать по меньшей мере около 15, 25, 30, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 1000, 1050, 1100 последовательных аминокислот или вплоть до общего числа аминокислот, присутствующих в полноразмерном белке δ-эндотоксине по изобретению.

Предпочтительные белки δ-эндотоксины по настоящему изобретению кодируются нуклеотидной последовательностью с достаточной степенью идентичности нуклеотидной последовательности 8ЕС ΙΌ N0: 1-60 и 124-132. Под с достаточной степенью идентичности понимают аминокислотную или нуклеотидную последовательность, которая по меньшей мере на приблизительно 60 или 65% идентична последовательности, приблизительно на 70 или 75% идентична последовательности, приблизительно на 80 или 85% идентична последовательности, приблизительно на 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или выше идентична последовательности по сравнению с эталонной последовательностью, используя одну из программ выравнивания, описанных в настоящем документе, используя стандартные параметры. Специалисту в данной области будет понятно, что эти величины могут быть подходящим образом подогна

- 3 020327 ны для определения соответствующей идентичности белков, кодируемых двумя нуклеотидными последовательностями, учитывая вырожденность генетического кодона, сходность аминокислот, расположенность рамки считывания и подобное.

Для определения процента идентичности двух аминокислотных последовательностей или двух нуклеиновых кислот последовательности выравнивают для оптимального сравнения. Процент идентичности двух последовательностей представляет собой функцию от числа идентичных позиций, которые являются общими для последовательностей (т.е. процент идентичности = число идентичных позиций/общее число позиций (например, перекрывающиеся позиции) х 100). В одном из вариантов осуществления две последовательности имеют одинаковую длину. В другом варианте осуществления сравнение проводят по всей эталонной последовательности (например, по всей одной из 8ΕΟ ΙΌ N0: 1-60 и 124-132 или по всей из одной из 8Ε0 ΙΌ N0: 61-121 и 133-141). Процент идентичности двух последовательностей может быть определен, используя методики, аналогичные методикам, описанным ниже, с допущением или без допущения пропусков. При расчете процента идентичности обычно подсчитывают точное соответствие.

Определение процента идентичности двух последовательностей можно осуществлять, используя математический алгоритм. Не ограничивающим примером математического алгоритма, использованного для сравнения двух последовательностей, является алгоритм Катйи и Л118сйи1 (1990) Ргос. ΝαΙΙ. Асаб. 8сЕ И8А 87:2264, модифицированный в статье Катйи и А118сйи1 (1993) Ргос. ΝαΙΙ. Асаб. 8сЕ И8А 90:58735877. Такой алгоритм встроен в программы Β^А8ΤN и ВЬА8ТХ авторов А118сйц1 е! а1. (1990) 1. Мо1. Вю1. 215:403. Поиски нуклеотидных последовательностей в ВЬА8Т могут быть осуществлены с помощью программы ΒΕΛ8ΤΝ. баллы = 100, длина слова = 12, для получения нуклеотидных последовательностей, гомологичных молекулам δ-эндотоксинподобных нуклеиновых кислот по изобретению. Поиски белка в программе ВЬА8Т могут быть осуществлены с помощью программы ВЬА8ТХ, баллы = 50, длина слова = 3, для получения аминокислотных последовательностей, гомологичных молекулам белка δ-эндотоксина по изобретению. Для получения выравниваний с пропусками для сравнения может быть использована программа Оарреб ВЬА8Т (в ВЬА8Т 2.0), как описано в статье А1!8сйи1 е! а1. (1997) ШсШс Ас1б8 Вез. 25:3389. Альтернативно, для осуществления итеративного поиска, при котором определяются отдаленные сходства между молекулами, может быть использована программа Р81-В1аз1. См. статью А118сйи1 е! а1. (1997) выше. При использовании программ ВЬА8Т, Оарреб ВЬА8Т и Р81-В1аз! могут быть использованы параметры по умолчанию соответствующих программ (например, ВЬА8ТХ и ВЬА8ТЦ). Выравнивание также может быть осуществлено сравнением вручную.

Другим, не ограничивающим примером математического алгоритма, используемого для сравнения последовательностей, является алгоритм С1и81а1^ (Шддшз е! а1. (1994) ШсШс Ашбз Вез. 22:4673-4680). Алгоритм С1и8!а1^ сравнивает последовательности и полностью выравнивает аминокислотную или ДНК-последовательность и, таким образом, может предоставить данные о консервативности последовательности полноразмерной аминокислотной последовательности. Алгоритм С1и8!а1^ используется в нескольких коммерчески доступных пакетах программного обеспечения для анализа ДНК/аминокислот, таких как модуль Λ^IОNX пакета программ Уес!от ΝΠ (продукция фирмы 1иуйтодеи Сотротабои, Саг1зЬаб, СА). После выравнивания аминокислотных последовательностей с помощью программы С1из1а1\У может быть оценен процент аминокислотной идентичности. Не ограничивающим примером программного обеспечения, используемого для анализа выравниваний с помощью С1ив!а1^, является ΟΕΝΕΌΟΟ™. Программа ΟΕΝΕΌΟΟ™ (Каг1 №сйо1аз) дает возможность оценить сходность аминокислот (или ДНК) и идентичность большего числа белков. Другим, не ограничивающим примером математического алгоритма, используемого для сравнения последовательностей, является алгоритм Муегз и МШет (1998) САВЮ8 4:11-17. Такой алгоритм встроен в программу Λ^IОN (версия 2.0), которая является частью пакета программ ОСО ХУбсоозт Оеиебсз, Уетзюи 10 (доступного у фирмы Ассе1ту8, 1ис., 9685 8стаи!ои Вб., 8аи П1едо, СА, И8А). При использовании программы Λ^IОN для сравнения аминокислотных последовательностей могут быть использованы таблица весовых остатков РАМ120, штраф за длину пропуска - 12 и штраф за разрыв - 4.

Если не указано другое, для определения идентичности или сходности последовательностей используется программа ОАР Уетзюи 10, в которой используется алгоритм №еб1ешаи и ХУшъсй (1970) 1. Мо1. Вю1. 48 (3): 443-453, используя следующие параметры: % идентичности и % подобия нуклеотидной последовательности, используя штраф за пропуск 50 и штраф за удлинение 3 и матрицу замен иетздарбиа.сшр; % идентичности или % подобия для аминокислотной последовательности, используя штраф за пропуск 8 и штраф за удлинение 2 и матрицу замен ВЬ08иМ62. Также могут быть использованы эквивалентные программы. Под эквивалентной программой понимают любую программу сравнения последовательностей, которая производит выравнивание двух любых рассматриваемых последовательностей, имеющее совпадения идентичных нуклеотидных остатков, и идентичный процент гомологии последовательностей при сопоставлении с соответствующим выравниванием, полученным с помощью программы ОАР Уетзюи 10. Изобретение также относится к вариантам молекул нуклеиновых кислот. К вариантам нуклеотидных последовательностей, кодирующих δ-эндотоксин, относятся такие последовательности, которые кодируют белки δ-эндотоксины, описанные в настоящем документе, но которые

- 4 020327 отличаются вследствие вырожденности генетического кода, а также такие последовательности, которые в достаточной степени идентичны, как описано выше. Природные аллельные варианты могут быть идентифицированы с помощью хорошо известных молекулярно-биологических методик, таких как методы полимеразной цепной реакции (ПЦР) и гибридизации, описанных ниже. К вариантам нуклеотидных последовательностей также относятся синтетические нуклеотидные последовательности, которые были получены, например, используя сайт-направленный мутагенез, но которые сохраняют способность кодировать белки δ-эндотоксины, описанные в настоящем изобретении, как описано ниже. Варианты белков, описываемые в настоящем изобретении, биологически активны, то есть они сохраняют желательную биологическую активность нативного белка, то есть пестицидную активность. Под сохраняют активность понимают, что вариант обладает по меньшей мере около 30%, по меньшей мере около 50%, по меньшей мере около 70% или по меньшей мере около 80% пестицидной активности нативного белка. Способы измерения пестицидной активности хорошо известны в данной области. См., например, статьи Схар1а и Ьаид (1990) 1. Есоп. Еи1ото1. 83: 2480-2485; Лпбгс\\ъ е1 а1. (1988) Вюсйет. 1. 252:199-206; Маггопе е1 а1. (1985) 1. οί Есоиотк Еи1ото1оду 78:290-293 и патент США 5743477, которые приведены в настоящем документе в качестве ссылок в полном объеме.

Специалисту в данной области, кроме того, будет понятно, что изменения могут быть введены посредством мутации нуклеотидных последовательностей по изобретению, таким образом, изменяя аминокислотную последовательность кодируемых белков δ-эндотоксинов без изменения биологической активности белков. Таким образом, варианты выделенных молекул нуклеиновых кислот могут быть получены введением одной или нескольких нуклеотидных замен, добавок или делеций в соответствующую нуклеотидную последовательность, описанную в настоящем документе, так что в кодируемый белок вводятся одна или несколько аминокислотных замен, добавок или делеций. Мутации могут быть введены стандартными методиками, такими как сайт-направленный мутагенез и ПЦР-опосредованный мутагенез. Такие варианты нуклеотидных последовательностей также входят в состав настоящего изобретения.

Например, консервативные аминокислотные замены могут быть получены в одном или нескольких прогнозируемых заменимых аминокислотных остатках. Заменимый аминокислотный остаток представляет собой остаток, который может быть изменен у последовательности дикого типа белка δэндотоксина без изменения биологической активности, в то время как незаменимый аминокислотный остаток необходим для биологической активности. Консервативная аминокислотная замена представляет собой замену, при которой аминокислотный остаток заменяется аминокислотным остатком, имеющим сходную боковую цепь. Семейства аминокислотных остатков, имеющих сходные боковые цепи, были определены в данной области. Эти семейства включают аминокислоты с основными боковыми цепями (например, лизин, аргинин, гистидин), кислотными боковыми цепями (например, аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота), незаряженными полярными боковыми цепями (например, глицин, аспарагин, глютамин, серин, треонин, тирозин, цистеин), неполярными боковыми цепями (например, аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин, триптофан), β-разветвленными боковыми цепями (например, треонин, валин, изолейцин) и ароматическими боковыми цепями (например, тирозин, фенилаланин, триптофан, гистидин).

δ-Эндотоксины, как правило, имеют пять доменов с консервативными последовательностями и три консервативных структурных домена (См., например, статью бе Маадб е1 а1. (2001) Тгеибк Сеиебск 17:193-199). Первый консервативный структурный домен состоит из семи α-спиралей и участвует во встраивании в мембрану и образование пор. Домен II состоит из трех β-складчатых слоев, расположенных в конфигурации греческий ключ, а домен III состоит из двух антипараллельных β-складчатых слоев в расположении рулет с вареньем (бе Маадб е1 а1., 2001, выше). Домены II и III участвуют в распознавании и связывании рецептора и поэтому они имеют детерминанты специфичности для токсина.

Аминокислотные замены могут быть осуществлены в неконсервативных областях для сохранения их функций. В целом, такие замены, по всей видимости, не могут быть осуществлены с консервативными аминокислотными остатками или аминокислотными остатками, находящимися в консервативном повторе, когда такие остатки незаменимы для активности белка. Примерами остатков, которые являются консервативными и которые могут быть незаменимыми для активности белка, относятся, например, остатки, которые идентичны среди всех белков, в которых они содержатся, при выравнивании аминокислотных последовательностей по настоящему изобретению и известных последовательностей δэндотоксинов. Примерами остатков, которые являются консервативными, но но для которых можно провести консервативные аминокислотные замены с сохранением активности, относятся, например, остатки, которые имеют лишь консервативные замены между всеми белками, в которых они содержатся, при выравнивании аминокислотных последовательностей по настоящему изобретению и известных последовательностей δ-эндотоксинов. Тем не менее, специалисту в данной области будет понятно, что функциональные варианты могут иметь незначительные консервативные или неконсервативные изменения в консервативных остатках.

Альтернативно, варианты нуклеотидных последовательностей могут быть получены введением мутаций случайным образом на протяжении всей или части кодирующей последовательности, например, с

- 5 020327 помощью насыщающего мутагенеза, и полученные мутанты могут быть скринированы на способность придавать активность δ-эндотоксина для идентифицикации мутантов, которые сохраняют активность. После мутагенеза кодируемый белок может быть экспрессирован с помощью рекомбинантных техник, и активность белка может быть определена, используя стандартные методы анализа.

Используя способы, такие как ПЦР, гибридизация и подобное, могут быть идентифицированы соответствующие последовательности δ-эндотоксинов, причем такие последовательности обладают существенной идентичностью с последовательностями по изобретению. См., например, руководства 8атЬтоок и Киззе11 (2001) Мо1еси1аг С1опшд: А ЬаЬота1огу Мапиа1. (Со1й 8рпп§ НагЬот ЬаЬотаЮту Ргезз, Со1й 8ρτίη§ НагЬог, ΝΥ) и Ιηηίδ, е1 а1. (1990) РСК Рго1осо1з: А Сшйе 1о Ме11юйз апй Аррйсайопз (Асайетю Ргезз, ΝΥ).

В способе гибридизации вся или часть нуклеотидной последовательности δ-эндотоксина может быть использована для скрининга кДНК или геномных библиотек. Способы создания таких кДНК и геномных библиотек хорошо известны в данной области и описаны в руководстве 8атЬтоок апй Киззе11, 2001, выше. Так называемые зонды для гибридизации могут представлять собой фрагменты геномной ДНК, фрагменты кДНК, фрагменты РНК или другие олигонуклеотиды и могут быть помечены с помощью детектируемой группы, такой как ³²Р, или любого другого детектируемого маркера, такого как другие радиоизотопы, флуоресцентное соединение, фермент или кофактор фермента. Зонды для гибридизации могут быть получены мечением синтетических олигонуклеотидов, основанных на известной кодирующей δ-эндотоксин нуклеотидной последовательности, описанной в настоящем документе. Кроме того, могут быть использованы вырожденные праймеры, созданные на основе консервативных нуклеотидов или аминокислотных остатков в нуклеотидной последовательности или кодируемой аминокислотной последовательности. Зонд обычно содержит область нуклеотидной последовательности, которая гибридизуется в жестких условиях по меньшей мере с около 12, по меньшей мере с около 25, по меньшей мере с около 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350 или 400 последовательными нуклеотидами δэндотоксинкодирующей нуклеотидной последовательности по изобретению или ее фрагментом или вариантом. Способы получения зондов для гибридизации хорошо известны в данной области и описаны в руководстве 8атЬтоок апй Киззе11, 2001, выше, приведенном в данном документе в качестве ссылки.

Например, в качестве зонда, способного специфически гибридизоваться с соответствующими δэндотоксинподобными последовательностями и матричными РНК, могут быть использованы полноразмерная последовательность δ-эндотоксина, описанная в настоящем документе, или один или несколько ее участков. Для достижения специфической гибридизации в различных условиях такие зонды включают последовательности, которые уникальны и предпочтительно составляют по меньшей мере около 10 нуклеотидов в длину или по меньшей мере около 20 нуклеотидов в длину. Такие зонды могут быть использованы для амплификации соответствующих последовательностей δ-эндотоксина из выбранного организма с помощью ПЦР. Этот метод может быть использован для выделения из желаемого организма дополнительных кодирующих последовательностей или в качестве диагностического анализа для определения наличия в организме кодирующих последовательностей. К техникам гибридизации относится гибридизационный скрининг библиотек ДНК (либо бляшек, либо колоний; См., например, 8атЬтоок е1 а1. (1989) Мо1еси1аг С1ошпд: А ЬаЬотаЮту Мапиа1 (2й ей., Со1й 8рпп§ НагЬог ЬаЬота1огу Ргезз, Со1й 8рпп§ НагЬог, Νονν Уогк).

Г ибридизация таких последовательностей может быть осуществлена в жестких условиях. Под жесткими условиями или жесткими условиями гибридизации понимают условия, при которых зонд будет гибридизоваться со своей мишеневой последовательностью, с регистрируемой более высокой степенью, чем с другими последовательностями (например, по меньшей мере в 2 раза выше фонового значения). Жесткие условия зависят от последовательности и различаются при различных условиях. Регулируя жесткость гибридизации и/или условия промывки, могут быть идентифицированы мишеневые последовательности, которые на 100% комплементарны зонду (гомологичное зондирование).

Альтернативно, условия жесткости могут быть доведены до некоторого несоответствия в последовательностях, чтобы регистрировалась меньшая степень подобия (гетерологичное зондирование). Как правило, зонд составляет менее около 1000 нуклеотидов в длину, предпочтительно менее 500 нуклеотидов в длину.

Обычно жесткие условия представляют собой такие условия, в которых концентрация соли составляет менее около 1,5М иона Νι обычно концентрация иона №1 (или других солей) от около 0,01 до 1,0М при величине рН от 7,0 до 8,3, и температура равняется по меньшей мере около 30°С для коротких зондов (например, от 10 до 50 нуклеотидов) и по меньшей мере около 60°С для длинных зондов (например, больше чем 50 нуклеотидов). Жесткие условия также могут быть получены путем добавления дестабилизирующих агентов, таких как формамид. Характерные условия низкой жесткости включают гибридизацию с помощью буферного раствора от 30 до 35% формамида, 1М №С1, 1% 8Ό8 (додецилсульфат натрия) при 37°С и промывку в от 1-кратного до 2-кратного 88С (20-кратный 88С=3,0М №1С1/0.3М тринатриевый цитрат) при от 50 до 55°С. Характерные условия умеренной жесткости включают гибридизацию в от 40 до 45% формамиде, 1,0М №С1, 1% 8Ό8 при 37°С и промывку в от 0,5-кратного до 1

- 6 020327 кратного 88С при от 55 до 60°С. Характерные условия высокой жесткости включают гибридизацию в 50% формамиде, 1М ЫаС1, 1% 8Ό8 при 37°С и промывку в 0,1-кратном 88С при от 60 до 65°С. Необязательно промывочные буферы могут содержать от около 0,1 до около 1% 8Ό8. Продолжительность гибридизации составляет, как правило, менее около 24, обычно от около 4 до около 12 ч.

Специфичность обычно зависит от пост-гибридизационной промывки, причем критическими факторами являются ионная сила и температура последнего промывочного раствора. Для гибридов ДНКДНК Т_т может быть аппроксимирована, исходя из уравнения Метко111 и ^аЫ (1984) Апа1. Вюсйет. 138:267-284: Т_т=81,5°С+16,6 (1од М)+0,41 (% СС)-0,61 (% форм)-500/Ь; где М представляет собой молярность моновалентных катионов, % ОС представляет собой процент гуанозиновых и цитозиновых нуклеотидов в ДНК, % форм представляет собой процент формамида в растворе для гибридизации, и Ь представляет собой длину гибрида в парах оснований. Тт представляет собой температуру (при определенных ионной силе и величине рН), при которой 50% комплементарной мишеневой последовательности гибридизуется с полностью совместимым зондом. Тт снижается на около 1°С для каждого 1% несовместимости; таким образом, Тт, условия гибридизации и/или промывки могут быть доведены, чтобы гибридизоваться с последовательностями желаемой идентичности. Например, если желательно, последовательность с идентичностью >90% Т_т может быть снижена на 10°С. Как правило, жесткие условия выбирают так, чтобы температура оказалась на около 5°С ниже, чем температура точки плавления (Т_т) для конкретной последовательности и ее комплементарной последовательности при определенной ионной силе и величине рН. Тем не менее, при крайне жестких условиях может использоваться гибридизация и/или промывка при температуре на 1, 2, 3 или 4°С ниже, чем температура точки плавления (Т_т); при условиях средней жесткости может использоваться гибридизация и/или промывка при температуре на 6, 7, 8, 9 или 10°С ниже, чем температура точки плавления (Тт); при условиях низкой жесткости может использоваться гибридизация и/или промывка при температуре на 11, 12, 13, 14, 15 или 20°С ниже, чем температура точки плавления (Т_т). Используя уравнение, композиции для гибридизации и промывки и желаемую величину Т_т, специалисту в данной области будет понятно, что, по существу, описаны варианты жесткости растворов для гибридизации и/или промывки. Если желаемая степень несовпадения приводит к Т_т меньше чем 45°С (водный раствор) или 32°С (раствор формамида), предпочтительно повысить концентрацию 88С, чтобы можно было использовать более высокую температуру. Подробное руководство по гибридизации нуклеиновых кислот находится в пособиях Туззеп (1993) ЬаЬога1огу Тес11пк|иез ίη Вюс11ет181гу апб Мо1еси1аг Вю1оду - НуЬпб|/а1юп \νί11ι Ыис1е1с Ас1б РгоЬез, ч. I, гл. 2 (Е1зеу1ег, Ыете Уогк); и Аи8иЬе1 е! а1., ебз. (1995) СиггеШ Рго!осо1з ίη Мо1еси1аг Вю1оду, глава 2 (Сгеепе РиЬБзЫпд апб \УПеу-1Щег8с1епсе. №\ν Уогк). См. руководство 8атЬгоок е! а1. (1989) Мо1еси1аг С1оптд: А ЬаЬогаЮгу Мапиа1. (2б еб., Со1б 8ргтд НагЬог БаЬога1огу Ргезз, Со1б 8ргтд НагЬог, №\ν Уогк).

Выделенные белки и их варианты и фрагменты

Настоящее изобретение также охватывает белки δ-эндотоксины. Под белком δ-эндотоксином понимают белок, с аминокислотной последовательностью 8ЕО ΙΌ N0: 61-121 и 133-141. Также можно использовать для осуществления способов по настоящему изобретению его фрагменты, биологически активные участки и варианты.

К фрагментам или биологически активным участкам относятся полипептидные фрагменты, содержащие аминокислотные последовательности, в достаточной степени идентичные аминокислотной последовательности 8ЕО ΙΌ N0: 61-121 и 133-141, и у которых наблюдается пестицидная активность. Биологически активный участок белка δ-эндотоксина может представлять собой полипептид, то есть например, 10, 25, 50, 100 или более аминокислот в длину. Такие биологически активные участки могут быть получены методами рекомбинантных ДНК и оценены на пестицидную активность. Способы измерения пестицидной активности хорошо известны в данной области. См., например, статьи С.'хар1а апб Ьапд (1990) 1. Есоп. Еп!ото1. 83:2480-2485; Апбге^з е! а1. (1988) Вюсйет. 1. 252:199-206; Маггопе е! а1. (1985) 1. о! Есопотю Еп1ото1оду 78:290-293; и патент США 5743477, все они приводятся в настоящем документе в качестве ссылок в полном объеме. Используемый в данном случае фрагмент содержит по меньшей мере 8 непрерывных аминокислот 8Е0 ΙΌ N0: 61-121 и 133-141. Изобретение охватывает другие фрагменты, тем не менее, такие как любой фрагмент в белке больше чем около 10, 20, 30, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200, 1250 или 1300 аминокислот.

Под вариантами понимают белки или полипептиды, имеющие аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на около 60, 65%, около 70, 75%, около 80, 85%, около 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентична любой аминокислотной последовательности 8ЕО ΙΌ N0: 61-121 и 133141. К вариантам также относятся полипептиды, кодируемые молекулой нуклеиновой кислоты, которая гибридизуется с молекулой нуклеиновой кислоты 8Е0 ΙΌ N0: 1-60 и 124-132, или ее комплементарной последовательностью в жестких условиях. К вариантам относятся полипептиды, которые отличаются по аминокислотной последовательности по причине мутагенеза. Вариантные белки, охватываемые настоящим изобретением, биологически активны, то есть они сохраняют желаемую биологическую активность нативного белка, а именно пестицидную активность. Способы измерения пестицидной активности хоро

- 7 020327 шо известны в данной области. См., например, статьи Схар1а апб Ьапд (1990) 1. Есоп. Еп1ото1. 83:24802485; Апбгс\\ъ е1 а1. (1988) Вюсйет. 1. 252:199-206; Маггопе е1 а1. (1985) 1. оГ Есопоплс Еп1ото1оду 78:290-293 и патент США 5743477, все они приводятся в настоящем документе в качестве ссылок в полном объеме.

Гены бактерий, такие как гены ахт1 по настоящему изобретению, довольно часто обладают множественными инициирующими кодонами метионина вблизи начала открытой рамки считывания. Часто инициация трансляции в одном или нескольких из этих стартовых кодонов будет приводить к получению функционального белка. К этим стартовым кодонам могут относиться кодоны АТС. Тем не менее, бактерии, такие как Васй1и8 5р.. также распознают в качестве стартового кодона СТС, и белки, которые транслируются, начиная с кодонов СТС, в первой аминокислоте содержат метионин. Более того, не часто определяется а рпогт какой из этих кодонов используется в природных условиях в бактерии. Таким образом, понятно, что применение одного из альтернативных метиониновых кодонов также может приводить к получению белков δ-эндотоксинов, которые кодируют пестицидную активность. Эти белки δэндотоксины охватываются настоящим изобретением и могут быть использованы в способах по настоящему изобретению.

Также изобретение относится к антителу против полипептидов по настоящему изобретению или против их вариантов или фрагментов. Способы получения антител хорошо известны в данной области (см., например, руководство Наботе апб Ьапе (1988) АпйЬоб1е8: А ЬаЬога1огу Мапиа1, Со1б Брбпд НатЬот ЬаЬога1огу, Со1б Бртшд НагЬог, ΝΥ; патент США 4196265).

Измененные или улучшенные варианты

Известно, что ДНК-последовательности δ-эндотоксина могут быть изменены большим числом способов, и что эти изменения могут приводить к ДНК-последовательностям, кодирующим белки с аминокислотными последовательностями, отличными от кодируемых δ-эндотоксином по настоящему изобретению. Этот белок может быть изменен большим числом способов, к которым относятся аминокислотные замены, делеции, усечения и вставки одной или нескольких аминокислот 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 61-121 и 133141, включая до около 2, около 3, около 4, около 5, около 6, около 7, около 8, около 9, около 10, около 15, около 20, около 25, около 30, около 35, около 40, около 45, около 50, около 55, около 60, около 65, около 70, около 75, около 80, около 85, около 90, около 100, около 105, около 110, около 115, около 120, около 125, около 130 или больше аминокислотных замен, делеций или инсерций.

Способы осуществления таких вмешательств хорошо известны в данной области. Например, варианты аминокислотной последовательности белка δ-эндотоксина могут быть получены путем мутаций в ДНК. Это также может быть осуществлено одной из нескольких форм мутагенеза и/или при направленном развитии. В некоторых аспектах изменения, кодируемые в аминокислотной последовательности, будут несущественно влиять на функцию белка. Такие варианты будут обладать желаемой пестицидной активностью. Тем не менее, понятно, что способность δ-эндотоксина придавать пестицидную активность может быть улучшена за счет применения таких техник к композициям по настоящему изобретению. Например, можно экспрессировать δ-эндотоксин в клетках-хозяевах, у которых наблюдаются высокие степени ошибки включения основания в процессе репликации ДНК, таких как клетки ХЬ-1 Веб (продукция фирмы Б1та1адепе). После размножения в таких штаммах можно выделять ДНК δ-эндотоксина (например, путем получения плазмидной ДНК или путем амплификации с помощью ПЦР и клонирования полученного ПЦР-фрагмента в вектор), культивировать мутации δ-эндотоксина в немутагенном штамме и идентифицировать мутантные гены δ-эндотоксина, обладающие пестицидной активностью, например, осуществляя анализ на тестирование в отношении пестицидной активности. Как правило, белок смешивают и используют в анализах подкормки. См., например, статью Маггопе е1 а1. (1985) 1. оГ Есопотю Еп1ото1оду 78:290-293. Такие анализы могут включать приведение в контакт растений с одним или несколькими вредителями и определение способности растения выживать и/или вызывать гибель вредителей. Примеры мутаций, которые приводят к повышенной токсичности, можно найти в статье БсйперГ е1 а1. (1998) МюгоЬю1. Мо1. Вю1. Веу. 62:775-806.

Альтернативно, изменения могут быть осуществлены на последовательности белка большого числа белков на амино- или карбоксиконце, существенно не влияя на активность. Они могут включать вставки, делеции или изменения, вводимые современными молекулярными способами, такими как ПЦР, включая ПЦР-амплификацию, которые изменяют или удлиняют кодирующую белок последовательность за счет включения последовательностей, кодирующих аминокислоты, в олигонуклеотиды, используемые в ПЦРамплификации. Альтернативно, добавленные белковые последовательности могут включать полные белок-кодирующие последовательности, такие как последовательности, широкоиспользуемые в данной области для получения слитых белков. Такие слитые белки часто используют для (1) повышения экспрессии интересующего белка, (2) введения связывающего домена, ферментативной активности или эпитопа для содействия либо очистке белка, детекции белка, либо другим экспериментальным применениям, известным в данной области, (3) адресной секреции или трансляции белка в субклеточные органеллы, такие как периплазматическое пространство грамотрицательных бактерий или эндоплазматическая сеть эукариотических клеток, последняя из которых часто приводит к гликозилированию белка.

- 8 020327

Варианты нуклеотидных и аминокислотных последовательностей по настоящему изобретению также охватывают последовательности, полученные исходя из мутагенных и рекомбиногенных процедур, таких как перетасовка ДНК. С помощью такой процедуры один или несколько различных регионов, кодирующих белок δ-эндотоксин, могут быть использованы для создания нового белка δ-эндотоксина, обладающего желаемыми свойствами. Таким образом, библиотеки рекомбинантных полинуклеотидов получают из популяции полинуклеотидов с родственными последовательностями, содержащих области последовательности, которые имеют значительную идентичность последовательности и могут быть гомологично рекомбинированы ίη νίίτο или ίη νίνο. Например, используя этот подход, мотивы последовательности, кодирующие интересующий домен, могут быть перетасованы между геном δ-эндотоксина по изобретению и другими известными генами δ-эндотоксинов для получения нового гена, кодирующего белок с улучшенным интересующим свойством, таким как повышенная инсектицидная активность. Методики такой перетасовки ДНК известны в данной области. См., например, статьи 81еттег (1994) Ргос. №111. Асак. 8ск И8А 91:10747-10751; 81еттет (1994) Ыа!иге 370:389-391; Статей е! а1. (1997) Ыа!иге Βίο1есЬ. 15:436-438; Мооге е! а1. (1997) 1. Мо1. Βΐο1. 272:336-347; /Канд е! а1. (1997) Ргос. Ыа!1. Асак. 8с1. И8А 94:4504-4509; Статей е! а1. (1998) №11иге 391:288-291; и патенты США 5605793 и 5837458.

Обмен или перетасовка доменов представляет собой другой механизм получения измененных белков δ-эндотоксинов. Домены II и III можно обменять между белками δ-эндотоксинами, получая гибридные или химерные токсины с улучшенной пестицидной активностью или спектром мишеней. Способы получения рекомбинантных белков и тестирования их в отношении пестицидной активности хорошо известны в данной области (см., например, статьи №·ιίιηον е! а1. (2001) Арр1. Εηνίτοη. М1стоЬю1. 67:53285330; ке Маадк е! а1. (1996) Арр1. Εηνίτοη. МютоЬю1. 62:1537-1543; Ое е! а1. (1991) I. Βίο1. Сйет. 266:17954-17958; 8с1шер! е! а1. (1990; I. Βίο1. Сйет. 265:20923-20930; Ва^ е! а1. 91999) Арр1. Εηνίτοη. МкгоЬю1. 65:2918-2925).

Векторы.

Последовательность δ-эндотоксина по изобретению может быть получена в кассете экспрессии для экспрессии в интересующем растении. Под растительной кассетой экспрессии понимают ДНКконструкцию, которая способна приводить к экспрессии белка в растительной клетке, начиная с открытой рамки считывания. Обычно они содержат промотор и кодирующую последовательность. Часто такие конструкции также будут содержать 3'-нетранслируемый регион. Такие конструкции могут содержать сигнальную последовательность или лидерную последовательность для облегчения котрансляционного или посттрансляционного транспорта пептида в некоторые внутриклеточные структуры, такие как хлоропласт (или другая пластида), эндоплазматическая сеть или комплекс Гольджи.

Под сигнальной последовательностью понимают последовательность, которая, как известно или предполагается, обеспечивает котрансляционный или посттрансляционный транспорт пептида через клеточную мембрану. В эукариотах это обычно включает секрецию в комплекс Гольджи с некоторым гликозилированием в результате. Под лидерной последовательностью понимают любую последовательность, которая при трансляции приводит к получению аминокислотной последовательности, достаточной для запуска котрансляционного транспорта пептидной цепи в субклеточную органеллу. Таким образом, указанное выше включает транспорт, направленный лидерными последовательностями, и/или гликозилирование за счет переноса в эндоплазматическую сеть, переноса в вакуоли, пластиды, включая хлоропласты, митохондрии и подобное.

Под вектором для трансформации растений понимают молекулу ДНК, которая необходима для эффективной трансформации растительной клетки. Такая молекула может состоять из одной или нескольких растительных экспрессирующих кассет и может быть организована в более чем одну векторную молекулу ДНК. Например, бинарные векторы представляют собой векторы для трансформации растений, в которых используются два не смежных ДНК-вектора для кодирования всех необходимых цис- и трансдействующих функций для трансформации растительных клеток (Не11еи5 анк Ми11теаих (2000) Тгеикх ίη Р1аШ 8с1еисе 5:446-451). Под вектором понимают конструкцию из нуклеиновой кислоты, предназначенную для переноса между различными клетками-хозяевами. Под экспрессирующим вектором понимают вектор, который обладает способностью встраиваться, интегрировать и экспрессировать гетерологичные последовательности или фрагменты ДНК в чужеродную клетку. Кассета должна содержать 5'- и 3'-регуляторные последовательности, функционально связанные с последовательностью по изобретению. Под функционально связанными понимают функциональную связь между промотором и второй последовательностью, где последовательность промотора инициирует и опосредует транскрипцию последовательности ДНК соответствующей второй последовательности. Как правило, функционально связанные означает, что связанные последовательности нуклеиновых кислот непрерывны и при необходимости соединения двух белоккодирующих регионов непрерывны и находятся в одной и той же рамке считывания. Кассета может дополнительно содержать по меньшей мере один дополнительный ген для котрансформации в организм. Альтернативно, дополнительный(е) ген(ы) может(гут) быть предложен(ы) в большом числе экспрессирующих кассет.

Под промотором понимают последовательность нуклеиновой кислоты, которая функционирует,

- 9 020327 чтобы контролировать транскрипцию ниже расположенной кодирующей последовательности. Промотор наряду с другими последовательностями нуклеиновой кислоты, регулирующими транскрипцию и трансляцию (также обозначаемыми контрольными последовательностями), необходимы для экспрессии интересующей последовательности ДНК.

Такая экспрессионная кассета снабжена большим числом сайтов рестрикции для встраивания последовательности δ-эндотоксина под регуляцией транскрипции регуляторными областями.

Экспрессионная кассета должна включать в 5'-3' направлении транскрипции область инициации транскрипции и трансляции (т.е. промотор), последовательность ДНК по изобретению и область терминации транскрипции и трансляции (т.е. область терминации), функционирующий у растений. Промотор может быть нативным, или аналогичным, или чужеродным, или гетерологичным для растения-хозяина и/или для последовательности ДНК по изобретению. Кроме того, промотор может представлять собой природную последовательность или, альтернативно, синтетическую последовательность. Если промотор является нативным или гомологичным для растения-хозяина, то предполагается, что промотор существует в нативном растении, в которое промотор встраивают. Если промотор чужероден или гетерологичен последовательности ДНК по изобретению, предполагается, что промотор не является нативным или природным промотором для функционально связанной ДНК-последовательности по изобретению.

Область терминации может быть нативной по отношению к области инициации транскрипции, может быть нативной по отношению к функционально связанной интересующей последовательности ДНК, может быть нативным по отношению к растению-хозяину или может быть получен из другого источника (т.е. быть чужеродным или гетерологичным для промотора, интересующей последовательности ДНК, растения-хозяина или любого их сочетания). Принятые области терминации доступны из Τί-плазмиды бактерии А. 1итсГас1СП5. такие как области терминации октопинсинтазы и нопалинсинтазы. См. также статьи Сиеппеан е! а1. (1991) Мо1. Сеп. Сепе!. 262:141-144; РгоибГоо! (1991) Се11. 64:671-674; ЗапГасоп е! а1. (1991) Сепек Пеу. 5:141-149; Моден е! а1. (1990) Р1ап!. Се11. 2:1261-1272; Мипгое е! а1. (1990) Сепе 91:151-158; Ва11ак е! а1. (1989) Ыис1е1с Ас1бк Кек. 17:7891-7903; апб 1ок1п е! а1. (1987) Ыис1е1с Ас1б Кек. 15:9627-9639.

При необходимости ген(ы) может(гут) быть оптимизирован(ы) для повышенния экспрессии в трансформированной клетке-хозяине. То есть гены могут быть синтезированы для улучшенной экспрессии, используя предпочтительные для клетки-хозяина кодоны, или могут быть синтезированы, используя кодоны с периодичностью употребления кодона, предпочтительной для хозяина. Как правило, ССсодержание гена будет повышенным. Для рассмотрения употребления предпочтительного для хозяина кодона см., например, статью СатрЬе11 апб Со\тп (1990) Р1ап! Рйукю1. 92:1-11. В данной области доступны способы синтеза генов, предпочтительных для растения. См., например, патенты США 5380831 и 5436391 и статью Миггау е! а1. (1989) Ыис1е1с Ас1бк Кек. 17:477-498, приведенные в настоящем документе в качестве ссылки.

В одном из вариантов осуществления δ-эндотоксин для экспрессии нацеливают на хлоропласт. Таким образом, если δ-эндотоксин не вводят непосредственно в хлоропласт, экспрессионная кассета будет дополнительно содержать нуклеиновую кислоту, кодирующую транзитный пептид для направления δэндотоксина в хлоропласты. Такие транзитные пептиды известны в данной области. См., например, статьи Уоп Неупе е! а1. (1991) Р1ап!. Мо1. Вю1. Кер. 9:104-126; С1агк е! а1. (1989) 1. Вю1. Сйет. 264:1754417550; Пе11а-Сюрра е! а1. (1987) Р1ап!. Рйукю1. 84:965-968; Котег е! а1. (1993) Вюсйет. Вюрйук. Кек. Соттип. 196:1414-1421; апб 8йай е! а1. (1986) ЗДепсе 233:478-481.

Ген δ-эндотоксина для нацеливания на хлоропласт может быть оптимизирован для экспрессии в хлоропласте с учетом различия в использовании кодона между ядром растения и этой органеллой. Таким образом, интересующие нуклеиновые кислоты могут быть синтезированы, используя кодоны, предпочтигельные для хлоропласта. См., например, патент США 5380831, приведенный в настоящем документе в качестве ссылки.

Трансформация растения

Способы по изобретению включают введение нуклеотидной конструкции в растение. Под введением понимают наличие в растении нуклеотидной конструкции такой, чтобы конструкция проникла во внутреннее пространство клетки растения. Способы по изобретению не требуют, чтобы использовался определенный способ введения нуклеотидной конструкции в растение, за исключением того, чтобы нуклеотидная конструкция проникала во внутреннее пространство по меньшей мере одной клетки растения. Способы введения нуклеотидных конструкций в растения известны в данной области, к ним относятся, но ими не ограничиваясь, способы устойчивой трансформации, способы временной трансформации и вирус-опосредованные способы.

Под растением понимают целые растения, органы растений (например, листья, стебли, корни и т.д.), семена, растительные клетки, побеги, зародыши и их потомство. Клетки растений могут быть дифференцированными или недифференцированными (например, каллюс, клетки суспензионной культуры, протопласты, клетки листа, клетки корня, клетки флоэмы, пыльца).

Под трансгенными растениями, или трансформированными растениями, или устойчиво транс

- 10 020327 формированными растениями, или клетками, или тканями понимают растения, у которых в растительную клетку ввели или интегрировали экзогенные последовательности нуклеиновых кислот или ДНКфрагменты. К этим последовательностям нуклеиновых кислот относятся последовательности, которые являются экзогенными или отсутствуют в ^трансформированной растительной клетке, а также последовательности, которые могут быть эндогенными или присутствовать в ^трансформированной растительной клетке. Под гетерологичными, как правило, понимают последовательности нуклеиновых кислот, которые не являются эндогенными для клетки или участка нативного генома, в котором они присутствуют, и были добавлены в клетку путем инфицирования, трансфекции, микроинъекции, электропорации, микропроекции или подобное.

Трансформация растительных клеток может быть осуществлена одной из нескольких техник, известных в данной области. Ген δ-эндотоксина по изобретению может быть модифицирован для достижения или усиления экспрессии в растительных клетках. Обычно конструкция, которая экспрессирует такой белок, должна содержать промотор для запуска транскрипции гена, а также 3'-нетранслируемую область для терминации транскрипции и полиаденилирования. Организация таких конструкций хорошо известна в данной области. В некоторых случаях она может быть использована для получения гена так, что полученный пептид секретируется или иначе нацелен на растительную клетку. Например, ген может быть получен так, что содержит сигнальный пептид для облегчения переноса пептида в эндоплазматическую сеть. Также может быть предпочтительно получена растительная экспрессионная кассета, содержащая интрон такой, что для экспрессии требуется процессинг мРНК с удалением интрона.

Обычно эта растительная экспрессионная кассета должна встраиваться в вектор для трансформации растения. Этот вектор для трансформации растения может быть составлен из одного или нескольких ДНК-векторов, необходимых для трансформации растения. Например, установившейся практикой в данной области является использование векторов для трансформации растений, которые состоят из более чем одного непрерывного ДНК-сегмента. Эти векторы часто обозначают в данной области как бинарные векторы. Бинарные векторы, а также векторы со вспомогательными плазмидами чаще всего используют для АдгоЬас1етшт-опосредованной трансформации, когда размер и сложность ДНКсегментов, желательных для достижения эффективной трансформации, довольно велики, и предпочитается разделять функции между отдельными молекулами ДНК. Бинарные векторы обычно содержат плазмидный вектор, который содержит цис-действующие последовательности, требуемые для переноса Т-ДНК (такой как левый край и правый край), селектируемый маркер, который создают, чтобы он мог экспрессироваться в растительной клетке, и интересующий ген (ген, созданный так, чтобы он мог экспрессироваться в растительной клетке, для которой желательно получение трансгенных растений). Также на этом плазмидном векторе присутствуют последовательности, необходимые для бактериальной репликации. Цис-действующие последовательности расположены так, чтобы дать возможность эффективного переноса в растительные клетки и экспрессии в них. Например, ген селектируемого маркера и δэндотоксин расположены между левым и правым краями. Часто второй плазмидный вектор содержит транс-действующие факторы, которые опосредуют перенос Т-ДНК из АдгоЬас1етшт в растительные клетки. Эта плазмида часто содержит функции вирулентности (гены νίτ), которые дают возможность инфицирования растительных клеток штаммом АдгоЬас1етшт и переноса ДНК за счет расщепления по краевым последовательностям и νίτ-опосредованного переноса ДНК, как известно в данной области (Не11еив и МиШиеаих (2000) Ттеибв ίη Р1ап1 Баеисе 5:446-451). Для трансформации растений могут быть использованы некоторые типы штаммов АдгоЬас1етшт (например, БВА4404, Ον3101, ЕНА101, ЕНА105 и т.д.). Для трансформации растений другими способами, такими как микропроекция, микроинъекция, электропорация, полиэтиленгликоль и т.д., второй плазмидный вектор не требуется.

В целом, способы трансформации растений включают перенос гетерологичной ДНК в растительные мишеневые клетки (например, незрелые или зрелые зародыши, суспензионные культуры, недифференцированный каллюс, протопласты и т.д.) с последующим применением максимального порогового уровня подходящей селекции (в зависимости от гена селектируемого маркера) для извлечения трансформированных растительных клеток из группы нетрансформированной клеточной массы. Эксплантаты обычно переносят в свежий материал той же среды и культивируют принятым способом. Затем трансформированные клетки дифференцируются в побеги после помещения на среду для регистрации, дополненную максимальным пороговым уровнем селективного агента. Побеги затем переносят в селективную среду для укоренения с целью получения укоренившегося побега или проростка. Трансгенный проросток затем вырастает в зрелое растение и продуцирует фертильные семена (например, Н1е1 е! а1. (1994) Тйе Р1аи1 1оигиа1 6:271-282; 1вЫба е! а1. (1996) Ыа1иге Вю1есйио1о§у 14:745-750). Эксплантаты обычно переносят на свежий материал той же среды и культивируют принятым способом. Общее описание техник и способов получения трансгенных растений можно найти в статьях Аутев и Рагк (1994) Стй1са1 Ве\зе\\ъ ίη Р1аи! Бс1еисе 13:219-239 и Вотттеш и 1аийат (1997) Маубка 42:107-120. Поскольку трансформированный материал содержит большое число клеток, в любом участке подвергшегося воздействию мишеневого каллюса или ткани или группы клеток присутствуют как трансформированные, так и нетрансформированные клетки. Возможность уничтожать нетрансформированные клетки и давать возможность трансформиро- 11 020327 ванным клеткам пролиферировать приводит к получению культур трансформированного растения. Часто способность удалять ^трансформированные клетки является ограничением для быстрого извлечения трансформированных растительных клеток и успешного получения трансгенных растений.

Протоколы трансформации, а также протоколы встраивания нуклеотидных последовательностей в растения могут изменяться в зависимости от типа растения или растительной клетки, т.е. от того, является ли растение, нацеленное на трансформацию, однодомным или двудомным. Получение трансгенных растений может быть осуществлено одним из нескольких способов, к которым относятся, но ими не ограничиваясь, микроинъекция, электропорация, прямой перенос гена, встраивание в растительные клетки гетерологичной ДНК с помощью АдгоЬас1епит (АдтоЬас!етшт-опосредованная трансформация), бомбардировка растительных клеток гетерологичной чужеродной ДНК, адгезированной на частицах, баллистическое ускорение частиц, трансформация струей аэрозоля (опубликованная заявка США 20010026941; патент США 4945050; международная публикация \УО 91/00915; опубликованная заявка США 2002015066), трансформация Ьес1 и большое число других способов переноса ДНК, прямо не опосредованных частицами.

Способы трансформации хлоропластов известны в данной области. См., например, статьи ЗуаЬ е! а1. (1990) Ргос. Να!1. Асаб. 8с1. ИЗА 87:8526-8530; 8уаЬ апб МаНда (1993) Ргос. Να!1. Асаб. Зск ИЗА 90:913917; 8уаЬ апб Майда (1993) ЕМВО 1. 12:601-606. Способ основан на доставке ДНК, содержащей селектируемый маркер, с помощью генной пушки и нацеливании ДНК на геном пластиды за счет гомологичной рекомбинации. Кроме того, трансформация пластиды может быть осуществлена посредством трансактивации молчащего пластидного трансгена за счет тканеспецифичной экспрессии кодируемой в ядре и направленной на пластиду РНК-полимеразы. О такой системе было сообщено в статье МсВпбе е! а1. (1994) Ргос. N311. Асаб. Зсй ИЗА 91:7301-7305.

После интеграции гетерологичной чужеродной ДНК в растительные клетки затем используют максимальный пороговый уровень подходящей селекции в среде для уничтожения нетрансформированных клеток и отделения и пролиферации предполагаемых трансформированных клеток, которые выживают после этого режима селекции, путем периодического переноса на свежую среду. За счет непрерывного пассажа и проверки с помощью подходящей селекции идентифицируются и пролиферируют клетки, которые трансформированы плазмидным вектором. Для подтверждения наличия интересующего интегрированного гетерологичного гена в геноме трансгенного растения затем могут быть использованы молекулярные и биохимические способы.

Трансформированные клетки могут быть выращены до растений в соответствии с принятыми способами. См., например, статью МсСопшск е! а1. (1986) Р1ап1. Се11. Керог1к 5:81-84. Эти растения затем могут быть выращены и опылены либо тем же самым трансформированным штаммом, либо отличными штаммами и идентифицирован полученный гибрид с конститутивной экспрессией желаемых фенотипических характеристик. Для устойчивого сохранения и наследования экспрессии желательных фенотипических характеристик могут быть выращены два или более поколений и затем получены семена с экспрессией желательных фенотипических характеристик. Таким образом, настоящее изобретение относится к трансформированным семенам (также обозначаемым как трансгенные семена), имеющим нуклеотидную конструкцию по изобретению, например экспрессионную кассету по изобретению, устойчиво встроенную в их геном.

Оценка трансформации растений

После введения гетерологичной чужеродной ДНК в растительные клетки трансформацию или интеграцию гетерологичного гена в геном растения подтверждают большим числом способов, таких как анализ нуклеиновых кислот, белков и метаболитов, связанных с интегрированным геном.

Анализ ПЦР представляет собой быстрый способ скрининга трансформированных клеток, ткани или побегов на наличие встроенного гена на ранней стадии перед высадкой в почву (ЗатЬгоок и Кикке11 (2001) Мо1еси1аг С1ошпд: А ЬаЬота!огу Мапиа1. Со1б Зрппд НагЬог ЬаЬота!огу Ргекк, Со1б Зрппд НагЬог, ΝΥ). ПЦР осуществляют, используя олигонуклеотидные праймеры, специфичные для интересующего гена или фонового вектора АдтоЬас!етшт и т.д.

Трансформация растения может быть подтверждена анализом саузерн-блот геномной ДНК (ЗатЬгоок и Кикке11, 2001, выше). В целом, из трансформанта экстрагируют суммарную ДНК, расщепляют с помощью подходящих рестриктаз, фракционируют в агарозном геле и переносят на нитроцеллюлозную или найлоновую мембрану. Мембрану или блот затем исследуют, например, с помощью радиоактивно меченного ³²Р нацеленного ДНК-фрагмента для подтверждения интеграции введенного гена в геном растения согласно стандартным техникам (ЗатЬтоок и Кикке11, 2001, выше).

В анализе нозерн-блот из специфических тканей трансформанта выделяют РНК, фракционируют в агарозном геле с формальдегидом и блоттируют на найлоновом фильтре согласно стандартным процедурам, которые принято использовать в данной области (ЗатЬгоок и Кикке11, 2001, выше). Экспрессию РНК, кодируемой геном δ-эндотоксина, затем тестируют посредством гибридизации фильтра с радиоактивным зондом, полученным исходя из δ-эндотоксина, посредством способов, известных в данной области (ЗатЬгоок и Кикке11, 2001, выше).

- 12 020327

Для подтверждения наличия белка, кодируемого геном δ-эндотоксина, на трансгенных растениях могут быть осуществлены вестерн-блот, биохимические анализы и пободное с помощью стандартных процедур (8атЬтоок и Ги55с11. 2001, выше), используя антитела, которые связываются с одним или несколькими эпитопами, присутствующими на белке δ-эндотоксине.

Пестицидная активность в растениях

В другом аспекте изобретения можно получить трансгенные растения, экспрессирующие δэндотоксин, который обладает пестицидной активностью. Для получения трансгенных растений могут быть использованы способы, описанные выше в качестве примера, но то, каким образом получают трансгенные растения, не является решающим для настоящего изобретения фактором. На усмотрение экспериментатора могут быть использованы способы, известные или описанные в данной области, такие как АдтоЬас1епит-опосредованная трансформация, биолистическая трансформация и способы, не опосредованные частицами. Растения, экспрессирующие δ-эндотоксин, могут быть выделены общими способами, описанными в данной области, например трансформацией каллюса, селекцией трансформированного каллюса и восстановлением фертильных растений из такого трансгенного каллюса. В таком способе в качестве селектируемого маркера можно использовать любой ген при условии, что его экспрессия в растительных клетках дает возможность идентифицировать или отобрать трансформированные клетки.

Для использования с растительными клетками было разработано большое число маркеров, таких как устойчивость к хлорамфениколу, аминогликозиду 0418, гигромицину или подобное. В качестве селектируемых маркеров также могут быть использованы другие гены, которые кодируют продукт, участвующий в метаболизме хлоропластов. Например, могут найти особое применение гены, которые придают устойчивость к гербицидам растений, таким как глифозат, бромоксинил или имидазолинон. Такие гены были описаны (81а1ксг с1 а1. (1985) 1. ΒίοΙ. Скет. 263:6310-6314 (ген нитрилазы, придающей устойчивость к бромоксинилу); и 8;·ι11ι;·ΐ5ίν;·ιη е1 а1. (1990) Ыис1. Ас1б§ Ре5.18:2188 (ген устойчивости к имидазолинону АНА8). Кроме того, гены, описанные в настоящем документе, можно использовать в качестве маркеров для оценки трансформации бактериальных или растительных клеток. Способы определения наличия трансгена в растении, органе растения (например, листьях, стеблях, корнях и т.д.), семенах, растительной клетке, ростке, зародыше или их потомстве хорошо известны в данной области. В одном из вариантов осуществления наличие трансгена определяют тестированием на пестицидную активность.

Фертильные растения, экспрессирующие δ-эндотоксин, могут быть протестированы на пестицидную активность, и растения, у которых наблюдается оптимальная активность, отобраны для дополнительного скрещивания. Способы оценки активности против вредителей доступны в данной области. Как правило, белок смешивают и используют в анализах с подкормкой. См., например, статью Маггопе е1 а1. (1985) 1. οί Есопотю Еп1ото1оду 78:290-293.

Настоящее изобретение может быть использовано для трансформации любого вида растений, включая, но ими не ограничиваясь, однодомных и двудомных. Примером интересующих растений являются, но ими не ограничиваются, кукуруза, сорго, пшеница, подсолнечник, помидоры, крестоцветные, перец, картофель, хлопок, рис, соя, сахарная свекла, сахарный тростник, табак, ячмень и масличный репс Втакыса кр., люцерна, рожь, просо, сафлор, арахис, батат, маниока, кофе, кокос, ананас, цитрусовые деревья, какао, чай, банан, авокадо, инжир, гуаява, манго, маслина, дынное дерево, анакард, макадамия, миндаль, овес, овощи, декоративные растения и хвойные деревья.

К овощам относятся, но ими не ограничиваются, томаты, салат-латук, зеленая фасоль, фасоль Лима, горох и члены рода СитситЦ, такие как огурец, мускусная дыня и мускусный арбуз. К декоративным растениям относятся, но ими не ограничиваются, азалия, гортензия, гибискус, розы, тюльпаны, желтые нарциссы, петунии, гвоздика, пуансеттия и хризантема. Предпочтительно растения по настоящему изобретению представляют собой зерновые растения (например, маис, сорго, пшеницу, подсолнечник, помидор, крестоцветные, перец, картофель, хлопок, рис, сою, сахарную свеклу, сахарный тростник, табак, ячмень, масличный рапс и т.д.).

Применение в контроле за вредителями

В настоящей области известны основные способы использования штаммов, содержащих нуклеотидную последовательность по настоящему изобретению или ее вариант, в контроле пестицидными препаратами или в создании других организмов в качестве пестицидных агентов. См., например, патент США 5039523 и ЕР 0480762А2.

Штаммы ВасШик, содержащие нуклеотидную последовательность по настоящему изобретению или ее вариант, или микроорганизмы, которые были генетически изменены так, чтобы содержать пестицидные ген и белок, могут быть использованы для защиты сельскохозяйственных зерновых культур и продуктов от вредителей. В одном из аспектов изобретения целые, т.е. нелизированные клетки токсин (пестицид)-продуцирующего организма, обрабатывают реагентами, которые пролонгируют активность токсина, продуцируемого в клетке, при применении клетки в среде обитания мишеневого(вых) вредителя(ей).

Альтернативно, пестицид продуцируют введением гена δ-эндотоксина в клеточного хозяина. Экспрессия гена δ-эндотоксина непосредственно или косвенно приводит к внутриклеточной продукции и

- 13 020327 сохранению пестицида. В одном из аспектов настоящего изобретения эти клетки затем обрабатывают в условиях, которые продляют активность токсина, продуцируемого в клетке, при применении клетки в среде обитания мишеневого(вых) вредителя(ей). Полученный продукт сохраняет токсичность токсина. Эти природным образом инкапсулированные пестициды затем могут быть смешаны в соответствии с принятыми методиками для применения в среде обитания мишеневого вредителя, например почве, воде и листве растений. См., например, ЕРА 0192319 и ссылки, приведенные там. Альтернативно, можно смешать клетки, экспрессирующие ген по данному изобретению, таким образом, чтобы использовать полученный материал в качестве пестицида.

Пестицидные композиции

Активные ингредиенты по настоящему изобретению обычно используют в виде композиций, и они могут быть использованы на посевной площади или обрабатываемых растениях одновременно или последовательно с другими соединениями. Эти соединения могут представлять собой удобрения, гербициды, криопротекторы, поверхностно-активные вещества, детергенты, пестицидные омыляющие вещества, дормантные масла, полимеры и/или препаративные формы с высвобождаемым с течением времени или биодеградируемым носителем, которые обеспечивают длительное дозирование мишеневой области, после однократного нанесения препаративной формы. Они также могут представлять собой селективные гербициды, химические инсектициды, вируциды, микробициды, амебициды, пестициды, фунгициды, бактериоциды, нематоциды, моллюскоциды или смеси нескольких из этих препаратов при необходимости вместе с дополнительными приемлемыми для сельского хозяйства носителями, поверхностноактивными веществами или способствующими нанесению наполнителями, обычно применяемыми в данной области смешивания. Подходящие носители и наполнители могут представлять собой твердое вещество или жидкость и соответствовать веществам, обычно используемым в технологии смешивания, например природным или искусственным минеральным веществам, растворителям, диспергирующим веществам, увлажняющим агентам, усилителям клейкости, связующим средствам или удобрениям. Также препаративные формы могут быть получены в съедобных приманках или сформированы в западни для вредителей для кормления или поглощения вредителем, являющимся мишенью, пестицидной препаративной формы.

К способам нанесения активного ингредиента по настоящему изобретению или агрохимической композиции по настоящему изобретению, которая содержит по меньшей мере один из пестицидных белков, продуцируемых бактериальными штаммами по настоящему изобретению, относятся нанесение на листья, дражирование семян и внесение в почву. Количество нанесений и скорость нанесения зависят от интенсивности нашествия соответствующего вредителя.

Композиция может быть смешана в виде порошка, дуста, пилюли, гранулы, спрея, эмульсии, коллоида, раствора или тому подобного и может быть получена такими принятыми способами, как высушивание, лиофилизация, гомогенизация, экстракция, фильтрация, центрифугирование, осаждение или концентрирование культуры клеток, содержащих полипептид. Во всех таких композициях, которые содержат по меньшей мере один такой пестицидный полипептид, полипептид может присутствовать в концентрации от около 1 до около 99 мас.%.

Бабочки, жуки или нематоды-вредители могут быть уничтожены или их количество снижено на данной площади способами по изобретению или можно применить на области обитания с профилактической целью для предотвращения нашествия чувствительного вредителя. Предпочтительно вредитель поглощает или приводится в контакт с пестицидно-эффективным количеством полипептида. Под пестицидно-эффективным количеством понимают количество пестицида, которое способно привести к гибели по меньшей мере одного вредителя или к заметному снижению роста, питания или нормального физиологического развития вредителя. Это количество будет изменяться в зависимости от таких факторов, как, например, конкретные контролируемые мишеневые вредители, обрабатываемая конкретная окружающая обстановка, месторасположение, растение, зерновая культура или сельскохозяйственный участок, условия окружающей среды и способ, скорость, концентрация, устойчивость и количество применяемой пестицидно-эффективной полипептидной композиции. Препаративные формы также могут изменяться в связи с климатическими условиями, факторами окружающей среды, которые необходимо учесть, и/или частотой применения и/или тяжестью нашествия вредителей.

Описанные пестицидные композиции могут быть получены смешиванием либо бактериальной клетки, кристаллической и/или споровой суспензии, либо выделенного белкового компонента с желательным приемлемым для сельского хозяйства носителем. Композиции могут быть смешаны до применения подходящими способами, такими как лиофилизация, высушивание замораживанием, высушивание, или в водном носителе, среде, или подходящем разбавителе, таком как солевой раствор или другой буфер. Смешанные композиции могут находиться в форме дуста, или гранулированного материала, или суспензии в масле (растительном или минеральном), или воде, или эмульсиях масло/вода, или в виде гигроскопичного порошка, или в сочетании с любым другим материалом носителя, подходящим для применения в сельском хозяйстве. Подходящие для сельского хозяйства носители могут представлять собой твердые вещества или жидкости и хорошо известны в данной области. Термин приемлемый для сельского хозяйства носитель охватывает все наполнители, инертные компоненты, диспергирующие

- 14 020327 средства, поверхностно-активные вещества, клеющие средства, связующие средства и т.д., которые обычно используются в технологии препаративных форм пестицидов; они хорошо известны специалистам в препаративной форме пестицидов. Препаративные формы могут быть смешаны с одним или несколькими твердыми или жидкими наполнителями и получены большим числом способов, например смешиванием до однородного состояния, смешиванием и/или растиранием пестицидной композиции с подходящими наполнителями, используя принятые техники смешивания. Подходящие препаративные формы и способы применения описаны в патенте США 6468523, приведенном в настоящем документе в качестве ссылки.

К вредителям относятся, но ими не ограничиваются, насекомые, грибы, бактерии, нематоды, клещи, иксодовые клещи и подобное. К насекомым-вредителям относятся насекомые, выбранные из отрядов Со1еор1ега. 0|р1сга. Нушспор1сга. Бер1бор1ега. Ма11ор1ада. НошорЮга. НсиирЮга. ОгЙпорЮга. Т11укапор1ега. Эсгтар1сга. !кор(ега. Апор1ига, 81р1юпар1ега. Тпе1юр1сга и т.д., особенно Со1сор1сга. Ьер1бор1ега и Э|р1ега.

Порядок Со1еор1ега включает подпорядки Аберйада и Ро1ур1ада. Подпорядок Аберйада включает суперсемейства СагаЬо1беа и Сугшо1беа, тогда как подпорядок Ро1ур1ада включает суперсемейства НубгорЫ1о1беа, 81ар11у1шо1беа. СагИНагсабеа. С1его1беа, Екйегснбеа. ОаксП1о1беа. Пгуоро1беа, Вугг1кнбеа. Сиси)о1беа, Ме1о1беа, Могбе11о1беа, ТеиеЬгюио1беа, Вок1пс1ю1беа. 8еагаЬаео1беа, СегатЬусо1беа, СНгу8оте1о1беа и СигсЬ1юио1беа. Суперсемейство СагаЬо1беа включает семейства Сюшбейбае, СагаЫбае и Пуйкс1бае. Суперсемейство Сугшо1беа включает семейство Супшбае. Суперсемейство НубгорЫ1о1беа включает семейство НубгорЫйбае. Суперсемейство 81ар11у1йю1беа включает семейства 8йрЫбае и 81арНуйн1бае. Суперсемейство СагИНагсабеа включает семейства СагИйапбае и Ьатрупбае. Суперсемейство С1его1беа включает семейства С1ег1бае и Пегтекйбае. Суперсемейство Е1а1егснбеа включает семейства Е1а1епбае и Виргекйбае. Суперсемейство Сиси)о1беа включает семейство СоссшеШбае. Суперсемейство Ме1о1беа включает семейство Ме1о1бае. Суперсемейство ТеиеЬгюио1беа включает семейство ТепеЬпошбае. Суперсемейство 8сагаЬаео1беа включает семейства Раккайбае и 8сагаЬаео1бае. Суперсемейство СегатЬусо1беа включает семейство СегатЬуабае. Суперсемейство СНгуютеЫбеа включает семейство СНгуютеНбае. Суперсемейство СигсЬ1юио1беа включает семейства СигсЬйошбае и 8со1уйбае.

Порядок 0|р1ега включает подпорядки ЫетаЮсега, ВгасНусега и Сус1оггНарНа. Подпорядок №та!осега включает семейства Т1рийбае, Ркус1тоб|бае. Сийшбае, СегаЮродошбае, СЫгоиот1бае, 81ти1пбае, ВЛюшбае и Сеаботупбае. Подпорядок ВгасНусега включает семейства 81гайоту1бае, ТаЬатбае, ТНегеу1бае, АкШбае, Муб1бае, ВотЬуШбае и Пойсйороб1бае. Подпорядок Сус1оггНарНа включает разделы Л5с1пха и АксЫха.

Раздел А^сЫха включает семейства РНопбае. 8угрЫбае и Соиор1бае. Раздел АксЫха включает секции Аса1ур!га1ае и Са1ур1га1ае. Секция Аса1ур1га1ае включает семейства Оййбае, ТерБпПбае. Адготух1бае и Ого5ор1пНбае. Секция Са1ур1га1ае включает семейства Н1рроЬокс1бае, Оекйгбае, ТасЫшбае, АиЛотуйбае, Микс1бае, СаШрБопбае и 8агсорЬад1бае.

Порядок Бер1бор1ега включает семейства РарШошбае, Р1ег1бае, Ьусаешбае, Мутрйайбае, Оапа1бае. 8а1упбае. Некрешбае, 8р1нпд|бае.8аШгппбае. Сеоте1пбае. АгсШбае, №с1шбае. БутаШгЕбае. 8екйбае и Тше1бае.

К нематодам относятся паразитарные нематоды. такие как клубеньковые. цистные и корневые нематоды, включая Не1егобега крр., Ме1о1бодуие крр. и С1оЬобега крр.; в частности, к членам цистных нематод относятся, но ими не ограничиваясь, Не1егобега д1усшек (соевая цистная нематода); Не1егобега ксВасЫи (свекольная цистная нематода); Не1егобега ауеиае (зерновая цистная нематода) и С1оЬобега гок1ос1пепк1к и С1оЬобега раШба (картофельные цистные нематоды). К корневым нематодам относятся Рга1у1епс1и.18 крр.

К насекомым-вредителям по изобретению основных злаковых культур относятся кукуруза: Окйгша пиЬйайк, европейский кукурузный мотылек; Адгойк 1ркйоп, совка-ипсилон; Нейсоуегра хеа. совка хлопковая; 8робор1ега Ггид1регба, совка травяная; 0|а1гаеа дгапбюкейа, огневка кукурузная юго-западная; Е1а8шора1ри8 йдпокейик, малый кукурузный мотылек; 0|а1гаеа кассБагайк. огневка сахарного тростника; П1аЬгойса гйд|Гега. западный кукурузный жук; П1аЬгойса 1опд1согшк ЬагЬей, северный кукурузный жук; П1аЬгойса ипбеснприпсЕйа 1ю\уагбБ южный кукурузный жук; Ме1апоШк крр., проволочники; Сус1осерБа1а Ьогеайк (личинка хруща); Сус1осерБа1а пптасикНе (личинка хруща); Рорййа )арошса. японский жук; С11ае1оспе1па риБсапа. земляная кукурузная блошка; 8рБепорБогик та1б1к, долгоносик кукурузный; Р1юра1ок1р1и.ип та1б1к, тля кукурузная листовая; АпигарЫк 1па1бйаб1с1к. тля кукурузная корневая; Вйккик 1еисор1егнк 1енсор1егик. клоп-черепашка пшеничный североамериканский; Ме1апор1ик ГетиггиЬгшп. краснобедрая кобылка; Ме1апор1ик капдшшрек, кобылка мексиканская; Нектуа ркйига. личинка мухи ростковой; Адготуха раггкогшк. кукурузная минирующая мушка; АпарНо1Ьг1рк оЬксгигик, трипс злаковый; 8о1епорк1к 1ш1ек1а. муравей-вор; Те1гапус1шк игйсае, обыкновенный паутинный клещ; сорго: С1п1о рагкйик, огневка сорго; 8робор1ега Ггид1регба, совка травяная; Нейсоуегра хеа, совка хлопковая; Е1актора1рик йдпоке11ик, малый кукурузный мотылек; ЕеШа киЫеггапеап; РБу11орБада сппйе, личинка хруща; Е1еобек, Сопобегик и Аео1ик крр., проволочники; Онкта театрик, пьявица красногрудая; С11ае1оспе1па риНсапа. кукурузная земляная блошка; 8рБепорБогик та1б1к, долгоносик кукурузный; В1юра1ок1р1и.ип та1б1к; тля

- 15 020327 кукурузная листовая; 81рйа Пама, тля желтая сахарного тростника; ВНззик 1еисор!егик 1еисор1етик, клопчерепашка пшеничный североамериканский; СогИапша когдй1со1а, галлица сортовая; Тейаиусйик сйтаЬапиик, красный паутинный клещ; Тей’аиусйик итйсае, обыкновенный паутинный клещ; пшеница: Ркеиба1ейа ишриис1а1а, гусеница; 8робор!ега Егид1регба, совка травяная; Е1актора1рик йдиокейик, малый кукурузный мотылек; Адтойк оййодоша, совка прямоугольная; 0и1ета те1аиорик, пьявица красногрудая; Нурега риисЕИа, слоник листовой бобовый; П1аЬтойса иибес1триис1а1а йо\\'агбк блошка 11-точечная Говарда; русская пшеничная тля; 8сй1харй1к дтаттит, тля злаковая обыкновенная; Масгоырйит ауеиае, тля листовая; Ме1аиор1ик ГетиггиЬгит, краснобедрая кобылка; Ме1аиор1ик б1ГГегеийайк, кобылка отличительная; Ме1аиор1ик каидштрек, кобылка мексиканская; Мауейо1а бек1гис1ог, гессенская мушка; 8йоб1р1ок1к токе11аиа, галлица злаковая оранжевая; Меготуха атепсаиа, личинка американской меромизы; Ну1етуа соагсЕИа, муха озимая; Еи-тЕШ-пеПа Гикса, трипс табачный; Серйик стсШк, пилильщик хлебный американский; Асепа !ийрае, луковичный клещ тюльпанов; подсолнечник: 8и1е1та йейаиШаиа; Нотоеокота е1ес1е11ит, огневка подсолнечниковая; худодгатта ехс1атайошк, совка подсолнечниковая восклицательная; ВоШутик дШЬокик, жук морковный; №о1акюр!ета ти^ίТе1бйапа, галлица подсолнечниковая; хлопок: Нейоΐ1ίκ У1гексеик, хлопковая совка; Нейсоуегра хеа, коробочный червь; 8робор!ега ех1диа, совка малая; Ресйиорйога доккур1е11а, розовый коробочный червь; АиШоиотик дгаибщ долгоносик хлопковый; АрЫк доккури, тля хлопковая; РкенбаЮтоксейк кепаШк, хлопковая блоха-наездник; Тпа1еигобек аЬиШоиеа; Ьудик йиео1апк, клоп травяной; Ме1аиор1ик ГетиггиЬгит, краснобедрая кобылка; Ме1аиор1ик б1ГГегеийайк, кобылка отличительная; Тйпрк Юйаск трипс луковый; РтаикЕикхейа Гикса, трипс табачный; Тейаиусйик стиаЬапиик, красный паутинный клещ; Тей’аиусйик итйсае, обыкновенный паутинный клещ; рис: О1а1гаеа кассйагайк, огневка сахарного тростника; 8робор!ега Ггид1регба, совка травяная; Нейсоуегра хеа, совка хлопковая; Со1акр1к Ьгиииеа; Шкогйорйик огухорйПнк, долгоносик рисовый водяной; 8йорййик огухае, долгоносик рисовый; №рйо!ей1х шдторюШк, зеленая рисовая цикадка; Вйккик 1енсор1егнк 1енсор1егнк, клоп-черепашка пшеничный североамериканский; Асгок1егиит ййаге, щитники; соя: Ркеибор1ик1а шс1ибек, пяденица соевая; Аийсагыа детта!айк, гусеница бархатного боба; Р1а!йуреиа ксаЬга, зеленый вредитель клевера; 0к1пша ииЬйайк, мотылек кукурузный; Адгойк 1ркйои, совка-ипсилон; 8робор!ега ех1диа, совка малая; Нейойик уйексеик хлопковая совка; Нейсоуегра хеа, коробочный червь; Ерйасйиа мапуекйк, зерновка бобовая мексиканская; Мухик регкюае, тля персиковая зеленая; Етроакса ГаЬае, цикадка картофельная; Асгок1егиит ййаге, щитники; Ме1аиор1ик ГетиггиЬгит, краснобедрая кобылка; Ме1аиор1ик бйТсгеийайк, кобылка отличительная; Ну1етуа р1а!ига, личинка мухи ростковой; 8епсо1йпрк уапаЬШк, трипс соевый; Тйпрк 1айаск трипс табачный; Тей’аиусйик ШгкекЕтк клещик паутинный атлантический; Тей’аиусйик игйсае, обыкновенный паутинный клещ; ячмень: 0к1пша ииЬйайк, мотылек кукурузный; Адгойк 1рк11ои, совка-ипсилон; 8сй1харЫк дтаттит, тля злаковая обыкновенная; Вйккик 1енсор1егнк 1еисор1егик, клоп-черепашка пшеничный североамериканский; Асгок1егиит ййаге, щитники; ЕиксЫкШк кегуик; Эейа р1а!ига, личинка мухи ростковой; Мауейо1а бек1гнс1ог, гессенская мушка; РейоЫа 1а1ееик; масличный репс: Втеуюотуие Ьтаккюае, тля капустная; Рйу11о1ге1а сгиаГегае, блошка крестоцветная; Матекйа соийдига!а, совка латуковая; Р1и!е11а ху1ок!е11а, моль капустная; Эейа крр., личинки корневые.

Способы повышения урожая растений

Предлагаются способы повышения урожая растений. Способы содержат введение в растение или растительную клетку полинуклеотида, содержащего пестицидную последовательность, описанную в настоящем документе. Под используемым в настоящем документе термином урожай растения понимают качество и/или количество биомассы, продуцируемой растением. Под биомассой понимают любой оцениваемый продукт растения. Повышение продукции биомассы представляет собой любое улучшение урожая оцениваемого продукта растения. Увеличенный урожай растения имеет некоторые коммерческие применения. Например, повышенная биомасса листвы растения может увеличивать урожай листовых овощей для употребления человеком или животным. Кроме того, повышенная биомасса листвы может быть использована для увеличения продукции фармацевтических или промышленных продуктов растительного происхождения. Повышение урожая может содержать любое статистически значимое повышение, включая, но ими не ограничиваясь, повышение по меньшей мере на 1%, по меньшей мере на 3%, по меньшей мере на 5%, по меньшей мере на 10%, по меньшей мере на 20%, по меньшей мере на 30%, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 100% или большее повышение урожая по сравнению с растением, не экспрессирующим пестицидную последовательность.

В специфических способах урожай растения повышается в результате улучшенной устойчивости к вредителю растения, экспрессирующего пестицидный белок, описанный в настоящем документе. Экспрессия пестицидного белка приводит к сниженной способности вредителя к нашествию или питанию за счет растения, таким образом, улучшая урожай растения.

Следующие примеры предлагаются в качестве иллюстрации, а не ограничения.

Экспериментальная часть

Пример 1. Обнаружение новых пестицидных генов у бактерии ВасШик Шипид1еик1к.

Новые пестицидные гены идентифицировали у бактериальных штаммов, перечисленных в табл. 1, используя следующие стадии:

получение внехромосомной ДНК из штамма, который включает плазмиды, обычно содержащие ге

- 16 020327 ны δ-эндотоксина;

механическое разделение внехромосомной ДНК для получения распределенных по размеру фрагментов;

клонирование фрагментов внехромосомной ДНК размером от ~2 до ~10 т.п.н.; выращивание ~1500 клонов внехромосомной ДНК;

частичное секвенирование 1500 клонов, используя праймеры, специфичные для клонирующего вектора (считывает конец);

идентификация предполагаемых генов токсина посредством анализа гомологии способом ΜΪΌΆ8 (описанным в патентной публикации США 20040014091, которая приводится в данном документе в качестве ссылки в полном объеме);

завершение последовательностей (прогулка) клонов, содержащих фрагменты предполагаемых ин тересующих генов токсина.

Таблица 1

Список новых генов, выделенных из ВасШиз 1йипи§1еи818

Ген	Штамм	Нуклеотид 5ΕΩ Ю ΝΟ:	Аминокислота 5ΕΩ Ю ΝΟ:	Процент идентичности с близкородственной последовательностью в данной области	Близкородственная последовательность в данной области
ахтЮ4б'	АТХ13026	1	61	54,30%	Сгу4Аа1
ахтЮ4&	АТХ13026	2	62	56,4	Сгу4Ва1
ахтЮбХ	АТХ21049	3	63	17,9%	Сгу21Ва1
ахтЮбУ	АТХ21049	4	64	21,3%	Сгу35Ас1
ахтЮбХ	АТХ21049	5	65	19,70%	Сгу35Аа1
ахтЮбЗ	АТХ21049	6	66	21,9%	Сгу35Ас1
ахтЮ54	АТХ21049	7	67	20,1%	Сгу35Ас1
ахтЮ55	АТХ12976	8	68	42,0% (гомология с Ν-	Сгу32Са1
ахтЮбб	АТХ12976	9	69	концом)	ΒίηΑ/ΒίπΒ
ахтЮ57	АТХ13058	10	70	73,1%	Сгу320а1
ахтЮ58	АТХ13058	11	71	26,8%	Сгу6Ва1
ахтЮ59	АТХ13058	12	72	56,0%	Сгу32Аа1
ахтЮбО	АТХ13058	13	73	54,6%	Сгу32Аа1
ахтЮ61	АТХ13058	14	74	29,2%	Сгу45Аа1
ахтЮ67	АТХ12974	15	75	36,3%	Сгу320а1 Некоторая
ахтЮ69	АТХ12997	17	77	Сгу32Са1	гомология с Νконцом
ахтЮ71	АТХ12982	18	78	22,9%	Сгу21Ва1
ахтЮ72	АТХ12982	19	79	16,4%	М1х2
ахтЮ73	АТХ16042	20	80	15,3%	М1х2
ахтЮ74	АТХ12993	21	81	43,8%	Сгу21Ва1
ахтЮ75	АТХ12997	22	82	30,4%	Сгу320а1
ахтЮ87	АТХ13030	27	87	71,0%	Сгу8Аа1
ахтЮ88	АТХ13039	28	88	26,2%	Сгу21Ва1
ахтЮЭЗ	АТХ13058	31	91	56,1%	Сгу32Аа1

вероятная коактивность при экспрессии или сочетании с другим токсином, таким как ЛхтЮ014 или ЛхтЮ08 ²Вероятная коактивность при экспрессии или сочетании с другим токсином, таким как ЛхтЮ014 или ЛхтЮ09 ³Гомология Ν-терминального домена с каталитическим доменом фосфолипазы С ⁴Вероятная коактивность при экспрессии или сочетании с другим токсином, таким как ЛхтЮ52 ⁵Вероятная коактивность при экспрессии или сочетании с другим токсином, таким как ЛхтЮ51

Пример 2. Обнаружение новых пестицидных генов ВасШиз Шипид1еи818.

Новые пестицидные гены идентифицировали из штаммов, перечисленных в табл. 2, используя способ Μ1ΌΆ8, описанный в патентной публикации США 20040014091, которая приводится в данном документе в качестве ссылки в полном объеме, используя следующие стадии:

- 17 020327 получение из штамма внехромосомной ДНК. Внехромосомная ДНК содержит смесь некоторых или всех структур из следующего списка: плазмиды различного размера; фаговые хромосомы; фрагменты геномной ДНК, не разделенные посредством протокола очистки; другие ^охарактеризованные внехромосомные молекулы;

механическое или ферментативное разделение внехромосомной ДНК для получения распределенных по размеру фрагментов;

секвенирование фрагментированной ДНК;

идентификация предполагаемых генов токсина посредством анализа гомологии и/или другими компьютерными анализами;

при необходимости завершение последовательности интересующего гена одной из нескольких стратегий ПЦР или клонирования (например, ТЛГЬ-РСК).

Таблица 2

Список новых генов, выделенных из БасШиз Шипп§1епы8

Ген	Штамм	Нуклеотид ЗЕО Ю N0:	Аминокислота ЗЕО Ю ΝΟ:	Процент идентичности с близкородственной последовательностью в данной области	Близкородственная последовательность в данной области
ахтЮ79	АТХ12974	23	83	36,7%	Сгу320а1
ахтЮ80	АТХ12974	24	84	39,9%	Сгу42Аа1
					ОгГЗ, описанная как
ахтЮ81	АТХ12974	25	85	68%	С-терминальная половина белка Сгу
ахтЮ82	АТХ13056	26	86	47,8%	Сгу320а1
ахтЮ91	АТХ13053	29	89	35,3%	Сгу8Ва1
ахтЮ92	АТХ13053	30	90	74,4%	Сгу39ОгГ2
ахтЮ96	АТХ13007	32	92	29,6%	Сгу320а1
ахтЮ97	АТХ13007	33	93	29,3%	Сгу320а1
ахтЮ98	АТХ13007	34	94	56%	Сгу41АЫ
				69%	ахтЮ81
				61%	ахтЮ67
ахтЮ99	АТХ13007	35	95	60%	ахтЮ79
				45%	ахтЮ75
				45%	Сгу32Са1
ахтИОО	АТХ12990	36	96	77%	Сгу9Са1
				76%	Сгу9Еа1
				74%	ахтЮ02
				72%	СгуЭВЫ
				65%	Сгу7Ва1
				62%	ахтЮ37
ахтН01	АТХ13035	37	97	60%	ахтЮ29
				58%	Сгу7АЬ2
				86%	ахтЮ82
				65%	ахтЮЭЗ
ахтИ02	АТХ13056	38	98	58%	ахтЮ59
				56%	Сгу32Аа1
				64%	ахтЮ82
				58%	Сгу320а1
ахтИОЗ	АТХ13056	39	99
				56%	ахтЮЭЗ
				52%	ахтЮ59
				19,3%	ахтЮ20
				18,3%	Сгу21Ва1
ахтН04	АТХ13058	40	100
				17,1%	Сгу5Ва1
				17,1%	Сгу44Аа
				35%	У1р1Аа2
ахтИ07	АТХ13007	41	101	34%
МрЮа1
				90%	Сгу45Аа1
ахтН08	АТХ12984	42	102	25%
Сгу23Аа1
ахтНОЭ	АТХ12984	43	103	38%	Сгу45Аа1
ахтН 10	АТХ12984	44	104	43%	Сгу32Аа1
ахтН 11	АТХ12984	45	105	34%	Сгу41АЫ
ахтН12	АТХ12987	46	106	96%	Сгу1АЬ
				85,8%	ахтЮ43
				85,8%	ахтЮ28
ахтН14	АТХ14903	47	107	56,7%	ахтЮ37
				57,2%	Сгу7Са1
				56,3%	Сгу7АЬ2
				53,5%	Сгу7Ва1
				53,2%	ахтИ 14
				53,1%	ахтЮ28
ахтИ16	АТХ12975	48	108
				53%	ахтЮ43
				52,3%	Сгу7Са1
				50,3%	Сгу7АЫ
			109	92,2%	Сгу22Ва1
ахтН 17	АТХ13029	49	110	48,2%	Сгу22Аа1
			47,1%	Сгу22АЫ

- 18 020327

^!Этот ген представляет собой Ν-терминальный участок расщепленного гена сгу и образует пару в своем исходном состоянии с геном Ахт1126, который представляет С-концевой участок расщепленной пары сгу. Эти гены могут действовать в качестве котоксинов, и у них при коэкспрессии или слиянии может наблюдаться усиленная, новая или измененная активность. Промежуточная область между геном Ахт1125 и ниже расположенным геном Ахт1126 приводится в 8ЕР ГО N0: 122.

²Этот ген представляет собой С-терминальный участок расщепленного гена сгу и образует пару в своем нативном состоянии с Ахт1125, который представляет Ν-концевой участок расщепленной пары сгу. Эти гены могут действовать в качестве котоксинов, и у них при коэкспрессии или слиянии может наблюдаться усиленная, новая или измененная активность.

Пример 3. Обнаружение нового токсинового гена АхтЮ68 из штамма ВасШик Шиг1п§1епк1к АТХ13046.

Штамм, кодирующий АхтЮ68, идентифицировали согласно следующему: информацию о последовательностях известных или предполагаемых токсиновых генов использовали для получения выравнивания, представляющего консервативные и не вполне консервативные ДНКпоследовательности в группе (семействе) токсинов;

для селективной амплификации одного или нескольких членов семейства токсинов на основании выровненной последовательности создавали праймеры для проведения полимеразной цепной реакции (ПЦР);

ДНК, выделенную из бактериальных штаммов, скринировали посредством ПЦР для идентификации

- 19 020327 штаммов, содержащих предполагаемые гомологи мишеневого семейства гена;

ПЦР-продукты секвенировали для отбора штамма, содержащего интересующий ген.

У отобранного штамма идентифицировали полную последовательность гена посредством геномного способа УЕОАВ (патентная публикация США 20040014091) согласно следующему:

получение из штамма внехромосомной ДНК. Внехромосомная ДНК содержит смесь некоторых или всех структур из следующего списка: плазмиды различного размера; фаговые хромосомы; фрагменты геномной ДНК, не разделенные посредством протокола очистки; другие неохарактеризованные внехромосомные молекулы;

механическое или ферментативное разделение внехромосомной ДНК для получения распределенных по размеру фрагментов;

клонирование фрагментов внехромосомной ДНК в плазмидный вектор;

выращивание и очистка клонированной внехромосомной ДНК;

частичное секвенирование клонов;

идентификация предполагаемых токсиновых генов посредством анализа гомологии и/или другими компьютерными анализами;

при необходимости завершение последовательностей (прогулка) клонов, содержащих последовательность предполагаемых интересующих генов токсина;

нуклеотидная последовательность гена ахтШ68 приводится в ВЕС) ΙΟ ΝΟ: 16 и аминокислотная последовательность белка ахтЮ68 приводится в ВЕР ΙΟ ΝΟ: 76.

Характеристики гена и белка

Размер гена, пары оснований ДНК: 1 791

Размер белка, аминокислотные остатки: 597

Рассчитанная молекулярная масса белка, Да: 66 495

Известные гомологи и примерный процент

СгуНШ, 71,4% идентичности:

Пример 4. Экспрессия в ВасШиз.

Инсектицидный ген, описанный в настоящем документе, амплифицируют с помощью ПЦР и ПЦРпродукт клонируют в экспрессионный вектор ВасШиз рАХ916 или другой подходящий вектор способами, хорошо известными в данной области. Полученный штамм ВасШиз, содержащий вектор с геном ахт1, культивируют на принятой ростовой среде, такой как среда СУВ (бакто-казитон в концентрации 10 г/л; дрожжевой экстракт в концентрации 3 г/л; 6 г/л КН₂РО₄; 14 г/л К₂НРО₄; 0,5 мМ МдВО₄; 0,05 мМ МпС1₂; 0,05 мМ ЕеВО₄), пока споруляция не станет очевидна с помощью микроскопической оценки. Образцы получают и тестируют в отношении активности в биоанализах.

Пример 5. Создание синтетических последовательностей.

В одном из аспектов изобретения получали синтетические последовательности ахтс Эти синтетические последовательности имеют последовательность ДНК, измененную по сравнению с родительской последовательностью ахтц и кодируют белок, который коллинеарен родительскому белку АХМ1, которому он соответствует, но во многих белках δ-эндотоксинах отсутствует С-терминальный кристаллический домен.

Синтетические гены представлены в табл. 3.

- 20 020327

Таблица 3

Название гена дикого типа	Название синтетического гена	ЗЕО Ю N0:
ахш1050	ахтЮ50Ьч01	142
ахтЮ5ОЬчО2	143
ахш1051	ахтЮ51ЬчО1	144
ахтЮ51ЬчО2	145
ахт1052	ахт1052Ьч01	146
ахтЮ52ЬчО2	147
ахш1053	ахтЮ53ЬчО1	148
ахтЮ53ЬчО2	- 149
ахшЮ54	ахтЮ54ЬчО1	150
ахтЮ54ЬчО2	151
ахтЮ55	ахтЮ55ЬчО1	152
ахт1055Ьч02	153
ахтЮБб	ахтЮ56ЬчО1	154
ахтЮ56ЬдО2	155
ахтЬ057	ахтЮ57ЬчО1	156
ахтп1057Ьч02	157
ахт1058	ахш1058Ьч01	158
ахтЮ58ЬчО2	159
ахтЮ59	ахтЬ059 1Ьч01	160
ахтЮ59 1ЬчО2	161
ахтЬО59_2ЬчО1	162
ахтЮ59_2ЬчО2	163
ахтЮбО	ахтЮ60Ьч01	164
ахш1060Ьч02	165
ахтЮб1	ахтЮ61ЬчО1	166
ахтЮ61ЬчО2	167
ахтЮ67	ахтЮ67ЬдО1	168
ахтЮ67ЬчО2	169
ахтЮ69	ахтЬ069Ьч01	170
ахт1069Ьч02	171
ахтЮ71	ахтЮ71ЬчО1	172
ахш1071Ьч02	173
ахтЮ72	ахтЮ72ЬчО1	174
ахтЮ72ЬчО2	175
ахтЮ73	ахгп1073Ьд01	176
ахш1073Ьд02	177
ахтЮ74	ахтЬ074Ьч01	178
ахтЮ74ЬдО2	179
ахтЮ75	ахтЮ75ЬчО1	180
ахтЮ75ЬчО2	181
ахтЮ7 9	ахтЮ7 9ЬчО1	182
ахш1079Ьд02	183

- 21 020327 ахшЮ80 ахтЮ80Ьу01

184 ахтЮ82 ахтЮ87 ахтЮ8 8 ахтЮ91 ахтЮ93 ахтЮ96 ахтЮ97 ахтЮ98 ахтНОО ахтИ01 ахтИ02 ахтИОЗ ахтИ04 ахтИ07 ахтИ08 ахтИ09 ахтШО ахтИИ ахтИ12 ахт1114 ахтШб ахтИ17 ахтИ18 ахтИ19 ахтИ20 ахт1121 ахтИ22 ахтИ23 ахтЮ80Ьу02 ахтЮ82ЬуО1 ахтЮ82ЬуО2 ахпи.087 1ЬуО1 ахтЮ87 1ЬуО2 ахтЮ87 2Ьу01 ахтЮ87 2ЬуО2 ахтЮ88ЬуО1 ахт1088кгу02 ахтЮ91ЬуО1 ахт!091Ьу02 ахтЮ93ЬуО1 ахтЮ93ЬуО2 ахтЮ96ЬуО1 ахтЮ96ЬуО2 ахтЮ97 1ЬуО1 ахтЮ97 1ЬуО2 ахш1097 2ЬуО1 ахт1097 2ЬуО2 ахтЮ98ЬуО1 ахтЮ98ЬуО2 ахтИООЬуО!

ахт1100Ьу02 оркахтИООуО!

орЁахт1100у02 ахтИ01 1ЬуО1 ахтИ01_1Ьу02 ахтИ01 2ЬуО1 ахтИ01 2ЬуО2 ахтИ02Ьу01 ахтИ02Ьу02 ахтИОЗЬуО!

ахтИ03Ьу02 ахтИ04Ьу01 ахтИ04Ьу02 ахт11О7ЬуО1 ахтИ07Ьу02 ахтИ08Ьу01 ахтИ08Ьу02 ахтИ0 9Ьу01 ахт1109Ьу02 ахтШОЬуО!

ахтИ10Ьу02 ахтИИЬуО!

ахтИ11ЬуО2 ахтИ12ЬуО1 ахтИ12ЬуО2 ахтИ14ЬуО1 ахтИ14Ьу02 ахтШбЬуО!

ахтИ16ЬуО2 ахтИ17ЬуО1 ахтИ17ЬуО2 ахтИ18ЬуО1 ахтИ18ЬуО2 ахтИ19ЬуО1 ахтд.119ЬуО2 ахтИ20 1ЬуО1 ахтИ20 1ЬуО2 ахтИ2 0 2ЬуО1 ахтИ20_2Ьу02 ахтИ21ЬуО1 ахтИ21ЬуО2 ахтИ22ЬуО1 ахтИ22ЬуО2 ахтИ23ЬуО1 ахтИ23ЬуО2

185

186

187

188

189

190

191

192

193

194

195

196

197

198

199

200

201

202

203

204

205

206

207

282

283

208

209

210

211

212

213

214

215

216

217

218

219

220

221

222

223

224

225

226

227

228

229

230

231

232

233

234

235

236

237

238

239

240

241

242

243

244

245

246

247

248

249

- 22 020327

ахтИ24	3χιηΐ1240ν01	250
ахт1124кгу02	251
ахтИ25	3χιηί125Ε)ν01	252
ахш11251уу02	253
ахтИ27 ахтИ29 ахтИ37 ахтИ38 ахш1151 ахтИ61 ахтИ 64	ахтИ27 ΙΟνΟΙ	254
ах1П1127_1кгуО2 ахтИ27 2Τ>νΟ1 ахтИ27 2Τ>νΟ2 ахтИ29 ΙΟνΟΙ ахтИ29 16ν02 ахтИ29 2Ε>νΟ1 ахтИ29_21ууО2 ахт1137к^01 ахт1137ЫлО2 ахта.138Ы7-01 ахт11381ууС)2 ахтИ51 ΙΒνΌΙ ахт1151_1кгу02 ахш1151 2Ε>νΟ1 ахтИ51 21ον02 ахт1161 16ν01 ахш1161 16ν02 ахтИ61 2ΒνΟ1 ахтИ61 2Ε>νΟ2 ахтИ64 ΙΒνΟΙ ахтИб4 1Τ>νΟ2 ахтИ64 2ΒνΟ1 ахтИ64 26ν02	255 256 257 258 259 260 261 262 263 264 265 266 267 268 269 270 271 272 273 274 275 276 277
ахтИ83	ахтИ83 2Ον01	278
ахтИ83 26ν02	279
ахт1183кгц-01	280
ахт1183Ы702	281

В другом аспекте изобретения создают модифицированные версии синтетических генов таким образом, чтобы нацелить полученный пептид на органеллу растения, такую как эндоплазматическая сеть или апопласт. Пептидные последовательности, нацеливающие слитые белки на органеллы растений, известны в данной области. Например, Ν-терминальная область гена кислой фосфатазы белого люпина Биртиз а1Ьиз (Генбанк ГО ОЕ14276838; МШег е! а1. (2001) Р1ип! РИузЫоду 127: 594-606) известен в данной области как нацеливающий гетерологичные белки на эндоплазматическую сеть. Если полученный слитый белок также содержит последовательность удержания в эндоплазматической сети, содержащую на С-конце пептид Ν-конец-лизин-аспарагиновая кислота-глутаминовая кислота-лейцин (т.е. мотив КЭЕБ (8ΕΡ ГО N0:123), то слитый белок будет нацелен на эндоплазматическую сеть. При отсутствии на С-конце слитого белка последовательности, нацеленной на эндоплазматическую сеть, белок будет нацелен на эндоплазматическую сеть, но будет, в конечном счете, секвестрирован в апопласте.

Пример 6. Экспрессия гена ахт1100 в Е.сой и Βас^11и8.

Полную ОКЕ гена ахт1100 (размером 3,45 т.п.н., которая кодирует белок размером 1156 аминокислот) клонировали в экспрессирующий вектор Е.сой на основе плазмиды рВ8Е1Ь (для получения рАХ5445) и вектор ΒасШи8 на основе плазмиды рАХ916 (для получения рАХ5444). Полученные клоны подтверждали рестрикционным анализом и в заключение полным секвенированием клонированного гена.

Для экспрессии в Е.сой клетки ΒΕ21*ΌΕ3 трансформировали с помощью рАХ5445. Единичную колонию инокулировали в среду ΕΒ, дополненную канамицином, и выращивали в течение ночи при 37°С. На следующий день свежую среду инокулировали в двух повторах 1% ночной культурой и выращивали при 37°С до логарифмической фазы. После чего культуры индуцировали с помощью 1 мМ ГОТО в течение 3 ч при 37°С или в течение ночи при 20°С. Каждый клеточный осадок суспендировали в 50 мМ натрий-карбонатном буфере, рН 10,5, дополненном 1 мМ ЭТТ, и обрабатывали ультразвуком. Анализ посредством электрофореза в 8Э8-РАОЕ детектировал экспрессию белка размером 130 кДа, соответствующего белку Ахт1100.

Для экспрессии в Βас^11и8 штамм Βас^11и8 !йи^^ηд^еη8^8 трансформировали с помощью рАХ5444 и единичную колонию выращивали в среде СУ8-д1и в течение 3 дней до споруляции. Клеточный осадок затем экстрагировали с помощью 50 мМ натрий-карбонатного буфера, рН 10,5, дополненного 1 мМ ЭТТ. Растворимая фракция показала наличие белка Ахт1100 размером 130 кДа наряду с несколькими полосами белков меньшей молекулярной массы вследствие процессинга белка Ахт1100. Трипсинизация белка Ахт1100 дала 2 четких полосы белков размером около 65 и 55 кДа.

Пример 7. Биоанализ белка Ахт1100.

- 23 020327

Получение образцов.

Бесклеточные экстракты клеток, экспрессирующих АХМН00, обычно ресуспендировали в 50 мМ натрий-карбонатном буфере, рН 10,5, как правило, с включением 1 мМ ΌΤΤ в качестве восстанавливающего агента. Для тестирования посредством биоанализа готовили трипсинизированные и нетрипсинизированные образцы.

Обзор методологии биоанализа.

В 24-луночные планшеты для культивирования тканей (продукция фирмы Согшпд) помещали по 1 мл диеты для большого числа видов (продукция фирмы Вю-8ету) и оставляли до затвердевания. После затвердевания на поверхность каждой лунки с кормом помещали 40 мкл образца белка и оставляли для впитывания/высушивания при комнатной температуре. В зависимости от эксперимента в каждую лунку помещали либо кладки кукурузного мотылька ЕСВ, десять новорожденных личинок, либо одну новорожденную личинку. Планшеты покрывали газопроницаемыми мембранами (продукция фирмы РекеагсН Ргобис!к !п1егпа11опа1) и инкубировали при 25°С и 90% РН. Через пять или семь дней (в зависимости от эксперимента) образцы оценивали визуально, сравнивая с одним буфером или контролем экстракта нетрансформированных клеток.

Повышенная активность АХМЫ00 наблюдалась в отношении кукурузного мотылька и табачной листовертки. Активность в отношении совки-ипсилона наблюдалась при высоких концентрациях белка. Некоторая активность также наблюдалась при высоких концентрациях в отношении гусеницы бархатного боба, но активность как в отношении совки-ипсилона, так и гусеницы бархатного боба оказалась менее отчетливой и более вариабельной, чем в отношении других протестированных насекомых. Трипсинизация белка Ахш1100 дала 2 четких полосы белков около 65 и 55 кДа, и не наблюдалось требуемого для активности Ахш1100.

Пример 8. Дополнительные анализы на пестицидную активность.

Способность пестицидного белка действовать в качестве пестицида на вредителя часто оценивают большим числом способов. Один из способов, хорошо известных в данной области, представляет собой осуществление анализа с подкормкой. В таком анализе с подкормкой экспонируют вредителя с образцом, содержащим либо тестируемые соединения, либо контрольные образцы. Часто это осуществляют помещением тестируемого материала или подходящего разведения такого материала на материал, который вредитель проглотит, такой как искусственная питательная среда. Тестируемый материал может быть составлен из жидкости, твердого вещества или взвеси. Тестируемый материал может быть помещен на поверхность и затем оставлен для высушивания. Альтернативно, тестируемый материал может быть смешан с растопленной искусственной питательной средой, затем разложен в камере для проведения анализа. Камера для проведения анализа может представлять собой, например, чашку, тарелку или лунку планшета для микротитрования.

Анализы с сосущими вредителями (например, тлей) могут включать разделение тестируемого материала в зависимости от насекомого посредством фрагментации, желателен участок, который может быть проколот частями сосущего ротового аппарата сосущего насекомого для заглатывания тестируемого материала. Часто тестируемый материал смешивают со стимулятором кормления, таким как сахароза, для усиления поглощения тестируемого соединения.

Другие виды анализов могут включать микроинъекцию тестируемого материала в ротовой аппарат или кишечник вредителя, а также разработку трансгенных растений с последующим тестированием способности вредителя съедать трансгенное растение. Тестирование растения может включать выделение обычно поедаемых частей растения, например небольшие садки, прикрепленные к листу, или выделение целых растений в садках, содержащих насекомых.

В данной области известны и другие способы и подходы к анализу вредителей, и их можно найти, например, в руководстве РоЬег1коп, РЬ.& Рге1к1ет Н.К. 1992. Рекйшбе Ыоаккаук \\Й11 аййторобк. СКС, Воса Ра1оп, РЬ. Альтернативно, анализы часто описываются в журналах АтШтороб Мападешеп! Тек!к и 1оитпа1 оГ Есопошю Еп!ошо1оду или обсуждаются членами энтомологического общества Америки (Е8А).

Пример 9. Биоанализ белков АхшЮ79 и Ахш1082.

Экспрессия и очистка гена.

ДНК-области, кодирующие токсиновые домены белков Ахш1079 и Ахш1082, по отдельности клонировали в экспрессирующий вектор Е. сой рМАЬ-С4х позади гена ша1Е, кодирующего белок, связывающий мальтозу (МВР). Эти слияния внутри рамки считывания привели к экспрессии в Е. сой слитых белков МВР-Ахшт

Для экспрессии в Е. сой клетки ВЬ21 *ЭЕ3 трансформировали отдельными плазмидами. Единичную колонию инокулировали в среду ЬВ, дополненную карбенициллином и глюкозой, и выращивали в течение ночи при 37°С. На следующий день свежую среду инокулировали 1% ночной культуры и выращивали при 37°С до логарифмической фазы. Затем культуры индуцировали с помощью 0,3 мМ ГРТС в течение ночи при 20°С. Каждый клеточный осадок суспендировали в 20 мМ буфере Трис-НС1, рН 7,4 + 200 мМ ОТТ + ингибиторы протеазы и обрабатывали ультразвуком. Анализ посредством электрофореза в δΌδ-РАСЕ подтвердил экспрессию слитых белков.

- 24 020327

Суммарные бесклеточные экстракты загружали на колонку с амилозой, присоединенную к ГРЬС для аффинной очистки слитых белков МВР-ахтс Связавшийся слитый белок элюировали со смолы с помощью 10 мМ раствора мальтозы. Очищенные слитые белки затем расщепляли либо с помощью фактора Ха, либо трипсина для удаления аминоконцевого МВР-хвоста с белка Ахтт Расщепление и растворимость белков определяли с помощью 8В8-РАОЕ.

Биоанализы с насекомыми.

Расщепленные белки тестировали в анализах с насекомыми с подходящими контролями. Считывание 5-дневных планшетов показало следующие активности этих белков.

Белок Αχιηί	Слитый белок МВР- Αχτηί, расщепленный с помощью	Активность в отношении насекомых
Αχιηί079	Фактора Ха, трипсина	Моль капустная
АхтЮ82	Фактора Ха, трипсина	Моль капустная

Результаты дополнительного биоанализа на насекомых

Ген	Тестируемый образец	с. е1едапз	УВС*	ϋΒΜ*	5ИСВ	СРВ*	ЕСВ*	Ηζ*	Ην*
Ахтт50	сырой экстракт	3, 3
Ахгп152	очищенный, расщепленный		1, 0%
Αχιτιί 5 8 Ахтт68 Αχιηί 8 8 Αχιηί 93 Ахт197	очищенный, расщепленный сырой экстракт очищенный, расщепленный очищенный, расщепленный очищенный, расщепленный	3, 2 20%		4, 100% 1, 0%	1, 0%	1, 0%
Ахтт102	сырой экстракт			4, 100%			3, 75%
Ахгп1112	очищенный, расщепленный		з, 0%	4, 100%	з, 25%		3, 75%	1, 0%	3, 0%
Αχιηί117	очищенный, расщепленный			1, 25%
ΑχιηίΙΟΟ	очищенный, расщепленный			4, 100%			4, 100%

УВС = гусеница бархатного боба

ΏΒΜ = моль капустная

ЗИСВ = огневка кукурузная юго-западная

СРВ = колорадский жук

ЕСВ = мотылек кукурузный

Ηζ = НеИсоуегра геа

Ην = табачная совка * = представлено в виде задержки роста и процента смертности, где задержку роста оценивают по следующей шкале:

- 25 020327

Шкала	Определение
0	Активность отсутствует
1	Незначительная неравномерная задержка роста
2	Неравномерная задержка роста
3	Равномерная задержка роста
4	Равномерная задержка роста со смертностью (выражена в
	виде процента)
5	Равномерная задержка роста со смертностью 100%

Пример 10. Нацеливание пестицидных генов по изобретению на экспрессию в растениях.

Каждый из кодирующих регионов генов по изобретению соединяют независимо с подходящими промоторными и терминаторными последовательностями для экспрессии в растениях. Такие последовательности хорошо известны в данной области, и к ним могут относиться актиновый промотор риса или убиквитиновый промотор кукурузы для экспрессии в однодомных растениях, промотор АтаЬ1бор818 1'0(0 или промотор СаМV 358 для экспрессии в двудомных растениях и терминаторные последовательности поз или РшП. Техники продукции и подтверждения конструкций промотор-ген-терминатор также хорошо известны в данной области.

Пример 11. Трансформация генов по изобретению в растительные клетки посредством АдгоЬас!егшт-опосредованной трансформации.

Початки собирают через 8-12 дней после опыления. Зародыши выделяют из початков и эти зародыши размером 0,8-1,5 мм используют для трансформации. Зародыши помещают щитком вверх на подходящую инкубационную среду и инкубируют в течение ночи при 25°С в темноте. Тем не менее, необязательно непосредственно инкубировать зародыши в течение ночи. Зародыши приводят в контакт со штаммом АдгоЬайегшт, содержащим подходящие векторы для опосредованного плазмидой Т1 переноса, в течение 5-10 мин и затем помещают на среду для совместного культивирования в течение 3 дней (25°С в темноте). После совместного культивирования эксплантаты переносят на среду для периода восстановления в течение пяти дней (при 25°С в темноте). Эксплантаты инкубируют в среде для селекции до восьми недель, в зависимости от особенностей и характеристик конкретной используемой селекции. После периода селекции полученный каллюс переносят на среду для созревания зародыша до обнаружения образования зрелых соматических зародышей. Полученные зрелые соматические зародыши затем помещают в слабоосвещенное помещение и начинают процесс регенерации, известный в данной области. Полученные побеги оставляют для укоренения на среде для укоренения и полученные растения переносят в горшки для рассады и размножают как трансгенные растения.

Пример 12. Трансформация клеток кукурузы пестицидными генами по изобретению.

Кукурузные початки собирают через 8-12 дней после опыления. Из початков выделяют зародыши и эти зародыши размером 0,8-1,5 мм используют для трансформации. Зародыши помещают щитком вверх на подходящую инкубационную среду, такую как среда 1)\62Л58 (соли N6 в концентрации 3,98 г/л; витамины N6 в концентрации 1 мл/л (1000-кратного матричного раствора); Ь-аспарагин в концентрации 800 мг/л; мио-инозитол в концентрации 100 мг/л; Ь-пролин в концентрации 1,4 г/л; казаминокислоты в концентрации 100 мг/л; сахароза в концентрации 50 г/л; 2,4-Ό в концентрации 1 мл/л (1 мг/мл матричного раствора)) и инкубируют в течение ночи при 25°С в темноте.

Полученные эксплантаты переносят в квадратные лунки (30-40 на чашку), переносят в осмотическую среду в течение 30-45 мин, затем переносят на пластину для инжекции (см., например, публикацию РСТ №0/0138514 и патент США 5240842).

ДНК-конструкции, предназначенные для экспрессии генов по изобретению в растительных клетках, ускоряют в ткани растения, используя ускоритель струи аэрозоля, используя условия, по существу, описанные в публикации РСТ №0/0138514. После инжекции зародыши инкубируют в течение 30 мин на осмотической среде, затем помещают в инкубационную среду в течение ночи при 25°С в темноте. Чтобы избежать чрезмерного повреждения эксплантатов процедурой инжекции, их инкубируют в течение по меньшей мере 24 ч перед переносом в среду для регенерации. Зародыши затем помещают в среду для восстановительного периода в течение 5 дней при 25°С в темноте, затем переносят на среду для селекции. Эксплантаты инкубируют в среде для селекции в течение до восьми недель в зависимости от природы и особенностей конкретной используемой селекции. После периода селекции полученный каллюс переносят на среду для созревания зародыша до обнаружения образования зрелых соматических зародышей. Полученные зрелые соматические зародыши затем помещают в слабоосвещенное место и инициируют процесс регенерации способами, известными в данной области. Полученные побеги оставляют для укоренения в среде для укоренения и полученные растения переносят в горшки для рассады и размножают как трансгенные растения.

- 26 020327

Материалы.

Среда 1Ж62А58

Компоненты	на литр	Источник
Основная смесь солей СНи N6 (Прод. № С 416)	3,98 г/л	РЬуЬобесЬпо1оду ЬаЬз
Раствор витаминов СЬи N6 (Прод. № С 149)	1 мл/л (1000кратного матричного раствора)	РПуЕобесПпоХоду ЬаЬз
Ь-аспарагин	800 мг/л	РПубоСесПпоТоду ЬаЬз
Мио-инозитол	100 мг/л	Згдта
Ъ-пролин	1,4 г/л	РНуЬо1:есЬпо1оду ЬаЬз
Казаминокислоты	100 мг/л	ГгзЬег δοίθηΐίίίο
Сахароза	50 г/л	РЬуЬо'ЬесЬпо1оду ЬаЬз
2,4-ϋ (Прод. № 0- 7299)	1 мл/л (матричного раствора концентрацией 1 мг/мл)	ЗЬдта

С помощью 1Ν ΚΟΗ/1Ν КС1 доводят рН раствора до величины 5,8, добавляют Ое1п1е (81§ша) до 3 г/л и автоклавируют. После охлаждения до 50°С добавляют 2 мл/л матричного раствора нитрата серебра концентрацией 5 мг/мл (продукция фирмы РЬу!о!есЪио1о§у ЬаЬз). Рецепт позволяет получить около 20 чашек.

Все публикации и патентные заявки, упомянутые в описании, указывают на уровень специалистов в области техники, к которой данное изобретение относится. Все публикации и патентные заявки приводятся в данный документ в качестве ссылки в той степени, как если бы было конкретно и отдельно указано, что каждая отдельная публикация или патентная заявка приводится в качестве ссылки.

Несмотря на то, что вышеизложенное изобретение для лучшего понимания было описано в некоторых подробностях с помощью иллюстрации и примера, должно быть понятно, что некоторые изменения и модификации могут быть осуществлены в объеме прилагаемой формулы изобретения.

Claims (25)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Выделенная или рекомбинантная молекула нуклеиновой кислоты, содержащая нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:

   a) нуклеотидной последовательности 8Ε^ ΙΌ ΝΟ: 36;

   b) нуклеотидной последовательности, которая по меньшей мере на 90% идентична нуклеотидной последовательностью 8Ε^ ΙΌ ΝΟ: 36, где указанная нуклеотидная последовательность кодирует полипептид с пестицидной активностью;

   c) нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид, содержащий аминокислотную последовательность 8Ε^ ΙΌ ΝΟ: 96; и

   б) нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид, который по меньшей мере на 90% идентичен по аминокислотной последовательности аминокислотной последовательности 8Ε^ ΙΌ ΝΟ: 96, где указанный полипептид обладает пестицидной активностью.
2. 2. Выделенная или рекомбинантная молекула нуклеиновой кислоты по п.1, где указанная нуклеотидная последовательность представляет собой синтетическую последовательность, которая была получена для экспрессии в растении.
3. 3. Выделенная или рекомбинантная молекула нуклеиновой кислоты по п.2, где указанная нуклеотидная последовательность выбрана из любой последовательности 8Ε^ ΙΌ ΝΟ: 206, 207, 282 и 283.
4. 4. Вектор, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты по п.1.
5. 5. Вектор по п.4, дополнительно содержащий молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую гетерологичный полипептид.
6. 6. Клетка-хозяин, содержащая вектор по п.4.
7. 7. Клетка-хозяин по п.6, которая представляет собой бактериальную клетку-хозяин.
8. 8. Клетка-хозяин по п.6, которая представляет собой растительную клетку.
9. 9. Трансгенное растение, содержащее клетку-хозяин по п.8.
10. 10. Трансгенное растение по п.9, где указанное растение выбрано из группы, состоящей из кукурузы, сорго, пшеницы, капусты, подсолнечника, томата, огурцов, перца, картофеля, хлопка, риса, сои, сахарной свеклы, сахарного тростника, табака, ячменя и масличного рапса.

    - 27 020327
11. 11. Выделенный полипептид с пестицидной активностью, выбранный из группы, состоящей из:

    a) полипептида, содержащего аминокислотную последовательность ЗЕЦ ΙΌ N0: 96;

    b) полипептида, содержащего аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична по последовательности аминокислотной последовательности ЗЕЦ ΙΌ N0: 96, где указанный полипептид обладает пестицидной активностью;

    c) полипептида, который кодируется любой нуклеотидной последовательностью ЗЕЦ ΙΌ N0: 36,

    206, 207, 282 и 283; и

    б) полипептида, который кодируется нуклеотидной последовательностью, которая по меньшей мере на 90% идентична по нуклеотидной последовательности любой последовательности ЗЕЦ ΙΌ N0: 36, 206,

    207, 282 и 283, где указанный полипептид обладает пестицидной активностью.
12. 12. Полипептид по п.11, дополнительно содержащий гетерологичные аминокислотные последовательности.
13. 13. Антитело, которое селективно связывается с полипептидом по п.11.
14. 14. Композиция, содержащая полипептид по п.11.
15. 15. Композиция по п.14, где указанная композиция выбрана из группы, состоящей из порошка, дуста, таблетки, гранулы, спрея, эмульсии, коллоидного соединения и раствора.
16. 16. Композиция по п.14, где указанная композиция получена высушиванием, лиофилизацией, гомогенизацией, экстракцией, фильтрацией, центрифугированием, осаждением и концентрированием культуры клеток ВасШик !йигтд1епк1к.
17. 17. Композиция по п.14, содержащая от около 1 до около 99 мас.% указанного полипептида.
18. 18. Способ контроля популяции чешуекрылых или жесткокрылых насекомых-вредителей, включающий приведение в контакт указанную популяцию и пестицидно эффективное количество полипептида по п.11.
19. 19. Способ уничтожения чешуекрылого или жесткокрылого насекомого-вредителя, включающий приведение в контакт указанного вредителя или подкормку указанного вредителя пестицидно эффективным количеством полипептида по п.11.
20. 20. Способ получения полипептида с пестицидной активностью, включающий культивирование клетки-хозяина по п.6 в условиях, в которых экспрессируется молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая данный полипептид.
21. 21. Растение, имеющее стабильно встроенную в свой геном ДНК-конструкцию, содержащую нуклеотидную последовательность, которая кодирует белок с пестицидной активностью, где указанная нуклеотидная последовательность выбрана из группы, состоящей из:

    a) любой нуклеотидной последовательности ЗЕЦ ΙΌ N0: 36, 206, 207, 282 и 283;

    b) нуклеотидной последовательности, которая по меньшей мере на 90% идентична по последовательности любой нуклеотидной последовательности ЗЕЦ ΙΌ N0: 36, 206, 207, 282 и 283, где указанная нуклеотидная последовательность кодирует полипептид с пестицидной активностью;

    c) нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид, содержащий любую аминокислотную последовательность ЗЕЦ ΙΌ N0: 96; и

    б) нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид, который по меньшей мере на 90% идентичен по аминокислотной последовательности с любой аминокислотной последовательностью ЗЕЦ ΙΌ N0: 96, где указанный полипептид обладает пестицидной активностью;

    где указанную нуклеотидную последовательность функционально связывают с промотором, который запускает экспрессию кодирующей последовательности в растительной клетке.
22. 22. Растение по п.21, в котором указанное растение представляет собой растительную клетку.
23. 23. Трансгенное семя растения по п.22.
24. 24. Способ защиты растения от вредителя, включающий введение в указанное растение или его клетку по меньшей мере одного экспрессирующего вектора, содержащего нуклеотидную последовательность, которая кодирует пестицидный полипептид, где указанная нуклеотидная последовательность выбрана из группы, состоящей из:

    a) любой нуклеотидной последовательности ЗЕЦ ΙΌ N0: 36, 206, 207, 282 и 283;

    b) нуклеотидной последовательности, которая по меньшей мере на 90% идентична последовательности с любой нуклеотидной последовательностью ЗЕЦ ΙΌ N0: 36, 206, 207, 282 и 283, где указанная нуклеотидная последовательность кодирует полипептид, обладающий пестицидной активностью;

    c) нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид, содержащий любую аминокислотную последовательность ЗЕЦ ΙΌ N0: 96; и

    б) нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид, который по меньшей мере на 90% идентичен по аминокислотной последовательности с любой аминокислотной последовательностью ЗЕЦ ΙΌ N0: 96, где указанный полипептид обладает пестицидной активностью.
25. 25. Способ по п.24, где указанное растение продуцирует пестицидный полипептид, обладающий пестицидной активностью против чешуекрылого или жесткокрылого насекомого-вредителя.