CN102517228B

CN102517228B - 一株苏云金芽孢杆菌st7及其抗癌基因和应用

Info

Publication number: CN102517228B
Application number: CN201110387024.3A
Authority: CN
Inventors: 李平; 郑爱萍; 唐裕杰; 朱军; 王世全; 邓其明; 李双成; 王玲霞; 刘怀年
Original assignee: Sichuan Agricultural University
Current assignee: Sichuan Agricultural University
Priority date: 2011-11-29
Filing date: 2011-11-29
Publication date: 2014-02-19
Anticipated expiration: 2031-11-29
Also published as: CN102517228A

Abstract

本发明提供了一株具有抗癌活性的苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)菌株ST7，其保藏编号为CGMCC No.3922。它具有cry62Aa1基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明提供的菌株ST7所含cry62Aa1基因的表达蛋白对危害人类健康的乳腺癌细胞具有较高的杀灭活性。

Description

一株苏云金芽孢杆菌ST7及其抗癌基因和应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地，涉及一种苏云金芽孢杆菌ST7及其抗癌基因和应用。

背景技术

苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis，简称Bt)是一种革兰氏阳性好氧细菌，它在形成芽孢的过程中，会在菌体的一端或两端形成一个或多个独特的伴胞晶体蛋白，这是唯一能区分两个分类学上的近缘物种B.thuringiensis和B.cereus的特征。不同菌株晶体蛋白的形状、大小和组分均各不相同，并且常常存在特异的杀虫活性，故称为杀虫晶体蛋白(insecticidal crystal protein，ICP)。这种蛋白对鳞翅目、双翅目、鞘翅目等多种昆虫，以及线虫、螨类和原生动物等都具有特异的杀虫活性(FaustRM.，et al.1983.Plasmid，9：98-103.)，而对哺乳动物没有任何有害作用，广泛应用于卫生与农业害虫的防治(Schnepf HE，et al.1998.MicrobiolMol Biol Rev，62：775-806)。Bt的杀虫晶体蛋白主要包含两个结构上无任何相关性的蛋白家族：Cry蛋白和Cyt蛋白，前者对特异的昆虫有毒性，而后者对无脊椎动物和脊椎动物细胞具有广泛的溶细胞活性，包括昆虫和哺乳动物红细胞。目前，Cry蛋白现在已被划分为69个不同类型：Cry1-Cry69，而Cyt仅有三个类型：Cyt1、Cyt2和Cyt3(http://www.biols.susx.ac.uk/Home/Neil-Crickmore/Bt)(Crickmore N，Zeigler DR，Feitelson J.1998.Microbiol Mol Biol Rev，62：807-813.)。

至今人们已从世界各地的昆虫、土壤和植物体表等样本中分离到数万株Bt菌株，但其中绝大部分Bt菌株没有杀虫活性，因此这些菌株一直不受重视，它们的生物学特征也很少被研究过。直到1999年，日本学者Mizuki才对这类能产生晶体蛋白，而没有杀虫活性的Bt菌进行深入研究(Mizuki E.et al.1999.J Appl Microbiol，86：477-486)。他发现Bt菌株A1190所产生的81kDa伴孢晶体蛋白经蛋白酶处理激活后对体外培养的人癌细胞(人白血病T细胞MOLT-4、人子宫颈癌细胞等)具有杀伤能力，而且无溶血作用。此外，由于Cyt类杀虫晶体蛋白的溶细胞活性，Al-yahaeet等将Cyt2蛋白与肿瘤细胞抗体融合为一个特异破坏肿瘤细胞的融合蛋白进行临床研究，结果表明Cyt2蛋白对癌细胞具有抑制作用(Al-yahaee SA and Ellar DJ.1996.Bioconjug Chem，7：451-460)。该研究是继发现Bt以色列变种之后又一个与医学联系的全新领域，可能为抗癌药物的研究与发展开辟新的方向，引起了许多科学家的关注，并将这类具有抗癌活性的蛋白统称为Parasporin(PS)，具体定义为“Bt及其相关细菌产生的无溶血作用但可优先杀死癌细胞的伴胞晶体蛋白”(Kitada S，et al.2005.Victoria B C：Minireview，1-8.)。2006年，成立了以Michio Ohba为首的Parasporin分类和命名国际委员会(Committee of ParasporinClassification and Nomenclature)，并构建了抗癌晶体蛋白完善的分类系统。与Cry及Cyt蛋白的分类命名一样，根据氨基酸序列的同源性，把现已发现的Parasporin蛋白分划为4种不同类型：Parasporin 1-4(http://parasporin.fitc.pref.fukuoka.jp/intro.html)。通过对目前已有的4类PS蛋白进化分析，结果表明它们存在很少的亲缘关系，而这四种PS蛋白在抗癌毒性谱和活性水平上有显著差别。两种分子量较低的蛋白PS2和PS4具有相对较宽的杀细胞谱，每个都能诱导6个人类癌细胞系死亡，而具有典型三域结构的PS3蛋白具有最窄的活性谱，仅对两个癌细胞系HL-60和HepG2存在中度细胞毒性。与Cry和Cyt蛋白的活化相似，Bt菌株合成的抗癌晶体蛋白也属于无活性的原毒素，需要在碱性溶液中经过蛋白酶水解之后才能产生有活性的抗癌蛋白，并且不同的蛋白酶处理对不同菌株蛋白的活化效果也有很大差异。上述四种PS蛋白未经蛋白酶处理时，不具有杀死癌细胞的活性，或由于内源酶的水解活化而具有极低的抗癌活性。

目前的抗癌药物最大的缺陷是不能特异的作用于癌细胞，在杀死癌细胞的同时也会杀死正常体细胞。而活化的Bt抗癌伴胞晶体蛋白能区别癌细胞与正常细胞，特异地或优先杀死癌细胞。同时，不同菌株的水解产物对不同的癌细胞的杀伤力也有很大区别。如PS2蛋白能优先杀死来自于肝脏和结肠癌组织的癌细胞，而不影响正常细胞(Akio Ito，et al.2004.J Biol Chem，279(20)：21282-21286.)。它对人肝癌细胞有很强的杀细胞活性，但对人正常肝细胞和人子宫颈癌细胞细胞无毒性作用。抗癌蛋白引发的细胞和线粒体肿胀与Cry杀虫蛋白在体内和体外对鳞翅目和双翅目昆虫细胞引发的症状相似，而Cyt蛋白导致的细胞病变没有经历细胞肿胀阶段而直接裂解(Cooksey K.E.1971.London：Academic Press，247-274.)。

从非杀虫Bt菌株中发现具有识别并特异杀死癌细胞能力的伴胞晶体蛋白意义重大。有必要大规模发掘我国抗癌Bt蛋白新资源，筛选出高效、新型的Bt菌株，以及发现新的抗癌蛋白基因对于推动我国抗癌研究工作的进展以及研发新型的更有效、更安全的抗癌药物都具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种具有抗癌活性的苏云金芽孢杆菌及其抗癌基因和应用。

本发明提供的菌株为苏云金芽孢杆菌ST7，该菌株已于2010年6月12日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称为CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)保藏，分类命名为苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)，保藏号为CGMCC No.3922。

该菌株ST7细胞呈杆状，两端钝圆，能形成芽胞，同时能形成球形伴胞晶体，见附图1。菌株大小为(1.2-1.7)μm×(3.2-4.3)μm，通常单个、或两个、或短链细胞存在，一个营养细胞为一个孢子囊，每个孢子囊内含有一个芽孢，次端生，另一端有一个伴孢晶体，孢子囊不膨大。

本发明发现该菌含有伴胞晶体蛋白Cry62Aa1，其氨基酸序列如SEQID NO.2所示。

本发明发现该菌含有1个编码蛋白Cry62Aa1的cry基因cry62Aa1，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

在本发明的一个实施例中，实验发现苏云金芽孢杆菌ST7菌株分泌的伴胞晶体蛋白Cry62Aa1能使人类乳腺癌细胞凋亡，而对正常细胞没有杀灭活性，见附图4。

本发明提供了苏云金芽孢杆菌ST7或其发酵产物在制备杀灭癌细胞的药物中的应用。

本发明提供了苏云金芽孢杆菌ST7或其发酵产物在制备抗癌药物中的应用。

本发明提供了cry62Aa1基因在杀灭癌细胞中的应用。

本发明提供了cry62Aa1基因在制备抗癌药物中的应用。

本发明提供了cry62Aa1基因在制备转基因植物或微生物中的应用。

本发明提供了一种含有cry62Aa1基因的抗癌药物。

优选地，为抗乳腺癌药物。

本发明提供的苏云金芽孢杆菌ST7是一种新发现的Bt资源，含有cry62Aa1基因，能够表达出伴胞晶体蛋白Cry62Aa1，该蛋白不具有杀虫活性，但对人类癌细胞具有杀灭能力。因此本发明的Bt ST7菌株所产生的伴胞晶体蛋白或其抗癌cry62Aa1基因可用于研制抗癌作用的药物，也可用于制备产生抗癌蛋白的转基因植物或微生物，为推动我国抗癌研究工作的发展提供新的研究资料，具有重要的经济价值和应用前景。

附图说明

图1为苏云金芽孢杆菌ST7菌株的圆形伴孢晶体蛋白、芽孢(5000×)；

图2为苏云金芽孢杆菌ST7菌株SDS-PAGE电泳分析，其中：M为蛋白质Marker，1.ST7菌株晶体蛋白Cry62Aa1；

图3为ST7菌株中cry全长基因型的克隆，其中：M.marker；1.cry62Aa1基因；

图4为ST7晶体蛋白对乳腺癌细胞MDA-MB-231的毒杀情况，其中图4A为正常细胞对照，图4B为48h后，凋亡的乳腺癌细胞MDA-MB-231。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的化学试剂均为常规市售试剂，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

本实施例中所用的土样，来自各地不同植物根基土壤。

实施例1苏云金芽孢杆菌ST7菌株的分离培养和cry基因鉴定

(1)菌株的分离培养

土壤采自四川省成都温江地区。采用醋酸钠-抗生素分离法，称取10g土样放入装有50ml醋酸钠培养基的摇瓶中，分别加入青霉素钠盐和硫酸庆大霉素各400μg/ml，摇床培养(200r/min，30℃)4h。培养结束后取土壤悬液10ml，加入无菌的离心管3000r/min离心15min，取上层混浊液2ml于65℃水浴15min，取热处理后的混浊液0.1ml涂平板，将平板置30℃培养箱中培养。48h后从平板上挑取类似Bt的菌株涂片。发现一株含有球状晶体形态的菌株。经用光学显微镜和电子显微镜观察，该菌株细胞呈杆状，两端钝圆，菌株大小为(1.2-1.7)μm×(3.2-4.3)μm，通常单个、或两个、或短链细胞存在，一个营养细胞为一个孢子囊，每个孢子囊内含有一个芽孢，次端生，另一端有一个伴孢晶体(图1)，孢子囊不膨大。SDS-PAGE电泳表明，菌株ST7主要产生约70kDa左右大小的蛋白(图2)。

(2)菌株cry基因的鉴定根据抗癌Cry蛋白的基因保守序列设计1对通用引物：5’-AAHACRAAYTATAAAGATTGG-3’；5’-TTTAKCCAAGTRAATAWATG-3’

扩增体系

扩增条件

cry基因的扩增：

94℃ 5min(预变性)

72℃ 10min(稳定延伸)

4℃ 停止(保存)

扩增反应产物在1％琼脂糖凝胶上电泳，置凝胶成像系统中观察PCR扩增结果，发现约1k的目的条带产生。测序分析表明，该基因片段为cry基因片段。根据菌株的培养特性和PCR鉴定结果，鉴定分离的ST7菌株为苏云金芽孢杆菌。

该杆菌ST7于2010年6月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为CGMCCNo.3922，分类命名为苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)。

实施例2菌株ST7中cry62Aa1基因的克隆

采用基因组DNA纯化试剂盒(购自成都晶肽生物公司)提取菌株ST7的总DNA；设计其全长基因引物P1、P2(引物序列如下)：

P1：5’-ATGAATCAAAATTGTAAAAAAG-3’

P2：5’-TTATGCCGGAATAAATTCGATTT-3’

以菌株ST7总DNA为模板，用P1和P2扩增cry62Aa1全长基因，得到长约2kb的片段(图3)。将纯化后的PCR产物与pGEM-T载体连接，转化，挑取阳性克隆，测序，得到序列SEQ ID NO.1，即为cry62Aa1基因的核苷酸序列。

实施例3菌株ST7伴胞晶体蛋白对乳腺癌细胞杀灭活性检测

(1)Bt菌株ST7伴胞晶体蛋白的提取：

1)挑取菌株ST7的单菌落，接于5ml LB液体培养基中，30℃，230rpm，摇床培养过夜；

2)次日按1％的接菌量转接到1L LB液体培养基中，30℃，230rpm培养，镜检观察50％以上的菌体裂解时停止培养；

3)将第2步所获得的发酵液于8,000rpm，4℃离心8min，沉淀用预冷的1M的NaCl洗涤，离心后用预冷的无菌水洗涤；

4)沉淀悬浮于裂解液(含3％β-巯基乙醇，pH 9.6)，pH值调至9.5-10.0，冰上摇4h，溶解蛋白；

5)10,000rpm，4℃离心20min，取上清，用4M乙酸钠-乙酸溶液(pH 4.5)，调pH值到4.5-5.0，4℃沉淀4h；

6)12,000rpm，4℃离心15min，沉淀用无菌水洗涤数次后溶于50mMNa₂CO₃(pH 9.6)中。

(2)晶体蛋白浓度的测定及其酶处理活化将上述步骤(1)获得的纯化晶体蛋白37℃下在裂解液(50mmol/L pH10.0Na₂CO₃，10mmol/LDTT，1mmol/L EDTA)中溶解60min。用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测其分子量，并用Lowry法测定蛋白含量。蛋白浓度为3mg/L，用蛋白酶K处理晶体蛋白，30μg/mL蛋白酶K 37℃作用90min，加入蛋白酶抑制剂1mmol/L PMSF终止酶解反应，最终调节pH至7.2，获得酶活化的Bt菌株ST7伴胞晶体蛋白Cry62Aa1，过滤除菌备用。

(3)对乳腺癌细胞杀灭活性检测将乳腺癌细胞MDA-MB-231(成都晶肽生物科技有限公司)培养于含10％新生小牛血清、100U/ml青霉素和链霉素的RPMI1640培养液中。分别取MDA-MB-231和人正常T细胞(成都晶肽生物科技有限公司)的对数生长期细胞，以0.25％胰酶与0.02％EDTA混合液(1∶1)消化后制成单细胞悬液，血小板计数器计数，调细胞浓度为1.5×10⁵/ml后接种96孔培养板中，每孔100μl细胞悬液，添加正常T细胞的孔为对照孔，添加MDA-MB-231细胞的孔为处理孔。37℃，5％CO₂，24h后，吸去培养液，每孔分别加入上述步骤(2)获得的ST7菌株伴胞晶体蛋白Cry62Aa1[用含10％新生小牛血清的RPMI1640培养基把步骤(2)获得的蛋白(浓度3mg/L)稀释一倍作为第一个上药浓度，再作五倍梯度稀释，共作8个稀释浓度]培养液200μl，继续培养48h。然后，每孔加入50ul 50％三氯乙酸(TCA)，4℃放置1h，弃去固定液，用蒸馏水洗5次，轻轻甩干以除去剩余水分。在对照孔和各处理孔加入50ul 0.4％SRB染液，室温放置20min。吸出染液弃去，用1％醋酸溶液洗涤，每孔至少5次，直至无红色染液为止，轻轻甩干以除去残留液体。按200ul/孔加入10mM Tris碱，振荡10-15s，使其充分溶解混匀。用酶标仪在490nm波长处测定各孔吸光度(OD)值。伴胞晶体蛋白的浓度为横轴，吸光度(OD)值为纵轴作图观察伴胞晶体蛋白Cry62Aa1对乳腺癌细胞生长的影响。再用专用模板Originpro7.0中四参数方程(y＝A2+(A1-A2)/(1+(x/x0)^p))计算半数有效抑制浓度(IC₅₀值)。结果表明，菌株ST7伴胞晶体蛋白对正常细胞没有抑制作用，但可使乳腺癌细胞MDA-MB-231凋亡，具有杀灭癌细胞的作用(图4)，IC₅₀为8.09mg/L。

Claims

1.苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）菌株ST7，其保藏编号为CGMCC No.3922，含有伴胞晶体蛋白Cry62Aa1，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，编码伴胞晶体蛋白Cry62Aa1的基因为cry62Aa1基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

该菌株ST7细胞呈杆状，两端钝圆，能形成芽胞，同时能形成球形伴胞晶体，菌株大小为(1.2-1.7)μm×(3.2-4.3)μm，一般以单个、或两个、或短链细胞存在，一个营养细胞为一个孢子囊，每个孢子囊内含有一个芽孢，次端生，另一端有一个伴孢晶体，孢子囊不膨大；

其中，根据抗癌Cry蛋白的基因保守序列设计1对通用引物：5’-AAHACRAAYTATAAAGATTGG-3’；5’-TTTAKCCAAGTRAATAWATG-3’，来对菌株cry基因进行鉴定。

2.权利要求1所述的苏云金芽孢杆菌ST7或其发酵产物在制备杀灭癌细胞的药物中的应用，所述的癌为乳腺癌。

3.权利要求1所述的苏云金芽孢杆菌ST7或其发酵产物在制备抗癌药物中的应用，所述的癌为乳腺癌。