CN106047749A - 一种玉米赤霉烯酮降解菌及其应用 - Google Patents

一种玉米赤霉烯酮降解菌及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种玉米赤霉烯酮降解菌及其应用，属于生物技术领域。本发明以ZEN为唯一碳源和能源进行初筛和复筛，分离到一株能高效降解ZEN的细菌H6(CCTCC NO:M2016129)，其发酵液与ZEN(终浓度为10μg/mL)在37℃、180r/min条件下培养72h)，对ZEN的降解率达到93.64％。通过细胞形态、生理生化鉴定以及16S rRNA序列比对分析，鉴定为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)。菌株H6降解活性物质主要存在于发酵后的上清液中，菌体也具有部分降解作用。菌株H6可应用于制备降解玉米赤霉烯酮的微生物制剂或者饲料生物降解添加剂。

Description

一种玉米赤霉烯酮降解菌及其应用
技术领域
本发明涉及一种玉米赤霉烯酮降解菌，同时还涉及该降解菌的应用，属于生物技术领域。
背景技术
玉米赤霉烯酮(Zearalenone，ZEN)又称F-2毒素，是一种酚的二羟基苯酸的内酯结构，与雌二醇结构相似，主要是禾谷镰刀菌产生的具有类雌激素作用的真菌毒素，对人和动物健康造成极大的危害，能使机体连续动情并导致假孕、不育、卵巢畸形和流产等一系列的生殖障碍，此外研究证实玉米赤霉烯酮还具有遗传毒性、细胞毒性、免疫毒性和致癌性。目前，世界上许多国家的谷物和农副产品中都存在ZEN的污染，给畜牧场或食品业造成巨大的经济损失。戎晓平等在调查2014年9月～2015年5月北京、山东、河南、四川等地区的部分饲料公司和养殖场时发现，大猪料中ZEN污染较为严重，阳性平均值为510.42μg/kg，为中度污染，而玉米、DDGS中ZEN含量超标，阳性平均值分别为477.14μg/kg和417.67μg/kg，超标率分别为23.21％和13.33％。
目前，去除ZEN的方法主要有物理、化学和微生物法三大类。其中，物理脱毒法包括热处理法、辐照法、吸附法等，化学法包括氨化法、碱法、臭氧处理法、双氧水处理法等。但是，传统的物理、化学脱毒法并不能彻底去除ZEN的毒性，有些还可能造成谷物营养成分的流失，甚至产生潜在的不确定性危害因素，不能被广泛应用。微生物是自然界的分解者，几乎能够分解自然界中所有的物质，因而可以从环境中分离出能够降解ZEN的微生物来去除ZEN。微生物降解法主要通过破坏毒素分子结构中的毒性基团，将毒素降解为无毒的物质，具有高效性、高特异性、无毒副作用等特点。已有报道蜡样芽孢杆菌、粘滞塞氏杆菌、红球菌属等对ZEN具有降解能力。如Tan等从土壤中分离出的假单胞菌(Pseudomonas)TH-C1和TH-L1，对ZEN(2μg/mL)的降解率分别为68±0.85％和57±0.73％。Sun等筛选得到的黑曲霉(Aspergillus niger strain)FS10，可去除玉米浆中60.1％的ZEN(29μg/mL)。公布号CN10398113A的发明专利公开的一株解淀粉芽孢杆菌CGMCC NO.8726，对ZEN也具有较好的降解效果，降解率为95.99±0.23％，但是该菌株仅能降解5μg/mL的ZEN。
发明内容
本发明的目的是提供一种玉米赤霉烯酮降解菌，由胞外酶发挥ZEN降解作用，对ZEN的降解率达93.64％。
同时，本发明还提供一种玉米赤霉烯酮降解菌在降解玉米赤霉烯酮、制备降解玉米赤霉烯酮的微生物制剂或者饲料生物降解添加剂中的应用。
最后，本发明再提供一种包含玉米赤霉烯酮降解菌的微生物制剂或者饲料生物降解添加剂。
为了实现以上目的，本发明所采用的技术方案是：
玉米赤霉烯酮降解菌，其名称为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)H6，保藏编号：CCTCC NO:M2016129，保藏日期：2016年3月17日，保藏单位：中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址：中国武汉.武汉大学(湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学保藏中心)。
菌株H6(CCTCC NO:M2016129)的菌落呈圆形，浊白色，边缘锯齿状，镜检菌体为短杆状，有芽孢，革兰氏阳性。经PCR扩增得到16S rRNA基因序列，全长约1500bp。测序后在NCBI上使用Blast比对，从GenBank数据库中获得相关序列进行系统发育分析，结果显示菌株H6与解淀粉芽孢杆菌(Accession No.KT961125)的16S rRNA同源性达到99％，判定为解淀粉芽孢杆菌。
玉米赤霉烯酮降解菌(CCTCC NO:M2016129)在降解玉米赤霉烯酮中的应用。
玉米赤霉烯酮降解菌(CCTCC NO:M2016129)在制备降解玉米赤霉烯酮的微生物制剂或者饲料生物降解添加剂中的应用。
微生物制剂，包含玉米赤霉烯酮降解菌(CCTCC NO:M2016129)。
饲料生物降解添加剂，包含玉米赤霉烯酮降解菌(CCTCC NO:M2016129)。
本发明的有益效果：
本发明以ZEN为唯一碳源和能源进行初筛和复筛，分离到一株能高效降解ZEN的细菌H6，其发酵液与ZEN(终浓度为10μg/mL)在37℃、180r/min条件下培养72h)，对ZEN的降解率达到93.64％。通过细胞形态、生理生化鉴定以及16S rRNA序列比对分析，鉴定为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)。菌株H6降解活性物质主要存在于发酵后的上清液中，菌体也具有部分降解活性。菌株H6可应用于制备降解玉米赤霉烯酮的微生物制剂或者饲料生物降解添加剂。
保藏证明和存活证明说明
保藏菌株：解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)H6，保藏编号：CCTCCNO:M2016129，保藏日期：2016年3月17日，保藏单位：中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址：中国武汉.武汉大学(湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学保藏中心)。
附图说明
图1为菌株H6的16S rRNA扩增序列电泳图；
图2为菌株H6与同源性较高细菌16S rRNA序列的系统进化树；
图3为菌株H6的上清液、菌悬液及胞内液对ZEN的降解率；
图4为菌株H6的上清液经蛋白酶K、蛋白酶K+SDS、热处理后对ZEN的降解率；
图5为不同浓度的硫酸铵沉淀菌株H6粗酶的SDS-PAGE图；
图6为80％硫酸铵沉淀的胞外酶对ZEN的降解率。
具体实施方式
下述实施例仅对本发明作进一步详细说明，但不构成对本发明的任何限制。
实施例1
玉米赤霉烯酮降解菌(CCTCC NO:M2016129)在降解玉米赤霉烯酮中的应用。
实施例2
玉米赤霉烯酮降解菌(CCTCC NO:M2016129)在制备降解玉米赤霉烯酮的微生物制剂中的应用。
实施例3
微生物制剂，包含玉米赤霉烯酮降解菌(CCTCC NO:M2016129)。
试验例
1、主要仪器与试剂
PCR仪器，酶标仪，细胞破碎仪，低温离心机；ZEN标准品(Pribolab)，ZEN ELISA检测试剂盒(Pribolab)，甲醇，硫酸铵，蛋白酶K，SDS。
PBS缓冲液(0.05mol/L)：40g NaCl，1g KCl，17.9g Na2HPO4·12H2O，1.2g KH2PO4溶于800mL蒸馏水中，调节pH为7.4，定容至1L。
初筛培养基(g/L)：1.52g KH2PO4，2.44g Na2HPO4，0.2g MgSO4·7H2O，0.5g(NH4)2SO4，0.05g CaCl2，pH 7.0；121℃，灭菌20min。
种子培养基为营养肉汤培养基。
2、玉米赤霉烯酮降解菌的筛选与研究：
1)降解ZEN菌株的初筛
分别称取5g健康兔、羊、牛和长颈鹿粪便，加入灭菌的250mL锥形瓶中，用100mL无菌蒸馏水水溶解。在37℃、170r/min条件下震荡2h。取上清500μL加入4.5mL以ZEN(终浓度为2μg/mL)为唯一碳源的初筛培养基中，在37℃、170r/min条件下培养5d后，取500μL转接于4.5mL含ZEN(2μg/mL)的初筛培养基中，在37℃、170r/min条件下培养5d，连续转接3次。用ELISA试剂盒检测最后一次培养菌液中ZEN的剩余量，并在营养琼脂平板上分离、保留能生长的菌株。
ZEN含量测定方法：取样品12000r/min离心10min，按照ELISA试剂盒说明书，取500μL上清液，加入1mL甲醇，混匀。取上述混匀液体100μL，加入567μL样本稀释液，用酶联免疫检测仪检测ZEN的含量。ZEN降解率(％)＝(对照组含量-试验组含量)/对照组含量×100％。
以ZEN为选择压力，如表1所示，筛选到可生长的40株菌株。用ELISA试剂盒检测各组样品中ZEN残余量，发现兔粪便混合物样品培养液中ZEN减少最多，剩余量为1308.31ng/mL，长颈鹿粪便混合物样品混合液ZEN减少最少，剩余量为1855.28ng/mL。
表1 降解ZEN菌株的初筛结果
2)降解ZEN菌株的复筛
取分离菌在营养琼脂平板上活化，挑取单菌落于50mL的营养肉汤中培养8h后，以6％的接种量接种于100mL营养肉汤中培养24h。培养结束后，取900μL发酵液与100μL ZEN(终浓度为10μg/mL)在37℃、170r/min条件下培养72h，以不接菌的营养肉汤加ZEN作为空白对照。
从初筛得到的40株菌株中，分别取菌株发酵液与ZEN(10μg/ml)标准品反应进行复筛。如表2所示，有5株菌株有ZEN降解能力，其中从兔粪便混合物中分离的菌H6降解效果最好，降解率可达93.64％。因此选择H6菌株进行进一步的研究。
表2 分离自不同样品的降解ZEN的菌株
3)降解ZEN菌株的鉴定
根据《常见细菌系统鉴定手册》中实验方法，将筛选得到的ZEN降解菌株划线接种于LB琼脂培养基，37℃倒置培养24h，观察菌落形态；挑取菌体进行革兰氏染色，观察菌体形态。参照金晶等的简便酚/氯仿法提取菌株基因组总DNA，用16S rRNA通用引物16S 27f(AGAGTTTGATCCTGGCTCAG)和16S 1525r(AAGGAGGTGATCCAGCCGCA)扩增菌株16S rRNA片段。PCR反应体系50μL：2×Taq Mix 25μL，16S 27f(10μmol/L)2.5μL，16S 1525r(10μmol/L)2.5μL，细菌DNA 5μL，无菌水15μL。PCR反应程序：95℃预变性5min；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸50s，32个循环；72℃延伸8min。PCR产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳，检测PCR产物大小，后将16S rRNA基因产物交华大基因公司测序。测序结果与NCBI中GenBank数据库进行BLAST分析序列同源性，对得到的同源性较高的序列采用MEGA6.0构建进化树。
菌株H6的细胞形态和生理生化特征为：菌落呈圆形；浊白色；边缘锯齿状；镜检菌体为杆状；有芽孢；革兰氏阳性；发光：-；吲哚产生：+；柠檬酸盐利用：-；V.P：+；甲基红：-；氧化酶：+；淀粉水解：+；明胶液化：+；脲酶：-；吐温80：-；硝酸盐还原：+；纤维素利用：-；葡萄糖利用：+；蔗糖利用：+；乳糖利用：+；50℃生长：+；；5％NaCl生长：+。
经PCR扩增得到16S rRNA基因序列(如SEQ ID NO.1所示)，全长约1500bp(见图1，图中M为Marker，H6为菌株H6)。测序后在NCBI上使用Blast比对，从GenBank数据库中获得相关序列进行系统发育分析，由图2可知，菌株H6与解淀粉芽孢杆菌(AccessionNo.KT961125)的16S rRNA同源性达到99％。结合遗传距离、细胞形态和生理生化特征，确定菌株H6为解淀粉芽孢杆菌。
4)菌株降解ZEN活性组分的确定以及不同组分对ZEN的降解作用
参考雷元培等(《降解黄曲霉毒素枯草芽孢杆菌的解毒性、抗菌性及抗逆性研究》，2011)的方法，取5mL发酵液，4℃离心20min(6000r/min)分离上清液与菌体，上清液用0.22μm大小孔径的滤膜过滤，除去少量杂菌；上清中加入蛋白酶K(1mg/mL)，37℃作用1h；上清中加入蛋白酶K和SDS，37℃作用6h；100℃处理上清20min；离心后的菌体用PBS洗涤2次，加入5mL PBS制得菌悬液；菌悬液进行细胞超声波破碎后冷冻离心，取上清制得胞内液备用。
菌株H6发酵后的上清液、菌细胞及胞内液分别与ZEN(终浓度10μg/ml)在37℃、180r/min条件下共同培养72h，并对它们降解ZEN的能力进行比较。结果显示(见图3),上清液降解率达63.99％，菌悬液的降解能力次之，降解率为25.70％，胞内液降解率为7.17％，几乎无降解能力。表明菌株H6发挥降解作用的活性物质主要存在于发酵后的上清液中。
菌株H6发酵后的上清液经过蛋白酶K、蛋白酶K+SDS、热处理后，分别与ZEN(终浓度10μg/mL)在37℃、180r/min条件下共同培养72h，发现其对ZEN的降解能力显著降低(见图4)，分别为10.11％、3.02％和8.04％。初步判断菌株H6降解ZEN的活性物质主要是菌体细胞分泌的一种胞外酶。
5)粗蛋白液的制备以及活性蛋白分子量的确定
分别取发酵上清液50mL，边搅拌边缓慢加入100％饱和硫酸铵溶液(pH＝7.4)，使硫酸铵饱和度分别为65％、70％、75％和80％，然后将其置于4℃冰箱中过夜，再于4℃、1000r/min条件下离心15min，收集沉淀物，沉淀物用1.5mL PBS复溶后，将其置于无菌蒸馏水中透析24h。
对沉淀后的蛋白利用12％的SDS-PAGE蛋白电泳进行检测，将待测样品与样品缓冲液等比例混合，于100℃水浴5min，冷却后5000r/min离心，上样。初始电压80v，待样品进入分离胶后，将电压调高至100v。当溴酚蓝指示剂迁移到接近凝胶底部时停止电泳。考马斯亮兰R-250染色2h，脱色15h。
用65％、70％、75％、80％四种浓度的硫酸铵沉淀菌株H6粗酶，SDS-PAGE电泳图(见图5)表明，这四种浓度硫酸铵沉淀的蛋白分子量差别不大，在36kDa(lane 1)和18kDa(lane2)左右处都有清晰明亮的条带，除此之外还有其他的蛋白，但因含量较低所以条带不够清晰，说明lane 1和lane 2应是主要的蛋白成分。故选用80％硫酸铵沉淀的胞外酶进行后续的降解实验，结果表明(见图6)，胞外酶和PBS分别与ZEN(终浓度10μg/mL)在37℃、180r/min条件下作用3d后，ZEN含量分别减少到410.82ng/mL和920.36ng/mL，胞外酶对ZEN的降解率为55.36％。
小结：
本发明从兔粪便混合物中分离的解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)H6，其发酵液对ZEN(10μg/mL)的去毒率达93.64％。通过对菌株H6的上清液、菌细胞及胞内液去毒活性进行比较发现，H6菌株降解ZEN的活性物质主要存在于上清液中，用蛋白酶K、蛋白酶K+SDS、热处理上清液后，降解能力明显降低，用80％硫酸铵沉淀的胞外活性物质的降解率为55.3％，表明H6菌株发挥降解作用的活性物质是一种胞外酶。
本发明以ZEN为唯一碳源和能源进行初筛和复筛，分离到一株能高效降解ZEN的细菌H6，其发酵液与ZEN(终浓度为10μg/mL)在37℃、180r/min条件下培养72h)，对ZEN的降解率达到93.64％。通过细胞形态、生理生化鉴定以及16S rRNA序列比对分析，鉴定为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)。菌株H6去毒活性物质主要存在于发酵后的上清液中，菌体也有部分降解作用。菌株H6可应用于制备降解玉米赤霉烯酮的微生物制剂或者饲料生物降解添加剂。

Claims (5)

1.玉米赤霉烯酮降解菌，其特征在于：玉米赤霉烯酮降解菌的名称为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)H6，保藏编号：CCTCC NO:M2016129。
2.如权利要求1所述的玉米赤霉烯酮降解菌在降解玉米赤霉烯酮中的应用。
3.如权利要求1所述的玉米赤霉烯酮降解菌在制备降解玉米赤霉烯酮的微生物制剂或者饲料生物降解添加剂中的应用。
4.微生物制剂，其特征在于：包含如权利要求1所述的玉米赤霉烯酮降解菌。
5.饲料生物降解添加剂，其特征在于：包含如权利要求1所述的玉米赤霉烯酮降解菌。
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