CN101597581B

CN101597581B - 一种嗜碱芽孢杆菌及其培养方法和应用

Info

Publication number: CN101597581B
Application number: CN2009100882237A
Authority: CN
Inventors: 张薇
Original assignee: North China Electric Power University
Current assignee: North China Electric Power University
Priority date: 2009-07-13
Filing date: 2009-07-13
Publication date: 2011-01-05
Anticipated expiration: 2029-07-13
Also published as: CN101597581A

Abstract

本发明公开了一种属于微生物技术领域的嗜碱芽孢杆菌(Bacillusalcalophilus)SD7903保藏号为CGMCC No.3158，本发明还公开了该菌株的培养方法以及该菌株在生产四氢嘧啶方面的应用，该菌具有较高的四氢嘧啶合成能力，且是一株革兰氏阳性菌，对目前工业上主要应用革兰氏阴性菌生产四氢嘧啶而言，拓宽了生物资源利用空间，有良好的工业应用前景。

Description

一种嗜碱芽孢杆菌及其培养方法和应用

技术领域

本发明涉及一种嗜碱芽孢杆菌，具体涉及一种嗜碱芽孢杆菌(Bacillusalcalophilus)SD7903及其及其培养方法和应用。

背景技术

当微生物处于高渗环境时，多数中度嗜盐菌可以在体内积累小分子有机溶质，如糖、多元醇、甜菜碱及氨基酸等，以维持细胞内外渗透压平衡，这类物质被称为“相容性溶质”。其中，氨基酸的衍生物四氢嘧啶(ectoine)，几乎为所有中度嗜盐菌的主要累积。如应用13C-NMR、HPLC等技术，已在Marinbactrhydrocarbonoclasticus、Marinococcushalophilus、Vibriocosticola、Halomonasspp.、Bacillusspp.等多种嗜盐菌中发现了四氢嘧啶，由此可见它对耐盐细菌调渗功能的重要性。

四氢嘧啶(1，4，5，6-tetrahydro-2-methyl-4-pyrimidinecarboxylicacid)，又名1，4，5，6，-四氨-2-甲基-4-嘧啶羧酸，一种环状氨基酸，首先是在光合紫细菌的盐生绿色外硫红螺菌(Ectothiorhodospirahalochloris)中发现并得名，具有高度的可溶性和生理pH条件下的非离子特性，所以成为嗜盐光合细菌主要的渗透压调节剂。不仅可以维持内外渗透压平衡，保护细胞免受高盐伤害，还有广泛的抗逆保护效果，能稳定酶蛋白、DNA和细胞膜结构，帮助细胞抵抗冷冻、干旱、高温、高渗、辐射等各种逆境。目前已经开发出许多商业用途，酶的稳定剂、微生物的保护剂、护肤品中的保湿剂和医学上保护化疗健康细胞的保护剂等。

由于四氢嘧啶很难用化学方法合成，目前国外利用一种称为细菌泌乳的工艺(Bacterialmilking)来生产四氢嘧啶。其原理是利用高渗和低渗环境的反复交替来刺激菌体产生大量四氢嘧啶，释放到细胞外(泌乳)。目前该工艺可应用的菌株大多为革兰氏阴性菌，如短杆菌(Brevibacteriumsp.JCM6894)、延长盐单胞菌(Halomonaselongata)、盐脱氮盐单胞菌(Halomonashalodenitrificans)等。革兰氏阳性菌只有海球菌(MarinococcusM52)，可以采用一次培养工艺进行四氢嘧啶的生物发酵，所以一般认为革兰氏阳性细菌不适合细菌泌乳工艺。嗜碱芽孢杆菌DTY1(张薇等，微生物学报，2006，46(6)：956-960)受盐的诱导可生成四氢嘧啶，但是四氢嘧啶的产量不高。

发明内容

本发明的目的在于提供一种嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alcalophilus)SD7903，为革兰氏阳性菌。

本发明的另一目的在于提供上述嗜碱芽孢杆菌的培养方法。

本发明的目的还在于提供上述嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alcalophilus)SD7903在生产四氢嘧啶方面的应用。

本发明的嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alcalophilus)SD7903，自山西五寨县柠条种植区盐碱土壤中分离，已于2009年7月2日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其简称为CGMCC，保藏编号为CGMCC No.3158。

上述嗜碱芽孢杆菌的培养方法，具体操作如下：将所述嗜碱芽孢杆菌接种于NaCl浓度为0-12wt％的LB液体培养基内，在培养温度为25-37℃的条件下，振荡培养至饱和后，离心收集菌体。

所述LB液体培养基中NaCl浓度为5-9wt％。

所述LB液体培养基的pH为7-10。

所述培养温度为32-35℃。

本发明所使用的LB培养基同生物学领域常用LB培养基相比，成分相同，仅NaCl浓度和pH不完全相同，其他成分浓度均与常用LB培养基相同。其中，NaCl浓度和pH如上所述。

上述嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alcalophilus)SD7903用于生产四氢嘧啶。

本发明菌株嗜碱芽孢杆菌SD7903具有以下微生物学特征：

(1)菌落形态：在LB培养基上菌落呈圆形，边缘整齐，表面隆起光滑，直径0.5～1mm。

(2)细胞形态：革兰氏阳性菌，可运动，菌体杆状，大小为0.6～1μm×3～4μm，产芽孢，椭圆形(见图1)。

(3)生长条件：可以在NaCl浓度为0-12wt％的LB液体培养基内生长(见图2)，其中，最适生长的NaCl浓度为5-9wt％，最适生长温度32-35℃，最适生长pH为7-10。

(4)生理生化特征：过氧化氢酶反应阳性，甲基红反应阳性，可以分解吐温60；不能水解酪氨酸，苯丙氨酸脱氨酶反应、卵磷脂酶反应、v-p反应、精氨酸双水解反应阴性，不能利用柠檬酸盐，不能合成H₂S；与模式菌Bacillus alcalophilus DSM 485^T相比，SD7903兼性厌氧，不水解淀粉和明胶，脲酶反应和酪蛋白反应阴性。与嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alcalophilus)DTY1(张薇等，微生物学报，2006，46(6)：956-960)相比，硝酸盐反应阳性。SD7903能利用木糖、树胶醛糖、蜜二糖产酸，能较好利用鼠李糖、阿拉伯糖、甲硫氨酸、半乳糖、乳糖、果糖、木糖、葡萄糖、麦芽糖和肌醇等碳源。本发明与Bacillusalcalophilus DSM 485^T相比，不能利用甘露糖产酸。与Bacillusalcalophilus DTY1相比，可以利用肌醇。具体如表1：

表1 SD7903生理生化试验结果

注：+表示阳性反应，-表示阴性反应

(5)功能特征：该菌最高可以耐受12％NaCl高盐环境，远远高于模式菌Bacillus alcalophilus DSM 485^T 5％和Bacillus alcalophilus DTY1 7％耐盐度。并且表现出随盐度升高四氢嘧啶生成量增加的趋势，在含10％NaCl的LB液体培养基中四氢嘧啶产量可达到170.6mg/g·cdw。

(6)抗生素抗性特征：该菌对氨苄青霉素、硫酸卡那霉素、氯霉素、四环素和利福平均无抗性。

(7)质粒特征：该菌不携带质粒，避免了质粒的不相容性，可以用作构建具多种降解能力的基因工程菌。

本发明嗜碱芽孢杆菌SD7903的16SrDNA序列测定：扩增约1.4kb的16SrDNA序列，测序鉴定结果如SEQIDNO.1所示。将其在GenBank数据库中进行同源序列比对，发现菌种SD7903与嗜碱芽孢杆菌Bacillus a lcalophilus具有99％同源性。

结合形态观察、生理生化结果和16SrDNA分子测序，确定本发明分离到的高产四氢嘧啶菌株为嗜碱芽孢杆菌Bacillus alcalophilus。

本发明菌株有较高的耐盐性和四氢嘧啶合成能力，与属于同一菌种的Bacillus alcalophilus DTY1相比，耐盐性强且四氢嘧啶产量高，且是一株革兰氏阳性菌，对目前工业上主要应用革兰氏阴性菌生产四氢嘧啶而言，拓宽了生物资源利用空间，有良好的工业应用前景；此外，本发明的菌株对氨苄青霉素、硫酸卡那霉素、氯霉素、四环素和利福平均无抗性，在实际使用过程中不会向环境传递这些耐药因子，保证了生态安全性；且不携带质粒，避免了质粒的不相容性，可以用作构建具多种降解能力的基因工程菌。

附图说明：

图1为本发明SD7903菌电镜照片；

图2为本发明SD7903菌株在不同NaCl浓度中的生长情况；

图3为本发明SD7903菌株含有四氢嘧啶合成基因片段；

其中M为1Kb Marker，泳道1D7903菌株，泳道2阴性对照菌株

图4为本发明SD7903在不同盐域环境下四氢嘧啶的合成能力。

具体实施方式：

本发明实施例中培养基配方的比例均为重量百分比，特别标明的除外，采用常规方法配制。实施例中一些分子生物学操作如未注明具体试验条件和方法，均参照SambrookJ等主编，科学出版社，2002，分子克隆实验指南(第三版)。

本发明所使用的LB培养基同生物学领域常用LB培养基相比，成分相同，仅NaCl浓度和pH不完全相同，其他成分浓度均与常用LB培养基相同，其中，NaCl浓度和pH见实施例。

生物学领域常用LB培养基配制：

常用液体LB培养基的配制：以配制1升为例，在950ml去离子水中加入胰化蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCl 10g，摇动容器直至溶质溶解。用NaOH或HCl调pH至7.0，用去离子水定容至1L，高压灭菌20min。

常用固体LB培养基的配制：以配制1升为例，在上述常用液体LB培养基中再加入15g琼脂，其他同常用液体LB培养基的配制。

实施例1：嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alcalophilus)SD7903的获得

该菌株自山西五寨县柠条种植区盐碱土壤中分离，取1g上述土样用无菌水系列稀释为10×、100×、1000×浓度，分别涂于含5％NaCl、PH为7.0的LB固体培养基，33℃培养5d后挑取单菌落，反复划线直至获得纯菌，从100×稀释土样中筛选到本发明菌。此为第一次筛选，即使用筛选培养基筛选耐盐细菌。

第二次用PCR方法复筛可产四氢嘧啶的耐盐细菌，CTAB法提取经初筛的各耐盐菌株的基因组DNA，以其为模板，设计特异性引物ect1198和ect1966，扩增约750bp的四氢嘧啶基因片段，1％琼脂糖凝胶电泳检查，如有该750bp条带，则为含四氢嘧啶合成基因，为产四氢嘧啶的耐盐菌(见图3)。

引物序列如下：

ect11985′-TCGATTTCTTCGCAGGTGCAGG-3′(SEQIDNO.2)

ect19665′-GGAATGTGCCATTATGTTCGCC-3′(SEQIDNO.3)

PCR反应组分为：

10×PCR buffer 5μl

dNTP(各2.5mM) 5μl

引物ect1198(10μM) 2μl

引物ect1966(10μM) 2μl

gDNA(0.1μg) 1μl

PfuTaq(5U/μL) 0.5μl

ddH₂O 34.5μl

总体积 50μl

PCR程序：95℃变性5min，95℃40s，58℃40s，72℃1min，共30个循环，72℃延伸10min。

第三次复筛高产四氢嘧啶的细菌菌株。将经前两次筛选的耐盐菌株接种于NaCl浓度为7wt％的LB液体培养基内，在160rpm，33℃的条件下，培养至OD₅₇₈约为1时，用HPLC法(具体操作见实施例6的相应部分)检测四氢嘧啶产量，最终筛选出产量最高的嗜碱芽孢杆菌SD7903。

实施例2嗜碱芽孢杆菌(Bacillus al calophilus)SD7903的16SrDNA的扩增、测序及序列比对

CTAB法提取菌株SD7903基因组DNA为模板，引物序列如下：

27F 5’-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’(SEQIDN O.4)

1495R 5’-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3’(SEQIDN O.5)

按照下列扩增体系扩增约1.4kb的片段。

PCR反应组分为：

10×PCR buffer 5μl

dNTP(各2.5mM) 5μl

引物27F(10μM) 2μl

引物1495R(10μM) 2μl

gDNA(0.1μg) 1μl

PfuTaq(5U/μl) 0.5μl

ddH₂O 34.5μl

总体积 50μl

PCR反应程序：95℃5min；95℃40s，52℃40s，72℃1min，共30个循环；72℃延伸10min。PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳回收纯化后连接到T载体上克隆，经蓝白筛选后提取质粒测序，测序结果具有序列表中SEQ ID No.1的核苷酸序列，测序公司为上海生工。应用BLAST对序列同源性比较，发现该菌与Bacillus alcalophilusDSM485^T(BA16SRRX)同源性最高，达到99％。

因此，参照《Bergey’sManualofDeteriminativeBacteriology》第9版和《常见细菌系统鉴定手册》芽孢杆菌属特征，结合其形态特征、生理生化指标、16SrDNA基因序列相似性，鉴定菌株SD7903为嗜碱芽孢杆菌Bacillusalcalophilus，保藏号为CGMCC No.3158。

实施例3嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alcalophilus)SD7903的抗性检测

将该菌分别接种于含50mg/L浓度的氨苄青霉素、硫酸卡那霉素、氯霉素、四环素和利福平抗生素的常用LB固体培养基中，33℃温箱中静置培养5d，观察菌体是否在培养基上生长。结果表明，该菌对氨苄青霉素、硫酸卡那霉素、氯霉素、四环素和利福平均无抗性，在实际使用过程中不会向环境传递这些耐药因子，保证了生态安全性。

实施例4嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alcalophilus)SD7903的质粒检测

用改进的碱裂解法提取SD7903的质粒。具体方法如下：

1、常用LB液体培养基33℃、160rpm条件下培养至对数生长期；

2、取1mL菌液装于离心管中，4℃条件下12000r/min离心1min收集菌体；

3、加入250μL的P1溶液，振荡悬浮沉淀；

4、加入250μL的P2溶液，轻轻混匀，颠倒几次至溶液澄清、黏稠；

5、加入250μL的P3溶液，颠倒混匀(可稍微剧烈)至出现白色絮状物，4℃条件下12000r/min离心10min；

6、将上清转移到新的离心管，加0.6倍体积的异丙醇，轻轻混匀，12000r/min离心15min；

7、去上清，加1mL无水乙醇，轻混，12000r/min离心5min；

8、去上清，无菌风吹干，加20μL TE溶液溶解沉淀；

9、琼脂糖凝胶电泳分析。

其中，所用试剂的配制如下：

Buffer P1：在800mL Milli-Q中加入6.06g Tris base，3.72g EDTA·2H₂O，用HCl调节pH至8.0，定容至1升，灭菌后4℃保存。

Buffer P2：在800mL Milli-Q中加入8.0g NaOH，10.0g SDS，定容至1升，不灭菌常温保存。

Buffer P3：500mL Milli-Q中加入294.5g乙酸钾，用冰醋酸调节pH至5.5，定容至1升，不灭菌4℃保存。

质粒检测结果表明，该菌不携带质粒，因此降解基因编码于染色体上。这一特性使得在利用质粒进行水平基因转移过程中，避免了质粒的不相容性，是构建具备多种降解能力的基因工程菌的良好材料。

实施例5本发明的嗜碱芽孢杆菌SD7903的培养方法

按表2的培养条件将嗜碱芽孢杆菌SD7903菌接种于含有NaCl的LB液体培养基内，在160rpm条件下，培养至饱和后，4℃条件下12000r/min离心1min收集菌体。

表2 各方法中SD7903的培养条件

培养方法编号	NaCl含量(wt％)	培养温度(℃)	培养基PH值
				1	1	33	7
2	5	35	7
				3	9	25	8
4	12	37	10

实施例6本发明的嗜碱芽孢杆菌SD7903生产四氢嘧啶的实验

将实施例5中按编号1的培养方法培养的菌液，按体积百分比为1％的接种量分别将其接种于100ml，pH8，NaCl含量为1％、3％、5％、7％、9％、10％的LB液体培养基，于33℃，160rpm条件下继续培养至OD₅₇₈约为1，然后采用如下方法检测不同盐浓度条件下四氢嘧啶的生成量。

检测方法：

用改进的Bligh方法(Kuhlmann AU，Bremer E，Appl Environ Microbiol，2002，68：772-783)提取菌体中四氢嘧啶。将菌体在不同盐浓度的LB培养基中培养至OD₅₇₈约为1。离心(12000rpm，5min)收集菌体冻干，测菌体干重。用400μl抽提液(甲醇∶氯仿∶水＝10∶5∶4)溶解菌体，猛烈振荡30min进行抽提。再加入等体积(约130μl)氯仿和水，继续振荡10min。离心(12000r/min，20min)分层收集水相、干燥。干燥物质用100μl水和400μl乙腈(ACN)重新悬浮，稀释后溶解在80％(体积比)ACN中进行HPLC(Waters600，USA)分析。色谱柱为氨基反向色谱柱(250×4.6mm，5μm，μBondapak，USA)；流动相乙腈∶水(v∶v)＝60∶40，流速1.0ml/min，柱温25℃；检测波长210nm；进样体积10μl。滞留时间约6min，结果见图4。

在1％NaCl浓度的LB培养基中，SD7903可产四氢嘧啶19.1mg/g·cdw，而同种菌DTY1产四氢嘧啶1.4mg/g·cdw。随盐浓度升高，四氢嘧啶含量也逐渐升高，10％NaCl浓度中四氢嘧啶产量最高，达170.6mg/g·cdw(图4)。在相同盐浓度的LB液体培养基中，本发明SD7903的四氢嘧啶生成量远远高于属于同菌种的菌株DTY1的生成量，此外，本发明菌株还受高盐环境的诱导，一定范围内盐度升高，生成量也随之增加。

参考文献

1、张薇，胡跃高，张力群，高洪文，中度嗜盐菌DTY1的鉴定及其耐盐机制的初步分析，微生物学报，2006，46(6)：956-960

2、Kuhlmann AU，Bremer E.Osmotically regulated synthesis of the compatiblesolute ectoine in Bacillus pasteurii and related Bacillus spp.Appl EnvironMicrobiol，2002，68：772-783

SEQUENCE LISTING

<110>华北电力大学

<120>一种嗜碱芽孢杆菌及其培养方法和应用

<130>33

<160>5

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>1437

<212>DNA

<213>Bacillus alcalophilus

<400>1

gagcgaacca aagggagctt gctcccagag gttagcggcg gacgggtgag taacacgtgg 60

gcaacctgcc ctgtagattg ggataacatc gagaaatcgg tgctaatacc ggataatcaa 120

ttgaatcaca tggtttgatt gtaaaagatg gctccggcta tcactacggg atgggcccgc 180

ggcgcattag ctagttggta aggtaatggc ttaccaaggc gacgatgcgt agccgacctg 240

agagggtgat cggccacact gggactgaga cacggcccag actcctacgg gaggcagcag 300

tagggaatct tccgcaatgg acgaaagtct gacggagcaa cgccgcgtga gtgatgaagg 360

ttttcggatc gtaaagctct gttgttaggg aagaacaagt gccgttcgaa taggtcggca 420

ccttgacggt acctaaccag aaagccacgg ctaactacgt gccagcagcc gcggtaatac 480

gtaggtggca agcgttgtcc ggaattattg ggcgtaaagc gcgcgcaggc ggtcttttaa 540

gtctgatgtg aaatctcggg gctcaacccc gagcggtcat tggaaactgg gagacttgag 600

tacagaagag gagagtggaa ttccacgtgt agcggtgaaa tgcgtagata tgtggaggaa 660

caccagtggc gaaggcgact ctctggtctg taactgacgc tgaggcgcga aagcgtgggg 720

agcaaacagg attagatacc ctggtagtcc acgccgtaaa cgatgagtgc taggtgttag 780

gggtttcgat gcccttagtg ccgaagttaa cacattaagc actccgcctg gggagtacga 840

ccgcaaggct gaaactcaaa ggaattgacg ggggcccgca caagcagtgg agcatgtggt 900

ttaattcgaa gcaacgcgaa gaaccttacc aggtcttgac atcctttgac cactctagag 960

atagagcttt ccccttcggg ggacaaagtg acaggtggtg catggttgtc gtcagctcgt 1020

gtcgtgagat gttgggttaa gtcccgcaac gagcgcaacc cttgatctta gttgccagca 1080

tttagttggg cactctaagg tgactgccgg tgacaaaccg gaggaaggtg gggatgacgt 1140

caaatcatca tgccccttat gacctgggct acacacgtgc tacaatggat ggtacaaagg 1200

gcagcaaaac cgcgaggtcg agccaatccc ataaagccat tctcagttcg gattgtaggc 1260

tgcaactcgc ctacatgaag ccggaattgc tagtaatcgc ggatcagcat gccgcggtga 1320

atacgttccc gggccttgta cacaccgccc gtcacaccac gagagtttgt aacacccgaa 1380

gtcggtgggg taaccttttg gagccagccg cctaaggtgg gacagatgat tggggtg 1437

<210>2

<211>22

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>扩增四氢嘧啶基因的上游引物

<400>2

tcgatttctt cgcaggtgca gg 22

<210>3

<211>22

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>扩增四氢嘧啶基因的下游引物

<400>3

ggaatgtgcc attatgttcg cc 22

<210>4

<211>21

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>扩增SD7903基因组DNA上游引物

<400>4

gagagtttga tcctggctca g 21

<210>5

<211>20

<212>DNA

<213>Artiticial Sequence

<220>

<223>扩增SD7903基因组DNA下游引物

<400>5

ctacggctac cttgttacga 20

Claims

1.一种嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alcalophilus)SD7903，其保藏编号为CGMCCNo.3158。

2.权利要求1所述嗜碱芽孢杆菌的培养方法，其特征在于，将所述嗜碱芽孢杆菌接种于NaCl浓度为0-12wt％、pH值为7-10的LB液体培养基内，在培养温度为25-37℃的条件下，振荡培养至饱和后，离心收集菌体。

3.根据权利要求2所述的培养方法，其特征在于，所述LB液体培养基中NaCl浓度为5-9wt％。

4.根据权利要求2所述的培养方法，其特征在于，所述培养温度为32-35℃。

5.权利要求1所述嗜碱芽孢杆菌的应用，其特征在于，所述嗜碱芽孢杆菌用于生产四氢嘧啶。