CN101643716B - 一株硝基还原假单胞菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了属于环境微生物领域的一株硝基还原假单胞菌及其应用。本发明的一株硝基还原假单胞菌(Pseudomonas nitroreducens)CQ1来源于北京燕山石化公司污水处理系统中的氧化塘污水中，经过富集、分离和纯化而得到，该菌已于2009年7月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其简称为CGMCC，保藏号为CGMCC No.3159。本发明还公开了该菌在生物降解喹啉或其衍生物中的应用。本发明的菌株可降解喹啉或其衍生物的浓度达到700mg/L，处理72h后，降解率达到100％。此外，本发明菌株CQ1对硫酸卡那霉素、四环素和庆大霉素敏感，且不携带质粒。
Description
技术领域
本发明属于环境微生物领域，具体涉及一株硝基还原假单胞菌及其在生物降解喹啉或其衍生物中的应用。
背景技术
喹啉(又称氮杂萘)是含氮杂环化合物的典型代表，又是大量复杂含氮杂环化合物的基本结构单元。喹啉及其衍生物广泛存在于天然产物如煤焦油、矿物油、杂酚油、化石燃料和植物碱中，同时还是焦化废水、橡胶废水、制药废水等多种工业废水中重要的难降解有机污染成分。由于这类化合物水溶性较强，已成为土壤和地下水中常见的污染物，在固体垃圾掩埋场、炼钢厂和化石燃料加工厂附近污染尤其严重。大量研究证明，喹啉及其衍生物对动物和人体具有毒性、致癌和致突变等危害性，已给生态环境和人类健康造成了潜在威胁。如何降低和控制环境中含氮杂环化合物的含量正成为社会关注和科学研究的热点。由于自然界中喹啉类含氮杂环化合物光解速度缓慢，很多研究者将目光投向生物降解，并进行了大量研究，利用微生物降解是有效消除喹啉污染的新途径。
自然界中存在许多特殊的具有降解有机污染物的微生物资源，研究这些微生物的降解功能对效降低环境中有毒有害物质具有重要的科学意义和应用价值。1976年Grant等发现莫拉氏菌(Moraxella sp.)可以降解喹啉(Grant DJW等，Microbios，1976，15(61-62)：177-89)，随后研究人员相继发现了许多其他可以降解喹啉的微生物，如皮氏伯克霍尔德氏菌(Burkholderia pickettii)、食酸丛毛单胞菌(Comamonas acidovorans)、睾丸酮丛毛单胞菌(Comamonas testosteroni)、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)、绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)、脱硫菌(Rhodococcus sp.)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、恶臭假单胞菌Pseudomonas putida)、红球菌(Rhodococcus sp.)、芽孢杆菌(Bacillus sp.)等细菌和白腐菌等真菌。这些微生物多数是通过富集培养，然后以喹啉为唯一碳氮源分离而得。
目前国内外有许多应用微生物活体降解喹啉的报道，但可以降解喹啉的最大浓度普遍偏低。如崔明超报道了一株睾丸酮丛毛单胞菌(Comamonastestosteroni)，可以完全降解250mg/L喹啉浓度的废水(崔明超等，环境科学学报，2004，24(1)：171-173)。朱顺妮分离到的一株红球菌(Rhodococcus sp.)QL2的最佳喹啉降解浓度为150mg/L(朱顺妮等，环境科学，2008，29(2)：488-493)。少数革兰氏阳性菌对喹啉降解能力较强，如发酵乳酸杆菌(Lactobacillus sp.)Q5可以在72h内降解掉72.6％的初始浓度500mg/L的喹啉，一株芽孢杆菌(Bacillus sp.)Q5对800mg/L喹啉降解率达到60％，极限浓度为1000mg/L(房苗苗等，石油学报，2007，23(5)：111-116)，但降解率不足20％。目前报道的假单胞菌降解喹啉能力一般较低，洪新分离到的一株假单胞菌(Pseudomonas sp.)最大喹啉降解浓度仅为140mg/L(洪新等，辽宁石油化工大学学报，2005，25(2)：32-35)，超过该浓度菌体生长受到抑制。柏耀辉报道过一株可以同时去除吡啶和喹啉的假单胞菌(Pseudomonas sp.)BC001(柏耀辉等，北京大学学报(自然科学版)，2007，2(3)：1-7)，但该菌对吡啶的去除属于生物吸附，即不能利用吡啶为碳氮源生长而进行代谢转化，对喹啉去除包括生物吸附和生物降解，可以降解初始浓度500mg/L喹啉的废水。在实际污染现场，喹啉浓度或者较高，或者与其他污染源同时存在，加大了生物技术处理的难度。因此筛选能降解高浓度喹啉的微生物菌种，对丰富微生物资源，改善生态环境具有深远的现实意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一株硝基还原假单胞菌及其应用。
本发明所提供的硝基还原假单胞菌为硝基还原假单胞菌(Pseudomonasnitroreducens)CQ 1 CGMCC No.3159。
所述硝基还原假单胞菌(Pseudomonas nitroreducens)CQ1，已于2009年7月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其简称为CGMCC，保藏号为CGMCC No.3159。
本发明的硝基还原假单胞菌(Pseudomonas nitroreducens)CQ1来源于北京燕山石化公司污水处理系统中的氧化塘污水，经过富集、分离和纯化得到，是废水处理系统中的优势菌株，能处理含喹啉或其衍生物浓度较高的废水，有较好的应用前景。
本发明所述硝基还原假单胞菌(Pseudomonas nitroreducens)CQ1的特征：
1)、形态学特征
该菌在无机盐固体培养基中菌落呈白色晕状，边缘参差不齐，在无机盐液体培养基中为黄色悬浊液。革兰氏染色为阴性杆菌，极生鞭毛，多数菌株鞭毛在两根以上可运动，菌体杆状，大小为0.6～1μm×1.5～2μm(见图1)。
所述无机盐液体培养基的配制为：Na2HPO4 6.0g、KH2PO4 3.0g、NaCl 0.5g，去离子水定容至1L后灭菌；配制1M MgSO4·7H2O和1M CaCl2两种溶液，灭菌；在无菌条件下，取1M MgSO4·7H2O和1M CaCl2两种溶液加入上述灭菌的盐溶液中，使其终浓度为0.001mol/L。
所述无机盐固体培养基的配制为：Na2HPO4 6.0g、KH2PO4 3.0g、NaCl 0.5g，琼脂粉12g，去离子水定容至1L后灭菌；配制1M MgSO4·7H2O和1M CaCl2两种溶液，灭菌；在无菌条件下，取1M MgSO4·7H2O和1M CaCl2两种溶液加入上述灭菌的盐溶液中，使其终浓度为0.001mol/L，然后倒平板。
2)、CQ1菌株的16S rDNA鉴定
PCR扩增硝基还原假单胞菌(Pseudomonas nitroreducens)CQ1菌株16SrDNA约1.5kb，测序结果具有序列表中SEQ ID No.1的核苷酸序列，将CQ1菌的16S rDNA片段在GenBank中进行同源性比对，该菌与Pseudomonasnitroreducens(EF107515)同源性最高，达到99％。使用MEGA 4软件，利用邻位互换算法(CNI)搜索最小进化树(ME树)，由K2P模型产生ME树(见图2)。
3)、生理生化特征
CQ1菌为专性好氧菌，呼吸型代谢；有可扩散的荧光，氧化酶阳性，不水解明胶和淀粉，不产硫化氢，精氨酸双水解反应阳性，可以将硝酸盐还原成亚硝酸盐，尿酶反应、赖氨酸脱羧酶反应阳性；能够利用葡萄糖、蔗糖、阿拉伯糖、己二酸、柠檬酸、羟基-L-脯氨酸等碳源，不能利用丙二酸、甲酸苄酯、L-丝氨酸、犬尿胺酸、马尿酸、乙酰胺和氨基苯，与模式菌P.nitroreducens DSM14399相比，本发明的菌株还能利用甘露醇、山梨醇、肌醇、鼠李糖；4℃以下和41℃以上不生长，最适生长温度30℃，最适pH为7.5。
表1 CQ1生理生化试验结果
4)抗生素抗性特征
本发明菌株CQ1对硫酸卡那霉素、四环素和庆大霉素敏感。
5)质粒特征
该菌不携带质粒，可以用作构建具有多种降解能力的基因工程菌。
参照《Bergey’s Manual of Deteriminative Bacteriology》第9版和《常见细菌系统鉴定手册》假单胞菌属特征，结合其形态特征和16S rDNA基因序列相似性，将CQ1菌鉴定为硝基还原假单胞菌Pseudomonas nitroreducens。
本发明所述硝基还原假单胞菌在好氧条件下可以利用喹啉或其衍生物作为唯一碳氮源。该菌可在LB培养基中生长，也可在含有喹啉浓度为100-700mg/L的无机盐培养基中培养，生长温度为28-32℃，pH 7-9，最适生长温度为30℃，最适pH为7.5。
上述硝基还原假单胞菌CQ1的应用是指该菌在生物降解喹啉或其衍生物中的应用。
所述生物降解喹啉或其衍生物为降解污水中的喹啉或其衍生物，具体方法为将硝基还原假单胞菌(Pseudomonas nitroreducens)CQ1 CGMCC No.3159接种于含有喹啉或其衍生物的污水中，在28-32℃条件下培养36-72h。
所述污水中喹啉或其衍生物浓度不超过700mg/L。
所述硝基还原假单胞菌(Pseudomonas nitroreducens)CQ1 CGMCC No.3159接种量为1×107-1×108cfu/mL。
本发明的有益效果：本发明菌株硝基还原假单胞菌(Pseudomonasnitroreducens)CQ1 CGMCC No.3159可降解喹啉或其衍生物的浓度达到700mg/L，处理72h后，降解率达到100％，能较好满足工业生产中喹啉处理浓度高，时间短等要求。此外，本发明菌株CQ1对硫酸卡那霉素、四环素和庆大霉素敏感，在实际使用中不会向土著菌传递这些耐药因子，保证使用的安全性。该菌不携带质粒，可以用作构建具有多种降解能力的基因工程菌。在好氧条件下可以利用喹啉为唯一碳氮源。本发明丰富了微生物资源，为生物降解高浓度喹啉或其衍生物提供了优良菌种，对改善生态环境具有深远的现实意义。
附图说明
图1为CQ1菌电镜扫描照片；
图2为CQ1菌株及其近缘属种的聚类分析树状图；
图3为CQ1菌株在多种初始喹啉浓度下的降解曲线；
图4为CQ1菌株在700mg/L喹啉浓度的无机盐培养液中生长和降解情况。
具体实施方式
本发明实施例中培养基配制均采用常规方法配制。实施例中涉及的分子生物学操作如未注明具体试验条件和方法，均参照SambrookJ等主编，科学出版社，2002，分子克隆实验指南(第三版)。
以下实施例中使用的培养基的配制：
1L富集培养基的配制：胰蛋白胨5.0g，葡萄糖1.5g，酵母粉2.5g，NaCl5.0g，去离子水定容至1L，HCl或NaOH调节pH至7.2。
所述无机盐液体培养基的配制为：Na2HPO4 6.0g、KH2PO4 3.0g、NaCl 0.5g，去离子水定容至1L后灭菌；配制1M MgSO4·7H2O和1M CaCl2两种溶液，灭菌；在无菌条件下，取1M MgSO4·7H2O和1M CaCl2两种溶液加入上述灭菌的盐溶液中，使其终浓度为0.001mol/L。
所述无机盐固体培养基的配制为：Na2HPO4 6.0g、KH2PO4 3.0g、NaCl 0.5g，琼脂粉12g，去离子水定容至1L后灭菌；配制1M MgSO4·7H2O和1M CaCl2两种溶液，灭菌；在无菌条件下，取1M MgSO4·7H2O和1M CaCl2两种溶液加入上述灭菌的盐溶液中，使其终浓度为0.001mol/L，然后倒平板。
1L常用LB液体培养基的配制：在950ml去离子水中加入胰化蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCl 10g，摇动容器直至溶质溶解。用NaOH或HCl调pH至7.2，用去离子水定容至1L，高压灭菌20min。
1L常用固体LB培养基的配制：在上述常用液体LB培养基中再加入12g琼脂，其他同常用液体LB培养基的配制，高压灭菌后倒平板。
实施例1：硝基还原假单胞菌(Pseudomonas nitroreducens)CQ1的分离及纯化
将取自北京燕山石化公司废水处理系统中的氧化塘废水10mL，接种到含200mg/L喹啉的100mL富集培养基摇瓶中，于30℃、160rpm摇床震荡培养5d。以此摇瓶中的培养菌液作为菌种，转接至含同样浓度喹啉的新鲜富集培养液中，接种量为5mL，再次驯化培养5d，共转接3次。将最后一次培养的菌液5mL接种到100mL含喹啉500mg/L的无机盐液体培养基中，在同样条件下培养，每5d转接1次，转接3次。将最后一次培养菌液用富集培养液梯度稀释成10×和100×菌液，分别涂布在以喹啉为唯一碳、氮源的500mg/L喹啉的无机盐固体培养基上，30℃在培养箱中培养5d。挑取长势较好的单菌落，接入LB固体培养基上。在30℃下培养72h，将LB固体培养基上的单菌落接种于含500mg/L喹啉的无机盐固体培养基上，反复划线纯化，以不添加喹啉的作对照。挑取能够在无机盐固体培养基上健康生长的细菌菌落，其中有一菌落表现较好，定名为CQ1菌株。
实施例2：硝基还原假单胞菌(Pseudomonas nitroreducens)CQ1的16S rDNA鉴定
以CTAB法提取CQ1菌的基因组DNA为模板，采用扩增细菌16S rDNA全长的保守引物27F和1495R(Lane DJ，Wiley，Chichester，1991，115-175)，扩增CQ1菌株16S rDNA约1.5kb。
27F：5’-GAG AGT TTG ATC CTG GCT CAG-3’(SEQ ID No.2)
1495R：5’-CTA CGG CTA CCT TGT TAC GA-3’(SEQ ID No.3)
PCR反应组分为：
10×PCR buffer 5μl
dNTP(2.5mM) 5μl
引物27F(10μM) 2μl
引物1495R(10μM) 2μl
gDNA(0.1μg) 1μl
Pfu Taq(5U/μL) 0.5μl
ddH2O 34.5μl
总体积 50μl
PCR扩增反应条件为：94℃变性5min；94℃变性40s，53℃复性40s，72℃延伸1min，循环数为35；72℃充分延伸10min。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳回收纯化后连接到T载体上克隆，经蓝白筛选后提取质粒测序，测序公司为上海生工，测序结果表明具有序列表中SEQ ID No.1的核苷酸序列。
将CQ1菌的16S r DNA片段在GenBank中进行同源性比对，发现该菌与Pseudomonas nitroreducens(Genbank登录号EF 107515)同源性最高，达到99％。用DNAMAN(Version 6)对序列进行比对及对齐操作。使用MEGA 4软件通过Kimura 2-Parameter(K2P)模型计算距离矩阵。使用MEGA 4软件，利用邻位互换算法(CNI)搜索最小进化树(ME树)，由K2P模型产生ME树(见图2)，并进行1000次重复的自展检验。
参照《Bergey’s Manual of Deteriminative Bacteriology》第9版和《常见细菌系统鉴定手册》假单胞菌属特征，结合其形态特征和16S rDNA基因序列相似性，将CQ1菌鉴定为硝基还原假单胞菌Pseudomonas nitroreducens。
实施例3：硝基还原假单胞菌CQ1对喹啉的降解效果检测
取纯化后的菌株，接种于LB培养液中，培养至OD600＝0.6，按1∶500(V∶V)接种量接种于100ml、pH7.5的无机盐液体培养基，其中喹啉含量分别为200mg/L、300mg/L、400mg/L、500mg/L、600mg/L、700mg/L和800mg/L。在30℃、170rpm摇床培养，每隔6h取出3ml测定OD600值。然后将菌液12000rpm离心10min，取上清进行高压液相色谱分析(HPLC)。每处理重复3个。
检测方法：
1)、喹啉浓度测定：色谱柱采用安捷伦ZORBAX SB-C18色谱柱(250×4.6mm，5μm)；VWD UV-Vis Detector；流动相为V甲醇∶V水＝4∶1，流速为1mL/min；检测波长为275nm，进样体积为10μL，滞留时间7.5min。
2)、CQ1生长曲线测定：上海尤尼柯2102型紫外可见分光光度计测定波长为600nm的光密度值。
CQ1菌株对不同初始喹啉浓度的降解情况，见图3；CQ1菌株在700mg/L喹啉浓度的无机盐培养液中生长和降解情况见图4。
实验结果表明，降解初期，CQ1生长缓慢，主要由于其从营养丰富的LB培养基转入以喹啉为唯一碳氮源的无机盐培养基，需要一定的适应时间，此为微生物生长的停滞时间，根据喹啉的初始浓度不同，低浓度喹啉(200-500mg/L)中的菌生长停滞期大约需要6-24h，高浓度喹啉(500-700mg/L)时间较长，约60h。之后经过6-12h进入对数生长期，该期的喹啉降解量随生长速率增加而显著提高，残留喹啉量有时甚至呈直线下降。200-500mg/L的初始喹啉浓度42h内可以完全降解完，高浓度的喹啉也可以在72h内降解完全，表现出较好的降解能力。对800mg/L喹啉降解能力较弱，84h内降解率仅为16.6％。
实施例4：硝基还原假单胞菌(Pseudomonas nitroreducens)CQ1的抗性检测
将纯化后的该菌分别接种于含50mg/L浓度的氨苄青霉素、硫酸卡那霉素、氯霉素、四环素、利福平和庆大霉素抗生素的LB固体培养基中，30℃温箱中静置培养5d，观察菌体是否在培养基上生长。结果表明，该菌对对硫酸卡那霉素、庆大霉素和四环素均无抗性，在实际使用过程中不会向环境传递这些耐药因子，保证了生态安全性。
实施例5：硝基还原假单胞菌(Pseudomonas nitroreducens)CQ1的质粒检测用改进的碱裂解法提取CQ1的质粒，具体方法如下：
1、将纯化后的CQ1接种于LB液体培养基中，在30℃、170rpm条件下培养至对数生长期；
2、取1mL菌液装于离心管中，4℃条件下12000r/min离心1min收集菌体；
3、加入250μL的P1溶液，振荡悬浮沉淀；
4、加入250μL的P2溶液，轻轻混匀，颠倒几次至溶液澄清、黏稠；
5、加入250μL的P3溶液，颠倒混匀(可稍微剧烈)至出现白色絮状物，4℃条件下12000r/min离心10min；
6、将上清转移到新的离心管，加0.6倍体积的异丙醇，轻轻混匀，12000r/min离心15min；
7、去上清，加1mL无水乙醇，轻混，12000r/min离心5min；
8、去上清，无菌风吹干，加20μL TE溶液溶解沉淀；
9、琼脂糖凝胶电泳分析。
所用试剂
Buffer P1：在800mL Milli-Q中加入6.06g Tris base，3.72g EDTA·2H2O，用HCl调节pH至8.0，定容至1升，灭菌后4℃保存。
Buffer P2：在800mL Milli-Q中加入8.0g NaOH，10.0g SDS，定容至1升，不灭菌常温保存。
Buffer P3：：500mL Milli-Q中加入294.5g乙酸钾，用冰醋酸调节pH至5.5，定容至1升，不灭菌4℃保存。
质粒检测结果表明，该菌不携带质粒，有利于外源质粒进行水平基因转移，避免了质粒的不相容性，是构建具备多种降解能力的基因工程菌的良好材料。
参考文献
1.Grant DJW，Al Najjar TR，Degradation of quinoline by a soil bacterium，Microbios，1976，15(61-62)：177-89.
2.Lane DJ，16S/23S rRNA sequencing.In：Stackebrandt E，Goodfellow M(eds)Nucleic acidtechniques in bacterial systematics.Wiley，Chichester，1991，115-175.
3.崔明超，李丽，陈繁忠等，睾丸酮丛毛单胞菌对喹啉的微生物降解途径的研究，环境科学学报，2004，24(1)：171-173.
4.朱顺妮，刘冬启，樊丽等，喹啉降解菌Rhodococcus sp.QL2的分离鉴定及降解特性，环境科学，2008，29(2)：488-493.
5.柏耀辉，孙庆华，温东辉等，假单胞杆菌BC001对吡啶和喹啉的生物去除，北京大学学报(自然科学版)，2007，2(3)：1-7.
6.洪新，杨翔华，喹啉降解菌的分离鉴定及在柴油脱氮中的应用，辽宁石油化工大学学报，2005，25(2)：32-35.
7.房苗苗，张秀霞，王欣等，石油污染土壤中喹啉降解菌Q5的筛选及其喹啉降解性能，石油学报，2007，23(5)：111-116.
SEQUENCE LISTING
<110>华北电力大学
<120>一株硝基还原假单胞菌及其应用
<130>34
<160>3
<170>PatentIn version 3.5
<210>1
<211>1397
<212>DNA
<213>Pseudomonas nitroreducens
<400>1
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<220>
<223>扩增CQ1 16S rDNA的上游引物
<400>2
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<220>
<223>扩增CQ1 16S rDNA的下游引物
<400>3
ctacggctac cttgttacga 20
Claims (4)
1.一种硝基还原假单胞菌(Pseudomonas nitroreducens)，其为硝基还原假单胞菌CQ1，保藏号为CGMCC No.3159。
2.权利要求1所述硝基还原假单胞菌的应用，其特征在于，所述硝基还原假单胞菌在生物降解喹啉或其衍生物中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述生物降解喹啉或其衍生物为降解污水中的喹啉或其衍生物，具体方法为将硝基还原假单胞菌CGMCCNo.3159接种于含有喹啉或其衍生物的污水中，在28-32℃条件下培养36-72h，其中，所述硝基还原假单胞菌CGMCC No.3159的接种量为1×107-1×108cfu/mL。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述污水中喹啉或其衍生物浓度不超过700mg/L。
Priority Applications (1)
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| 宋蕾等.降解1,2,4-三氯苯的硝基还原假单胞菌J5-1 的分离鉴定和邻苯二酚1,2-双加氧酶基因的克隆.《环境科学》.2007,第28卷(第8期),1878-1881. * |
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