CN107400639B - 一种拮抗水稻黄单胞菌的溶杆菌及其分离方法与应用 - Google Patents
一种拮抗水稻黄单胞菌的溶杆菌及其分离方法与应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN107400639B CN107400639B CN201710483767.8A CN201710483767A CN107400639B CN 107400639 B CN107400639 B CN 107400639B CN 201710483767 A CN201710483767 A CN 201710483767A CN 107400639 B CN107400639 B CN 107400639B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- lysobacter
- xanthomonas oryzae
- rice
- antagonizing
- bacterial
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 241000863031 Lysobacter Species 0.000 title claims abstract description 23
- 241000589652 Xanthomonas oryzae Species 0.000 title claims abstract description 22
- 230000003042 antagnostic effect Effects 0.000 title claims abstract description 18
- 238000000926 separation method Methods 0.000 title abstract description 6
- 241000209094 Oryza Species 0.000 claims abstract description 17
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 claims abstract description 16
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 claims abstract description 16
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims abstract description 11
- 238000004321 preservation Methods 0.000 claims abstract description 6
- 238000009629 microbiological culture Methods 0.000 claims abstract description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 26
- 241001248650 Lysobacter sp. Species 0.000 claims description 18
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 10
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 9
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 9
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 5
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 claims description 4
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 claims description 4
- 241000589634 Xanthomonas Species 0.000 claims description 2
- 230000008485 antagonism Effects 0.000 claims description 2
- 238000000861 blow drying Methods 0.000 claims 1
- 239000000575 pesticide Substances 0.000 abstract description 5
- 241000700605 Viruses Species 0.000 abstract 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 18
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 7
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 7
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 7
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 7
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 6
- 108020004465 16S ribosomal RNA Proteins 0.000 description 4
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 4
- 241000907138 Xanthomonas oryzae pv. oryzae Species 0.000 description 4
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 4
- 230000000443 biocontrol Effects 0.000 description 4
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 4
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 4
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 4
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 3
- 241000053198 Lysobacter brunescens Species 0.000 description 3
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- FFRBMBIXVSCUFS-UHFFFAOYSA-N 2,4-dinitro-1-naphthol Chemical compound C1=CC=C2C(O)=C([N+]([O-])=O)C=C([N+]([O-])=O)C2=C1 FFRBMBIXVSCUFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 2
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 2
- 102000012286 Chitinases Human genes 0.000 description 2
- 108010022172 Chitinases Proteins 0.000 description 2
- 241001660189 Lysobacter antibioticus Species 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 2
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 2
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- 230000006799 invasive growth in response to glucose limitation Effects 0.000 description 2
- 238000005304 joining Methods 0.000 description 2
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 2
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 2
- 238000011392 neighbor-joining method Methods 0.000 description 2
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 2
- 230000007480 spreading Effects 0.000 description 2
- 238000003892 spreading Methods 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 239000001974 tryptic soy broth Substances 0.000 description 2
- 108010050327 trypticase-soy broth Proteins 0.000 description 2
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 2
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 2
- FXVNBZGTAWLLNE-UHFFFAOYSA-N 1,3-thiazole;zinc Chemical compound [Zn].C1=CSC=N1 FXVNBZGTAWLLNE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RSNWORHVUOZYLT-UHFFFAOYSA-N 5-[[(2-sulfanylidene-3h-1,3,4-thiadiazol-5-yl)amino]methylamino]-3h-1,3,4-thiadiazole-2-thione Chemical compound S1C(=S)NN=C1NCNC1=NNC(=S)S1 RSNWORHVUOZYLT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004382 Amylase Substances 0.000 description 1
- 102000013142 Amylases Human genes 0.000 description 1
- 108010065511 Amylases Proteins 0.000 description 1
- 229920002498 Beta-glucan Polymers 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000016938 Catalase Human genes 0.000 description 1
- 108010053835 Catalase Proteins 0.000 description 1
- 108010059892 Cellulase Proteins 0.000 description 1
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 208000035240 Disease Resistance Diseases 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 241000863030 Lysobacter enzymogenes Species 0.000 description 1
- 241000053197 Lysobacter gummosus Species 0.000 description 1
- 241000244206 Nematoda Species 0.000 description 1
- 241000233654 Oomycetes Species 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 235000019418 amylase Nutrition 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 244000000005 bacterial plant pathogen Species 0.000 description 1
- 230000003385 bacteriostatic effect Effects 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 235000015278 beef Nutrition 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 230000000853 biopesticidal effect Effects 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 1
- 229940106157 cellulase Drugs 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000000635 electron micrograph Methods 0.000 description 1
- 238000001493 electron microscopy Methods 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 210000003495 flagella Anatomy 0.000 description 1
- 238000011010 flushing procedure Methods 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 244000000004 fungal plant pathogen Species 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 1
- 238000000034 method Methods 0.000 description 1
- CEQFOVLGLXCDCX-WUKNDPDISA-N methyl red Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC=C1\N=N\C1=CC=CC=C1C(O)=O CEQFOVLGLXCDCX-WUKNDPDISA-N 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000013081 phylogenetic analysis Methods 0.000 description 1
- 238000012257 pre-denaturation Methods 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 239000012264 purified product Substances 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 229930000044 secondary metabolite Natural products 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 244000000000 soil microbiome Species 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
- C12N1/205—Bacterial isolates
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/02—Separating microorganisms from their culture media
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Virology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Dentistry (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Pest Control & Pesticides (AREA)
- Agronomy & Crop Science (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明涉及一种拮抗水稻黄单胞菌的溶杆菌及其分离方法与应用，该溶杆菌分类命名为溶杆菌（Lysobacter sp.）OH23，已保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏编号：CGMCC No.13677，保藏日期：2017年2月23日，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。本发明溶杆菌（Lysobacter sp.）OH23为革兰氏阴性细菌，且对水稻条斑病菌和水稻白叶病菌具有明显的拮抗作用，具有被开发为生物农药的潜能。
Description
技术领域
本发明属于水稻病害防治技术领域，涉及一种拮抗水稻黄单胞菌的溶杆菌及其分离方法与应用。
背景技术
水稻黄单胞菌(X.oryzae)，包括水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzaepv.oryzae)和水稻条斑病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzicola)两个致病变种，分别引起水稻白叶枯病(bacterial blight，BB)和细菌性条斑病(bacterial leaf streak，BLS)。目前，生产上对这两个病害的防治主要依靠抗病品种和化学农药。化学农药主要包括农用链霉素、叶枯灵、叶枯唑、噻唑锌等。化学农药防治具有防效好、见效快、成本低等优点，但长期过量并不当地施用引起的“3R”(残留、再猖獗、抗性)问题已经成为食品质量安全和生态安全关注的焦点。因此，寻找新的生防微生物或其代谢产物并开发为生态安全、环境友好的生物农药将是今后病害绿色防治的发展方向。
溶杆菌属(Lysobacter)细菌属于黄单胞科。截止2016年底，国际上已鉴定的溶杆菌属细菌有43个种，其中产酶溶杆菌(L.enzymogenes)、抗生素溶杆菌 (L.antibioticus)、变棕溶杆菌(L.brunescens)和胶状溶杆菌(L.gummosus) 这四个种具有高效抗菌活性和植物病害生防潜力，是一类新型植物病害生防细菌。这类细菌对植物病原真菌、卵菌、革兰氏阴性细菌(G－)、阳性细菌(G+)和线虫都有显著的拮抗作用，其作用机理为：(1)产生小分子抗菌次生代谢物质；(2) 分泌产生大量胞外酶，包括几丁质酶、β-1,3-葡聚糖、蛋白酶和纤维素酶；(3) 诱导植物产生抗病性；(4)较好的定殖能力。因此，分离鉴定对水稻黄单胞菌具有拮抗活性的溶杆菌菌株，从中获得抗菌活性物质，可为新型农用抗生素的开发和水稻黄单胞菌病害的防治提供新途径。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种拮抗水稻黄单胞菌的溶杆菌及其分离方法与应用，该溶杆菌为革兰氏阴性细菌，且对水稻条斑病菌和水稻白叶病菌具有明显的拮抗作用，具有被开发为生物农药的潜能。
为解决现有技术问题，本发明采取的技术方案为：
一种拮抗水稻黄单胞菌的溶杆菌，分类命名为溶杆菌(Lysobacter sp.)OH23，已保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏编号： CGMCCNo.13677，保藏日期：2017年2月23日，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
本发明所述的菌株Lysobacter sp.OH23分离于江苏水稻根际土壤，其形态学及生理生化学特征如下：
形态学特征：在NA培养基、TSA培养基、LB培养基生长良好，菌落黄色； 10％TSA培养基生长较差，菌落白色；利用TSA培养基、LB培养基、10％TSA 培养基培养时菌落边缘平整，NA培养基上菌落边缘呈锯齿状；革兰氏阴性细菌，无鞭毛，可游动，单菌落扁平状，具有扩散性。
生理生化特征：简单碳源生长试验、几丁质酶活性、过氧化氢酶活性呈阳性；甲基红活性、V-P试验呈阴性；不能水解淀粉酶，能利用柠檬酸盐，能液化明胶。
16S rDNA特征：16S rDNA序列与Lysobacter sp.两个分离物(Genbank:KX022851.1、KM083544.1)及L.brunescens三个分离物(Genbank:NR_041004.1、KF911330.1、KU984674.1)的16S rDNA部分序列同源性高达100％，并结合其生理生化特征，将菌株OH23鉴定为溶杆菌(Lysobacter sp.)。
上述拮抗水稻黄单胞菌的溶杆菌Lysobacter sp.OH23在抑制水稻黄单胞菌中的应用。
上述应用，操作步骤如下：挑取Lysobacter sp.OH23单菌落培养获得 OD600＝1.0的菌液，取50μl水稻黄单胞菌菌液(OD＝1.0)，稀释100倍后铺于 NA平板上，吹干，再取3μlLysobacter sp.OH23菌液滴于含有病原菌菌液的平板上，28℃培养观察。
有益效果
Lysobacter sp.OH23对水稻白叶枯病菌不同菌株的生长具有显著抑制作用，对水稻条斑病菌RS105菌株拮抗效果明显，对其他菌株也表现出一定的抑制能力。Lysobactersp.OH23对环境友好，是新型的生防细菌，具有开发为绿色农药的潜力，为防治水稻黄单胞菌引起的病害提供了新的途径。
附图说明
图1为本发明Lysobacter sp.OH23在不同培养基上培养的菌落形态；
图2为Lysobacter sp.OH23的电镜照片；
图3为Lysobacter sp.OH23对不同水稻白叶枯病菌拮抗效果对比图；
图4为Lysobacter sp.OH23对不同水稻条斑病菌拮抗效果；
图5为为Lysobacter sp.OH23的系统发育树；
图6为用MEGA软件中的邻接法(Neighbor-Joining)构建系统发育树。
具体实施方式
1材料和方法
1.1试验菌株、培养基
试验菌株：水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae)不同菌株、水稻条斑病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzicola)不同菌株。
培养基：
NA培养基：牛肉浸膏3g，Tryptone 5g，Yeast Extract 1g，蔗糖10g，蒸馏水1 L，pH7.0-7.2，固体培养基分装后另加琼脂17g/L。
LB培养基：Tryptone 10g，NaCl 10g，Yeast Extract 5g/L，蒸馏水1L，固体培养基分装后另加琼脂17g/L。
TSA培养基：Tryptic Soy Broth 30g，蒸馏水1L，固体培养基分装后另加琼脂17g/L。
10％TSA培养基：Tryptic Soy Broth 3g，蒸馏水1L，固体培养基分装后另加琼脂17g/L。
1.2土壤细菌的分离
取江苏水稻根际土样10份，经2mm土壤筛过筛，称取10g于装有90mL 无菌水的三角瓶中(内有玻璃珠若干)，摇床振荡30min后10倍梯度稀释5次。吸取稀释液100μl于NA培养基上涂布，28℃培养2天。稀释度以每个平板上菌落数100-300个为宜，挑取不同类型的菌落于相应培养基进一步纯化得 Lysobacter sp.OH23菌株，纯化3次后-70℃保存。
1.3拮抗细菌对植物病原细菌的抑菌活性检测
挑取Lysobacter sp.OH23单菌落在NA液体培养基中培养24-48h，1％接种量接种于新的NA液体培养基，获得OD600＝1.0的细菌菌液。取50μl病原菌菌液(OD600＝1.0)，稀释100倍后铺于NA平板上，吹干备用。取3μl拮抗细菌菌液(OD600＝1.0)滴于含有病原菌的平板上，28℃培养2d。Lysobacter sp.OH23 对水稻白叶枯病菌的不同菌株抑制作用显著(图3)，对水稻条斑病菌RS105菌株抑制效果明显，而对其他菌株拮抗作用较弱(图4)。
1.4拮抗菌株的鉴定
1.4.1菌落形态观察与电镜观察
菌落形态：取OD600＝1.0的Lysobacter sp.OH23菌液5μl分别于10％TSA、TSA、 NA、LB培养基中央，28℃培养2-4d，观察形态。在NA培养基上，菌落由嫩黄色变为金黄色，表面平坦，边缘锯齿状；在TSA、LB上，菌落金黄色，边缘整齐；在10％TSA上，生长不良，菌落白色(图1)。
电镜观察：
(1)将Lysobacter sp.OH23菌液划线于NA培养基，在菌落生长新鲜处，使用少量灭菌水冲洗菌落，并轻轻晃动培养皿，使灭菌水在新鲜菌落周围反复冲洗，配制成菌悬液。
(2)在石蜡板上滴加1～2滴新鲜的PTA负染液。
(3)取新的铜网片吸附菌悬液，置于干净的滤纸上晾干。
(4)待铜网片上的菌悬液七八成干时，将铜网片吸附菌悬液的一面接触负染液，漂浮染色15s。
(5)从负染液中取出铜网片，用滤纸吸干多余的负染液，日光灯下烤45s，使其干燥。
(6)将制作好的样品，放置于透射电镜日立H-650中，在80千伏下观察细胞
形态。OH23呈现杆状，无鞭毛(如图2)。
1.4.2 16S rDNA鉴定
利用TIANGEN细菌基因组提取试剂盒提取Lysobacter sp.OH23菌株的基因组DNA，作为16S rDNA扩增模板，通用引物FD2 (5'-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3')和 RP1(5'-ACGGTTACCTTGTTACGACTT-3')。PCR反应体系(25μL)：10×buffer 2.5 μL；dNTP(1.25mM)2μL；正向引物(20pmol/μL)0.5μL；反向引物(20pmol/μL) 0.5μL；Trans-Taq聚合酶0.3μL；模板(10ng/μL)0.3μL；ddH2O 18.9μL。 PCR反应条件：95℃预变性5min，94℃变性30s、55℃退火30s、72℃延伸1min 30s、29个循环，72℃延伸8min。PCR反应产物经琼脂糖凝胶电泳检测，见图5。
含有目的片段的PCR产物利用AXYGEN PCR clean up试剂盒进行纯化回收，将纯化产物进行测序，所得序列长度为1390bp。
将所得序列与NCBI核酸数据库进行同源性比对分析，挑选部分相似性高的菌株与Lysobacter sp.OH23菌株进行系统发育分析，用MEGA软件中的邻接法 (Neighbor-Joining)构建系统发育树，见图6，由图可知Lysobacter sp.OH23与 L.brunescens遗传距离最近。
OH23 16S rDNA序列，长度为1390bp：
TTGCGGTTAAGCTACCTGCTTCTGGTGCAACAAACTCCCATGGTGTGACGGGCGGTGT GTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCAGCAATGCTGATCTGCGATTACTAGCGATTC CGACTTCATGGAGTCGAGTTGCAGACTCCAATCCGGACTGAGATGGGGTTTCTGGGAT TGGCTCACTCTCGCGAGTTTGCAGCCCTCTGTCCCCACCATTGTAGTACGTGTGTAGCC CTGGCCGTAAGGGCCATGATGACTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGCTTGTCGCCGGCGGTCTCCCTAGAGTTCCCACCATTACGTGCTGGCAACTAGGGACAAGGGTTGCGCT CGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAGCCATGCAGCACC TGTGTCACGGTTCCCGAAGGCACCAATCCATCTCTGGAAAGTTCCGTGCATGTCAAGG CCAGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCATCGAATTAAACCACATACTCCACCGCTTGTGCGGG CCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAGTCTTGCGACCGTACTCCCCAGGCGGCGAACTTA ACGCGTTAGCTTCGATACTGAGTGCCTAGTTGCACCCAACATCCAGTTCGCATCGTTTA GGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTCCCCACGCTTTCGTGCCTCAGTG TCAGTGCTGGTCCAGATGGCCGCCTTCGCCACAGATGTTCCTCCCGATCTCTACGCATT TCACTGCTACACCGGGAATTCCGCCATCCTCTACCGCACTCTAGCCCGCCAGTATCCAA TGCAATTCCCAGGTTGAGCCCAGGGCTTTCACATCAGACTTAACGAACCACCTACGCA CGCTTTACGCCCAGTAATTCCGAGTAACGCTTGCACCCTTCGTATTACCGCGGCTGCTG GCACGAAGTTAGCCGGTGCTTATTCTTCCGGTACCGTCAGAACACCGAAGTATTAATCC AGTGCTTTTCTTTCCGGACAAAAGGGCTTTACAACCCGAAGGCCTTCTTCACCCACGC GGCATGGCTGGATCAGGCTTGCGCCCATTGTCCAATATTCCCCACTGCTGCCTCCCGTA GGAGTCTGGACCGTGTCTCAGTTCCAGTGTGGCTGATCATCCTCTCAGACCAGCTACC GATCGTCGCCTTGGTGGGCCATTACCCCGCCAACTAGCTAATCGGACATCGGCTCATCT AATCGCGCGAGGTCTTGCGATCCCCCGCTTTCACCCGTAGGTCGTATGCGGTATTAGCG TAAGTTTCCCTACGTTATCCCCCACGACTAGGCAGATTCCGATGTATTCCTCACCCGTCC GCCACTCGCCACCCACAGTATTGCTACTGCTGTGCTGCCG。
SEQUENCE LISTING
<110> 江苏省农业科学院
<120> 一种拮抗水稻黄单胞菌的溶杆菌及其分离方法与应用
<130>
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
agagtttgat catggctcag 20
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
acggttacct tgttacgact t 21
<210> 3
<211> 1390
<212> DNA
<213> 溶杆菌
<400> 3
ttgcggttaa gctacctgct tctggtgcaa caaactccca tggtgtgacg ggcggtgtgt 60
acaaggcccg ggaacgtatt caccgcagca atgctgatct gcgattacta gcgattccga 120
cttcatggag tcgagttgca gactccaatc cggactgaga tggggtttct gggattggct 180
cactctcgcg agtttgcagc cctctgtccc caccattgta gtacgtgtgt agccctggcc 240
gtaagggcca tgatgacttg acgtcatccc caccttcctc cggcttgtcg ccggcggtct 300
ccctagagtt cccaccatta cgtgctggca actagggaca agggttgcgc tcgttgcggg 360
acttaaccca acatctcacg acacgagctg acgacagcca tgcagcacct gtgtcacggt 420
tcccgaaggc accaatccat ctctggaaag ttccgtgcat gtcaaggcca ggtaaggttc 480
ttcgcgttgc atcgaattaa accacatact ccaccgcttg tgcgggcccc cgtcaattcc 540
tttgagtttc agtcttgcga ccgtactccc caggcggcga acttaacgcg ttagcttcga 600
tactgagtgc ctagttgcac ccaacatcca gttcgcatcg tttagggcgt ggactaccag 660
ggtatctaat cctgtttgct ccccacgctt tcgtgcctca gtgtcagtgc tggtccagat 720
ggccgccttc gccacagatg ttcctcccga tctctacgca tttcactgct acaccgggaa 780
ttccgccatc ctctaccgca ctctagcccg ccagtatcca atgcaattcc caggttgagc 840
ccagggcttt cacatcagac ttaacgaacc acctacgcac gctttacgcc cagtaattcc 900
gagtaacgct tgcacccttc gtattaccgc ggctgctggc acgaagttag ccggtgctta 960
ttcttccggt accgtcagaa caccgaagta ttaatccagt gcttttcttt ccggacaaaa 1020
gggctttaca acccgaaggc cttcttcacc cacgcggcat ggctggatca ggcttgcgcc 1080
cattgtccaa tattccccac tgctgcctcc cgtaggagtc tggaccgtgt ctcagttcca 1140
gtgtggctga tcatcctctc agaccagcta ccgatcgtcg ccttggtggg ccattacccc 1200
gccaactagc taatcggaca tcggctcatc taatcgcgcg aggtcttgcg atcccccgct 1260
ttcacccgta ggtcgtatgc ggtattagcg taagtttccc tacgttatcc cccacgacta 1320
ggcagattcc gatgtattcc tcacccgtcc gccactcgcc acccacagta ttgctactgc 1380
tgtgctgccg 1390
Claims (4)
1.一种拮抗水稻黄单胞菌的溶杆菌（Lysobacter sp.），其特征在于，分类命名为溶杆菌（Lysobacter sp.）OH23，已保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏编号：CGMCC No. 13677，保藏日期：2017年2月23日，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
2.权利要求1所述拮抗水稻黄单胞菌的溶杆菌在抑制水稻黄单胞菌中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述黄单胞菌为水稻白叶枯病菌或水稻条斑病菌。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，挑取Lysobacter sp. OH23单菌落培养获得OD600=1.0的菌液，取50 μl水稻黄单胞菌菌液，稀释100倍后铺于NA平板上，吹干，再取3 μlLysobacter sp. OH23菌液滴于含有病原菌菌液的平板上，28℃培养观察。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201710483767.8A CN107400639B (zh) | 2017-06-22 | 2017-06-22 | 一种拮抗水稻黄单胞菌的溶杆菌及其分离方法与应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201710483767.8A CN107400639B (zh) | 2017-06-22 | 2017-06-22 | 一种拮抗水稻黄单胞菌的溶杆菌及其分离方法与应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN107400639A CN107400639A (zh) | 2017-11-28 |
| CN107400639B true CN107400639B (zh) | 2020-03-17 |
Family
ID=60404718
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201710483767.8A Active CN107400639B (zh) | 2017-06-22 | 2017-06-22 | 一种拮抗水稻黄单胞菌的溶杆菌及其分离方法与应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN107400639B (zh) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109880844A (zh) * | 2019-03-06 | 2019-06-14 | 江苏省农业科学院 | 一种基于同源重组的变棕溶杆菌oh23基因敲除系统的构建方法与应用 |
| CN115011645B (zh) * | 2021-06-24 | 2024-04-16 | 江苏省农业科学院 | 吡啶甲酸在制备防治黄单胞菌病害的生物农药上的应用 |
Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101177671A (zh) * | 2007-12-05 | 2008-05-14 | 南京农业大学 | 一株防治植物病害的生防细菌菌株 |
| CN101617691A (zh) * | 2009-07-24 | 2010-01-06 | 云南农业大学 | 一种具有防治水稻条斑病害及促生作用的生物制剂及应用 |
| CN103667136A (zh) * | 2013-12-10 | 2014-03-26 | 南京农业大学 | 一株拮抗植物病原细菌的抗生素溶杆菌oh13的分离鉴定 |
| CN104082346A (zh) * | 2014-06-27 | 2014-10-08 | 江苏省农业科学院 | 一株辣椒溶杆菌nf87-2及其应用 |
| CN104651265A (zh) * | 2014-12-22 | 2015-05-27 | 南京农业大学 | 一株特异性拮抗黄单胞菌的变棕溶杆菌oh21的分离鉴定 |
| CN105145633A (zh) * | 2015-07-31 | 2015-12-16 | 北京泰克美高新技术有限公司 | 一种防治植物线虫的药剂 |
-
2017
- 2017-06-22 CN CN201710483767.8A patent/CN107400639B/zh active Active
Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101177671A (zh) * | 2007-12-05 | 2008-05-14 | 南京农业大学 | 一株防治植物病害的生防细菌菌株 |
| CN101617691A (zh) * | 2009-07-24 | 2010-01-06 | 云南农业大学 | 一种具有防治水稻条斑病害及促生作用的生物制剂及应用 |
| CN103667136A (zh) * | 2013-12-10 | 2014-03-26 | 南京农业大学 | 一株拮抗植物病原细菌的抗生素溶杆菌oh13的分离鉴定 |
| CN104082346A (zh) * | 2014-06-27 | 2014-10-08 | 江苏省农业科学院 | 一株辣椒溶杆菌nf87-2及其应用 |
| CN104651265A (zh) * | 2014-12-22 | 2015-05-27 | 南京农业大学 | 一株特异性拮抗黄单胞菌的变棕溶杆菌oh21的分离鉴定 |
| CN105145633A (zh) * | 2015-07-31 | 2015-12-16 | 北京泰克美高新技术有限公司 | 一种防治植物线虫的药剂 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| 变棕溶杆菌OH23次生代谢产物抗菌活性的分析及其发酵培养基优化;朱润杰等;《中国生物防治学报》;20190608;第35卷(第3期);第426-436页 * |
| 抗生素溶杆菌13-1代谢产物粗提物的抑菌活性研究;魏兰芳等;《2008年中国植病、菌物学会杭州联合年会论文集》;20081001;摘要 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN107400639A (zh) | 2017-11-28 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN106906167B (zh) | 一株生防用解淀粉芽胞杆菌及其应用 | |
| CN111254093A (zh) | 一株贝莱斯芽孢杆菌229-15及其应用 | |
| CN109207404B (zh) | 暹罗芽孢杆菌yj15及其应用 | |
| CN112746046B (zh) | 一株贝莱斯芽孢杆菌及其在防治黄瓜细菌性角斑病中的应用 | |
| CN107164285B (zh) | 一株枯草芽孢杆菌bbd012及防治番茄病害中的应用 | |
| CN104946574B (zh) | 一株抑制植物病原真菌的枯草芽孢杆菌Baisha2C | |
| CN107099484B (zh) | 一株产酶溶杆菌及其应用 | |
| CN114381391B (zh) | 一株铜绿假单胞菌及其在抑制黄瓜土传病害中的应用 | |
| CN111763643A (zh) | 一种防治花生根腐病的复合菌群及其应用 | |
| CN114657109B (zh) | 一种恶臭假单胞菌及其应用 | |
| CN110172422B (zh) | 一株溶蛋白芽孢杆菌及其在防治根结线虫中的应用 | |
| CN111004736B (zh) | 一种巨大芽孢杆菌及其降解拟除虫菊酯类杀虫剂的应用 | |
| CN110172423B (zh) | 一株贝莱斯芽孢杆菌及其在防治根结线虫中的应用 | |
| CN107400639B (zh) | 一种拮抗水稻黄单胞菌的溶杆菌及其分离方法与应用 | |
| CN107893047A (zh) | 一株石油芳香烃降解菌及其应用 | |
| CN102978130B (zh) | 一种短小芽孢杆菌gbsc66及其应用 | |
| CN111100813A (zh) | 一株缓解植物盐害的耐盐促生细菌jp-jh及其应用 | |
| CN114196585A (zh) | 一株用于防治番茄青枯病的伯克霍尔德菌及其应用 | |
| CN107118979B (zh) | 一种解淀粉芽孢杆菌与应用 | |
| Singh et al. | Characterization of actinomycetes against phytopathogenic fungi of Glycine max (L.) | |
| CN110343645A (zh) | 一株菌株短小芽孢杆菌sem-7及其应用 | |
| CN113980852B (zh) | 一种协同降解苯腈类除草剂的微生物组合物及其生产的菌剂 | |
| CN112608872B (zh) | 硫藤黄链霉菌及其在防治柑橘绿霉病中的应用 | |
| CN113373091A (zh) | 一株防治水稻纹枯病的生防菌株苏云金芽孢杆菌fj2b-25 | |
| CN110904005B (zh) | 一株氟磺胺草醚降解菌及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |