CN112608872B - 硫藤黄链霉菌及其在防治柑橘绿霉病中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了硫藤黄链霉菌，保藏编号为GDMCC NO:61327，分类命名为Streptomycesthioluteus GXMD‑hs‑43。该菌株筛选简单、容易培养，发明人还建立了相应培养方法。研究表明，GXMD‑hs‑43菌株发酵液对柑橘绿霉病具有很好的防治作用效果，它对指状青霉病菌抑制效果高达94.81％以上。此外，GXMD‑hs‑43菌株毒理实验表明其为无毒微生物，因而还具有生态安全性好等特点，使用过程中不会造成二次污染。该菌株的发现丰富了我国的可利用微生物资源，其抑菌效果稳定、高效、环境友好的优势，在防治柑橘绿霉病方面具有很好的应用前景。

Description

硫藤黄链霉菌及其在防治柑橘绿霉病中的应用
技术领域
本发明属于微生物技术领域，尤其涉及硫藤黄链霉菌及其在防治柑橘绿霉病中的应用。
背景技术
柑橘绿霉病由指状青霉病菌(Penicillium digitatum)引起的，柑橘绿霉菌会通过柑橘上的各种伤口侵染柑橘，如若有组织液渗出便能加速柑橘绿霉菌侵染速度。柑橘绿霉菌能在各种有机物质上生存，当柑橘表皮出现伤口后，在空气中的柑橘绿霉菌的分生孢子便会依附到柑橘的伤口上开始侵染果实。柑橘绿霉病是一种常见的柑橘储藏期病害，常导致柑橘果实腐烂并造成严重的损失。
目前，主要有三种措施用于防治柑橘采摘后的病害：物理防治，化学防治和生物防治。
化学防治是现阶段控制柑橘绿霉病最常使用的办法，化学防治是利用化学药剂，植物生长抑制剂等对果蔬进行喷洒，从而抑制病菌繁殖的手段，但使用化学防治不可避免的问题就是容易产生农药残留，水果口感受影响，表皮光泽度不饱和；另外，化学杀菌剂的持续使用，也会使病原菌产生耐药性，造成环境污染，威胁人类健康。
物理防治措施是减少水果损伤，通过物理方法阻碍果实致病细菌和霉菌的吸附和生长。最常用的办法有热处理，低温贮藏，紫外线照射处理和在果实表面涂膜处理等办法。然而，物理防治的成本比化学防治高得多并且多数防治效果不佳，操作复杂，不适合大规模使用。
生物防治措施是人类正在探索的一种新型的防治病害的方法，它主要是以微生物为工具，微生物本身具有相应的作用或者产生一些有用的代谢产物，以此对病菌产生抑制作用。生物防治措施比物理防治措施成本低，比化学防治措施更环保，采用生物防治方法被认为是目前防治柑橘绿霉病最绿色、环保的途径。目前，微生物防治病害的研究已取得不错的成果，但普遍应用的病虫害拮抗菌株都是以广谱性为主，很少涉及单一病害的深入研究，对单一作物单一病害防治效果达不到理想效果，造成社会资源及物力财力的浪费，对生物防治的推广造成不良的影响。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供硫藤黄链霉菌及其在防治柑橘绿霉病中的应用，为有效防治柑橘绿霉病开辟新途径、建立新方法。
为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：
硫藤黄链霉菌，保藏编号为GDMCC NO:61327，分类命名为Streptomycesthioluteus GXMD-hs-43。
上述硫藤黄链霉菌，其16S rRNA基因具有序列表SEQ.ID.NO.1的碱基序列。
上述硫藤黄链霉菌用于抑制指状青霉病菌。
上述硫藤黄链霉菌在防治柑橘绿霉病中的应用。
上述应用在于使用硫藤黄链霉菌的发酵液浸泡或喷洒柑橘。
上述硫藤黄链霉菌的发酵液用于制备指状青霉病菌抑菌剂或防治柑橘绿霉病药剂。
发明人在广西弄岗国家级自然保护区的土壤中分离得到本发明的功能微生物硫藤黄链霉菌，保藏编号为GDMCC NO:61327，分类命名为Streptomyces thioluteus GXMD-hs-43。该菌株筛选简单、容易培养，发明人还建立了相应培养方法。研究表明，GXMD-hs-43菌株发酵液对柑橘绿霉病具有很好的防治作用效果，它对指状青霉病菌抑制效果高达94.81％以上。此外，GXMD-hs-43菌株毒理实验表明其为无毒微生物，因而还具有生态安全性好等特点，使用过程中不会造成二次污染。该菌株的发现丰富了我国的可利用微生物资源，其抑菌效果稳定、高效、环境友好的优势，在防治柑橘绿霉病方面具有很好的应用前景。
附图说明
图1是硫藤黄链霉菌与柑橘绿霉病菌平板初筛抑制效果图。
图2是硫藤黄链霉菌过滤液与柑橘绿霉病菌复筛抑制效果图，图中：左边是对照组，右边是处理组。
图3是果实实验对照组A果实病发图。
图4是果实实验对照组B果实病发图。
图5是果实实验对照组C果实病发图。
图6是果实实验对照组D果实病发图。
图7是果实实验处理组A果实病发图。
图8是果实实验处理组B果实病发图。
图9是菌种测序电泳检测图，图中：DL2000为Marker，其条带从上至下分布为：2000、1000、750、500、250、100bp；1和2是共同测序的其它菌株，3是硫藤黄链霉菌。
保藏信息说明
硫藤黄链霉菌，分类命名为Streptomyces thioluteus GXMD-hs-43，保藏编号为GDMCC NO:61327，保藏日期：2020年12月01日，保藏地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，邮编510070，保藏单位：广东省微生物菌种保藏中心。
菌株保存和培养条件：
培养基为LB培养基。
菌株保存方法为加入60％甘油，冰箱-80°冷冻保存。
具体实施方式
一、菌株的筛选
1.1材料准备
样品采样：采样土壤地点为广西弄岗国家级自然保护区，拨开表层土，采表层以下15cm深度的土样，保存于4℃培养箱中，带回实验室进行下一步处理。
分离纯化培养基：
LB液体培养基：胰蛋白胨10.0g，酵母粉5.0g，氯化钠5.0g，蒸馏水1000mL。
LB固体培养基：胰蛋白胨10.0g，酵母粉5.0g，氯化钠5.0g，琼脂粉15g，蒸馏水1000mL。
PDA培养基：马铃薯200.0g，葡萄糖20.0g，琼脂20.0g，蒸馏水1000mL。
1.2菌株的分离纯化筛选
1.2.1分离纯化
将2g土壤样品加入18ml无菌水中制备土壤悬液，摇床(180r/min)震荡30min后，用无菌水梯度稀释成10-1-10-6倍的样品，取10-3、10-4两个稀释倍数的样品0.1ml涂于PDA培养基平板上，用于分离真菌。取10-5、10-6两个稀释倍数的样品0.1ml涂于LB固体培养基上，用于分离细菌。将PDA平板置于28℃培养箱，经2d、7d、14d后挑取单菌落于固体培养基纯化。将LB平板置于37℃培养箱，36h后挑取形态特征明显不一样的菌落在新的平板上划线，获得单菌落。
1.2.2初筛
采用对峙培养法筛选，用5mm的灭菌打孔器取已活化好的病原菌菌病，先将菌饼接在新鲜的PDA平板中央作指示菌，再将待测菌接在离菌饼2.5cm处(3处，剩余一处作为空白对照)，以仅接菌饼的平板为对照。放入28℃恒温培养箱培养5d，测量抑菌带并筛选出抑菌带较宽的菌株进行复筛。菌株初筛结果如图1所示。
1.2.3复筛
将复筛菌株接种到1ml LB液体培养基中，摇床35℃、180r/min培养36h后，于12000rpm离心5min，吸取上清液。挑取病原菌菌病置于PDA平板中央，在离菌饼2.5cm处十字交处放入4个6mm孔径的牛津杯，一组相对的牛津杯作对照组，另一组相对的牛津杯作实验组；在实验组中加入150uL复筛菌发酵上清液；在对照组中加入150uL的LB液体培养基，静置2h后，置于28℃培养4-5d，测量抑菌带。
1.2.4再次复筛
同上述复筛，配置复筛菌发酵液上清液，然后用细菌过滤灭菌器过滤，获得过滤液。取1ml过滤液与9mlPDA培养基混匀制成平板，在平板中央放置病菌菌块，以加无菌水的平板为对照，作3个重复，28℃恒温培养，待对照刚好长满培养皿时，测量抑菌圈直径，计算抑菌率。菌株再次复筛结果如图2和表1所示。
表1硫藤黄链霉菌过滤液与柑橘绿霉病菌复筛抑制结果
对照 加入菌株无菌发酵液
病原菌直径(mm) 71.0 39.0
抑菌率(％) 0 50
结果表明，硫藤黄链霉菌对柑橘绿霉病病原菌指状青霉病菌的抑制效果达到了50％。
二、菌株的抑菌应用
果实室内生防：将拮抗菌接种到LB液体培养基中培养，配制菌株发酵上清液；挑选大小均匀、无机械损伤、成熟度一致、较新鲜的皇帝柑用作实验材料，并对其用75％的酒精进行表面消毒；对实验果实进行分组，分为对照组和处理组。
对照组分为：
A将果实表面刺孔损伤后在伤口处接种柑橘绿霉病原菌菌块；
B将果实表面刺孔损伤后在伤口处接种空白PDA培养基；
C将果实先浸泡LB液体培养基，12h后再刺孔损伤接种柑橘绿霉病原菌菌块；
D将果实先刺孔损伤接种柑橘绿霉病原菌菌块，12h后再往果实表面均匀喷洒LB液体培养基。
处理组分为：
A将果实先浸泡拮抗菌发酵液，12h后再刺孔损伤接种柑橘绿霉病病原菌菌块；
B将果实表面先刺孔损伤接种柑橘绿霉病病原菌菌块，12h后再往果实表面均匀喷洒拮抗菌发酵液。
上述硫藤黄链霉菌对柑橘果实防治绿霉病的方法的抑菌率计算公式为：
Figure BDA0002898484040000041
硫藤黄链霉菌对柑橘果实防治绿霉病的实验结果图如图4-8和表2所示，其抑菌率分别为：处理组A的抑制效果高达94.81％；处理组B的抑制效果达67.95％。
表2硫藤黄链霉菌过滤液在果实实验上结果
Figure BDA0002898484040000051
三、菌株基因鉴定
采用Chelex-100加热法提取该菌株的基因组DNA，使用细菌16SrRNA基因通用引物(SEQ.ID.NO.2和SEQ.ID.NO.3)进行16SrRNA基因扩增。
PCR反应体系如下：
Figure BDA0002898484040000052
PCR反应条件如下：
Figure BDA0002898484040000053
16SrRNA扩增的产物用浓度为1％的琼脂凝胶做电泳检验，电泳结果如图9。合格的PCR产物交由上海美吉生物医药科技有限公司进行测序及鉴定，鉴定结果表明，本发明提供的对柑橘绿霉病有明显防治效果的菌种为硫藤黄链霉菌(Streptomyces thioluteus)。
四、菌株的毒性
本发明中硫藤黄链霉菌交由第三方检测机构北京中科光析化工技术研究所(化工实验室)完成菌株毒理实验，检测项目为急性经口毒性，检测结果为：在测试条件下，送检的样品对KM小鼠的急性经口毒性LD50＞5000mg/Kg体重，送检样品的经口毒性分级应为微毒(实际无毒)级。
综上所述，本发明的硫藤黄链霉菌在防治柑橘绿霉病上具有显著的效果，而且安全无毒，可广泛用于防治柑橘绿霉病，特别适合在柑橘未发病前使用该菌株发酵液进行预防。
序列表
<110> 广西民族大学
广西绿友农生物科技股份有限公司
<120> 硫藤黄链霉菌及其在防治柑橘绿霉病中的应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1435
<212> DNA
<213> 硫藤黄链霉菌(Streptomyces thioluteus GXMD-hs-43)
<400> 1
gcaaaggtgg ggggcgtgct tacacatgca gtcgaacgat gaagcccttc ggggtggatt 60
agtggcgaac gggtgagtaa cacgtgggca atctgccctt cactctggga caagccctgg 120
aaacggggtc taataccgga tacgaccttc gagcgcatgc ttgaaggtgg aaagctccgg 180
cggtgaagga tgagcccgcg gcctatcagc ttgttggtgg ggtgatggcc taccaaggcg 240
acgacgggta gccggcctga gagggcgacc ggccacactg ggactgagac acggcccaga 300
ctcctacggg aggcagcagt ggggaatatt gcacaatggg cgaaagcctg atgcagcgac 360
gccgcgtgag ggatgacggc cttcgggttg taaacctctt tcagcaggga agaagcgaaa 420
gtgacggtac ctgcagaaga agcgccggct aactacgtgc cagcagccgc ggtaatacgt 480
agggcgcaag cgttgtccgg aattattggg cgtaaagagc tcgtaggcgg cttgtcgcgt 540
cggatgtgaa agcccggggc ttaaccccgg gtctgcattc gatacgggca ggctagagtt 600
cggtagggga gatcggaatt cctggtgtag cggtgaaatg cgcagatatc aggaggaaca 660
ccggtggcga aggcggatct ctgggccgat actgacgctg aggagcgaaa gcgtggggag 720
cgaacaggat tagataccct ggtagtccac gccgtaaacg ttgggaacta ggtgtgggcg 780
acattccacg tcgtccgtgc cgcagctaac gcattaagtt ccccgcctgg ggagtacggc 840
cgcaaggcta aaactcaaag gaattgacgg gggcccgcac aagcagcgga gcatgtggct 900
taattcgacg caacgcgaag aaccttacca aggcttgaca tacaccggaa acgggccaga 960
gatggtcgcc cccttgtggt cggtgtacag gtggtgcatg gctgtcgtca gctcgtgtcg 1020
tgagatgttg ggttaagtcc cgcaacgagc gcaacccttg tcctgtgttg ccagcatgcc 1080
ctttcggggt gatggggact cacaggagac tgccggggtc aactcggagg aaggtgggga 1140
cgacgtcaag tcatcatgcc ccttatgtct tgggctgcac acgtgctaca atggccggca 1200
acaatgagct gcgataccgt gaggtggagc gaatctcaaa aagccggtct cagttcggat 1260
tggggtctgc aactcgaccc catgaagttg gagttgctag taatcgcaga tcagcattgc 1320
tgcggtgaat acgttcccgg gccttgtaca caccgcccgt cacgtcacga aagtcggtaa 1380
cacccgaagc cggtggccca acccttgtgg aggagccgtc gaagtgactg cagtt 1435
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
agagtttgat cctggctcag 20
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ggttaccttg ttacgactt 19

Claims (5)

1.硫藤黄链霉菌(Streptomyces thioluteus)GXMD-hs-43，保藏编号为GDMCC NO:61327，分类命名为Streptomyces thioluteus。
2.权利要求1所述硫藤黄链霉菌用于抑制指状青霉病菌(Penicillium digitatum)。
3.权利要求1所述硫藤黄链霉菌在防治柑橘绿霉病中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于使用硫藤黄链霉菌的发酵液浸泡或喷洒柑橘。
5.权利要求1所述硫藤黄链霉菌的发酵液用于制备指状青霉病菌抑菌剂或防治柑橘绿霉病药剂。
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