CN103290032B - 硫藤黄链霉菌抗生素调控基因及提高链霉菌抗生素产量的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种硫藤黄链霉菌抗生素调控基因ORF4，其核苷酸序列为SEQ ID NO：1所示，或与SEQ ID NO：1所示核苷酸编码相同蛋白的核苷酸序列。本发明还公开了所述基因在制备抗生素高产链霉菌基因突变株中的应用以及一种提高链霉菌抗生素产量的方法。本发明通过使用硫藤黄链霉菌抗生素调控基因ORF4，解决了传统链霉菌育种的高工作量、高盲目性的问题，在多种抗生素产生菌中发挥作用，得到了利用基因工程培育的抗生素高产菌株，应用前景广阔。

Description

硫藤黄链霉菌抗生素调控基因及提高链霉菌抗生素产量的方法

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体地说，涉及一种硫藤黄链霉菌抗生素调控基因及其用途和提高链霉菌抗生素产量的方法。

背景技术

链霉菌是一种极具商业价值的放线菌。在已发现的微生物源抗生素中，产自放线菌的约占2/3，这其中，产自链霉菌的约为80%(Kieser等，2000，Practical Streptomyces Genetics. The John InnesFoundation, Norwich)，它们分别在抗细菌、抗虫、抗肿瘤、抗真菌等方面发挥重要功效。

由于链霉菌的商业价值，提高链霉抗生素产量的方法显得十分重要，这些方法包括两类：一类是通过理化方法对链霉菌进行诱变，在突变株中筛选高产菌株；一类是通过遗传学方法，对菌株进行遗传改变，提高抗生素的产量。通过理化方法对链霉菌进行诱变已经取得了很大的成绩，得到了大量的高产菌株，但是，这种方法的筛选工作量大，而且具有一定盲目性。随着对细菌基因组研究的深入，用遗传学的方法育种降低操作的盲目性，而且使工作量大大降低。

例如，在天蓝色链霉菌（Streptomyces coelicolor）中，actII-ORF4是抗生素放线紫红素合成的途径专一性正调节因子，可以通过提高它的表达量来提高放线紫红素的产量（Gramajo HC等，1993，Stationary-phase production of the antibiotic actinorhodinin Streptomyces coelicolor A3(2) is transcriptionallyregulated. Mol Microbiol.7:837-845）。在灰色链霉菌（Streptomyces griseus）中，ArpA蛋白抑制抗生素的产生，可以通过对arpA基因进行破坏，提高链霉素的产量（Onaka, H.等，1995，Cloningand characterization of the A-factor receptor genefrom Streptomyces griseus. J Bacteriol，177:6083-6092）。在阿维链霉菌中，可以通过将aveR1或aveR2基因进行破坏，提高阿维链霉菌中阿维菌素的产量（美国专利US6197591，Stutzman-Engwall）。在棒状链霉菌(Streptomyces clavuligerus)中，中断gap基因后导入调控因子ccaR可以提高棒酸的产量（Enhancement of Clavulanic Acid Production by ExpressingRegulatory Genes in gap Gene Deletion Mutant of Streptomyces clavuligerus NRRL3585.J.Microbiol. Biotechnol.(2010),20(1),146–152）。

通过遗传学方法提高链霉菌抗生素的产量，主要是改造调控抗生素产生的调节基因来进行的。这些调节基因，有的起正调节作用，有的起负调节作用，有的可以调节多种抗生素的产量，有的专一调节一种抗生素的产量。对正调节基因，可以通过提高它的拷贝数或者表达量来提高抗生素的产量；对负调节基因，可以通过破坏该基因来提高抗生素的产量；另外，对能同时调控多种抗生素产量的调节基因进行改造比只改造调控单一抗生素产量的调节基因更加有效。

基于上述研究，本发明在硫藤黄链霉菌（Streptomyces thioluteus）中发现了一个全局性调控因子ORF4，可以在不同的抗生素产生菌中提高多种抗生素的产量。生物信息学比对分析显示ORF4为“可能的调节基因”，在现有数据中没有对其功能及作用机制的研究报道，是一个全新的基因。

发明内容

本发明的目的在于提供了一种新的上调抗生素生物合成的硫藤黄链霉菌抗生素调控基因ORF4及其用途。

本发明的第二个目的是提供一种使用该调控基因上调链霉菌抗生素合成并提高链霉菌抗生素产量的方法，并且利用该方法获得抗生素高产菌株变铅青链霉菌、棒状链霉菌及吸水链霉菌。

本发明所述的新的上调抗生素生物合成的硫藤黄链霉菌抗生素调控基因ORF4来源于硫藤黄链霉菌，其核苷酸序列为SEQ ID NO：1，或与SEQ ID NO：1所示核苷酸编码相同蛋白的核苷酸序列，通过对硫藤黄链霉菌基因组文库进行亚克隆获得，ORF4全长1221bp，包含了一个完整的开放阅读框，编码一个包含406个氨基酸的蛋白质。

本发明提供的提高链霉菌抗生素产量方法的流程图如图1所示，首先从链霉菌的基因组文库中筛选得到包含全局性调控因子ORF4基因的片段，将该片段克隆到带有启动子的载体上，得到含有ORF4基因片段的重组质粒。在本发明的实施例中构建了一个重组质粒，即pZMY9-3。第二步通过链霉菌接合转移的方法将pZMY9-3导入抗生素产生菌中，通过抗生素筛选得到包含ORF4基因的重组菌株。第三步针对重组菌株进行抗生素测定，得到抗生素高产菌株。本发明的实施例分别在变铅青链霉菌（Streptomyecs lividans）、吸水链霉菌（Streptomyces hygrocopicus）及棒状链霉菌（Streptomyces clavuligerus ）中实现了抗生素上调。对该方法的具体说明请参考本发明的三个实施例。

本发明的优点是通过使用硫藤黄链霉菌抗生素调控基因ORF4，解决了传统链霉菌育种的高工作量、高盲目性的问题，在多种抗生素产生菌中发挥作用，得到了利用基因工程培育的抗生素高产菌株，应用前景广阔。利用该方法对出发菌株变铅青链霉菌ZX1（Streptomyces coelicolor A3(2) lacks a genomic island present in thechromosome of Streptomyces lividans 66.Zhou X, He X,Li A, Lei F, Kieser T, Deng Z.Appl Environ Microbiol. 2004 Dec;70(12):7110-8.）进行改造，发现ORF4基因能使原本沉默的放线紫红素及十一烷基灵菌红素基因簇表达，使得这两种抗生素高产；同时能使改造后吸水链霉菌中的洋橄榄叶素总量较出发菌株ATCC29253(Deletion of rapQONML from the rapamycin genecluster of Streptomyces hygroscopicus gives production of the 16-O-desmethyl-27-desmethoxy analog.Chung L,Liu L, Patel S, Carney JR, Reeves CD.J Antibiot (Tokyo). 2001 Mar;54(3):250-6.)得到提高；同时改造后棒状链霉菌中的头霉素C总量较出发菌株NRRL3585（Malate synthase from Streptomyces clavuligerus NRRL3585: cloning, molecular characterization and its control by acetate.Chan M, Sim TS.Microbiology. 1998 Nov;144 ( Pt 11):3229-37.）也得到一定程度的提高。

附图说明

图1：pZMY9-3的物理图谱。

图2：ZMY1及ZX1-CK发酵平板拍照，拍照时间为3d和4d，ZMY1在3d时产生红色及少量蓝色色素，在4d时产生大量蓝色色素，ZX1-CK基本没有有色物质产生。

图3：ZMY1及ZX1-CK发酵平板萃取液TLC效果图，ZMY1样品位于上端的粉红色物质主要成分经分析为十一烷基灵菌红素，位于下端的蓝色物质主要成分经分析为放线紫红素，ZX1-CK基本没有有色物质产生。

图4：对ZMY1及ZX1-CK萃取液使用十一烷基灵菌红素的高效液相色谱方法及检测条件进行液相分析，发现在530nm处ZMY1较ZX1-CK有明显差异峰（灰色方框标记）。

图5：对ZMY1在530nm处较ZX1-CK有明显差异的峰进行质谱分析，发现该峰主要的成分为质荷比为m/z=394.2286[M+H]+的物质，与十一烷基灵菌红素的质谱数据吻合。

图6：对ZMY1及ZX1-CK萃取液使用放线紫红素的高效液相色谱方法及检测条件进行液相分析，发现在542nm处ZMY1较ZX1-CK有明显差异峰（灰色方框标记）。

图7：对ZMY1在530nm处较ZX1-CK有明显差异的峰进行质谱分析，发现该峰主要的成分为质荷比为m/z=631.1059[M+H]+的物质，与放线紫红素的质谱数据吻合。

图8：ZMY2及ATCC29253-CK的发酵萃取液使用洋橄榄叶素的高效液相色谱条件进行液相分析及发酵萃取液的生物活性测定效果图，液相分析得出ZMY2及ATCC29253-CK中有峰1和峰2两个峰（灰色方框标记），并且在ZMY2中这两个峰较ATCC29253-CK得到较为明显的提高。

图9：对ZMY2中的峰1进行质谱分析，发现峰1主要的成分为质荷比为m/z=1047.5852[M+Na]+的物质，与洋橄榄叶素的质谱数据吻合，

图10：对ZMY2中的峰2进行质谱分析，发现峰2主要的成分为质荷比为m/z=1061.6011[M+Na]+的物质，根据文献（J. Nat. Prod.1998,61, 1337-1339，Michael Ritzau）报道，为洋橄榄叶素的甲基化衍生物。

图11：ZMY3及NRRL3585-CK的发酵液使用头霉素C的高效液相色谱条件进行液相分析及发酵液的生物活性测定效果图，液相分析得出在ZMY2中有一个峰（灰色方框标记）较NRRL3585-CK得到较为明显的提高。

图12：对ZMY3中灰色方框标记的峰进行质谱分析，发现该峰主要的成分为质荷比为m/z=447.1185[M+H]+的物质，与头霉素C的质谱数据吻合。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明进行详细说明。

实施例1：利用ORF4基因提高变铅青链霉菌中放线紫红素及十一烷基灵菌红素产量的方法

1）包含ORF4基因的重组质粒pZMY9-3的构建

硫藤黄链霉菌能产生多种天然活性物质，本实验室对该菌株进行了深入研究，进行了基因组扫描同时构建了基因组文库，cosmid9-3来源于该文库。使用Sau3AI对cosmid9-3进行部分酶切，回收4kb左右的片段连接pJTU2554（Li L.The mildiomycin biosynthesis: initialst eps for sequential generation of 5-hydroxymethylcytidine 5'-monophosphate and 5-hydroxymethylcytosine inStreptoverticillium rimofaciens ZJU5119.2008,Chembiochem,9:1286-1294),通过转化导入变铅青链霉菌ZX1中，选取能使变铅青链霉菌ZX1放线紫红素高产的重组质粒测序，发现其中有一个未知的ORF，命名为ORF4。针对该ORF设计带有酶切位点的引物（9-3ORF4f上游引物TTTTCTAGAGGACGGGGAGGGCGGTGGCGGTGTTT；9-3ORF4r下游引物TTTGAATTCGGCGCGTCCATGTTGAGCAGGTTG；上游带有XbaI位点，下游带有EcoRI位点），连接到带有红霉素启动子的载体pMSB-WS052上，构成了包含ORF4基因的重组质粒pZMY9-3，该重组质粒保存在大肠杆菌菌株DH5α（Hanahan D. Studies on the transformation of E. coli with plasmids. J Mol Biol, 1983, 166:557-580）及大肠杆菌菌株S17-1（Construction of mobilizable vectors derived from plasmids RP4, pUC18 and pUC19. Gene. 1990 Sep 1;93(1):135-7.）中。

重组质粒pZMY9-3的物理图谱如图2所示，它的大小为7475bp，aac(3)IV（Kieser等，2000，Practical Streptomyces Genetics. The John Innes Foundation, Norwich，第465页）为安普拉霉素抗性基因，可在大肠杆菌与链霉菌中进行筛选。ori为能在大肠杆菌中复制的复制子，oriT（Kieser等，2000，Practical Streptomyces Genetics. The John Innes Foundation, Norwich，第502页）为接合转移的起始位点，intφC31（Kieser等，2000，Practical Streptomyces Genetics. The John Innes Foundation, Norwich，第265页）为整合酶基因，attPφC31为整合位点（Kieser等，2000，Practical Streptomyces Genetics. The John Innes Foundation, Norwich，第265页），PermE*为启动子，该启动子来源于质粒pWHM4*（华中师范大学李爱英老师课题组构建）。

pZMY9-3可以用酶切的方法进行验证，使用限制性内切酶EcoRI和XbaI酶切可得到1.6kb+5.8kb的带型。用限制性内切酶SmaI酶切可得到0.7kb+6.7kb的带型，由于提供了核苷酸序列，所以也可以通过测序的方法对pZMY9-3进行验证。大肠杆菌培养基及培养方法如下：

①LB培养基配方：

胰蛋白胨 10g，酵母抽提物 5g，NaCl 5g，加蒸馏水至 1000ml，pH7.0。于121℃灭菌30分钟，用于培养大肠杆菌，液态。

②LA培养基配方：

胰蛋白胨 10g，酵母抽提物 5g，NaCl 5g，琼脂15g，加蒸馏水至1000ml，pH7.0。于121℃灭菌30分钟用于培养大肠杆菌，固态。

③大肠杆菌培养方法：

在LB培养基中，37℃摇床，200转/分钟，过夜。

④大肠杆菌质粒抽提方法：

离心收集5ml大肠杆菌过夜培养物，将适量菌体悬浮于150μl的溶液I（50mM 葡萄糖，25mM Tris-HCl，10mM EDTA, pH8.0）中，加入300μl溶液II（0.2mol/L NaOH, 1%SDS）立即振荡混合均匀，然后加入230μl溶液III（3.0mol/L乙酸钾，pH4.8）混合均匀，12000转/分钟离心10min，上清液中加入1倍体积的异丙醇沉淀5分钟（或2.2倍体积无水乙醇沉淀1小时），12000转/分钟离心8min，用70%乙醇洗涤沉淀两次,干燥后加一定量的无菌去离子水溶解。

⑤限制性内切酶的酶切反应方法：

限制性内切酶酶切反应的体系为：质粒DNA 0.5~2μg，10×酶切缓冲液2μl，限制性内切酶5单位，去离子水加到30μl，总体系为30μl。反应条件为37℃，5小时。（所有限制性内切酶均购自fermentas公司）

⑥DNA的琼脂糖凝胶电泳分析方法：

将2μl DNA水溶液与0.5μl 上样液（0.25% 溴酚蓝，40%蔗糖）混合，用移液器（购自Gilson公司）将其加入到0.8%的琼脂糖凝胶（0.8克琼脂糖溶于100 ml水中，在微波炉中加热，使其完全融化，然后在倒胶板中倒出）胶孔中，电泳缓冲液为1×TAE（0.04Mol Tris-乙酸，0.02Mol EDTA），电泳电压为5 V/cm，时间为1小时。将电泳完毕的凝胶放入EB溶液（2.5mg/L溴化乙锭）中处理10分钟，然后在凝胶成像系统（购自Kodak公司）中进行分析。

⑦基因组DNA的Sau3AI部分酶切：

限制性内切酶及缓冲液由fermentas公司提供。

酶液准备：Sau 3AI（10u/μL）1μL加到10μL 10XBuffer在加89μL ddH₂O，总体系为100μL，酶的浓度为 0.1u/μL。cosmid9-3DNA准备：100μL（275 ng）加122μL 10XBuffer得到1222uL DNA（22.5μg/100μL）。稀释过程：

Solution 1 ： 5μL 0.1u/μL Sau 3AI + 495μL DNA→ 0.1u/100μL

Solution 2 ： 300μL Solution 1 + 100μL DNA → 0.075u/100μL

Solution 3 ： 200μL Solution 1 + 200μL DNA → 0.05u/100μL

Solution 4 ： 200μL Solution 2 + 200μL DNA → 0.0375u/100μL

Solution 5 ： 200μL Solution 4 + 200μL DNA → 0.01875u/100μL

在37 ℃ 反应1h取出后立即放冰上，电泳检测，回收4kb左右片段。

⑧DNA的琼脂糖凝胶回收方法：

DNA的琼脂糖凝胶回收使用爱思进公司产品，步骤见说明书。

⑨酶连反应方法：

T4 DNA 连接酶及连接缓冲液购自promega公司，酶连反应的体系为：载体DNA 500ng，外源DNA 1000ng，T4 DNA 连接缓冲液1μl，T4 DNA 连接酶0.5μl，去离子水补足到10μl。反应条件为16℃，8小时。

⑩大肠杆菌感受态的制备及转化方法：

从-70℃保存的菌种管中接种DH5α（或其它受体菌）在LA平板上划线。过夜培养后，挑取单菌落接种于5ml LB中，过夜培养。接种0.5ml过夜培养物于50ml 添加20mM MgCl₂的LB中，于37℃摇床培养2~3小时，至OD₆₀₀=0.5~0.8之间。将培养物置于冰中冷却10分钟（从此细胞应一直保持在0~4℃条件下），将培养物倒入预冷的塑料管中，用冷冻离心机3000转/分钟 离心4 分钟。 弃上清，加入1ml 预冷的0.1mol/L的CaCl₂，在冰上轻轻打散沉淀，再加入9ml CaCl₂。 冰上放置20 分钟后，再用冷冻离心机3000转/分钟 离心4分钟，弃上清，用 1ml 预冷的0.1mol/L的CaCl₂重悬浮。细胞即可贮存于冰上2~3天或立即用于转化。转化时，在插于冰上的1.5ml 的离心管中加入100μl感受态细胞，每管加入5~10μl DNA溶液， 轻弹混匀， 冰上放置20 分钟，42℃热激90秒， 加入150μl LB， 37℃恒温静置培养90 分钟。 吸出全部菌液涂布选择性培养基（含有抗生素的LA培养基）。37℃培养过夜即可见转化子出现。（如果转化质粒，可减少DNA和感受态细胞用量，或涂布少量菌液。）

2）将重组质粒pZMY9-3通过接合转移的方法导入变铅青链霉菌ZX1中

将包含有pZMY9-3重组质粒的大肠杆菌S17-1菌株与变铅青链霉菌ZX1进行接合转移，安普拉霉素抗性筛选得到含有pZMY9-3的变铅青链霉菌菌株ZMY1，同时导入空载pMSB-WS052命名为ZX1-CK做对照。

①MS培养基配方：

琼脂15g，甘露醇20g，黄豆饼粉100g，蒸馏水1000ml，pH7.2~7.3。先将100g黄豆饼粉用蒸馏水煮2~3小时，纱布过滤，补加水至1000ml，分装到预先装有琼脂和甘露醇的三角瓶中，121℃高压灭菌30分钟。用于接合转移和链霉菌的培养。

②2×YT培养基配方：

胰蛋白胨16g，酵母抽提物10g，NaCl 5g，加蒸馏水至1000ml，pH7.0。于121℃灭菌30分钟，用于接合转移。

③大肠杆菌和链霉菌间接合转移方法：

（a）将含有pZMY9-3的大肠杆菌S17-1菌株接种于5ml LB培养基（含有50μg/ml安普拉霉素）中，37℃培养过夜；（b）按1：100的比例将过夜培养物接种于含有50μg/ml安普拉霉素的5 ml新鲜LB中，于37℃继续培养至OD600 = 0.4~0.6；（c）将培养物在3000转/分钟离心3分钟，去掉上清，用5ml的新鲜LB培养基悬浮大肠杆菌细胞；（d）重复（c）；（e）将大肠杆菌悬液在3000转/分钟离心3分钟，去掉上清，用0.5ml的新鲜LB培养基悬浮大肠杆菌细胞；（f）在洗细胞的同时，可将每次接合转移所需的10⁸链霉菌孢子悬浮于500μl 2×YT培养基中，50℃热激10分钟，冷却至室温；（g）将处理好的大肠杆菌和变铅青链霉菌孢子混和，5000转/分钟离心2分钟，吸去上清，用残留的液体重新悬浮细菌沉淀块，涂布含有10mM MgCl₂的MS平板（20 ml培养基）；（h）于30℃培养16~20小时后，用含有1000μg/ml萘啶酮酸（购自Sigma公司）和1000μg/ml的安普拉霉素（购自Sigma公司）的1ml水溶液均匀覆盖平板表面，在超净工作台上打开平板盖子吹平板至平板表面干燥；（i）继续置30℃培养2~3天，即可观察接合转移子。用划线法使纯化，得到含有pZMY9-3的变铅青链霉菌菌株。

3）ZMY1的抗生素测定

将ZMY1在YD培养基上培养，ZMY1从第三天起开始产生可见红色及蓝色色素（图2），对照ZX1-CK不产生可见色素。将产素的平板使用乙酸乙酯萃取，减压蒸干后用甲醇溶解，进行硅胶板薄层层析分析，层析液为100%丙酮（图3）。使用十一烷基灵菌红素的高效液相色谱对萃取液进行分析，在530nm处能检测到ZMY1与ZX1-CK间明显差异，使用质谱对该峰进行分析，能检测到m/z=394.2286[M+H]+的离子，与十一烷基灵菌红素的质谱数据吻合；同时使用放线紫红素的高效液相色谱对萃取液进行分析，在542nm处能检测到ZMY1与ZX1-CK间明显差异，使用质谱对该峰进行分析，能检测到m/z=631.1059[M+H]+的离子，与放线紫红素的质谱数据吻合。据此分析得出：ORF4基因的导入使ZX1中原本沉默的十一烷基灵菌红素及放线紫红素基因簇激活，使这两种抗生素高产。

表1：ZX1-CK与基因工程菌ZMY1的十一烷基灵菌红素产量估算比较

实验组	菌株	检测波长530nm下吸光度	浓度（mol/L）
				第一组	ZX1-CK-1	0	—
	ZMY1-1	1.05937	1.05E-5
				第二组	ZX1-CK-2	0	—
	ZMY1-2	0.86604	0.86E-5

表2：ZX1-CK与基因工程菌ZMY1的放线紫红素产量估算比较

实验组	菌株	检测波长542nm下吸光度	浓度（mol/L）
				第一组	ZX1-CK-1	0	—
	ZMY1-1	0.44377	2.39E-5
				第二组	ZX1-CK-2	0	—
	ZMY1-2	0.39758	2.14E-5

①YD培养基：

酵母提取物5g，麦芽提取物10g，葡萄糖4g，氯化镁2g，氯化钙1.5g,琼脂20g，补水至1000ml，121℃高压灭菌30分钟，用于变铅青链霉菌的培养。

②十一烷基灵菌红素发酵及定量分析：

YD平板培养基培养30℃ 7d，乙酸乙酯萃取，减压蒸干后用甲醇溶解,使用层析液为100%丙酮进行硅胶板薄层层析分离，将粉红色的区域使用甲醇溶解，检测条件如下：色谱柱为Diamonsil C18（2）（5 μm，250x4.6 mm），10μL进行HPLC（高效液相色谱）分析，流动相为A:CH₃OH-CH₃CN-H₂O [4:1:5] ，B:CH₃O 20%B-100%B，12 min，检测波长530nm。十一烷基灵菌红素的浓度由以下公式估算得到：吸光度 = ε × [质量摩尔浓度]（2011-Deletion of polyphosphate kinase gene has a stimulatory effect on actinorhodin production by streptomyces coelicolor A3(2)），十一烷基灵菌红素标准品的ε =100500。

③放线紫红素发酵及分析：

YD平板培养基培养30℃ 7d，乙酸乙酯萃取，减压蒸干后用甲醇溶解,使用层析液为100%丙酮进行硅胶板薄层层析分离，将蓝色的区域使用甲醇溶解，检测条件如下：色谱柱为Diamonsil C18（2）（5 μm，250x4.6 mm），10μL进行HPLC分析，流动相为乙腈：水（1：1），0.9mL/min，检测波长542nm。放线紫红素标准品的ε =18600。

实施例2：利用ORF4基因提高吸水链霉菌中洋橄榄叶素产量的方法

1）包含ORF4基因的重组质粒pZMY9-3的构建（同实施例1）

2）将重组质粒pZMY9-3通过接合转移的方法导入吸水链霉菌ATCC29253中（同实施例1）

获得含有ORF4的吸水链霉菌ZMY2，同时导入空载pMSB-WS052命名为ATCC29253-CK做对照。

3）ZMY2的抗生素测定

将ZMY2及对照ATCC29253使用洋橄榄叶素发酵培养基培养7d，250rpm，30℃。离心后去上清，将菌丝体使用丙酮萃取，减压蒸干后用甲醇溶解，使用枯草芽孢杆菌进行生物活性测定（方法见下文）。ZMY2较对照的抑菌活性有明显提高（图8）。同时将萃取液进行HPLC分析，得到两个最大吸收波长为253nm的峰，其积分面积有明显提高。其中峰1经过LC-MS分析，能检测到m/z=1047.5855[M+Na]+离子，符合文献报道的洋橄榄叶素的质谱信息（J. Nat. Prod.1998, 61, 1337-1339，Michael Ritzau）；峰2能检测到m/z=1061.6010[M+Na]+离子，参照该文献为洋橄榄叶素的甲基化衍生物。以上实验说明ZMY2较出发菌株ATCC29253而言洋橄榄叶素及其甲基化衍生物产量均有提高。

表3：ATCC29253-CK与基因工程菌ZMY2的洋橄榄叶素产量比较

①洋橄榄叶素发酵培养基：20g棉籽粉，5g酵母提取物，1g K₂HPO₄，1gKH₂PO₄，5g NaCl，20g葡萄糖，1L水，自然PH，121℃高压灭菌30分钟。

②生物活性测定：挑取枯草芽孢杆菌单菌落，使用5mL LB过夜培养，第二天取0.1mL新鲜菌液加入15mL50℃左右的软琼脂中混匀，倒平板，凝固后使用。使用打孔器将滤纸剪成圆形，取5μL甲醇萃取液加在其上，自然风干后放在软琼脂上，37℃培养8h观察。

③软琼脂：胰蛋白胨 10g，酵母抽提物 5g，NaCl 5g，琼脂10g，加蒸馏水至 1000ml，pH7.0。于121℃灭菌30分钟。

④洋橄榄叶素发酵及分析：取50μL吸水链霉菌孢子加入发酵培养基中培养7d，250rpm，30℃。3000r/min离心20min，离心后去上清，将菌丝体使用丙酮萃取，减压蒸干后用甲醇溶解。检测条件如下：色谱柱为Diamonsil C18（2）（5 μm，250x4.6 mm），10μL进行HPLC分析，流动相为：A:B-45:55 to 5:95，A:0.01M NH₄Ac含有10% (vol/vol) CH₃CN and 0.001% (vol/vol)三氟乙酸，B:0.01M NH₄Ac含有90% (vol/vol) CH₃CN and 0.001% (vol/vol)三氟乙酸，1.0 ml/min，检测波长：253nm。

实施例3：利用ORF4基因提高棒状链霉菌中头霉素C的产量

1）包含ORF4基因的重组质粒pZMY9-3的构建（同实施例1）

2）将重组质粒pZMY9-3通过接合转移的方法导入棒状链霉菌NRRL3585中（同实施例1）

获得含有ORF4的吸水链霉菌ZMY3，同时导入空载pMSB-WS052命名为NRRL3585-CK做对照。。

3）ZMY3的抗生素测定

将ZMY3及对照野生型菌株NRRL3585使用头霉素C发酵培养基培养，使用枯草芽孢杆菌进行生物活性测定（方法见下文）。ZMY3较对照野生型菌株NRRL3585的抑菌活性有明显提高（图11）。同时将发酵液进行HPLC分析，得到一个最大吸收波长为263nm的峰，其积分面积有明显提高，经过LC-MS分析，检测到m/z=447.1184[M+H]+的离子，符合文献（2007-pcd Mutants of Streptomyces clavuligerus Still Produce Cephamycin C）报道的头霉素C质谱信息，以上实验说明ZMY3较出发菌株NRRL3585而言头霉素C产量有明显提高。

表4：NRRL3585-CK与基因工程菌ZMY3的头霉素C产量比较

①头霉素C发酵用种子培养基：甘油1.0g，蔗糖2.0g，胰蛋白胨0.5g，酵母提取物0.1g，蛋白胨1.5g，Na₂HPO₄ 0.02g，pH6.5~6.8，40mL/瓶，26℃，220r/min，22h。

②头霉素C发酵用发酵培养基：K₂HPO₄ 5.7g，玉米淀粉10.0g，蛋白胨10.0g，微量元素(FeSO₄ MnCl₂ ZnSO₄ CaCl₂均为1g.L^-1)1.0mL，pH6.8，40mL/瓶，26℃， 220r/min ，84h。

③生物活性测定：取100μL发酵液加入放于含有枯草芽孢杆菌软琼脂的牛津杯中，37℃培养8h后观察。

④头霉素C发酵及分析：取发酵液3000r/min离心20min，上清液用孔径0.45μm的滤膜过滤，得到样品溶液。检测条件如下：色谱柱为Diamonsil C18（2）（5 μm，250x4.6 mm），10μL上样，流动相10%甲醇，流速：0.9mL/min，检测波长：263nm。

Claims (4)

1.硫藤黄链霉菌抗生素调控基因ORF4在制备抗生素高产链霉菌基因突变株中的应用，所述硫藤黄链霉菌抗生素调控基因ORF4的核苷酸序列为SEQ IDNO：1所示，或与SEQ ID NO：1所示核苷酸编码相同蛋白的核苷酸序列。

2.一种使用硫藤黄链霉菌抗生素调控基因ORF4提高链霉菌抗生素产量的方法，其步骤是：1）从链霉菌的基因组文库中筛选得到包含抗生素调控基因ORF4的片段，将该片段克隆到连有启动子的载体上，得到含有ORF4基因的重组质粒；2）利用链霉菌接合转移的方法将含有ORF4基因的重组质粒导入抗生素产生菌中；3）通过抗生素筛选得到包含ORF4基因的抗生素产生菌重组菌株；4）对步骤3）得到的重组菌株进行抗生素测定，得到抗生素高产的链霉菌菌株，

所述硫藤黄链霉菌抗生素调控基因ORF4的核苷酸序列为SEQ ID NO：1所示，或与SEQ ID NO：1所示核苷酸编码相同蛋白的核苷酸序列。

3.根据权利要求2所述的提高链霉菌抗生素产量的方法，其中所述的链霉菌是硫藤黄链霉菌。

4.根据权利要求2或3所述的提高链霉菌抗生素产量的方法，其中所述的抗生素产生菌为变铅青链霉菌或棒状链霉菌或吸水链霉菌。