CN104357506B - 增加前体物供应以提高盐霉素发酵水平的方法 - Google Patents

Abstract

一种增加前体物供应以提高盐霉素发酵水平的方法，是通过整合型载体pSET152在白色链霉素DSMZ41398(Streptomyces albus DSMZ41398)染色体上分别加倍来源于天蓝色链霉菌的乙酰辅酶A羧化酶基因，来源于自身的甲基丙二酰辅酶A变位酶基因和来源于自身的巴豆酰辅酶A还原酶基因，来增加盐霉素合成中所需三种前提物质的供应，实现盐霉素产量的提高。本发明所得到工程菌株盐霉素的发酵终产量提高260％，实验室摇瓶水平达到2g/L。

Description

增加前体物供应以提高盐霉素发酵水平的方法

技术领域

本发明涉及生物工程技术，特别涉及一种增加前体物供应以提高盐霉素发酵水平的方法。

技术背景

放线菌是一类高GC含量的革兰氏阳性菌，目前已知抗生素中有60％以上是由放线菌合成。链霉菌是一类高等放线菌，具有强大的抗生素合成能力和复杂的形态分化，故一直受到人们的关注。聚酮类化合物是一类由放线菌产生的重要的次级代谢产物，其在抗肿瘤、抗寄生虫、抗生素领域都有极其重要的应用。前期的实验已经证明，聚酮类化合物的生物合成主要依赖I型、II型和III型聚酮生物合成基因簇，其主要使用的前体物是乙酰辅酶A、丙二酰辅酶A、甲基丙二酰辅酶A、乙基丙二酰辅酶A等等。

盐霉素属于聚醚类抗生素，是由白色链霉菌(Streptomyces albus)产生的。盐霉素具有广泛的抗球虫谱，50mg/kg就有显著的抑制作用。此外，盐霉素也能够抑制大多数革兰氏阳性菌的生长。盐霉素作用的机理同其它聚醚类抗生素相同为钠钾离子的螯合载体，通过结合钠钾离子改变细胞离子梯度，导致细胞死亡。1979年日本就批准使用盐霉素作为抗球虫病药物。1987年欧共体批准使用盐霉素作为球虫抑制剂和生长促进剂。自1993年经我国农业部批准后，盐霉素作为鸡球虫抑制剂和饲料添加剂被广泛的应用于家禽业和畜牧业。目前，研究人员又发现盐霉素能够高效且特异性的杀死上皮肿瘤干细胞，其活性是目前临床上应用的紫杉醇的100倍，这引发了国际上对盐霉素的研究热潮。鉴于盐霉素的重要性，本申请人的微生物代谢国家重点实验室在2011年鉴定完成了盐霉素生物合成基因簇，2012年完成了其产生菌白色链霉素DSMZ41398(Streptomyces albus DSMZ41398)的全基因组测序。通过对基因组进行分析，我们发现DSMZ41398中存在着完整的三种前体(丙二酰辅酶A、甲基丙二酰辅酶A和乙基丙二酰辅酶A)的生物合成途径，但是部分关键酶只有一个拷贝且不具有特别突出的转录活性，这暗示着菌体内前体物的供应并没有处于很高的水平，盐霉素的生产能力可能受到前体物供应的制约。

通过文献调研，发现前体物的充足供应会影响到聚酮链的延生，进而影响聚酮类化合物的最终产量。在天蓝色链霉菌中，通过加倍乙酰辅酶A羧化酶基因可以使放线紫红素产量提高6倍；在棒状链霉菌CKD1119中，通过加倍甲基丙二酰辅酶A变位酶可以使F靠06产量提高2倍；然而对于白色链霉菌DSMZ41398来说，是否可以通过加倍前体合成途径中的限速基因，使得菌体可以产生更多的前体，进而提高抗生素的发酵水平并不清楚。为此，本发明尝试通过分别加倍三个前体合成途径中的限速步骤基因来提高盐霉素的产量，为盐霉素工业化规模的扩大和生产成本的降低提供有效的参考。

发明内容

本发明的目的，在于提供一种通过增加前体物供应以提高盐霉素发酵水平的方法。

为了实现本发明的目的，本发明采用了以下技术方案：

一种增加前体物供应以提高盐霉素发酵水平的方法，是通过整合型载体pSET152在白色链霉素DSMZ41398(Streptomyces albus DSMZ41398)染色体上分别加倍来源于天蓝色链霉菌的乙酰辅酶A羧化酶基因、来源于自身的甲基丙二酰辅酶A变位酶基因和来源于自身的巴豆酰辅酶A还原酶基因，使盐霉素在发酵中的产量得到提高；

所述乙酰辅酶A羧化酶基因的序列如SEQ ID NO.1所示；所述甲基丙二酰辅酶A变位酶基因的序列如SEQ ID NO.2所示；所述巴豆酰辅酶A还原酶基因的序列如SEQ ID NO.3所示。

所述加倍的构建步骤如下：

第一步：设计并构建用于加倍来源于天蓝色链霉菌的乙酰辅酶A羧化酶基因的整合型质粒载体I；

第二步：设计并构建用于加倍来源于DSMZ41398的甲基丙二酰辅酶A变位酶基因的整合型质粒载体II；

第三步：设计并构建用于加倍来源于DSMZ41398的巴豆酰辅酶A还原酶基因的整合型质粒载体III；

第四步：将上述三步构建得到的质粒载体I、II、III结合转移导入受体菌白色链霉素DSMZ41398中进行同源重组；

第五步：通过对突变株的筛选和验证阿伯拉霉素抗性验证超量表达特定基因的突变株。

所述的质粒载体I的构建方法是在质粒pIB139的NdeI/EcoRI位点插入来自天蓝色链霉菌的3.67kb的乙酰辅酶A羧化酶基因PCR片段NdeI/EcoRI；所述的质粒载体II的构建方法是在质粒pIB139的NdeI/EcoRI位点插入来自DSMZ41398的4.17kb的甲基丙二酰辅酶A变位酶基因PCR片段NdeI/EcoRI；所述的质粒载体III的构建方法是在质粒pIB139的NdeI/EcoRI位点插入来自DSMZ41398的1.37kb的巴豆酰辅酶A还原酶基因PCR片段NdeI/EcoRI。

所述的发酵是指将链霉菌孢子或者菌丝体在TSBY培养基中于33℃、220转/分钟的转速下培养36～48小时后，转接到种子培养基，于33℃、220转/分钟的转速下培养16～20小时后，再转接到发酵培养基发酵9天。

所述TSBY培养基含有：TSB 3％，酵母提取物0.5％，蔗糖10.3％；所述种子培养基含有：葡萄糖4％，黄豆饼粉3％，酵母提取物1％，碳酸钙0.2％；所述发酵培养基含有：胚芽粉0.8％，黄豆饼粉0.5％，氯化钾0.22％，氯化钠0.1％，尿素0.16％，酒石酸0.2％，硫酸镁0.01％，磷酸氢二钾0.01％，碳酸钙0.5％，大豆油15％。

所述的转接到种子培养基是将TSBY培养物按照3％的接种量转接于种子培养基，所述的转接到发酵培养基是将种子培养物按照10％的接种量转接于发酵培养基。

采用本发明的方法，可以增加菌体内总的前体物的供应，进而提高用于盐霉素合成的前体供应以此来提高盐霉素发酵，最终乙酰辅酶A羧化酶加倍突变株的盐霉素发酵产量提高幅度最大，达到260％以上，最终产量达到2.0g/L，可显著提高盐霉素的发酵产量，同时使发酵成本大幅降低。

本发明所涉及的菌株白色链霉菌DSMZ41398已经在SCI数据库文献《YurkovichME,Tyrakis PA,Hong H,Sun Y,Samborskyy M,Kamiya K,Leadlay PF:A late-stageintermediate in salinomycin biosynthesis is revealed by specific mutation inthe biosynthetic gene cluster..Chembiochem 2012,Jan 2；13(1):66-71》中公开。

本发明所涉及的质粒pIB139已经在SCI数据库文献《Wilkinson CJ,Hughes-Thomas ZA,Martin CJ, I,Mironenko T,Deacon M,Wheatcroft M,Wirtz G,Staunton J,Leadlay PF.:Increasing the efficiency of heterologous promoters inactinomycetes.J Mol Microbiol Biotechnol 2002,Jul；4(4):417-26.》中公开。

附图说明

图1为乙酰辅酶A羧化酶基因(pLQ59)、甲基丙二酰辅酶A变位酶基因(pLQ61)和巴豆酰辅酶A还原酶基因(pLQ60)加倍质粒构建流程；

图2为加倍突变株半定量PCR的结果；

图3为加倍突变株与空载对照的盐霉素发酵产量示意图。

具体实施方法

以下实例将结合附图对本发明进一步作说明。本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，并给出了详细的实施方式和过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。下列实施例中未注明具体条件的实验方法的，按照常规条件或制造厂商的建议条件。

实施例

步骤一：质粒pLQ59、pLQ60和pLQ61的构建

以天蓝色链霉菌基因组DNA为模板，分别使用两组引物accA2-F/R和accBE-F/R通过PCR扩增得到乙酰辅酶A羧化酶的两个亚基accA2(1802bp)和accBE(1839bp)，通过基因测序确认序列的正确性。在质粒pIB139的NdeI/EcoRI位点插入accA2(NdeI/HindIII)和accBE(HindIII/EcoRI)，通过上述方法得到用于乙酰辅酶A羧化酶加倍的质粒pLQ59。在37摄氏度水浴条件下，采用NdeI，HindIII和EcoRI三种限制性内切酶进行酶切处理可以观察到1802bp和1839bp的两条目标条带，表明质粒构建正确。

以白色链霉菌DSMZ41398基因组DNA为模板，使用引物ccr-F/R通过PCR扩增得到巴豆酰辅酶A还原酶基因ccr(1338bp)，通过基因测序确认序列的正确性。在质粒pIB139的NdeI/EcoRI位点插入ccr(NdeI/EcoRI)，通过上述方法得到用于巴豆酰辅酶A还原酶加倍的质粒pLQ60.在37摄氏度水浴条件下，采用NdeI和EcoRI两种限制性内切酶进行酶切处理可以观察到1338bp的目标条带，表明质粒构建正确。

由于甲基丙二酰辅酶A变位酶基因由两个相邻的亚基mutA和mutB组成，但是其长度太长不容易PCR，所以选择序列中的天然酶切位点将其分成三部分PCR扩增随后再拼接。以白色链霉菌DSMZ41398基因组DNA为模板，使用引物mcm-I-F/R、mcm-II-F/R和mcm-III-F/R通过PCR扩增得到甲基丙二酰辅酶A变位酶基因的三个片段，通过基因测序确认序列的正确性。在质粒pIB139的NdeI/EcoRI位点插入mcm-I(NdeI/BamHI)、mcm-II(BamHI/BsrGI)和mcm-III(BsrGI/EcoRI)，通过上述方法得到用于甲基丙二酰辅酶A变位酶加倍的质粒pLQ61。在37摄氏度水浴条件下，采用NdeI和EcoRI两种限制性内切酶进行酶切处理可以观察到4.9kb的目标条带，表明质粒构建正确。

步骤二：将用于插入染色体中整合位点的整合质粒pLQ59、pLQ60、pLQ61和空载质粒导入野生型菌株DSMZ41398，并筛选得到具有阿伯拉霉素抗性的突变株，这些突变株表征了三个限速酶：乙酰辅酶A羧化酶、甲基丙二酰辅酶A变位酶和巴豆酰辅酶A还原酶的分别加倍。

基因加倍的具体操作如下：将已构建完成用于基因缺失的质粒pLQ59转化进入宿主ET12567(含有pUZ8002质粒)中。取ET12567于含有Amp，Kan和Chl三种抗生素的LB中于37℃过夜培养，用相同的培养基，将过夜培养物按10％的比例转接一次并培养2.5小时，然后用新鲜的LB溶液漂洗菌体以除去培养物中的抗生素。于此同时制备野生型菌株DSMZ41398的新鲜孢子约109个，用TES溶液漂洗2～3次之后再用2mLTES溶液悬浮孢子，于50℃热激10min后再冷却至室温，等体积加入2×孢子预萌发培养液后于37℃培养3小时。将预萌发的孢子液与之前制备的宿主菌ET12567混合(孢子和宿主菌的比例约为10：1)均匀后涂布于SFM平板，待平板吹干后转移至30℃培养箱正置培养17小时后取出平板，分别取阿伯拉霉素和萘啶酮酸两种抗生素的储存液40μL和12μL加入1.5mL无菌水中混匀后覆盖在SFM平板上，将平板晾干后转移至30℃培养箱中培养。一般3～5天后可见平板上有单菌落结合子长出，通过菌丝体PCR和抗性验证的方法验证结合子，其中乙酰辅酶A羧化酶基因加倍的突变株采用acc-C-F/acc-C-R为引物进行PCR验证，甲基丙二酰辅酶A变位酶基因加倍的突变株采用mcm-C-F/mcm-C-R为引物进行PCR验证，巴豆酰辅酶A还原酶基因加倍的突变株采用ccr-C-F/ccr-C-R为引物进行PCR验证。

上述步骤中所用到的引物序列如表1所示

表1

用于基因片段制备PCR反应体系和条件：DNA模板30ng，引物30pmol，50％DMSO 3μL，25mM Mg²⁺2μL，缓冲液3μL，KOD聚合酶1个单位，加纯水补齐至30μL；PCR条件：95摄氏度5分钟；95摄氏度30秒；60摄氏度30秒；68摄氏度2分；循环30次；68摄氏度10分钟。

基因加倍的结合转移子和突变株筛选时的PCR体系和条件：DNA模板10～100ng，引物30pmol，50％DMSO 3μL，缓冲液3μL，Taq聚合酶0.5个单位，加纯水补齐至30μL，；PCR条件：95摄氏度5分钟；95摄氏度30秒；58摄氏度30秒；72摄氏度1分钟；循环30次；72摄氏度10分钟。

步骤三，基因加倍菌株的发酵培养

TSBY培养基含有：TSB 3％，酵母提取物0.5％，蔗糖10.3％；种子培养基含有：葡萄糖4％、黄豆饼粉3％、酵母提取物1％、碳酸钙0.2％；发酵培养基含有：胚芽粉0.8％、黄豆饼粉0.5％、氯化钾0.22％、氯化钠0.1％、尿素0.16％、酒石酸0.2％、硫酸镁0.01％、磷酸氢二钾0.01％、碳酸钙0.5％、大豆油15％；

步骤四，基因加倍菌株中加倍基因转录水平的测定(半定量PCR)

用于RNA提取的样品一般都保存在Redzoll溶液中。RNA提取过程要求低温，离心过程除特殊说明，均在4℃12000转/min的条件下进行。取已经破碎处理的样品500μL加入100μL氯仿涡旋振荡混匀，离心15min后吸取上清液，加入100μL无水乙醇并混匀后将样品吸入离心柱(赛百盛)中，静置2min，离心1min，弃液体，用漂洗液(Washing buffer，赛百盛)漂洗两次，弃液体，将离心柱置于收集管中继续离心2min。换用新的收集管，往离心柱中加入60μLDEPC处理过的水，离心2min，将RNA样品从离心柱上洗脱下来。用Nanodrop 2000型核酸蛋白分析仪测定RNA的浓度和OD260/280，提取后的RNA样品-80℃保存。RNA样品的消化反应体系置于37℃孵育4小时后每个反应体系加入5μL 50mM EDTA后65℃加热10min即可终止消化，消化好的RNA样品-80℃保存。RNA经过逆转录后就得到cDNA，可用于后续的基因转录分析。

取cDNA样品用DEPC处理水稀释至合适的浓度，取相同体积的cDNA模板进行PCR扩增，使用引物hrdB-RT-F/hrdB-RT-R扩增hrdB基因作为内参，使用引物acc-RT-F/acc-RT-R扩增部分乙酰辅酶A羧化酶基因，引物mcm-RT-F/mcm-RT-R扩增部分甲基丙二酰辅酶A变位酶基因，引物ccr-RT-F/ccr-RT-R扩增部分巴豆酰辅酶A还原酶基因作为半定量PCR检测的目标。PCR结束之后取相同体积的PCR产物进行凝胶电泳，EB染色之后在紫外灯下观察PCR产物的亮度，可以半定量的表征被检测基因的转录水平。半定量PCR体系和条件：cDNA模板50ng，引物30pmol，50％DMSO 3μL，缓冲液3μL，Taq聚合酶0.5个单位，加纯水补齐至30μL，；PCR条件：95摄氏度5分钟；95摄氏度30秒；60摄氏度30秒；72摄氏度1分钟；循环30次；72摄氏度10分钟。反应结束之后取10μLPCR产物电泳检测比对条带亮度。

测定基因转录水平时使用的引物如表2所示

表2

图2为基因加倍突变株与空载对照的加倍基因半定量PCR结果。结果表明突变株和空载对照相比，作为内参的hrdB基因条带亮度基本一致，而目的基因在加倍突变株中的亮度要远远高于空载对照，说明上述三个基因都已经被成功加倍。

步骤五，利用HPLC检测盐霉素的发酵产量

使用Agilent公司的Agilent 1200系列HPLC进行色谱分析，采用DAD二极管阵列检测器测定210nm下的色谱吸收峰。色谱柱的参数为：Agilent TC-C18,4.6×250mm,5μm；流动相流速为1mL/min；流动相：8％(v/v)的2％的乙酸水溶液和92％(v/v)的HPLC级乙腈。柱温：室温。

图3为基因加倍突变株、野生型菌株DSMZ41398和空载对照菌株盐霉素发酵水平检测。结果表明三个突变株的产量均有不同幅度的提高，其中以乙酰辅酶A羧化酶基因加倍的突变株产量提升最为明显，和空载对照相比产量提高了260％，实验室摇瓶发酵盐霉素终产量达到2.0g/L。此外，甲基丙二酰辅酶A变位酶基因加倍突变株产量提高183％，终产量达到1.6g/L，巴豆酰辅酶A还原酶基因加倍突变株产量提高63％，终产量达到0.9g/L。

Claims (4)

1.一种增加前体物供应以提高盐霉素发酵水平的方法，是通过整合型载体pSET152在白色链霉菌DSMZ41398(Streptomyces albus DSMZ41398)染色体上分别加倍来源于天蓝色链霉菌的乙酰辅酶A羧化酶基因、来源于自身的甲基丙二酰辅酶A变位酶基因和来源于自身的巴豆酰辅酶A还原酶基因，使盐霉素在发酵中的产量得到提高；

所述乙酰辅酶A羧化酶基因的序列如SEQ ID NO.1所示；所述甲基丙二酰辅酶A变位酶基因的序列如SEQ ID NO.2所示；所述巴豆酰辅酶A还原酶基因的序列如SEQ ID NO.3所示；

所述加倍的构建步骤如下：

第一步：设计并构建用于加倍来源于天蓝色链霉菌的乙酰辅酶A羧化酶基因的整合型质粒载体I；

第二步：设计并构建用于加倍来源于DSMZ41398的甲基丙二酰辅酶A变位酶基因的整合型质粒载体II；

第三步：设计并构建用于加倍来源于DSMZ41398的巴豆酰辅酶A还原酶基因的整合型质粒载体III；

第四步：将上述三步构建得到的质粒载体I、II、III结合转移导入受体菌白色链霉菌DSMZ41398中进行同源重组；

第五步：通过对突变株的筛选和验证阿伯拉霉素抗性验证超量表达特定基因的突变株；

所述的质粒载体I的构建方法是在质粒pIB139的NdeI/EcoRI位点插入来自天蓝色链霉菌的3.67kb的乙酰辅酶A羧化酶基因PCR片段NdeI/EcoRI；所述的质粒载体II的构建方法是在质粒pIB139的NdeI/EcoRI位点插入来自DSMZ41398的4.17kb的甲基丙二酰辅酶A变位酶基因PCR片段NdeI/EcoRI；所述的质粒载体III的构建方法是在质粒pIB139的NdeI/EcoRI位点插入来自DSMZ41398的1.37kb的巴豆酰辅酶A还原酶基因PCR片段NdeI/EcoRI。

2.根据权利要求1所述增加前体物供应以提高盐霉素发酵水平的方法，其特征在于：所述的发酵是指将链霉菌孢子或者菌丝体在TSBY培养基中于33℃、220 转/分钟的转速下培养36～48小时后，转接到种子培养基，于33℃、220转/分钟的转速下培养16～20小时后，再转接到发酵培养基发酵9天。

3.根据权利要求2所述增加前体物供应以提高盐霉素发酵水平的方法，其特征在于：所述TSBY培养基含有：TSB 3％，酵母提取物0.5％，蔗糖10.3％；所述种子培养基含有：葡萄糖4％，黄豆饼粉3％，酵母提取物1％，碳酸钙0.2％；所述发酵培养基含有：胚芽粉0.8％，黄豆饼粉0.5％，氯化钾0.22％，氯化钠0.1％，尿素0.16％，酒石酸0.2％，硫酸镁0.01％，磷酸氢二钾0.01％，碳酸钙0.5％，大豆油15％。

4.根据权利要求2所述增加前体物供应以提高盐霉素发酵水平的方法，其特征在于：所述的转接到种子培养基是将TSBY培养物按照3％的接种量转接于种子培养基，所述的转接到发酵培养基是将种子培养物按照10％的接种量转接于发酵培养基。