CN101418276B - 一种宿主细胞及其用于重组蛋白高效分泌表达的方法 - Google Patents

Abstract

一种宿主细胞及其用于重组蛋白高效分泌表达的方法，属于微生物工程和发酵工程领域。本发明提供了一种地衣芽孢杆菌宿主细胞CBB3008，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO：M 208236。本发明将通过基因克隆技术获得的工业酶制剂的表达质粒转化入此宿主细胞中，在此宿主细胞中高效合成工业酶制剂，再通过此宿主细胞的蛋白分泌系统，将合成的酶蛋白高效分泌到培养基中，可以引导工业酶制剂的高效、分泌生产。由此有助于降低工业酶制剂的发酵制造成本、简化发酵制造工艺以及降低发酵工业环境压力。本发明的宿主细胞筛选与遗传改良方法，也可以用于其它类型的宿主细胞，特别是枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌等宿主细胞的选育。

Description

一种宿主细胞及其用于重组蛋白高效分泌表达的方法

技术领域

本发明为一种用于重组蛋白高效分泌表达的芽孢杆菌宿主细胞。本发明中的宿主细胞为通过微生物菌种选育获得的芽孢杆菌。本发明的宿主细胞可以满足重组蛋白的高效合成并将合成的重组蛋白分泌到培养基中。本发明的宿主细胞高效制备的重组蛋白为具有工业应用价值的酶，进一步为具有淀粉水解活性的α-淀粉酶、植酸酶等大宗酶制剂。本发明属微生物学和发酵工程领域。

背景技术

从自然界获得的重要蛋白质，如酶、生物活性多肽、药用蛋白等，由于在自然条件下含量低，往往达不到商业开发价值，需要对其进行高效、低成本制备。实现这些重要蛋白质的高效、低成本制备的主要方法之一是，通过基因克隆技术，将这些重要蛋白质的编码基因在合适的表达宿主细胞中进行高效表达。由此获得的基因表达产物，即为重组蛋白。

基因表达宿主细胞(简称宿主细胞)是指，从自然界获得的或通过实验室操作获得的、能够满足特定基因的转录与翻译、并能将基因产物以一定形式和一定水平生产出、并保证所表达出的基因产物具有原蛋白质相似生物学活性与性能的生物体。

用于重组蛋白表达与制备的生物体可以是动物、植物或微生物。由于微生物细胞具有生长速度快、营养要求简单、易于遗传操作以及最重要的一点是能够进行大规模的人工培养，因此，微生物细胞是目前为止最主要的宿主细胞。

重组蛋白的分泌表达是指，重组蛋白的表达体系(表达载体与表达宿主细胞)能够引导所表达的重组蛋白实现跨膜运输，重组蛋白被运送到细胞膜外并被释放到培养环境(培养基)中。这就要求：1)宿主细胞具有完善的蛋白分泌与蛋白释放的能力与物质基础；2)所表达重组蛋白具有被宿主细胞蛋白分泌系统所识别与加工的标识。前者毫无疑问由所采用的宿主细胞决定；后者则由重组蛋白表达单元与宿主细胞共同决定。可见，实现重组蛋白分泌表达的决定性因素是宿主细胞。目前，应用于重组蛋白表达的常用基因表达宿主细胞大肠杆菌，仅有较弱的将重组蛋白分泌到其周质空间的能力，不能将其分泌到培养基中。因此，必须通过细胞裂解过程释放重组蛋白。另外一种已实现多种工业应用的宿主细胞为毕赤氏酵母，可以利用能够被其自身蛋白分泌识别系统所识别的、来源于酿酒酵母的α因子信号肽，引导重组蛋白的分泌。这是目前已报导的较好的重组蛋白分泌表达系统，但对大多数来源于细菌的蛋白的表达能力明显有限。

作为重组蛋白表达的微生物宿主细胞可以是直接通过自然筛选，从自然界中获得，也可以通过实验室技术改良现有微生物保藏物的若干生理、生化与遗传性能获得。大肠杆菌及其衍生菌株(如大肠杆菌JM109)、酵母及其衍生菌株(如毕赤氏酵母GS115)等都是目前常用的宿主细胞。大肠杆菌宿主细胞表达重组蛋白的水平，可以达到菌体蛋白总量的30％以上(Terpe.Appl MicrobiolBiotechnol，2006)；缺点是重组蛋白以不溶状态(包涵体)存在于细胞内，需要复杂的下游提取、纯化与复性等过程，才能制备出合格的重组蛋白。因此，大肠杆菌宿主细胞一般仅适用于实验室研究目的和高附加值药用蛋白的生产目的，不适用面广量大的工业酶制剂的生产。酵母宿主细胞表达重组蛋白的最高水平可以达到10mg/mL发酵液(Cregg JM，et al.Molecular Biotechnology，2000)，最大优点是能够在较高表达水平下，进行重组蛋白的分泌表达。不足之处是，与其它所有宿主细胞一样，酵母宿主细胞不能满足绝大多数重组蛋白的高效、分泌表达；另一个缺点是培养时间较长、生产过程中需要有害物质如甲醇的不断诱导。因此，其它类型的微生物宿主细胞的研究仍然是具有重要价值，并且在某种程度上是必需的。

除了上述描述的大肠杆菌和酵母宿主细胞，微生物宿主细胞的研究还包含有：枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、假单胞菌、黑曲霉、米曲霉等。

具有工业应用属性的宿主细胞，特别是运用于满足高效率、低成本、规模化生产要素的大宗工业酶制剂生产的宿主细胞，一般应具有如下基本特征：1)生物安全性菌株(即所为：General Regard As Safe，GRAS)；2)营养要求简单，培养条件不复杂；3)具有较强蛋白合成与分泌能力；4)可以进行遗传操作并且遗传稳定；5)可以进行大规模工业化培养与操作；6)产物分离容易；等。

在芽孢杆菌属中，解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloquefaciens)，萎缩芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus)，地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)，短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)传统上被认为是生理特征相似的5个种，但通过DNA同源性分析，可以很容易将它们区分开来。地衣芽孢杆菌与萎缩芽孢杆菌的DNA相似性大约为8％，与其亲缘关系最近的解淀粉芽孢杆菌的DNA相似性在9-15％。r-RNA小亚基序列可以将这5个种区分开来。利用地衣芽孢杆菌的厌氧生长能力、精氨酸脱水酶生产、淀粉水解以及利用丙酸为惟一碳源生长等特性，也可以将此与枯草芽孢杆菌区分开来。

地衣芽孢杆菌为革兰氏阳性、内生芽孢、好氧型杆菌，广泛分布于自然界。土壤是其最主要的栖息地，是营养贫瘠土壤的优势菌群。地衣芽孢杆菌也常常存在于天然农业产品及其加工获得的食物中。地衣芽孢杆菌被公认为是非人类致病菌。地衣芽孢杆菌不同菌株间的性能存在较大不同，其中一些菌种已经育种成功用于工业酶制剂、生物聚合材料、药物生物素等重大产品的工业化生产。它的代表性菌株(实验菌株)ATCC14580(DSM13)的基因组已经得到解析(VeithB，etal.J Mol Biotechnol，2004)。

1972年，地衣芽孢杆菌已被大规模应用于淀粉酶的发酵生产，1981年，《食品化学品索引》(Food Chemicals Codex)将地衣芽孢杆菌列为食品加工用淀粉酶和蛋白酶的来源。1981年，由地衣芽孢杆菌生产的淀粉水解酶和蛋白酶被美国FDA鉴定为GRAS级，在其补充说明中强调，“地衣芽孢杆菌是一种被普遍认知的多种食品中存在的常见微生物，没有任何有关食品存在此种微生物与任何毒性或致病性相关的报道”。1989年，丹麦卫生部在世界上首次给予基因重组地衣芽孢杆菌菌株工业应用的生产许可和环境认证并宣布重组地衣芽孢杆菌菌株满足“优良工业性大规模生产(Good Industrial Large Scale Production organisms，GILSP organisms)”生物体的所有要求。1988年，美国国立卫生研究院(NIH)在其《重组DNA分子研究准则》中部分豁免了有关地衣芽孢杆菌宿主/载体系统有关限制，让地衣芽孢杆菌生物安全地位与枯草芽孢杆菌相似。1991年，NIH修补了其1988年发布的《重组DNA分子研究准则》，引入了与GILSP标准相同的GLSP(Good Large-Scale Practice，优良大规模实践)标准，用于指导和规范研究与生产中的重组微生物的大规模培养。1987年起，多个重组地衣芽孢杆菌得到美国环保署的生产许可。1988年，日本国际贸易与工业厅也批准了重组地衣芽孢杆菌的生产许可。

2004年，国际上两个独立研究小组几乎同时报道了有关地衣芽孢杆菌模式菌株ATCC14580(DSM13)基因组研究工作，以Veith等(Veith B，et al.J MolBiotechnol，2004)的研究小组的研究结果更为准确。地衣芽孢杆菌DSM13基因组特征为：单一环状染色体，大小为4,222,748bp(ATCC14580大小为4,222,336bp)，G+C含量为46.2％，含有4286个开放阅读框，72个tRNA基因，7个rRNA操纵子和20个转座酶基因。与枯草芽孢杆菌基因组极具相同之处，有80％的编码序列与枯草芽孢杆菌相似，但无论在基因组序列还是功能水平上皆含有与枯草芽孢杆菌完全不同的插入区域。地衣芽孢杆菌DSM13含有非常保守的蛋白分泌系统，没有聚酮体合成体系，但能形成脂肽性地衣素。该基因组中也显示了乙醛酸途径和厌氧核糖核酸还原酶的存在，解释了地衣芽孢杆菌能够利用乙酸和2，3丁二醇生长并能厌氧代谢葡萄糖的生理特征。

与枯草芽孢杆菌相似，地衣芽孢杆菌DSM13(Veith B，et al.J MolBiotechnol，2004)包含有五种蛋白质分泌途径：Sec型分泌途径、Tat分泌途径、ABC转运途径、Com分泌途径和穿膜途径。Sec途径中，先导蛋白翻译后，其分泌过程能被CsaA或SRP(信号肽识别颗粒)识别，维持合适的结构以刺激SecA蛋白到下一个蛋白。在转运后的短时间内，先导蛋白由信号肽I型酶酶切加工并折叠成成熟蛋白后释放到培养基中。Tat分泌途径的组成成分有TatAD，TatCD，TatAY，TatCY，支持先导蛋白的转运。在转运后，先导蛋白由信号肽I型或II型酶酶切加工，折叠的成熟蛋白释放到培养基中。通过不依赖于Sec的途径来转运后，脂蛋白的先导蛋白被Lgt脂修饰并由脂蛋白信号肽酶LspA(SPase II)酶切。纤毛蛋白共转录过程中的酶切和氨基端甲基化都依赖于ComC，纤毛蛋白包括ComGA、ComEC、ComGF、ComFA、ComEA、ComGG、ComGC、ComGD和ComGE，其帮助先导蛋白的转运。转运后先导蛋白的信号肽被ComC剪切，而先导蛋白在膜的胞内侧被甲基化修饰并且由类似ComC的信号肽酶剪切。ABC转运蛋白的推测分泌途径如下：先导蛋白通过NBD结合到质膜。在被ATP酶如EscA/B或CydD/C剪切后，随着胞膜成分的加工，蛋白分泌出膜外并释放至培养基中。许多不带有信号肽的胞外蛋白在其先导蛋白有跨膜区，它能引导蛋白分泌到胞外或他们整个拓扑结构在膜外。

地衣芽孢杆菌DSM13(Veith B，et al.J Mol Biotechnol，2004)的信号肽可分为五类：由I型信号肽酶(SipS/T/W/V)切割的Sec分泌型信号肽，双精氨酸结构信号肽(Tat信号肽)，由I型信号肽酶(Lip)切割的脂蛋白信号肽，由Com切割的纤毛(Com)信号肽，以及由EscA/B或CydD/C切割的生物信息素(ABC)信号肽。

如上所述，地衣芽孢杆菌菌株及其经过传统遗传改良获得的突变株，已经作为生产菌株在酶制剂工业中使用数十年。这一菌株的最突出性能是其具有极高分泌蛋白质(酶)的能力，其特定酶蛋白的分泌能力可以达到20mg/mL以上(Veith B，et al.J Mol Biotechnol，2004)。

多篇研究报导显示，从枯草芽孢杆菌等来源的质粒以及从地衣芽孢杆菌若干分离菌株中来源的天然质粒，可以在地衣芽孢杆菌中进行复制。从地衣芽孢杆菌中分离获得的质粒也是以RepA为基础，进行滚环复制，并且RepA与枯草芽孢杆菌来源的高度相似(Guglielmetti S，et al.Plasmid，2005)。如在枯草芽孢杆菌中使用的pUB110(Zyprian E，Matzura H.DNA，1986)、pHY300PLK(Ishiwa H，Shibahara SH.Jpn J Genet，1986)、pDG148(Stragier P，et al.Cell，1988)等都可以在地衣芽孢杆菌中较稳定的维持。故，以这类质粒为基础，构建许多枯草芽孢杆菌表达载体原则上皆可以用于地衣芽孢杆菌的遗传操作。

第一篇突出标注为专用于地衣芽孢杆菌的整合型载体见于1998年的报导(Tran LS，et al.Microbiology，1998)。在该报导中，所构建的载体pTLH包含有无启动子的大肠杆菌lacZ基因、pBR322复制原点、卡那霉素抗性选择性标记，以及杆菌肽合成酶操纵子的第一个基因的内侧部分序列用于对地衣芽孢杆菌的染色体整合。特异性整合发生后，重组菌因不能合成杆菌肽，则在藤黄微球菌指示平板上不出现抑菌圈。

地衣芽孢杆菌碱性磷酸酶I编码基因的启动子较早被鉴定为一超强诱导型启动子，并受磷浓度的严谨调控。另一个调控青霉素酶表达的启动子也被鉴定，可以用作引导外源基因的表达。我们以地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因及其上下游序列为基础，成功构建与初步应用了新型分泌表达系统(Niu & Wang.J IndMicrobiol Biotechnol，2007，34：357-362；王正祥牛丹丹。中国发明专利ZL200510081648.7)。其它一些来源于枯草芽孢杆菌的启动子和信号肽序列也可以试用于地衣芽孢杆菌的表达载体的构建。

目的基因拷贝数提高可以有效提高目的基因产物在地衣芽孢杆菌中的表达水平。如，提高碱性蛋白酶编码基因的拷贝数，碱性蛋白酶提高65％(Tang etal.Biotechnol Lett，2004)；角蛋白酶水平在其编码基因拷贝数提高3～5倍时，产酶水平提高了4～6倍(Wang etal.Biotechnol Bioeng，2004)。

另一方面，地衣芽孢杆菌菌株改良也有利于目的分泌蛋白水平的提高。地衣芽孢杆菌芽孢形成所必需基因spoIIAC突变，则其产角蛋白酶水平不变，有利于工业生产目的(Wang et al.J Appl Microbiol，2005)。芽孢形成缺陷突变株不影响其DNA酶、RNA酶、聚半乳糖醛酸裂解酶、蛋白酶和木聚糖酶水平，但葡聚糖内切酶、羧甲基纤维素酶活力有所降低，而延长发酵时间至72h，α-淀粉酶水平降低30％。提示芽孢形成缺陷突变株的不同基因的突变，对不同目的基因的表达的影响会不同(Fleming et al.Appl Environ Microbiol，1995)。提高突变dlt操纵子改变地衣芽孢杆菌细胞壁结构，异源环糊精糖基转移酶分泌水平提高1.5～7倍(Craynest et al.Lett Appl Microbiol，2003)。

对地衣芽孢杆菌所分泌的酶蛋白编码基因(celA，chiA和amyL)进行删除，再通过多拷贝游离质粒载体表达异源淀粉酶基因。研究发现，突变株表达异源淀粉酶的水平明显提高；同时还发现，细胞自身表达的蛋白酶活力也显著提高(Waldeck et al.J Biotechnol.2007)。

综上所述，地衣芽孢杆菌作为重组蛋白的表达宿主细胞具有很多优势，有可能作为重组蛋白，特别是工业酶制剂的重要生产宿主细胞。上述研究也暗示，特定地衣芽孢杆菌菌株的蛋白质分泌能力可能存在一个分泌容量极限。换句话说，不同地衣芽孢杆菌菌株的蛋白质分泌能力是有差异的。这就提示我们，选育出一种具有良好实现大规模发酵生产性能并具有理想蛋白合成与分泌能力的地衣芽孢杆菌是可以实现的，在此基础上完成相关遗传操作获得高效分泌重组蛋白的重组菌，将对工业酶制剂的发酵制造成本的降低、发酵制造工艺的简化以及发酵工业环境压力的降低作出重要贡献。

发明内容

本发明的目的是获得一种具有良好实现大规模发酵生产性能并具有理想蛋白合成与分泌能力的、用于重组蛋白，特别是工业酶制剂的高效分泌表达的宿主细胞。在此基础上完成相关遗传操作获得高效分泌重组蛋白，特别是工业酶制剂的重组菌，由此可降低工业酶制剂的发酵制造成本、简化发酵制造工艺以及降低发酵工业环境压力。

本发明提供了应用于工业酶制剂高效分泌合成的地衣芽孢杆菌菌株CBB3008。运用此菌株可以高效分泌表达多种重要的工业酶制剂，表达水平可以达到15～30mg/mL。

本发明的技术方案：一种宿主细胞，其分类命名为地衣芽孢杆菌Bacilluslicheniformis r^-m^-，CBB3008，巳保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO：M208236。

该宿主细胞，是一种高效、分泌合成工业酶制剂的地衣芽孢杆菌宿主细胞，革兰氏阳性杆菌，不形成芽孢，不形成色素；能够利用葡萄糖、乳糖、蔗糖、木糖、甘油、乙醇、乙酸、淀粉、纤维素在20～50℃、pH5.5～7.8下生长；无内生质粒；其DNA限制性修饰系统编码基因簇被删除，遗传转化方便实现；引导工业酶制剂的高效分泌表达，表达水平达到15～30mg/mL。

所述的宿主细胞，最适生长温度42～45℃，最适生长pH6.8～7.2。

用所述的宿主细胞进行重组蛋白高效分泌表达的方法，在于通过基因克隆技术获得工业酶制剂的表达质粒，并在所述宿主细胞中实现高效分泌表达；在所述宿主细胞中高效合成工业酶制剂，再通过所处宿主细胞的蛋白分泌系统，将合成的酶蛋白高效分泌到培养基中；

1、细菌培养分离与鉴定

自然样本从中国境内采集，共3050份。样本用0.9％NaCl溶液适度稀释，取适量，涂布LB培养基(0.5％酵母膏，1％蛋白胨，0.5％NaCl，pH7.2)后，42℃培养1～5天。单菌落在LB培养基上划线分离获得纯培养物。再按标准方法进行分子鉴定(陈源源等。食品与发酵工业，2007，33(5)：29-31)。必要时在培养基中添加0.01mg/mL四环素或0.005mg/mL卡那霉素。

地衣芽孢杆菌质粒提取、芽孢形成、遗传转化试验、碳源利用试验、生长曲线、色素形成等按文献方法进行(诸葛键王正祥。工业微生物实验技术手册，中国轻工业出版社，1996)。

用于对照的地衣芽孢杆菌工业菌株为：地衣芽孢杆菌CICIM B2004(王正祥等。应用与环境生物学报，2007，13(2)：253-256)或CICIM B0204(牛丹丹等。微生物学报，2006，46(4)：576-580)

2、基因克隆与表达质粒的构建

分子克隆的常规操作(质粒提取、DNA限制性酶切、体外重组、DNA测序等)按文献方法进行(Sambrook等。Molecular Cloning：A Laboratory Manual，1989)。

表达质粒的构建使用表达载体pHY-WZX或pBL-WZX(王正祥，牛丹丹。中国发明专利，z1200510081648；Niu & Wang.J Ind Microbiol Biotechnol，2007)。表达测试用基因为：高温α-淀粉酶编码基因amyL(牛丹丹等。微生物学报，2006，46(4)：576-580)，甘露聚糖酶编码基因manA(王正祥等。应用与环境生物学学报，2007，13(2)：253-256)，植酸酶编码基因NcphyN(王正祥等。中国发明专利，zl200610038936)。

上述基因经限制性酶切后，通过琼脂糖凝胶电泳分离纯化，克隆入表达载体pHY-WZX的EcoRI、KpnI或SmaI位点，获得相应的表达质粒pHY-amyL，pHY-manA或pHY-phyN。

3、地衣芽孢杆菌染色体DNA的提取

地衣芽孢杆菌染色体DNA提取方法按文献进行(诸葛键王正祥。工业微生物实验技术手册，中国轻工业出版社，1994)。

4、地衣芽孢杆菌质粒DNA的提取

按文献介绍的方法改进(诸葛键王正祥。工业微生物实验技术手册，中国轻工业出版社，1994)。细胞裂解后使用Qiagen公司的细菌基因组DNA纯化试剂盒进行。

5、基因扩增

DNA扩增在0.5mL PCR薄壁管中进行。PCR扩增混合物按以下顺序分别加入(单位：μL)。

超纯水              18

10×PCR缓冲液       2.5

dNTPs(2.5mol/L)     2.5

引物1(25pmol/μL)    0.5

引物2(25pmol/μL)    0.5

模板DNA             1

DNA聚合酶           0.3(1U)

PCR扩增条件为：1×(94℃ 5min)；35×(94℃ 10s，56℃ 60s，72℃ 60～300s)；1×(72℃ 10min)。

6、地衣芽孢杆菌电穿孔转化与重组菌的筛选

接种地衣芽孢杆菌CCTCC NO：M208236于2.5mL LB培养基中，过夜培养后，转接入50mL生长培养基(含0.65mol/L山梨醇的LB培养基)中，于37℃培养至OD₆₀₀为0.75-0.85。将菌体在冰水浴中放置10min，于4℃、10000r/min离心10分钟收集菌体。用预冷的EP缓冲液(0.65mol/L山梨醇，0.70mol/L甘露醇和10％甘油)反复洗涤细胞4次。将菌体细胞悬浮于约1mL的预冷EP缓冲液中。取100μL菌体细胞悬浮液分装于1.5mL Eppendorf管中。取1μL重组质粒pHY-amyL，pHY-manA或pHY-phyN的DNA(50ng/μL)，与菌体细胞混匀，移入预冷的电转化池，电击(1600v，5ms)后，加入1mL复苏培养基(含0.65mol/L山梨醇和0.45mol/L甘露醇的LB培养基)，37℃、160r/min培养3h，然后涂布含卡那霉素(0.025mg/mL)或四环素(0.05mg/mL)的LB平板，于37℃培养2～3天。转化子通过测定酶活进行确认。

7、合成的酶蛋白的高效分泌

发酵试验在250mL三角瓶中装30mL发酵培养基(酵母膏0.5～1.5％，蛋白胨1.2～3.6％，葡萄糖8～20％；pH 7.0)，接种重组菌，42℃、220r/min下培养5～7天。发酵试验进一步在15L全自动发酵罐(B.Brawn，瑞士)中进行，工作发酵体积10L，过程中维持溶氧为20％以上，并用硫酸或氨水控制为pH 7.0。定时取样分析。

8、酶活测定：高温α-淀粉酶、植酸酶分别按国家行业标准QB/T2306-97和GB/T 18634-2002进行。甘露聚糖酶按文献进行(王正祥等。应用与环境生物学学报，2007，13(2)：253-256)。

9、其它分析方法

蛋白含量按文献方法进行(Bradford。Anal Chem，1976)，葡萄糖含量用酶电极法测定(山东)，细胞密度用分光光度计(UV-2000，美国)在600nm下测定。蛋白电泳按文献方法进行(诸葛键王正祥。工业微生物实验技术手册，中国轻工业出版社，1994)。细胞形态用德国蔡氏显微镜观察。

本发明的有益效果：

1、本发明的重组蛋白表达宿主细胞为地衣芽孢杆菌，能够通过分子克隆等技术获得相应工业酶生产的重组菌，实现工业酶制剂的高效、分泌表达，表达不同工业酶制剂的水平可以达到15～30mg/mL。本发明有助于降低工业酶制剂的发酵制造成本、简化发酵制造工艺以及降低发酵工业环境压力。

2、本发明的重组蛋白为工业酶制剂，进一步为淀粉和纤维素水解酶，进一步为大宗工业酶制剂，如α-淀粉酶、纤维素酶、半纤维素酶、植酸酶、果胶酶等，但不局限于上述酶制剂。

3、本发明的获得优良的地衣芽孢杆菌宿主细胞的选育方法，经过适当修饰后，也可以用于其它类型的宿主细胞，特别是枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌等宿主细胞的选育。

生物材料样品保藏

一种宿主细胞，其分类命名为地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis r^-m^-，CBB3008，巳保藏于中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，保藏日期2008年11月25日，保藏编号CCTCC NO：M208236。

附图说明

图1.宿主细胞选育路线图

图2.宿主细胞的菌落形态和显微形态

图3.限制性修饰系统基因突变盒的构建

图4.限制性修饰系统突变盒的构建图谱。A1：RM2-1PCR产物；A2：RM2-2PCR产物；B1：以pUC-RM2′模板用引物RP1(SEQ ID NO：1)和RP4(SEQID NO：4)扩增的PCR产物；B2：pUC-RM2′的HindIII酶切图谱；C1：pUC-RM2′::Km^R的HindIII酶切图谱。

图5.限制性修饰系统突变株的鉴定。1：以CBB3008染色体DNA为模板用引物PR7(SEQ ID NO7)和PR8(SEQ ID NO8)扩增出的PCR产物。

图6.重组菌高温α-淀粉酶发酵时间曲线。CBB3008(○&●)，CBB3008(pHY-amyL)(△&▲)和B0204(◇&◆)在37℃、220r/min下于发酵培养基中发酵120h。空心符号代表菌体生长；实心符号代表高温α-淀粉酶酶活。

图7.重组菌分泌表达α-淀粉酶的蛋白电泳图谱

具体实施方式

实施例1：地衣芽孢杆菌宿主细胞的筛选

地衣芽孢杆菌宿主细胞选育过程如下图所示(附图1)。

从中国境内采集的3050份自然样本中分离获得526株地衣芽孢杆菌，并以地衣芽孢杆菌ATCC14580和CICIM B0204为对照，进行筛选。将所有收集到的地衣芽孢杆菌菌株点种添加4％葡萄糖的LB培养基，于45℃培养72h，观察菌落色泽及菌落周围色素形成状况，用染色确定地衣素和聚谷氨酸形成情况。24株地衣芽孢杆菌被选择出，用于下一步试验。将24株菌株分别点种0.01mg/mL四环素或0.005mg/mL卡那霉素的抗性平板，37℃培养24h后，确定其中的18株为抗生素敏感。对其可能存在的自身质粒进行了提取与鉴定，18株抗生素敏感菌株皆不含天然质粒。进一步将所获得的18株菌株在含2％葡萄糖的LB葡萄糖中于45℃和220r/min下培养72h，观察各个菌株的芽孢形成与菌体凝聚情况。以72h内芽孢形成率小于5％，菌体细胞分散性良好为指标，3株地衣芽孢杆菌菌株被选出用于下一步试验。将获得的3株候选菌株在含高浓度葡萄糖或可溶性淀粉的培养基中于45℃培养24h。菌株3008和2016菌株的生长优于0317。进一步考察3008和2016菌株在贫瘠营养培养基中的生长情况及其蛋白分泌情况。3008菌株在贫瘠营养培养基中的生长速度与2016相似，但其分泌蛋白的合成能力优于2016。至此，我们获得了可能作为优秀宿主细胞的地衣芽孢杆菌3008菌株，以此用于后续研究中。

3008的主要生物学特征汇总于表1。能够利用葡萄糖、乳糖、蔗糖、木糖、甘油、乙醇、乙酸、淀粉、纤维素生长；在20～50℃下生长，最适生长温度42～45℃，在pH5.5～7.8下生长，最适生长pH6.8～7.2。3008的菌落形态与菌体形态见图2。

                 表1.3008的主要生物学特征

图2的左图为菌落形态，右图为放大400倍下的细胞形态。

实施例2：限制性修饰系统编码基因簇的克隆与基因删除质粒的构建

分析B.licheniformis ATCC 14580基因组序列，其基因组4157995bp至4175263bp区域约17.3kb的区域中，存在一个B.licheniformis特异性I型DNA限制性修饰系统编码基因簇(Veith B，et al.J Mol Biotechnol，2004)。设计如下步骤对其进行删除(附图3)。

使用引物PR1(SEQ ID NO：1)和PR2(SEQ ID NO：2)，用PCR技术从地衣芽孢杆菌3008染色体DNA中扩增出限制性修饰系统基因簇的上游序列RM2-1，大小约为560bp，(图4A)；同样，使用引物PR3(SEQ ID NO：3)和PR4(SEQ ID NO：4)，用PCR技术从地衣芽孢杆菌3008染色体DNA中扩增出限制性修饰系统基因簇的下游序列RM2-2，大小约610bp(图4A)。用HindIII和EcoRV酶切片段RM2-1以及HindIII和SmaI酶切片段RM2-2。将pUC19(Yanisch PC，Vieira J，Messing J.Improved M13 phage cloning vectors and hoststrains：nucleotide sequences of the M13mp18 and pUC19 vectors.1985，Gene，33：103-119)用EcoRI和BamHI酶切并用DNA聚合酶进行末端补平，自身环化后获得pUC19(E-B)。将上述酶切PCR片段克隆入pUC19(E-B)的HindIII位点，获得了质粒pUC-RM2′。通过限制性酶切及PCR(引物为PR1(SEQ ID NO：1)和PR4(SEQ ID NO：4))确认获得了正确的重组质粒pUC-RM2′(图4B)。再使用引物PR5(SEQ ID NO：5)和PR6(SEQ ID NO：6)，以质粒pUC-RM2′为模板，反向PCR获得中间质粒并同步引入顺向重复序列5′-ATGGATAAGTTCAAATTAAAATTTTCCATCATTTATGGTAAGGCTCCCCTCGATTAATCC-3′；再与Km抗性序列连接，获得了重组质粒pUC-RM2′::Km^R(图4C)。

实施例3：DNA限制性修饰系统编码基因簇的删除

将重组质粒pUC-RM2′::Km^R在重组菌Ec(met)(王正祥，牛丹丹。中国发明专利，公开号：CN101230329A)中进行扩增。HindIII酶切重组质粒的制备物后，用电转化法转化地衣芽孢杆菌3008细胞。转化物涂布含0.025mg/mL卡那霉素的LB平板上培养48h。生长菌落在0.025mg/mL卡那霉素的LB培养基上传代纯化后，再在无卡那霉素的LB培养基中传代，筛选得到卡那霉素抗性消失的菌株，用引物PR7(SEQ ID NO：7)和PR8(SEQ ID NO：8)对卡那霉素敏感菌株进行鉴定，地衣芽孢杆菌3008中的限制性修饰系统编码基因簇被删除，则以引物PR7(SEQ ID NO：7)和PR8(SEQ ID NO：8)为基础的PCR产物应为850bp大小。结果如附图5所示。

可以看出，地衣芽孢杆菌3008中的限制性修饰系统编码基因簇被删除，此菌株命名为CBB3008，同时将此菌在中国典型菌种保藏中心进行专利菌种保藏，保藏号为CCTCCNO：M208236。此菌株的芽孢形成率与出发菌株相似，用pHY300PLK和pUB110的转化CBB3008(M208236)其电转化率在48～72CFU/μg DNA。与出发菌株3008相比，其遗传转化率得到明显改善。

实施例4：地衣芽孢杆菌宿主细胞用于表达工业酶制剂

将高温α-淀粉酶表达载体pHY-amyL用电穿孔转化法转化入地衣芽孢杆菌CBB3008(M208236)，获得转化子。

                     表3-8.CBB3008的遗传稳定性

转化子CBB3008(pHY-amyL)在250mL三角瓶(装液量30mL)中进行摇瓶发酵。发酵在发酵培养基中于37℃和220r/min下进行，发酵过程中每8h取样分析。重组菌高温α-淀粉酶的合成与分泌水平几乎是B0204的3倍，且生长速度还略快于B0204，慢于其出发菌株CBB3008，产酶维持时间明显长于B0204(图6)。重组菌的传代75代后，质粒维持率在92％左右。

进一步将CBB3008(pHY-amyL)在15L发酵罐中进行发酵试验，发酵120～168h后，此菌株产生高温α-淀粉酶的酶活水平约为25～30mg/mL发酵液)。25倍稀释后的发酵液蛋白电泳图谱见图7，发酵液中的蛋白质几乎全为高温α-淀粉酶。

相似地，将pHY-manA和pHY-phyN转化入地衣芽孢杆菌CBB3008获得重组菌CBB3008(pHY-manA)和CBB3008(pHY-phyN)，重组菌在15L发酵罐中的产酶水平为15mg/mL和21mg/mL。

序列表

SEQ ID NO：1

SEQ ID NO：2

SEQ ID NO：3

SEQ ID NO：4

SEQ ID NO：5

SEQ ID NO：6

SEQ ID NO：7

SEQ ID NO：8

Claims (5)

1.一种宿主细胞，其分类命名为地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis r^-m^-，CBB3008，巳保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO：M208236。

2.权利要求1所述的宿主细胞，其特征在于其是一种高效、分泌合成工业酶制剂的地衣芽孢杆菌宿主细胞，革兰氏阳性杆菌，不形成芽孢，不形成色素；能够利用葡萄糖、乳糖、蔗糖、木糖、甘油、乙醇、乙酸、淀粉、纤维素在20～50℃、pH5.5～7.8下生长；无内生质粒；其DNA限制性修饰系统编码基因簇被删除，遗传转化方便实现；引导工业酶制剂的高效分泌表达，表达水平达到15～30mg/mL。

3.权利要求1所述的宿主细胞，其特征在于最适生长温度42～45℃，最适生长pH6.8～7.2。

4.用权利要求1所述的宿主细胞进行重组蛋白高效分泌表达的方法，其特征在于通过基因克隆技术获得工业酶制剂的表达质粒，并在所述宿主细胞中实现高效分泌表达；在所述宿主细胞中高效合成工业酶制剂，再通过所处宿主细胞的蛋白分泌系统，将合成的酶蛋白高效分泌到培养基中；

(1)基因克隆与表达质粒的构建

表达质粒的构建所用表达载体pHY-WZX或pBL-WZX；表达测试用基因为：高温α-淀粉酶编码基因amyL，甘露聚糖酶编码基因manA，或植酸酶编码基因NcphyN；

上述基因经限制性酶切后，通过琼脂糖凝胶电泳分离纯化，克隆入表达载体pHY-WZX的EcoRI、KpnI或SmaI位点，获得相应的表达质粒pHY-amyL，pHY-manA或pHY-phyN；

(2)宿主细胞中实现高效分泌表达：

地衣芽孢杆菌电穿孔转化与重组菌的筛选，接种地衣芽孢杆菌CCTCC NO：M208236于2.5mL LB培养基中，过夜培养后，转接入50mL生长培养基，即含0.65mol/L山梨醇的LB培养基中，于37℃培养至OD₆₀₀为0.75-0.85，将菌体在冰水浴中放置10min，于4℃、10000r/min离心10分钟收集菌体细胞，用预冷的含0.65mol/L山梨醇、0.70mol/L甘露醇和10％甘油的EP缓冲液反复洗涤菌体细胞4次，将菌体细胞悬浮于1mL的预冷EP缓冲液中，取100μL菌体细胞悬浮液分装于1.5mL Eppendorf管中，取50ng/μL表达质粒pHY-amyL，pHY-manA或pHY-phyN的DNA 1μL，与菌体细胞混匀，移入预冷的电转化池，1600v电击5ms后，加入含0.65mol/L山梨醇和0.45mol/L甘露醇的LB培养基的复苏培养基1mL，37℃、160r/min培养3h，然后涂布含0.025mg/mL卡那霉素或0.05mg/mL四环素的LB平板，于37℃培养2～3天；转化子通过测定酶活进行确认；

(3)合成的酶蛋白高效分泌：

发酵试验在250mL三角瓶中装30mL发酵培养基：酵母膏0.5％～1.5％，蛋白胨1.2％～3.6％，葡萄糖8％～20％；pH7.0；接种步骤(2)获得的转化子重组菌，42℃、220r/min下培养5～7天；发酵试验进一步在15L全自动发酵罐中进行，工作发酵体积10L，过程中维持溶氧为20％以上，并用硫酸或氨水控制pH7.0，定时取样分析，测定酶活。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于工业酶制剂，选用淀粉酶、纤维素酶、半纤维素酶、或植酸酶。 

Images