实施例9
1、参比实施7,全基因合成rhaM、ibpB、ribC、TEVP、groL、lacZ基因,构建pBTS- FR-rhaM、pBTS-FR-ibpB、pBTS-FR-ribC、pBTS-FR-TEVP、pBTS-FR-groL、pBTS-FR-lacZ载体,转化进入Z15菌株,并完成第一次重组,构建表达菌株Z15-rhaM-45、Z15-ibpB-45、 Z15-ribC-45、Z15-TEVP-45、Z15-groL-45、Z15-lacZ-45。
2、接菌Z15-rhaM-45、Z15-ibpB-45、Z15-ribC-45、Z15-GFP-45、Z15-TEVP-45、Z15-groL-45、Z15-lacZ-45到40ml LB中,添加2‰的木糖进行诱导,另接种Z15到40ml LB中,添加0和2‰的木糖作对照。37℃,200rpm,培养24h。
3、取各种菌液菌液1ml,12000g离心一分钟;取上清100ul,加入等体积2×LoadingBuffer,95℃处理5min,作为菌液蛋白样品进行PAGE电泳;沉淀采用600ul Buffer A (50mMtris,2mM EDTA,100mM NaCl,1%Triton-100)重悬,加入1ul 100mg/L的溶菌酶, 37℃处理5min裂解细胞壁;取处理液100ul,加入等体积的2×Loading Buffer,95℃处理 5min,作为菌体蛋白样品进行PAGE电泳。
4、对3中的样品进行PAGE电泳,采用梯度SDA-PAGE电泳,胶浓度为10%-15%。
结果如图2,1号泳道为Marker,2号泳道为RhaM,3号泳道为IbpB,4号泳道为RibC,5号泳道为GFP,6号泳道为TEVP,7号泳道为GroL,8号泳道为LacZ,9号和10号泳道为Z15菌株,分别添加0和2‰的木糖;a图为菌体蛋白,b图为菌液蛋白。RhaM、IbpB、RibC、 GFP、GroL蛋白都可以在胞内大量表达,同时也可以大量分泌到发酵液中;但是TEVP蛋白不能在胞内有效表达,推测其被胞内蛋白降解,故也不能分泌到发酵液中;LacZ蛋白可能太大(110kDa),亦不能在胞内大量表达,故也不能分泌到发酵液中。
序列表
SEQUENCE LISTING
<110> 成都美溢德生物技术有限公司
<120>一种利用芽孢杆菌高效表达外源蛋白的方法
<160>3
<170>PatentIn version 3.3
<210> 1
<211>2847
<212> DNA
<213> 人工合成
<220>
<223>pBTS序列
<400> 1
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