CN109486688A - 一种里氏木霉基因工程菌及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株组成型高产Sorbicillinoids里氏木霉基因工程菌及其制备方法和应用，该里氏木霉基因工程菌，其分类命名为丛梗孢目（Moniliales）木霉属（Penicillium）丝状真菌里氏木霉（Trichoderma reesei），菌株号ZC121，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 2018385，保藏日期为2018年06月20日。该菌株ZC121是在里氏木霉Rut‑C30中敲除基因121121发生脱靶效应得到，可用于生产大量Sorbicillinoids。

Description

一种里氏木霉基因工程菌及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一株组成型高产Sorbicillinoids里氏木霉基因工程菌及其制备方法和应用。

背景技术

Sorbicillinoids通常也被称作黄色色素，来源于聚酮类化合物及一些在羧基末端具有环化结构的己酮类次级代谢产物，通常由一些海洋或陆地的丝状真菌产生，比如：木霉属(ApplEnviron Microbio.2016；82:6247-57)、曲霉属(Microbiol Res.2010；165:516-22)、青霉属(Tetrahedron.2005；61:7252-65)、链霉菌属(Proc Natl Acad Sci USA.2001；98:12215-20)、支顶孢属(Tetrahedron Lett.1994；35:2577-80)、拟青霉属(TetrahedronLett.2008；49:654-57)，这些化合物大部分具有复杂的、高度氧化的C1-C6山梨酰基侧链和两个或三个循环结构。基于这样的结构，Sorbicillinoids类化合物可以分成四类：单体类的Sorbicillinoids,，双元的BiSorbicillinoids，三元的TriSorbicillinoids和杂合的Sorbicillinoids。它们具有多种生物活性，包括抗癌(J Nat Prod.2010；73:969-71)、抗氧化(Chem Commun.2002；662-3)、抗病毒(J NatProd.2014；77:424-8)、抗菌作用(J NatProd.2005；68:865-70)，显示出了在农业、医药和食品工业上的重要应用。因此，虽然这些物质最开始在真菌发酵生产β-lactams(Appl Enviro.Microbiol.2016；82:3971-78)和纤维素酶(Appl Environ Microbio.2016；82:6247-57)时希望被去除，但是这些黄色色素类物质仍吸引了人们极大的兴趣。

关于Sorbicillinoids的研究主要集中在里氏木霉和青霉菌。里氏木霉作为工业上生产纤维素酶、半纤维素酶以及其他重组蛋白的主要工业化菌株(TrendsBiotechnol.2016；34:970-82)，它同时也能够产生丰富的次级代谢产物(Microbiology.2012；158:35-45),但是却很少引起人们注意。人们观察到里氏木霉在生长过程中会产生黄色色素(Eur J Biochem.1996；235:248-55),随后这些黄色物质被鉴定为Sorbicillin，Sorbicillinol和Soribicilloinds的混合物(Front Microbiol.2017；8.Technical University of Denmark.2013；164.Appl Environ Microbio.2016；82:6247-57)。人们猜测在产黄青霉(Microb Biotechnol.2017；10:958-68)和里氏木霉(FrontMicrobiol.2017；8)的产Sorbicillinoids类物质的合成路径中，所有基因和次级代谢中所涉及到的基因一样在基因组上是聚成簇的(Microbiol.2016；82:3971-78)。该基因簇也包含两个转录调节因子YPR1和YRP2以及一个转运因子(Appl Environ Microbio.2016；82:6247-57)。然而，Sorbicillinoids类物质的合成仍然不是很清楚，并且也缺少提高Sorbicillinoids产量的相关研究。

发明内容

本发明的目的是解决现有Sorbicillinoids产量低，且产量受培养条件影响严重的技术问题，提供一种里氏木霉基因工程菌ZC121，是在里氏木霉Rut-C30中敲除基因121121发生脱靶效应得到，菌株ZC121可用于生产大量Sorbicillinoids。

一种里氏木霉基因工程菌，其分类命名为丛梗孢目(Moniliales)木霉属(Penicillium)丝状真菌里氏木霉(Trichoderma reesei)，菌株号ZC121，已保藏于中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，地址为中国湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山，武汉大学，邮编为430072，保藏编号为CCTCC M 2018385，保藏日期为2018年06月20日。

上述里氏木霉基因工程菌的制备方法，包括以下步骤：

步骤1，提取里氏木霉RUT-C30的RNA并进行反转录获得cDNA；

步骤2，以里氏木霉RUT-C30的cDNA为模版设计基因121121敲除的上下游同源臂引物，进行PCR扩增；

步骤3，将步骤2的PCR扩增产物采用同源重组的方法插入质粒的XhoI和BamHI酶切位点中，得到重组质粒pXBthg-121121；

步骤4，将步骤3中得到的重组质粒pXBthg-121121转入里氏木霉RUT-C30的孢子中，筛选获得稳定遗传的转化子，即为里氏木霉基因工程菌ZC121。

筛选得到稳定遗传的转化子的方法具体为：将重组质粒pXBthg-121121导入里氏木霉RUT-C30的孢子后，在筛选培养基中培养5天得到转化子，再将转化子进行3轮稳定的传代培养，即得稳定遗传的转化子。对获得的稳定遗传的转化子进行3轮稳定的传代培养以使得pXBthg-121121在转化子中稳定地过表达，之后对转化子的培养液进行Sorbicillinoids产量的检测，结果显示，菌株ZC121-1在各种碳源、pH4-7、温度18-42℃、光照或不光照条件下都能高产Sorbicillinoids，表现出组成型高产。

进一步地，基因121121基因敲除盒的序列如SEQ ID No.1所示。

进一步地，基因121121敲除的上下游同源臂引物为：上游同源序列的上游引物序列如SEQ ID No.2所示、下游引物序列如SEQ ID No.3所示；下游同源序列的上游引物序列如SEQID No.4所示、下游引物序列如SEQ ID No.5所示。

进一步地，步骤3中采用的质粒为pxBthg。

上述里氏木霉基因工程菌在生产Sobicillinoids的应用。

与现有技术相比，本发明具有如下优势：

1、本发明利用同源重组技术所构建的里氏木霉基因工程菌ZC121能组成型高产Sorbicillinoids。在分别以纤维素、乳糖、葡萄糖、半乳糖和甘油为碳源时，ZC121所产的黄色色素分别是RUT-C30的5.1倍、8.4倍、4.3倍、5.1倍和4.5倍。

2、里氏木霉基因工程菌ZC121高产Sorbicillinoids的过程具有很高的鲁棒性。菌株ZC121在pH 4-7，温度18-42℃，和不同光照条件下(全光照、不光照或全暗)都能高产Sorbicillinoids。

3、与已有文献相比，里氏木霉基因工程菌ZC121的Sorbicillinoids产量是最高的。

附图说明

图1为实施例1中pXBthg-121121重组质粒图谱。

图2为实施例1中不同转化子的Sorbicillinoids产量。

图3为实施例2中不同碳源条件下菌株ZC121和RUT-C30的Sorbicillinoids产量。

图4为实施例3中葡萄糖条件下菌株ZC121在不同温度条件下的Sorbicillinoids产量。

图5为实施例4中葡萄糖条件下菌株ZC121在不同pH度条件下的Sorbicillinoids产量。

图6为实施例5葡萄糖条件下菌株ZC121在不同光照条件下的Sorbicillinoids产量。

具体实施方式

实施例1

里氏木霉基因工程菌ZC121是在里氏木霉Rut-C30中利用农杆菌介导基因操作敲除基因121121过程中，发生脱靶效应得到的。敲除基因121121所用敲除盒的基因序列如SEQID No.1所示。

pXBthg-121121重组质粒构建，包括以下步骤：

(1)基因121121上游以及下游基因扩增引物具体如下：

上游同源序列：上游引物的核苷酸序列为：acccaatagtcaatctagaatgcgttaccgaacagcagc(SEQ ID No.2)；

下游引物的核苷酸序列为：acccaatagtcaatctagaatgcgttaccgaacagcagc(SEQ IDNo.3)；

下游同源序列：上游引物的核苷酸序列为：acccaatagtcaatctagaatgcgttaccgaacagcagc(SEQ ID No.4)；

下游引物的核苷酸序列为：acccaatagtcaatctagaatgcgttaccgaacagcagc(SEQ IDNo.5)。

以里氏木霉RUT-C30的cDNA为模版用上述引物扩增基因121121的上下游序列。扩增条件为预变性：95℃，15s；变性：95℃，15s；退火：66℃，3s；延伸：72℃，3min；彻底延伸：72℃，5min；

(2)经纯化的目的基因PCR产物采用单酶切同源重组插入到质粒pXBthg的XhoI和BamHI酶切位点上获得pXBthg-121121重组质粒，如图1所示；

(3)采用农杆菌介导的办法将该表达盒转入到里氏木霉孢子中，具体方法如下：

根癌农杆菌转化：

a.-70℃保持的根癌农杆菌置于冰上孵育10min；

b.往根癌农杆菌中加入0.5-1μg的质粒，冰浴30min；

c.液氮5min，37℃5min，冰浴2min；

d.加入1mL的液体LB，200rpm,28℃培养3h后，离心收集菌体，再洗一次；

e.用100μL液体LB重悬菌体并均匀涂布在LB抗性平板上(含50μg/mL的羧苄青霉素和50μg/mL的卡那霉素)，28℃培养两天。

根癌农杆菌介导的里氏木霉的转化：

a.里氏木霉孢子要求新鲜制备，0.02％的Tween-80水从平板上洗下孢子，浓度约1x106/mL。

b.农杆菌:首先将农杆菌AGL1单菌落(含双元载体)接种于3mL含有50μg/mL的羧苄青霉素和50μg/mL的卡那霉素的LB液体培养基中，200rpm、28℃过夜培养至OD660为0.6，然后离心收集菌体并用适量的IM液体培养基(含200μM的乙酰丁香酮)重悬菌体，并将菌液浓度调到OD660为0.15，然后200rpm、28℃培养至OD660为0.5-0.8。将100μL农杆菌液与100μL的里氏木霉的孢子混匀后，均匀涂在固体IM(含200μM的乙酰丁香酮)平板上，26℃避光培养48h。将共培养两天后的混合物用0.02％的Tween-80水刮下后，均匀涂在含有600μM头孢噻肟(cefotaxime，以杀死农杆菌细胞)、0.1％Triton X-100以及相应抗生素的PDA平板上，28℃培养一周。获得转化子。

(4)对步骤(3)中获得的转化子进行3轮的稳定遗传，于SDB中活化48h后，接种于TMM+2％微晶纤维素培养基中进行酶活以及色素的检测，见图2，四株转化子菌表现出了低于出发菌株RUT-C30的纤维素酶酶活而高于RUT-C30的色素产生，其中ZC121-1的色素产量最高，OD370达到8。ZC121-1命名为ZC121，并用于以下不同培养条件的研究。

实施例2

不同碳源对菌株ZC121的Sorbicillinoids产量的影响

里氏木霉基因工程菌ZC121和RUT-C30在PDA固体培养基中于28℃下培养7天后，取孢子接种于SDB培养基活化48小时后，分别接种到含有2％纤维素(cellulose)、乳糖(lactose)、葡萄糖(glucose)、半乳糖(galactose)或甘油(glycerol)的TMM培养基(pH6.0)中培养7天。培养液经4℃，8000rpm，15min离心获得上清液。用紫外分光光度计测上清液在370nm处的吸收。结果如图3所示，在分别以纤维素、乳糖、葡萄糖、半乳糖和甘油为碳源时，ZC121所产Sorbicillinoids分别为6.6、8.4、17.3、13.3和10.5,分别是RUT-C30的5.1倍、8.4倍、4.3倍、5.1倍和4.5倍。

实施例3

不同温度对菌株ZC121的Sorbicillinoids产量的影响

里氏木霉基因工程菌ZC121在PDA固体培养基中于28℃下培养7天后，取孢子接种于SDB培养基活化48小时后，接种到TMM+2％葡萄糖培养基(pH 6.0)中，于200rpm不同温度(18、24、28、37、42、44和46℃)的摇床中，培养7天。培养液经4℃，8000rpm，15min离心获得上清液。用紫外分光光度计测上清液在370nm处的吸收。结果如图4所示，菌株ZC121在18-42℃培养下，高产Sorbicillinoids。但随着温度下降，产量有所下降。但温度为44或46℃时，菌株ZC121几乎不产Sorbicillinoids。这是因为培养温度过高，菌株ZC121的菌丝几乎不生长。

实施例4

不同pH对菌株ZC121的Sorbicillinoids产量的影响

里氏木霉基因工程菌ZC121在PDA固体培养基中于28℃下培养7天后，取孢子接种于SDB培养基活化48小时后，分别接种到pH为2、4、6、7、10或12的TMM+2％葡萄糖培养基中，于200rpm,28℃摇床中，培养7天。培养液经4℃，8000rpm，15min离心获得上清液。用紫外分光光度计测上清液在370nm处的吸收。结果如图5所示，在pH为4-7时，菌株ZC121高产Sorbicillinoids。

实施例5

不同光照对菌株ZC121的Sorbicillinoids产量的影响

里氏木霉基因工程菌ZC121在PDA固体培养基中于28℃下培养7天后，取孢子接种于SDB培养基活化48小时后，接种到TMM+2％葡萄糖培养基(pH 6.0)中，于200rpm,28℃的摇床中，培养7天。培养期间，光照条件分别为自然光照(Control)、全光照(Light)、全暗(dark)和半光照(Light/DARK)。半光照及光照24h，避光24h，如此交替。培养液经4℃，8000rpm，15min离心获得上清液。用紫外分光光度计测上清液在370nm处的吸收。结果如图6所示，菌株ZC121在不同光照条件下，均能高产Sorbicillinoids。

序列表

<110> 东南大学

<120> 一种里氏木霉基因工程菌及其制备方法和应用

<130> 1

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 4953

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

cggaagcgac ggtggagaag aaatatcggg gattagctga taaagttctc cgggcatttg 60

tgaaaccaaa gcctcacggc ctttacgttg tcggtagctg caggggtgaa tcaactttat 120

ttccgcttat taaaaggtgc cgaattcaag gagagttgga gagggggcat aggtacaagc 180

ccggaagaac tagctacttg ttcagcacgg gtaaagccgg aaacgaataa tgaactgcgc 240

agagcaaacg tgagcaaagg cacaaacaaa ggcttgcagt gcctcagtcc atggacttgc 300

tctcgcacaa ttgcgagcgg taggtaggca atagttcatt taagcttgac ggcaatcttg 360

atgtgacggc aggtttggcc agcaagcgaa aatgacagat aacaccagag aggcaagtac 420

aataagctca tatagcaaat gttctttctg cgcagctttc aaaagtccac aactccctgt 480

gtatagtaaa gcgaacgtgt gtcgctaata tgcgtgttgg caccacaatc gacgcactca 540

cttagcagca ggcgcttgaa ccaaatgcaa taggatcgaa tacatctata cacacatata 600

ttatagggtt actctcagtg acttggataa gaggccacgt taggcaacta ttgtaataac 660

acgcatgtat taccggttag catcgcgtcc aagctggctg gaacaacgga gacttgaaat 720

gcttcctttt tttcacattt ctcttcaaga gtctagtgca tatgaagaag gcgggaagta 780

aagaaaagac tctgttttta gcacaatcga aagtgcaaaa tggcagttta taagcacccg 840

aacctaaggt atgtttatat acatccattt gccagcagac gctccctcgt ctcttacaga 900

gcgaaccaat ccgatgtgcg ggccggtccg ttataattcc gtgctgctga ctccttgctt 960

actgcatctc agcaggcagg atcgaggtga cattgcggtt attcaacctt ccacttccac 1020

atgccgtcga cagcttctaa tgtcaatttc tcgcccgaaa gatatcataa attgcacaga 1080

tctttatcag tgaattgccc aagaggagcc ctcacgtctt gtcataacct ctgattatgt 1140

tgtctcgcat ttgcagcaaa caactagcgg ttccatgaac gtgggataga agcagattgg 1200

tctcaattac cccaaaccgg gactaatcga cgcgcatgaa aggttacatc ttcctgcatg 1260

tcgaactgaa cgctaggctc tctataacca tcgcgttcca ttctcgtctt cattcattgt 1320

ttctatactt gcccagtagg agactgttcc gttaactcat cgcgtacgtc tcagcatagg 1380

caaatggcct agcctcggtg acagttaatc cgcttatttt ttgccgggaa taacctcacc 1440

aataggctaa agaagaagac gaggagacag agacggaaca gcaacagcac tagagcacaa 1500

gcgcaattaa ccctcactaa agggaacaaa agctggagct ccaccgcggt ggcggccgcg 1560

acgttaactg atattgaagg agcacttttt gggcttggct ggagctagtg gaggtcaaca 1620

atgaatgcct attttggttt agtcgtccag gcggtgagca caaaatttgt gtcgtttgac 1680

aagatggttc atttaggcaa ctggtcagat cagccccact tgtagcagta gcggcggcgc 1740

tcgaagtgtg actcttatta gcagacagga actaggacat tatcatcatc tgctgcttgg 1800

tgcacgataa cttggtgcgt ttgtcaagca aggtaagtga acgacccggt cataccttct 1860

taagttcgcc cttcctccct ttgtttcaga ttcaatctga cttacctatt ctacccaagc 1920

atcgatatga aaaagcctga actcaccgcg acgtctgtcg agaagtttct gatcgacaag 1980

ttcgacagcg tctccgacct gatgcagctc tcggagggcg aagaatctcg tgctttcagc 2040

ttcgatgtag gagggcgtgg atatgtcctg cgggtaaata gctgcgccga tggtttctac 2100

aaagatcgtt atgtttatcg gcactttgca tcggccgcgc tcccgattcc ggaagtgctt 2160

gacattgggg aattcagcga gagcctgacc tattgcatct cccgccgtgc acagggtgtc 2220

acgttgcaag acctgcctga aaccgaactg cccgctgttc tgcagccggt cgcggaggcc 2280

atggatgcga tcgctgcggc cgatcttagc cagacgagcg ggttcggccc attcggaccg 2340

caaggaatcg gtcaatacac tacatggcgt gatttcatat gcgcgattgc tgatccccat 2400

gtgtatcact ggcaaactgt gatggacgac accgtcagtg cgtccgtcgc gcaggctctc 2460

gatgagctga tgctttgggc cgaggactgc cccgaagtcc ggcacctcgt gcacgcggat 2520

ttcggctcca acaatgtcct gacggacaat ggccgcataa cagcggtcat tgactggagc 2580

gaggcgatgt tcggggattc ccaatacgag gtcgccaaca tcttcttctg gaggccgtgg 2640

ttggcttgta tggagcagca gacgcgctac ttcgagcgga ggcatccgga gcttgcagga 2700

tcgccgcggc tccgggcgta tatgctccgc attggtcttg accaactcta tcagagcttg 2760

gttgacggca atttcgatga tgcagcttgg gcgcagggtc gatgcgacgc aatcgtccga 2820

tccggagccg ggactgtcgg gcgtacacaa atcgcccgca gaagcgcggc cgtctggacc 2880

gatggctgtg tagaagtact cgccgatagt ggaaaccgac gccccagcac tcgtccgagg 2940

gcaaaggaat agagtagatg ccgaccggga tcgatccact taacgttact gaaatcatca 3000

aacagcttga cgaatctgga tataagatcg ttggtgtcga tgtcagctcc ggagttgaga 3060

caaatggtgt tcaggatctc gataagatac gttcatttgt ccaagcagca aagagtgcct 3120

tctagtgatt taatagctcc atgtcaacaa gaataaaacg cgtttcgggt ttacctcttc 3180

cagatacagc tcaactgcaa tgcattaatg cattggacct cgcaacccta gtacgccctt 3240

caggctccgg cgaagcagaa gaatagctta gcagagtcta ttttcatttt cgggagacga 3300

gatcaagcag atcaacggtc gtcaagagac ctacgagact gaggaatccg ctcttggctc 3360

cacgcgacta tatatttgtc tctaattgta ctttgacatg ctcctcttct ttactctgat 3420

agcttgacta tgaaaattcc gtcaccagcc ctgattaagt gtatacagaa gtagcagcac 3480

tatgagtacc ttgtatcaca tccatctttg tcttctttgc attaatgcca aaccaccatc 3540

ccagaatgcc catctatgca tatcttctat tgacacaagt tcccatcctt tgactccctt 3600

ggcttttctg gtactttccg caatcgcttt tgctcacgtg ttgaatctac agccccatcc 3660

agaatcgcgt ttcaggcaca atcagcttcc ccttgcccga gatttcctga ctcgagaatc 3720

ctacaagcac atcataaatg cccctctcgc tcttccacat gctctcaatc tcgtcccaga 3780

agctagtagc gtactggtca atgggtattt gtacctcctt ctcctcgcca gcttcaagat 3840

acaccttttc gaatccgtgc agctccttga ccgggcgatg tgtaggcgag tttggggccg 3900

aaatgtatag ctgcaggacc tgggcgcccg ggacactgct cgtgttcttg atcttgacaa 3960

tggctactgt gggctggtcc gggtggaagg tttcggggac cgtcctcacg gtagaatctg 4020

ggagcttgaa ggtagcgtaa gacaggccat gcctgtgcga ctgtcagaga tcacaagaac 4080

agaagccata gactgataga aggagggaaa caaaacactt acccaaaagg aaacagaacc 4140

tccctctccg ttttgtcgta gaacttgtag ccaacgtaaa catcctcgcc atacaagacc 4200

cgtccaccaa cgctggcgta gttgagatat gctgggttgt gcttcacatc gactggccac 4260

gatagggaga gtttccccga cgggttgacg ttgccaaaga gcacatcgga gattccgtgg 4320

cctgtctcgt taccaccata ccaagcctgc acaatggcct ttgctttatg agcccagctc 4380

attgtcactg gggtgcctga ctggttgacg actacagcat tgggagcggc gtcaagaact 4440

tgcgagatca tggtgtccac accagggggc aggtccatgt gaggccggtc aaaaccctca 4500

gactcccact cgccgctgag tcccgtgcag atgatggtgt agtcggcatc ggctgcggcc 4560

ttgacggccc gcgcaatcat ctcctgtggg tcgaccttga gacaggcacc caggtgtacg 4620

gcaccgccgc caaagttgac aacaccggtc gtctccatct tggtcgtgtt ggcagaccca 4680

aactcgagac gcagcttgta ggtgctgccg gccaccatcc tcctggtagc gactttttcc 4740

gtcgttccct ttccgaaaaa ggcggtacca cgcgtctgat gtgttgtatt ttcaatcacg 4800

agctcattat caatataaag gtcggcagtg ccaaagacac tgaggccaaa ttcccaaatt 4860

cccgtggcgg tagggataaa ctcgcccacg agagtacccc agaacatggc cttgttgagc 4920

gttgggatgt tgttgtaatc catgagctgg aac 4953

<210> 2

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

acccaatagt caatctagaa tgcgttaccg aacagcagc 39

<210> 3

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

acccaatagt caatctagaa tgcgttaccg aacagcagc 39

<210> 4

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

acccaatagt caatctagaa tgcgttaccg aacagcagc 39

<210> 5

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

acccaatagt caatctagaa tgcgttaccg aacagcagc 39

Claims (6)

1.一种里氏木霉基因工程菌，其分类命名为丛梗孢目（Moniliales）木霉属（Penicillium）丝状真菌里氏木霉（Trichoderma reesei），菌株号ZC121，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 2018385，保藏日期为2018年06月20日。

2.权利要求1所述的里氏木霉基因工程菌的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

步骤1，提取里氏木霉RUT-C30的RNA并进行反转录获得cDNA；

步骤2，以里氏木霉RUT-C30的cDNA为模版设计基因121121敲除的上下游同源臂引物，进行PCR扩增；

步骤3，将步骤2的PCR扩增产物采用同源重组的方法插入质粒的XhoI和BamHI酶切位点中，得到重组质粒pXBthg-121121；

步骤4，将步骤3中得到的重组质粒pXBthg-121121转入里氏木霉RUT-C30的孢子中，筛选获得稳定遗传的转化子，即为里氏木霉基因工程菌ZC121。

3.根据权利要求2所述的里氏木霉基因工程菌的制备方法，其特征在于：基因121121基因敲除盒的序列如SEQ ID No. 1所示。

4.根据权利要求2所述的里氏木霉基因工程菌的制备方法，其特征在于：基因121121敲除的上下游同源臂引物为：上游同源序列的上游引物序列如SEQ ID No. 2所示、下游引物序列如SEQ ID No. 3所示；下游同源序列的上游引物序列如SEQ ID No. 4所示、下游引物序列如SEQ ID No.5所示。

5.根据权利要求2所述的里氏木霉基因工程菌的制备方法，其特征在于：步骤3中采用的质粒为pxBthg。

6.权利要求1所述的里氏木霉基因工程菌在生产Sobicillinoids的应用。