CN102174420A - 生产高纯度头孢菌素c的基因工程菌及其应用 - Google Patents

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CN102174420A CN2011100316284A CN201110031628A CN102174420A CN 102174420 A CN102174420 A CN 102174420A CN 2011100316284 A CN2011100316284 A CN 2011100316284A CN 201110031628 A CN201110031628 A CN 201110031628A CN 102174420 A CN102174420 A CN 102174420A
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刘钢
安洋
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Abstract

本发明公开了生产高纯度头孢霉素的基因工程菌及其应用。本发明所提供的基因工程菌，为将如下融合基因导入宿主菌得到的基因工程菌：序列表中序列1中第7-1194位核苷酸所示DNA片段与蛋白cefF的编码基因构成的融合基因。将所得到的的基因工程菌中的一株命名为顶头孢霉cefF基因工程菌(Acremonium chrysogenum)，其保藏号为CGMCC No.4515。本发明将带有顶头孢霉菌启动子PpcbC的棒状链霉菌来源的基因cefF转入顶头孢霉菌中，使其在体内转录表达，增强DAOC羟化生成DAC这一催化反应，从而降低DAOC在终产物CPC中的含量，达到提高工业产品纯度的目的。

Description

生产高纯度头孢菌素C的基因工程菌及其应用
技术领域
本发明涉及基因工程菌及其应用，特别涉及生产高纯度头孢菌素C的基因工程菌及其应用。
背景技术
头孢菌素C(Cephalosporin C，CPC)是工业生产头孢菌素的原料，头孢菌素属于β内酰胺类抗生素，是一类具有重要应用价值的广谱抗生素。头孢菌素C的工业生产菌是顶头孢霉菌(Acremonium chrysogenum)。头孢菌素C在顶头孢霉菌中的生物合成途径已经研究得十分清楚，为利用基因工程手段改造顶头孢霉菌奠定了良好基础。去乙酰氧头孢菌素C(Deacetoxycephalosporin C，DAOC)是头孢菌素C生物合成过程中的一种中间产物。在生物合成中，青霉素N(penicillin N)被由基因cefEF编码的扩环/羟化双功能酶催化，首先扩环生成DAOC，然后羟化生成DAC(Deacetylcephalosporin C)。在工业发酵生产过程当中，DAOC会累积在发酵液中，占终产物CPC总量的1％到2％之间。当CPC作为原料进入下游化学合成头孢菌素的过程中，DAOC也会相应的变成无法去除的杂质，影响到产品的纯度。
蛋白cefF的氨基酸序列如序列表中序列2所示。
发明内容
本发明的一个目的是提供顶头孢霉cefF基因工程菌(Acremonium chrysogenum)，其保藏号为CGMCC No.4515。
本发明的另一个目的是提供一种基因工程菌。
本发明所提供的基因工程菌，为将如下融合基因导入宿主菌得到的基因工程菌：序列表中序列1中第7-1194位核苷酸所示DNA片段与蛋白cefF的编码基因构成的融合基因。
所述蛋白cefF的编码基因的核苷酸序列如序列表中序列1中第1203-2275位核苷酸所示；
所述宿主菌为顶头孢霉菌(Acremonium chrysogenum)；
所述融合基因是通过重组表达载体导入宿主菌的。
所述重组表达载体为将所述融合基因插入表达载体pAg1-H3的多克隆位点得到的重组表达载体；
所述融合基因的核苷酸序列为序列表中序列1所示。
所述顶头孢霉cefF基因工程菌或所述基因工程菌在生产头孢菌素C中的应用也属于本发明的保护范围。
本发明的又一个目的是提供含有如下融合基因的重组质粒：序列表中序列1中第7-1194位核苷酸所示DNA片段与蛋白cefF的编码基因构成的融合基因。
所述重组质粒为将所述融合基因插入表达载体pAg1-H3的多克隆位点得到的重组表达载体；
所述蛋白cefF的编码基因的核苷酸序列如序列表中序列1中第1203-2275位核苷酸所示；
所述融合基因的核苷酸序列为序列表中序列1所示。
蛋白cefF或蛋白cefF的编码基因在用发酵菌制备头孢菌素C的过程中降低产物中去乙酰氧头孢菌素C的产量中的应用也属于本发明的保护范围。
所述蛋白cefF的编码基因的核苷酸序列如序列表中序列1中第1203-2275位核苷酸所示。
本发明的又一个目的是提供一种制备头孢菌素C的方法，包括如下步骤：发酵所述顶头孢霉cefF基因工程菌或所述工程菌，得到头孢菌素C。
本发明将带有顶头孢霉菌启动子PpcbC的棒状链霉菌来源的基因cefF转入顶头孢霉菌中，使其在体内转录表达，增强DAOC羟化生成DAC这一催化反应，从而降低发酵产物中DAOC的量，达到提高工业产品CPC纯度的目的。
附图说明
图1为PCR扩增PpcbC产物的琼脂糖凝胶电泳图。
图2为PCR扩增cefF产物的琼脂糖凝胶电泳图。
图3为重组质粒pAg1-H3-cefF的构建。
图4为PCR验证基因工程菌株的扩增产物琼脂糖凝胶电泳图。
图5为野生型菌株中DAOC与CPC的检测结果图。
图6为基因工程菌株中DAOC与CPC的检测结果图。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、生产高纯度头孢霉素的基因工程菌及其应用
顶头孢霉(Acremonium chrysogenum)CGMCC 3.3795购自中国普通微生物保藏管理中心(CGMCC)；
棒状链霉菌(Streptomyces clavuligerus)ATCC27064购自美国典型培养物保藏中心(ATCC)。
一、构建重组质粒pAg-H3-cefF
1、PCR扩增启动子PpcbC
以顶头孢霉(Acrernonium chrysogenum)CGMCC 3.3795基因组DNA为模板，对基因pcbC的启动子区设计引物对：
上游引物为：5′-GactagtGTGGATGGCACCTTTTGGG-3′，小写字母为酶切位点SpeI，
下游引物为：5′-CggcgcgccGGTGACGGTTTGTCCTGCC-3′，小写字母为酶切位点AscI。
PCR扩增得到1188bps大小DNA片段，使用SpeI和AscI双酶切，回收1.1kb片段，如图1(图1中泳道1为DNA marker，泳道2为PpcbC的PCR扩增产物)所示；并将所得到的PCR产物连接到克隆载体pEASY-Blunt(购自全式金公司)上进行测序。序列测定结果表明，PCR反应获得的片段的核苷酸序列与启动子PpcbC基因序列(genebank号为X74601.1)一致，即序列表中序列1中第7-1194位核苷酸。
2、PCR扩增基因cefF
以棒状链霉菌(Streptomyces clavuligerus)ATCC27064基因组DNA为模板，对基因cefF设计引物对：
上游引物：5′-AggcgcgccCGAAGGAGCAGGGGAACA-3′，小写字母为酶切位点AscI，
下游引物：5′-CcctgcaggCGGCTTGAATGCAACGAC-3′，小写字母为酶切位点SbfI。
PCR扩增得到1091bps大小DNA片段，使用AscI和SbfI双酶切，回收1kb片段，如图2(图2中泳道1为DNA marker，泳道2为cefF的PCR扩增产物)所示；并将所得到的PCR产物连接到克隆载体pEASY-Blunt(购自全式金公司)上进行测序。序列测定结果表明，PCR反应获得的片段的核苷酸序列为cefF基因序列，即序列表中序列1中第1203-2275位核苷酸。该基因编码的蛋白序列如序列表中序列2所示。
3、构建重组质粒pAg-H3-cefF
使用SpeI和SbfI双酶切质粒pAg1-H3(公众可从中国科学院微生物研究所获得，记载过该质粒的非专利文献是：A.Zhang et al.Efficient disruption of a polyketide synthase gene(pksl)for melanin synthesis through Agrobacterium-mediated transformation of Glarea lozoyensis Mol Gen Genomic(2003)268：645-655)，回收6.4kb DNA片段，与上述两条DNA回收片段连接，方法是：将回收6.4kb的质粒DNA片段与步骤1回收的1.1kb启动子PpcbC片段以及步骤2回收的cefF基因1kb片段加入同一连接体系，使用T4DNALigase(NEB cat#M0202S)，16摄氏度反应，得到重组质粒。
将重组质粒转入大肠杆菌中，卡那霉素抗性筛选，挑取阳性克隆，将阳性克隆进行液体培养，提取阳性克隆质粒进行测序验证，测序结果表明在质粒pAg1-H3的SpeI和SbffI酶切位点间插入了序列表中序列1所示DNA片段，其中第第7-1194位为启动子PpcbC，第1203-2275位为cefF基因，证明质粒构建正确，将构建重组质粒命名为pAg-H3-cefF(图3)。
二、重组质粒pAg1-H3-cefF转化根瘤农杆菌
制备根瘤农杆菌AGL-1感受态细胞：
(1)将根瘤农杆菌AGL-1(购自ATCC，产品目录号为BAA-101)甘油保存液接种在含100μg/mL羧苄青霉素的LB琼脂平板上，28℃静置培养两天；
(2)挑取单菌落接种在4mL含100μg/mL羧苄青霉素的LB液体培养基中，28℃、250rpm振荡过夜培养；
(3)将4mL培养液转接至含有100mL LB液体培养基的500mL锥形瓶中，28℃、250rpm培养至OD600＝0.5；
(4)将培养液置于冰上10分钟，4000rpm离心10分钟收集菌体；
(5)弃上清，用2mL 20mM CaCl2重悬菌体，100μL分装。浸入液氮1分钟后放入-80℃保存。
提取步骤一构建的重组质粒pAg1-H3-cefF DNA，取1μg该质粒DNA，将其加入上述制备的根瘤农杆菌AGL-1感受态细胞中混匀，放入液氮中5分钟。37℃热激20分钟后加入700μL LB培养基，28℃振荡培养2小时。将菌液均匀涂布在含有卡那霉素(75μg/mL)的LB琼脂平板上，28℃倒置培养2天，得到含有重组质粒pAg1-H3-cefF的根瘤农杆菌单菌落。
三、构建含有cefF基因的顶头孢霉工程菌株
向培养7天的顶头孢霉(Acremonium chrysogenum)CGMCC 3.3795琼脂平板上滴加2mL无菌水，用无菌棉棒将菌体刮下，得到溶液用无菌脱脂棉过滤，得到顶头孢霉孢子悬液。
将步骤二得到的含有重组质粒pAg1-H3-cefF的根瘤农杆菌单菌落接种于5mLMM液体培养基中，28℃振荡培养2天。用IM培养基将菌体稀释到OD600＝0.15，28℃振荡培养6小时，至OD600＝0.6。取100μL菌液与等体积顶头孢霉孢子悬液混合(悬液浓度＝107个孢子/mL)，均匀涂布在CM培养基平板上，25℃倒置培养3天。用棉签将平板上菌体转接至含有50μg/mL潮霉素B和200μm/mL噻孢霉素钠的TSA培养基平板上，28℃倒置培养5天至含有抗性筛选标记的转化子长出可见单菌落，再次转接进行纯化培养，纯化培养的方法为：使用含有50μg/mL潮霉素B和200μm/mL噻孢霉素钠的TSA培养基抑制农杆菌的生长，使农杆菌与顶头孢霉转化子分离，多次传代，得到转化重组质粒pAg1-H3-cefF的基因工程菌株。设未转化的顶头孢霉菌为野生型对照菌株。分别提纯基因工程菌株和野生型对照菌株的基因组DNA和总RNA。通过RT-PCR扩增，分别得到基因工程菌株和野生型对照菌株的cDNA。RT-PCR扩增的引物为：
上游引物：5′-AggcgcgccCGAAGGAGCAGGGGAACA-3′，小写字母为酶切位点AscI，
下游引物：5′-CcctgcaggCGGCTTGAATGCAACGAC-3′，小写字母为酶切位点SbfI。
以重组质粒pAg1-H3-cefF DNA为模板作为阳性对照，分别以基因工程菌株和野生型对照菌株的基因组DNA及cDNA为模板，进行PCR验证。使用的引物对如下：
上游引物：5′-aggcgcgccCGAAGGAGCAGGGGAACA-3′，
下游引物：5′ccctgcaggCGGCTTGAATGCAACGAC-3′。
结果如图4所示(图4中，泳道1为1kb DNA marker，泳道2为以基因工程菌株的基因组DNA为模板得到的PCR扩增产物；泳道4为以基因工程菌株的cDNA为模板得到的PCR扩增产物；泳道6为以重组质粒pAg1-H3-cefF DNA为模板得到的PCR扩增产物；泳道3为以野生型对照菌株的基因组DNA为模板得到的PCR扩增产物；泳道5为以野生型对照菌株的cDNA为模板得到的PCR扩增产物)。从图4可见，以基因工程菌株基因组DNA及cDNA为模板，均扩增得到了约1000bps大小DNA片段，而以野生型对照菌株基因组DNA及cDNA为模板均未出现该DNA片段。结果表明cefF基因已整合在获得的基因工程菌株的基因组DNA上，并能够在体内正常转录。
将上述获得的基因工程菌株中的一株命名为顶头孢霉cefF基因工程菌(Acremonium chrysogenum)。
该顶头孢霉cefF基因工程菌已于2010年12月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为CGMCC No.4515。
以上各培养基的配制方法如下：
(1)MM培养基(100mL)：
K-buffer(K2HPO420g，KH2PO414.5g，加水至100mL，pH7.0)    1mL
M-N(MgSO4·7H2O 3g，NaCl 1.5g，加水至100mL)             2mL
1％CaCl2·2H2O水溶液(质量百分比)                        0.1mL
微量元素(ZnSO4·7H2O 0.01g，CuSO4·5H2O 0.01g，H3BO3 0.01g，MnSO4·H2O 0.01g，Na2MoO4·2H2O 0.01g，加水至100mL)                           1mL
20％NH4NO3水溶液(质量百分比)                            0.25mL
20％葡萄糖水溶液(质量百分比)                            1mL
0.01％FeSO4水溶液(质量百分比)                           1mL
50mg/mL卡那霉素水溶液                                   0.15mL
纯水                                                    93.5mL
(2)IM培养基(100mL)：
K-buffer(K2HPO4 20g，KH2PO4 14.5g，加水至100mL，pH7.0)  1mL
M-N(MgSO4·7H2O 3g，NaCl 1.5g，加水至100mL)             2mL
1％CaCl2·2H2O水溶液(质量百分比)                        0.1mL
微量元素(ZnSO4·7H2O 0.01g，CuSO4·5H2O 0.01g，H3BO30.01g，MnSO4·H2O 0.01g，Na2MoO4·2H2O 0.01g，加水至100mL)                           1mL
20％NH4NO3水溶液(质量百分比)                            0.25mL
20％葡萄糖水溶液(质量百分比)                            1mL
0.01％FeSO4水溶液(质量百分比)                           1mL
50％甘油(质量百分比)                                    1mL
2-(N-吗啡啉)乙磺酸(1M，pH5.3)                           4mL
50mg/mL卡那霉素水溶液                                   0.15mL
乙酰丁香酮                                              0.2mL
纯水                                                    88.5mL
(3)CM培养基(100mL)：
K-buffer(K2HPO4 20g，KH2PO4 14.5g，加水至100mL，pH7.0)  1mL
M-N(MgSO4·7H2O 3g，NaCl 1.5g，加水至100mL)             2mL
1％CaCl2·2H2O水溶液(质量百分比)                        0.1mL
微量元素(ZnSO4·7H2O 0.01g，CuSO4·5H2O 0.01g，H3BO30.01g，MnSO4·H2O 0.01g，Na2MoO4·2H2O 0.01g，加水至100mL)                           1mL
20％NH4NO3水溶液(质量百分比)                            0.25mL
20％葡萄糖水溶液(质量百分比)                            1mL
0.01％FeSO4水溶液(质量百分比)                           1mL
50％甘油(质量百分比)                                    1mL
2-(N-吗啡啉)乙磺酸(1M，pH5.3)                           4mL
50mg/mL卡那霉素水溶液                                   0.15m
乙酰丁香酮                                              0.2mL
琼脂                                                    1.5g
纯水                                                    88.5mL
(4)TSA培养基(1L)
蛋白胨；                                         17g
酶消化豆粕(购自OXOID公司，产品目录号为CM0129)    3g
葡萄糖                                           2.5g
NaCl                                             5g
K2HPO4                                           2.5g
琼脂                                             15g
纯水                                             1L
四、含有cefF基因的顶头孢霉工程菌株的应用
1、发酵实验
对步骤三获得的顶头孢霉cefF基因工程菌和野生型对照菌株进行多次摇瓶发酵；将摇瓶内的所有物质记作发酵液。
顶头孢霉cefF基因工程菌摇瓶发酵：
(1)将顶头孢霉cefF基因工程菌和野生型对照菌株接种在产孢培养基琼脂平板上，暗处28℃生长7天，收集孢子；
(2)分别取1mL顶头孢霉cefF基因工程菌和野生型对照菌株的孢子悬液(107个/mL)加100mL种子液培养基(500mL锥形瓶)，28℃，摇床培养48h；
(3)分别取10mL生长48h的顶头孢霉cefF基因工程菌和野生型对照菌株种子液，加入到100mL发酵培养基中(500mL锥形瓶)，28℃，摇床培养7天。
顶头孢霉产孢培养基：
葡萄糖                          1g
酵母抽提物                      2g
NaCl                            1.5g
CaCl2                           10g
琼脂                            25g
加蒸馏水至1L，pH 6.8。
顶头孢霉种子液培养基MDIA：
葡萄糖                          10g
CaCO3                           5g
玉米浆                          30g
淀粉                            30g
加蒸馏水至1L，pH 7.0。
顶头孢霉发酵培养基MDFA：
蔗糖                        36g
葡萄糖                      27g
DL-甲硫氨酸                 3.2g
L-天冬氨酸                  12g
2％Fe(NH4)(SO4)2·6H2O      8mL
微量元素液                  144mL
加蒸馏水至1L，pH 7.4，
上述微量元素液：
K2HPO4                      104g
KH2PO4                      102g
Na2SO4·10H2O               11.5g
MgSO4·7H2O                 2.4g
ZnSO4·7H2O                 0.2g
MnSO4·H2O                  0.2g
CuSO4·5H2O                 0.05g
CaCl2·2H2O                 0.5g
加蒸馏水至1L。
2、对发酵液中DAOC与CPC的高效液相色谱分析和质谱分析
将上述步骤1得到的顶头孢霉cefF基因工程菌和野生型对照菌株的发酵液分别在室温离心，13000rpm，离心10分钟，取上清进行高效液相色谱分析和质谱分析。
标准品为头孢霉素C锌盐(Cephalosporin C zinc salt)(购自sigma公司，产品目录号为C3270)采用Agilent液质联用系统(Agilent 1200&6520Q-TOF mass)进行分析。
色谱条件：
色谱柱：Thermo Hypersil Gold C18(4.6×25cm，5μm)；
流动相：乙腈(acetonitrile)∶0.05％甲酸(methanoic acid)(梯度：从2∶98(v/v)到20∶80(v/v)，20min)；
柱温：35℃；
流速：1mL/min；
进样量：20μL。
质谱检测条件：正离子模式；加热管温度：300℃；干燥气体流速：10L/min；碎裂电压：115V；扫描范围：100-1000。
结果：
在如上条件下，Cephalosporin C zinc salt标准品中CPC的保留时间为10.2min，DAOC的保留时间为9.5min。野生型顶头孢霉的发酵液中，CPC和DAOC的保留时间如图5中A所示，其中CPC的保留时间为10.279min，DAOC的保留时间为9.476min；CPC和DAOC的峰面积值如图5中B所示，DAOC与CPC的峰面积比值为1.60。顶头孢霉cefF基因工程菌的发酵液中，CPC和DAOC的保留时间如图6中A所示，其中CPC的保留时间为10.253min，DAOC的保留时间为9.530min；CPC和DAOC的峰面积值如图6中B所示，DAOC与CPC的峰面积比值为0.24；从图5中B和图6中B可见，顶头孢霉cefF基因工程菌与野生型对照菌株相比，发酵液中DAOC的含量显著下降，CPC的含量升高，同时，DAOC与CPC含量的比值下降。与此结果说明，构建的顶头孢霉cefF基因工程菌可生产更高纯度的头孢菌素(CPC)。
Figure IDA0000045928690000011
Figure IDA0000045928690000031
Figure IDA0000045928690000041
Figure IDA0000045928690000051
Figure IDA0000045928690000061

Claims (10)

1.顶头孢霉cefF基因工程菌(Acremonium chrysogenum)，其保藏号为CGMCC No.4515。
2.一种基因工程菌，为将如下融合基因导入宿主菌得到的基因工程菌：序列表中序列1中第7-1194位核苷酸所示DNA片段与蛋白cefF的编码基因构成的融合基因。
3.根据权利要求2所述的基因工程菌，其特征在于：
所述蛋白cefF的编码基因的核苷酸序列如序列表中序列1中第1203-2275位核苷酸所示；
所述宿主菌为顶头孢霉菌(Acremonium chrysogenum)；
所述融合基因是通过重组表达载体导入宿主菌的。
4.根据权利要求2或3所述的基因工程菌，其特征在于：
所述重组表达载体为将所述融合基因插入表达载体pAg1-H3的多克隆位点得到的重组表达载体；
所述融合基因的核苷酸序列为序列表中序列1所示。
5.权利要求1所述的顶头孢霉cefF基因工程菌或权利要求2-4中任一所述的基因工程菌在生产头孢菌素C中的应用。
6.含有如下融合基因的重组质粒：序列表中序列1中第7-1194位核苷酸所示DNA片段与蛋白cefF的编码基因构成的融合基因。
7.根据权利要求6中所述的重组质粒，其特征在于：
所述重组质粒为将所述融合基因插入表达载体pAg1-H3的多克隆位点得到的重组表达载体；
所述蛋白cefF的编码基因的核苷酸序列如序列表中序列1中第1203-2275位核苷酸所示；
所述融合基因的核苷酸序列为序列表中序列1所示。
8.蛋白cefF或蛋白cefF的编码基因在用发酵菌制备头孢菌素C的过程中降低产物中去乙酰氧头孢菌素C的产量中的应用。
9.根据权利要求8中所述的应用，其特征在于：所述蛋白cefF的编码基因的核苷酸序列如序列表中序列1中第1203-2275位核苷酸所示。
10.一种制备头孢菌素C的方法，包括如下步骤：发酵权利要求1所述的顶头孢霉cefF基因工程菌或权利要求2-4中任一所述工程菌，得到头孢菌素C。
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