CN102719473A

CN102719473A - 一种顶头孢霉工程菌及其构建方法

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Publication number: CN102719473A
Application number: CN2012102221870A
Authority: CN
Inventors: 刘钢; 龙良鲲; 刘莉
Original assignee: Institute of Microbiology of CAS
Current assignee: Institute of Microbiology of CAS
Priority date: 2012-06-28
Filing date: 2012-06-28
Publication date: 2012-10-10
Anticipated expiration: 2032-06-28
Also published as: CN102719473B

Abstract

本发明公开了一种顶头孢霉工程菌及其构建方法。该方法是抑制顶头孢霉（Acremonium chrysogenum）中序列表序列1蛋白的表达得到的头孢菌素C合成能力高于所述顶头孢霉（Acremonium chrysogenum）的菌株。实验证明：敲除了顶头孢霉中硫氧还蛋白还原酶编码基因的顶头孢霉工程菌，其头孢菌素C产量与野生型顶头孢霉相比提高近1倍。本发明对提高头孢菌素C的生产效率具有重要应用价值。

Description

一种顶头孢霉工程菌及其构建方法

技术领域

本发明涉及一种顶头孢霉工程菌及其构建方法。

背景技术

头孢菌素C（Cephalosporin C，CPC）是生产头孢类抗生素重要中间体7-氨基头孢烷酸(7-ACA)的主要原料。目前，工业上主要利用顶头孢霉（Acremoniumchrysogenum）发酵获得CPC。头孢菌素C在顶头孢霉中的生物合成途径已经研究清楚，且顶头孢霉的遗传操作系统已经成熟，这为利用基因工程手段改造这一重要的工业真菌奠定了良好基础。

丝状真菌的次级代谢往往与其体内的氧化还原平衡有着一定的联系，当细胞处于一定的氧化状态时可能更有利于某些次级代谢产物的合成。硫氧还蛋白系统（thioredox system）是存在于绝大多数生物体中的一类抗氧化系统，具有十分广泛的功能。硫氧还蛋白从氧化态转化成还原态依赖于硫氧还蛋白还原酶（thioredoxinreductase，TrxR)的催化作用。因而，TrxR对于胞内的氧化还原平衡或某些蛋白分子的氧化还原状态具有重要的调控作用。破坏顶头孢霉的TrxR编码基因（TrxR）可能会导致细胞的氧化压力增强，并刺激头孢菌素的生物合成。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种顶头孢霉工程菌的构建方法，是抑制顶头孢霉（Acremonium chrysogenum）中序列表序列1所示蛋白的表达得到的头孢菌素C合成能力高于所述顶头孢霉（Acremonium chrysogenum）的工程菌菌株。

在上述方法中，所述抑制顶头孢霉（Acremonium chrysogenum）中序列表序列1蛋白的表达通过敲除序列表序列1所示蛋白的编码基因实现。

在上述方法中，所述敲除序列表序列1所示蛋白的编码基因通过同源重组的方式进行。

在上述方法中，所述蛋白的编码基因为如下1）或2）或3）的基因：

1）序列表序列2所示的DNA分子；

2）与1）限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同一性且编码序列表序列1所示蛋白的DNA分子；

3）在严格条件下与1）或2）限定的DNA序列杂交且编码序列表序列1所示蛋白的DNA分子；

所述严格条件可为如下：50℃，在7％十二烷基硫酸钠（SDS）、0.5M Na₃PO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，2×SSC，0.1%SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M Na₃PO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，1×SSC，0.1%SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M Na₃PO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.5×SSC，0.1%SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M Na₃PO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.1×SSC，0.1%SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M Na₃PO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在65℃，0.1×SSC，0.1%SDS中漂洗；也可为：在6×SSC，0.5%SDS的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1%SDS和1×SSC，0.1%SDS各洗膜一次。

在上述方法中，所述敲除包括将如下DNA片段导入所述顶头孢霉的步骤：5’端连接有序列表序列3所示序列且3’端连接有序列表序列4所示序列的DNA片段。

在上述方法中，所述DNA片段是通过重组质粒pAg1-ActrxRDM导入所述顶头孢霉的，所述重组质粒pAg-1ActrxRDM是在质粒pAg1-H3的SmaI和ApaI的位点间连入序列表序列3所示的DNA片段，在AscI和SwaI的位点间连入序列表序列4所示的DNA片段，和在SwaI的位点处连入序列表序列5的第10-1175位所示的DNA片段。

在上述方法中，所述顶头孢霉（Acremonium chrysogenum）为顶头孢霉（Acremoniumchrysogenum）CGMCC 3.3795。

本发明保护上述任一所述方法获得的顶头孢霉（Acremonium chrysogenum）工程菌菌株，具体可为顶头孢霉（Acremonium chrysogenum）ActrxRDM，在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCC No.6205。

顶头孢霉（Acremonium chrysogenum）ActrxRDM CGMCC No.6205未发现有性阶段，在正常培养条件下菌丝呈丝状生长，菌丝有隔，菌丝宽3-5μm；生长后期能形成产孢菌丝，产孢菌丝顶端形成分生孢子，分生孢子无隔膜（单核，极少双核），分生孢子大小范围1.1-1.3μm×3.2-3.8μm；该菌可正常利用葡萄糖、蔗糖、甘油等碳源，及蛋白胨、天冬碱、乙酸胺等氮源，最适生长温度28℃，最适生长pH 6.8；在化学合成培养基（如MMC和MDFA）中，该菌株的分生孢子不能正常萌发，菌丝则生长十分缓慢，但培养基中加入甲硫氨酸后，其生长可恢复正常；生长后期，该菌株可合成头孢菌素及黄色素；液体发酵条件下，菌丝可分化成单细胞或双细胞的节孢子或节孢子链，甲硫氨酸可促进这种形态分化。

本发明保护所述顶头孢霉（Acremonium chrysogenum）工程菌菌株在制备头孢霉素C中的应用。

本发明保护培养所述顶头孢霉（Acremonium chrysogenum）工程菌的培养基，即在用于培养顶头孢霉（Acremonium chrysogenum）的培养基中添加甲硫氨酸。

本发明保护所述重组质粒pAg1-ActrxRDM，该质粒可用于敲除顶头孢霉（Acremonium chrysogenum）基因组上的编码序列表序列1所示蛋白的基因。

保藏说明

菌种名称：顶头孢霉

拉丁名：Acremonium chrysogenum

菌株编号：ActrxRDM

保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心

保藏机构简称：CGMCC

地址：北京朝阳区北辰西路1号院3号

保藏日期：2012年6月12日

保藏中心登记入册编号：CGMCC No.6205

本发明通过基因克隆和序列分析，获得了顶头孢霉（Acremonium chrysogenum）的硫氧还蛋白还原酶及其编码基因，并基于硫氧还蛋白还原酶具有催化硫氧还蛋白从氧化态转化成还原态的作用，且氧化压力增强会刺激顶头孢霉头孢菌素的生物合成的原理，通过实验证明：敲除了顶头孢霉中硫氧还蛋白还原酶编码基因的顶头孢霉工程菌，其头孢菌素C的产量与野生型顶头孢霉相比提高近1倍。本发明对工业生产中提高头孢菌素C的生产效率具有重要的应用价值。

附图说明

图1为顶头孢霉（Acremonium chrysogenum）基因ActrxR编码的蛋白序列与已知的硫氧还蛋白还原酶序列的比对结果。其中，A.chr代表顶头孢霉（Acremoniumchrysogenum），P.chr代表产黄青霉（Penicillium chrysogenum），E.coli代表大杆菌(Escherichia coli)，S.cla代表带小棒链霉菌（Streptomyces clavuligerus）。

图2为基因敲除质粒pAg1-ActrxRDM的构建过程。

图3为菌落PCR筛选转化子的原理示意图（A）及扩增产物电泳图（B）。

图4为甲硫氨酸（Met）对恢复顶头孢霉基因工程菌株正常生长的测定。

图5为顶头孢霉基因工程菌株发酵液在枯草芽孢杆菌培养基上的抑菌圈。其中，WT为野生型顶头孢霉，DM为顶头孢霉基因工程菌株，PenG（青霉素G）为检测青霉素类物质残留的对照。

图6为顶头孢霉基因工程菌株发酵培养过程中CPC合成基因的相对表达量。其中，WT为野生型顶头孢霉，DM为顶头孢霉基因工程菌株。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、基因敲除载体pAg1-ActrxRDM的构建

1、顶头孢霉硫氧还蛋白还原酶编码基因ActrxR的获得

分析顶头孢霉（Acremonium chrysogenum）CGMCC 3.3795的全基因组序列，获得一个候选的硫氧还蛋白还原酶编码基因ActrxR（Genbank号：JN389793，其序列如序列表序列2所示）。采用Trizol试剂分离顶头孢霉CGMCC 3.3795的总RNA，并进行反转录获得cDNA。以高保真酶（KOD-Plus）和引物trxR-F1/trxR-R1进行PCR扩增获得ActrxR的cDNA，并进行DNA测序分析，将ActrxR的编码序列与序列如序列表序列2所示序列进行比对，发现ActrxR的编码序列被4个内含子（其序列分别为序列表序列2的第20-105位、第169-234位、第355-421位和第1122-1210位）间隔开。根据ActrxR的编码序列推测得出对应的蛋白序列（如序列表序列1所示），将该蛋白序列与已知的硫氧还蛋白还原酶序列进行比对分析，鉴定出ActrxR编码的蛋白含有硫氧还蛋白还原酶家族的典型保守结构域：黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）结合区I和Ⅱ、还原型辅酶Ⅱ(NADPH)结合区以及氧化还原功能结构域（Redox）（如图1所示），确定ActrxR基因编码硫氧还蛋白还原酶。

上述引物的序列（5′端-3′端）如下：

t rxR-F 1：ATGCACAGCAAGGTTGTCAGTA；

trxR-R1：CTACTCACGGTCGTCGACCTC。

2、构建基因敲除质粒pAg1-ActrxRDM

以顶头孢霉（Acremonium chrysogenum）CGMCC 3.3795基因组DNA为模板，在高保真酶（KOD-Plus）作用下，分别用引物trxR-LB-F（5’端含SmaI识别序列和保护碱基）/trxR-LB-R（5’端含ApaI识别序列和保护碱基）和trxR-RB-F（5’端含AscI识别序列和保护碱基）/trxR-RB-R（5’端含SwaI识别序列和保护碱基）扩增ActrxR基因的5’端区域（记为LB，2408bp，其序列见序列表序列3）和3’端区域（记为RB，2347bp，其序列见序列表序列4）的DNA片段，得到两端含有限制性内切酶识别序列的LB和RB片段，经测序验证正确。

将上述扩增得到的LB片段用SmaI和ApaI双酶切，与经SmaI和ApaI双酶切的质粒pAg1-H3（文献：Zhang,A.,Lu,P.,Dahl-Roshak,A.M.,Paress,P.S.,Kennedy,S.,Tkacz,J.S.,An,Z.,2003.Efficient disruption of a polyketide synthasegene(pks 1)required for melanin synthesis through Agrobacterium-mediatedtransformation of Glarea lozoyensis.Mol Gen Genomics 268,645-655.公众可从中国科学院微生物研究所获得）的骨架片段连接，获得中间载体；将上述扩增得到的RB片段用AscI和SwaI双酶切，与经AscI和SwaI双酶切的上述中间载体的骨架片段连接，获得载体pAg1-1；以质粒pUC43为模板，用引物ble-F（5’端含SwaI识别序列和保护碱基）/ble-R（5’端含SwaI识别序列和保护碱基）扩增得到1.1kb的两端含SwaI识别序列的博莱霉素抗性表达框(ble)（序列如序列表序列5所示），将该表达框用SwaI酶切，与经SwaI酶切的载体pAg1-1的线性片段相连，获得基因敲除质粒pAg1-ActrxRDM，经测序验证正确，即基因敲除质粒pAg1-ActrxRDM是在质粒pAg1-H3的SmaI和ApaI位点间插入了LB片段，在AscI和SwaI位点间插入了RB片段，且在SwaI位点处插入了序列表序列5的第10-1175位所示的博莱霉素抗性表达框(ble)。

基因敲除质粒pAg1-ActrxRDM的构建过程如图2所示。

上述引物序列（5′端-3′端，下划线部分为限制性内切酶识别序列）如下：

trxR-LB-F：CCCCCGGGCGCCAAGTCTCGCCTTATGA；

trxR-LB-R：GGGGGCCCTATGGTGCTGGGCTGGGTAG；

trxR-RB-F：AGGCGCGCCGGAAGAGTCTCGGCTGATTG；

trxR-RB-R：GATTTAAATCCTGACGCCCACCTTTAT；

ble-F：GATTTAAATCGAGGTCGACATGGATACCCT；

ble-R：GATTTAAATGTCGGTCAGTCCTGCTCCTC。

实施例2、基因敲除质粒pAg1-ActrxRDM转化根癌农杆菌

取1μg质粒pAg1-ActrxRDM的DNA加入根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)AGL-1（文献：Mullins,E.D.,Chen,X.,Romaine,P.,Raina,R.,Geiser,D.M.,Kang,S.,2001.Agrobacterium-mediated transformation of Fusariumoxysporum:an efficient tool for insertional mutagenesis and gene transfer.Phytopathology.91:173-180.公众可从中国科学院微生物研究所获得）的感受态细胞中混匀，放入液氮中5分钟。取出，立即在42℃热激2分钟后加入700μL LB液体培养基，28℃振荡培养2小时。将菌液均匀涂布在含有75μg/ml卡那霉素的LB琼脂平板上，28℃倒置培养2天，得到含有重组质粒pAg1-ActrxRDM的根癌农杆菌单菌落。

实施例3、构建敲除ActrxR基因的顶头孢霉基因工程菌株

1、根癌农杆菌介导的遗传转化及菌株的初步抗性筛选

将实施例2获得的含有重组质粒pAg1-ActrxRDM的根癌农杆菌单菌落接种于5mLMM液体培养基中，28℃振荡培养2天，用IM培养基将菌体稀释到D₆₀₀=0.15，28℃振荡培养6小时，至OD₆₀₀=0.6，取100μL菌液与等体积的顶头孢霉（Acremoniumchrysogenum）CGMCC 3.3795孢子悬液混合（悬液浓度=2×10⁷个孢子/mL），均匀涂布在CM琼脂平板（铺有玻璃纸）上，25℃正置共培养3天。将共培养菌体转接至含有50μg/mL潮霉素B和200μg/mL噻孢霉素钠的TSA琼脂平板上，28℃倒置培养5-7天至含有潮霉素B抗性基因的转化子长出。将获得的转化子编号并接种到含10μg/mL博莱霉素的TSA平板上，筛选博莱霉素抗性敏感而具有潮霉素B抗性的转化子。

2、菌落PCR筛选敲除ActrxR基因的顶头孢霉基因工程菌株

将步骤1获得的博莱霉素抗性敏感而具有潮霉素B抗性的转化子分别进行如下两个PCR反应：

PCR1（图3A）：根据ActrxR和hph（潮霉素抗性基因）两端的LB和RB序列设计引物DI_F/DI_R，目的产物分别为2.3kb和2.7kb；

PCR2（图3A）：根据ActrxR上的一段基因组DNA序列设计引物Trx_q_f/Trx_q_r，目的产物为127bp；

同时以质粒pAg1-ActrxRDM（P）、未经转化的顶头孢霉（Acremonium chrysogenum）CGMCC 3.3795菌株（WT）和无菌水（NC）为对照，PCR扩增产物进行琼脂糖电泳检测，结果如图3B所示。

图3B中，未经转化的顶头孢霉（Acremonium chrysogenum）CGMCC 3.3795菌株（WT）在PCR1中得到2.3kb的一条带，且PCR2中有127bp的一条带的菌株；质粒pAg1-ActrxRDM（P）在PCR1中得到2.7kb的一条带；无菌水（NC）在两个PCR反应中均无扩增条带；PCR1得到2.7kb的一条带，且PCR2未得到127bp的一条带的菌株为敲除ActrxR基因的顶头孢霉基因工程菌株（DM）；PCR1得到2.3kb和2.7kb两条带，且PCR2得到127bp的一条带的菌株为发生单交换未敲除ActrxR基因顶头孢霉转化子（T1）。

上述引物序列（5′端-3′端）如下：

DI_F：CTCATCACGCCAACGCTTAGT（对应于序列表序列3的第2217-2237位）；

DI_R：GACCTGTCCAAGTGGCGAGA（对应于序列表序列4的第92-73位）；

Trx_q_f：TACGGGTAAGGAGGAGGTGGTC（对应于序列表序列2的第912-933位）；

Trx_q_r：GCCAGGCTTGGTGATGATGTAG（对应于序列表序列2的第1038-1017位）。

上述培养基的配方如下：

TSA培养基（1000mL）：胰蛋白胨17g，大豆蛋白胨3g，葡萄糖2.5g，NaCl5g，K₂HPO₄·3H₂O 2.5g，琼脂15g，pH7.0。

表1.MM、IM和CM培养基配方:

注：试剂6、7、9和11的储存液分别进行过滤除菌，并于-20℃储存备用。

实施例4、甲硫氨酸（Met）对恢复顶头孢霉基因工程菌株正常生长的测定

1、随机取3株实施例3获得的敲除ActrxR基因的顶头孢霉基因工程菌株（DM）和野生型顶头孢霉（Acremonium chrysogenum）CGMCC 3.3795（WT），分别用培养基LPE平板培养获得分生孢子后配制成约1×10⁷个/mL的孢子悬液。

2、制备培养基MMC平板，以及分别含0.001%或0.1%（W/V）的DL型甲硫氨酸（DL-Met）的MMC平板。

3、从步骤1两种孢子悬液中分别取1μL的点接到步骤2的三种平板上，28℃培养4天，观察菌落生长情况（图4）。

结果显示，WT在三种平板上均可正常生长；而DM在不含DL-Met的平板上不能正常萌发和生长，当添加了DL-Met后，DM可以正常生长，随着DL-Met浓度的提高，其生长接近野生型WT水平。

上述培养基LPE和培养基MMC的配方如下：

LPE培养基（1000mL）：葡萄糖1g,酵母浸取物2g,NaCl 1.5g,CaCl₂10g,琼脂25g,pH 6.8。

MMC培养基（1000mL）：蔗糖31.6g,葡萄糖2.2g,L-天冬碱7.5g,CH₃COONH₄0.22g,KH₂PO₄15g,K₂HPO₄·3H₂O 27g,Na₂SO₄0.75g,MgSO₄·7H₂O 0.18g,CaCl 20.06g,1ml盐溶液（1.3%Fe(NH₄)₂(SO₄)₂·6H₂O,0.3%MnSO₄·4H₂O,0.3%ZnSO₄·7H₂O,0.08%CuSO₄·5H₂O），琼脂15g，pH 7.0。

实施例5、顶头孢霉基因工程菌株的发酵及头孢菌素C的产量测定

取实施例4中的3株敲除ActrxR基因的顶头孢霉基因工程菌株（DM）和野生型顶头孢霉（Acremonium chrysogenum）CGMCC 3.3795（WT），按照如下步骤进行发酵和头孢菌素C的产量测定：

1、发酵培养：用培养基LPE平板培养获得分生孢子，分别取约4×10⁷个孢子分别接入40ml MDFA培养液（250ml三角瓶）中，28℃、220rpm培养2天获得种子液。分别取种子液按5%的比例接入25ml的MDFA培养液（250ml三角瓶）中，28℃、220rpm发酵培养5天。收集样品，离心取上清（即发酵液）进行步骤2的生物活性检测，并测定菌体的生物量（干重）。

2、生物活性检测：取枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）CGMCC 1.1630用LB液体培养基在37℃、220rpm培养2-3小时，再用LB液体培养基将该菌液稀释至D₆₀₀=0.2，获得枯草芽孢杆菌稀释菌液。取1ml的枯草芽孢杆菌稀释菌液及1ml青霉素酶(Penicillinase，2×10⁶U/ml，TOKYO，日本)添加到融化的100ml LB软琼脂培养基中，充分混匀后倒制含枯草芽孢杆菌的平板，待琼脂完全凝固后，用打孔器（直径6mm）打孔，并取20-40μl步骤1获得的发酵液上清点接到孔中，28℃培养20小时，测量抑菌圈大小。同时以一系列浓度(25、50、100、200、400μg/ml)的CPC-Zn水溶液作为标准品，测定计算发酵产头孢菌素C的水平。结果如表2和图5。

CPC-Zn效价测定的标准曲线方程为：y=2.3422x+2.2161（R²=0.9968）；

其中，y=LN[CPC-Zn,μg/ml]，x=抑菌圈直径(cm)-孔直径(cm)。

表2.顶头孢霉野生型菌株和基因工程菌株发酵菌体生物量和头孢菌素产量的比较

菌株	生物量(mg/ml)	头孢菌素C(μg/ml)
			野生型菌株(WT)	25.6±1.7	72.7±4.8
基因工程菌株（DM）	24.6±1.9	136.2±1.7

上述MDFA培养液（1000mL）的组成如下：

蔗糖36g,DL-Met 3.2g,L-天冬碱7.5g,Fe(NH₄)₂(SO₄)₂·6H₂O 0.16g,溶液I20ml,溶液Ⅱ40ml,溶液Ⅲ144ml,溶液Ⅳ8ml,pH 7.4。

溶液I:50%葡萄糖溶液；

溶液Ⅱ:50%甘油溶液；

溶液Ⅲ(1000ml):K₂HPO₄·3H₂O 128.61g,KH₂PO₄·H₂O 102g,NaSO₄·10H₂O 11.5g,MgSO₄·7H₂O 2.4g,ZnSO₄·7H₂O 0.2g,MnSO₄·4H₂O 0.2g,CuSO₄·5H₂O 0.05g,CaCl₂·2H₂O 0.5g；

溶液Ⅳ:2%Fe(NH₄)₂(SO₄)₂·6H₂O溶液。

从实施例5的3株敲除ActrxR基因的顶头孢霉基因工程菌株（DM）中随机取一株编号为ActrxRDM，2012年6月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），分类名称为顶头孢霉（Acremonium chrysogenum），保藏编号为CGMCC No.6205。

实施例6、顶头孢霉基因工程菌株中CPC生物合成基因的转录分析

用Trizol试剂分别提取经实施例5发酵培养1天、2天、3天和4天的野生型顶头孢霉菌（WT）和3株敲除ActrxR基因的顶头孢霉基因工程菌株（DM）的菌体样品总RNA。取1μg的RNA用PrimeScript^TMRT试剂盒(TaKaRa,Japan)合成cDNA。以该cDNA为模板，用引物cefEF-F/cefEF-R和cefG-F/cefG-R分别对CPC合成基因cefEF（Genbank号：AJ404737.1）和cefG（Genbank号：M91649.1）进行实时定量PCR，结果如图6所示。

引物cefEF-F/cefEF-R和cefG-F/cefG-R的序列（5′端-3′端）如下：

cefEF-F：CCGTAACCACCAAGGGTATCT；

cefEF-R：CTCCTCGCTTCCGTTCTTGA；

cefG-F：AAGAGCAAACCTGCGATGGA；

cefG-R：TCTGTGCCGTTGATTTCCTTCT。

反应程序：95℃预变性30s；95℃变性5s，58℃退火30s，72℃延伸15s（40个热循环）。设置不添加反转录产物的阴性对照。同时，以β-aactin基因表达为内参，Pfaffl’s方法计算目标基因的相对转录水平（即相对表达量）。

结果表明：在发酵前期（1-2天），敲除ActrxR基因的顶头孢霉基因工程菌株（DM）的CPC合成基因cefEF和cefG的转录水平均明显高于野生型顶头孢霉菌（WT），这进一步验证了基因工程菌株的CPC合成能力增强。

Claims

1.一种顶头孢霉（Acremonium chrysogenum）工程菌的构建方法，是抑制顶头孢霉（Acremonium chrysogenum）中序列表序列1所示蛋白的表达得到的头孢菌素C合成能力高于所述顶头孢霉（Acremonium chrysogenum）的工程菌菌株。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述抑制顶头孢霉（Acremoniumchrysogenum）中序列表序列1所示蛋白的表达通过敲除序列表序列1所示蛋白的编码基因实现。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：序列表序列1所示蛋白的编码基因为如下1）或2）或3）的基因：

1）序列表序列2所示的DNA分子；

3）在严格条件下与1）或2）限定的DNA序列杂交且编码序列表序列1所示蛋白的DNA分子。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述敲除包括将如下DNA片段导入所述顶头孢霉的步骤：5’端连接有序列表序列3所示序列且3’端连接有序列表序列4所示序列的DNA片段。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述DNA片段是通过重组质粒pAg1-ActrxRDM导入所述顶头孢霉的，所述重组质粒pAg-1ActrxRDM是在质粒pAg1-H3的SmaI和ApaI的位点间连入序列表序列3所示的DNA片段，在AscI和SwaI的位点间连入序列表序列4所示的DNA片段，和在SwaI的位点处连入序列表序列5的第10-1175位所示的DNA片段。

6.根据权利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于：所述顶头孢霉（Acremoniumchrysogenum）为顶头孢霉（Acremonium chrysogenum）CGMCC 3.3795。

7.权利要求1-6中任一所述方法获得的顶头孢霉（Acremonium chrysogenum）工程菌菌株，具体为顶头孢霉（Acremonium chrysogenum）ActrxRDM,在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCC No.6205。

8.权利要求7所述顶头孢霉（Acremonium chrysogenum）工程菌菌株在制备头孢菌素C中的应用。

9.培养权利要求7所述顶头孢霉（Acremonium chrysogenum）工程菌菌株的培养基，其特征在于：在用于培养顶头孢霉（Acremonium chrysogenum）的培养基中添加甲硫氨酸。

10.权利要求5所述方法中的所述重组质粒pAg1-ActrxRDM。