CN105647821B

CN105647821B - 一株瑞氏木霉工程菌CstrxR1及其构建方法和应用

Info

Publication number: CN105647821B
Application number: CN201610174130.6A
Authority: CN
Inventors: 龙良鲲; 丁少军; 丁达繁; 徐梅娟
Original assignee: Nanjing Forestry University
Current assignee: Nanjing Forestry University
Priority date: 2016-03-24
Filing date: 2016-03-24
Publication date: 2018-12-18
Anticipated expiration: 2036-03-24
Also published as: CN105647821A

Abstract

本发明公开了一株瑞氏木霉工程菌CstrxR1及其构建方法和应用。瑞氏木霉工程菌CstrxR1，分类名称为瑞氏木霉Trichoderma reesei CstrxR1，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为：2016年3月1日，保藏编号为CCTCC NO:M2016078，保藏地址为中国湖北武汉武汉大学。本发明的瑞氏木霉工程菌CstrxR1，其各纤维素酶产量与瑞氏木霉亲本菌株相比提高0.78倍。本发明对提高纤维素酶生产效率具有重要应用价值。

Description

一株瑞氏木霉工程菌CstrxR1及其构建方法和应用

技术领域

本发明属于工程菌技术领域，具体涉及一株瑞氏木霉工程菌CstrxR1及其应用。

背景技术

纤维素酶是能将纤维素降解为葡萄糖单体的一组酶系的总称，通常包括内切型葡聚糖酶、外切型葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶。纤维素酶资源对于可持续利用生物质资源具有重要意义，可广泛应用于生物能源、饲料、洗涤、造纸及植物源活性物质制备等领域。瑞氏木霉（Trichoderma reesei）能够产生完整的纤维素酶系，是工业生产纤维素酶的重要菌株。当前，传统的诱变育种技术难以继续提升瑞氏木霉产纤维素酶的能力。借助基因工程手段改良瑞氏木霉的纤维素酶产生能力，成为降低纤维素酶生产成本的有效途径。

丝状真菌的细胞氧化还原状态能够控制许多重要基因的表达调控。硫氧还蛋白系统（thioredoxin system）是存在于绝大多数生物体中的一类抗氧化系统，具有调控细胞氧化还原平衡等多种重要功能。硫氧还蛋白从氧化态转化成还原态依赖于硫氧还蛋白还原酶（thioredoxin reductase，TrxR）的催化作用。因而，TrxR对于胞内的氧化还原平衡或某些蛋白分子的氧化还原状态具有重要的调控作用。瑞氏木霉细胞中具有高水平的 TrxR会极大的改变其细胞氧化还原状态，进而增强相关蛋白（如纤维素酶）分子的基因表达。

发明内容

发明目的：针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一株瑞氏木霉工程菌CstrxR1，能高产纤维素酶。本发明的另一目的是提供上述瑞氏木霉工程菌CstrxR1的构建方法。

技术方案，为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：

一株瑞氏木霉工程菌CstrxR1，分类名称为瑞氏木霉Trichoderma reesei CstrxR1，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为：2016年3月1日，保藏编号为CCTCCNO：M2016078，保藏地址为：中国湖北武汉武汉大学。

在所述的瑞氏木霉工程菌CstrxR1中克隆有来自于虫拟蜡菌的硫氧还蛋白还原酶基因序列，该基因序列如SEQ ID NO.1所示。

构建所述瑞氏木霉工程菌CstrxR1的方法：将序列如SEQ ID NO.1所示的DNA片段通过质粒pAg1-CstrxR1导入瑞氏木霉基因组，所述质粒pAg1-CstrxR1是在质粒pAg1-H3的KpnI和ApaI位点顺序装入瑞氏木霉纤维二糖水解酶I启动子序列Pcbh1、序列如SEQ IDNO.1所示的DNA片段和瑞氏木霉纤维二糖水解酶I 终止序列Tcbh1。

所述瑞氏木霉为瑞氏木霉D-86271。

所述的瑞氏木霉工程菌CstrxR1在产纤维素酶中的应用。

有益效果：与现有技术相比，本发明成功构建出瑞氏木霉工程菌CstrxR1，通过实验证明高表达虫拟蜡菌中硫氧还蛋白还原酶编码基因的瑞氏木霉工程菌，其纤维素酶产量（滤纸酶活）与亲本瑞氏木霉相比提高0.78倍。本发明对工业生产中提高纤维素酶生产效率具有重要的应用价值。

附图说明

图1是表达质粒pAg1-CstrxR1的图；

图2是基因CstrxR1大肠杆菌重组表达SDS-PAGE电泳检测图；

图3是CstrxR1基因瑞氏木霉转化株的鉴定图；

图4是固态发酵条件下瑞氏木霉基因工程菌株纤维素酶产量的比较图；D-86271为未转化亲本菌株，CstrxR1为瑞氏木霉基因工程菌，CK为含空载体的瑞氏木霉转化菌株；

图5是固态发酵条件下瑞氏木霉基因工程菌株胞外蛋白的比较结果图；D-86271为未转化亲本菌株，CstrxR1为瑞氏木霉基因工程菌，CK为含空载体的瑞氏木霉转化菌株；

图6是固态发酵条件下瑞氏木霉基因工程菌株生物量的比较结果图；D-86271为未转化亲本菌株，CstrxR1为瑞氏木霉基因工程菌；

图7是瑞氏木霉基因工程菌株发酵培养过程中纤维素酶合成基因的相对表达量结果图；其中，D-86271为未转化亲本菌株，CstrxR1为瑞氏木霉基因工程菌。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1 基因表达载体pAg1-CstrxR1的构建

1、虫拟蜡菌硫氧还蛋白还原酶编码基因CstrxR1的获得及E. coli 表达

分析虫拟蜡菌（Ceriporiosis subvermispora B）的全基因组序列（GenBank号:AEOV00000000.1），获得一个候选的硫氧还蛋白还原酶蛋白编码基因CstrxR1。采用Trizol试剂分离虫拟蜡菌（Ceriporiopsis subvermispora）FP-105752-Sp （由Forest ProductsLaboratory（Centre for Forest Mycology Research）, Madison, WI, USA提供）的总RNA，并以反转录试剂盒（TransGen，北京）进行cDNA第一链的合成（oligo（dT）引物），并作为模板以引物CstrxR_f1（含NdeI识别序列和保护碱基）和CstrxR_r1（含HindIII识别序列和保护碱基）扩增获得CsTrxR1的cDNA片段。将获得的cDNA片段克隆到载体pEASY-Blunt（TransGen，北京），并由上海英骏生物技术公司进行测序分析（Invitrogen, 上海），经测序验证正确，其序列如SEQ ID NO.1所示，推测得出对应的蛋白序列如SEQ ID NO.2所示。各引物的序列如下：

CstrxR_f1：5′-gctctagacatatgatggcacccctcacgaatg-3′；

CstrxR_r1：5′-cgaagcttatcttcgataccctcttcctc-3′。

对CstrxR1基因的cDNA 片段进行NdeI/HindIII双酶切，并连接入大肠杆菌（E. coli）表达载体pET23b（Novagen，Germany）的相应位点，获得质粒pET-CstrxR1。根据产品操作说明，将pET-CstrxR1转入大肠杆菌表达菌株（E. coli ）Rosseta菌株（TransGen，北京），并以异丙基-1-硫代β-D吡喃型半乳糖（IPTG）进行诱导表达。借助表达的CstrxR1重组蛋白具有C端融合的组氨酸标签，对其进行His·Bind 柱（Novagen，Germany）纯化，并进行SDS-PAGE电泳检测（如图1所示）。图1显示，获得的重组CstrxR1分子大小与理论分子量（38.4kD, 包括His标签）相符。

2、构建瑞氏木霉基因表达质粒pAg1-CstrxR1

以瑞氏木霉（Trichoderma reesei）D-86271（=Rut-C30）（购买于 VTT culturecenter，Finland）基因组DNA为模板，在高保真酶（Fastpfu）作用下，以引物Tcbh1_f（含XhoI识别序列和保护碱基）/Tcbh1_r（含ApaI识别序列和保护碱基）扩增获得长1088 bp 的纤维二糖水解酶I 终止序列（Tcbh1），并将其插入pAg1-H3（Zhang, A., Lu, P., Dahl-Roshak,A.M., Paress, P.S., Kennedy, S., Tkacz, J.S., An, Z., 2003. Efficientdisruption of a polyketide synthase gene （pks1） required for melaninsynthesis through Agrobacterium-mediated transformation of Glarea lozoyensis.Mol Gen Genomics 268, 645-655.）的XhoI/ApaI位点，获得质粒 pAg1-Tcbh1。同时，以瑞氏木霉（Trichoderma reesei） D-86271基因组DNA为模板，以引物Pcbh1_f/Pcbh1_r扩增获得 891 bp 纤维二糖水解酶I启动子序列（Pcbh1）。以质粒pET-CstrxR1为模板，以引物CstrxR_f2/CstrxR_r2 扩增获得 CstrxR1 基因序列。通过Hieff CloneTM One Step Pcr克隆试剂盒（上海翊圣生物科技有限公司, 上海）将以上获得的Pcbh1和CstrxR1基因序列同源重组方式克隆到质粒pAg-Tcbh1（经过KpnI/XhoI双酶切），产生质粒 pAg1-CstrxR1。基因表达质粒pAg1- CstrxR1的物理图谱如图2所示。各引物序列如下：

CstrxR_f2：5′-catgtctagaatggcacccctcacgaatg-3′；

CstrxR_r2：5′-ctttcgcacggagctctcgagctagtggtggtggtggtggtgctc-3′；

Pcbh1_f：5′-agtgaattcgagctcggtaccgatagcagtgtctagtagca-3′；

Pcbh1_r：5′-tgaggggtgccattctagacatgatgccagtccgcggttg-3′；

Tcbh1_f：5′-gactcgagagctccgtgcgaaagcctgacgca-3′；

Tcbh1_r：5′-ctgggcccatcgtaaccgagaatccagagctg-3′。

实施例2 构建表达CstrxR1基因的瑞氏木霉基因工程菌株

1、基因表达质粒pAg1-CstrxR1转化根癌农杆菌

取1 μg质粒pAg1-CstrxR1的DNA加入根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）AGL-1（Mullins, E.D., Chen, X., Romaine, P., Raina, R., Geiser, D.M., Kang,S., 2001. Agrobacterium-mediated transformation of Fusarium oxysporum: anefficient tool for insertional mutagenesis and gene transfer. Phytopathology.91: 173-180.）的感受态细胞中混匀，放入液氮中5分钟。取出，立即在42 ℃热激2分钟后加入700 μL LB液体培养基，28 ℃振荡培养2小时。将菌液均匀涂布在含有75 μg/ml卡那霉素的LB琼脂平板上，28 ℃倒置培养2天，得到含有重组质粒pAg1-CstrxR1的根癌农杆菌单菌落。

2、根癌农杆菌介导的遗传转化及菌株的初步抗性筛选

将获得的含有重组质粒pAg1-CstrxR1的根癌农杆菌单菌落接种于5 mL MM液体培养基中，28 ℃振荡培养2天。用IM培养基将菌体稀释到OD ₆₀₀=0.15，28 ℃振荡培养6小时，至OD ₆₀₀=0.6。取100 μL菌液与等体积的瑞氏木霉（Trichoderma reesei）D-86271孢子悬液混合（悬液浓度=2×10⁶个孢子/mL），均匀涂布在CM琼脂平板（铺有玻璃纸）上，24 ℃正置共培养3天。将共培养菌体转接至含有75 μg/mL潮霉素B和400 μg/mL噻孢霉素钠的PDA琼脂平板上，28 ℃倒置培养4-5天至含有潮霉素B抗性基因的转化子长出。

3、PCR筛选表达CstrxR1基因的瑞氏木霉基因工程菌株

将获得的潮霉素B抗性的转化子接种于Mandels培养基（以1%乳糖作为碳源），28℃、180 rmp 振荡培养2天。根据前述方法提取其总DNA和RNA后，分别进行如下PCR和RT-PCR反应：

PCR（图3A）：根据hph（潮霉素抗性基因）设计引物hph_f/hph_r，目的产物为0.9kb；RT-PCR（图3B）：根据CstrxR的特异性引物CstrxR_f1/ CstrxR_r1，目的产物为1.032kb；各引物序列如下：

CstrxR_f1：5′-gctctagacatatgatggcacccctcacgaatg-3′；

CstrxR_r1：5′-cgaagcttatcttcgataccctcttcctc-3′；

hph_f：5′-aagttcgacagcgtctcc-3′；

hph_r：5′-ttccactatcggcgagta-3′。

同时，以未经转化的瑞氏木霉（Trichoderma reesei）D-86271、空载体pAg1-Tcbh1的瑞氏木霉转化菌株（CK）和无菌水（NC）为对照，PCR扩增产物进行琼脂糖电泳检测。结果如图3所示。图3A中，以质粒pAg1-CstrxR1和空载体pAg1-Tcbh1转化的瑞氏木霉的菌株均能获得0.9 kb的条带；未转化菌株D-86271和无菌水（NC）均无扩增条带。图3B中，含质粒pAg1-CstrxR1的瑞氏木霉基因工程菌可获得1.032 kb的目标条带，而未转化菌株D-86271、pAg1-Tcbh1转化菌（CK）和无菌水（NC）均无扩增条带。

从筛选的9株高表达CstrxR1基因的瑞氏木霉基因工程菌株中取一株编号为CstrxR1，2016年3月1日保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），分类名称为瑞氏木霉（Trichoderma reesei）CstrxR1，保藏编号为CCTCC NO：M2016078。

瑞氏木霉CstrxR1在正常培养条件下菌落呈广铺的棉絮状，起初为白色致密的平坦菌丝，而后边缘出现浅绿的产孢子丛束区，反面无色；分生孢子梗菌丝的短侧枝，透明，多分枝；小梗瓶形，中部弯曲，形成大量的分生孢子，分生孢子椭圆形或长形，单细胞，透明，无色，壁光滑，成堆时绿色；该菌可正常利用葡萄糖、淀粉、甘油等碳源，及蛋白胨、尿素、硫酸铵等氮源。

实施例3 瑞氏木霉基因工程菌株的发酵及纤维素酶的产量测定

取瑞氏木霉基因工程菌株CstrxR1接种于PDA斜面，28 ℃培养7 天，等待产生分生孢子。取1×10⁸个瑞氏木霉孢子接种于100 mL Mandels 培养基（以1%葡萄糖作为碳源），28℃，180 rpm培养2 天。取1 mL菌悬液接入固态发酵培养基中，并于30 ℃、70%湿度条件下黑暗发酵培养15 天。

固态发酵培养基配方：麦杆（粉碎至1-3 mm，且脱木素）1.5 g，麸皮 1.5 g，10 ×Mandels 培养基（同上述，不含碳源）5 mL，以上组分装入250-mL三角瓶中，充分混匀，高压灭菌。麦杆的脱木素方法：按每10 g麦杆加入20 mL 4% NaOH溶液，混匀后，121 ℃、20 min处理，并以流水去除褐色物质，处理后的麦杆晾干备用。

发酵结束后，按每三角瓶加入30 mL无菌水（含0.1% Tween-80），搅拌均匀，并于28℃、120 rpm振荡浸提2 h。继续以7000 rpm 离心20 min，将粗酶液转入新的离心管中，于4℃冰箱保存。

滤纸酶活的测定，以Whatman NO.1滤纸（3 cm×0.5 cm）作为底物，50 ℃ 反应60min；内切型纤维素酶（EG）活的测定以1%的羧甲基纤维素钠（CMC-Na）作为底物，50 ℃ 反应30 min；最后均以3,5-二硝基水杨酸法DNS的方法（Miller, G.L., 1959. Use ofdinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar. Anal Chem,31, 426-428.）测定还原糖的生成量，通过标准葡萄糖曲线，换算获得酶活（IU/g基质干重）。β-葡萄糖苷酶的活性测定，以5 mM的4-硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷（pNPG）作为底物，50 ℃ 反应30 min，并根据标准曲线，计算酶活性（IU/g基质干重）。以上酶活测定均在pH4.8的50 mM的柠檬酸缓冲液中进行，每处理3-4次重复。

滤纸酶或CMC酶单位酶活定义为：该实验条件下，每分钟催化相应底物生成1 µmol葡萄糖的酶量。β-葡萄糖苷酶单位酶活定义为：该实验条件下，每分钟催化pNPG生成1 µmol4-硝基苯酚的酶量。

结果如图4所示，表达CstrxR1基因的瑞氏木霉基因工程菌CstrxR1所产β-葡萄糖苷酶、CMC酶和滤纸酶活性均显著高于未转化的亲本瑞氏木霉（D-86271）。发酵13天后，瑞氏木霉基因工程菌CstrxR1的β-葡萄糖苷酶、CMC酶和滤纸酶的产量分别比亲本菌株D-86271增加了0.84、0.48和0.78倍。同时，对照质粒pAg1-Tcbh1转化菌（CK）各种酶的产量与未转化的瑞氏木霉亲本菌株（D-86271）一致。

实施例4 固态发酵瑞氏木霉胞外蛋白的分析

取实施例3中各菌株的发酵液，按一定比例稀释后，以BCA检测试剂盒（ThermoTech，USA）测定菌株发酵所产胞外蛋白总量。结果如图5所示，在发酵7到15天，瑞氏木霉基因工程菌CstrxR1所产胞外蛋白量显著高于未转化的瑞氏木霉亲本菌株D-86271。在发酵13天后，瑞氏木霉基因工程菌CstrxR1所产胞外蛋白量比未转化的瑞氏木霉亲本菌株D-86271增加了1.4倍。

实施例5、固态发酵过程中瑞氏木霉菌体生物量的测算分析

通过测定发酵基质中菌丝体的核酸含量，间接法换算出菌体的生物量。取2 g固态发酵物70 ℃ ，烘干12 小时，并于液氮中充分研磨至粉状。取 0.04 g研磨物放入1.5 mL无菌离心管中，并加入1 mL 5% 三氯乙酸后充分混合。混合物于80 ℃ 水浴锅处理30分钟（每5分钟混匀一次），后置于冰上3 分钟。10,000 g 离心 10分钟，上清转入新的离心管中。样品稀释100倍后，测定波长260 nm 下的吸光值，并根据标准曲线计算菌体生物量。

标准曲线的制作：以Mandels培养基（以1%葡萄糖作为碳源）培养获得纯的瑞氏木霉菌丝体，并烘干至恒重。分别取0、2.5、5、10、20、40 mg干菌丝按照以上方法测定其中的核酸含量，并以菌丝干重为纵坐标和核酸含量为横坐标，绘制出标准曲线。

结果如图6显示：发酵5到15天，瑞氏木霉基因工程菌CstrxR1的生物量低于未转化的瑞氏木霉亲本菌株D-86271。因此，CstrxR1基因的表达并没有增加瑞氏木霉的菌体生物量。

实施例6 瑞氏木霉基因工程菌株中纤维素酶合成相关基因的转录分析

用Trizol试剂分别提取经实施例3发酵培养5天、7天、9天和11天瑞氏木霉基因工程菌株CstrxR1和瑞氏木霉亲本菌株D-86271的菌体样品总RNA。取1μg的RNA用TransScript® RT/RI Enzyme Mix （引物oligo（dT）和 6-mers 随机引物）（Transgene，北京）合成cDNA。以该cDNA为模板，用引物Qcel1a_f/Qcel1a_r、QeglI_f/ QeglI_r和Qcbh1_f/Qcbh1_r分别对β-葡萄糖苷酶合成基因cel1a（Genbank号：XM_006963374）、内切型纤维素酶合成基因eglI（Genbank号：XM_006965612）和纤维二糖水解酶合成基因cbh1（Genbank号：XM_006969162）进行实时定量PCR（ABI StepOne Plus, USA）。反应程序：94 ℃预变性30 s；94℃变性5 s，58 ℃退火15 s，72 ℃延伸10 s（40个热循环）。设置不添加反转录产物的阴性对照。同时，以β-actin 基因表达为内参，Pfaffl’s方法计算目标基因的相对转录水平（即相对表达量），结果如图7所示。所用引物的序列如下：

Qcbh1_f：5′-cttggcaacgagttctctt-3′；

Qcbh1_r：5′-tgttggtgggatacttgct-3′；

Qcel1a_f：5′-cgtgctcttcaccaacaa-3′；

Qcel1a_r：5′-tcttgctgatccacacca-3′；

QeglI_f：5′-cttctgctgcaacgagatgg-3′；

QeglI_r：5′-tcttggaggtgtcaacggtat-3′；

Qactin_f：5′-tccatcatgaagtgcgac-3′；

Qactin_r：5′-gtagaaggagcaagagcagtg-3′。

其中引物Qcbh1_f、Qcbh1_r、Qcel1a_f、Qcel1a_r、Qactin_f及Qactin_r源自文献Xu, J. T., Zhao, G. L., Kou, Y. B., Zhang, W. X., Zhou, Q. X., Chen, G. J.,Liu, W. F., 2014. Intracellular beta-glucosidases CEL1a and CEL1b areessential for cellulase induction on lactose in Trichoderma reesei.Eukaryotic Cell, 13（8）: 1001-1013。

结果表明：纤维素酶合成基因cel1a、egl1和cbh1在瑞氏木霉基因工程菌（CstrxR1）中的表达水平显著高于未转化的亲本瑞氏木霉菌株D-86271，这进一步证明了瑞氏木霉基因工程菌CstrxR1的纤维素酶产生能力得到显著的提高。

SEQUENCE LISTING

<110> 南京林业大学

<120> 一株瑞氏木霉工程菌CstrxR1及其构建方法和应用

<130> 100

<160> 14

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1035

<212> DNA

<213> Ceriporiosis subvermispora B

<400> 1

atggcacccc tcacgaatgg tgcgaatggc gaggtccaga agactggcga gcagagctca 60

aagctgcact cgaaagtggt cattatcggc tctggaccag caggacatac cgctgctatc 120

taccttgcac gtgcaaacct gaaccccgtc ctcttcgagg gtttcatggc gaacggcttc 180

gctgccggtg gacaactgac gaccaccacc gagattgaga acttcccggg tttcccctcc 240

ggcatccttg gccccgagct catggaccga ttccgcgcac aatctctgcg attcggcact 300

gacattatca ccgagaccat ctcgaaggtt gatctctccc agcggccatt ccgctactgg 360

cgcgaaggtc aggagacgga agagcccgag accgcggaca cccttatcat tgcgactgga 420

gccagcgcga agcggctggg tctcaagggc gaggaggcgt actggcagag cggcatctcc 480

gcgtgcgcag tctgcgacgg tgccgtcccc atcttcagga acaagccgct tgctgtgatt 540

ggtggcggtg actcggcggc ggaggaagca acctacctga caaagtacgg ttcgcacgtc 600

tacgtgctcg tgcgccgcgg cgagctccgt gcgtcgaaga tcatggcgaa gcggctcatg 660

aatcacccca aggtcaccat cctctggaac accgtcgcgg tcgagtgcca gggcgacgga 720

gacctcctga acaacctccg catcaagaac gtgctcaccg gcgaggaaca ggacctccag 780

gtgaacggcc tgttctacgc cgttggtcac gagcccgcga ccggcctcgt ccgcggccag 840

ctgcagacag acaccgatgg ctacatcatc accgtccctg gcacgaccca gacgagcgtc 900

aagggtgtct tcgcggcagg tgacgtgcag gacaagaggt accgtcaggc gatcaccagt 960

gcgggcagcg gctgcatggc tgccctagag gccgagcgtc tgatctccga agaggaagag1020

ggtatcgaag attag 1035

<210> 2

<211> 344

<212> PRT

<213> Ceriporiosis subvermispora B

<400> 2

Met Ala Pro Leu Thr Asn Gly Ala Asn Gly Glu Val Gln Lys Thr Gly

1 5 10 15

Glu Gln Ser Ser Lys Leu His Ser Lys Val Val Ile Ile Gly Ser Gly

20 25 30

Pro Ala Gly His Thr Ala Ala Ile Tyr Leu Ala Arg Ala Asn Leu Asn

35 40 45

Pro Val Leu Phe Glu Gly Phe Met Ala Asn Gly Phe Ala Ala Gly Gly

50 55 60

Gln Leu Thr Thr Thr Thr Glu Ile Glu Asn Phe Pro Gly Phe Pro Ser

65 70 75 80

Gly Ile Leu Gly Pro Glu Leu Met Asp Arg Phe Arg Ala Gln Ser Leu

85 90 95

Arg Phe Gly Thr Asp Ile Ile Thr Glu Thr Ile Ser Lys Val Asp Leu

100 105 110

Ser Gln Arg Pro Phe Arg Tyr Trp Arg Glu Gly Gln Glu Thr Glu Glu

115 120 125

Pro Glu Thr Ala Asp Thr Leu Ile Ile Ala Thr Gly Ala Ser Ala Lys

130 135 140

Arg Leu Gly Leu Lys Gly Glu Glu Ala Tyr Trp Gln Ser Gly Ile Ser

145 150 155 160

Ala Cys Ala Val Cys Asp Gly Ala Val Pro Ile Phe Arg Asn Lys Pro

165 170 175

Leu Ala Val Ile Gly Gly Gly Asp Ser Ala Ala Glu Glu Ala Thr Tyr

180 185 190

Leu Thr Lys Tyr Gly Ser His Val Tyr Val Leu Val Arg Arg Gly Glu

195 200 205

Leu Arg Ala Ser Lys Ile Met Ala Lys Arg Leu Met Asn His Pro Lys

210 215 220

Val Thr Ile Leu Trp Asn Thr Val Ala Val Glu Cys Gln Gly Asp Gly

225 230 235 240

Asp Leu Leu Asn Asn Leu Arg Ile Lys Asn Val Leu Thr Gly Glu Glu

245 250 255

Gln Asp Leu Gln Val Asn Gly Leu Phe Tyr Ala Val Gly His Glu Pro

260 265 270

Ala Thr Gly Leu Val Arg Gly Gln Leu Gln Thr Asp Thr Asp Gly Tyr

275 280 285

Ile Ile Thr Val Pro Gly Thr Thr Gln Thr Ser Val Lys Gly Val Phe

290 295 300

Ala Ala Gly Asp Val Gln Asp Lys Arg Tyr Arg Gln Ala Ile Thr Ser

305 310 315 320

Ala Gly Ser Gly Cys Met Ala Ala Leu Glu Ala Glu Arg Leu Ile Ser

325 330 335

Glu Glu Glu Glu Gly Ile Glu Asp

340

<210> 3

<211> 33

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> CstrxR_f1

<400> 3

gctctagaca tatgatggca cccctcacga atg 33

<210> 4

<211> 29

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> CstrxR_r1

<400> 4

cgaagcttat cttcgatacc ctcttcctc 29

<210> 5

<211> 29

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> CstrxR_f2

<400> 5

catgtctaga atggcacccc tcacgaatg 29

<210> 6

<211> 45

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> CstrxR_r2

<400> 6

ctttcgcacg gagctctcga gctagtggtg gtggtggtgg tgctc 45

<210> 7

<211> 41

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Pcbh1_f

<400> 7

agtgaattcg agctcggtac cgatagcagt gtctagtagc a 41

<210> 8

<211> 40

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Pcbh1_r

<400> 8

tgaggggtgc cattctagac atgatgccag tccgcggttg 40

<210> 9

<211> 32

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Tcbh1_f

<400> 9

gactcgagag ctccgtgcga aagcctgacg ca 32

<210> 10

<211> 32

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Tcbh1_r

<400> 10

ctgggcccat cgtaaccgag aatccagagc tg 32

<210> 11

<211> 33

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> CstrxR_f1

<400> 11

gctctagaca tatgatggca cccctcacga atg 33

<210> 12

<211> 29

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> CstrxR_r1

<400> 12

cgaagcttat cttcgatacc ctcttcctc 29

<210> 13

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> hph_f

<400> 13

aagttcgaca gcgtctcc 18

<210> 14

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> hph_r

<400> 14

ttccactatc ggcgagta 18

Claims

1.一株瑞氏木霉工程菌CstrxR1，分类名称为瑞氏木霉Trichoderma reeseiCstrxR1，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为：2016年3月1日，保藏编号为CCTCC NO:M2016078，保藏地址为中国湖北武汉武汉大学。

2.构建权利要求1所述瑞氏木霉工程菌CstrxR1的方法，其特征在于：将序列如SEQ IDNO.1所示的DNA片段通过质粒pAg1-CstrxR1导入瑞氏木霉基因组，所述质粒pAg1-CstrxR1是在质粒pAg1-H3的KpnI和ApaI位点顺序装入瑞氏木霉纤维二糖水解酶I启动子序列Pcbh1、序列如SEQ ID NO.1所示的DNA片段和瑞氏木霉纤维二糖水解酶I 终止序列Tcbh1。

3.根据权利要求2所述构建瑞氏木霉工程菌CstrxR1的方法，其特征在于：所述瑞氏木霉为瑞氏木霉D-86271。

4.权利要求1所述的瑞氏木霉工程菌CstrxR1在产纤维素酶中的应用。