BR112014012910A2

BR112014012910A2 - coquetéis de enzima preparados a partir de culturas misturadas

Info

Publication number: BR112014012910A2
Application number: BR112014012910-0A
Authority: BR
Inventors: George England; Suzanne E. Lantz
Original assignee: Danisco Us Inc.
Priority date: 2011-12-13
Filing date: 2012-12-04
Publication date: 2020-10-20
Also published as: US20140295475A1; RU2014128577A; HK1203083A1; MX2014006570A; KR20140122704A; AU2012352763A1; BR112014012910B1; CA2858373A1; DK2791350T3; EP2791350A1; WO2013090053A1; CN104011222A; EP2791350B1; JP2015500041A; MX367078B

Abstract

método de produção de uma mistura de enzimas que catalisam um processo de conversão e método de preparação de um banco de células. o presente pedido refere-se a métodos de produção de uma mistura de enzimas com o uso de duas ou mais linhagens celulares, bem como métodos para identificar ou construir linhagens celulares para produção de uma mistura de enzimas, e a métodos de preparação de um banco de células para produção de mistura de enzimas.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MÉTO- DO DE PRODUÇÃO DE UMA MISTURA DE ENZIMAS QUE CATA- LISAM UM PROCESSO DE CONVERSÃO E MÉTODO DE PREPA- RAÇÃO DE UM BANCO DE CÉLULAS".

PRIORIDADE

[001] O presente pedido reivindica a prioridade ao pedido provisório n° de série US 61/570.243, depositado em 13 de deze mbro de 2011, o qual está aqui incorporado a título de referência, em sua totalidade.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[002] Os coquetéis de enzimas são usados em muitos processos industriais. Os coquetéis de enzima podem ser preparados pela pro- dução individual de enzimas em linhagens celulares separadas segui- dos de mistura. A produção individualizada e mistura é com frequência associada a custos substanciais. Os coquetéis de enzimas podem também ser preparados pela manipulação de todas as enzimas dese- jadas em um coquetel específico em uma única linhagem de células de produção. Esse método é desprovido de flexibilidade, pois, nesse caso, as enzimas expressas por uma linha de células específicas são sempre produzidas em proporções iguais ou quase iguais. Essa falta de flexibilidade é uma desvantagem, particularmente quando os co- quetéis de enzima produzidos por esse método são para aplicações em processos, como hidrólise de biomassa e processamento de grão. Nessas aplicações, a seleção e o desempenho dos coquetéis de en- zimas com frequência dependem do tipo de substratos e/ou métodos de pré-tratamento. Uma blenda diferente pode ser necessária para di- ferentes substratos ou pré-tratamentos. Uma nova produção de hos- pedeiro pode precisar ser criada cada vez que uma blenda nova ou mesmo minuciosamente modificada é desejada.

[003] O desenvolvimento de coculturas bacterianas de linhagens celulares foi reportado como tedioso devido a diferentes exigências de crescimento (Dashtban et al., Int. J. de Biol. Sci., 5:578-595, 2009) pa- ra diferentes linhagens celulares. Foi relatado que o coestabelecimen- to de uma cocultura estável depende das exigências do meio e de crescimento, como temperatura, atmosfera e fonte de carbono, (Maki et al., Int. J. de Biol. Sciences, 5:500-516, 2009). Foi relatado que co- culturas são afetadas pelas interações metabólicas (isto é, relações sintróficas ou alternativamente, competição por substratos) e outras interações (isto é, promoção de crescimento ou inibição de crescimen- to, como antibióticos) (consulte, por exemplo, Maki et al., Int. J. de Biol. Sciences, 5:500-516, 2009).

[004] A cofermentação de estado sólido (por exemplo, com o uso de bandejas de fermentação) de duas cepas fúngica tem sido relata- das (consulte, por exemplo, Sun et al., Electronic J. of Biotechnology, 12: 1-13, 2008; Pandey et al., Curr. Sci., 77:149–162, 1999; Hu et al., internacional Biodeterioration & Diodegradation 65:248-252, 2011; Wang et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 73:533-540, 2006). Entretan- to, as cofermentações de estado sólido são difíceis e nem sempre a- dequadas para produção recombinante de enzimas em escalas indus- triais. As fermentações submersas são com frequência mais flexíveis e consideradas mais desejáveis, as quais tem sido usadas em, por e- xemplo, Penicillium sp. CH-TE-001 e Aspergillus terreus CH-TE-013 para produção de uma mistura de enzima (Garcia-Kirchner, et al., Ap- plied Biochem & Biotechnol., 98:1105-1114, 2002). Além disso, cultu- ras misturadas de micro-organismos têm sido fermentadas sob dife- rentes condições para obter micro-organismos cultivados enriquecidos para certas características, que são então misturados para obter uma cultura formulada complexa (consulte, por exemplo, o documento EP 2292731).

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[005] Figura 1: Um vetor pENTR/D-TOPO com o quadro de leitu-

ra aberto de Fv3C.

[006] Figura 2: Um mapa do plasmídeo de expressão da fusão pTTT-pyr13-Fv3C/Bgl3.

[007] Figura 3: Um mapa do pENTR-TOPO-Bgl1 (943/942).

[008] Figura 4: Um mapa do TOPO Blunt/Pegl1-Fv43D.

[009] Figura 5: Análise de eletroforese em gel SDS da expressão Fv43D e (quimera Fv3C/Te3A/Bgl3).

[0010] Figura 6: cromatograma HPLC de Fv43D e (quimera Fv3C/Te3A/Bgl3) produzido pela cofermentação de duas cepas de T. reesei.

[0011] Figura 7: Análise de eletroforese em gel SDS da expressão de celulase por RL-P37 de T. reesei e expressão de beta-glusosidase 1 (Bgl1, ou Tr3A) por RL-P37-d/Tr3A de T. reesei.

[0012] Figura 8: Cromatograma HPLC de Bgl1 (Tr3A) e celulase produzida pela cofermentação de RL-P37 de T. reesei e RL-P37- d/Tr3A de T. reesei.

[0013] Figura 9: Cromatograma HPLC de amilases variantes 1 e 2 produzida pela cofermentação de duas cepas de B. licheniformis.

[0014] Figura 10: Cromatograma HPLC de amilase variantes 1 e 2 produzidas pela cofermentação de duas cepas de B. licheniformis.

[0015] Figura 11: Cromatograma HPLC da quimera (Fv3C/Te3A/Bgl3), Bgl1 (Tr3A), e glicoamilase produzida pela cofer- mentação de três cepas de T. reesei.

SUMÁRIO

[0016] A presente invenção fornece métodos de produção de uma mistura de enzimas que catalisam um processo de conversão. Esses métodos compreendem combinar as primeira e segunda linhagens ce- lulares em um meio líquido e cultivar as linhagens celulares combina- das. As linhagens celulares secretam as enzimas para o meio, ou são lisadas liberando as enzimas, fornecendo assim uma mistura de enzi-

mas em proporções eficazes para acentuar o processo de conversão. A primeira linhagem de células codifica e está disposta para expressar um primeiro conjunto de uma ou mais enzimas. A segunda linhagem de células codifica e está disposta para expressar um segundo conjun- to de uma ou mais enzimas. Os primeiro e segundo conjuntos de en- zimas têm atividades catalíticas que acentuam o processo de conver- são. Um ou mais do primeiro conjunto de enzimas são exógenos em relação à primeira linhagem de células. Um ou mais do segundo con- junto de enzimas são exógenos em relação à segunda linhagem de células, ou não são codificados pela primeira linhagem de células ou expressados em um nível baixo pela primeira linhagem de células. Em alguns métodos, um ou mais do segundo conjunto de enzimas são e- xógenos em relação à segunda linhagem de células ou não codifica- dos pela primeira linhagem de células. Em alguns métodos, um ou mais do segundo conjunto de enzimas são expressados em um nível mais baixo pela primeira linhagem de células. Certos métodos podem também incluir uma terceira, uma quarta, ou mesmo uma quinta ou sexta linhagens celulares, cada uma das quais pode secretar as enzi- mas para o interior do meio ou ser lisada liberando as enzimas, codifi- ca e está disposta para expressar um terceiro, quarto, quinto, ou sexto, respectivamente, conjunto de uma ou mais enzimas. Esses conjuntos de enzimas adicionais também têm atividades catalíticas que acentu- am o processo de conversão, em que uma ou mais das enzimas são exógenas em relação às respectivas linhagens celulares. Uma ou mais enzimas desses conjuntos de enzimas adicionais podem ser exógenas em relação a uma ou mais das linhagens celulares além das que ex- pressam as enzimas.

[0017] Alguns métodos compreendem adicionalmente identificar uma pluralidade de enzimas que catalisam o processo de conversão, e identificar ou construir (1) uma linhagem de células que codifica e é disposta para expressar um primeiro conjunto de uma ou mais das en- zimas identificadas, e (2) uma segunda linhagem de células que codifi- ca e é disposta para expressar um segundo conjunto de uma ou mais enzimas para fornecer as primeira e a segunda linhagens celulares. As linhagens celulares têm sido cultivadas sob pressão seletiva ou sob condições que permitem crescimento auxotrófico para reter sua dispo- sição para expressar as enzimas para formar um banco de linhagens celulares. Alguns métodos compreendem adicionalmente identificar ou construir linhagens celulares que codificam e são dispostas para ex- pressar diferentes conjuntos de enzimas que catalisam um processo de conversão, e selecionar as primeira e segunda linhagens celulares do banco. Alguns métodos da invenção pode compreender adicional- mente uma terceira, uma quarta, uma quinta ou mesmo uma sexta li- nhagens celulares. A pluralidade de linhagens celulares compreende a primeira linhagem de células que codifica e é disposta para expressar um primeiro conjunto de uma ou mais enzimas, e a segunda linhagem de células que codifica e é disposta para expressar um segundo con- junto de uma ou mais enzimas. Nos casos em que mais de duas linha- gens celulares são contempladas, a terceira, quarta, quinta ou sexta linhagens celulares que codificam e são dispostas para expressar um terceiro, quarto, quinto e sexto conjunto de uma ou mais enzimas. Os fenótipos de cada da pluralidade de linhagens celulares podem ser mantidos mediante o cultivo sob pressão seletiva ou sob condições que permitam o crescimento auxotrófico. Em alguns métodos, as li- nhagens celulares são cultivadas sob diferentes pressões seletivas na etapa de identificação e sem pressão seletiva na etapa de cultivo.

[0018] A invenção adicionalmente fornece métodos de preparação de um banco de células. Esses métodos compreendem (1) identificar uma pluralidade de enzimas que catalisam um processo de conversão, (2) identificar ou construir uma pluralidade de linhagens celulares que codifica e é disposta para expressar diferentes conjuntos da pluralida- de de enzimas, (3) propagar as linhagens celulares sob diferentes pressões seletivas ou sob condições que permitem o crescimento au- xotrófico para reter a disposição para expressar o conjunto de enzimas codificadas por uma linhagem de células, para fornecer um banco de células; e (4) combinar diferentes combinações das linhagens celula- res, cultivar as linhagens celulares combinadas em um meio líquido, e comparar a capacidade das enzimas de melhorar ou acentuar o pro- cesso de conversão. As enzimas são secretadas ou as células são li- sadas e as enzimas liberadas no meio para fornecer diferente mistura de enzimas.

[0019] Em alguns métodos, as primeira e segunda linhagens celu- lares, ou uma ou mais outras linhagens celulares, são a mesma linha- gem de células manipulada para codificar o primeiro e o segundo con- junto, ou um ou mais outros conjuntos de uma ou mais enzimas, res- pectivamente. Em alguns métodos, o segundo conjunto de uma ou mais enzimas são expressos de forma endógena pela segunda linha- gem de células. O terceiro, quarto, quinto, ou sexto conjunto de uma ou mais enzimas são expressos de forma endógena pelas respectivas linhagens celulares. Em alguns métodos, ao menos um dentre o pri- meiro conjunto de uma ou mais enzimas não é codificado pela segun- da linhagem de células e pelo menos um do segundo conjunto de uma ou mais enzimas não é codificado pela primeira linhagem de células. Em alguns métodos, ao menos um dentre qualquer conjunto de uma ou mais enzimas não é codificado por ao menos uma dentre as linha- gens celulares além das que codificam aquela enzima. Em alguns mé- todos, ao menos uma enzima do segundo conjunto é codificada e dis- posta para ser expressada pela primeira linhagem de células. Em al- guns métodos, a etapa de combinação compreende combinar as pri- meira, segunda e terceira linhagens celulares, sendo que a terceira li-

nhagem de células que codifica e é disposta para expressar um tercei- ro conjunto de uma ou mais enzimas. Em alguns métodos, a etapa de combinação compreende combinar a primeira, segunda, terceira, quar- ta, quinta ou sexta linhagens celulares, em que a última (isto é, após a primeira e a segunda) linhagem celular codifica e é disposta para ex- pressar o terceiro, quarto, quinto e sexto conjunto de uma ou mais en- zimas. Em alguns métodos, o primeiro conjunto de enzimas compre- ende duas ou mais enzimas diferentes, sendo que cada uma tem uma atividade que acentua o processo de conversão. Em alguns métodos, cada conjunto de enzimas compreende duas ou mais enzimas diferen- tes, sendo que cada uma tem uma atividade que acentua o processo de conversão.

[0020] Alguns métodos compreendem adicionalmente separar a mistura de enzimas das células na cultura. Alguns métodos compre- endem adicionalmente combinar a mistura de enzimas com um subs- trato, em que a mistura de enzimas aprimora a conversão do substrato para um produto. Em alguns métodos, o substrato é celulose e/ou he- micelulose e o produto é glicose. Em alguns métodos, o substrato é amido e o poduto é açúcar.

[0021] Alguns métodos compreendem adicionalmente determinar as proporções das enzimas na mistura. Em alguns métodos, a razão molar entre uma enzima do primeiro conjunto de enzimas e uma enzi- ma do segundo conjunto de enzimas na mistura é pelo menos duas vezes diferente de uma razão molar entre as enzimas expressas pela primeira ou pela segunda linhagem de células sozinha. Em alguns mé- todos, a enzima do segundo conjunto de enzimas é exógena em rela- ção à segunda linhagem de células. Em alguns métodos, a razão mo- lar entre o primeiro conjunto de enzimas que são secretadas e o se- gundo conjunto de enzimas que são secretadas é pelo menos duas vezes diferente de uma razão molar entre as enzimas expressas pela primeira ou pela segunda linhagem de células sozinha. Em alguns mé- todos, a razão molar entre o primeiro conjunto de enzimas que são e- xógenas em relação a uma primeira linhagem de células e o segundo conjunto de enzimas que são exógenas em relação à segunda linha- gem de células é pelo menos duas vezes diferente de uma razão mo- lar entre as enzimas expressadas apenas pela primeira ou pela se- gunda linhagem de células. Em alguns métodos, a razão molar entre a enzima mais altamente expressada do primeiro conjunto e a enzima mais altamente expressada do segundo conjunto na mistura é pelo menos duas vezes diferente de uma razão molar entre as enzimas ex- pressadas pela primeira ou pela segunda linhagem de células sozinha. Em alguns métodos, a razão molar é pelo menos cinco vezes diferen- te. Em alguns métodos, a razão molar fica na faixa de 1:20 a 20:1. Em alguns métodos, a razão molar fica na faixa de 1:5 a 5:1. Em alguns métodos, a razão molar fica na faixa de 1:2 a 2:1. Em algumas modali- dades, a razão molar de uma enzima de cada conjunto de enzimas pode ser determinada pelo cultivo de cada linhagem de células, e combinação dos conjuntos de enzimas para formar uma mistura que tem a proporção desejada de cada enzima.

[0022] Em alguns métodos, as primeira e segunda linhagens celu- lares são cepas iguais. Em alguns métodos, duas ou mais da plurali- dade das linhagens celulares podem ser de cepas iguais. Em alguns métodos, as primeira e segunda linhagens celulares são cepas iguais modificadas para expressar diferentes conjuntos de uma ou mais en- zimas exógenas. Em alguns métodos, duas ou mais da pluralidade das linhagens celulares, que são de cepas iguais, podem ser modificadas para expressar diferentes conjuntos de uma ou mais enzimas exóge- nas. Em alguns métodos, as primeira e segunda linhagens celulares são linhagens celulares microbianas. Em alguns métodos, uma ou mais linhagens celulares da pluralidade de linhagens celulares são li-

nhagens celulares microbianas.

Em alguns métodos, as primeira e segunda linhagens celulares são as linhagens celulares de linhagens de células fúngicas.

Em alguns métodos, uma ou mais linhagens celu- lares da pluralidade de linhagens celulares são linhagens de células fúngicas.

Em alguns métodos, as primeira e segunda linhagens celu- lares são linhagens de célula fúngica filamentosa ou linhagens celula- res bacterianas.

Em alguns métodos, uma ou mais, ou duas ou mais linhagens celulares da pluralidade de linhagens celulares são linha- gens de célula fúngica filamentosa ou linhagens celulares bacterianas.

Em alguns métodos, as primeira e segunda linhagens celulares são de linhagens de células fúngicas de gêneros iguais.

Em alguns méto- dos, duas ou mais linhagens celulares da pluralidade de linhagens ce- lulares são linhagens de células fúngicas de gêneros iguais.

Em al- guns métodos, as primeira e segunda linhagens celulares são linha- gens de células fúngicas de gêneros diferentes.

Em alguns métodos, duas ou mais da pluralidade de linhagens celulares são linhagens de células fúngicas de gêneros diferentes.

Em alguns métodos, as primei- ra e segunda linhagens celulares são linhagens de células fúngicas de espécies diferentes de gêneros iguais.

Em alguns métodos, duas ou mais linhagens celulares da pluralidade de linhagens celulares são li- nhagens de células fúngicas de espécies diferentes de gêneros iguais.

Em alguns métodos, as primeira e segunda linhagens celulares são linhagens de células fúngicas de cepas diferentes de espécies iguais.

Em alguns métodos, duas ou mais linhagens celulares da pluralidade de linhagens celulares são linhagens de células fúngicas de cepas di- ferentes de espécies iguais.

Em alguns métodos, as primeira e se- gunda linhagens celulares são linhagens de células fúngicas de espé- cies diferentes de gêneros iguais.

Em alguns métodos, duas ou mais linhagens celulares da pluralidade de linhagens celulares são linha- gens de células fúngicas de espécies diferentes de gêneros iguais.

Em alguns métodos, a primeira linhagem é uma linhagem de células fúngi- cas e a segunda linhagem de células é uma linhagem de células bac- terianas. Em alguns métodos, ao menos uma da pluralidade de linha- gens celulares é uma linhagem de células fúngicas e pelo menos uma da pluralidade de linhagens celulares é uma linhagem de células bac- terianas. Em alguns métodos, a primeira e/ou a segunda linhagens ce- lulares são linhagens de célula fúngica. Em alguns métodos, uma ou mais linhagens celulares da pluralidade de linhagens celulares são li- nhagens de células fúngicas. Em alguns métodos, a primeira e/ou a segunda linhagens celulares são linhagens celulares de Tricoderma reesei. Em alguns métodos, uma ou mais linhagens celulares da plura- lidade de linhagens celulares são linhagens celulares de Tricoderma reesei. Em alguns métodos, a primeira e/ou a segunda linhagens celu- lares são linhagens de células bacterianas. Em alguns métodos, uma ou mais linhagens celulares da luralidade de linhagens celulares são linhagens celulares bacterianas. Em alguns métodos, as primeira e/ou segunda linhagens celulares são linhagens celulares de Bacillus. Em alguns métodos, uma ou mais linhagens celulares da pluralidade de linhagens celulares são linhagens celulares de Bacillus.

[0023] Alguns métodos compreendem adicionalmente determinar os perfis de crescimento das linhagens celulares antes da etapa de combinação, por exemplo, determinar uma razão de mistura das linha- gens celulares com base nos perfis de crescimento. Em alguns méto- dos, os perfis de crescimento das linhagens celulares são determina- dos em meio líquido diferente. Alguns métodos compreendem adicio- nalmente selecionar o meio líquido para cultivar as linhagens celulares combinadas com base nos perfis de crescimento das linhagens celula- res no meio líquido diferente. Em alguns métodos, os perfis de cresci- mento das linhagens celulares são determinados no mesmo meio lí- quido. Alguns métodos compreendem adicionalmente selecionar o meio líquido para cultivar as linhagens celulares combinadas com base nos perfis de crescimento das linhagens celulares no mesmo meio lí- quido. Em alguns métodos, as taxas de crescimento das linhagens ce- lulares estão dentro de um fator de dois de um do outro no meio líqui- do selecionado. Definições

[0024] As células usadas nos presentes métodos podem ser de qualquer tipo de organismo, por exemplo, organismos eucarióticos, or- ganismos procarióticos e archaebacteria. De preferência, as células são de um micro-organismo (isto é, linhagens celulares microbianas), o que significa que as células são procarióticas, archaebacteria, ou de um eucariote capaz de crescimento unicelular, como fungos (por e- xemplo, fungos filamentosos ou leveduras), e algas. Diferentes orga- nismos podem ser classificados pelo domínio (por exemplo, eucariotas e procariotas). Os domínios são subdivididos em reinos, por exemplo, bactérias (por exemplo, Eubacteria); Archaebacteria; Protista; Fungi; Plantae; e Animalia. Os reinos são adicionalmente divididos em filos, classes, subclasses, ordens, famílias, e gêneros. Por exemplo, os gê- neros de fungos incluem Tricoderma, Aspergillus, Dermatophytes, Fu- sarium, Penicillum, e Saccharomyces. Os gêneros são adicionalmente divididos em espécies. Por exemplo, a espécie de Tricoderma inclui Tricoderma reesei, Tricoderma viride, Tricoderma harzianum, e Trico- derma koningii. As espécies são divididas em cepas.

[0025] As cepas diferentes são isolados independentes de espé- cies iguais. As cepas diferentes têm diferentes genótipos e/ou fenóti- pos.

[0026] Uma linhagem de células é usada no sentido convencional para indicar uma população de células substancialmente isogênicas capazes de crescimento contínuo (de preferência indefinido) e divisão in vitro sem alteração além das mutações aleatórias ocasionais ineren-

tes a partir da replicação do DNA. Uma linhagem de células é tipica- mente propagada a partir de uma única colônia.

[0027] A fermentação submersa é um processo em que as células se expandem ao menos predominantemente sob a superfície do meio líquido.

[0028] A fermentação de estado sólido é um processo em que as células se expandem sobre e dentro de um médio sólido.

[0029] Uma enzima exógena significa uma enzima que não é nor- malmente expressada por uma célula (por exemplo, uma enzima hete- róloga de uma outra cepa, espécie, gêneros ou reino) ou uma enzima que é normalmente expressada por uma célula mas é expressada em um nível ampliado em virtude de estar sob o controle de material gené- tico que não está normalmente presente em uma célula. Essa expres- são pode ser causada pela introdução de um gene que codifica essa uma enzima em um local onde ela não está normalmente presente ou pela manipulação genética da célula para acentuar a expressão de uma enzima. Essa manipulação genética pode alterar um elemento regulatório que controla a expressão da enzima ou pode introduzir ma- terial genético que codifica uma proteína que atua in trans para acen- tuar a expressão da enzima.

[0030] Um ácido nucleico exógeno (por exemplo, DNA) significa um ácido nucleico que não está normalmente presente em uma célula (isto é, introduzido pela engenharia genética). Um ácido nucleico exó- geno pode ser de cepas, espécies, gêneros ou reinos (isto é, heterólo- go) diferentes ou pode estar normalmente presente em uma célula, mas introduzido em um local diferente do qual está normalmente pre- sente.

[0031] Uma enzima é endógena em relação a uma célula se a en- zima é normalmente expressada pela célula, e nenhum ácido nucleico que codifica a enzima ou qualquer outro ácido nucleico que regula a expressão da enzima tiver sido introduzido na célula. Um gene endó- geno significa um gene normalmente presente em uma célula em sua localização genômica normal. Uma enzima ou ácido nucleico que codi- fica a enzima são heterólogos em relação a uma célula se não forem normalmente codificados pela célula e introduzidos na célula pelay en- genharia genética.

[0032] O termo "fungos filamentosos" refere-se a todas as formas filamentosas da subdivisão Eumycotina (consulte, Alexopoulos, C. J. (1962), Introductory Mycology, Wiley, Nova Iorque, EUA). Esses fun- gos são caracterizados por um micélio vegetativo com uma parede ce- lular composta de quitina, celulose, e outros polissacarídeos comple- xos. Os fungos filamentosos são morfologicamente, fisiologicamente, e geneticamente distintos de leveduras. O crescimento vegetativo por fungos filamentosos ocorre por alongamento da hifa e o catabolismo de carbono é obrigatoriamente aeróbico.

[0033] Uma célula é disposta para expressar uma enzima se a cé- lula incluir DNA que codifica a enzima ligada de maneira funcional a um ou mais elementos regulatórios que permitem a expressão do DNA. A enzima pode ser endógena ou exógena. A expressão pode ser constitutiva ou induzível. O DNA que codifica a enzima pode estar em um local genômico ou episomal no interior da célula. Quando se diz que duas enzimas são expressas em diferentes níveis por diferentes linhagens de células, os intervalos representados pelo erro-padrão da média (SEM) para os respectivos níveis de expressão ao nível proteico não se sobrepõem os níveis de expressão são comparados entre as respectivas culturas de iguais, densidade e estágio de crescimento da cultura das respectivas linhagens celulares. Os níveis de expressão são de preferência determinados a partir da concentração de proteína secretada no meio de cultura. Os níveis de expressão podem ser de- terminados em unidades de moles, unidades de atividade, unidades,

densidade ótica ou outras unidades.

DESCRIÇÃO DETALHADA Introdução

[0034] A presente invenção fornece métodos de preparação de coquetéis de enzimas pela cocultura de diferentes linhagens celulares que expressam diferentes conjuntos de enzimas que catalisam o mesmo processo de conversão. A cocultura fornece maior flexibilidade e custos mais baixos do que os métodos convencionais. Ela permite que várias misturas sejam feitas conforme a necessidade, sem ter que construir uma nova cepa de produção para cada tipo individual de substratos e métodos de pré-tratamento. Também permite que as mis- turas de enzimas desejadas sejam criadas em um lote, eliminando a necessidade de misturar a saída de várias fermentações separadas. A preparação de uma mistura de enzimas de acordo com os presentes métodos não exige um processo de recuperação total para cada fer- mentação e/ou de armazenamento separado de cada componente da enzima. Adicionalmente, ela permite a manutenção de cada cepa de produção separadamente, evitando, assim, a perda de todo o coquetel (manipulação de uma única linhagem celular de produção) de uma só vez. Processo de conversão

[0035] Um processo de conversão é um processo em que um substrato é convertido em um produto catalizável por ao menos duas enzimas. O substrato pode ser uma substância complexa, como mate- rial de origem vegetal contendo múltiplo tipos de moléculas. O produto pode ser um único produto ou múltiplos produtos. O processo de con- versão pode ser um processo de uma única etapa ou envolver múlti- plas etapas. O processo pode envolver múltiplas etapas sequenciais e/ou paralelas. Diferentes enzimas podem atual em etapas sequenci- ais, etapas paralelas ou em combinação na mesma etapa. Os proces-

sos de conversão exemplificadores incluem a conversão de biomassa celulósica, glicogênio, amido e várias formas do mesmo em açúcares (por exemplo, glicose, xilose, maltose) e/ou álcoois (por exemplo, me- tanol, etanol, propanol, butanol).

[0036] Alguns processos de conversão convertem o amido, por exemplo, amido de milho, amido de trigo ou amido de cevada, sólidos de milho, sólidos de trigo e amido de grãos e tubérculos (por exemplo, batata doce, batata, arroz e fécula de mandioca) em etanol, ou um xa- rope rico em sacarídeos úteis para a fermentação, particularmente maltotriose, glicose, e/ou maltose, ou simplesmente em uma ou mais formas de açúcar, os quais são produtos úteis por si só.

[0037] Alguns processos de conversão atuam no material celulósi- co ou lignocelulósico, como os materiais que compreendem celulose e/ou hemicelulose, e algumas vezes lignina, amido, oligossacarídeos, e/ou monossacarídeos. O material celulósico ou lignocelulósico pode, opcionalmente, compreender componentes adicionais, como proteínas e/ou lipídios. Material celulósico ou lignocelulósico inclui plantações bioenergéticas, resíduos agrícolas, resíduos sólidos urbanos, resíduos sólidos industriais, lodo de fabricação de papel, resíduos de jardim, re- síduos de madeira e florestais, como resíduos de espigas de milho, re- síduos de cultura agrícola, como casca de milho, palha de milho, gra- míneas, trigo, palha de trigo, palha de cevada, feno, palha de arroz, grama de crescimento rápido, restos de papel, bagaço de cana, sorgo, cana gigante, capim-elefante, miscanto, cedro japonês, componentes obtidos a partir de moagem de grãos, árvores, ramos, raízes, folhas, madeira lascas, serragem e arbustos, legumes, frutas, flores e estrume animal. O material celulósico ou lignocelulósico pode ser derivado de uma única fonte, ou pode compreender um mistura derivada de mais de uma fonte. Por exemplo, o material celulósico ou lignocelulósico pode compreender uma mistura de espigas de milho e palha de milho,

ou uma mistura de grama e folhas. Os produtos exemplificadores de conversão enzimática do substrato de material celulósico ou lignocelu- lósico são glicose e etanol.

[0038] Em outros processos de conversão, o substrato é glicose, frutose, dextrose, e sacarose, e/ou açúcares C5 como xilose e arabi- nose, e misturas dos mesmos. A sacarose pode ser derivada de fon- tes, como de cana de açúcar, beterraba, mandioca, sorgo, e misturas dos mesmos. A glicose e a dextrose podem ser obtidas a partir de fon- tes renováveis de grãos por meio de sacarificação de matérias-primas à base de amido, incluindo grãos, como milho, trigo, centeio, cevada, aveia, e misturas dos mesmos. Os açúcares fermentáveis também po- dem ser derivados de biomassa celulósica ou lignocelulósico por meio de processos de pré-tratamento e de sacarificação. O produto desses processos de conversão podem ser álcoois como etanol ou butanol.

[0039] Em alguns processos de conversão, os substratos são pré- tratados. Os pré-tratamentos podem ser processos mecânicos, quími- cos, ou bioquímicos ou combinações dos mesmos. O pré-tratamento pode compreender uma ou mais técnicas incluindo auto-hidrólise, ex- plosão de vapor d´água, lixação, corte, moagem por bola, moagem por compressão, radiação, tratamento com água quente com fluxo de lí- quido, tratamento com ácido diluído, tratamento com ácido concentra- do, tratamento com ácido peracético, tratamento com dióxido de car- bono supercrítico, tratamento alcalino, tratamento com solvente orgâ- nico, e tratamento com um micro-organismo, como, por exemplo, um fungo ou uma bactéria. O tratamento alcalino pode incluir tratamento com hidróxido de sódio, tratamento com lima, oxidação úmida, trata- mento com amônia, e tratamento alcalino oxidante. O pré-tratamento pode envolver a remoção ou alteração de lignina, remoção de hemice- lulose, decristalização de celulose, remoção de grupos acetila da he- micelulose, redução do grau de polimerização da celulose, aumento do volume de poros de biomassa lignocelulósica, aumento da área de su- perfície de material lignocelulósico, ou qualquer combinação dos mesmos. Enzimas

[0040] Podem ser feitos coquetéis de qualquer combinação de en- zimas selecionadas dentre enzimas que incluem, mas não se limitam a, as seis maiores classificações de enzima de hidrolase, oxidorredu- tase, transferase, liase, isomerase ou ligase (Nomemclature Commit- tee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology (NC-IUBMB), Enzyme Nomemclature, Academic Press, San Diego, California, EUA, 1992). Exemplos de enzimas adequadas incluem uma celulase, uma hemicelulase, uma xilanase, uma amilases, uma glico- amilase, uma protease, uma fitase, uma cutinase, uma fitase, uma la- case, uma lipase, uma isomerase, uma glicose isomerase, uma este- rase, uma peroxidase, uma fosfolipase, uma pectinase, uma querati- nase, uma redutase, uma oxidase, uma peroxidase, um fenol oxidase, um lipoxigenase, uma ligninase, uma pululanase, uma tanase, uma pentosanase, uma maltase, mananase, glicuronidase, galactanase, uma β-glucanase, uma arabinosidase, uma hialuronidase, uma lacta- se, uma poligalacturonase, uma β-galactosidase, e uma condroitinase, ou qualquer enzima para as quais existem homólogos estreitamente relacionados e menos estáveis.

[0041] As enzimas podem ser de qualquer origem, por exemplo, bactérias ou fungos. As enzimas podem ser uma enzima híbrida, isto é, uma proteína de fusão que seja uma enzima funcional, sendo que ao menos uma parte ou porção é de uma primeira espécie e uma outra parte ou porção é de uma segunda espécie. As enzimas podem ser uma forma mutante, truncada ou híbrida de enzimas nativas. As enzi- mas adequadas para os presentes métodos podem ser uma proteína secretada, citoplasmática, nuclear, ou membrânica. Extracelular enzi-

mas, por exemplo, um celulase, hemicelulase, protease, ou enzima pa- ra degradação de amido, como amilases, geralmente têm uma se- quência de sinais ligados a uma porção N-terminal de sua sequência de codificação.

[0042] Exemplos de substratos de enzimas incluem materiais lig- nocelulósicos, celulose, hemicelulose, amido, ou uma combinação dos mesmos. Um grupo de enzimas exemplificador para catalisar a con- versão de materiais lignocelulósicos inclui endoglucanases, exogluca- nases ou celobio-hidrolases e β-glucosidases. Um grupo exemplifica- dor de enzimas para catalisar a conversão de hemicelulose inclui ao menos xilanase, mananase, xilosidase, mannosidase, glicosidase, a- rabinosidase, glicuronidase, e galactosidase. Um grupo exemplificador de enzimas para catalisar a hidrólise de amido inclui ao menos α- amilases, α-amilases sacarificantes, β-amilases, glicoamilase, e pulu- lanases. Dependendo das matérias-primas e dos métodos de pré- tratamento, enzimas adicionais, por exemplo, proteases e fitases, po- dem ser selecionadas.

[0043] As celulases são enzimas que hidrolisam as ligações de β- D-glucosídeo em celuloses. As enzimas celulóticas têm sido tradicio- nalmente divididas em três classes principais: endoglucanases, exo- glucanases ou celobio-hidrolases e β-glucosidases (Knowles, J. et al., TIBTECH 5:255-261 (1987)). As enzimas celulase também incluem enzimas acessórias, que incluem membros GH61, como EG4, swolle- nina, expansina e CIP1. Numerosas celulases foram descritas na lite- ratura científica, cujos exemplos incluem: de Tricoderma reesei: Sho- emaker, S. et al., Bio/Technology, 1:691-696, 1983, que revela CBHI; Teeri, T. et al., Gene, 51:43-52, 1987, que revela CBHII; Penttila, M. et al., Gene, 45:253-263, 1986, que revela EGI; Saloheimo, M. et al., Ge- ne, 63:11-22, 1988, que revela EGII; Okada, M. et al., Appl. Environ. Microbiol., 64:555-563, 1988, que revela EGIII; Saloheimo, M. et al.,

Eur. J. Biochem., 249:584-591, 1997, que revela EGIV; e Saloheimo, A. et al., Molecular Microbiology, 13:219-228, 1994, que revela EGV Exo-celobio-hidrolases e endoglucanases de espécie diferente de Tri- coderma também têm sido descritas, por exemplo, em Ooi et al., 1990, que revela a sequência de codificação cDNA para endoglucanase F1- CMC produzida pela Aspergillus aculeatus; Kawaguchi T et al., 1996, que revela a clonagem e sequenciamento do cDNA que codifica β- glicosidase 1 da Aspergillus aculeatus; Sakamoto et al., 1995, que re- vela a sequência de cDNA que codifica a endoglucanase CMCase-1 da Aspergillus kawachii IFO 4308; e Saarilahti et al., 1990 que revela uma endoglucanase da Erwinia carotovara.

[0044] As hemicelulases são enzimas que catalisam a degradação e/ou modificação de hemiceluloses, incluindo xilanase, mananase, xi- losidase, manosidase, glicosidase, arabinosidase, glicuronidase, e ga- lactosidase. Por exemplo, a hemicelulase pode ser uma xilanase, isto é, qualquer enzima que degrade xilano que produzido naturalmente ou recombinantemente. De modo geral, as enzimas que degradam xilano são endo- e exo-xilanases que hidrolisam xilano em uma maneira en- do- ou exo-. As enzimas que degradam xilano exemplificadoras inclu- em endo-1,3-β-xilosidase, endo-β1,4-xilanases (1,4-β-xilano xilano- hidrolase; EC 3.2.1.8), 1,3-β-D-xilano xilo-hidrolase e β-1-4- xilosida- ses (1,4-β-xilano xilo-hidrolase; EC 3.2.1.37) (EC n°s 3.2.1. 32,

3.2.1.72, 3.2.1.8, 3.2.1.37). Xilanases preferenciais são aquelas que são derivadas de um fungo filamentoso (por exemplo, os fungos dos gêneros Aspergillus, Disportrichum, Penicillium, Humicola, Neurospo- ra, Fusarium, Tricoderma e Gliocladium) ou uma fonte bacteriana (e.g., bacilo, thermotoga, Streptomyces, Microtetraspora, Actinmadura, Thermomonospora, Actinomyctes e Cepholosporum).

[0045] As amilases são enzimas que degradam amido, classifica- das como hidrolases, que clivam as ligações de α-D-(1 4) O-

glicosídico em amido. De modo geral, as α-amilases (E.C 3.2.1.1, α-D- (1 4)-glicano-glicano-hidrolase) são definidas como enzimas de en- doativas que clivam ligações de α-D-(l 4) O-glicosídico na molécula de amido de forma aleatória. As enzimas amilolíticas exoativas, como β-amilases (E.C 3.2.1.2, α-D-(l 4)-glucano malto-hidrolase), e algu- mas amilases específicas a certos produtos, como a alfa-amilase mal- togênica (E.C. 3.2.1.133) clivam a molécula de amido da extremidade não redutora do substrato. As β- amilases, α-glucosidases (E.C

3.2.1.20, α-D-glicosídeo-glico-hidrolase), glicoamilase (E.C 3.2.1.3, α- D-(l 4)-glicano glico-hidrolase), e amilases específicas a certos pro- dutos podem produzir malto-oligossacarídeos de um comprimento es- pecífico de amido.

[0046] De preferência, α-amilases são aquelas derivadas de bacilo sp., particularmente as de Bacillus licheniformis, Bacillus amyloliquefa- ciens ou bacilo stearothermophilus, bem como Geobacillus stearo- thermophilus, e fungai α-amilases como aquelas derivadas de Asper- gillus (i.e., A. oryzae e A. niger). Opcionalmente, as α-amilases podem ser derivadas de um precursor de α-amilases. O precursor de α- amilase é produzido por qualquer fonte capaz de produzir α-amilases. Fontes adequadas de α-amilases são organismos procarióticos ou eu- carióticos, incluindo fungos, bactérias, plantas ou animais. De prefe- rência, o precursor de α-amilases é produzido por Geobacillus stearo- thermophilus ou a Bacillus; Com mais preferência, por Bacillus licheni- formis, Bacillus amyloliquefaciens ou bacilo stearothermophilus; Com a máxima preferência, o precursor de α-amilases é derivado de Bacillus licheniformis. As α-amilases também podem ser de Bacillus subtilis.

[0047] As glicoamilases são enzimas da classe amiloglicosidase (E.C. 3.2.1.3, glicoamilase, 1,4-alfa-D-glicano-glico-hidrolase). Essas enzimas liberam resíduos de glicosila das extremidades não redutoras de moléculas de amilose e/ou amilopectina.

[0048] Pululanases são enzimas desramificantes de amido. As pu- lulanases são enzimas classificadas em EC 3.2.1.41 e essas enzimas são caracterizadas por sua capacidade de hidrolisar as ligações α-1, 6- glicosídicas em, por exemplo, amilopectina e pululano.

[0049] Outras enzimas incluem proteases, como a serina, metalo, tiol ou protease ácida. As proteases serina (por exemplo, subtilisina) são descritas por, por exemplo, Honne-Seyler's Z Physiol. Chem 364:1537-1540, 1983; Drenth, J. et al. Eur. J. Biochem. 26:177-181, 1972; patentes US n°s 4.760.025 (RE 34.606), 5.182. 204 e 6.312.936 e EP 0 323.299). A atividade proteolítica pode ser medida como des- crito em K. M. Kalisz, "Microbial Proteinases" Advances in Biochemical Engineering and Biotechnology, A. Fiecht Ed. 1988.

[0050] As fitases são enzimas que catalisam a hidrólise de fitato a (1) mio-inositol e/ou (2) seus mono-, di-, tri-, tetra- e/ou pentafosfatos e (3) fosfato inorgânico. Por exemplo, as fitases incluem enzimas defini- das pelo número EC 3.1.3.8, ou número EC 3.1.3.26. Linhagens celulares

[0051] Após a seleção de um processo de conversão e identifica- ção a partir da literatura publicada e/ou mediante a experimentação de uma ou mais combinações de enzimas destinadas a acentuar o pro- cesso de conversão, são identificadas ou construídas linhagens celula- res para expressar diferentes conjuntos das enzimas. As enzimas ex- pressadas de forma endógena por algumas linhagens celulares são bem conhecidas. Por exemplo, T. reesei é uma fonte de várias enzi- mas de processamento de celulose e Bacillus é uma fonte de inúme- ras amilases. Essas linhagens celulares são algumas vezes usadas sem modificação. Com frequência, entretanto, uma ou mais enzimas desejadas para acentuar o processo de conversão enzimática não es- tão endogenamente expressadas em níveis suficientes, por uma co- nhecida linhagem de células existente. Nesse caso, uma linhagem de células existente pode ser geneticamente modificada para expressar uma enzima exógena. Se várias enzimas desejadas para acentuar o processo de conversão não são expressadas em níveis suficientes por uma linhagem de células existente conhecida, as linhagens de células existentes podem ser geneticamente modificadas para expressar cada uma das enzimas exógenas. Para obter o máximo de modularidade, cada uma de tais enzimas pode ser expressa de forma exógena na sua própria linhagem de células. De preferência, as linhagens celula- res para as quais diferentes enzimas são geneticamente modificadas representam modificações da mesma linhagem de células base.

[0052] Como resultado da expressão endógena, da expressão e- xógena, ou de ambas, as linhagens de células a serem cocultivadas podem expressar diferentes conjuntos ou painéis de enzimas, os quais contribuem para o aumento da conversão enzimática. Em uma linha- gem de células que não expressa nenhuma enzima endógena que a- centua o processo de conversão, e que tenha sido geneticamente mo- dificada para expressar uma ou mais enzimas exógenas, o conjunto ou painel de enzimas produzidas pela linhagem de células inclui a enzi- ma(s) exógena. Em uma linhagem de células que expressa de forma endógena enzima(s) que acentua(m) o processo de conversão, e que tenha sido geneticamente modificada para expressar uma ou mais en- zimas exógenas, o conjunto ou painel de enzimas produzidas pela li- nhagem de células inclui enzimas endógenas e enzimas exógenas. Em uma linhagem de células que não tenha sido geneticamente modi- ficada para expressar uma enzima exógena, o conjunto ou painel de enzimas produzido pela linhagem de células inclui apenas enzimas endógenas. Embora as enzimas exógenas de um conjunto sejam prontamente conhecidas e reconhecidas, este não é necessariamente o caso com relação às enzimas endógenas expressas em níveis de traço. Por esta razão, o conjunto ou painel de enzimas é definido como incluindo apenas enzimas expressadas em níveis detectáveis como determinável pelo HPLC, de acordo com as condições e/ou protocolos usados nos exemplos. De preferência, cada enzima em um conjunto é expressa e/ou secretada a um teor de ao menos 1/100 ou 1/10 do ní- vel da enzima mais altamente expressada no conjunto. Não é neces- sário para a prática dos presentes métodos conhecer a identidade de todas as enzimas inseridas em um conjunto. Pelo contrário, é suficien- te conhecer a identidade de pelo menos uma enzima em de um con- junto produzido por uma dada linhagem de células.

[0053] O conjunto de enzimas codificado por uma linhagem de cé- lulas pode conter nenhuma, parcial ou completa sobreposição com o conjunto de enzimas codificado por uma segunda linhagem de células. As enzimas presentes no primeiro conjunto da primeira linhagem de células e as enzimas presentes no segundo conjunto da segunda li- nhagem de células podem ser expressas em níveis diferentes. Se as identidades das enzimas nos conjuntos se sobrepõem completamente, pelo menos uma enzima é expressa a um nível diferente (isto é, os er- ros-padrão das médias (SEMs) não se sobrepõem) entre os conjuntos. De preferência, cada conjunto de enzimas inclui, pelo menos, uma en- zima não expressada ou expressada a um nível inferior no outro con- junto(s) de enzimas a partir de outra linhagem(s) celular incluída na cocultura. De preferência ao menos uma enzima em um conjunto de enzimas (por exemplo, um primeiro conjunto) que catalisa um proces- so de conversão é exógena em relação à linhagem de células que ex- pressa o mesmo conjunto de enzimas (por exemplo, uma primeira li- nhagem de células). De preferência, qualquer linhagem de células in- cluídas numa cocultura que não expressa uma enzima exógena, ex- pressa uma enzima endógena, que de outra forma não é expressada ou é expressada em níveis significativamente mais baixos pela linha- gem celular incluída na cocultura. Quando um conjunto de enzimas in-

clui uma enzima exógena e todas as enzimas nos outros conjuntos de enzimas são endógenas, as linhagens celulares que expressam os ou- tros conjuntos podem ser um alongamento, uma espécie, ou um gêne- ro diferente daquele da primeira linhagem de células. Alternativamen- te, uma linhagem celular pode ser uma cepa de base ou linhagem de células modificadas para expressar uma enzima exógena e outra li- nhagem de células pode ser a linhagem de células de base ou cepa sem a modificação. Embora possa-se pensar que a coexpressão da linhagem de célula modificada com a linhagem de células base iria in- desejavelmente diluir a concentração relativa de enzima exógena em relação às enzimas endógenas produzidas pela linhagem de células de base, de fato, a modificação pode suprimir substancialmente a ex- pressão de uma enzima endógena que poderia de outro modo melho- rar o processo de conversão. Nesta situação, a cocultura da linhagem celular modificada com a cepa de base ou linhagem de célula pode proporcionar uma mistura de enzimas exógenas e endógenas em pro- porções mais eficazes do que a cultura de ambas as linhagens de cé- lulas isoladamente.

[0054] Mediante a cocultura de duas ou mais linhagens celulares, diferentes conjuntos de enzimas podem ser expressos em conjunto, alcançar razões de enzimas ou atividades enzimáticas diferentes do que aquelas de cada linhagem de célula sozinha. As razões são de preferência, por moles, mas unidades de atividade, massa ou outras unidades também podem ser usadas.

[0055] A razão de quaisquer enzimas pode ser comparada através da avaliação da diferença entre 1) um primeiro conjunto de enzimas e um segundo conjunto de enzimas em uma mistura de enzimas resul- tante da cocultura e 2) uma ou ambas as linhagens celulares individu- ais. Essa comparação é mais prontamente ilustrada em uma base de pares entre a enzima mais altamente expressada no primeiro conjunto e a enzima mais altamente expressada no segundo conjunto (expres- são sendo medida ao nível da proteína, de preferência de uma proteí- na secretada). A razão entre essas enzimas em cada linhagem de cé- lulas individual é, de preferência, ao menos 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, ou 50 vezes diferente do que na mistura de enzimas. Por exemplo, se a maior enzima expressada em um primeiro conjunto e a maior enzima expressada em um segundo conjunto são expressa- das com uma razão molar de 1:1, em uma mistura resultante da cocul- tura e uma razão de 10:1 em uma primeira linhagem de célula e uma razão de 1:10 em uma segunda linhagem de células, então, a razão molar é 10 vezes diferente na mistura do que em qualquer uma das linhagens de células. Comparações de pares ou grupos podem ser fei- tas entre todas as demais enzimas no primeiro ou no segundo conjun- to. Um grupo usado para uma comparação pode ser definido como, por exemplo, enzimas secretadas em cada conjunto, enzimas intrace- lulares em cada conjunto, enzimas exógenas em cada conjunto, ou enzimas que têm uma tag recombinante em cada conjunto.

[0056] A razão entre as enzimas do primeiro e as enzimas do se- gundo conjuntos também pode ser comparada pela soma das quanti- dades molares de enzimas conhecidas no primeiro conjunto e as quantidades molares de enzimas no segundo conjunto (ou ao menos as que são conhecidas) e cálculo de uma razão. Essas razões de pre- ferência variam de 1:50 a 50:1, 1:45 a 45:1, 1:40 a 40:1, 1:35 a 35:1, 1:30 a 30:1, 1:25 a 25:1, 1:20 a 20:1, 1:10 a 10:1, 1:5 a 5:1, ou 1:2 a 2:1.

[0057] Linhagens celulares são manipuladas para expressar uma ou mais enzimas exógenas pelos métodos convencionais. Em alguns desses métodos, um ácido nucleico que codifica uma enzima em liga- ção operável com sequências regulatórias para assegurar a sua ex- pressão é transformado na linhagem de células. Opcionalmente, a en-

zima pode ser fundida a uma tag recombinante (por exemplo, His-tag, FLAG-tag, GST, HA-tag, MBP, Myc-tag) para facilitar a detecção ou quantificação em cocultura ou em uma mistura de enzimas resultantes da cocultura. O ácido nucleico que codifica a enzima é, de preferência, também fundido a um peptídeo de sinalização para permitir a secre- ção. Qualquer peptídeo de sinalização adequado pode ser usado de- pendendo da enzima a ser expressada e secretada em um organismo hospedeiro. Exemplos de sequências de sinal incluem uma sequência de sinais de um Streptomyces celulase gene. Uma sequência prefe- rencial de sinais é uma celulase S. lividans, celA (Bently et al., Nature 417:141-147, 2002). O ácido nucleico é, então, de preferência, manti- do de forma estável, seja como resultado da transformação de um e- pissoma ou através de integração no cromossoma. Alternativamente, a expressão de uma enzima pode ser induzida pela ativação em cis ou in trans do DNA que codifica a enzima no cromossomo.

[0058] Assim como a manipulação de linhagens celulares para ex- pressar um gene exógeno, é por vezes desejável manipular linhagens de células para inibir ou separar a expressão de um gene endógeno que codifica um produto que é um inibidor do processo de conversão. A estratégia de inibição ou separação também pode ser usada para remover genes ou substituir um gene endógeno e substituí-lo por uma versão aprimorada, uma variante de, e/ou uma versão heteróloga da- quele gene. Essa inibição ou separação pode ser realizada por siRNA, proteínas de dedo de zinco, outras técnicas da biologia molecular usa- das para separar ou reduzir a expressão de genes endógenos especí- ficos, ou similares.

[0059] As linhagens celulares combinadas para cocultura podem ser de domínios, reinos, filos, classes, subclasses, ordens, famílias, gêneros, ou espécies iguais ou diferentes. Elas também podem ser de cepas diferentes de espécies diferentes, cepas diferentes de iguais espécies, ou de cepas iguais.

[0060] Combinações exemplificadoras incluem linhagens celulares de cepas diferentes de iguais espécies (por exemplo, T. reesei RL-P37 (Sheir-Neiss e Montenecourt, Appl. Microbiol. Biotechnol., 20:46-53, 1984) e T. reesei QM-9414 (ATCC n° 26921; isoladas pelo U.S. Army Natick Laboratory). Linhagens celulares de cepas diferentes de espé- cie diferente no mesmo reino (por exemplo, fungo) pode ser usada (por exemplo, T. reesei RL-P37 e Aspergillus niger). Linhagens celula- res de cepas diferentes de espécie diferente em reinos/domínios iguais podem ser usadas (por exemplo, bactérias, levedura, fungos, algas, e células eucarióticas superiores (células de plantas ou de animais)). As combinações exemplificadoras incluem, ainda, uma bactéria (por e- xemplo, B. subtilis ou E. coli) e um fungo (por exemplo, T. reesei ou Aspergillus niger); Uma bactéria e uma levedura (por exemplo, Sac- charomyces ou Pichia); Uma levedura e um fungo; Uma bactéria e uma alga, uma levedura e uma alga, um fungo e uma alga e assim por diante.

[0061] Quando duas ou mais linhagens celulares são manipuladas a partir de uma mesma cepa base (por exemplo, T. reesei, RL-P37 ou B. subtilis), cada linhagem de células pode codificar uma ou mais en- zimas exógenas diferentes. Opcionalmente, algumas linhagens celula- res podem também ser manipuladas de modo que um gene na cepa base seja suprimido ou inibido, por exemplo, por, pelo menos, 50%, 75%, ou 90%, do nível de expressão normal.

[0062] As linhagens celulares adequadas para os presentes méto- dos incluem bactérias, levedura, fungos e linhagens mais elevadas de célula eucariótica, como linhagens celulares de plantas ou animais. As linhagens celulares microbianos são preferenciais.

[0063] As linhagens celulares podem ser linhagens de células de levedura. Exemplos de células de levedura incluem Saccharomyces sp., Schizosaccharomyces sp., Pichia sp., Hansenula sp., Kluyveromy- ces sp., Prtaffia sp., ou Candida sp., como Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Candida albicans, Hansenula polymor- pha, Pichia pastoris, P. canadensis, Kluyveromyces marxianus, e Phaf- fia rhodozyma.

[0064] As linhagens celulares podem ser linhagens de células fún- gicas. Exemplos de fungos incluem uma espécie de Aspergillus como A. oryzae e A. niger, uma espécie de Saccharomyces como S. cerevi- siae, uma espécie de Schizosaccharomyces como S. pombe, e uma espécie de Trichoderma como T. reesei.

[0065] Exemplos de fungos preferenciais incluem células fúngicas filamentosas. A célula progenitora fúngica filamentosa pode ser uma célula de uma espécie de, mas não se limitando a, Trichoderma, (por exemplo, Trichoderma reesei, a transformação assexuada de Hypo- crea jecorina, anteriormente classificado como T. longibrachiatum, Tri- choderma viride, Trichoderma koningii, Trichoderma harzianum) (Sheir-Neiss et al, Appl. Microbiol. Biotechnol 20: 46-53, 1984; ATCC n° 56765 e ATCC n° 26921); Penicillium sp., Humicola sp. (por exem- plo, H. insolens, H. lanuginose, ou H. grisea); Chrysosporium sp. (por exemplo, C. lucknowense), Gliocladium sp., Aspergillus sp. (por exem- plo, A. oryzae, A. niger, A sojae, A. japonicus, A. nidulans, ou A. awa- mori) (guarda et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 39: 7380743, 1993 e Goedegebuur et al., Genet 41: 89-98, 2002), Fusarium sp., (por exem- plo, F. roseum, F. graminum, F. cerealis, F. oxysporuim, ou F. venena- tum), Neurospora sp., (por exemplo, N. crassa), Hypocrea sp., Mucor sp., (por exemplo, M. miehei), Rhizopus sp. e Emericella sp. (consulte também, Innis et al., ScL 228: 21-26, 1985). O termo "Tricoderma" ou "Tricoderma sp." ou "Tricoderma spp." refere-se a qualquer gênero fúngico anteriormente ou atualmente classificado como Tricoderma. O fungo pode ser A. nidulans, A. awamori, A. oryzae, A. aculeatus, A. ni-

ger, A. japonicus, T. reesei, T. viride, F. oxysporum, ou F. solani. Ce- pas de Aspergillus são apresentadas em Ward et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 39:738-743, 1993 e Goedegebuur et al., Curr Gene 41:89- 98, 2002, que estão, cada uma, aqui incorporadas por referência nas suas totalidades, particularmente com relação aos fungos. De prefe- rência, o fungo é uma tensão de Trichoderma, como uma tensão de T. reesei. Cepas de T. reesei são conhecidas e exemplos não limitadores incluem ATCC n° 13631, ATCC n° 26921, ATCC n° 56764 , ATCC n° 56765, ATCC n° 56767, e NRRL 15709, que estão, cada uma, aqui in- corporadas por referência nas suas totalidades, particularmente com relação às cepas de T. reesei. A cepa hospedeira pode ser um deriva- do de RL-P37 (Sheir-Neiss et al., Appl. Microbiol. Biotechnology 20:46- 53, 1984).

[0066] As linhagens celulares podem ser linhagens de células bac- terianas. Os exemplos de células bacterianas adequadas aos presen- tes métodos incluem uma bactéria gram-positiva (por exemplo, Strep- tomyces e Bacillus) e uma bactéria gram-negativa (por exemplo, Es- cherichia coli e pseudomonas sp.). Os exemplos preferenciais incluem cepas de Bacillus, como B. lichenformis ou B. subtilis, cepas de lacto- bacilo, cepas de estreptococo, cepas de Pantoea, como P. citrea, ce- pas de pseudomonas como P. alcaligenes, cepas de Streptomyces, como S. albus, S. lividans, S. murinus, S. rubiginosus, S. coelicolor, ou S, griseus, ou cepas de Escherichia, como E. coli. O gênero "Bacillus" inclui todas as espécies do gênero "Bacillus," Conforme é de conheci- mento dos versados na técnica, incluindo, mas não se limitando a B. subtilis, B. licheniformis, B. lentus, B. brevis, B. stearothermophilus, B. alkalophilus, B. amyloliquefaciens, B. clausii, B. halodurans, B. mega- terium, B. coagulans, B. circulans, B. lautus, e B. thuringiensis. É reco- nhecido que o gênero Bacillus continua a sofrer reorganização taxo- nômica. Assim, o gênero inclui espécie que têm sido reclassificadas,

incluindo, mas não se limitando a tais organismos como B. stearo- thermophilus, que é atualmente denominado "Geobacillus stearother- mophilus." A produção de endosporos resistentes na presença de oxi- gênio é considerada a característica que define o gênero Bacillus, em- bora esta característica também se aplique aos recentemente desig- nados Alicyclobacillus, Amphibacillus, Aneurinibacillus, Anoxybacillus, Brevibacillus, Filobacillus, Gracilibacillus, Halobacillus, Paenibacillus, Salibacillus, Thermobacillus, Ureibacillus, e Virgibacillus.

[0067] As linhagens celulares podem ser linhagens de células ve- getais. Exemplos de células vegetais incluem uma célula vegetal da família da Fabaceae, como a da subfamília Faboideae. Exemplos de células vegetais adequadas para os presentes métodos incluem uma célula vegetal de kudzu, poplar (como Populus alba x tremula CAC35696 ou Populus alba) (Sasaki et al., FEBS Letters 579(11): 2514-2518, 2005), choupo tremedor (como Populus tremuloides), ou Quercus robur.

[0068] As linhagens celulares podem ser células de algas, como uma alga verde, algas vermelhas, glaucophytes, chlorarachniophytes, euglenids, chromista, ou dinoflagellates.

[0069] As linhagens celulares podem ser uma célula cianobacteria, como a cianobacteria classificada em qualquer um dos seguintes gru- pos com base na morfologia: Chroococcales, Pleurocapsales, Oscilla- toriales, Nostocales, ou Stigonematales.

[0070] As linhagens celulares podem ser uma célula de mamífero, como células de ovário de hamster chinês (CHO), células HeLa, célu- las de rins de hamster bebê (BHK), células COS, ou qualquer número de outras linhagens celulares imortalizadas disponível, por exemplo, no American Type cultura Collection.

[0071] Em alguns métodos, a primeira linhagem de células é uma cepa de T. reesei que codifica uma β-xilosidase exógena e a segunda linhagem de células é uma cepa de T. reesei que codifica uma β- glicosidase exógena.

[0072] Em alguns métodos, a primeira linhagem de células é uma cepa de B. licheniformis que codifica amilases de Bacilllus lichenifor- mis e a segunda linhagem de células é uma cepa de B. licheniformis que codifica amilases de Geobacillus stearothermophilus.

[0073] Em alguns métodos, por exemplo, a primeira linhagem de células é uma cepa de T. reesei que codifica uma enzima GH61 exó- gena e a segunda linhagem de células é uma cepa de T. reesei que codifica celulases exógenas ou endógenas. Métodos de co-cultura

[0074] As linhagens celulares a serem cocultivadas podem em al- gumas modalidades ser separadamente cultivadas inicialmente para formar culturas iniciadoras (que têm, de preferência, uma densidade óptica (diâmetro externo) de pelo menos cerca de 0,1, 0,2, 0,4, 0,8, 1,0, ou 1,5 em um comprimento de onda de 600 nm e um comprimento de trajetória de 1 cm). As culturas iniciadoras são, então, misturadas em volumes iguais ou outra razão desejada (como discutido adicio- nalmente abaixo) em meio de cultura fresca para formar uma cocultura iniciadora. Opcionalmente, os isolados podem ser diretamente inocu- lados em meio de cultura pela produção de proteína (por exemplo, sem o uso de culturas iniciadoras).

[0075] Os problemas potenciais de uma linhagem de células que supera o crescimento de outra podem ser reduzidos pela seleção de linhagens de células, por exemplo, linhagens de células estreitamente relacionadas, com características de crescimento inerentemente se- melhantes, seleção de um meio de cultura que não é ideal para ao menos uma das linhagens de células, mas reduz diferenças de cres- cimento quando cada linhagem de células é cultivada em meios de cultura separados e/ou ajuste da razão por volume, ou mais precisa-

mente pela contagem de OD ou de células, com as quais as culturas são combinadas a fim de compensar as diferentes características de crescimento.

[0076] Uma fonte de linhagens celulares estreitamente relaciona- das é a de linhagens celulares da mesma espécie (por exemplo, T. re- esei) ou da mesma cepa, ou, com mais preferência, cepa de base i- gual ou linhagem de células modificadas em diferentes formas para expressar diferente enzimas exógenas. Por exemplo, uma primeira li- nhagem de células é uma linhagem de células base geneticamente modificada para expressar a enzima A e a segundo linhagem de célu- las é a linhagem de células base geneticamente modificada para ex- pressar a enzima B.

[0077] Antes de combinar as linhagens celulares para cocultura, o perfil de crescimento de cada linhagem de células pode ser determi- nado. Com base nos perfis determinados de crescimento, a razão ou uma faixa de razões, com as quais misturar as linhagens celulares pa- ra coexpressão ideal do primeiro conjunto de enzimas e o segundo conjunto de enzimas (ou mais conjuntos de enzimas), pode então ser determinada para compensar ao menos em parte os diferentes perfis de crescimento.

[0078] Em qualquer sistema de cultura celular, há um padrão de crescimento característico após a inoculação que inclui uma fase lag, uma fase de crescimento acelerado, uma fase exponencial ou "loga- rítmica", uma fase de aceleração negativa do crescimento e uma fase platô ou estacionária. As fases logarítmica e platô fornecem informa- ções sobre a linhagem de células, o tempo de duplicação da popula- ção durante o crescimento logarítmico, a taxa de crescimento, e a densidade máxima da célula obtida na fase platô. Por exemplo, na fa- se logarítmica, como o crescimento continua, as células atingem a sua taxa máxima de divisão celular, e o número de células aumenta em re-

lação logarítmica com o tempo. Ao fazer uma contagem em um deter- minado momento e uma segunda contagem depois de um intervalo durante a fase logarítmica e conhecendo o número de unidades de tempo decorrido, pode-se calcular o número total de divisões ou dupli- cações celulares, a taxa de crescimento e tempo de geração.

[0079] A medição do tempo de duplicação da população pode ser usada para monitorar a cultura durante a passagem serial e calcular os crescimentos celulares e o fator de diluição necessário em subcultura. O tempo de duplicação da população é um valor médio, e descreve o resultado de uma ampla gama de razões de divisão celular dentro da cultura. O tempo de duplicação difere em diferentes tipos de célula, re- cipientes e condições de cultura. Os perfis de crescimento predetermi- nado podem ser usados para determinar o tempo de duplicação da população para cada linhagem de células usadas na cocultura. De pre- ferência, os tempos de duplicação da população em crescimento ex- ponencial de linhagens celulares a serem cocultivadas estão dentro de um fator de 2 ou 5 de um ao outro. Por exemplo, o tempo de duplica- ção da população em crescimento exponencial de linhagens celulares selecionadas para serem cocultivadas estão dentro de um fator de 2, 3, 4, ou 5 de um ao outro. Se as taxas de crescimento diferem de for- ma mais ampla, então, o meio de cultura é de preferência variado para identificar um meio de cultura sobre o qual os tempos de duplicação da população são mais semelhantes, de preferência dentro de um fator de 2 ou 5 de um ao outro. Por exemplo, os componentes e as condi- ções fornecidas pelo meio de cultura podem ser modificados e usados para reduzir as diferenças no tempo de duplicação da população em crescimento exponencial de linhagens de células, de modo que os tempos de duplicação da população de cada linhagem celular se trans- formam em fator de 2 ou 5 de um ao outro. Adicionalmente, as linha- gens celulares podem ser primeiramente selecionadas com base em suas pequenas diferenças em perfis de crescimento, com o uso do meio de cultura convencional, seguido pelo ajuste do meio/condições de cultura, de modo que as diferenças de perfis de crescimento tor- nam-se ainda menores.

[0080] A razão ideal de conjuntos de enzimas codificadas por uma primeira linhagem de células em relação à segunda linhagem de célu- las não é necessariamente conhecida a priori. A combinação das li- nhagens celulares em diferentes razões, volume, OD ou número de células permite que diferentes razões sejam comparadas empirica- mente em pequena escala, com uma relação ideal identificada por es- ta análise a ser utilizada para a subsequente cultura em maior escala.

[0081] Para assegurar que não haja nenhuma linhagem celular que inaceitavelmente supere uma ou mais das demais linhagens celu- lares, por exemplo, através do crescimento de forma mais rápida e su- pressão do crescimento de outras linhas celulares, as linhagens celu- lares podem ser em razões que resultam em cada linhagem de células atingindo um ponto definido na curva de crescimento aproximadamen- te ao mesmo tempo. Por exemplo, a razão pode ser ajustada de forma que cada linhagem de células alcance a meia fase logarítmica aproxi- madamente ao mesmo tempo. Alternativamente, cada linhagem de cé- lulas atinge a fase platô (fase meio-platô) aproximadamente ao mesmo tempo. De preferência, cada linhagem de células atinge a meia fase logarítmica e a fase platô aproximadamente ao mesmo tempo. Opcio- nalmente, cada linhagem de células atinge a fase estacionária aproxi- madamente ao mesmo tempo.

[0082] Os perfis de crescimento também podem ser utilizados para determinar o tempo de colheita e/ou densidades de semeadura neces- sários para atingir certas razões de densidades de celulares de colhei- ta entre as linhagens de células. Por exemplo, uma razão molar igual de diferentes conjuntos de enzimas pode ser desejada para um tipo de substratos/métodos de pré-tratamento. Diferentes razões de enzimas desejadas para outros tipos de métodos de substratos/métodos de pré-tratamento podem ser obtidas por variação das densidades de semeadura de uma ou mais linhagens de células, assim como do tem- po de colheita.

[0083] Cada linhagem de células pode ter diferentes requisitos pa- ra o crescimento ideal em meio de cultura, particularmente com rela- ção a linhagens celulares de diferentes organismos (por exemplo, dife- rentes domínios, reinos, gêneros, ou espécie), ou diferentes cepas. Entretanto, um meio de cultura, embora não seja ideal para qualquer linha de célula única pode ser otimizado para efeitos de cofermentação de todas as linhagens celulares, se todas as linhagens celulares tive- rem perfis de crescimento semelhantes em tal meio. Consequente- mente, o perfil de crescimento de cada linhagem de células em múlti- plos meios de cultura pode ser determinado. Esses perfis de cresci- mento são então comparados para identificar um meio de cultura no qual os perfis de crescimento das linhagens celulares são os mais si- milares. Por exemplo, em tal meio, cada linhagem celular atinge a fase de platô (fase meio-platô), a fase meio-logarítmica, e/ou a fase esta- cionária aproximadamente ao mesmo tempo. O meio de cultura esco- lhido é, então, usado para cocultura.

[0084] Como uma alternativa para, ou em combinação com, a densidade com base nos perfis de crescimento celular, as quantidades de enzimas e/ou as atividades das enzimas expressadas podem ser medidas ao longo da curva de crescimento. Estas variações ao longo da curva de crescimento fornecem orientações para determinar a ra- zão com a qual misturar as linhagens de células para coexpressão i- deal das enzimas. Por exemplo, os níveis de expressão de algumas enzimas podem ser mais baixos do que de outras enzimas. Com rela- ção a estas enzimas, uma maior densidade de semeadura das linha-

gens de células que expressam as enzimas é preferencial para se ob- ter uma quantidade desejada dessas enzimas expressadas de forma modesta.

[0085] Linhagens celulares da mesma cepa geralmente têm perfis de crescimento similares e exigem meio de cultura similar. Por outro lado, linhagens celulares de cepas diferentes ou de diferentes orga- nismos com frequência têm perfis de crescimento diferentes e exigem meio de cultura distintos. Como discutido acima, os perfis de cresci- mento de diferentes linhagens celulares podem ser medidos para de- terminar a densidade de semadura para cada linhagem de células. Opcionalmente, os perfis de crescimento em vários meios de cultura para cada linhagem de células são medidos para determinar um meio adequado para a cocultura.

[0086] As enzimas podem ser liberadas diretamente no meio de cultura. Alternativamente, as células podem ser lisadas liberando en- zimas intracelulares. Ademais, algumas enzimas expressadas por uma determinada linhagem de células podem ser liberadas diretamente, enquanto que outras enzimas podem ser liberadas por lise celular. As enzimas liberadas, seja como resultado de secreção ou lise, podem ser coletadas do meio de cultura, ou o meio de cultura pode ser usado tal como é com processamento adicional mínimo, se algum, como um caldo completo. Os restos de células (por exemplo, células hospedei- ras, fragmentos lisados), podem, opcionalmente, ser removidos por, por exemplo, centrifugação ou ultrafiltração, se for desejado. Opcio- nalmente, a mistura de enzima pode ser concentrada, por exemplo, com um filtro de concentração de proteína disponível para comerciali- zação. A mistura de enzima pode ser adicionalmente separada de ou- tras impurezas por uma ou mais etapas de purificação, por exemplo, cromatografia por imunoafinidade, fracionamento de coluna de troca iônica (por exemplo, em dietilamino etil (DEAE) ou matrizes contendo grupos carbóxi metila ou sulfopropila), cromatografia em Blue- Sepharose, CM Blue-Sepharose, MONO-Q, MONO-S, lentil lectina- Sepharose, WGA-Sepharose, Con A-Sepharose, Éter Toyopearl, butila Toyopearl, fenila Toyopearl, ou protein A Sepharose, cromatografia SDS-Page, cromatografia de sílica, cromatofocalização, HPLC de fase reversa (RP-HPLC), filtração de gel com o uso, por exemplo, de penei- ra molecular Sephadex ou cromatografia de exclusão por tamanho, cromatografia em colunas que seletivamente ligam o peptídeo, e eta- nol, pH ou precipitação de sulfato de amônio, filtragem por membrana e várias técnicas. Em alguns métodos, a mistura de enzima é usada em aplicação a jusante com processamento adicional mínimo, se al- gum.

[0087] As quantidades de enzimas secretadas ou lisadas de célu- las ou no produto final pode ser medida com o uso de técnicas con- vencionais, por exemplo, pela cromatografia líquida de alta eficiência de fase reversa (RP-HPLC), ou eletroforese em gel de poliacrilamida- dodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE). As atividades das enzimas tam- bém podem ser medidas com o uso dos métodos bem conhecidos na técnica. Banco de célula

[0088] As linhagens celulares que expressam diferentes conjuntos de enzimas podem ser armazenadas em um banco de células e cocul- tivadas em diferentes combinações. Um banco de células pode ser construído com um processo de conversão específico ou um conjunto de conversão específico em mente. As enzimas que acentuam o pro- cesso de conversão são identificadas a partir de fontes conhecidas ou publicadas, a partir de experimentos ou ambos. As linhagens celulares são então identificadas ou construídas codificadas ou dispostas para expressar diferente conjuntos de enzimas. As linhagens celulares que expressam uma ou mais das enzimas de forma endógena ou exógena já podem ser conhecidas. As linhagens celulares que expressam uma ou mais das enzimas exogenamente também podem ser particular- mente construídas se nenhuma linhagem de células que expressa uma enzima em particular ou uma combinação particular ou painel de enzimas em quantidades suficientes já estiver disponível.

[0089] As linhagens celulares em um banco podem ser armazena- das em meio sólido ou líquido no meio frio ou congelado. Antes do u- so, um frasco de células é tipicamente propagado separadamente para formar uma cultura iniciadora, que também pode ocorrer em um meio líquido ou sólido. As linhagens celulares podem ser propagadas e ar- mazenadas sob diferentes pressões seletivas para reterem a expres- são dos respectivos conjuntos de enzimas e evitar a possibilidade de contaminação transversal. Alternativamente, as linhagens celulares podem ser propagadas e armazenadas sobre condições que permitam o crescimento de auxotrofos, mantendo assim os genótipos.

[0090] As linhagens celulares podem ser cocultivadas e usadas para preparar uma mistura de enzimas com o uso dos métodos da presente invenção descritos acima. Após a combinação, as linhagens celulares são propagadas em meio no qual as linhagens celulares combinadas são usadas, de forma que condições seletivas ou condi- ções que permitam o crescimento auxotrófico, que pode ter sido usado para propagação e armazenamento separados das linhagens celula- res, não são necessariamente usadas na etapa de cocultura.

[0091] O banco de células pode permitir a seleção de diferentes variantes de linhagens celulares que fornecem as enzimas que acen- tuam o processo de conversão em diferentes combinações ou níveis de expressão relativa. As combinações diferentes podem ser compa- radas para determinar qual mistura de enzimas tem a melhor atividade para acentuar o processo de conversão. Essa comparação pode indi- car a melhor combinação de linhagens de células em um banco, sem necessariamente se conhecer a priori exatamente quais enzimas são ideais, ou qual razão de enzimas é ideal. Nesse sentido, tal procedi- mento permite a adaptação do painel de enzimas expressadas a partir de uma cocultura às exigências específicas de um processo de con- versão específico.

[0092] Variações nos substratos ou de pré-tratamento de substra- tos em um processo diferente, podem ser acomodados mediante a va- riação da razão em que as culturas iniciadoras de linhagens celulares do banco de células são combinadas. Por exemplo, a quantidade de hemicelulose pode variar em uma preparação de celulose. Os coque- téis de enzimas para tratamento de quantidades elevadas de hemice- lulose podem conter um nível elevado de atividade de xilanase. Algu- mas preparações de amido podem conter uma substância (por exem- plo, matéria-prima ou metabólito) conhecida por ser inibitória da ativi- dade de amilase, em cujo caso uma quantidade elevada de amilase é desejável. Dependendo das composições (por exemplo, perfil diferente de xilano/ glucano) nos substratos pré-tratados, coquetéis de diferen- tes enzimas podem ser preparados mediante a mistura de culturas ini- ciadoras de cepas de produção de enzima em diferentes proporções, produzindo, assim, um coquetel de enzimas com diferentes quantida- des relativas de enzimas.

[0093] Os bancos de células também podem ser úteis, indepen- dentemente do processo de conversão. Ao armazenar diferentes li- nhagens celulares que codificam uma variedade de enzimas industri- ais comumente utilizadas, as linhagens celulares podem ser combina- das em diferentes combinações do banco para cocultura, dependendo do processo de conversão disponível. O método de cofermentação aqui fornecido, portanto, não só proporciona flexibilidade de uma com- posição resultante, mas também oferece várias outras vantagens, co- mo, por exemplo, redução de custos, em comparação com a condução da fermentação de cada componente da enzima desejada separada- mente, seguido da mistura; O custo reduzido de armazenamento de enzimas em virtude dos resultados da cofermentação resulta em uma composição com as razões desejadas de enzimas, enquanto que a es- tratégia de mistura irá exigir o armazenamento para cada enzima indi- vidual fermentada separadamente ou preparada separadamente. Aplicações

[0094] As misturas de enzimas produzidas pelos métodos da pre- sente invenção têm várias aplicações agrícolas, industriais, médicas e nutricionais onde esse processo de conversão é utilizado. Os substra- tos desse processo de conversão podem ser, por exemplo, materiais lignocelulósicos, celulose, hemicelulose, amido.

[0095] Por exemplo, uma mistura de enzimas celulase e/ou enzi- mas celulase acessórias podem ser usadas para hidrólise de materiais celulolítico, por exemplo, na fermentação de biomassa em biocombus- tíveis. A mistura também é útil para gerar glicose a partir de grãos, ou como um suplemento em ração animal para decrescer a produção de resíduo fecal pelo aumento da digestibilidade da ração. Enzimas celu- lase também podem ser utilizadas para aumentar a eficiência de fer- mentações alcoólicas (por exemplo, em fabricação de cerveja) pela conversão de biomassa lignocelulósica em açúcares fermentáveis. A mistura de celulases pode ser usada para processamento de alimento comercial em café, por exemplo, hidrólise de celulose durante a seca- gem de grãos. Elas também foram usadas na indústria de polpa e pa- pel para várias finalidades. Em aplicações farmacêuticas, as celulases são úteis como um tratamento para fitobezores, uma forma de bezoar de celulose encontrado no estômago humano.

[0096] Uma mistura de enzimas celulase, enzimas acessórias ce- lulase, e/ou enzimas hemicelulase são amplamente usadas na indús- tria têxtil em detergentes de lavanderia. As celulases também podem ser usadas em materiais que hidrolizam materiais celulósicos ou ligno- celulósicos em açúcares fermentáveis.

[0097] Uma mistura de amilases ou uma mistura de α-amilases, β- amilases, glicoamilase, e/ou pululanases tem várias aplicações na in- dústria de alimentos. Por exemplo, uma mistura de enzimas amilase é útil na fabricação de xarope, fabricação de dextrose, assamento, saca- rificação de empastagem fermentada, fabricação de produtos de dex- trina alimentar e açúcar, fabricação de alimentos secos para o desje- jum, fabricação de xaropes de chocolate, e remoção de amido de su- cos de frutas. As amilases também podem ser usadas na produção de glicose a partir de produtos em grãos para produção de etanol.

[0098] Uma mistura de enzimas contendo fitases pode ser usada em moagem a úmido de grãos e produtos de limpeza. Eles também encontram muitos outros usos em produtos para cuidados pessoais, produtos médicos e produtos alimentares e nutricionais, e também em várias aplicações industriais, particularmente nas técnicas de limpeza, têxteis, litográficas e químicas. Exemplos Exemplo 1: Cofermentação de duas cepas de T. reesei para produção de uma mistura de β-xilosidase e β-glicosidase. Expressão de proteína analisada por SDS-PAGE:

[0099] Géis NuPAGE® Novex 4-12% Nis-Tris e tampão MOPS (Invitrogen) foram usados com o marcador de peso molecular SeeBlu- e®Plus2 para análise do SDS-Page. As amostras foram adicionadas em um volume igual de base de supernatante da cultura. Expressão de proteína analisada por HPLC:

[00100] Cromatografia líquida (CL) e espectroscopia de massa (EM) foram realizadas para separar e quantificar as enzimas contidas nos caldos de fermentação. Em alguns casos, as amostras de enzima fo- ram tratadas com uma endoglicosidade H (Endo H) expressada por endoH de S. plicatus (por exemplo, NEB P0702L) antes da análise por HPLC. EndoH foi usada a uma quantidade de 0,01 a 0, 03 µg de en- doH por µg de proteína total na amostra. As misturas foram incubadas durante 3 h a 37°C, pH 4,5 a 6,0, para remover enzi maticamente a gli- cosilação N-ligada, antes da análise por HPLC. Cerca de 50 µg de pro- teína foram, então, submetidos a cromatografia por interação hidrofó- bica (Agilent 1100 HPLC) com o uso de uma coluna de HIC-fenila e um gradiente de sal decrescente ao longo de 35 minutos. O gradiente foi atingido usando o tampão A de alta salinidade: Sulfato de amônio 4 M contendo fosfato de potássio 20 mM e pH 6,75; e buffer com pouco sal B: fosfato de potássio 20 mM, pH 6,75. Foram detectados picos em UV 222 nm. Frações foram coletadas e analisadas com o uso de es- pectroscopia de massa para identificar a proteína(s) em cada pico. As razões entre proteínas são registradas como a porcentagem de cada área de pico em relação à área integrada total da amostra. Clonagem e expressão de Fv3C:

[00101] Sequência de Fv3C (SEQ ID NOs: 1 e 2) foi obtido a partir do genoma de Fusarium verticillioides na base de dados do Broad Ins- titute (http://www.broadinstitute.org/). O quadro de leitura aberto de Fv3C foi amplificado por PCR, usando-se como modelo o DNA genô- mico purificado obtido de Fusarium verticillioides. O termociclo usado para PCR foi o equipamento DNA Engine Tetrad 2 Peltier Thermal Cy- cler (Bio-Rad Laboratories). A DNA polimerase usada foi PfuUltra II Fusion HS DNA Polymerase (Stratagene). Os iniciadores usados para amplificar o quadro de leitura aberto foram conforme exposto a seguir: O iniciador direto (forward) MH234 (5’- CACCATGAAGCTGAATTGGGTCGC-3’) (SEQ ID NO:15) O iniciador reverso (reverse) MH235 (5’- TTACTCCAACTTGGCGCTG-3’) (SEQ ID NO:16)

[00102] Os iniciadores diretos incluem quatro nucleotídeos adicio-

nais (sequências – CACC) na extremidade 5’ para facilitar a clonagem direcional em pENTR/D-TOPO (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA). As condições de PCR para amplificação dos quadros de leitura aberta e- ram conforme exposto a seguir: Etapa 1: 94°C por 2 minutos. Etapa 2: 94°C por 30 segundos. Etapa 3: 57°C por 30 segundos . Etapa 4: 72°C por 60 segundos. As Etapas 2, 3 e 4 foram repetidas durante 29 ciclos adicionais. Etapa 5: 72°C por 2 minutos O produto d e PCR do quadro de leitura aberto de Fv3C foi purificado com o uso de um kit de purifi- cação Qiaquick PCR (Qiagen). O produto de PCR purificado foi inici- almente clonado no vetor pENTR/D-TOPO, transformado em células TOP10 Chemically Competent E. coli (Invitrogen) e colocado sobre placas LA contendo 50 ppm de canamicina. O DNA plasmidial foi obti- do a partir dos transformantes de E. coli com o uso de um kit para pre- paração de plasmídeo QIAspin (Qiagen). A confirmação de sequência para o DNA inserido no vetor pENTR/D-TOPO foi obtida com o uso de iniciadores diretos e reversos M13, e os seguintes iniciadores de se- quenciamento adicionais: MH255 (5’-AAGCCAAGAGCTTTGTGTCC-3’) (SEQ ID NO:17) MH256 (5’-TATGCACGAGCTCTACGCCT-3’) (SEQ ID NO:18) MH257 (5’-ATGGTACCCTGGCTATGGCT-3’) (SEQ ID NO:19) MH258 (5’-CGGTCACGGTCTATCTTGGT-3’) (SEQ ID NO:20)

[00103] O vetor pENTR/D-TOPO com a sequência de DNA do qua- dro de leitura aberto Fv3C é mostrado na a Figura 1.

[00104] β-GLUCOSIDASE QUIMÉRICA: Porções do tipo selvagem da Fusarium verticillioides Fv3C (SEQ ID NOs: 1 e 2) sequências C- terminal de genes foram substituídas por sequência C-terminal de T.

reesei para β-glicosidase, Bgl3 (ou Tr3B) (SEQ ID NOs: 7 e 8). Especi- ficamente, um trecho contíguo representando os resíduos de 1 a 691 de Fv3C foi fundido com um trecho contíguo representando os resí- duos de 668 a 874 de Bgl3 (SEQ ID NOs: 9 e 10). A molécula de qui- mera/fusão foi construída com o uso de PCR de fusão. Os clones pENTR das sequências de codificação genômica Fv3C (Figura 1) e Bgl3 foram usadas como gabaritos de PCR. Ambos os clones de en- trada foram construídos no vetor pDONR™221 (Invitrogen). O produto de fusão foi montado em duas etapas. Primeiro, a parte quimérica Fv3C foi amplificada em uma reação de PCR usando um DNA pEN- TR_Fv3C como modelo, e os seguintes iniciadores de oligonucleotí- deo: pDonor direto: 5’-

GCTAGCATGGATGTTTTCCCAGTCACGACGTTGTAAAACGACGGC - 3’ (SEQ ID NO:21) Fv3C/Bgl3 reverso:5’- GGAGGTTGGAGAACTTGAACGTCGACCAAGATAGACCGTGA CC- GAAC TCGTAG 3’ (SEQ ID NO:22) A parte quimérica Bgl3 foi amplificada a partir de um vetor pENTR_Bgl3 usando os seguintes iniciadores de oligonucleotídeo: pDonor reverso: 5’- TGCCAGGAAACAGCTATGACCATGTAATACGACTCACTATAGG-3’ (SEQ ID NO:23) Fv3C/Bgl3 direto: 5’- CTACGAGTTCGGTCACGGTC- TATCTTGGTCGACGTTCAAGTTC TCCAACCTCC-3’ (SEQ ID NO:24)

[00105] Na segunda etapa, uma mistura equimolar dos produtos de PCR (cerca de 1 µL e 0,2 µL das reações de PCR iniciais, respectiva- mente) foram adicionados como modelos para uma subsequente rea- ção de PCR de fusão com o uso de um conjunto de iniciadores ani- nhados, conforme exposto a seguir:

Att L1 direto: 5’ TAAGCTCGGGCCCCAAATAATGATTT- TATTTTGACTGATAGT 3’ (SEQ ID NO:25) AttL2 reverso: 5’GGGATATCAGCTGGATGGCAAATAATGATTTTATTTTGACTGATA 3’ (SEQ ID NO:26)

[00106] As reações de PCR foram realizadas com o uso de uma DNA polimerase Phusion de alta fidelidade (Finnzymes OY). O produto de PCR fundido resultante continha, nas extremidades, os sítios de re- combinação intactos attL1 e attL2 específicos para Gateway, permitin- do a clonagem direta em um vetor de destino final por meio de uma reação de recombinação Gateway LR (Invitrogen).

[00107] Após a separação dos fragmentos de DNA em um gel de 0,8% de agarose, os fragmentos foram purificados com o uso de um kit de limpeza de Extrato PCR Nucleospin® (Macherey-Nagel GmbH & Co. KG) e 100 ng de cada fragmento foi recombinado com o uso de um vetor de destinação pTTT-pyrG13 e a mistura de enzima LR clona- se™ II (Invitrogen). Os produtos de recombinação resultantes foram transformados em E.coli Max Efficiency DH5α (Invitrogen), e os clones contendo o construto de expressão pTTT-pyrG13-Fv3C/Bgl3 de fusão (Figura 2) contendo a β-glicosidase quimérica foram selecionados em placas de ágar 2xYT, preparadas com o uso de 16 g/L de triptona (Bacto Tryptone, Difco), 10 g/L de extrato de levedura (Bacto Yeast Extract, Difco), 5 g/L de NaCl, 16 g/L de ágar (Bacto Agar, Difco) e 100 µg/mL de ampicilina. As bactérias foram cultivadas em meio 2x YT contendo 100 µg/mL de ampicilina. Em seguida, os plasmídeos foram isolados e submetidos a digestões de restrição por BglI ou EcoRV. A região Fv3C/Bgl3 resultante foi sequenciada com o uso de um anali- sador de sequência ABI3100 (Applied Biosystems) para confirmação.

[00108] Uma β-glucosidase quimérica adicional foi construída, com- preendida de sequência N-terminal derivada de Fv3C (SEQ ID NOs: 1 e 2), uma região de laço derivada da sequência de uma β-glicosidase de Talaromyces emersonii Te3A (SEQ ID NOs: 5 e 6), e uma sequên- cia de parte C-terminal derivada de T. reesei Bgl3 (Tr3B) (SEQ ID NOs: 7 e 8). Isso foi obtido mediante a substituição de uma região de laço da quimera Fv3C/Bgl3. Especificamente, os resíduos de Fv3C de 665 a 683 da quimera Fv3C/Bgl3 (tendo uma sequência de R- RSPSTDGKSSPNN TAAPL (SEQ ID n° 27)) foram substituí dos por re- síduos Te3A de 634 a 640 (KYNITPI (SEQ ID n° 28))). A molécula hí- brida foi construída com o uso de uma abordagem de PCR de fusão.

[00109] Dois sítios de N-glicosilação, especificamente S725N e S751N, foram introduzidos na cadeia principal de Fv3C/Bgl3. Essas mutações de glicosilação foram introduzidas na cadeia principal Fv3C/Bgl3 com o uso da técnica de amplificação por PCR de fusão conforme descrito acima, empregando-se o plasmídeo de fusão pTTT- pyrG13-Fv3C/Bgl3 (Figura 2) como um modelo para gerar os fragmen- tos de PCR iniciais. Os seguintes pares de iniciadores foram usados em reações de PCR separadas: Pr CbhI direto: 5’ CGGAATGAGCTAGTAGGCAAAGT- CAGC 3’ (SEQ ID NO:29) e 725/751 reverso: 5’-

CTCCTTGATGCGGCGAACGTTCTTGGGGAAGCCATAGTCCTTAA GGTTCTTGCTGAAGTTGCCCAGAGAG 3’ (SEQ ID NO:30) 725/751 direto: 5’- GGCTTCCCCAAGAACGTTCGCCG- CATCAAGGAGTTTATCTACC CCTACCTGAACACCACTACCTC 3’ (SEQ ID NO:31), e Ter CbhI reverso: 5’ GATACACGAAGAGCGGCGATTC- TACGG 3’ (SEQ ID NO:32).

[00110] Em seguida, os fragmentos de PCR foram fundidos com o uso dos iniciadores Pr CbhI direto e Ter CbhI. O produto de fusão re- sultante incluía os dois sítios de glicosilação desejados, mas também continha sítios attB1 e attB2 intactos, o que permitiu a recombinação com o vetor pDONR221 usando-se a reação de recombinação Gate- way BP (Invitrogen). Isso resultou em um clone pENTR-Fv3C/Bgl3/ S725N S751N que foi, então, usado como uma cadeia principal para a construção da molécula triplamente híbrida Fv3C/Te3A/Bgl3.

[00111] Para substituir o laço do híbrido Fv3C/Bgl3 nos resíduos 665 – 683 com a sequência de laço de Te3A (SEQ ID NOs: 5 e 6), re- ações primárias de PCR foram realizadas com o uso dos seguintes conjuntos de iniciadores: Conjunto 1: pDonor direto: 5’- GCTAGCATG- GATGTTTTCCCAGTCACGACGTTGTAAA ACGACGGC 3’ (SEQ ID NO:21) e Te3A reverso: 5’-

GATAGACCGTGACCGAACTCGTAGATAGGCGTGATGTT GTACTTGTCGAAGTGACGGTAGTCGATGAAGAC 3’ (SEQ ID NO:33); Conjunto 2 Te3A2 direto: 5’- GTCTTCATCGACTACCGTCACTTCGACAAGTACAACATCAC GCC- TATCTACGAGTTCGGTCACGGTCTATC-3’ (SEQ ID NO:34); e pDonor reverso: 5’ TGCCAGGAAACAGCTATGACCATG- TAATACGACTCACTATAGG 3’ (SEQ ID NO:23)

[00112] Os fragmentos obtidos nas reações de PCR primárias fo- ram então fundidos com o uso dos seguintes iniciadores: Att L1 direto: 5’ TAAGCTCGGGCCCCAAATAATGATTT- TATTTTGACTGATAGT 3’ (SEQ ID NO:25) e AttL2 reverso: 5’GGGATATCAGCTGGATGGCAAATAATGATTTTATTTTGACTGATA 3’ (SEQ ID NO:26).

[00113] O produto de PCR resultante continha, nas extremidades, os sítios de recombinação intactos attL1 e attL2 específicos para Ga-

teway, permitindo a clonagem direta em um vetor de destino final com o uso de uma reação de recombinação Gateway LR (Invitrogen).

[00114] A sequência de DNA do gene que codifica Fv3C/Te3A/Bgl3 é mencionada na SEQ ID NO:11. A sequência de aminoácidos do hí- brido Fv3C/Te3A/Bgl3 é mencionada na SEQ ID NO:12. A sequência de genes que codifica a quimera Fv3C/Te3A/Bgl3 foi clonada no vetor pTTT-pyrG13 e expressada em uma cepa recipiente de T. reesei, con- forme descrito abaixo.

[00115] Especificamente, de 0,5 a 1 µg desse fragmento foi trans- formado em uma cepa hexadeletada de T. reesei mad6 de genes dele- tados (cel7B, cel5A, cel6A, cel7A, cel3A, cel12A, WO 2010/141779) usando-se o método PEG-protoplasto com ligeiras modificações, con- forme descrito abaixo. Para a preparação de protoplastos, os esporos foram cultivados durante 16 a 24 h a 24°C em meio m ínimo MM de Trichoderma, o qual continha 20 g/L de glicose, 15 g/L de KH2PO4, pH 4,5, 5 g/L de (NH4)2SO4, 0,6 g/L de MgSO4x7H2O, 0,6 g/L de Ca- Cl2x2H2O, 1 mL de solução de elementos-traço de T. reesei a 1.000X (que continha 5 g/L de FeSO4x7H2O, 1,4 g/L de ZnSO4x7H2O, 1,6 g/L de MnSO4 x H2O, 3,7 g/L de CoCl2 x 6H2O) com agitação a 150 rpm. Os esporos em germinação foram coletados por centrifugação e trata- dos com 50 mg/mL de solução de Glucanex G200 (Novozymes AG) para lisar as paredes das células fúngicas. A preparação adicional dos protoplastos foi realizada de acordo com um método descrito por Penttilä et al., Gene 61(1987)155-164. Cada uma das misturas de transformação, que continham cerca de 1 µg de DNA e de 1 a 5 x 107 protoplastos em um volume total de 200 µL, foi tratada com 2 mL de solução de PEG a 25%, diluída com 2 volumes de 1,2 M sorbitol/10 mM Tris, pH 7,5, 10 mM de CaCl2, e misturada com 3% de MM seleti- vo top agarose contendo 5 mM de uridina e 20 mM de acetamida. As misturas resultantes foram vertidas sobre placas seletivas com agaro-

se a 2%, contendo uridina e acetamida. As placas foram adicionalmen- te incubadas durante 7 a 10 dias a 28°C, antes que os transformantes únicos fossem novamente selecionados sobre placas MM sem uso prévio contendo uridina e acetamida. Os esporos provenientes de clo- nes independentes foram usados para inocular um meio de fermenta- ção em placas para microtitulação com 96 cavidades ou em frascos de agitação. Construção do vetor de expressão da β-glucosidase:

[00116] A porção N-terminal do gene bgl1 nativo de T. reesei para β-glicosidase foi submetida à otimização de códons (DNA 2,0, Menlo Park, CA, EUA). Essa porção sintetizada compreendia as primeiras 447 bases da região de codificação dessa enzima. Esse fragmento foi, então, amplificado por PCR com o uso dos iniciadores SK943 e SK941. A região remanescente do gene bgl1 nativo foi amplificada por PCR a partir de uma amostra de DNA genômico extraída da cepa de T. reesei RL-P37 (Sheir-Neiss, G et al. Appl. Microbiol. Biotechnol., 1984, 20:46-53), com o uso dos iniciadores SK940 e SK942. Estes dois fragmentos de PCR do gene bgl1 foram unidos por fusão em uma reação de PCR de fusão, com o uso dos iniciadores SK943 e SK942: Iniciador direto SK943: (5’– CACCATGAGATATAGAA- CAGCTGCCGCT-3’) (SEQ ID NO:35) Iniciador reverso SK941: (5’- CGACCGCCCTGCGGAGTCTTGCCCAGTGGTCCCGCGACAG-3’) (SEQ ID NO:36) Iniciador direto (SK940): (5’– CTGTCGCGGGACCACTGGGCAAGACTCCGCAGGGCGGTCG-3’) (SEQ ID NO:37) Iniciador reverso (SK942): (5’– CCTACGCTACCGACA- GAGTG-3’) (SEQ ID NO:38)

[00117] Os fragmentos de PCR de fusão resultantes foram clona-

dos no vetor pENTR™/D-TOPO® de Gateway ® Entry, e transforma- dos em células quimicamente competentes de E. coli One Shot® TOP10 (Invitrogen) resultando no vetor intermediário, pENTR-TOPO- Bgl1(943/942) (Figura 3). A sequência de nucleotídeos do DNA inseri- do foi determinada. O vetor pENTR-943/942 com a sequência bgl1 correta foi recombinado com pTrex3 g usando-se uma reação de LR Clonase® (consulte os protocolos descritos pela Invitrogen). A mistura de reação LR clonase foi transformada em células quimicamente com- petentes One Shot® TOP10 de E. coli (Invitrogen), resultando no vetor de expressão, pTrex3 g 943/942. O vetor também continha o gene As- pergillus nidulans amdS, que codifica acetamidase, como um marca- dor selecionável para transformação de T. reesei. O cassete de ex- pressão foi amplificado por PCR com iniciadores SK745 e SK771 (a- baixo) para gerar o produto para transformação da cepa hexadeletada mad6 de T. reesei. Iniciador direto SK771: (5’ – GTCTAGACTGGAAACGCAAC -3’) (SEQ ID NO:39) Iniciador reverso SK745: (5’ – GAGTTGTGAAGTCGGTA- ATCC -3’) (SEQ ID NO:40) Construção do cassete de expressão da β-xylosidase Fv43D:

[00118] Para a construção do cassete de expressão de β-xilosidase Fv43D (SEQ ID NO:13), o produto gênico fv43D (SEQ ID NO:14) foi amplificado a partir de uma amostra de DNA genômico F.verticillioides usando-se os iniciadores SK1322 e SK1297 (abaixo). Uma região do promotor do gene egl1 para endoglucanase foi amplificado por PCR a partir de uma amostra de DNA genômico de T. reesei extraída a partir da cepa RL-P37, usando-se os iniciadores SK1236 e SK1321 (abaixo). Esses fragmentos de DNA amplificados por PCR foram subsequente- mente fundidos em uma reação de PCR de fusão, usando-se os inici- adores SK1236 e SK1297 (abaixo). O fragmento de PCR de fusão re-

sultante foi clonado em vetor pCR-Blunt II-TOPO (Invitrogen) para pro- duzir o plasmídeo TOPO Blunt/Pegl1-Fv43D (consulte a Figura 4). Es- se plasmídeo foi, então, usado para transformar células quimicamente competentes E. coli One Shot® TOP10 (Invitrogen). O DNA plasmidial foi extraído de vários clones de E.coli, e suas sequências foram con- firmadas por digestões de restrição. O cassete de expressão foi ampli- ficado por PCR a partir de TOPO Blunt/Pegl1-Fv43D usando-se os ini- ciadores SK1236 e SK1297 para gerar o produto para transformação. Iniciador direto SK1322: (5’– CACCATGCAGCTCAAGTTTCTGTC-3’) (SEQ ID NO:41) Iniciador reverso SK1297: (5’– GGTTACTAGTCAACTGCCCGTTCTGTAGCGAG-3’) (SEQ ID NO:42) Iniciador direto SK1236: (5’– CATGCGATCGCGACGTTTTGGTCAGGTCG-3’) (SEQ ID NO:43) Iniciador reverso SK1321: (5’- GACAGAAACTTGAGCTGCATGGTGTGGGACAACAAGAAGG-3’) (SEQ ID NO:44) Fermentação de cepa misturada para produzir um produto da proteína da beta-xilosidase e da beta-glicosidase:

[00119] Duas cepas hexadeletadas de T. reesei expressando fv43D ou fv3C/te3A/bgl3 foram inoculadas em um frasco de vidro de 250 mL com 4 defletores, contendo 30 mL de caldo YEG (5 g/L de extrato de levedura, 20 g/L de glicose). Após 2 dias de crescimento a 28°C, com agitação, as culturas foram transferidas, em duplicata, para o meio de produção de proteína. O meio de produção era 36 mL de caldo defini- do contendo glicose/soforose e 2 g/L de uridina, como meio mínimo de glicina (6,0 g/L de glicina; 4,7 g/L (NH4)2SO4; 5,0 g/L de KH2PO4; 1,0 g/L MgSO4•7H2O; 33,0 g/L de PIPPS; pH 5,5) com adição estéril de uma mistura de ~2% glicose/soforose como a fonte de carbono, 10 ml/L de 100 g/L de CaCl2, 2,5 ml/L de elementos-traço deT. reesei

(400X)): 175 g/L de ácido cítrico anidro; 200 g/L FeSO4•7H2O; 16 g/L ZnSO4•7H2O; 3,2 g/L CuSO4•5H2O; 1,4 g/L MnSO4•H2O; 0,8 g/L H3BO3 em frascos 250 mL Thomson Ultra. Os volumes de transferência foram da seguinte forma:

[00120] Controles, (Fv3C/Te3A/Bgl3) = 4 mL; Fv43D = 4 mL

[00121] Frascos de frascos, Fv43D/ (Fv3C/Te3A/Bgl3) = 2 mL/ 4 mL

[00122] Todos os frascos foram incubados a 30°C, 16 0 rpm por quatro dias. Após quatro dias de incubação, as células foram centrifu- gadas por centrifugação e os sobrenadantes foram armazenados em 4°C pendentes de análise.

[00123] A expressão de proteína em supernatantes em frascos de agitação foi analisada por SDS-Page (Figura 5) e HPLC (Figura 6). Tabela 1. A quantidade de cada proteína em uma cultura individual em um caldo de cocultura (expressado como o percentual da área total in- tegrada por HPLC). Percentual da área total integrada Fv43D Fv3C/Te3A/Bgl3 Fv43D produto da cultura de cepa única 46 0 (Fv3C/Te3A/Bgl3) produto da cultura de 0 64 cepa única Fv43D e (Fv3C/Te3A/Bgl3) produto da 25 16 cocultura da cepa Fermentação de cepa misturada para produzir um produto da proteína de T. reesei com teor de beta-glicosidase aprimorado:

[00124] Uma cepa mutante de Tricoderma reesei (RL-P37-d), deri- vada de RL-P37 (Sheir-Neiss, G. et al.Appl. Microbiol. Biotechnol., 1984, 20:46-53) e selecionada para produção de celulase elevada foi inoculada no interior de um frasco de vidro de 250 mL com 4 defletores contendo 30 mL de caldo YEG (5 g/L de extrato de levedura, 20 g/L de glicose). Uma cepa hexa-deletada de T. reesei expressando T. reesei bgl1 (tr3A) (construção da cepa foi descrita acima, em Construção do vetor de expressão da β-glicosidase) foi inoculada em um frasco de vidro separado de 250 mL com 4 defletores contendo 30 mL de caldo YEG. Após 2 dias de crescimento a 28°C, com agitaçã o, as culturas foram transferidas para o meio de produção de proteína.

[00125] O meio de produção era 36 mL de caldo definido contendo glicose/soforose e uridina, como meio mínimo de glicina (6,0 g/L de glicina; 4,7 g/L (NH4)2SO4; 5,0 g/L de KH2PO4; 1,0 g/L MgSO4•7H2O; 33,0 g/L de PIPPS; pH 5,5) com adição estéril de uma mistura de ~2% glicose/soforose como a fonte de carbono, 10 ml/L de 100 g/L de Ca- Cl2, 2,5 ml/L de elementos-traço deT. reesei (400X)): 175 g/L de ácido cítrico anidro; 200 g/L FeSO4•7H2O; 16 g/L ZnSO4•7H2O; 3,2 g/L Cu- SO4•5H2O; 1,4 g/L MnSO4•H2O; 0,8 g/L H3BO3, em frascos de 250 mL Thomson Ultra. Os volumes de transferência foram da seguinte forma: Controle, RL-P37-d = 4 mL Frascos de teste, RL-P37-d/Tr3A = 4 mL/2 mL

[00126] Todos os frascos foram incubados a 30°C, 16 0 rpm por quatro dias. Após quatro dias de incubação, as células foram centrifu- gadas por centrifugação e os sobrenadantes foram armazenados em 4°C pendentes de análise.

[00127] A expressão de proteína em supernatantes em frasco de agitação foi analisada por SDS-PAGE (Figura 7) e HPLC (Figura 8). Tabela 2. A quantidade de cada proteína em uma cultura única em um caldo de cocultura (expressado como o percentual da área total inte- grada por HPLC). Percentual da área total integrada Derivado RL-P37 Tr3A (Bgl1) RL-P37-d produto da cultura de cepa única 98 2 RL-P37-d e Tr3A(Bgl1) produto da cultura de 60 40 cepa única

Exemplo 2: Cofermentação de duas cepas de bacilo para produção de uma mistura de amilases variantes.

[00128] Materiais e Métodos: Ambas as cepas usadas neste e- xemplo são cepas de produção. Amilase variante um (Amilase-1), uma amilase de Bacilllus licheniformis com quatro substituições, é ex- pressada de acordo com a US 5.958.739. Amilase variante dois (Ami- lase-2), uma Geobacillus stearothermophilus com uma substituição é expressada de acordo com a US 20090314286A1. O experimento foi realizado em frascos de agitaçãode 250 mL Thomson Ultra. A cultura de partícula inicial foi cultivada em um meio de partícula inicial conten- do extrato de levedura, sais de fosfato, sais de sulfato, e outros com- ponentes nutricionais, e um antiespumante adequado. Os frascos de controle e de teste usaram um meio contendo lactose, extrato de leve- dura, sulfonato, e sais de fosfato, outro sais, e Maltrin® M-1000 e um agente antiespumante adequado. Uma receita desse meio está abai- xo:

[00129] Criação de uma blenda de amilases pela fermentação de cepa misturada: Duas culturas de partícula inicial foram iniciadas. Um frasco de amilase-1 e amilase-2 congelado foi usado para iniciar as culturas de partícula inicial em 35 mls de meio de grão em frascos de vidro para agitação de 250 mL. Os frascos de partícula inicial foram incubados a 38°C, 160 rpm por três horas. Após três horas, as culturas de partícula inicial foram usadas para iniciar um frasco de controle de cada enzima e frascos de teste em duplicata. Cada um desses frascos tinha 27 mls de meio. Os frascos de controle foram inoculados com 3,0 mls a partir de suas respectivas culturas de partícula inicial. Os frascos de teste foram inoculados com 1,5 mls a partir de cada cultura de par- tícula inicial. Todos os frascos foram, então, incubados a 40°C e 160 rpm por 48 horas. No final de 48 horas de incubação, o pH foi verifica- do para determinar se as fermentações haviam alcançado um ponto final. Todos os frascos tinham um pH entre 7-8 indicando que o ponto final havia sido alcançado. Um gel SDS-PAGE de supernatantes de controle e culturas de teste mostraram que as enzimas haviam sido expressadas em todos os frascos. As culturas de teste duplicado fo- ram analisadas pelo HPLC para confirmar que continham uma blenda de ambas as amilases-1 e amilases-2. O HPLC não determinou que as enzimas tinham coexpressado. Exemplo 3: Cofermentação de duas cepas de Bacillus para produção de uma mistura de amilases variantes com uma razão de atividade de 1:3

[00130] Experimento 14L amilase-1/ amilase-2: Com o uso das mesmas duas enzimas como o experimento do frasco acima, uma fermentação de 14L foi realizada para testar se uma determinada ra- zão das duas enzimas poderia ser preparada de maneira bem contro- lada pela cofermentação. Foi decidido criar um produto com uma ra- zão de atividade de 1:3 amilase-1: amilase-2.

[00131] Com base nas taxas de produção das duas enzimas em escala de 14L, um frasco de partícula inicial (250 mL vidro de agitação com 30 mL de um meio de partícula inicial (contendo extrato de leve- dura, sais de fosfato, sais de sulfato, e outro componentes nutricionais, e um antiespumante adequado) foi inoculado com 0,2 mL de amilases- 1 e 0,8 mL de amilases-2. O frasco de partícula inicial foi incubado por 3 horas a 37°C, em 160 rpm. No final de três horas, todo o conteúdo do frasco foi transferido para um fermentador de partícula inicial de 14L e funcionando com o meio de produção.

[00132] Quando a taxa de absorção de oxigênio (OUR) do tanque da partícula inicial alcançou 60 mm/Kg/Hr, 0,6 Kgs foram usados para inocular o fermentador da produção, que foi testado sob condições de alimentação típicas para produção de amilases durante uma fermenta- ção de 100 horas.

[00133] As amostras de curso do tempo tiradas durante a fermenta- ção da produção foram testadas com relação à atividade da amilase. As curvas de crescimento e produção de enzima foram aquelas de uma fermentação de amilase de escala 14L típica. A amostra de ponto temporal final de 100 horas foi analisada por HPLC para determinar a razão entre as duas enzimas. Com base na área de pico, a razão de proteína foi 1:2.9 amilases-1: Amilase-2. As enzimas da cadeia princi- pal de proteína, que foi usada para construir a cepa de produção de amilase-2, mostram duplos picos por este método de HPLC. As áreas de ambos os picos são combinadas para determinar a área de amila- ses-2 total. Exemplo 4: Fermentação de cepa misturada para produzir um produto de proteína glicoamilase e duas beta-glicosidase

[00134] Uma primeira cepa hexadeletada de T. reesei expressando fv3C/te3A/bgl3, uma segunda cepa hexa-deletada de T. reesei expres- sando beta-glicosidase 1 de T. reesei (bgl1); e uma cepa quad- deletada de T. reesei (WO 2005/001036) expressando glicoamilase foram inooculadas em um frasco de vidro de 250 mL com 4 defletores, contendo 30 mL de caldo YEG (5 g/L de extrato de levedura, 20 g/L de glicose) e 2 g/L de uridina. Inóculos foram retirados de culturas esporu- ladas que crescem em PDA (batata dextrose ágar) com uridina. Após 2 dias de crescimento a 28°C, com agitação, as cult uras foram transfe- ridas, em duplicata, para o meio de produção de proteína. Cada um do meio de produção foi de 36 mL de caldo definido contendo glico- se/soforose e 2 g/L de uridina, como meio mínimo de glicina (6,0 g/L glicina; 4,7 g/L (NH4)2SO4; 5,0 g/L de KH2PO4; 1,0 g/L MgSO4•7H2O; 33,0 g/L de PIPPS; pH 5,5) com adição estéril de uma mistura de ~2% glicose/soforose como a fonte de carbono, 10 ml/L de 100 g/L de Ca- Cl2, 2,5 ml/L de elementos-traço deT. reesei (400X)): 175 g/L de ácido cítrico anidro; 200 g/L FeSO4•7H2O; 16 g/L ZnSO4•7H2O; 3,2 g/L Cu-

SO4•5H2O; 1,4 g/L MnSO4•H2O; 0,8 g/L H3BO3, [colocado em um fras- co de vidro para agitação de 250 mL com 4 defletores. Os volumes de transferência foram da seguinte forma:

[00135] Controle, (Fv3C/Te3A/Bgl3) = 3 mL; Tr3A = 3 mL; glicoami- lase = 3 mL

[00136] Frasco de teste, 1 mL cada de (Fv3C/Te3A/Bgl3), Tr3A, gli- coamilase.

[00137] Todos os frascos foram incubados a 28°C, 20 0 rpm (Innova 4900) por quatro dias. Após quatro dias de incubação, as células fo- ram removidas por centrifugação e os supernatantes armazenados a 4°C pendentes de análise.

[00138] A expressão de proteína em supernatantes em frascos de agitação foi analisada por SDS-PAGE e HPLC (Figura 11). Tabela 3. A quantidade de cada proteína em uma cultura individual em um caldo de cocultura (expressado como o percentual da área total in- tegrada por HPLC). Percentual da área total integrada (Fv3C/Te3A/Bgl3) Tr3A Glicoami- lase (Fv3C/Te3A/Bgl3) produto da cultura 69.7 de cepa única Tr3A(Bgl1) produto da cultura de ce- 65.5 pa única produto da cultura de cepa única de 96.8 glicoamilase (Fv3C/Te3A/Bgl3), Tr3A(Bgl1), e pro- 3.2 6.7 86.5 duto da cocultura de glicoamilase Exemplo 5: Fermentação de cepa misturada para produzir um produto de proteína deT. reesei com teor de β-glicosidase aprimorado para i- noculação direta

[00139] Uma cepa mutante de T. reesei (RL-P37-d), derivada de

RL-P37 (Sheir-Neiss, G. et al. Appl. Microbiol. Biotechnol., 1984, 20:46-53) e selecionada para produção de celulase elevada foi incu- bada com uma cepa hexa-deletada expressando fv3C/te3A/bgl3. Cada cepa foi inoculada no interior de um único frasco de vidro de 250 mL com 4 defletores contendo 30 mls de meio de produção, com glico- se/soforose e uridina, como meio mínimo de glicidina (6,0 g/L de glici- na; 4,7 g/L (NH4)2SO4; 5,0 g/L de KH2PO4; 1,0 g/L MgSO4•7H2O; 33,0 g/L de PIPPS; pH 5,5) com adição estéril de uma mistura de ~2% giu- cose/soforose como a fonte de carbono, 10 ml/L de 100 g/L de CaCl2, 2,5 ml/L de elementos-traço deT. reesei (400X)): 175 g/L de ácido cí- trico anidro; 200 g/L FeSO4•7H2O; 16 g/L ZnSO4•7H2O; 3,2 g/L Cu- SO4•5H2O; 1,4 g/L MnSO4•H2O; 0,8 g/L H3BO3, placas maduras de PDA esporulatado com uridina. Após 4 dias de crescimento a 28°C, com agitação, as culturas foram coletadas. As células foram removidas por centrifugação e os supernatantes armazenados a 4°C pendentes de análise por HPLC. No caldo de cultura misturada, (Fv3C/Te3A/Bgl3) representou 56% da proteína total, enquanto que representou 70% da proteína total quando a cepa Fv3C/Te3A/Bgl3 foi cultivada separadamente como uma cultura única. Exemplo 6: Fermentação de cepa misturada para produzir um produto de proteína da T. reesei com teor de duas β-glucosidases, glicoamila- se, e beta-xilosidase pela inoculação direta

[00140] Uma primeira cepa hexadeletada de T. reesei expressando fv3C/te3A/bgl3, uma segunda cepa hexa-deletada de T. reesei expres- sando bgl1 (tr3A), uma terceira cepa hexa-deletada expressando fv43D, e uma cepa quarta cepa hexa-deletada de T. reesei (WO 2005/001036) expressando glicoamilase de T.reesei foram inoculadas em um frasco de vidro de 250 mL com 4 defletores contendo 30 mL de meio de produção com glicose/soforose e uridina, como meio mínimo de glicina (6,0 g/L de glicina; 4,7 g/L (NH4)2SO4; 5,0 g/L de KH2PO4;

1,0 g/L MgSO4•7H2O; 33,0 g/L de PIPPS; pH 5,5) com adição estéril de uma mistura de ~2% glicose/soforose como a fonte de carbono, 10 ml/L de 100 g/L de CaCl2, 2,5 ml/L de elementos-traço deT. reesei (400X)): 175 g/L de ácido cítrico anidro; 200 g/L FeSO4•7H2O; 16 g/L ZnSO4•7H2O; 3,2 g/L CuSO4•5H2O; 1,4 g/L MnSO4•H2O; 0,8 g/L H3BO3, placas maduras de PDA esporulatado com uridina. Após 4 dias de crescimento a 28°C, com agitação, as culturas fo ram coletadas. As células foram removidas por centrifugação e os supernatantes arma- zenados a 4°C pendents de análise por HPLC. Tabela 4. A quantidade de cada proteína em uma cultura individual em um caldo de cocultura (expressado como o percentual da área total in- tegrada por HPLC). Percentual da área total integrada Fv43D (Fv3C/Te3A/Bgl3) Tr3A Glicoamilase Fv43D produto da cultura de 30,3 cepa única (Fv3C/Te3A/Bgl3) produto da 69,7 cultura de cepa única Tr3A (Bgl1) produto da cultura 65,5 de cepa única produto da cultura de cepa ú- 96,8 nica de glicoamilase Fv43D, (Fv3C/Te3A/Bgl3), 2,3 2,2 15,8 73,5 Tr3A(Bgl1), e produto da co- cultura de glicoamilase

[00141] As culturas individuais foram todas cultivadas com uma e- tapa adicional de uma cultura iniciadora, enquanto que a cultura mistu- rada (última fileira) foi inoculada diretamente a partir de tampões de ágar, sem uma etapa de cultura iniciadora.

[00142] Todas as patentes e publicações, incluindo todas as se- quências reveladas em tais patentes e publicações, aqui referidas são expressamente incorporadas a título de referência em suas totalidades para todos os propósitos. Embora métodos e materiais preferenciais tenham sido descritos, quaisquer métodos e materiais similares ou e- quivalentes àqueles aqui descritos podem ser usados na prática ou no teste da presente invenção. A não ser que seja evidente de outro mo- do a partir do contexto, qualquer modalidade, aspecto, etapa, feição, elemento ou limitação pode ser usado (usado) em combinação com qualquer outro (outra). Listagem de sequência SEQ ID NO:1 Sequência de nucleotídeos de Fv3C, uma β-glucosidase da família GH3 de Fusarium verticillioides

ATGAAGCTGAATTGGGTCGCCGCAGCCCTGTCTATAGGTGCTGCT GGCACTGACAGCGCAGTTGCTCTTGCTTCTGCAGTTCCAGACACT TTGGCTGGTGTAAAGGTCAGTTTTTTTTCACCATTTCCTCGTCTAA TCTCAGCCTTGTTGCCATATCGCCCTTGTTCGCTCGGACGCCACG CACCAGATCGCGATCATTTCCTCCCTTGCAGCCTTGGTTCCTCTTA CGATCTTCCCTCCGCAATTATCAGCGCCCTTAGTCTACACAAAAAC CCCCGAGACAGTCTTTCATTGAGTTTGTCGACATCAAGTTGCTTCT CAACTGTGCATTTGCGTGGCTGTCTACTTCTGCCTCTAGACAACC AAATCTGGGCGCAATTGACCGCTCAAACCTTGTTCAAATAACCTTT TTTATTCGAGACGCACATTTATAAATATGCGCCTTTCAATAATACC GACTTTATGCGCGGCGGCTGCTGTGGCGGTTGATCAGAAAGCTG ACGCTCAAAAGGTTGTCACGAGAGATACACTCGCATACTCGCCGC CTCATTATCCTTCACCATGGATGGACCCTAATGCTGTTGGCTGGG AGGAAGCTTACGCCAAAGCCAAGAGCTTTGTGTCCCAACTCACTC TCATGGAAAAGGTCAACTTGACCACTGGTGTTGGGTAAGCAGCTC CTTGCAAACAGGGTATCTCAATCCCCTCAGCTAACAACTTCTCAGA TGGCAAGGCGAACGCTGTGTAGGAAACGTGGGATCAATTCCTCGT CTCGGTATGCGAGGTCTCTGTCTCCAGGATGGTCCTCTTGGAATT CGTCTGTCCGACTACAACAGCGCTTTTCCCGCTGGCACCACAGCT GGTGCTTCTTGGAGCAAGTCTCTCTGGTATGAGAGAGGTCTCCTG ATGGGCACTGAGTTCAAGGAGAAGGGTATCGATATCGCTCTTGGT CCTGCTACTGGACCTCTTGGTCGCACTGCTGCTGGTGGACGAAAC TGGGAAGGCTTCACCGTTGATCCTTATATGGCTGGCCACGCCATG GCCGAGGCCGTCAAGGGTATTCAAGACGCAGGTGTCATTGCTTGT GCTAAGCATTACATCGCAAACGAGCAGGGTAAGCCACTTGGACGA TTTGAGGAATTGACAGAGAACTGACCCTCTTGTAGAGCACTTCCG ACAGAGTGGCGAGGTCCAGTCCCGCAAGTACAACATCTCCGAGT CTCTCTCCTCCAACCTGGATGACAAGACTATGCACGAGCTCTACG CCTGGCCCTTCGCTGACGCCGTCCGCGCCGGCGTCGGTTCCGTC ATGTGCTCGTACAACCAGATCAACAACTCGTACGGTTGCCAGAAC TCCAAGCTCCTCAACGGTATCCTCAAGGACGAGATGGGCTTCCAG GGTTTCGTCATGAGCGATTGGGCGGCCCAGCATACCGGTGCCGC TTCTGCCGTCGCTGGTCTCGATATGAGCATGCCTGGTGACACTGC CTTCGACAGCGGATACAGCTTCTGGGGCGGAAACTTGACTCTGG CTGTCATCAACGGAACTGTTCCCGCCTGGCGAGTTGATGACATGG CTCTGCGAATCATGTCTGCCTTCTTCAAGGTTGGAAAGACGATAG AGGATCTTCCCGACATCAACTTCTCCTCCTGGACCCGCGACACCT TCGGCTTCGTGCATACATTTGCTCAAGAGAACCGCGAGCAGGTCA ACTTTGGAGTCAACGTCCAGCACGACCACAAGAGCCACATCCGTG AGGCCGCTGCCAAGGGAAGCGTCGTGCTCAAGAACACCGGGTCC CTTCCCCTCAAGAACCCAAAGTTCCTCGCTGTCATTGGTGAGGAC GCCGGTCCCAACCCTGCTGGACCCAATGGTTGTGGTGACCGTGG TTGCGATAATGGTACCCTGGCTATGGCTTGGGGCTCGGGAACTTC CCAATTCCCTTACTTGATCACCCCCGATCAAGGGCTCTCTAATCGA GCTACTCAAGACGGAACTCGATATGAGAGCATCTTGACCAACAAC GAATGGGCTTCAGTACAAGCTCTTGTCAGCCAGCCTAACGTGACC GCTATCGTTTTCGCCAATGCCGACTCTGGTGAGGGATACATTGAA GTCGACGGAAACTTTGGTGATCGCAAGAACCTCACCCTCTGGCAG CAGGGAGACGAGCTCATCAAGAACGTGTCGTCCATATGCCCCAAC ACCATTGTAGTTCTGCACACCGTCGGCCCTGTCCTACTCGCCGAC TACGAGAAGAACCCCAACATCACTGCCATCGTCTGGGCTGGTCTT CCCGGCCAAGAGTCAGGCAATGCCATCGCTGATCTCCTCTACGG CAAGGTCAGCCCTGGCCGATCTCCCTTCACTTGGGGCCGCACCC GCGAGAGCTACGGTACTGAGGTTCTTTATGAGGCGAACAACGGC CGTGGCGCTCCTCAGGATGACTTCTCTGAGGGTGTCTTCATCGAC TACCGTCACTTCGACCGACGATCTCCAAGCACCGATGGAAAGAGC TCTCCCAACAACACCGCTGCTCCTCTCTACGAGTTCGGTCACGGT CTATCTTGGTCCACCTTTGAGTACTCTGACCTCAACATCCAGAAGA ACGTCGAGAACCCCTACTCTCCTCCCGCTGGCCAGACCATCCCC GCCCCAACCTTTGGCAACTTCAGCAAGAACCTCAACGACTACGTG TTCCCCAAGGGCGTCCGATACATCTACAAGTTCATCTACCCCTTC CTCAACACCTCCTCATCCGCCAGCGAGGCATCCAACGATGGTGG CCAGTTTGGTAAGACTGCCGAAGAGTTCCTCCCTCCCAACGCCCT CAACGGCTCAGCCCAGCCTCGTCTTCCCGCCTCTGGTGCCCCAG GTGGTAACCCTCAATTGTGGGACATCTTGTACACCGTCACAGCCA CAATCACCAACACAGGCAACGCCACCTCCGACGAGATTCCCCAG CTGTATGTCAGCCTCGGTGGCGAGAACGAGCCCATCCGTGTTCTC CGCGGTTTCGACCGTATCGAGAACATTGCTCCCGGCCAGAGCGC CATCTTCAACGCTCAATTGACCCGTCGCGATCTGAGTAACTGGGA TACAAATGCCCAGAACTGGGTCATCACTGACCATCCCAAGACTGT CTGGGTTGGAAGCAGCTCTCGCAAGCTGCCTCTCAGCGCCAAGT TGGAGTAAGAAAGCCAAACAAGGGTTGTTTTTTGGACTGCAATTTT

TTGGGAGGACATAGTAGCCGCGCGCCAGTTACGTC SEQ ID NO:2 Sequência de proteína de Fv3C, uma β-glucosidase da família GH3 de Fusarium verticillioides

MKLNWVAAALSIGAAGTDSAVALASAVPDTLAGVKKADAQKVVTRDT LAYSPPHYPSPWMDPNAVGWEEAYAKAKSFVSQLTLMEKVNLTTGV GWQGERCVGNVGSIPRLGMRGLCLQDGPLGIRLSDYNSAFPAGTTA GASWSKSLWYERGLLMGTEFKEKGIDIALGPATGPLGRTAAGGRNW EGFTVDPYMAGHAMAEAVKGIQDAGVIACAKHYIANEQEHFRQSGE VQSRKYNISESLSSNLDDKTMHELYAWPFADAVRAGVGSVMCSYNQ INNSYGCQNSKLLNGILKDEMGFQGFVMSDWAAQHTGAASAVAGLD MSMPGDTAFDSGYSFWGGNLTLAVINGTVPAWRVDDMALRIMSAFF KVGKTIEDLPDINFSSWTRDTFGFVHTFAQENREQVNFGVNVQHDHK SHIREAAAKGSVVLKNTGSLPLKNPKFLAVIGEDAGPNPAGPNGCGD RGCDNGTLAMAWGSGTSQFPYLITPDQGLSNRATQDGTRYESILTN NEWASVQALVSQPNVTAIVFANADSGEGYIEVDGNFGDRKNLTLWQ QGDELIKNVSSICPNTIVVLHTVGPVLLADYEKNPNITAIVWAGLPGQE SGNAIADLLYGKVSPGRSPFTWGRTRESYGTEVLYEANNGRGAPQD DFSEGVFIDYRHFDRRSPSTDGKSSPNNTAAPLYEFGHGLSWSTFEY SDLNIQKNVENPYSPPAGQTIPAPTFGNFSKNLNDYVFPKGVRYIYKFI YPFLNTSSSASEASNDGGQFGKTAEEFLPPNALNGSAQPRLPASGA PGGNPQLWDILYTVTATITNTGNATSDEIPQLYVSLGGENEPIRVLRG FDRIENIAPGQSAIFNAQLTRRDLSNWDTNAQNWVITDHPKTVWVGS

SSRKLPLSAKLE SEQ ID NO:3 Sequência de nucleotídeos de Bgl1 (ou Tr3A), uma β- glucosidase da família GH3 de Trichoderma reesei

ATGCGTTACCGAACAGCAGCTGCGCTGGCACTTGCCACTGGGCC CTTTGCTAGGGCAGACAGTCAGTATAGCTGGTCCCATACTGGGAT GTGATATGTATCCTGGAGACACCATGCTGACTCTTGAATCAAGGT AGCTCAACATCGGGGGCCTCGGCTGAGGCAGTTGTACCTCCTGC AGGGACTCCATGGGGAACCGCGTACGACAAGGCGAAGGCCGCAT TGGCAAAGCTCAATCTCCAAGATAAGGTCGGCATCGTGAGCGGTG TCGGCTGGAACGGCGGTCCTTGCGTTGGAAACACATCTCCGGCC TCCAAGATCAGCTATCCATCGCTATGCCTTCAAGACGGACCCCTC GGTGTTCGATACTCGACAGGCAGCACAGCCTTTACGCCGGGCGT TCAAGCGGCCTCGACGTGGGATGTCAATTTGATCCGCGAACGTG GACAGTTCATCGGTGAGGAGGTGAAGGCCTCGGGGATTCATGTC ATACTTGGTCCTGTGGCTGGGCCGCTGGGAAAGACTCCGCAGGG CGGTCGCAACTGGGAGGGCTTCGGTGTCGATCCATATCTCACGG GCATTGCCATGGGTCAAACCATCAACGGCATCCAGTCGGTAGGC GTGCAGGCGACAGCGAAGCACTATATCCTCAACGAGCAGGAGCT CAATCGAGAAACCATTTCGAGCAACCCAGATGACCGAACTCTCCA TGAGCTGTATACTTGGCCATTTGCCGACGCGGTTCAGGCCAATGT CGCTTCTGTCATGTGCTCGTACAACAAGGTCAATACCACCTGGGC CTGCGAGGATCAGTACACGCTGCAGACTGTGCTGAAAGACCAGC TGGGGTTCCCAGGCTATGTCATGACGGACTGGAACGCACAGCAC ACGACTGTCCAAAGCGCGAATTCTGGGCTTGACATGTCAATGCCT GGCACAGACTTCAACGGTAACAATCGGCTCTGGGGTCCAGCTCTC ACCAATGCGGTAAATAGCAATCAGGTCCCCACGAGCAGAGTCGAC GATATGGTGACTCGTATCCTCGCCGCATGGTACTTGACAGGCCAG GACCAGGCAGGCTATCCGTCGTTCAACATCAGCAGAAATGTTCAA GGAAACCACAAGACCAATGTCAGGGCAATTGCCAGGGACGGCAT CGTTCTGCTCAAGAATGACGCCAACATCCTGCCGCTCAAGAAGCC CGCTAGCATTGCCGTCGTTGGATCTGCCGCAATCATTGGTAACCA CGCCAGAAACTCGCCCTCGTGCAACGACAAAGGCTGCGACGACG GGGCCTTGGGCATGGGTTGGGGTTCCGGCGCCGTCAACTATCCG TACTTCGTCGCGCCCTACGATGCCATCAATACCAGAGCGTCTTCG CAGGGCACCCAGGTTACCTTGAGCAACACCGACAACACGTCCTCA GGCGCATCTGCAGCAAGAGGAAAGGACGTCGCCATCGTCTTCAT CACCGCCGACTCGGGTGAAGGCTACATCACCGTGGAGGGCAACG CGGGCGATCGCAACAACCTGGATCCGTGGCACAACGGCAATGCC CTGGTCCAGGCGGTGGCCGGTGCCAACAGCAACGTCATTGTTGT TGTCCACTCCGTTGGCGCCATCATTCTGGAGCAGATTCTTGCTCT TCCGCAGGTCAAGGCCGTTGTCTGGGCGGGTCTTCCTTCTCAGG AGAGCGGCAATGCGCTCGTCGACGTGCTGTGGGGAGATGTCAGC CCTTCTGGCAAGCTGGTGTACACCATTGCGAAGAGCCCCAATGAC TATAACACTCGCATCGTTTCCGGCGGCAGTGACAGCTTCAGCGAG GGACTGTTCATCGACTATAAGCACTTCGACGACGCCAATATCACG CCGCGGTACGAGTTCGGCTATGGACTGTGTAAGTTTGCTAACCTG AACAATCTATTAGACAGGTTGACTGACGGATGACTGTGGAATGAT AGCTTACACCAAGTTCAACTACTCACGCCTCTCCGTCTTGTCGAC CGCCAAGTCTGGTCCTGCGACTGGGGCCGTTGTGCCGGGAGGC CCGAGTGATCTGTTCCAGAATGTCGCGACAGTCACCGTTGACATC GCAAACTCTGGCCAAGTGACTGGTGCCGAGGTAGCCCAGCTGTA CATCACCTACCCATCTTCAGCACCCAGGACCCCTCCGAAGCAGCT GCGAGGCTTTGCCAAGCTGAACCTCACGCCTGGTCAGAGCGGAA CAGCAACGTTCAACATCCGACGACGAGATCTCAGCTACTGGGACA CGGCTTCGCAGAAATGGGTGGTGCCGTCGGGGTCGTTTGGCATC AGCGTGGGAGCGAGCAGCCGGGATATCAGGCTGACGAGCACTCT

GTCGGTAGCGTAG SEQ ID NO:4 Sequência de proteína de beta glicosidase 1 de T. reesei (Bgl1), uma β-glicosidase da família GH3 de Tricoderma reesei

MRYRTAAALALATGPFARADSHSTSGASAEAVVPPAGTPWGTAYDK AKAALAKLNLQDKVGIVSGVGWNGGPCVGNTSPASKISYPSLCLQD GPLGVRYSTGSTAFTPGVQAASTWDVNLIRERGQFIGEEVKASGIHVI LGPVAGPLGKTPQGGRNWEGFGVDPYLTGIAMGQTINGIQSVGVQA TAKHYILNEQELNRETISSNPDDRTLHELYTWPFADAVQANVASVMC SYNKVNTTWACEDQYTLQTVLKDQLGFPGYVMTDWNAQHTTVQSA NSGLDMSMPGTDFNGNNRLWGPALTNAVNSNQVPTSRVDDMVTRI LAAWYLTGQDQAGYPSFNISRNVQGNHKTNVRAIARDGIVLLKNDANI LPLKKPASIAVVGSAAIIGNHARNSPSCNDKGCDDGALGMGWGSGA VNYPYFVAPYDAINTRASSQGTQVTLSNTDNTSSGASAARGKDVAIV FITADSGEGYITVEGNAGDRNNLDPWHNGNALVQAVAGANSNVIVVV HSVGAIILEQILALPQVKAVVWAGLPSQESGNALVDVLWGDVSPSGK LVYTIAKSPNDYNTRIVSGGSDSFSEGLFIDYKHFDDANITPRYEFGY GLSYTKFNYSRLSVLSTAKSGPATGAVVPGGPSDLFQNVATVTVDIA NSGQVTGAEVAQLYITYPSSAPRTPPKQLRGFAKLNLTPGQSGTATF

NIRRRDLSYWDTASQKWVVPSGSFGISVGASSRDIRLTSTLSVA SEQ ID NO:5 Nucleotídeo sequenciado de Te3A, uma β-glucosidase da família de GM3 de Talaromyces emersonii, atomizado para a expressão em T.reesei

ATGCGCAACGGCCTCCTCAAGGTCGCCGCCTTAGCCGCTGCCAG CGCCGTCAACGGCGAGAACCTCGCCTACAGCCCCCCCTTCTACC CCAGCCCCTGGGCCAACGGCCAGGGCGACTGGGCCGAGGCCTA CCAGAAGGCCGTCCAGTTCGTCAGCCAGCTCACCCTCGCCGAGA AGGTCAACCTCACCACCGGCACCGGCTGGGAGCAGGACCGCTGC GTCGGCCAGGTCGGCAGCATCCCCCGCTTAGGCTTCCCCGGCCT CTGCATGCAGGACAGCCCCCTCGGCGTCCGCGACACCGACTACA ACAGCGCCTTCCCTGCCGGCGTTAACGTCGCCGCCACCTGGGAC CGCAACTTAGCCTACCGCAGAGGCGTCGCCATGGGCGAGGAACA CCGCGGCAAGGGCGTCGACGTCCAGTTAGGCCCCGTCGCCGGC CCCTTAGGCCGCTCTCCTGATGCCGGCCGCAACTGGGAGGGCTT CGCCCCCGACCCCGTCCTCACCGGCAACATGATGGCCAGCACCA TCCAGGGCATCCAGGATGCTGGCGTCATTGCCTGCGCCAAGCAC TTCATCCTCTACGAGCAGGAACACTTCCGCCAGGGCGCCCAGGA CGGCTACGACATCAGCGACAGCATCAGCGCCAACGCCGACGACA AGACCATGCACGAGTTATACCTCTGGCCCTTCGCCGATGCCGTCC GCGCCGGTGTCGGCAGCGTCATGTGCAGCTACAACCAGGTCAAC AACAGCTACGCCTGCAGCAACAGCTACACCATGAACAAGCTCCTC AAGAGCGAGTTAGGCTTCCAGGGCTTCGTCATGACCGACTGGGG CGGCCACCACAGCGGCGTCGGCTCTGCCCTCGCCGGCCTCGAC ATGAGCATGCCCGGCGACATTGCCTTCGACAGCGGCACGTCTTTC TGGGGCACCAACCTCACCGTTGCCGTCCTCAACGGCTCCATCCC CGAGTGGCGCGTCGACGACATGGCCGTCCGCATCATGAGCGCCT ACTACAAGGTCGGCCGCGACCGCTACAGCGTCCCCATCAACTTC GACAGCTGGACCCTCGACACCTACGGCCCCGAGCACTACGCCGT CGGCCAGGGCCAGACCAAGATCAACGAGCACGTCGACGTCCGCG GCAACCACGCCGAGATCATCCACGAGATCGGCGCCGCCTCCGCC GTCCTCCTCAAGAACAAGGGCGGCCTCCCCCTCACTGGCACCGA GCGCTTCGTCGGTGTCTTTGGCAAGGATGCTGGCAGCAACCCCT GGGGCGTCAACGGCTGCAGCGACCGCGGCTGCGACAACGGCAC CCTCGCCATGGGCTGGGGCAGCGGCACCGCCAACTTTCCCTACC TCGTCACCCCCGAGCAGGCCATCCAGCGCGAGGTCCTCAGCCGC AACGGCACCTTCACCGGCATCACCGACAACGGCGCCTTAGCCGA GATGGCCGCTGCCGCCTCTCAGGCCGACACCTGCCTCGTCTTTG CCAACGCCGACTCCGGCGAGGGCTACATCACCGTCGATGGCAAC GAGGGCGACCGCAAGAACCTCACCCTCTGGCAGGGCGCCGACC AGGTCATCCACAACGTCAGCGCCAACTGCAACAACACCGTCGTCG TCTTACACACCGTCGGCCCCGTCCTCATCGACGACTGGTACGACC ACCCCAACGTCACCGCCATCCTCTGGGCCGGTTTACCCGGTCAG GAAAGCGGCAACAGCCTCGTCGACGTCCTCTACGGCCGCGTCAA CCCCGGCAAGACCCCCTTCACCTGGGGCAGAGCCCGCGACGACT ATGGCGCCCCTCTCATCGTCAAGCCTAACAACGGCAAGGGCGCC CCCCAGCAGGACTTCACCGAGGGCATCTTCATCGACTACCGCCG CTTCGACAAGTACAACATCACCCCCATCTACGAGTTCGGCTTCGG CCTCAGCTACACCACCTTCGAGTTCAGCCAGTTAAACGTCCAGCC CATCAACGCCCCTCCCTACACCCCCGCCAGCGGCTTTACGAAGG CCGCCCAGAGCTTCGGCCAGCCCTCCAATGCCAGCGACAACCTC TACCCTAGCGACATCGAGCGCGTCCCCCTCTACATCTACCCCTGG CTCAACAGCACCGACCTCAAGGCCAGCGCCAACGACCCCGACTA CGGCCTCCCCACCGAGAAGTACGTCCCCCCCAACGCCACCAACG GCGACCCCCAGCCCATTGACCCTGCCGGCGGTGCCCCTGGCGG CAACCCCAGCCTCTACGAGCCCGTCGCCCGCGTCACCACCATCA TCACCAACACCGGCAAGGTCACCGGCGACGAGGTCCCCCAGCTC TATGTCAGCTTAGGCGGCCCTGACGACGCCCCCAAGGTCCTCCG CGGCTTCGACCGCATCACCCTCGCCCCTGGCCAGCAGTACCTCT GGACCACCACCCTCACTCGCCGCGACATCAGCAACTGGGACCCC GTCACCCAGAACTGGGTCGTCACCAACTACACCAAGACCATCTAC GTCGGCAACAGCAGCCGCAACCTCCCCCTCCAGGCCCCCCTCAA

GCCCTACCCCGGCATCTGATGA SEQ ID NO:6 Sequência de proteína de Te3A, uma β-glucosidase da família GH3 de Talaromyces emersonii

MRNGLLKVAALAAASAVNGENLAYSPPFYPSPWANGQGDWAEAYQ KAVQFVSQLTLAEKVNLTTGTGWEQDRCVGQVGSIPRLGFPGLCMQ DSPLGVRDTDYNSAFPAGVNVAATWDRNLAYRRGVAMGEEHRGKG VDVQLGPVAGPLGRSPDAGRNWEGFAPDPVLTGNMMASTIQGIQDA GVIACAKHFILYEQEHFRQGAQDGYDISDSISANADDKTMHELYLWPF ADAVRAGVGSVMCSYNQVNNSYACSNSYTMNKLLKSELGFQGFVM TDWGGHHSGVGSALAGLDMSMPGDIAFDSGTSFWGTNLTVAVLNG SIPEWRVDDMAVRIMSAYYKVGRDRYSVPINFDSWTLDTYGPEHYAV GQGQTKINEHVDVRGNHAEIIHEIGAASAVLLKNKGGLPLTGTERFVG VFGKDAGSNPWGVNGCSDRGCDNGTLAMGWGSGTANFPYLVTPE QAIQREVLSRNGTFTGITDNGALAEMAAAASQADTCLVFANADSGEG YITVDGNEGDRKNLTLWQGADQVIHNVSANCNNTVVVLHTVGPVLID DWYDHPNVTAILWAGLPGQESGNSLVDVLYGRVNPGKTPFTWGRA RDDYGAPLIVKPNNGKGAPQQDFTEGIFIDYRRFDKYNITPIYEFGFGL SYTTFEFSQLNVQPINAPPYTPASGFTKAAQSFGQPSNASDNLYPSDI ERVPLYIYPWLNSTDLKASANDPDYGLPTEKYVPPNATNGDPQPIDP AGGAPGGNPSLYEPVARVTTIITNTGKVTGDEVPQLYVSLGGPDDAP KVLRGFDRITLAPGQQYLWTTTLTRRDISNWDPVTQNWVVTNYTKTI

YVGNSSRNLPLQAPLKPYPGI SEQ ID NO:7 Sequência de nucleotídeos de Bgl3 (ou Tr3B), uma β- glicosidase da família GH3 de Tricoderma reesei

ATGAAGACGTTGTCAGTGTTTGCTGCCGCCCTTTTGGCGGCCGTA GCTGAGGCCAATCCCTACCCGCCTCCTCACTCCAACCAGGCGTA CTCGCCTCCTTTCTACCCTTCGCCATGGATGGACCCCAGTGCTCC AGGCTGGGAGCAAGCCTATGCCCAAGCTAAGGAGTTCGTCTCGG GCTTGACTCTCTTGGAGAAGGTCAACCTCACCACCGGTGTTGGCT GGATGGGTGAGAAGTGCGTTGGAAACGTTGGTACCGTGCCTCGC TTGGGCATGCGAAGTCTTTGCATGCAGGACGGCCCCCTGGGTCT CCGATTCAACACGTACAACAGCGCTTTCAGCGTTGGCTTGACGGC CGCCGCCAGCTGGAGCCGACACCTTTGGGTTGACCGCGGTACCG CTCTGGGCTCCGAGGCAAAGGGCAAGGGTGTCGATGTTCTTCTC GGACCCGTGGCTGGCCCTCTCGGTCGCAACCCCAACGGAGGCC GTAACGTCGAGGGTTTCGGCTCGGATCCCTATCTGGCGGGTTTG GCTCTGGCCGATACCGTGACCGGAATCCAGAACGCGGGCACCAT CGCCTGTGCCAAGCACTTCCTCCTCAACGAGCAGGAGCATTTCCG CCAGGTCGGCGAAGCTAACGGTTACGGATACCCCATCACCGAGG CTCTGTCTTCCAACGTTGATGACAAGACGATTCACGAGGTGTACG GCTGGCCCTTCCAGGATGCTGTCAAGGCTGGTGTCGGGTCCTTC ATGTGCTCGTACAACCAGGTCAACAACTCGTACGCTTGCCAAAAC TCCAAGCTCATCAACGGCTTGCTCAAGGAGGAGTACGGTTTCCAA GGCTTTGTCATGAGCGACTGGCAGGCCCAGCACACGGGTGTCGC GTCTGCTGTTGCCGGTCTCGATATGACCATGCCTGGTGACACCGC CTTCAACACCGGCGCATCCTACTTTGGAAGCAACCTGACGCTTGC TGTTCTCAACGGCACCGTCCCCGAGTGGCGCATTGACGACATGG TGATGCGTATCATGGCTCCCTTCTTCAAGGTGGGCAAGACGGTTG ACAGCCTCATTGACACCAACTTTGATTCTTGGACCAATGGCGAGT ACGGCTACGTTCAGGCCGCCGTCAATGAGAACTGGGAGAAGGTC AACTACGGCGTCGATGTCCGCGCCAACCATGCGAACCACATCCG CGAGGTTGGCGCCAAGGGAACTGTCATCTTCAAGAACAACGGCAT CCTGCCCCTTAAGAAGCCCAAGTTCCTGACCGTCATTGGTGAGGA TGCTGGCGGCAACCCTGCCGGCCCCAACGGCTGCGGTGACCGC GGCTGTGACGACGGCACTCTTGCCATGGAGTGGGGATCTGGTAC TACCAACTTCCCCTACCTCGTCACCCCCGACGCGGCCCTGCAGA GCCAGGCTCTCCAGGACGGCACCCGCTACGAGAGCATCCTGTCC AACTACGCCATCTCGCAGACCCAGGCGCTCGTCAGCCAGCCCGA TGCCATTGCCATTGTCTTTGCCAACTCGGATAGCGGCGAGGGCTA CATCAACGTCGATGGCAACGAGGGCGACCGCAAGAACCTGACGC TGTGGAAGAACGGCGACGATCTGATCAAGACTGTTGCTGCTGTCA ACCCCAAGACGATTGTCGTCATCCACTCGACCGGCCCCGTGATTC TCAAGGACTACGCCAACCACCCCAACATCTCTGCCATTCTGTGGG CCGGTGCTCCTGGCCAGGAGTCTGGCAACTCGCTGGTCGACATT CTGTACGGCAAGCAGAGCCCGGGCCGCACTCCCTTCACCTGGGG CCCGTCGCTGGAGAGCTACGGAGTTAGTGTTATGACCACGCCCA ACAACGGCAACGGCGCTCCCCAGGATAACTTCAACGAGGGCGCC TTCATCGACTACCGCTACTTTGACAAGGTGGCTCCCGGCAAGCCT CGCAGCTCGGACAAGGCTCCCACGTACGAGTTTGGCTTCGGACT GTCGTGGTCGACGTTCAAGTTCTCCAACCTCCACATCCAGAAGAA CAATGTCGGCCCCATGAGCCCGCCCAACGGCAAGACGATTGCGG CTCCCTCTCTGGGCAGCTTCAGCAAGAACCTTAAGGACTATGGCT TCCCCAAGAACGTTCGCCGCATCAAGGAGTTTATCTACCCCTACC TGAGCACCACTACCTCTGGCAAGGAGGCGTCGGGTGACGCTCAC TACGGCCAGACTGCGAAGGAGTTCCTCCCCGCCGGTGCCCTGGA CGGCAGCCCTCAGCCTCGCTCTGCGGCCTCTGGCGAACCCGGC GGCAACCGCCAGCTGTACGACATTCTCTACACCGTGACGGCCAC CATTACCAACACGGGCTCGGTCATGGACGACGCCGTTCCCCAGC TGTACCTGAGCCACGGCGGTCCCAACGAGCCGCCCAAGGTGCTG CGTGGCTTCGACCGCATCGAGCGCATTGCTCCCGGCCAGAGCGT CACGTTCAAGGCAGACCTGACGCGCCGTGACCTGTCCAACTGGG ACACGAAGAAGCAGCAGTGGGTCATTACCGACTACCCCAAGACTG TGTACGTGGGCAGCTCCTCGCGCGACCTGCCGCTGAGCGCCCGC

CTGCCATGA SEQ ID NO:8 Sequência de proteínas de Bgl3 (ou Tr3B), uma β- glicosidase da família GH3 de Tricoderma reesei

MKTLSVFAAALLAAVAEANPYPPPHSNQAYSPPFYPSPWMDPSAPG WEQAYAQAKEFVSGLTLLEKVNLTTGVGWMGEKCVGNVGTVPRLG MRSLCMQDGPLGLRFNTYNSAFSVGLTAAASWSRHLWVDRGTALG SEAKGKGVDVLLGPVAGPLGRNPNGGRNVEGFGSDPYLAGLALADT VTGIQNAGTIACAKHFLLNEQEHFRQVGEANGYGYPITEALSSNVDD KTIHEVYGWPFQDAVKAGVGSFMCSYNQVNNSYACQNSKLINGLLK EEYGFQGFVMSDWQAQHTGVASAVAGLDMTMPGDTAFNTGASYFG SNLTLAVLNGTVPEWRIDDMVMRIMAPFFKVGKTVDSLIDTNFDSWT NGEYGYVQAAVNENWEKVNYGVDVRANHANHIREVGAKGTVIFKNN GILPLKKPKFLTVIGEDAGGNPAGPNGCGDRGCDDGTLAMEWGSGT TNFPYLVTPDAALQSQALQDGTRYESILSNYAISQTQALVSQPDAIAIV FANSDSGEGYINVDGNEGDRKNLTLWKNGDDLIKTVAAVNPKTIVVIH STGPVILKDYANHPNISAILWAGAPGQESGNSLVDILYGKQSPGRTPF TWGPSLESYGVSVMTTPNNGNGAPQDNFNEGAFIDYRYFDKVAPGK PRSSDKAPTYEFGFGLSWSTFKFSNLHIQKNNVGPMSPPNGKTIAAP SLGSFSKNLKDYGFPKNVRRIKEFIYPYLSTTTSGKEASGDAHYGQTA KEFLPAGALDGSPQPRSAASGEPGGNRQLYDILYTVTATITNTGSVM DDAVPQLYLSHGGPNEPPKVLRGFDRIERIAPGQSVTFKADLTRRDL

SNWDTKKQQWVITDYPKTVYVGSSSRDLPLSARLP SEQ ID NO:9 Sequência de nucleotídeos que codificam Fv3C/Bgl3

ATGAAGCTGA ATTGGGTCGC CGCAGCCCTG TCTATAGGTG CTGCTGGCAC TGACAGCGCA GTTGCTCTTG CTTCTGCAGT TCCAGACACT TTGGCTGGTG TAAAGGTCAG TTTTTTTTCA CCATTTCCTC GTCTAATCTC AGCCTTGTTG CCATATCGCC CTTGTTCGCT CGGACGCCAC GCACCAGATC GCGATCATTT CCTCCCTTGC AGCCTTGGTT CCTCTTACGA TCTTCCCTCC GCAATTATCA GCGCCCTTAG TCTACACAAA AACCCCCGAG ACAGTCTTTC ATTGAGTTTG TCGACATCAA GTTGCTTCTC AACTGTGCAT TTGCGTGGCT GTCTACTTCT GCCTCTAGAC AACCAAATCT GGGCGCAATT GACCGCTCAA ACCTTGTTCA AATAACCTTT TTTATTCGAG ACGCACATTT ATAAATATGC GCCTTTCAAT AATACCGACT TTATGCGCGG CGGCTGCTGT GGCGGTTGAT CAGAAAGCTG ACGCTCAAAA GGTTGTCACG AGAGATACAC TCGCATACTC GCCGCCTCAT TATCCTTCAC CATGGATGGA CCCTAATGCT GTTGGCTGGG AGGAAGCTTA CGCCAAAGCC AAGAGCTTTG TGTCCCAACT CACTCTCATG GAAAAGGTCA ACTTGACCAC TGGTGTTGGG TAAGCAGCTC CTTGCAAACA GGGTATCTCA ATCCCCTCAG CTAACAACTT CTCAGATGGC AAGGCGAACG CTGTGTAGGA AACGTGGGAT CAATTCCTCG TCTCGGTATG CGAGGTCTCT GTCTCCAGGA TGGTCCTCTT GGAATTCGTC TGTCCGACTA CAACAGCGCT TTTCCCGCTG GCACCACAGC TGGTGCTTCT TGGAGCAAGT CTCTCTGGTA TGAGAGAGGT CTCCTGATGG GCACTGAGTT CAAGGAGAAG GGTATCGATA TCGCTCTTGG TCCTGCTACT GGACCTCTTG GTCGCACTGC TGCTGGTGGA CGAAACTGGG AAGGCTTCAC CGTTGATCCT TATATGGCTG GCCACGCCAT GGCCGAGGCC GTCAAGGGTA TTCAAGACGC AGGTGTCATT GCTTGTGCTA AGCATTACAT CGCAAACGAG CAGGGTAAGC CACTTGGACG ATTTGAGGAA TTGACAGAGA ACTGACCCTC TTGTAGAGCA CTTCCGACAG AGTGGCGAGG TCCAGTCCCG CAAGTACAAC ATCTCCGAGT CTCTCTCCTC CAACCTGGAT GACAAGACTA TGCACGAGCT CTACGCCTGG CCCTTCGCTG ACGCCGTCCG CGCCGGCGTC GGTTCCGTCA TGTGCTCGTA CAACCAGATC AACAACTCGT ACGGTTGCCA GAACTCCAAG CTCCTCAACG GTATCCTCAA GGACGAGATG GGCTTCCAGG GTTTCGTCAT GAGCGATTGG GCGGCCCAGC ATACCGGTGC CGCTTCTGCC GTCGCTGGTC TCGATATGAG CATGCCTGGT GACACTGCCT TCGACAGCGG ATACAGCTTC TGGGGCGGAA ACTTGACTCT GGCTGTCATC AACGGAACTG TTCCCGCCTG GCGAGTTGAT GACATGGCTC TGCGAATCAT GTCTGCCTTC TTCAAGGTTG GAAAGACGAT AGAGGATCTT CCCGACATCA ACTTCTCCTC CTGGACCCGC GACACCTTCG GCTTCGTGCA TACATTTGCT CAAGAGAACC GCGAGCAGGT CAACTTTGGA GTCAACGTCC AGCACGACCA CAAGAGCCAC ATCCGTGAGG CCGCTGCCAA GGGAAGCGTC GTGCTCAAGA ACACCGGGTC CCTTCCCCTC AAGAACCCAA AGTTCCTCGC TGTCATTGGT GAGGACGCCG GTCCCAACCC TGCTGGACCC AATGGTTGTG GTGACCGTGG TTGCGATAAT GGTACCCTGG CTATGGCTTG GGGCTCGGGA ACTTCCCAAT TCCCTTACTT GATCACCCCC GATCAAGGGC TCTCTAATCG AGCTACTCAA GACGGAACTC GATATGAGAG CATCTTGACC AACAACGAAT GGGCTTCAGT ACAAGCTCTT GTCAGCCAGC CTAACGTGAC CGCTATCGTT TTCGCCAATG CCGACTCTGG TGAGGGATAC ATTGAAGTCG ACGGAAACTT TGGTGATCGC AAGAACCTCA CCCTCTGGCA GCAGGGAGAC GAGCTCATCA AGAACGTGTC GTCCATATGC CCCAACACCA TTGTAGTTCT GCACACCGTC GGCCCTGTCC TACTCGCCGA CTACGAGAAG AACCCCAACA TCACTGCCAT CGTCTGGGCT GGTCTTCCCG GCCAAGAGTC AGGCAATGCC ATCGCTGATC TCCTCTACGG CAAGGTCAGC CCTGGCCGAT CTCCCTTCAC TTGGGGCCGC ACCCGCGAGA GCTACGGTAC TGAGGTTCTT TATGAGGCGA ACAACGGCCG TGGCGCTCCT CAGGATGACT TCTCTGAGGG TGTCTTCATC GACTACCGTC ACTTCGACCG ACGATCTCCA AGCACCGATG GAAAGAGCTC TCCCAACAAC ACCGCTGCTC CTCTCTACGA GTTCGGTCAC GGTCTATCTT GGTCGACGTT CAAGTTCTCC AACCTCCACA TCCAGAAGAA CAATGTCGGC CCCATGAGCC CGCCCAACGG CAAGACGATT GCGGCTCCCT CTCTGGGCAG CTTCAGCAAG AACCTTAAGG ACTATGGCTT CCCCAAGAAC GTTCGCCGCA TCAAGGAGTT TATCTACCCC TACCTGAGCA CCACTACCTC TGGCAAGGAG GCGTCGGGTG ACGCTCACTA CGGCCAGACT GCGAAGGAGT TCCTCCCCGC CGGTGCCCTG GACGGCAGCC CTCAGCCTCG CTCTGCGGCC TCTGGCGAAC CCGGCGGCAA CCGCCAGCTG TACGACATTC TCTACACCGT GACGGCCACC ATTACCAACA CGGGCTCGGT CATGGACGAC GCCGTTCCCC AGCTGTACCT GAGCCACGGC GGTCCCAACG AGCCGCCCAA GGTGCTGCGT GGCTTCGACC GCATCGAGCG CATTGCTCCC GGCCAGAGCG TCACGTTCAA GGCAGACCTG ACGCGCCGTG ACCTGTCCAA CTGGGACACG AAGAAGCAGC AGTGGGTCAT TACCGACTAC CCCAAGACTG TGTACGTGGG CAGCTCCTCG

CGCGACCTGC CGCTGAGCGC CCGCCTGCCA TGA SEQ ID NO:10 A sequência de polipeptídeos quiméricos Fv3C/Bgl3 (a parte quimérica Bgl3 está em negrito e em maiúsculas)

MKLNWVAAALSIGAAGTDSAVALASAVPDTLAGVKKADAQKVVTRDT LAYSPPHYPSPWMDPNAVGWEEAYAKAKSFVSQLTLMEKVNLTTGV GWQGERCVGNVGSIPRLGMRGLCLQDGPLGIRLSDYNSAFPAGTTA GASWSKSLWYERGLLMGTEFKEKGIDIALGPATGPLGRTAAGGRNW EGFTVDPYMAGHAMAEAVKGIQDAGVIACAKHYIANEQEHFRQSGE VQSRKYNISESLSSNLDDKTMHELYAWPFADAVRAGVGSVMCSYNQ INNSYGCQNSKLLNGILKDEMGFQGFVMSDWAAQHTGAASAVAGLD MSMPGDTAFDSGYSFWGGNLTLAVINGTVPAWRVDDMALRIMSAFF KVGKTIEDLPDINFSSWTRDTFGFVHTFAQENREQVNFGVNVQHDHK SHIREAAAKGSVVLKNTGSLPLKNPKFLAVIGEDAGPNPAGPNGCGD RGCDNGTLAMAWGSGTSQFPYLITPDQGLSNRATQDGTRYESILTN NEWASVQALVSQPNVTAIVFANADSGEGYIEVDGNFGDRKNLTLWQ QGDELIKNVSSICPNTIVVLHTVGPVLLADYEKNPNITAIVWAGLPGQE SGNAIADLLYGKVSPGRSPFTWGRTRESYGTEVLYEANNGRGAPQD DFSEGVFIDYRHFDRRSPSTDGKSSPNNTAAPLYEFGHGLSWSTFKF SNLHIQKNNVGPMSPPNGKTIAAPSLGSFSKNLKDYGFPKNVRRIKEF IYPYLSTTTSGKEASGDAHYGQTAKEFLPAGALDGSPQPRSAASGEP GGNRQLYDILYTVTATITNTGSVMDDAVPQLYLSHGGPNEPPKVLRG FDRIERIAPGQSVTFKADLTRRDLSNWDTKKQQWVITDYPKTVYVGS

SSRDLPLSARLP SEQ ID NO:11: Sequência de ácidos nucleicos que codifica a quimera Fv3C/Te3A/Bgl3

ATGAAGCTGAATTGGGTCGCCGCAGCCCTGTCTATAGGTGCTGCT GGCACTGACAGCGCAGTTGCTCTTGCTTCTGCAGTTCCAGACACT TTGGCTGGTGTAAAGGTCAGTTTTTTTTCACCATTTCCTCGTCTAA TCTCAGCCTTGTTGCCATATCGCCCTTGTTCGCTCGGACGCCACG CACCAGATCGCGATCATTTCCTCCCTTGCAGCCTTGGTTCCTCTTA CGATCTTCCCTCCGCAATTATCAGCGCCCTTAGTCTACACAAAAAC CCCCGAGACAGTCTTTCATTGAGTTTGTCGACATCAAGTTGCTTCT CAACTGTGCATTTGCGTGGCTGTCTACTTCTGCCTCTAGACAACC AAATCTGGGCGCAATTGACCGCTCAAACCTTGTTCAAATAACCTTT TTTATTCGAGACGCACATTTATAAATATGCGCCTTTCAATAATACC GACTTTATGCGCGGCGGCTGCTGTGGCGGTTGATCAGAAAGCTG ACGCTCAAAAGGTTGTCACGAGAGATACACTCGCATACTCGCCGC CTCATTATCCTTCACCATGGATGGACCCTAATGCTGTTGGCTGGG AGGAAGCTTACGCCAAAGCCAAGAGCTTTGTGTCCCAACTCACTC TCATGGAAAAGGTCAACTTGACCACTGGTGTTGGGTAAGCAGCTC CTTGCAAACAGGGTATCTCAATCCCCTCAGCTAACAACTTCTCAGA TGGCAAGGCGAACGCTGTGTAGGAAACGTGGGATCAATTCCTCGT CTCGGTATGCGAGGTCTCTGTCTCCAGGATGGTCCTCTTGGAATT CGTCTGTCCGACTACAACAGCGCTTTTCCCGCTGGCACCACAGCT GGTGCTTCTTGGAGCAAGTCTCTCTGGTATGAGAGAGGTCTCCTG ATGGGCACTGAGTTCAAGGAGAAGGGTATCGATATCGCTCTTGGT CCTGCTACTGGACCTCTTGGTCGCACTGCTGCTGGTGGACGAAAC TGGGAAGGCTTCACCGTTGATCCTTATATGGCTGGCCACGCCATG GCCGAGGCCGTCAAGGGTATTCAAGACGCAGGTGTCATTGCTTGT GCTAAGCATTACATCGCAAACGAGCAGGGTAAGCCACTTGGACGA TTTGAGGAATTGACAGAGAACTGACCCTCTTGTAGAGCACTTCCG ACAGAGTGGCGAGGTCCAGTCCCGCAAGTACAACATCTCCGAGT CTCTCTCCTCCAACCTGGATGACAAGACTATGCACGAGCTCTACG CCTGGCCCTTCGCTGACGCCGTCCGCGCCGGCGTCGGTTCCGTC ATGTGCTCGTACAACCAGATCAACAACTCGTACGGTTGCCAGAAC TCCAAGCTCCTCAACGGTATCCTCAAGGACGAGATGGGCTTCCAG GGTTTCGTCATGAGCGATTGGGCGGCCCAGCATACCGGTGCCGC TTCTGCCGTCGCTGGTCTCGATATGAGCATGCCTGGTGACACTGC CTTCGACAGCGGATACAGCTTCTGGGGCGGAAACTTGACTCTGG CTGTCATCAACGGAACTGTTCCCGCCTGGCGAGTTGATGACATGG CTCTGCGAATCATGTCTGCCTTCTTCAAGGTTGGAAAGACGATAG AGGATCTTCCCGACATCAACTTCTCCTCCTGGACCCGCGACACCT TCGGCTTCGTGCATACATTTGCTCAAGAGAACCGCGAGCAGGTCA ACTTTGGAGTCAACGTCCAGCACGACCACAAGAGCCACATCCGTG AGGCCGCTGCCAAGGGAAGCGTCGTGCTCAAGAACACCGGGTCC CTTCCCCTCAAGAACCCAAAGTTCCTCGCTGTCATTGGTGAGGAC GCCGGTCCCAACCCTGCTGGACCCAATGGTTGTGGTGACCGTGG TTGCGATAATGGTACCCTGGCTATGGCTTGGGGCTCGGGAACTTC CCAATTCCCTTACTTGATCACCCCCGATCAAGGGCTCTCTAATCGA GCTACTCAAGACGGAACTCGATATGAGAGCATCTTGACCAACAAC GAATGGGCTTCAGTACAAGCTCTTGTCAGCCAGCCTAACGTGACC GCTATCGTTTTCGCCAATGCCGACTCTGGTGAGGGATACATTGAA GTCGACGGAAACTTTGGTGATCGCAAGAACCTCACCCTCTGGCAG CAGGGAGACGAGCTCATCAAGAACGTGTCGTCCATATGCCCCAAC ACCATTGTAGTTCTGCACACCGTCGGCCCTGTCCTACTCGCCGAC TACGAGAAGAACCCCAACATCACTGCCATCGTCTGGGCTGGTCTT CCCGGCCAAGAGTCAGGCAATGCCATCGCTGATCTCCTCTACGG CAAGGTCAGCCCTGGCCGATCTCCCTTCACTTGGGGCCGCACCC GCGAGAGCTACGGTACTGAGGTTCTTTATGAGGCGAACAACGGC CGTGGCGCTCCTCAGGATGACTTCTCTGAGGGTGTCTTCATCGAC TACCGTCACTTCGACAAGTACAACATCACGCCTATCTACGAGTTC GGTCACGGTCTATCTTGGTCGACGTTCAAGTTCTCCAACCTCCAC ATCCAGAAGAACAATGTCGGCCCCATGAGCCCGCCCAACGGCAA GACGATTGCGGCTCCCTCTCTGGGCAACTTCAGCAAGAACCTTAA GGACTATGGCTTCCCCAAGAACGTTCGCCGCATCAAGGAGTTTAT CTACCCCTACCTGAACACCACTACCTCTGGCAAGGAGGCGTCGG GTGACGCTCACTACGGCCAGACTGCGAAGGAGTTCCTCCCCGCC GGTGCCCTGGACGGCAGCCCTCAGCCTCGCTCTGCGGCCTCTGG CGAACCCGGCGGCAACCGCCAGCTGTACGACATTCTCTACACCG TGACGGCCACCATTACCAACACGGGCTCGGTCATGGACGACGCC GTTCCCCAGCTGTACCTGAGCCACGGCGGTCCCAACGAGCCGCC CAAGGTGCTGCGTGGCTTCGACCGCATCGAGCGCATTGCTCCCG GCCAGAGCGTCACGTTCAAGGCAGACCTGACGCGCCGTGACCTG TCCAACTGGGACACGAAGAAGCAGCAGTGGGTCATTACCGACTAC CCCAAGACTGTGTACGTGGGCAGCTCCTCGCGCGACCTGCCGCT

GAGCGCCCGCCTGCCATGA SEQ ID NO:12 Sequência de aminoácidos da quimera Fv3C/Te3A/Bgl3

MKLNWVAAALSIGAAGTDSAVALASAVPDTLAGVKKADAQKVVTRDT LAYSPPHYPSPWMDPNAVGWEEAYAKAKSFVSQLTLMEKVNLTTGV GWQGERCVGNVGSIPRLGMRGLCLQDGPLGIRLSDYNSAFPAGTTA GASWSKSLWYERGLLMGTEFKEKGIDIALGPATGPLGRTAAGGRNW EGFTVDPYMAGHAMAEAVKGIQDAGVIACAKHYIANEQEHFRQSGE VQSRKYNISESLSSNLDDKTMHELYAWPFADAVRAGVGSVMCSYNQ INNSYGCQNSKLLNGILKDEMGFQGFVMSDWAAQHTGAASAVAGLD MSMPGDTAFDSGYSFWGGNLTLAVINGTVPAWRVDDMALRIMSAFF KVGKTIEDLPDINFSSWTRDTFGFVHTFAQENREQVNFGVNVQHDHK SHIREAAAKGSVVLKNTGSLPLKNPKFLAVIGEDAGPNPAGPNGCGD RGCDNGTLAMAWGSGTSQFPYLITPDQGLSNRATQDGTRYESILTN NEWASVQALVSQPNVTAIVFANADSGEGYIEVDGNFGDRKNLTLWQ QGDELIKNVSSICPNTIVVLHTVGPVLLADYEKNPNITAIVWAGLPGQE SGNAIADLLYGKVSPGRSPFTWGRTRESYGTEVLYEANNGRGAPQD DFSEGVFIDYRHFDKYNITPIYEFGHGLSWSTFKFSNLHIQKNNVGPM SPPNGKTIAAPSLGNFSKNLKDYGFPKNVRRIKEFIYPYLNTTTSGKE ASGDAHYGQTAKEFLPAGALDGSPQPRSAASGEPGGNRQLYDILYT VTATITNTGSVMDDAVPQLYLSHGGPNEPPKVLRGFDRIERIAPGQS

VTFKADLTRRDLSNWDTKKQQWVITDYPKTVYVGSSSRDLPLSARLP SEQ ID NO:13: Seiuência de nucleotídeos de Fv43D, uma enzima da família GH43D obtida de Fusarium verticilloides

ATGCAGCTCAAGTTTCTGTCTTCAGCATTGTTGCTGTCTTTGACCG GCAATTGCGCTGCGCAAGACACTAATGATATCCCTCCTCTGATCA CCGACCTCTGGTCTGCGGATCCCTCGGCTCATGTTTTCGAGGGCA AACTCTGGGTTTACCCATCTCACGACATCGAAGCCAATGTCGTCA ACGGCACCGGAGGCGCTCAGTACGCCATGAGAGATTATCACACC TATTCCATGAAGACCATCTATGGAAAAGATCCCGTTATCGACCATG GCGTCGCTCTGTCAGTCGATGATGTCCCATGGGCCAAGCAGCAA ATGTGGGCTCCTGACGCAGCTTACAAGAACGGCAAATATTATCTC TACTTCCCCGCCAAGGATAAAGATGAGATCTTCAGAATTGGAGTT GCTGTCTCCAACAAGCCCAGCGGTCCTTTCAAGGCCGACAAGAG CTGGATCCCCGGTACTTACAGTATCGATCCTGCTAGCTATGTCGA CACTAATGGCGAGGCATACCTCATCTGGGGCGGTATCTGGGGCG GCCAGCTTCAGGCCTGGCAGGATCACAAGACCTTTAATGAGTCGT GGCTCGGCGACAAAGCTGCTCCCAACGGCACCAACGCCCTATCT CCTCAGATCGCCAAGCTAAGCAAGGACATGCACAAGATCACCGAG ACACCCCGCGATCTCGTCATCCTGGCCCCCGAGACAGGCAAGCC CCTTCAAGCAGAGGACAATAAGCGACGATTTTTCGAGGGGCCCTG GGTTCACAAGCGCGGCAAGCTGTACTACCTCATGTACTCTACCGG CGACACGCACTTCCTCGTCTACGCGACTTCCAAGAACATCTACGG TCCTTATACCTATCAGGGCAAGATTCTCGACCCTGTTGATGGGTG GACTACGCATGGAAGTATTGTTGAGTACAAGGGACAGTGGTGGTT GTTCTTTGCGGATGCGCATACTTCTGGAAAGGATTATCTGAGACA GGTTAAGGCGAGGAAGATCTGGTATGACAAGGATGGCAAGATTTT

GCTTACTCGTCCTAAGATTTAG SEQ ID NO:14 Sequência de proteína de Fv43D

MQLKFLSSALLLSLTGNCAAQDTNDIPPLITDLWSADPSAHVFEGKLW VYPSHDIEANVVNGTGGAQYAMRDYHTYSMKTIYGKDPVIDHGVALS VDDVPWAKQQMWAPDAAYKNGKYYLYFPAKDKDEIFRIGVAVSNKP SGPFKADKSWIPGTYSIDPASYVDTNGEAYLIWGGIWGGQLQAWQD HKTFNESWLGDKAAPNGTNALSPQIAKLSKDMHKITETPRDLVILAPE TGKPLQAEDNKRRFFEGPWVHKRGKLYYLMYSTGDTHFLVYATSKNI YGPYTYQGKILDPVDGWTTHGSIVEYKGQWWLFFADAHTSGKDYLR

QVKARKIWYDKDGKILLTRPKI SEQ ID NO:15 O iniciador direto MH234 5’-CACCATGAAGCTGAATTGGGTCGC-3’ SEQ ID NO:16 O iniciador reverso MH235 5’-TTACTCCAACTTGGCGCTG-3’ SEQ ID NO:17 MH255 5’-AAGCCAAGAGCTTTGTGTCC-3’ SEQ ID NO:18 MH256 5’-TATGCACGAGCTCTACGCCT-3’ SEQ ID NO:19 MH257 5’-ATGGTACCCTGGCTATGGCT-3’ SEQ ID NO:20 MH258 5’-CGGTCACGGTCTATCTTGGT-3’ SEQ ID NO:21 pDonor direto 5’-

GCTAGCATGGATGTTTTCCCAGTCACGACGTTGTAAAACGACGGC - 3’ SEQ ID NO:22 Fv3C/Bgl3 reverso 5’-GGAGGTTGGAGAACTTGAACGTCGACCAAGATAGACCGTGA CCGAAC TCGTAG 3’ SEQ ID NO:23 pDonor reverso 5’-TGCCAGGAAACAGCTATGACCATGTAATACGACTCACTATAGG- 3’ SEQ ID NO:24 Fv3C/Bgl3 direto

5’- CTACGAGTTCGGTCACGGTCTATCTTGGTCGACGTTCAAGTTC TCCAACCTCC-3’ SEQ ID NO:25 Att L1 direto 5’ TAAGCTCGGGCCCCAAATAATGATTTTATTTTGACTGATAGT 3’ SEQ ID NO:26 AttL2 reverso 5’GGGATATCAGCTGGATGGCAAATAATGATTTTATTTTGACTGATA 3’ SEQ ID NO:27 Resíduos Fv3C 665 – 683 da quimera Fv3C/Bgl3

RRSPSTDGKSSPNN TAAPL SEQ ID NO:28 resíduos Te3A 634 – 640

KYNITPI SEQ ID NO:29 Pr CbhI direto 5’ CGGAATGAGCTAGTAGGCAAAGTCAGC 3’ SEQ ID NO:30 725/751 reverso 5’-

CTCCTTGATGCGGCGAACGTTCTTGGGGAAGCCATAGTCCTTAA GGTTCTTGCTGAAGTTGCCCAGAGAG 3’ SEQ ID NO:31 725/751 direto 5’- GGCTTCCCCAAGAACGTTCGCCGCATCAAGGAGTTTATCTACC CCTACCTGAACACCACTACCTC 3’ SEQ ID NO:32 Ter CbhI reverso 5’ GATACACGAAGAGCGGCGATTCTACGG 3’ SEQ ID NO:33 Te3A reverso 5’-GATAGACCGTGACCGAACTCGTAGATAGGCGTGATGTT GTACTTGTCGAAGTGACGGTAGTCGATGAAGAC 3’ SEQ ID NO:34 Te3A2 direto 5’-GTCTTCATCGACTACCGTCACTTCGACAAGTACAACATCAC GCCTATCTACGAGTTCGGTCACGGTCTATC-3’ SEQ ID NO:35 Iniciador direto SK943 5’– CACCATGAGATATAGAACAGCTGCCGCT-3’

SEQ ID NO:36 Iniciador reverso SK941 5’-CGACCGCCCTGCGGAGTCTTGCCCAGTGGTCCCGCGACAG-3’ SEQ ID NO:37 Iniciador direto (SK940) 5’–CTGTCGCGGGACCACTGGGCAAGACTCCGCAGGGCGGTCG-3’ SEQ ID NO:38 Iniciador reverso (SK942) 5’– CCTACGCTACCGACAGAGTG-3’ SEQ ID NO:39 Iniciador direto SK771 5’ – GTCTAGACTGGAAACGCAAC -3’ SEQ ID NO:40 Iniciador reverso SK745 5’ – GAGTTGTGAAGTCGGTAATCC -3’ SEQ ID NO:41 Iniciador direto SK1322 5’–CACCATGCAGCTCAAGTTTCTGTC-3’ SEQ ID NO:42 Iniciador reverso SK1297 5’–GGTTACTAGTCAACTGCCCGTTCTGTAGCGAG-3’ SEQ ID NO:43 Iniciado direto SK1236 5’–CATGCGATCGCGACGTTTTGGTCAGGTCG-3’ SEQ ID NO:44 Iniciador reverso SK1321 5’-GACAGAAACTTGAGCTGCATGGTGTGGGACAACAAGAAGG-3’

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Método de produção de uma mistura de enzimas que ca- talisam um processo de conversão, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: combinar as primeira e segunda linhagens celulares em um meio líquido, em que a primeira linhagem de células codifica e é disposta para expressar um primeiro conjunto de uma ou mais enzi- mas, a segunda linhagem de células codifica e é disposta para ex- pressar um segundo conjunto de uma ou mais enzimas, em que o pri- meiro e o segundo conjuntos de enzimas têm atividades catalíticas que acentuam o processo de conversão, em que um ou mais do pri- meiro conjunto de enzimas é heterólogo em relação à primeira linha- gem de células, e um ou mais do segundo conjunto de enzimas é he- terólogo em relação à segunda linhagem de células ou não é codifica- do pela primeira linhagem de células ou expressado a um nível mais baixo pela primeira linhagem de células; cultivar as linhagens celulares combinadas; de modo que as linhagens celulares secretam as enzimas para o meio, ou são lisa- das liberando as enzimas, fornecendo assim uma mistura de enzimas em proporções eficazes para acentuar o processo de conversão, em que as primeira e segunda linhagens celulares são li- nhagens de células fúngicas filamentosas ou linhagens de células bac- terianas.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que um ou mais do segundo conjunto de enzimas são exógenos em relação à segunda linhagem de células ou não são codi- ficados pela primeira linhagem de células; ou um ou mais do segundo conjunto de enzimas é expresso em um nível mais baixo pela primeira linhagem de células.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente: identificar uma pluralidade de enzimas que catalisam o pro- cesso de conversão; identificar ou construir uma primeira linhagem de células que codifica e é disposta para expressar um primeiro conjunto de uma ou mais das enzimas identificadas, e uma segunda linhagem de célu- las que codifica e é disposta para expressar um segundo conjunto da uma ou mais enzimas para fornecer as primeira e segunda linhagens celulares.

4. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente: identificar ou construir linhagens de células que codificam ou são dispostas linhagens celulares para expressar diferentes conjun- tos de enzimas que catalisam um processo de conversão, sendo que as linhagens celulares foram cultivadas sob pressão seletiva ou sob condições que permitem o crescimento auxotrófico para reter suas disposições para expressar as enzimas para formar um banco de li- nhagens celulares; sendo que a pluralidade de linhagens celulares compreende a primeira linhagem de células que codifica e é disposta para expressar um primeiro conjunto de uma ou mais enzimas, e a se- gunda linhagem de células codifica e é disposta para expressar um segundo conjunto de uma ou mais enzimas; selecionar as primeira e segunda linhagens celulares do banco.

5. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que as linhagens celulares são cultivadas sob diferentes pressões seletivas na etapa de identificação e sem pressão seletiva na etapa de cultivo.

6. Método de preparação de um banco de células, caracte- rizado pelo fato de que compreende identificar uma pluralidade de enzimas que catalisam um processo de conversão; identificar ou construir uma pluralidade de linhagens celula- res que codificam e são dispostas para expressar diferentes conjuntos da pluralidade de enzimas; propagar as linhagens celulares sob diferentes pressões seletivas ou sob condições que permitem o crescimento auxotrófico para reter a disposição para expressar o conjunto de enzimas codifi- cadas por uma linhagem de células, para fornecer um banco de célu- las; e combinar diferentes combinações das linhagens celulares, cultivar as linhagens celulares combinadas em um meio líquido, em que as enzimas são secretadas ou as células são lisadas e as enzi- mas liberadas para o meio para fornecer diferentes mistura de enzi- mas, e comparar a capacidade das enzimas de melhorar ou acentuar o processo de conversão, em que a pluralidade de enzimas é heteróloga em relação à pluralidade de células, e em que a pluralidade de linhagens de células é linhagem de células fúngicas filamentosas ou linhagens de células bacterianas.

7. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente se- parar a mistura de enzimas das células na cultura.

8. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente combinar a mistura de enzimas com um substrato, em que a mistura de enzimas aprimora a conversão do substrato para um produto.

9. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que o substrato é celulose e/ou hemi- celulose e o produto é glicose, ou em que o substrato é amido e o pro- duto é açúcar.

10. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 9, caracterizado pelo fato de que a razão molar entre uma enzima do primeiro conjunto de enzimas e uma enzima do segundo conjunto de enzimas na mistura é pelo menos duas vezes diferente de uma razão molar entre as enzimas expressadas pela primeira ou pela segunda linhagem de células sozinha.

11. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 9, caracterizado pelo fato de que a razão molar entre o pri- meiro conjunto de enzimas que são secretadas e o segundo conjunto de enzimas que são secretadas é pelo menos duas vezes diferente de uma razão molar entre as enzimas expressadas pela primeira ou pela segunda linhagem de células sozinha.

12. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 11, caracterizado pelo fato de que a primeiro e a segunda li- nhagens celulares são cepas iguais.

13. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 12, caracterizado pelo fato de que a primeira e/ou a segunda linhagens celulares são linhagens celulares de Tricoderma reesei.

14. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 12, caracterizado pelo fato de que a primeira e/ou a segunda linhagens celulares são linhagens celulares de Bacillus.

15. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 14, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmen- te determinar os perfis de crescimento das linhagens celulares antes da etapa de combinação.

16. Invenção, em quaisquer formas de suas concretizações ou em qualquer categoria aplicável de reivindicação, por exemplo, de produto ou de processo ou uso englobadas pela matéria inicialmente descrita, revelada ou ilustrada no pedido de patente.