CN104011222A - 从混合培养物制备的酶合剂 - Google Patents

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Abstract

本发明申请提供使用两个或更多个细胞系生成酶混合物的方法，鉴定或构建用于生成酶混合物的细胞系的方法，以及制备用于生成酶混合物的细胞库的方法。

Description

从混合培养物制备的酶合剂
优先权
本专利申请要求2011年12月13日提交的美国临时专利申请No.61/570,243的优先权，将该专利申请全文以引用的方式并入本文中。
背景技术
酶合剂用于多个工业过程。酶合剂可通过在单独的细胞系中单独生成酶然后共混来制备。单独生成和共混通常与高额成本相关。酶合剂也可通过将特定合剂的所有所需的酶工程改造进入单独生产细胞系中来制备。该方法缺乏灵活性，因为在这种情况下特定细胞系表达的酶始终以相同或几乎相同的比例生成。所述灵活性缺乏是缺点，尤其是当该方法生产的酶合剂用于例如生物质水解和谷物加工的过程中的应用时。在这些应用中，酶合剂的选择和性能通常取决于底物的类型和/或预处理方法。对于不同的底物或预处理可能需要不同的共混物。每当需要新的或甚至微小修饰的共混物时，需要构建新的生产宿主。
据报道，由于不同细胞系的不同生长需求(Dashtban et al.,Int.J.ofBiol.Sci.,5:578-595,2009(Dashtban等人，《国际生物科学杂志》，第5卷，第578-595页，2009年))，培育细胞系的细菌共培养物是繁琐的。据报道，共建立稳定的共培养物取决于培养基和生长需求，例如温度、大气环境和碳源(Maki et al.,Int.J.of Biol.Sciences,5:500-516,2009(Maki等人，《国际生物科学杂志》，第5卷，第500-516页，2009年))。据报道，共培养物受到代谢相互作用(即互养关系或者对底物的竞争)和其他相互作用(即生长增强或生长抑制，例如抗生素)的影响(参见例如Makiet al.,Int.J.of Biol.Sciences,5:500-516,2009(Maki等人，《国际生物科学杂志》，第5卷，第500-516页，2009年))。
已经报道了两个真菌菌株的固态共发酵(如，使用发酵盘)(参见例如Sun et al.,Electronic J.of Biotechnology,12:1-13,2008(Sun等人，《生物技术电子杂志》，第12卷，第1-13页，2008年)；Pandey et al.,Curr.Sci.,77:149–162,1999(Pandey等人，《当前科学》，第77卷，第149-162页，1999年)；Hu et al.,International Biodeterioration&Biodegradation65:248-252,2011(Hu等人，《国际生物腐败和生物降解》，第65卷，第248-252页，2011年)；Wang et al.,Appl.Microbiol.Biotechnol.73:533-540,2006(Wang等人，《应用微生物学和生物技术》，第73卷，第533-540页，2006年))。然而，固态共发酵是困难的，而且并不总是适用于酶的工业规模重组生产。深层发酵通常更灵活并且被认为是更可取的，其用于例如，用于生产酶混合物的青霉(Penicillium sp.)CH-TE-001和土曲霉(Aspergillus terreus)CH-TE-013(Garcia-Kirchner,et al.,Applied Biochem&Biotechnol.98:1105-1114,2002(Garcia-Kirchner等人，《应用生物化学和生物技术》，第98卷，第1105-1114页，2002年))。此外，微生物的混合培养物在不同的条件下发酵，以获得某些特性富集的培养微生物，然后共混以获得配制的复合培养物(参见例如EP 2292731)。
附图说明
图1：具有Fv3C开放阅读框的pENTR/D-TOPO载体。
图2：表达质粒pTTT-pyr13-Fv3C/Bgl3融合体的图谱。
图3：pENTR-TOPO-Bgl1(943/942)的图谱。
图4：TOPO平端/Pegl1-Fv43D的图谱。
图5：Fv43D和(Fv3C/Te3A/Bgl3嵌合体)表达的SDS凝胶电泳分析。
图6：两个里氏木霉(T.reesei)菌株共发酵生成的Fv43D和(Fv3C/Te3A/Bgl3嵌合体)的HPLC色谱图。
图7：SDS凝胶电泳分析里氏木霉RL-P37的纤维素酶表达和里氏木霉RL-P37-d/Tr3A的β-葡萄糖苷酶1(Bgl1或Tr3A)表达。
图8：里氏木霉RL-P37和里氏木霉RL-P37-d/Tr3A共发酵生成的Bgl1(Tr3A)和纤维素酶的HPLC色谱图。
图9：两个地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)菌株共发酵生成的淀粉酶变体1和2的HPLC色谱图。
图10：两个地衣芽孢杆菌菌株共发酵生成的淀粉酶变体1和2的HPLC色谱图。
图11：三个里氏木霉菌株共发酵生成的(Fv3C/Te3A/Bgl3嵌合体)、Bgl1(Tr3A)和葡糖淀粉酶的HPLC色谱图。
发明内容
本发明提供生成催化转化过程的酶混合物的方法。此类方法包括在液体培养基中组合第一和第二细胞系以及培养组合的细胞系。细胞系将酶分泌至培养基，或裂解细胞系释放酶，从而按有效地增强转化过程的比例提供酶混合物。第一细胞系编码并适于表达第一组的一个或多个酶。第二细胞系编码并适于表达第二组的一个或多个酶。第一和第二组的酶具有增强转化过程的催化活性。第一组的酶中的一者或多者对第一细胞系是外源性的。第二组的酶中的一者或多者对第二细胞系是外源性的，或不由第一细胞系编码或由第一细胞系以低水平表达。在一些方法中，第二组的酶中的一者或多者对第二细胞系是外源性的或不由第一细胞系编码。在一些方法中，第二组的酶中的一者或多者由第一细胞系以低水平表达。某些方法也可包括第三、第四或甚至第五或第六细胞系，其中每个可将酶分泌至培养基或裂解细胞系而释放酶，分别编码并适于表达第三、第四、第五或第六组的一个或多个酶。这些其他组的酶也具有增强转化过程的催化活性，其中这些酶中的一者或多者对各自细胞系是外源性的。这些其他组酶的一个或多个酶可以是对一个或多个除表达酶的细胞系之外的细胞系是外源的。
一些方法还包括鉴定催化转化过程的多个酶，以及鉴定或构建(1)编码并适于表达第一组的一个或多个已鉴定酶的细胞系，以及(2)编码并适于表达第二组的一个或多个酶的第二细胞系，从而提供第一和第二细胞系。细胞系在选择压力下或在允许营养缺陷型生长的条件下生长，以保持其适于表达酶，从而形成细胞系库。一些方法还包括鉴定或构建编码并适于表达不同组催化转化过程的酶的细胞系，以及从库选择第一和第二细胞系。本发明的一些方法还可包括第三、第四、第五或甚至第六细胞系。所述多个细胞系包括编码并适于表达第一组的一个或多个酶的第一细胞系，和编码并适于表达第二组的一个或多个酶的第二细胞系。在其中设想多于两个细胞系的情况下，第三、第四、第五或第六细胞系编码并适于表达第三、第四、第五和第六组的一个或多个酶。所述多个细胞系中的每个的表型可通过在选择压力下或在允许营养缺陷型生长的条件下生长来保持。在一些方法中，细胞系在鉴定步骤中在不同的选择压力下生长，在培养步骤中无选择压力生长。
本发明还提供制备细胞库的方法。此类方法包括(1)鉴定催化转化过程的多个酶，(2)鉴定或构建编码并适于表达所述多个酶中的不同组酶的多个细胞系，(3)使细胞系在不同选择压力下或在允许营养缺陷型生长的条件下繁殖，以保持适于表达细胞系编码的酶组，从而提供细胞库；以及(4)组合不同的细胞系组合，在液体培养基中培养组合的细胞系，并且比较酶的能力，以增强转化过程。酶是分泌的、或裂解细胞将酶释放到培养基，从而提供不同的酶混合物。
在一些方法中，第一和第二细胞系或一个或多个其他细胞系是工程改造为分别编码第一和第二组或一个或多个其他组的一个或多个酶的相同细胞系。在一些方法中，第二组的一个或多个酶由第二细胞系内源性表达。第三、第四、第五或第六组的一个或多个酶由各自细胞系内源性表达。在一些方法中，第一组的一个或多个酶中的至少一个不由第二细胞系编码，并且第二组的一个或多个酶中的至少一个不由第一细胞系编码。在一些方法中，任何组的一个或多个酶中的至少一个不由除编码该酶的细胞系之外的细胞系中的至少一个编码。在一些方法中，第一细胞系编码并适于表达第二组的至少一个酶。在一些方法中，组合步骤包括组合第一、第二和第三细胞系，所述第三细胞系编码并适于表达第三组的一个或多个酶。在一些方法中，组合步骤包括组合第一、第二、第三、第四、第五或第六细胞系，其中后面(即，第一和第二之后)的细胞系编码并适于表达第三、第四、第五和第六组的一个或多个酶。在一些方法中，第一组酶包括两个或更多个不同的酶，每个均具有增强转化过程的活性。在一些方法中，每组酶包括两个或更多个不同的酶，每个均具有增强转化过程的活性。
一些方法还包括从培养中的细胞分离酶混合物。一些方法还包括使酶混合物与底物组合，其中酶的混合物增强底物向产物的转化。在一些方法中，底物是纤维素和/或半纤维素，产物是葡萄糖。在一些方法中，底物是淀粉，产物是糖。
一些方法还包括确定混合物中酶的比例。在一些方法中，混合物中第一组酶的酶和第二组酶的酶的摩尔比与第一或第二细胞系单独表达的酶的摩尔比相差至少两倍。在一些方法中，第二组酶的酶对第二细胞系是外源性的。在一些方法中，所分泌的第一组酶和所分泌的第二组酶的摩尔比与第一或第二细胞系单独表达的酶的摩尔比相差至少两倍。在一些方法中，对第一细胞系是外源性的第一组酶和对第二细胞系是外源性的第二组酶的摩尔比与第一或第二细胞系单独表达的酶的摩尔比相差至少两倍。在一些方法中，混合物中第一组中最高表达的酶和第二组中最高表达的酶的摩尔比与第一或第二细胞系单独表达的酶的摩尔比相差至少两倍。在一些方法中，摩尔比相差至少五倍。在一些方法中，摩尔比在1:20至20:1的范围内。在一些方法中，摩尔比在1:5至5:1的范围内。在一些方法中，摩尔比在1:2至2:1的范围内。在一些实施例中，每组酶中的酶的摩尔比可通过培养每个细胞系来确定，并且组合各组酶以形成具有所需比例的每个酶的混合物。
在一些方法中，第一和第二细胞系是相同的株。在一些方法中，所述多个细胞系中的两个或更多个可以是相同的株。在一些方法中，第一和第二细胞系是修饰为表达不同组的一个或多个外源性酶的相同株。在一些方法中，所述多个细胞系中的两个或更多个是相同的株，可修饰为表达不同组的一个或多个外源性酶。在一些方法中，第一和第二细胞系是微生物细胞系。在一些方法中，所述多个细胞系的一个或多个细胞系是微生物细胞系。在一些方法中，第一和第二细胞系是真菌细胞系的细胞系。在一些方法中，所述多个细胞系的一个或多个细胞系是真菌细胞系。在一些方法中，第一和第二细胞系是丝状真菌细胞系或细菌细胞系。在一些方法中，所述多个细胞系的一个或多个或两个或更多个细胞系是丝状真菌细胞系或细菌细胞系。在一些方法中，第一和第二细胞系来自相同属的真菌细胞系。在一些方法中，所述多个细胞系的两个或更多个细胞系是相同属的真菌细胞系。在一些方法中，第一和第二细胞系是不同属的真菌细胞系。在一些方法中，所述多个细胞系的两个或更多个是不同属的真菌细胞系。在一些方法中，第一和第二细胞系是相同属不同种的真菌细胞系。在一些方法中，所述多个细胞系的两个或更多个细胞系是相同属不同种的真菌细胞系。在一些方法中，第一和第二细胞系是相同种不同菌株的真菌细胞系。在一些方法中，所述多个细胞系的两个或更多个细胞系是相同种不同菌株的真菌细胞系。在一些方法中，第一和第二细胞系是相同属不同种的真菌细胞系。在一些方法中，所述多个细胞系的两个或更多个细胞系是相同属不同种的真菌细胞系。在一些方法中，第一细胞系是真菌细胞系，第二细胞系是细菌细胞系。在一些方法中，所述多个细胞系中的至少一个是真菌细胞系，并且所述多个细胞系中的至少一个是细菌细胞系。在一些方法中，第一和/或第二细胞系是真菌细胞系。在一些方法中，所述多个细胞系的一个或多个细胞系是真菌细胞系。在一些方法中，第一和/或第二细胞系是里氏木霉细胞系。在一些方法中，所述多个细胞系的一个或多个细胞系是里氏木霉细胞系。在一些方法中，第一和/或第二细胞系是细菌细胞系。在一些方法中，所述多个细胞系的一个或多个细胞系是细菌细胞系。在一些方法中，第一和/或第二细胞系是芽孢杆菌(Bacillus)细胞系。在一些方法中，所述多个细胞系的一个或多个细胞系是芽孢杆菌细胞系。
一些方法还包括在组合步骤之前确定细胞系的生长曲线，如根据生长曲线确定混合细胞系的比率。在一些方法中，细胞系的生长曲线在不同的液体培养基中确定。一些方法还包括根据不同液体培养基中细胞系的生长曲线选择培养组合细胞系的液体培养基。在一些方法中，细胞系的生长曲线在相同的液体培养基中确定。一些方法还包括根据相同液体培养基中细胞系的生长曲线选择培养组合细胞系的液体培养基。在一些方法中，选定液体培养基中细胞系的生长速率在彼此的2倍内。
定义
用于本发明方法的细胞可来自任何类型的生物体，如真核生物体、原核生物体和古细菌。优选地，细胞来自微生物(即，微生物细胞系)，意指细胞是原核生物、古细菌，或来自能够单细胞生长的真核生物，例如真菌(如，丝状真菌或酵母)和藻类。不同生物体可通过域(如，真核生物域和原核生物域)分类。域再分为界，如细菌界(如，真细菌界)、古细菌界、原生生物界、真菌界、植物界和动物界。界进一步分为门、纲、亚纲、目、科和属。例如，来自真菌的属包括木霉属(Trichoderma)、曲霉属(Aspergillus)、皮肤癣菌(Dermatophytes)、镰刀菌属(Fusarium)、青霉属(Penicillum)和酵母属(Saccharomyces)。属进一步分为种。例如，来自木霉属的种包括里氏木霉、绿色木霉(Trichoderma viride)、哈茨木霉(Trichoderma harzianum)和康宁木霉(Trichoderma koningii)。种分为菌株。
不同的菌株是相同种的独立分离体。不同的菌株具有不同的基因型和/或表型。
细胞系在传统意义上用于表示一群基本上同基因的细胞，其能够连续(优选地无限)生长并在体外分裂，除DNA复制固有的偶然随机突变之外无任何变化。细胞系通常从单个菌落繁殖。
深层发酵是其中细胞至少主要在液体培养基的表面下生长的过程。
固态发酵是其中细胞在固体培养基上和内部生长的过程。
外源性酶意指通常不由细胞表达的酶(如，来自另一个菌株、种、属或界的异源性酶)或通常由细胞表达但由于受通常不存在于细胞中的遗传物质的控制在增高的水平上表达的酶。此类表达可因将编码此类酶的基因引入其通常不存在的位置或通过遗传操作细胞以增强酶的表达而产生。此类遗传操作可改变控制酶表达的调控元件，或可引入编码蛋白质的遗传物质，该蛋白质以反式起作用以增强酶的表达。
外源性核酸(如，DNA)意指通常不存在于细胞中(即，通过基因工程引入)的核酸。外源性核酸可来自不同的菌株、种、属或界(即，异源性)或通常可存在于细胞中但引入与通常存在不同的位置。
如果酶通常由细胞表达，则酶对细胞是内源性的，且无论是编码酶的核酸，还是调控酶的表达的任何其他核酸均不被引入细胞。内源性基因意指通常存在于细胞中其正常基因组位置的基因。如果酶或编码酶的核酸通常不由细胞编码并且通过基因工程引入细胞，则其对细胞是异源性的。
术语“丝状真菌”是指真菌亚门(Eumycotina)的所有丝状形式(参见Alexopoulos,C.J.(1962),Introductory Mycology,Wiley,New York(Alexopoulos,C.J.，1962年，《菌物学概论》，纽约威利出版社)。这些真菌的特征是其营养菌丝体的细胞壁由甲壳质、纤维素和其他复合多糖组成。丝状真菌在形态学上、生理学上和遗传学上与酵母不同。丝状真菌的营养生长是通过菌丝伸长来进行，并且碳分解代谢是专性好氧的。
如果细胞包括编码有效连接至一个或多个调控元件以允许DNA表达的酶的DNA，则细胞适于表达酶。酶可以是内源性的或外源性的。表达可以是组成型的或诱导型的。编码酶的DNA可以在细胞内的基因组或附加体位置。当两个酶被说成由不同的细胞系以不同的水平表达时，在蛋白质水平上各自表达水平的平均数标准误差(SEM)表示的范围不重叠。在相同密度的各自培养物和各自细胞系培养生长的阶段之间比较表达水平。表达水平优选地根据培养基中分泌蛋白的浓度确定。表达水平可以摩尔单位、活性单位、OD或其他单位确定。
具体实施方式
I.简介
本发明提供通过共培养表达不同组的催化相同转化过程的酶的不同细胞系来制备酶合剂的方法。共培养与常规方法相比提供更大的灵活性和更低的成本。其允许各种混合物按需要制备，而无需为每个单独类型的底物和预处理方法构建新的生产菌株。其还允许所需的酶混合物在一个批次产生，消除共混多个单独发酵的输出物的需要。根据本发明方法制备酶混合物不需要每次发酵的完全回收过程，和/或单独储存每个酶组分。另外，其允许单独维护每个生产菌株，从而防止整个合剂(工程改造进入单独生产细胞系)同时损失。
II.转化过程
转化过程是其中底物转化为可被至少两个酶催化的产物的过程。底物可以是复合物，例如包含多个类型分子的植物材料。产物可以是单个产物或多个产物。转化过程可以是单步过程或涉及多个步骤。该过程可涉及多个连续和/或平行步骤。不同的酶可以以连续步骤、平行步骤或组合在相同步骤上起作用。示例性转化过程包括纤维素类生物质、糖原、淀粉及其各种形式向糖(如，葡萄糖、木糖、麦芽糖)和/或醇(如，甲醇、乙醇、丙醇、丁醇)的转化。
一些转化过程将淀粉，如玉米淀粉、小麦淀粉或大麦淀粉、玉米固体物、小麦固体物以及来自谷物和块茎(如，甘薯、马铃薯、水稻和木薯淀粉)的淀粉转化为乙醇，或富含用于发酵的糖类的糖浆，尤其是麦芽三糖、葡萄糖和/或麦芽糖，或仅仅转化为本身为可用产物的一种或多种形式的糖。
一些转化过程作用于纤维素或木质纤维素材料，例如包含纤维素和/或半纤维素，并且有时包含木质素、淀粉、寡糖和/或单糖的材料。纤维素或木质纤维素材料还可任选地包含另外的组分，例如蛋白质和/或脂质。纤维素或木质纤维素材料包括生物能源作物、农业废弃物、市政固体垃圾、工业固体垃圾、来自造纸的淤渣、庭院垃圾、木材废料和林业垃圾例如玉米芯、作物废弃物例如玉米壳、玉米秸秆、草、小麦、小麦秸秆、大麦秸秆、干草、稻秆、柳枝稷、废纸、甘蔗渣、高粱、芦竹、象草、芒草、日本柳杉、谷物研磨而成的组分、枝条、树枝、根、叶片、木片、锯屑、灌木和灌丛、蔬菜、果实、花以及动物粪肥。纤维素或木质纤维素材料可源自单个来源，或可包括源自多于一个来源的混合物。例如，纤维素或木质纤维素材料可包括玉米芯和玉米秸秆的混合物，或草和叶片的混合物。纤维素或木质纤维素材料底物的酶转化的示例性产物是葡萄糖和乙醇。
在其他转化过程中，底物是葡萄糖、果糖、右旋糖和蔗糖，和/或C5糖例如木糖和阿拉伯糖，以及它们的混合物。蔗糖可源自多个来源，例如甘蔗、甜菜、木薯、甜高粱，以及它们的混合物。葡萄糖和右旋糖可通过基于淀粉的原料包括谷物例如玉米、小麦、裸麦、大麦、燕麦及其混合物的糖化而源自可再生的谷物来源。可发酵糖也可通过预处理和糖化过程而源自纤维素或木质纤维素生物质。此类转化过程的产物可以是醇例如乙醇或丁醇。
在一些转化过程中，底物是经过预处理的。预处理可以是机械、化学或生物化学过程或其组合。预处理可包括一种或多种技术，包括自动水解、蒸汽爆破、碾磨、切斩、球磨、压磨、辐射、流经液体热水处理、稀酸处理、浓酸处理、过乙酸处理、超临界二氧化碳处理、碱处理、有机溶剂处理以及用微生物例如真菌或细菌处理。碱处理可包括氢氧化钠处理、石灰处理、湿式氧化、氨气处理和氧化碱处理。预处理可涉及移除或改变木质素、移除半纤维素、纤维素去晶、从半纤维素移除乙酰基、减小纤维素的聚合度、增加木质纤维素生物质的孔隙体积、增加木质纤维素的表面积或它们的任何组合。
III.酶
可制备酶的任何组合的合剂，所述酶选自包括但不限于六种主要酶分类的酶：水解酶、氧化还原酶、转移酶、裂解酶、异构酶或连接酶(Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry andMolecular Biology(NC-IUBMB),Enzyme Nomenclature,Academic Press,SanDiego,California,1992(国际生物化学和分子生物学联合会命名委员会(NC-IUBMB)，《酶命名法》，学术出版社，加利福尼亚州圣地亚哥，1992年))。合适酶的例子包括纤维素酶、半纤维素酶、木聚糖酶、淀粉酶、葡糖淀粉酶、蛋白酶、植酸酶、角质酶、植酸酶、漆酶、脂肪酶、异构酶、葡萄糖异构酶、酯酶、过氧化物酶、磷脂酶、果胶酶、角蛋白酶、还原酶、氧化酶、过氧化物酶、酚氧化酶、脂肪氧合酶、木质酶、支链淀粉酶、鞣酸酶、戊聚糖酶、麦芽糖酶、甘露聚糖酶、葡糖苷酸酶、半乳聚糖酶、β-葡聚糖酶、阿拉伯糖苷酶、透明质酸酶、乳糖酶、聚半乳糖醛酸酶、β-半乳糖苷酶和软骨素酶，或密切相关和较不稳定同系物存在的任何酶。
酶可以来自任何起源，如细菌或真菌。酶可以是杂交酶，即作为功能酶的融合蛋白，其中至少一份或部分来自第一物种，另一份或部分来自第二物种。酶可以是天然酶的突变、截短或杂交形式。适于本发明方法的酶可以是分泌的、细胞质、细胞核或细胞膜蛋白。胞外酶，如纤维素酶、半纤维素酶、蛋白酶或淀粉降解酶如淀粉酶，通常具有连接至其编码序列的N-端部分的信号序列。
酶底物的例子包括木质纤维素材料、纤维素、半纤维素、淀粉或它们的组合。催化木质纤维素材料转化的示例性酶组包括内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶或纤维二糖水解酶和β-葡萄糖苷酶。催化半纤维素转化的示例性酶组包括至少木聚糖酶、甘露聚糖酶、木糖苷酶、甘露糖苷酶、葡萄糖苷酶、阿拉伯糖苷酶、葡糖苷酸酶和半乳糖苷酶。催化淀粉水解的示例性酶组包括至少α-淀粉酶、糖化α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡糖淀粉酶和支链淀粉酶。取决于原材料和预处理方法，可选择另外的酶，如蛋白酶和植酸酶。
纤维素酶是水解纤维素中β-D-糖苷键的酶。纤维分解酶通常分为三个主要类别：内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶或纤维二糖水解酶和β-葡萄糖苷酶(Knowles,J.et al.,TIBTECH5:255-261(1987)(Knowles,J.等人，《TIBTECH》，第5卷，第255-261页，1987年))。纤维素酶还包括辅助酶，包括GH61成员，例如EG4、膨胀因子、扩展蛋白和CIP1。科学文献中描述了多种纤维素酶，其例子包括：来自里氏木霉：Shoemaker,S.etal.,Bio/Technology,1:691-696,1983(Shoemaker,S.等人，《生物/技术》，第1卷，第691-696页，1983年)，其公开了CBHI；Teeri,T.et al.,Gene,51:43-52,1987(Teeri,T.等人，《基因》，第51卷，第43-52页，1987年)，其公开了CBHII；Penttila,M.et al.,Gene,45:253-263,1986(Penttila,M.等人，《基因》，第45卷，第253-263页，1986年)，其公开了EGI；Saloheimo,M.et al.,Gene,63:11-22,1988(Saloheimo,M.等人，《基因》，第63卷，第11-22页，1988年)，其公开了EGII；Okada,M.et al.,Appl.Environ.Microbiol.,64:555-563,1988(Okada,M.等人，《应用和环境微生物学》，第64卷，第555-563页，1988年)，其公开了EGIII；Saloheimo,M.et al.,Eur.J.Biochem.,249:584-591,1997(Saloheimo,M.等人，《欧洲生物化学杂志》，第249卷，第584-591页，1997年)，其公开了EGIV；以及Saloheimo,A.et al.,Molecular Microbiology,13:219-228,1994(Saloheimo,A.等人，《分子微生物学》，第13卷，第219-228页，1994年)，其公开了EGV。来自除木霉属之外的物种的外切纤维二糖水解酶和内切葡聚糖酶也有所描述，如Ooi等人，1990年，其公开了编码棘孢曲霉(Aspergillusaculeatus)生成的内切葡聚糖酶F1-CMC的cDNA序列；Kawaguchi T等人，1996年，其公开了编码来自棘孢曲霉的β-葡萄糖苷酶1的cDNA的克隆和测序；Sakamoto等人，1995年，其公开了编码来自白曲霉(Aspergilluskawachii)IFO4308的内切葡聚糖酶CMCase-1的cDNA序列；以及Saarilahti等人，1990年，其公开了来自胡萝卜软腐欧文氏菌(Erwiniacarotovara)的内切葡聚糖酶。
半纤维素酶是催化半纤维素的降解和/或修饰的酶，包括木聚糖酶、甘露聚糖酶、木糖苷酶、甘露糖苷酶、葡萄糖苷酶、阿拉伯糖苷酶、葡糖苷酸酶和半乳糖苷酶。例如，半纤维素酶可以是木聚糖酶，即任何天然或重组生成的木聚糖降解酶。一般来讲，木聚糖降解酶是以内切或外切方式水解木聚糖的内切和外切木聚糖酶。示例性木聚糖降解酶包括内切-1,3-β-木糖苷酶、内切-β-1,4-木聚糖酶(1,4-β-木聚糖木聚糖水解酶；EC3.2.1.8)、1,3-β-D-木聚糖木聚糖水解酶和β-1,4-木糖苷酶(1,4-β-木聚糖木聚糖水解酶；EC3.2.1.37)(EC No.3.2.1.32、3.2.1.72、3.2.1.8、3.2.1.37)。优选的木聚糖酶是源自丝状真菌(如，曲霉属、Disportrichum、青霉属、腐质霉属(Humicola)、脉孢菌属(Neurospora)、镰刀菌属、木霉属和粘帚霉属(Gliocladium)的真菌)或细菌来源(如，芽孢杆菌属、栖热袍菌(Thermotoga)、链霉菌属(Streptomyces)、小四孢菌属(Microtetraspora)、马杜拉放线菌属(Actinmadura)、高温单孢菌属(Thermomonospora)、放线菌(Actinomyctes)和头孢霉属(Cepholosporum))的那些。
淀粉酶是分类为水解酶的淀粉降解酶，其裂解淀粉中的α-D-(1→4)O-糖苷键。一般来讲，α-淀粉酶(E.C.3.2.1.1，α-D-(1→4)-葡聚糖葡聚糖水解酶)被定义为以随机方式在淀粉分子内裂解α-D-(1→4)O-糖苷键的内切酶。外切淀粉分解酶例如β-淀粉酶(E.C.3.2.1.2，α-D-(1→4)-葡聚糖麦芽糖水解酶)和一些产物特异性淀粉酶如产麦芽糖α-淀粉酶(E.C.3.2.1.133)从底物的非还原末端裂解淀粉分子。β-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶(E.C.3.2.1.20，α-D-葡萄糖苷葡萄糖水解酶)、葡糖淀粉酶(E.C.3.2.1.3，α-D-(1→4)-葡聚糖葡萄糖水解酶)和产物特异性淀粉酶可由淀粉生成特定长度的麦芽低聚糖。
优选地，α-淀粉酶是源自芽孢杆菌的那些，尤其是源自地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)或嗜热脂肪芽胞杆菌(Bacillus stearothermophilus)以及嗜热脂肪地芽孢杆菌(Geobacillusstearothermophilus)的那些，以及真菌α-淀粉酶例如源自曲霉属(即，米曲霉(A.oryzae)和黑曲霉(A.niger))的那些。任选地，α-淀粉酶可衍生自前体α-淀粉酶。前体α-淀粉酶由能够生成α-淀粉酶的任何来源生成。α-淀粉酶的合适来源是原核或真核生物体，包括真菌、细菌、植物或动物。优选地，前体α-淀粉酶由嗜热脂肪地芽孢杆菌或芽孢杆菌属生成；更优选地，由地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌或嗜热脂肪芽胞杆菌生成；最优选地，前体α-淀粉酶源自地衣芽孢杆菌。α-淀粉酶也可来自枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)。
葡糖淀粉酶是淀粉葡糖苷酶类的酶(E.C.3.2.1.3，葡糖淀粉酶，1,4-α-D-葡聚糖葡萄糖水解酶)。这些酶从直链淀粉和支链淀粉分子的非还原性末端释放葡糖基残基。
支链淀粉酶是淀粉脱支酶。支链淀粉酶是分为EC3.2.1.41的酶，此类酶的特征在于其能够水解例如支链淀粉和胶淀粉中的α-1,6-糖苷键。
其他酶包括蛋白酶，例如丝氨酸、金属、巯基或酸性蛋白酶。丝氨酸蛋白酶(如，枯草杆菌蛋白酶)在例如Honne-Seyler's Z Physiol.Chem364:1537-1540,1983(《荷柏-塞勒生理化学杂志》，第364卷，第1537-1540页，1983年)；Drenth,J.et al.Eur.J.Biochem.26:177-181,1972(Drenth,J.等人，《欧洲生物化学杂志》，第26卷，第177-181页，1972年)；美国专利No.4,760,025(RE34,606)、5,182,204和6,312,936以及EP0 323,299中有所描述。蛋白水解活性可以如K.M.Kalisz，“MicrobialProteinases”Advances in Biochemical Engineering and Biotechnology,A.Fiecht Ed.1988(K.M.Kalisz，“微生物蛋白酶”，《生物化学工程和生物技术进展》，A.Fiecht编辑，1988年)所公开测定。
植酸酶是催化肌醇六磷酸盐水解为(1)肌醇和/或(2)其单、二、三、四和/或五磷酸盐以及(3)无机磷酸盐的酶。例如，植酸酶包括EC编号3.1.3.8或EC编号3.1.3.26定义的酶。
IV.细胞系
在选择转化过程并且从公开文献和/或通过实验鉴定预期增强转化过程的酶的一种或多种组合之后，细胞系被鉴定或构建为表达不同组的酶。一些细胞系内源性表达的酶是熟知的。例如，里氏木霉是多个纤维素处理酶的来源，并且芽孢杆菌是多个淀粉酶的来源。此类细胞系的使用有时无需修饰。然而，通常增强酶转化过程所需的一个或多个酶不是由已知的现有细胞系以足够水平内源性表达的。在这种情况下，现有细胞系可经基因工程改造来外源性表达酶。如果增强转化过程所需的多个酶不由已知的现有细胞系以足够水平表达，则现有细胞系可经基因工程改造来源性表达每个酶。为了使模块化程度最大化，每个此类酶可在其自身细胞系中外源性表达。优选地，不同的酶经基因工程改造进入的细胞系代表相同基础细胞系的修饰。
作为内源性表达、外源性表达或二者的结果，共培养的细胞系可表达不同组的酶，所有酶均有助于增强酶致转化。对于不表达任何增强转化过程的内源性酶并且经基因工程改造为表达一个或多个外源性酶的细胞系，由细胞系生成的酶组被认为包括外源性酶。对于内源性表达增强转化过程的酶并且经基因工程改造为表达一个或多个外源性酶的细胞系，由细胞系生成的酶组被认为包括内源性酶和外源性酶。在未经基因工程改造为表达外源性酶的细胞系中，由细胞系生成的酶组被认为仅包括内源性酶。虽然一组外源性酶易于理解和认识，但对于以痕量水平表达的内源性酶的情况这是不一定的。因此，根据例子所用的条件和/或方案，酶组定义为仅包括以HPLC可测定的可检测水平表达的酶。优选地，一组中的每个酶以该组中最高表达的酶的水平的至少1/100或1/10的水平表达和/或分泌。不必通过本发明方法的实施来认识属于一组的所有酶的种类。相反，认识由给定细胞系生成的一组中的至少一个酶的种类即足够。
一个细胞系编码的酶组可包含与第二细胞系编码的酶组的不重叠、部分重叠或完全重叠。存在于第一组的第一细胞系中的酶以及存在于第二组的第二细胞系中的酶可以以不同水平表达。如果该组中的酶的种类完全重叠，则至少一个酶以各组之间的不同水平表达(即，平均数标准误差(SEM)不重叠)。优选地，每组酶包括在来自共培养物中包括的其他细胞系的其他酶组中不表达或以低水平表达的至少一个酶。优选地，一组催化转化过程的酶(如，第一组)中的至少一个酶是表达相同组酶的细胞系(如，第一细胞系)外源性的。优选地，共培养物中包括的任何不表达外源性酶的细胞系表达内源性酶，所述内源性酶不由共培养物中包括的每个其他细胞系表达或以显著较低的水平表达。当一组酶包括外源性酶并且其他组酶中的所有酶为内源性时，表达其他组的细胞系可以是与第一细胞系的菌株、种或属不同的菌株、种或属。或者，一个细胞系可以是修饰为表达外源性酶的基础菌株或细胞系，另一个细胞系可以是无修饰的基础细胞系或菌株。虽然据认为修饰细胞系与基础细胞系的共表达会不期望地稀释外源性酶相对于由基础细胞系生成的内源性酶的相对浓度，但事实上，修饰可基本上抑制否则将增强转化过程的内源性酶的表达。在该情况下，修饰细胞系与基础菌株或细胞系的共培养可提供比任何一个细胞系单独培养更有效比例的外源性和内源性酶共混物。
通过共培养两个或更多个细胞系，不同组的酶可在一起表达，实现与每个细胞系单独的酶比率或酶活性比率不同的酶比率或酶活性比率。比率优选地以摩尔计，但也可使用活性单位、质量或其他单位。
任何酶的比率可通过评估1)来自共培养物的酶混合物中第一组酶和第二组酶以及2)一个或两个单独细胞系之间的差异来比较。此类比较最容易根据第一组中最高表达的酶和第二组中最高表达的酶之间的配对示出(表达在蛋白质水平测量，优选地分泌蛋白)。任何一个单独细胞系中此类酶的比率优选地为与酶混合物中相差至少2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45或50倍。例如，如果第一组中最高表达的酶和第二组中最高表达的酶在来自共培养物的混合物中以1:1的摩尔比，在第一细胞系中以10:1的比率，并且在第二细胞系中以1:10的比率表达，则混合物中摩尔比与任何一个细胞系中摩尔比相差10倍。配对或分组比较可在第一或第二组中任何其他酶之间进行。用于比较的组可定义为，例如每组中的分泌酶，每组中的胞内酶，每组中的外源性酶，或每组中具有重组标签的酶。
第一和第二组之间酶的比率也可通过对第一组中已知酶的摩尔量和第二组中酶(或至少已知的那些)的摩尔量求和并且计算比率来比较。该比率优选地在1:50至50:1、1:45至45:1、1:40至40:1、1:35至35:1、1:30至30:1、1:25至25:1、1:20至20:1、1:10至10:1、1:5至5:1或1:2至2:1的范围内。
细胞系经工程改造为通过常规方法表达一个或多个外源性酶。在一些此类方法中，编码有效连接至调控序列以确保其表达的酶的核酸被转化到细胞系中。任选地，酶可融合到重组标签(如，His-标签、FLAG-标签、GST、HA-标签、MBP、Myc-标签)，以增强共培养物中或混合物中来自共培养物的酶的检测和定量。编码酶的核酸优选地还融合到信号肽以允许分泌。可根据要在宿主生物体中表达和分泌的酶使用任何合适的信号肽。信号序列的例子包括来自链霉菌属纤维素酶基因的信号序列。优选的信号序列是变铅青链霉菌(S.lividans)纤维素酶celA(Bently et al.,Nature417:141-147,2002(Bently等人，《自然》，第417卷，第141-147页，2002年))。然后优选地由于在附加体上转化或通过整合到染色体，稳定维持该核酸。或者，酶的表达可通过顺式或反式活化染色体中编码酶的DNA来诱导。
与工程改造细胞系以表达外源性基因一样，有时需要将细胞系工程改造以抑制或敲除编码作为转化过程抑制剂的产物的内源性基因的表达。抑制或敲除策略也可用于移除不必要的基因或替换内源性基因，并且将其替换为该基因的改进型式、变体和/或异源型式。此类抑制或敲除可通过siRNA、锌指蛋白、其他已知的用于敲除或减少特定内源性基因表达的分子生物学技术等等进行。
共培养物的组合细胞系可来自不同或相同的域、界、门、纲、亚纲、目、科、属或种。它们也可来自不同种的不同菌株、相同种的不同菌株，或来自相同的菌株。
示例性组合包括来自相同种的不同菌株的细胞系(如，里氏木霉RL-P37(Sheir-Neiss and Montenecourt,Appl.Microbiol.Biotechnol.20:46-53,1984(Sheir-Neiss和Montenecourt，《应用微生物学和生物技术》，第20卷，第46-53页，1984年))和里氏木霉QM-9414(ATCC No.26921；由美国陆军纳蒂克实验室(U.S.Army Natick Laboratory)分离))。可使用来自相同界(如，真菌界)中不同种的不同菌株的细胞系(如，里氏木霉RL-P37和黑曲霉)。也可使用来自不同界/域中不同种的不同菌株的细胞系(如，细菌、酵母、真菌、藻类和高等真核细胞(植物或动物细胞))。示例性组合还包括细菌(如，枯草芽孢杆菌或大肠杆菌(E.coli))和真菌(如，里氏木霉或黑曲霉)；细菌和酵母(如，酵母属或毕赤酵母属(Pichia))；酵母和真菌；细菌和藻类、酵母和藻类、真菌和藻类等等。
当两个或更多个细胞系由相同的基础菌株(如，里氏木霉RL-P37或枯草芽孢杆菌)经工程改造时，每个细胞系可编码一个或多个不同的外源性酶。任选地，一些细胞系也可经工程改造使得基础菌株中的基因正常表达水平的如至少50％、75％或90％受到抑制。
适于本发明方法的细胞系包括细菌、酵母、真菌和高等真核细胞系，例如植物或动物细胞系。微生物细胞系是优选的。
细胞系可以是酵母细胞系。酵母细胞的例子包括酵母属、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces sp.)、毕赤酵母属、汉逊酵母属(Hansenula sp.)、克鲁维酵母菌属(Kluyveromyces sp.)、法夫酵母属(Phaffia sp.)或假丝酵母属(Candida sp.)，例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、白假丝酵母(Candida albicans)、多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、加拿大毕赤酵母(P.canadensis)、马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)和红法夫酵母(Phaffia rhodozyma)。
细胞系可以是真菌细胞系。真菌的例子包括曲霉菌种，例如米曲霉和黑曲霉；酵母菌种，例如酿酒酵母；裂殖酵母菌种，例如粟酒裂殖酵母以及木霉属菌种，例如里氏木霉。
优选的真菌例子包括丝状真菌细胞。丝状真菌亲本细胞可以是以下各属(但不限于以下各属)的种的细胞：木霉属(如，里氏木霉(其为之前归类为长梗木霉(T.longibrachiatum)的红褐肉座菌(Hypocrea jecorina)的无性形式)、绿色木霉、康宁木霉、哈茨木霉)(Sheir-Neiss et al,Appl.Microbiol.Biotechnol20:46-53,1984(Sheir-Neiss等人，《应用微生物学和生物技术》，第20卷，第46-53页，1984年)；ATCC No.56765和ATCCNo.26921)；青霉属；腐质霉属(如，特异腐质霉(H.insolens)、柔毛腐质霉(H.lanuginose)或灰腐质霉(H.grisea))；金孢子菌属(Chrysosporium sp.)(如，勒克瑙金孢菌(C.lucknowense))；粘帚霉属；曲霉菌属(Aspergillussp.)(如，米曲霉、黑曲霉、酱油曲霉(A sojae)、日本曲霉(A.japonicus)、构巢曲霉(A.nidulans)或泡盛曲霉(A.awamori))(Ward et al.,Appl.Microbiol.Biotechnol.39:7380743,1993(Ward等人，《应用微生物学与生物技术》，第39卷，第7380743页，1993年)以及Goedegebuur et al.,Genet41:89-98,2002(Goedegebuur等人，《遗传学》，第41卷，第89-98页，2002年))；镰刀菌属(如，粉红色镰刀菌(F.roseum)、禾赤镰刀菌(F.graminum)、禾谷镰刀菌(F.cerealis)、尖孢镰刀菌(F.oxysporuim)或镰孢霉(F.venenatum))；脉孢菌属(如，粗糙脉胞菌(N.crassa))；肉座菌属(Hypocrea sp.)；毛霉属(Mucor sp.)(如，米黑毛霉(M.miehei))；根霉属(Rhizopus sp.)和裸胞壳属(Emericella sp.)(还可参见Innis et al,ScL228:21-26,1985(Innis等人，《ScL》，第228卷，第21-26页，1985年))。术语“木霉属”或“木霉菌种”是指过去或现在归类为木霉属的任何真菌属。真菌可以是构巢曲霉、泡盛曲霉、米曲霉、棘孢曲霉、黑曲霉、日本曲霉、里氏木霉、绿色木霉、尖孢镰刀菌或茄腐皮镰刀菌(F.solani)。曲霉菌菌株在Ward et al.,Appl.Microbiol.Biotechnol.39:738-743,1993(Ward等人，《应用微生物学和生物技术》，第39卷，第738-743页，1993年)和Goedegebuur et al.,Curr Gene41:89-98,2002(Goedegebuur等人，《现代基因》，第41卷，第89-98页，2002年)中有所公开，它们均据此全文以引用方式并入，尤其是关于真菌的内容。优选地，真菌是木霉属菌株，例如里氏木霉菌株。里氏木霉菌株是已知的，并且非限制性例子包括ATCC No.13631、ATCC No.26921、ATCC No.56764、ATCC No.56765、ATCC No.56767和NRRL15709，它们均据此全文以引用方式并入，尤其是关于里氏木霉菌株的内容。宿主菌株可以是RL-P37的衍生物(Sheir-Neiss et al.,Appl.Microbiol.Biotechnology20:46-53,1984(Sheir-Neiss等人，《应用微生物学与生物技术》，第20卷，第46-53页，1984年))。
细胞系可以是细菌细胞系。适于本发明方法的细菌细胞的例子包括革兰氏阳性菌(如，链霉菌属和芽孢杆菌属)和革兰氏阴性菌(如，大肠杆菌和假单胞菌属(Pseudomonas sp.))。优选的例子包括芽孢杆菌属的菌株，例如地衣芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌；乳杆菌属(Lactobacillus)的菌株；链球菌属(Streptococcus)的菌株；泛菌属(Pantoea)的菌株，例如柠檬泛菌(P.citrea)；假单胞菌属的菌株，例如产碱假单胞菌(P.alcaligenes)；链霉菌属的菌株，例如白色链霉菌(S.albus)、变铅青链霉菌、鼠灰链霉菌(S.murinus)、锈赤链霉菌(S.rubiginosus)、天蓝色链霉菌(S.coelicolor)或灰色链霉菌(S.griseus)；或埃希氏菌属(Escherichia)的菌株，例如大肠杆菌。“芽孢杆菌”属包括本领域技术人员已知的“芽孢杆菌”属内的所有种，包括但不限于枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌(B.lentus)、短芽孢杆菌(B.brevis)、嗜热脂肪芽胞杆菌、嗜碱芽孢杆菌(B.alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌(B.clausii)、耐盐芽孢杆菌(B.halodurans)、巨大芽孢杆菌(B.megaterium)、凝结芽孢杆菌(B.coagulans)、环状芽孢杆菌(B.circulans)、灿烂芽孢杆菌(B.lautus)和苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensis)。已经认识到，芽孢杆菌属还在继续进行分类学整理。因此，该属包括已经重新分类的种，包括但不限于诸如现在命名为“嗜热脂肪地芽孢杆菌”的嗜热脂肪芽孢杆菌之类的生物体。在氧存在下生成抗性内生孢子被认为是芽孢杆菌属的定义性特征，但该特征也可适用于最近命名的脂环酸芽孢杆菌属(Alicyclobacillus)、双芽孢杆菌属(Amphibacillus)、解硫胺素芽孢杆菌属(Aneurinibacillus)、厌氧芽孢杆菌属(Anoxybacillus)、短芽孢杆菌属(Brevibacillus)、线芽孢杆菌属(Filobacillus)、薄壁芽孢杆菌属(Gracilibacillus)、喜盐芽孢杆菌属(Halobacillus)、类芽孢杆菌属(Paenibacillus)、需盐芽孢杆菌属(Salibacillus)、耐热芽孢杆菌属(Thermobacillus)、解脲芽孢杆菌属(Ureibacillus)和枝芽孢杆菌属(Virgibacillus)。
细胞系可以是植物细胞系。植物细胞的例子包括来自蝶形花科(Fabaceae)，例如蝶形花亚科(Faboideae)的植物细胞。适于本发明方法的植物细胞的例子包括来自野葛(kudzu)、杨树(poplar)(例如银白杨与欧洲山杨的杂种(Populus alba x tremula)CAC35696或银白杨(Populus alba))的植物细胞(Sasaki et al.,FEBS Letters579(11):2514-2518,2005(Sasaki等人，《欧洲生物化学学会联合会通讯》，第579卷，第11期，第2514-2518页，2005年))、白杨(aspen)(例如美洲山杨(Populus tremuloides))或英国栎(Quercus robur)。
细胞系可以是藻类细胞，例如绿藻、红藻、灰胞藻门(glaucophytes)、chlorarachniophytes、鞭毛虫(euglenids)、色藻界(chromista)或沟鞭藻类(dinoflagellates)。
细胞系可以是蓝细菌细胞，例如根据形态分为任何如下组的蓝细菌：色球藻目(Chroococcales)、宽球藻目(Pleurocapsales)、颤藻目(Oscillatoriales)、念珠藻目(Nostocales)或真枝藻目(Stigonematales)。
细胞系可以是得自如美国典型培养物保藏中心(American Type CultureCollection)的哺乳动物细胞，例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、HeLa细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、COS细胞或任何数量的其他无限增殖化细胞系。
在一些方法中，第一细胞系是编码外源性β-木糖苷酶的里氏木霉菌株，第二细胞系是编码外源性β-葡萄糖苷酶的里氏木霉菌株。
在一些方法中，第一细胞系是编码地衣芽孢杆菌淀粉酶的地衣芽孢杆菌菌株，第二细胞系是编码嗜热脂肪地芽孢杆菌淀粉酶的地衣芽孢杆菌菌株。
在一些方法中，例如第一细胞系是编码外源性GH61酶的里氏木霉菌株，第二细胞系是编码外源性或内源性纤维素酶的里氏木霉菌株。
V.共培养方法
在一些实施例中待共培养的细胞系最初可以分开培养形成初始培养物(其优选地在600nm波长和1cm光程长度下具有至少约0.1、0.2、0.4、0.8、1.0或1.5的光密度)。然后初始培养物在新鲜培养基中以等体积或其他所需比率混合(如下进一步讨论)，形成初始共培养物。任选地，分离物可直接接种到培养基用于蛋白质生产(如，不使用初始培养物)。
一个细胞系生长超过另一个的潜在问题可通过如下步骤减少：选择具有本质上类似的生长特性的细胞系，如密切相关细胞系，当每个细胞系在单独培养基上生长时，选择不是最适于至少一个细胞系而是减少生长差异的培养基，和/或通过调整以体积计或更准确地以OD或细胞数量计的比率，培养物以该比率组合，以补偿不同的生长特性。
密切相关细胞系的一个来源是来自相同种(如，里氏木霉)或相同菌株，或更优选地相同基础菌株的细胞系，或以不同方式修饰为表达不同外源性酶的细胞系。例如，第一细胞系是经基因工程改造为表达酶A的基础细胞系，第二细胞系是经基因工程改造为表达酶B的基础细胞系。
在组合细胞系用于共培养之前，可确定每个细胞系的生长曲线。然后根据所确定的生长曲线，可确定混合细胞系以优化第一组酶和第二组酶(或更多组酶)共表达的比率或比率范围，以便至少部分补偿生长曲线的差异。
在任何细胞培养体系中，在接种后存在特征性生长模式，其包括延滞期、加速生长期、指数或“对数”期、负生长加速期和平台或稳定期。对数和平台期给出了关于细胞系、对数生长期间的群体倍增时间、生长速率以及平台期实现的最大细胞密度的信息。例如，在对数期中，随着生长的持续，细胞达到其最大细胞分裂速率，细胞数量与时间呈对数关系增加。通过在特定时间进行一次计数，在对数期期间间隔之后第二次计数，并知道实耗时间单位的数量，可计算细胞分裂或倍增的总数、生长速率和世代时间。
群体倍增时间测量可用于监测连续传代期间的培养物，并且计算传代培养所需的细胞产率和稀释因子。群体倍增时间是平均数字，并且描述了培养物内大范围细胞分裂速率的净结果。倍增时间随不同的细胞类型、培养瓶和条件而不同。预定生长曲线可用于确定共培养物所用的每个细胞系的群体倍增时间。优选地，共培养的细胞系指数级生长的群体倍增时间在彼此的2或5倍内。例如，共培养所选的细胞系指数级生长中的群体倍增时间在彼此的2、3、4或5倍内。如果生长速率有更多的不同，则优选地改变培养基，以鉴定其中群体倍增时间更相似，优选地在彼此的2或5倍内的培养基。例如，培养基提供的组分和条件可调整，并且用于减少细胞系指数级生长中的群体倍增时间差异，以使得每个细胞系的群体倍增时间在彼此的2或5倍内。另外，细胞系可以首先根据其使用常规培养基的生长曲线的小差异选择，然后调整培养基/条件，以使得生长曲线差异变得更小。
第一细胞系与第二细胞系编码的各组酶的最佳比率不必事先已知。细胞系以体积、OD或细胞数量计的不同比率的组合允许凭经验小规模比较不同的比率，此类分析确定的最佳比率用于后续大规模培养。
为确保单个细胞系不会无法接受地胜过一个或多个其他细胞系，如生长更迅速并且抑制其他细胞系的生长，细胞系可处于使得每个细胞系在大约相同的时间达到生长曲线中的预定点的比率。例如，可调整比率以使得每个细胞系在大约相同的时间达到对数中期。或者，每个细胞系在大约相同的时间达到平台期(平台中期)。优选地，每个细胞系在大约相同的时间达到对数中期和平台期二者。任选地，每个细胞系在大约相同的时间达到稳定期。
生长曲线也可用于确定实现收获细胞系之间的细胞密度的某些比率所需的收获时间和/或接种密度。例如，一种类型的底物/预处理方法可能希望不同组酶的等摩尔比。其他类型底物/预处理方法所需的酶的不同比率可通过改变一个或多个细胞系的接种密度以及收获时间实现。
每个细胞系可具有在培养基中进行最佳生长的不同要求，尤其是来自不同生物体(如，不同域、界、属或种)或不同菌株的细胞系。然而，培养基虽然不是最适于任何单个细胞系，但如果所有细胞系在此类培养基中具有类似的生长曲线，则可以最适于所有细胞系的共发酵。因此，可确定每个细胞系在多个培养基中的生长曲线。然后比较这些生长曲线，以鉴定其中细胞系的生长曲线最相似的培养基。例如，在此类培养基中每个细胞系在大约相同的时间到达平台期(平台中期)、对数中期和/或稳定期。然后所选的培养基用于共培养。
作为基于细胞密度的生长曲线的替代形式或与其组合，酶量和/或所表达酶的活性可沿着生长曲线测量。这些伴随生长曲线的变化提供了用于确定混合细胞系以优化酶的共表达的比率的指导。例如，一些酶的表达水平可低于其他酶。对于这些酶，表达酶的细胞系的高接种密度对于实现所需量的这些低表达酶是优选的。
来自相同菌株的细胞系通常具有类似的生长曲线并且需要类似的培养基。另一方面，来自不同菌株或不同生物体的细胞系通常具有不同的生长曲线并且需要不同的培养基。如上所讨论，可测定不同细胞系的生长曲线，以确定每个细胞系的接种密度。任选地，测定各种培养基中每个细胞系的生长曲线，以确定适于共培养的培养基。
酶可直接释放至培养基。或者细胞可裂解释放细胞内的酶。另外，给定细胞系表达的一些酶可直接释放，而其他酶可通过细胞裂解释放。所释放的酶，无论是分泌还是裂解的结果，均可从培养基收获，或培养基可按原样使用，尽可能少地(如果有的话)以全发酵液形式进一步加工。如果需要，细胞碎片(如，宿主细胞、裂解片段)可任选地通过例如离心或超滤移除。任选地，可以例如使用商购获得的蛋白质浓缩过滤器浓缩酶混合物。酶混合物可通过一种或多种纯化步骤与其他杂质进一步分离，如免疫亲和色谱、离子交换柱分馏(如，在二乙基氨基乙基(DEAE)或包含羧甲基或磺丙基的基质上)、在蓝-琼脂糖(Blue-Sepharose)、CM蓝-琼脂糖(CMBlue-Sepharose)、MONO-Q、MONO-S、小扁豆凝集素-琼脂糖(lentil lectin-Sepharose)、麦胚凝集素-琼脂糖(WGA-Sepharose)、伴刀豆凝集素-琼脂糖(Con A-Sepharose)、醚Toyopearl(Ether Toyopearl)、丁基Toyopearl(ButylToyopearl)、苯基Toyopearl(Phenyl Toyopearl)或蛋白A琼脂糖(protein ASepharose)上的色谱、SDS-PAGE色谱、二氧化硅色谱、层析聚焦、反相HPLC(RP-HPLC)、使用如Sephadex分子筛或尺寸排阻色谱的凝胶过滤、在选择性结合肽的柱上的色谱，以及乙醇、pH或硫酸铵沉淀、膜过滤和各种技术。在一些方法中，酶混合物用于下游应用中，只有极少的(如果有的话)进一步加工。
从细胞分泌或裂解或最终产物中的酶量可使用常规技术测量，如反相高效液相色谱(RP-HPLC)或十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)。酶的活性也可使用本领域熟知的方法测量。
VI.细胞建库
表达不同组酶的细胞系可存储在细胞库中，并且以不同的组合共培养。细胞库可使用想到的特定转化过程或特定的一组转化构建。增强转化过程的酶从已知或公布的来源、从实验或从二者鉴定。然后鉴定或构建编码并适于表达不同组的酶的细胞系。内源性或外源性表达一个或多个酶的细胞系可以是已知的。也可构建外源性表达一个或多个酶的细胞系，尤其是在如果以足够水平表达特定酶或特定酶的组合或组的细胞系不可用的情况下。
库中的细胞系可以在冷或冰冻条件下保存在固体或液体培养基中。在使用之前，通常单独繁殖一小瓶细胞，形成初始培养物，其也可在液体或固体培养基中进行。可繁殖细胞系并在不同选择压力下保存，以保持各组酶的表达，并且避免交叉污染的可能性。或者，可繁殖细胞系并且在允许营养缺陷型生长的条件下保存，从而保持基因型。
可共培养细胞系并将其用于使用上述方法制备酶混合物。在组合之后，在使用组合细胞系的培养基上繁殖细胞系，这样可用于单独繁殖和保存细胞系的所选择条件或允许营养缺陷型生长的条件不一定用于共培养步骤。
细胞库可允许选择不同的细胞系排列，以不同的组合或相对表达水平提供增强转化过程的酶。可比较不同的组合以确定哪一个给定酶混合物具有增强转化过程的最佳活性。此类比较可指出细胞库内细胞系的最佳组合，而无需事先确切知道哪个酶或酶的哪种比率是最佳的。在这个意义上，这允许根据特定转化过程的特定要求定制来自共培养物的所表达酶组。
可通过改变来自细胞库的细胞系初始培养物组合的比率来调整不同过程的底物或底物预处理的变化。例如，在纤维素制剂中半纤维素的量可变化。用于处理大量半纤维素的酶合剂可包含更高水平的木聚糖酶活性。一些淀粉制剂可包含已知抑制淀粉酶活性的物质(如，原材料或代谢物)，在该情况下需要更高的淀粉酶含量。取决于预处理底物中的组合物(如，不同的葡聚糖/木聚糖曲线)，不同的酶合剂可通过以不同的比率混合酶生产菌株的初始培养物来制备，从而生成具有不同的相对酶量的酶合剂。
即使不考虑转化过程细胞建库也是有用的。通过建立编码多个常用工业用酶的不同细胞系库，细胞系可根据即将进行的转化过程，从共培养物库以不同的组合进行组合。因此本文提供的共发酵方法不仅提供所得组合物的灵活性，还提供各种其他优点，例如与每个所需酶组分单独进行发酵然后共混相比降低了成本；降低保存酶的成本，因为共发酵生成所需比率的酶的组合物，而共混策略需要保存单独发酵或制备的每个酶。
VII.应用
本发明方法生成的酶混合物具有利用此类转化过程的农业、工业、医药和营养的多种应用。此类转化过程的底物可以是，例如木质纤维素材料、纤维素、半纤维素、淀粉。
例如，纤维素酶和/或纤维素酶辅助酶的混合物可用于纤维素材料的水解，如将生物质发酵为生物燃料。混合物还用于从谷物生成葡萄糖，或作为动物饲料的补充剂，通过增加饲料的消化率而减少粪便的生成。纤维素酶也可用于通过将木质纤维素生物质转化为可发酵糖，而提高醇发酵(如，在啤酒酿造中)的效率。纤维素酶混合物可用于咖啡中的商业化食品加工，即豆干燥期间的纤维素水解。它们还用于纸浆造纸工业的多个目的。在制药应用中，纤维素酶用于植物胃石(存在于人胃中的纤维素胃石一种)的处理。
纤维素酶、纤维素酶辅助酶和/或半纤维素酶的混合物广泛用于纺织工业和衣物洗涤剂。纤维素酶也可用于将纤维素或木质纤维素材料水解为可发酵糖。
淀粉酶的混合物或α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡糖淀粉酶和/或支链淀粉酶的混合物在食品行业中具有多种应用。例如，淀粉酶的混合物用于糖浆制造、右旋糖制造、烘焙、发酵麦芽浆的糖化、食品糊精和糖产物制造、干式早餐食物制造、巧克力糖浆制造以及从果汁移除淀粉。淀粉酶也可用于从谷物产物生成葡萄糖，用于乙醇生产。
含植酸酶的酶混合物可用于谷物湿磨和清洁产物。它们也有多个其他用途，用于个人护理产品、医药产品和食品和营养产品，以及各种工业应用，特别是清洁、纺织物、平版印刷和化学领域。
实例
实例1：两个里氏木霉菌株共发酵生成β-木糖苷酶和β-葡萄糖苷酶的混合物。
通过SDS-PAGE分析蛋白质表达：
使用Novex4-12％Bis-Tris凝胶和MOPS(英杰公司(Invitrogen))缓冲液结合Plus2分子量标记进行SDS-PAGE分析。样品与培养物上清液等体积加入。
通过HPLC分析蛋白质表达：
进行液相色谱(LC)和质谱(MS)以分离并定量发酵液中包含的酶。在一些情况下，酶样品在HPLC分析之前用来自褶皱链霉菌(S.plicatus)的重组表达的endoH糖苷酶(如，NEB P0702L)处理。EndoH以0.01-0.03μgendoH/μg样品中总蛋白的量使用。在HPLC分析之前，将所述混合物在37℃，pH4.5-6.0温育3小时以酶促移除N-连接糖基化。随后使用HIC-苯基柱和35分钟范围内由高至低的盐梯度，将约50μg的蛋白进行疏水相互作用色谱(Agilent1100HPLC)。使用高盐缓冲液A：4M硫酸铵，其包含20mM磷酸钾，pH6.75；以及低盐缓冲液B：20mM磷酸钾，pH6.75实现所述梯度。在UV222nm检测峰。收集级分并使用质谱分析以鉴定每个峰的蛋白质。蛋白质比例以每个峰面积相对于样品的总积分面积的百分比来报告。
Fv3C的克隆和表达：
Fv3C序列(SEQ ID NO:1和2)得自博德研究所(Broad Institute)数据库(http://www.broadinstitute.org/)中的轮枝镰刀菌(Fusarium verticillioides)基因组。Fv3C开放阅读框使用来自轮枝镰刀菌的纯化基因组DNA作为模板进行PCR扩增。所用的PCR热循环仪是DNA Engine Tetrad2Peltier热循环仪(伯乐实验室(Bio-Rad Laboratories))。所用的DNA聚合酶是PfuUltraII Fusion HS DNA聚合酶(Stratagene)。用于扩增开放阅读框的引物如下：
正向引物MH234(5’-CACCATGAAGCTGAATTGGGTCGC-3’)(SEQID NO:15)
反向引物MH235(5’-TTACTCCAACTTGGCGCTG-3’)(SEQ ID NO:16)
正向引物在5'末端包括四个额外的核苷酸(序列–CACC)以辅助定向克隆至pENTR/D-TOPO(加利福尼亚州卡尔斯巴德市的英杰公司(Invitrogen,Carlsbad,CA))中。用于扩增该开放阅读框的PCR条件如下：步骤1：在94℃下2分钟。步骤2：在94℃下30秒。步骤3：在57℃下30秒。步骤4：在72℃下60秒。对步骤2、3和4另外重复29个循环。步骤5：在72℃下2分钟。使用Qiaquick PCR纯化试剂盒(凯杰公司(Qiagen))纯化Fv3C开放阅读框的PCR产物。将纯化的PCR产物首先克隆至pENTR/D-TOPO载体中，转化至TOP10化学感受态大肠杆菌细胞(英杰公司(invitrogen))中并且涂布在包含50ppm卡那霉素的LA平板上。使用QIAspin质粒制备试剂盒(凯杰公司(Qiagen))从大肠杆菌转化体中获得质粒DNA。使用M13正向和反向引物以及如下额外的测序引物，证实pENTR/D-TOPO载体中插入的DNA的序列：
MH255(5’-AAGCCAAGAGCTTTGTGTCC-3’)(SEQ ID NO:17)
MH256(5’-TATGCACGAGCTCTACGCCT-3’)(SEQ ID NO:18)
MH257(5’-ATGGTACCCTGGCTATGGCT-3’)(SEQ ID NO:19)
MH258(5’-CGGTCACGGTCTATCTTGGT-3’)(SEQ ID NO:20)
具有Fv3C开放阅读框的DNA序列的pENTR/D-TOPO载体在图1中示出。
嵌合β-葡萄糖苷酶：部分野生型轮枝镰刀菌Fv3C(SEQ ID NO:1和2)的C-端基因序列被里氏木霉β-葡萄糖苷酶Bgl3(或Tr3B)(SEQ IDNO:7和8)的C-端序列替换。具体地，代表Fv3C的第1-691位残基的连续片段与代表Bgl3(SEQ ID NO:9和10)的第668-874位残基的连续片段融合。该嵌合/融合分子使用融合PCR构建。使用基因组Fv3C(图1)和Bgl3编码序列的pENTR的克隆作为PCR模板。两种入门克隆均构建于pDONRTM221载体中(英杰公司(invitrogen))。融合产物以两个步骤装配。首先，在PCR反应中扩增Fv3C嵌合部分，所述PCR反应使用pENTR_Fv3C DNA作为模板和以下寡核苷酸引物：
pDonor正向：5’-GCTAGCATGGATGTTTTCCCAGTCACGACGTTGTAAAACGACGGC-3’(SEQ ID NO:21)
Fv3C/Bgl3反向：5’-GGAGGTTGGAGAACTTGAACGTCGACCAAGATAGACCGTGACCGAAC TCGTAG3’(SEQ ID NO:22)
使用以下寡核苷酸引物，从pENTR_Bgl3载体扩增Bgl3嵌合部分：
pDonor反向：5’-TGCCAGGAAACAGCTATGACCATGTAATACGACTCACTATAGG-3’(SEQ ID NO:23)
Fv3C/Bgl3正向：5’-CTACGAGTTCGGTCACGGTCTATCTTGGTCGACGTTCAAGTTCTCCAACCTCC-3’(SEQ ID NO:24)
在第二步骤中，将等摩尔量的所述PCR产物(分别为约1μL和0.2μL的初始PCR反应物)作为模板添加，以便用于随后的融合PCR反应，所述融合PCR反应使用如下的一组套叠引物：
Att L1正向：5’TAAGCTCGGGCCCCAAATAATGATTTTATTTTGACTGATAGT 3’ (SEQID NO:25)
AttL2反向：5’GGGATATCAGCTGGATGGCAAATAATGATTTTATTTTGACTGATA 3’(SEQ ID NO:26)
所述PCR反应使用高保真的Phusion DNA聚合酶进行(芬兰生化酶公司(Finnzymes OY))。所得的融合PCR产物在末端包含完整的Gateway特异性attL1、attL2重组位点，允许其通过Gateway LR重组反应(英杰公司(invitrogen))直接克隆至最终目的载体中。
在0.8％的琼脂糖凝胶上分离DNA片段之后，使用提取PCR纯化试剂盒(Extract PCR clean-up kit)(Macherey-NagelGmbH & Co. KG)纯化该片段，并且使用pTTT-pyrG13目的载体和LRclonaseTMII酶混合物(英杰公司(invitrogen))将100ng的各种片段重组。将所得的重组产物转化至大肠杆菌Max Efficiency DH5α(英杰公司(invitrogen))中，并且在2xYT琼脂平板上选择包含表达构建体pTTT-pyrG13-Fv3C/Bgl3融合体(图2)的克隆，所述融合体包含嵌合β-葡萄糖苷酶，所述平板使用16g/L Bacto蛋白胨(迪飞科(Difco))、10g/L Bacto酵母提取物(迪飞科(Difco))、5g/L NaCl、16g/L Bacto琼脂(迪飞科(Difco))和100μg/mL氨苄青霉素制备。在包含100μg/mL氨苄青霉素的2xYT培养基上培育细菌。此后将质粒分离并且使用BglI或EcoRV进行限制酶切消化。使用ABI3100序列分析仪(应用生物系统公司(AppliedBiosystems))对所得的Fv3C/Bgl3区测序来证实。
构建另外的嵌合β-葡萄糖苷酶，其包含衍生自Fv3C(SEQ ID NO: 1和2)的N-端序列、衍生自埃默森篮状菌(Talaromyces emersonii) Te3Aβ-葡萄糖苷酶序列(SEQ ID NO:5和6)的环区以及衍生自里氏木霉Bgl3(Tr3B)(SEQ ID NO:7和8)的C-端部分序列。这是通过替换Fv3C/Bgl3嵌合体的环区而实现的。具体地，Fv3C/Bgl3嵌合体的Fv3C第665-683位残基(具有RRSPSTDGKSSPNN TAAPL(SEQ ID NO:27)的序列)由Te3A第634-640位残基(KYNITPI(SEQ ID NO:28))替换。使用融合PCR方法构建该杂合分子。
将两个N糖基化位点(即，S725N和S751N)引入Fv3C/Bgl3主链。使用如上所述的融合PCR扩增技术将这些糖基化突变引入Fv3C/Bgl3主链中，利用pTTT-pyrG13-Fv3C/Bgl3融合质粒(图2)作为模板以生成初始PCR片段。将以下引物对用于独立的PCR反应：
Pr CbhI正向：5’CGGAATGAGCTAGTAGGCAAAGTCAGC3’(SEQID NO:29)和
725/751反向：5’-CTCCTTGATGCGGCGAACGTTCTTGGGGAAGCCATAGTCCTTAAGGTTCTTGCTGAAGTTGCCCAGAGAG3’(SEQ ID NO:30)
725/751正向：5’-GGCTTCCCCAAGAACGTTCGCCGCATCAAGGAGTTTATCTACCCCTACCTGAACACCACTACCTC3’(SEQ ID NO:31)和
Ter CbhI反向：5’GATACACGAAGAGCGGCGATTCTACGG3’(SEQID NO:32)。
接下来，使用Pr CbhI正向和Ter CbhI引物融合PCR片段。所得的融合产物包括两个所需的糖基化位点，还包含完整的attB1和attB2位点，这允许使用Gateway BP重组反应(英杰公司(invitrogen))与pDONR221载体重组。这产生pENTR-Fv3C/Bgl3/S725N S751N克隆，所述克隆随后作为主链用于构建三元杂合分子Fv3C/Te3A/Bgl3。
为了用来自Te3A(SEQ ID NO:5和6)的环序列替换Fv3C/Bgl3杂合体第665-683位残基的环，使用以下引物组进行初始PCR反应：
组1：pDonor正向：5’-GCTAGCATGGATGTTTTCCCAGTCACGACGTTGTAAA ACGACGGC3’(SEQ ID NO:21)和
Te3A反向：5’-GATAGACCGTGACCGAACTCGTAGATAGGCGTGATGTTGTACTTGTCGAAGTGACGGTAGTCGATGAAGAC3’(SEQ ID NO:33)；
组2：Te3A2正向：5’-GTCTTCATCGACTACCGTCACTTCGACAAGTACAACATCACGCCTATCTACGAGTTCGGTCACGGTCTATC-3’(SEQ ID NO:34)；以及
pDonor反向：5’TGCCAGGAAACAGCTATGACCATGTAATACGACTCACTATAGG3’(SEQ ID NO:23)
随后使用以下引物，将初级PCR反应中获得的片段融合：
Att L1正向：5’TAAGCTCGGGCCCCAAATAATGATTTTATTTTGACTGATAGT3’(SEQID NO:25)和
AttL2反向：5’GGGATATCAGCTGGATGGCAAATAATGATTTTATTTTGACTGATA3’(SEQ ID NO:26)。
所得的PCR产物在末端包含完整的Gateway特异性attL1、attL2重组位点，这允许使用Gateway LR重组反应(英杰公司(invitrogen))直接克隆至最终目的载体中。
Fv3C/Te3A/Bgl3编码基因的DNA序列在SEQ ID NO:11中列出。Fv3C/Te3A/Bgl3杂合体的氨基酸序列在SEQ ID NO:12中列出。将编码Fv3C/Te3A/Bgl3嵌合体的基因序列克隆于pTTT-pyrG13载体中并在里氏木霉受体菌株中表达，如下文所述。
具体地，使用具有如下所述的轻微修改形式的PEG-原生质体方法将0.5-1μg的该片段转化到里氏木霉六重缺失菌株mad6(cel7B、cel5A、cel6A、cel7A、cel3A、cel12A基因缺失，WO 2010/141779)。对于原生质体制备，将孢子于24℃在木霉基本培养基MM中以150rpm振荡培育16-24小时，该培养基包含20g/L葡萄糖、15g/L KH2PO4(pH4.5)、5g/L(NH4)2SO4、0.6g/L MgSO4×7H2O、0.6g/L CaCl2×2H2O、1mL的1000X里氏木霉微量元素溶液(其包含5g/L FeSO4×7H2O、1.4g/L ZnSO4×7H2O、1.6g/L MnSO4×H2O、3.7g/L CoCl2×6H2O)。通过离心收集正在萌发的孢子并且使用50mg/mL的Glucanex G200(诺维信公司(Novozymes AG))溶液处理以裂解真菌细胞壁。对原生质体的进一步制备根据et al.Gene61(1987)155-164(等人，《基因》，第61卷，1987年，第155-164页)描述的方法进行。用2mL的25％PEG溶液处理各个在200μL总体积中包含约1μg DNA和1-5×107原生质体的转化混合物，用2体积的1.2M山梨醇/10mM Tris(pH7.5)，10mM CaCl2稀释，与包含5mM尿苷和20mM乙酰胺的3％选择性顶层琼脂糖MM混合。将所得的混合物倾倒于包含尿苷和乙酰胺的2％选择性琼脂糖平板上。在重新选取单一转化体到包含尿苷和乙酰胺的新鲜MM平板上之前，将平板在28℃进一步温育7-10天。使用来自独立克隆的孢子在96孔微量滴定平板或摇瓶中接种发酵培养基。
β-葡萄糖苷酶表达载体的构建：
将天然里氏木霉β-葡萄糖苷酶基因bgl1的N端部分进行密码子优化(DNA2.0，加利福尼亚州门洛帕克市(Menlo Park,CA))。这种合成的部分包含该酶编码区的最初447个碱基。随后通过PCR使用引物SK943和SK941扩增这种片段。从提取自里氏木霉菌株RL-P37的基因组DNA样品PCR扩增天然bgl1基因的剩余区域(Sheir-Neiss,G et al.Appl.Microbiol.Biotechnol.1984,20:46-53(Sheir-Neiss,G等人，《应用微生物学和生物技术》，1984年，第20卷，第46-53页))，其使用引物SK940和SK942。bgl1基因的这两个PCR片段在融合PCR反应中融合在一起，其使用引物SK943和SK942：
正向引物SK943：(5’–CACCATGAGATATAGAACAGCTGCCGCT-3’)(SEQ ID NO:35)
反向引物SK941：(5’-CGACCGCCCTGCGGAGTCTTGCCCAGTGGTCCCGCGACAG-3’)(SEQ IDNO:36)
正向引物(SK940)：(5’–CTGTCGCGGGACCACTGGGCAAGACTCCGCAGGGCGGTCG-3’)(SEQID NO:37)
反向引物(SK942)：(5’–CCTACGCTACCGACAGAGTG-3’)(SEQ IDNO:38)
将所得的融合PCR片段克隆至入门载体 并且转化至大肠杆菌OneTOP10(E.coli OneTOP10)化学感受态细胞(英杰公司(Invitrogen))，这产生中间载体pENTR TOPO-Bgl1(943/942)(图3)。测定插入DNA的核苷酸序列。将具有正确的bgl1序列的pENTR-943/942载体与pTrex3g使用LR反应加以重组(参见英杰公司(Invitrogen)描述的方案)。将LR clonase反应混合物转化进大肠杆菌OneTOP10(E.coli OneTOP10)化学感受态细胞(英杰公司(Invitrogen))，形成表达载体pTrex3g943/942。该载体还包含构巢曲霉amdS基因，其编码乙酰胺酶作为里氏木霉转化的可选标记。表达盒通过PCR用引物SK745和SK771(见下文)扩增得到用于六重缺失里氏木霉菌株mad6转化的产物。
正向引物SK771：(5’–GTCTAGACTGGAAACGCAAC-3’)(SEQ IDNO:39)
反向引物SK745：(5’–GAGTTGTGAAGTCGGTAATCC-3’)(SEQ IDNO:40)
β-木糖苷酶Fv43D表达盒的构建：
对于β-木糖苷酶Fv43D(SEQ ID NO:13)表达盒的构建，使用引物SK1322和SK1297(见下文)从轮枝镰刀菌基因组DNA样品扩增fv43D基因产物(SEQ ID NO:14)。内切葡聚糖酶基因egl1的启动子区域使用引物SK1236和SK1321(见下文)从提取自菌株RL-P37的里氏木霉基因组DNA样品进行PCR扩增。将这些PCR扩增的DNA片段随后在融合PCR反应中使用引物SK1236和SK1297(见下文)进行融合。将所得的融合PCR片段克隆至pCR-平端II-TOPO载体(英杰公司(Invitrogen))中，以产生质粒TOPO平端/Pegl1-Fv43D(参见，图4)。随后使用这种质粒转化大肠杆菌OneTOP10(E.coli OneTOP10)化学感受态细胞(英杰公司(invitrogen))。从多个大肠杆菌克隆中提取质粒DNA并通过限制酶切消化证实其序列。该表达盒使用引物SK1236和SK1297从TOPO平端/Pegl1-Fv43D通过PCR进行扩增以产生用于转化的产物。
正向引物SK1322：(5’–CACCATGCAGCTCAAGTTTCTGTC-3’)(SEQID NO:41)
反向引物SK1297：(5’–GGTTACTAGTCAACTGCCCGTTCTGTAGCGAG-3’)(SEQ ID NO:42)
正向引物SK1236：(5’–CATGCGATCGCGACGTTTTGGTCAGGTCG-3’)(SEQ ID NO:43)
反向引物SK1321：(5’-GACAGAAACTTGAGCTGCATGGTGTGGGACAACAAGAAGG-3’)(SEQID NO:44)
混合菌株发酵生成β-木糖苷酶和β-葡萄糖苷酶蛋白质产物：
将两个表达fv43D或fv3C/te3A/bgl3的六重缺失里氏木霉菌株的每个接种至包含30mL YEG液体培养基(5g/L酵母提取物，20g/L葡萄糖)的250mL四挡板玻璃烧瓶中。在2天28℃振荡生长后，将培养物一式两份转移到蛋白质生产培养基。生产培养基为36mL包含葡萄糖/槐糖和2g/L尿苷的限定液体培养基，例如甘氨酸基本培养基(6.0g/L甘氨酸；4.7g/L(NH4)2SO4；5.0g/L KH2PO4；1.0g/L MgSO4·7H2O；33.0g/L PIPPS；pH5.5)并灭菌后添加作为碳源的约2％葡萄糖/槐糖混合物、10ml/L的100g/LCaCl2、2.5ml/L里氏木霉微量元素(400X)：在250ml Thomson Ultra培养瓶中：175g/L无水柠檬酸；200g/L FeSO4·7H2O；16g/L ZnSO4·7H2O；3.2g/LCuSO4·5H2O；1.4g/L MnSO4·H2O；0.8g/L H3BO3。转移体积如下：
对照，(Fv3C/Te3A/Bgl3)＝4mL；Fv43D＝4mL
测试培养瓶，Fv43D/(Fv3C/Te3A/Bgl3)＝2mL/4mL
所有培养瓶在30℃、160rpm下温育四天。在四天温育后，通过离心旋出细胞，上清液保存在4℃下待分析。
摇瓶上清液中的蛋白质表达通过SDS-PAGE(图5)和HPLC(图6)分析。
表1.单培养物中或共培养发酵液中每个蛋白质的量(以HPLC总积分 面积的百分比表示)。
混合菌株发酵生成里氏木霉蛋白质产物，β-葡萄糖苷酶含量增加：
将衍生自RL-P37(Sheir-Neiss,G.et al.Appl.Microbiol.Biotechnol.1984,20:46-53(Sheir-Neiss,G.等人，《应用微生物学和生物技术》，1984年，第20卷，第46-53页))并选择用于高纤维素酶产量的里氏木霉突变株(RL-P37-d)接种至一个包含30mL YEG液体培养基(5g/L酵母提取物，20g/L葡萄糖)的250mL四挡板玻璃烧瓶中。将表达里氏木霉bgl1(tr3A)(菌株构建如上所述，根据β-葡萄糖苷酶表达载体的构建进行)的六重缺失里氏木霉菌株接种至包含30mL YEG液体培养基的单独的250mL四挡板玻璃烧瓶中。在2天28℃振荡生长后，将培养物转移到蛋白质生产培养基。
生产培养基为36mL包含葡萄糖/槐糖和尿苷的限定液体培养基，例如甘氨酸基本培养基(6.0g/L甘氨酸；4.7g/L(NH4)2SO4；5.0g/L KH2PO4；1.0g/L MgSO4·7H2O；33.0g/L PIPPS；pH5.5)并灭菌后添加作为碳源的约2％葡萄糖/槐糖混合物、10ml/L的100g/L CaCl2、2.5ml/L里氏木霉微量元素(400X)：在250ml Thomson Ultra培养瓶中：175g/L无水柠檬酸；200g/LFeSO4·7H2O；16g/L ZnSO4·7H2O；3.2g/L CuSO4·5H2O；1.4g/LMnSO4·H2O；0.8g/L H3BO3。转移体积如下：
对照，RL-P37-d＝4mL
测试培养瓶，RL-P37-d/Tr3A＝4mL/2mL
所有培养瓶在30℃、160rpm下温育四天。在四天温育后，通过离心旋出细胞，上清液保存在4℃下待分析。
摇瓶上清液中的蛋白质表达通过SDS-PAGE(图7)和HPLC(图8)分析。
表2.单培养物中或共培养发酵液中每个蛋白质的量(以HPLC总积分 面积的百分比表示)。
实例2：两个芽孢杆菌属菌株共发酵制备淀粉酶变体的混合物。
材料和方法：该实例中所用的两个菌株为生产菌株。淀粉酶变体1(淀粉酶-1)是具有四个置换的地衣芽孢杆菌淀粉酶，其根据US 5,958,739表达。淀粉酶变体2(淀粉酶-2)是具有置换的嗜热脂肪地芽孢杆菌，其根据US 20090314286A1表达。实验在250mL Thomson Ultra摇瓶中进行。种子培养物在包含酵母提取物、磷酸盐、硫酸盐和其他营养组分以及合适的消泡剂的接种培养基中生长。对照和测试培养瓶使用包含乳糖、酵母提取物、磺酸盐和磷酸盐、其他盐和M-1000以及合适的消泡剂的培养基。此类培养基的配方如下：
通过混合菌株发酵生成淀粉酶共混物：启动两个种子培养物。将冷冻小瓶中的淀粉酶-1和淀粉酶-2用于在250ml挡板玻璃烧瓶的35ml种子培养基中启动种子培养物。接种瓶在38℃、160rpm下温育三小时。在三小时后，将种子培养物用于启动每个酶的对照培养瓶和重复测试培养瓶。这些培养瓶中的每个具有27ml培养基。对照培养瓶从其相应的种子培养物接种3.0ml。测试培养瓶从每个种子培养物接种1.5ml。然后所有培养瓶在40℃和160rpm下温育48小时。在48小时温育结束时，测定pH以确定发酵是否达到终点。所有培养瓶在pH7-8之间，表示达到终点。对照和测试培养物上清液的SDS-PAGE凝胶分析显示酶在所有培养瓶中表达。重复测试培养物通过HPLC分析确认其包含淀粉酶-1和淀粉酶-2二者的共混物。HPLC确实发现酶共表达。
实例3：两个芽孢杆菌属菌株共发酵生成活性比为1:3的淀粉酶变体混合物
14L淀粉酶-1/淀粉酶-2实验：将两个相同的酶用于上述培养瓶实验，运行14L发酵以测试某些比率的两个酶是否可以以良好控制的方式通过共发酵制备。已确定生成淀粉酶-1：淀粉酶-2活性比为1:3的产物。
根据14L规模下两个酶的生成速率，给接种瓶(含30mL种子培养基的250mL挡板玻璃烧瓶，该培养基包含酵母提取物、磷酸盐、硫酸盐和其他营养组分以及合适的消泡剂)接种0.2mL淀粉酶-1和0.8mL淀粉酶-2。接种瓶在37℃、160rpm下温育3小时。在三小时结束时，将培养瓶的整个内容物转移到在含生产培养基的条件下运行的14L种子发酵罐中。
当种子罐的氧吸收率(OUR)达到60mM/Kg/Hr时，将0.6Kg用于接种生产发酵罐，其在典型分批补料条件下运行，用于在100小时发酵期间生产淀粉酶。
测定生产发酵期间采集的时间进程样品的淀粉酶活性。生长和酶生产曲线是那些典型的14L规模淀粉酶发酵曲线。通过HPLC分析最终100小时时间点的样品，以确定两个酶的比率。根据峰面积，蛋白质比率为1:2.9的淀粉酶-1：淀粉酶-2。该HPLC方法显示出来自蛋白质主链的酶的双峰，所述酶用于构建淀粉酶-2生产菌株。组合两个峰的面积以确定总淀粉酶-2面积。
实例4：混合菌株发酵生成葡糖淀粉酶和两个β-葡萄糖苷酶蛋白质产物
将表达fv3C/te3A/bgl3的第一六重缺失里氏木霉菌株、表达里氏木霉β-葡萄糖苷酶1(bgl1)的第二六重缺失里氏木霉菌株以及表达葡糖淀粉酶的四重缺失里氏木霉菌株(WO 2005/001036)各自接种至包含30mL YEG液体培养基(5g/L酵母提取物，20g/L葡萄糖)和2g/L尿苷的250mL四挡板玻璃烧瓶中。接种物从生长于含尿苷的PDA(马铃薯葡萄糖琼脂)上形成孢子的培养物采集。在2天28℃振荡生长后，将培养物一式两份转移到蛋白质生产培养基。每个生产培养基为36mL包含葡萄糖/槐糖和2g/L尿苷的限定液体培养基，例如甘氨酸基本培养基(6.0g/L甘氨酸；4.7g/L(NH4)2SO4；5.0g/L KH2PO4；1.0g/L MgSO4·7H2O；33.0g/L PIPPS；pH5.5)并灭菌后添加作为碳源的约2％葡萄糖/槐糖混合物、10ml/L的100g/L CaCl2、2.5ml/L里氏木霉微量元素(400X)：175g/L无水柠檬酸；200g/L FeSO4·7H2O；16g/LZnSO4·7H2O；3.2g/L CuSO4·5H2O；1.4g/L MnSO4·H2O；0.8g/L H3BO3，置于250mL四挡板玻璃摇瓶中。转移体积如下：
对照，(Fv3C/Te3A/Bgl3)＝3mL；Tr3A＝3mL；葡糖淀粉酶＝3mL
测试培养瓶，(Fv3C/Te3A/Bgl3)、Tr3A、葡糖淀粉酶各1mL。
所有培养瓶在28℃、200rpm(英诺华(Innova)4900)下温育四天。在四天温育后，通过离心移除细胞，上清液保存在4℃下待分析。
摇瓶上清液中的蛋白质表达通过SDS-PAGE和HPLC(图11)分析。
表3.单培养物中或共培养发酵液中每个蛋白质的量(以HPLC总积分 面积的百分比表示)。
实例5：通过直接接种进行的混合菌株发酵生成β-葡萄糖苷酶含量增加的里氏木霉蛋白质产物
将衍生自RL-P37(Sheir-Neiss,G.et al.Appl.Microbiol.Biotechnol.1984,20:46-53(Sheir-Neiss,G.等人，《应用微生物学和生物技术》，1984年，第20卷，第46-53页))并选择用于高纤维素酶产量的里氏木霉突变株(RL-P37-d)用表达fv3C/te3A/bgl3的六重缺失菌株温育。每个菌株接种至单个250mL四挡板玻璃培养瓶中，其包含30ml含葡萄糖/槐糖和尿苷的生产培养基，例如甘氨酸基本培养基(6.0g/L甘氨酸；4.7g/L(NH4)2SO4；5.0g/L KH2PO4；1.0g/L MgSO4·7H2O；33.0g/L PIPPS；pH5.5)并灭菌后添加作为碳源的约2％葡萄糖/槐糖混合物、10ml/L的100g/L CaCl2、2.5ml/L里氏木霉微量元素(400X)：175g/L无水柠檬酸；200g/L FeSO4·7H2O；16g/LZnSO4·7H2O；3.2g/L CuSO4·5H2O；1.4g/L MnSO4·H2O；0.8g/L H3BO3，来自成熟、形成孢子的含尿苷PDA平板。在4天28℃振荡生长后，收集培养物。通过离心移除细胞，上清液保存在4℃下待HPLC分析。在混合培养物发酵液中，(Fv3C/Te3A/Bgl3)表示56％的总蛋白，而当Fv3C/Te3A/Bgl3菌株作为单培养物单独生长时，其表示70％的总蛋白。
实例6：通过直接接种进行的混合菌株发酵生成含有两个β-葡萄糖苷酶、葡糖淀粉酶和β-木糖苷酶的里氏木霉蛋白质产物
将表达fv3C/te3A/bgl3的第一六重缺失里氏木霉菌株、表达bgl1(tr3A)的第二六重缺失里氏木霉菌株、表达fv43D的第三六重缺失菌株以及表达里氏木霉葡糖淀粉酶的四重缺失里氏木霉菌株(WO 2005/001036)各自接种至单个250mL四挡板玻璃培养瓶中，其包含30ml含葡萄糖/槐糖和尿苷的生产培养基，例如甘氨酸基本培养基(6.0g/L甘氨酸；4.7g/L(NH4)2SO4；5.0g/L KH2PO4；1.0g/L MgSO4·7H2O；33.0g/L PIPPS；pH5.5)并灭菌后添加作为碳源的约2％葡萄糖/槐糖混合物、10ml/L的100g/L CaCl2、2.5ml/L里氏木霉微量元素(400X)：175g/L无水柠檬酸；200g/L FeSO4·7H2O；16g/LZnSO4·7H2O；3.2g/L CuSO4·5H2O；1.4g/L MnSO4·H2O；0.8g/L H3BO3，来自成熟、形成孢子的含尿苷PDA平板。在4天28℃振荡生长后，收集培养物。通过离心移除细胞，上清液保存在4℃下待HPLC分析。
表4.单培养物中或共培养发酵液中每个蛋白质的量(以HPLC总积分 面积的百分比表示)。*
*单培养物均通过初始培养物的附加步骤培养，而混合培养物(最后一行)从琼脂块直接接种，无需初始培养物步骤。
本文提及的所有专利和出版物，包括在这些专利和出版物中公开的所有序列，出于所有目的全文明确地以引用方式并入。虽然优选的方法和材料已有所描述，但任何与本文所述的那些方法和材料相似或等同的方法和材料均可用于实施或测试本发明。除非语境中另外指明，否则任何实施例、方面、步骤、特征、要素或限制均可与任何其他联合使用。
序列表
SEQ ID NO:1Fv3C(得自轮枝镰刀菌的GH3家族β-葡萄糖苷酶)的核 苷酸序列
ATGAAGCTGAATTGGGTCGCCGCAGCCCTGTCTATAGGTGCTGCTGGCACTGACAGCGCAGTTGCTCTTGCTTCTGCAGTTCCAGACACTTTGGCTGGTGTAAAGGTCAGTTTTTTTTCACCATTTCCTCGTCTAATCTCAGCCTTGTTGCCATATCGCCCTTGTTCGCTCGGACGCCACGCACCAGATCGCGATCATTTCCTCCCTTGCAGCCTTGGTTCCTCTTACGATCTTCCCTCCGCAATTATCAGCGCCCTTAGTCTACACAAAAACCCCCGAGACAGTCTTTCATTGAGTTTGTCGACATCAAGTTGCTTCTCAACTGTGCATTTGCGTGGCTGTCTACTTCTGCCTCTAGACAACCAAATCTGGGCGCAATTGACCGCTCAAACCTTGTTCAAATAACCTTTTTTATTCGAGACGCACATTTATAAATATGCGCCTTTCAATAATACCGACTTTATGCGCGGCGGCTGCTGTGGCGGTTGATCAGAAAGCTGACGCTCAAAAGGTTGTCACGAGAGATACACTCGCATACTCGCCGCCTCATTATCCTTCACCATGGATGGACCCTAATGCTGTTGGCTGGGAGGAAGCTTACGCCAAAGCCAAGAGCTTTGTGTCCCAACTCACTCTCATGGAAAAGGTCAACTTGACCACTGGTGTTGGGTAAGCAGCTCCTTGCAAACAGGGTATCTCAATCCCCTCAGCTAACAACTTCTCAGATGGCAAGGCGAACGCTGTGTAGGAAACGTGGGATCAATTCCTCGTCTCGGTATGCGAGGTCTCTGTCTCCAGGATGGTCCTCTTGGAATTCGTCTGTCCGACTACAACAGCGCTTTTCCCGCTGGCACCACAGCTGGTGCTTCTTGGAGCAAGTCTCTCTGGTATGAGAGAGGTCTCCTGATGGGCACTGAGTTCAAGGAGAAGGGTATCGATATCGCTCTTGGTCCTGCTACTGGACCTCTTGGTCGCACTGCTGCTGGTGGACGAAACTGGGAAGGCTTCACCGTTGATCCTTATATGGCTGGCCACGCCATGGCCGAGGCCGTCAAGGGTATTCAAGACGCAGGTGTCATTGCTTGTGCTAAGCATTACATCGCAAACGAGCAGGGTAAGCCACTTGGACGATTTGAGGAATTGACAGAGAACTGACCCTCTTGTAGAGCACTTCCGACAGAGTGGCGAGGTCCAGTCCCGCAAGTACAACATCTCCGAGTCTCTCTCCTCCAACCTGGATGACAAGACTATGCACGAGCTCTACGCCTGGCCCTTCGCTGACGCCGTCCGCGCCGGCGTCGGTTCCGTCATGTGCTCGTACAACCAGATCAACAACTCGTACGGTTGCCAGAACTCCAAGCTCCTCAACGGTATCCTCAAGGACGAGATGGGCTTCCAGGGTTTCGTCATGAGCGATTGGGCGGCCCAGCATACCGGTGCCGCTTCTGCCGTCGCTGGTCTCGATATGAGCATGCCTGGTGACACTGCCTTCGACAGCGGATACAGCTTCTGGGGCGGAAACTTGACTCTGGCTGTCATCAACGGAACTGTTCCCGCCTGGCGAGTTGATGACATGGCTCTGCGAATCATGTCTGCCTTCTTCAAGGTTGGAAAGACGATAGAGGATCTTCCCGACATCAACTTCTCCTCCTGGACCCGCGACACCTTCGGCTTCGTGCATACATTTGCTCAAGAGAACCGCGAGCAGGTCAACTTTGGAGTCAACGTCCAGCACGACCACAAGAGCCACATCCGTGAGGCCGCTGCCAAGGGAAGCGTCGTGCTCAAGAACACCGGGTCCCTTCCCCTCAAGAACCCAAAGTTCCTCGCTGTCATTGGTGAGGACGCCGGTCCCAACCCTGCTGGACCCAATGGTTGTGGTGACCGTGGTTGCGATAATGGTACCCTGGCTATGGCTTGGGGCTCGGGAACTTCCCAATTCCCTTACTTGATCACCCCCGATCAAGGGCTCTCTAATCGAGCTACTCAAGACGGAACTCGATATGAGAGCATCTTGACCAACAACGAATGGGCTTCAGTACAAGCTCTTGTCAGCCAGCCTAACGTGACCGCTATCGTTTTCGCCAATGCCGACTCTGGTGAGGGATACATTGAAGTCGACGGAAACTTTGGTGATCGCAAGAACCTCACCCTCTGGCAGCAGGGAGACGAGCTCATCAAGAACGTGTCGTCCATATGCCCCAACACCATTGTAGTTCTGCACACCGTCGGCCCTGTCCTACTCGCCGACTACGAGAAGAACCCCAACATCACTGCCATCGTCTGGGCTGGTCTTCCCGGCCAAGAGTCAGGCAATGCCATCGCTGATCTCCTCTACGGCAAGGTCAGCCCTGGCCGATCTCCCTTCACTTGGGGCCGCACCCGCGAGAGCTACGGTACTGAGGTTCTTTATGAGGCGAACAACGGCCGTGGCGCTCCTCAGGATGACTTCTCTGAGGGTGTCTTCATCGACTACCGTCACTTCGACCGACGATCTCCAAGCACCGATGGAAAGAGCTCTCCCAACAACACCGCTGCTCCTCTCTACGAGTTCGGTCACGGTCTATCTTGGTCCACCTTTGAGTACTCTGACCTCAACATCCAGAAGAACGTCGAGAACCCCTACTCTCCTCCCGCTGGCCAGACCATCCCCGCCCCAACCTTTGGCAACTTCAGCAAGAACCTCAACGACTACGTGTTCCCCAAGGGCGTCCGATACATCTACAAGTTCATCTACCCCTTCCTCAACACCTCCTCATCCGCCAGCGAGGCATCCAACGATGGTGGCCAGTTTGGTAAGACTGCCGAAGAGTTCCTCCCTCCCAACGCCCTCAACGGCTCAGCCCAGCCTCGTCTTCCCGCCTCTGGTGCCCCAGGTGGTAACCCTCAATTGTGGGACATCTTGTACACCGTCACAGCCACAATCACCAACACAGGCAACGCCACCTCCGACGAGATTCCCCAGCTGTATGTCAGCCTCGGTGGCGAGAACGAGCCCATCCGTGTTCTCCGCGGTTTCGACCGTATCGAGAACATTGCTCCCGGCCAGAGCGCCATCTTCAACGCTCAATTGACCCGTCGCGATCTGAGTAACTGGGATACAAATGCCCAGAACTGGGTCATCACTGACCATCCCAAGACTGTCTGGGTTGGAAGCAGCTCTCGCAAGCTGCCTCTCAGCGCCAAGTTGGAGTAAGAAAGCCAAACAAGGGTTGTTTTTTGGACTGCAATTTTTTGGGAGGACATAGTAGCCGCGCGCCAGTTACGTC
SEQ ID NO:2Fv3C(得自轮枝镰刀菌的GH3家族β-葡萄糖苷酶)的蛋 白质序列
MKLNWVAAALSIGAAGTDSAVALASAVPDTLAGVKKADAQKVVTRDTLAYSPPHYPSPWMDPNAVGWEEAYAKAKSFVSQLTLMEKVNLTTGVGWQGERCVGNVGSIPRLGMRGLCLQDGPLGIRLSDYNSAFPAGTTAGASWSKSLWYERGLLMGTEFKEKGIDIALGPATGPLGRTAAGGRNWEGFTVDPYMAGHAMAEAVKGIQDAGVIACAKHYIANEQEHFRQSGEVQSRKYNISESLSSNLDDKTMHELYAWPFADAVRAGVGSVMCSYNQINNSYGCQNSKLLNGILKDEMGFQGFVMSDWAAQHTGAASAVAGLDMSMPGDTAFDSGYSFWGGNLTLAVINGTVPAWRVDDMALRIMSAFFKVGKTIEDLPDINFSSWTRDTFGFVHTFAQENREQVNFGVNVQHDHKSHIREAAAKGSVVLKNTGSLPLKNPKFLAVIGEDAGPNPAGPNGCGDRGCDNGTLAMAWGSGTSQFPYLITPDQGLSNRATQDGTRYESILTNNEWASVQALVSQPNVTAIVFANADSGEGYIEVDGNFGDRKNLTLWQQGDELIKNVSSICPNTIVVLHTVGPVLLADYEKNPNITAIVWAGLPGQESGNAIADLLYGKVSPGRSPFTWGRTRESYGTEVLYEANNGRGAPQDDFSEGVFIDYRHFDRRSPSTDGKSSPNNTAAPLYEFGHGLSWSTFEYSDLNIQKNVENPYSPPAGQTIPAPTFGNFSKNLNDYVFPKGVRYIYKFIYPFLNTSSSASEASNDGGQFGKTAEEFLPPNALNGSAQPRLPASGAPGGNPQLWDILYTVTATITNTGNATSDEIPQLYVSLGGENEPIRVLRGFDRIENIAPGQSAIFNAQLTRRDLSNWDTNAQNWVITDHPKTVWVGSSSRKLPLSAKLE
SEQ ID NO:3Bgl1(或Tr3A)(得自里氏木霉的GH3家族β-葡萄糖 苷酶)的核苷酸序列
ATGCGTTACCGAACAGCAGCTGCGCTGGCACTTGCCACTGGGCCCTTTGCTAGGGCAGACAGTCAGTATAGCTGGTCCCATACTGGGATGTGATATGTATCCTGGAGACACCATGCTGACTCTTGAATCAAGGTAGCTCAACATCGGGGGCCTCGGCTGAGGCAGTTGTACCTCCTGCAGGGACTCCATGGGGAACCGCGTACGACAAGGCGAAGGCCGCATTGGCAAAGCTCAATCTCCAAGATAAGGTCGGCATCGTGAGCGGTGTCGGCTGGAACGGCGGTCCTTGCGTTGGAAACACATCTCCGGCCTCCAAGATCAGCTATCCATCGCTATGCCTTCAAGACGGACCCCTCGGTGTTCGATACTCGACAGGCAGCACAGCCTTTACGCCGGGCGTTCAAGCGGCCTCGACGTGGGATGTCAATTTGATCCGCGAACGTGGACAGTTCATCGGTGAGGAGGTGAAGGCCTCGGGGATTCATGTCATACTTGGTCCTGTGGCTGGGCCGCTGGGAAAGACTCCGCAGGGCGGTCGCAACTGGGAGGGCTTCGGTGTCGATCCATATCTCACGGGCATTGCCATGGGTCAAACCATCAACGGCATCCAGTCGGTAGGCGTGCAGGCGACAGCGAAGCACTATATCCTCAACGAGCAGGAGCTCAATCGAGAAACCATTTCGAGCAACCCAGATGACCGAACTCTCCATGAGCTGTATACTTGGCCATTTGCCGACGCGGTTCAGGCCAATGTCGCTTCTGTCATGTGCTCGTACAACAAGGTCAATACCACCTGGGCCTGCGAGGATCAGTACACGCTGCAGACTGTGCTGAAAGACCAGCTGGGGTTCCCAGGCTATGTCATGACGGACTGGAACGCACAGCACACGACTGTCCAAAGCGCGAATTCTGGGCTTGACATGTCAATGCCTGGCACAGACTTCAACGGTAACAATCGGCTCTGGGGTCCAGCTCTCACCAATGCGGTAAATAGCAATCAGGTCCCCACGAGCAGAGTCGACGATATGGTGACTCGTATCCTCGCCGCATGGTACTTGACAGGCCAGGACCAGGCAGGCTATCCGTCGTTCAACATCAGCAGAAATGTTCAAGGAAACCACAAGACCAATGTCAGGGCAATTGCCAGGGACGGCATCGTTCTGCTCAAGAATGACGCCAACATCCTGCCGCTCAAGAAGCCCGCTAGCATTGCCGTCGTTGGATCTGCCGCAATCATTGGTAACCACGCCAGAAACTCGCCCTCGTGCAACGACAAAGGCTGCGACGACGGGGCCTTGGGCATGGGTTGGGGTTCCGGCGCCGTCAACTATCCGTACTTCGTCGCGCCCTACGATGCCATCAATACCAGAGCGTCTTCGCAGGGCACCCAGGTTACCTTGAGCAACACCGACAACACGTCCTCAGGCGCATCTGCAGCAAGAGGAAAGGACGTCGCCATCGTCTTCATCACCGCCGACTCGGGTGAAGGCTACATCACCGTGGAGGGCAACGCGGGCGATCGCAACAACCTGGATCCGTGGCACAACGGCAATGCCCTGGTCCAGGCGGTGGCCGGTGCCAACAGCAACGTCATTGTTGTTGTCCACTCCGTTGGCGCCATCATTCTGGAGCAGATTCTTGCTCTTCCGCAGGTCAAGGCCGTTGTCTGGGCGGGTCTTCCTTCTCAGGAGAGCGGCAATGCGCTCGTCGACGTGCTGTGGGGAGATGTCAGCCCTTCTGGCAAGCTGGTGTACACCATTGCGAAGAGCCCCAATGACTATAACACTCGCATCGTTTCCGGCGGCAGTGACAGCTTCAGCGAGGGACTGTTCATCGACTATAAGCACTTCGACGACGCCAATATCACGCCGCGGTACGAGTTCGGCTATGGACTGTGTAAGTTTGCTAACCTGAACAATCTATTAGACAGGTTGACTGACGGATGACTGTGGAATGATAGCTTACACCAAGTTCAACTACTCACGCCTCTCCGTCTTGTCGACCGCCAAGTCTGGTCCTGCGACTGGGGCCGTTGTGCCGGGAGGCCCGAGTGATCTGTTCCAGAATGTCGCGACAGTCACCGTTGACATCGCAAACTCTGGCCAAGTGACTGGTGCCGAGGTAGCCCAGCTGTACATCACCTACCCATCTTCAGCACCCAGGACCCCTCCGAAGCAGCTGCGAGGCTTTGCCAAGCTGAACCTCACGCCTGGTCAGAGCGGAACAGCAACGTTCAACATCCGACGACGAGATCTCAGCTACTGGGACACGGCTTCGCAGAAATGGGTGGTGCCGTCGGGGTCGTTTGGCATCAGCGTGGGAGCGAGCAGCCGGGATATCAGGCTGACGAGCACTCTGTCGGTAGCGTAG
SEQ ID NO:4里氏木霉β-葡萄糖苷酶1(Bgl1)(得自里氏木霉的GH3 家族β-葡萄糖苷酶)的蛋白质序列
MRYRTAAALALATGPFARADSHSTSGASAEAVVPPAGTPWGTAYDKAKAALAKLNLQDKVGIVSGVGWNGGPCVGNTSPASKISYPSLCLQDGPLGVRYSTGSTAFTPGVQAASTWDVNLIRERGQFIGEEVKASGIHVILGPVAGPLGKTPQGGRNWEGFGVDPYLTGIAMGQTINGIQSVGVQATAKHYILNEQELNRETISSNPDDRTLHELYTWPFADAVQANVASVMCSYNKVNTTWACEDQYTLQTVLKDQLGFPGYVMTDWNAQHTTVQSANSGLDMSMPGTDFNGNNRLWGPALTNAVNSNQVPTSRVDDMVTRILAAWYLTGQDQAGYPSFNISRNVQGNHKTNVRAIARDGIVLLKNDANILPLKKPASIAVVGSAAIIGNHARNSPSCNDKGCDDGALGMGWGSGAVNYPYFVAPYDAINTRASSQGTQVTLSNTDNTSSGASAARGKDVAIVFITADSGEGYITVEGNAGDRNNLDPWHNGNALVQAVAGANSNVIVVVHSVGAIILEQILALPQVKAVVWAGLPSQESGNALVDVLWGDVSPSGKLVYTIAKSPNDYNTRIVSGGSDSFSEGLFIDYKHFDDANITPRYEFGYGLSYTKFNYSRLSVLSTAKSGPATGAVVPGGPSDLFQNVATVTVDIANSGQVTGAEVAQLYITYPSSAPRTPPKQLRGFAKLNLTPGQSGTATFNIRRRDLSYWDTASQKWVVPSGSFGISVGASSRDIRLTSTLSVA
SEQ ID NO:5Te3A(得自埃默森篮状菌的GH3家族β-葡萄糖苷酶， 针对在里氏木霉中的表达进行了密码子优化)的核苷酸序列
ATGCGCAACGGCCTCCTCAAGGTCGCCGCCTTAGCCGCTGCCAGCGCCGTCAACGGCGAGAACCTCGCCTACAGCCCCCCCTTCTACCCCAGCCCCTGGGCCAACGGCCAGGGCGACTGGGCCGAGGCCTACCAGAAGGCCGTCCAGTTCGTCAGCCAGCTCACCCTCGCCGAGAAGGTCAACCTCACCACCGGCACCGGCTGGGAGCAGGACCGCTGCGTCGGCCAGGTCGGCAGCATCCCCCGCTTAGGCTTCCCCGGCCTCTGCATGCAGGACAGCCCCCTCGGCGTCCGCGACACCGACTACAACAGCGCCTTCCCTGCCGGCGTTAACGTCGCCGCCACCTGGGACCGCAACTTAGCCTACCGCAGAGGCGTCGCCATGGGCGAGGAACACCGCGGCAAGGGCGTCGACGTCCAGTTAGGCCCCGTCGCCGGCCCCTTAGGCCGCTCTCCTGATGCCGGCCGCAACTGGGAGGGCTTCGCCCCCGACCCCGTCCTCACCGGCAACATGATGGCCAGCACCATCCAGGGCATCCAGGATGCTGGCGTCATTGCCTGCGCCAAGCACTTCATCCTCTACGAGCAGGAACACTTCCGCCAGGGCGCCCAGGACGGCTACGACATCAGCGACAGCATCAGCGCCAACGCCGACGACAAGACCATGCACGAGTTATACCTCTGGCCCTTCGCCGATGCCGTCCGCGCCGGTGTCGGCAGCGTCATGTGCAGCTACAACCAGGTCAACAACAGCTACGCCTGCAGCAACAGCTACACCATGAACAAGCTCCTCAAGAGCGAGTTAGGCTTCCAGGGCTTCGTCATGACCGACTGGGGCGGCCACCACAGCGGCGTCGGCTCTGCCCTCGCCGGCCTCGACATGAGCATGCCCGGCGACATTGCCTTCGACAGCGGCACGTCTTTCTGGGGCACCAACCTCACCGTTGCCGTCCTCAACGGCTCCATCCCCGAGTGGCGCGTCGACGACATGGCCGTCCGCATCATGAGCGCCTACTACAAGGTCGGCCGCGACCGCTACAGCGTCCCCATCAACTTCGACAGCTGGACCCTCGACACCTACGGCCCCGAGCACTACGCCGTCGGCCAGGGCCAGACCAAGATCAACGAGCACGTCGACGTCCGCGGCAACCACGCCGAGATCATCCACGAGATCGGCGCCGCCTCCGCCGTCCTCCTCAAGAACAAGGGCGGCCTCCCCCTCACTGGCACCGAGCGCTTCGTCGGTGTCTTTGGCAAGGATGCTGGCAGCAACCCCTGGGGCGTCAACGGCTGCAGCGACCGCGGCTGCGACAACGGCACCCTCGCCATGGGCTGGGGCAGCGGCACCGCCAACTTTCCCTACCTCGTCACCCCCGAGCAGGCCATCCAGCGCGAGGTCCTCAGCCGCAACGGCACCTTCACCGGCATCACCGACAACGGCGCCTTAGCCGAGATGGCCGCTGCCGCCTCTCAGGCCGACACCTGCCTCGTCTTTGCCAACGCCGACTCCGGCGAGGGCTACATCACCGTCGATGGCAACGAGGGCGACCGCAAGAACCTCACCCTCTGGCAGGGCGCCGACCAGGTCATCCACAACGTCAGCGCCAACTGCAACAACACCGTCGTCGTCTTACACACCGTCGGCCCCGTCCTCATCGACGACTGGTACGACCACCCCAACGTCACCGCCATCCTCTGGGCCGGTTTACCCGGTCAGGAAAGCGGCAACAGCCTCGTCGACGTCCTCTACGGCCGCGTCAACCCCGGCAAGACCCCCTTCACCTGGGGCAGAGCCCGCGACGACTATGGCGCCCCTCTCATCGTCAAGCCTAACAACGGCAAGGGCGCCCCCCAGCAGGACTTCACCGAGGGCATCTTCATCGACTACCGCCGCTTCGACAAGTACAACATCACCCCCATCTACGAGTTCGGCTTCGGCCTCAGCTACACCACCTTCGAGTTCAGCCAGTTAAACGTCCAGCCCATCAACGCCCCTCCCTACACCCCCGCCAGCGGCTTTACGAAGGCCGCCCAGAGCTTCGGCCAGCCCTCCAATGCCAGCGACAACCTCTACCCTAGCGACATCGAGCGCGTCCCCCTCTACATCTACCCCTGGCTCAACAGCACCGACCTCAAGGCCAGCGCCAACGACCCCGACTACGGCCTCCCCACCGAGAAGTACGTCCCCCCCAACGCCACCAACGGCGACCCCCAGCCCATTGACCCTGCCGGCGGTGCCCCTGGCGGCAACCCCAGCCTCTACGAGCCCGTCGCCCGCGTCACCACCATCATCACCAACACCGGCAAGGTCACCGGCGACGAGGTCCCCCAGCTCTATGTCAGCTTAGGCGGCCCTGACGACGCCCCCAAGGTCCTCCGCGGCTTCGACCGCATCACCCTCGCCCCTGGCCAGCAGTACCTCTGGACCACCACCCTCACTCGCCGCGACATCAGCAACTGGGACCCCGTCACCCAGAACTGGGTCGTCACCAACTACACCAAGACCATCTACGTCGGCAACAGCAGCCGCAACCTCCCCCTCCAGGCCCCCCTCAAGCCCTACCCCGGCATCTGATGA
SEQ ID NO:6Te3A(得自埃默森篮状菌的GH3家族β-葡萄糖苷酶) 的蛋白质序列
MRNGLLKVAALAAASAVNGENLAYSPPFYPSPWANGQGDWAEAYQKAVQFVSQLTLAEKVNLTTGTGWEQDRCVGQVGSIPRLGFPGLCMQDSPLGVRDTDYNSAFPAGVNVAATWDRNLAYRRGVAMGEEHRGKGVDVQLGPVAGPLGRSPDAGRNWEGFAPDPVLTGNMMASTIQGIQDAGVIACAKHFILYEQEHFRQGAQDGYDISDSISANADDKTMHELYLWPFADAVRAGVGSVMCSYNQVNNSYACSNSYTMNKLLKSELGFQGFVMTDWGGHHSGVGSALAGLDMSMPGDIAFDSGTSFWGTNLTVAVLNGSIPEWRVDDMAVRIMSAYYKVGRDRYSVPINFDSWTLDTYGPEHYAVGQGQTKINEHVDVRGNHAEIIHEIGAASAVLLKNKGGLPLTGTERFVGVFGKDAGSNPWGVNGCSDRGCDNGTLAMGWGSGTANFPYLVTPEQAIQREVLSRNGTFTGITDNGALAEMAAAASQADTCLVFANADSGEGYITVDGNEGDRKNLTLWQGADQVIHNVSANCNNTVVVLHTVGPVLIDDWYDHPNVTAILWAGLPGQESGNSLVDVLYGRVNPGKTPFTWGRARDDYGAPLIVKPNNGKGAPQQDFTEGIFIDYRRFDKYNITPIYEFGFGLSYTTFEFSQLNVQPINAPPYTPASGFTKAAQSFGQPSNASDNLYPSDIERVPLYIYPWLNSTDLKASANDPDYGLPTEKYVPPNATNGDPQPIDPAGGAPGGNPSLYEPVARVTTIITNTGKVTGDEVPQLYVSLGGPDDAPKVLRGFDRITLAPGQQYLWTTTLTRRDISNWDPVTQNWVVTNYTKTIYVGNSSRNLPLQAPLKPYPGI
SEQ ID NO:7Bgl3(或Tr3B)(得自里氏木霉的GH3家族β-葡萄糖 苷酶)的核苷酸序列
ATGAAGACGTTGTCAGTGTTTGCTGCCGCCCTTTTGGCGGCCGTAGCTGAGGCCAATCCCTACCCGCCTCCTCACTCCAACCAGGCGTACTCGCCTCCTTTCTACCCTTCGCCATGGATGGACCCCAGTGCTCCAGGCTGGGAGCAAGCCTATGCCCAAGCTAAGGAGTTCGTCTCGGGCTTGACTCTCTTGGAGAAGGTCAACCTCACCACCGGTGTTGGCTGGATGGGTGAGAAGTGCGTTGGAAACGTTGGTACCGTGCCTCGCTTGGGCATGCGAAGTCTTTGCATGCAGGACGGCCCCCTGGGTCTCCGATTCAACACGTACAACAGCGCTTTCAGCGTTGGCTTGACGGCCGCCGCCAGCTGGAGCCGACACCTTTGGGTTGACCGCGGTACCGCTCTGGGCTCCGAGGCAAAGGGCAAGGGTGTCGATGTTCTTCTCGGACCCGTGGCTGGCCCTCTCGGTCGCAACCCCAACGGAGGCCGTAACGTCGAGGGTTTCGGCTCGGATCCCTATCTGGCGGGTTTGGCTCTGGCCGATACCGTGACCGGAATCCAGAACGCGGGCACCATCGCCTGTGCCAAGCACTTCCTCCTCAACGAGCAGGAGCATTTCCGCCAGGTCGGCGAAGCTAACGGTTACGGATACCCCATCACCGAGGCTCTGTCTTCCAACGTTGATGACAAGACGATTCACGAGGTGTACGGCTGGCCCTTCCAGGATGCTGTCAAGGCTGGTGTCGGGTCCTTCATGTGCTCGTACAACCAGGTCAACAACTCGTACGCTTGCCAAAACTCCAAGCTCATCAACGGCTTGCTCAAGGAGGAGTACGGTTTCCAAGGCTTTGTCATGAGCGACTGGCAGGCCCAGCACACGGGTGTCGCGTCTGCTGTTGCCGGTCTCGATATGACCATGCCTGGTGACACCGCCTTCAACACCGGCGCATCCTACTTTGGAAGCAACCTGACGCTTGCTGTTCTCAACGGCACCGTCCCCGAGTGGCGCATTGACGACATGGTGATGCGTATCATGGCTCCCTTCTTCAAGGTGGGCAAGACGGTTGACAGCCTCATTGACACCAACTTTGATTCTTGGACCAATGGCGAGTACGGCTACGTTCAGGCCGCCGTCAATGAGAACTGGGAGAAGGTCAACTACGGCGTCGATGTCCGCGCCAACCATGCGAACCACATCCGCGAGGTTGGCGCCAAGGGAACTGTCATCTTCAAGAACAACGGCATCCTGCCCCTTAAGAAGCCCAAGTTCCTGACCGTCATTGGTGAGGATGCTGGCGGCAACCCTGCCGGCCCCAACGGCTGCGGTGACCGCGGCTGTGACGACGGCACTCTTGCCATGGAGTGGGGATCTGGTACTACCAACTTCCCCTACCTCGTCACCCCCGACGCGGCCCTGCAGAGCCAGGCTCTCCAGGACGGCACCCGCTACGAGAGCATCCTGTCCAACTACGCCATCTCGCAGACCCAGGCGCTCGTCAGCCAGCCCGATGCCATTGCCATTGTCTTTGCCAACTCGGATAGCGGCGAGGGCTACATCAACGTCGATGGCAACGAGGGCGACCGCAAGAACCTGACGCTGTGGAAGAACGGCGACGATCTGATCAAGACTGTTGCTGCTGTCAACCCCAAGACGATTGTCGTCATCCACTCGACCGGCCCCGTGATTCTCAAGGACTACGCCAACCACCCCAACATCTCTGCCATTCTGTGGGCCGGTGCTCCTGGCCAGGAGTCTGGCAACTCGCTGGTCGACATTCTGTACGGCAAGCAGAGCCCGGGCCGCACTCCCTTCACCTGGGGCCCGTCGCTGGAGAGCTACGGAGTTAGTGTTATGACCACGCCCAACAACGGCAACGGCGCTCCCCAGGATAACTTCAACGAGGGCGCCTTCATCGACTACCGCTACTTTGACAAGGTGGCTCCCGGCAAGCCTCGCAGCTCGGACAAGGCTCCCACGTACGAGTTTGGCTTCGGACTGTCGTGGTCGACGTTCAAGTTCTCCAACCTCCACATCCAGAAGAACAATGTCGGCCCCATGAGCCCGCCCAACGGCAAGACGATTGCGGCTCCCTCTCTGGGCAGCTTCAGCAAGAACCTTAAGGACTATGGCTTCCCCAAGAACGTTCGCCGCATCAAGGAGTTTATCTACCCCTACCTGAGCACCACTACCTCTGGCAAGGAGGCGTCGGGTGACGCTCACTACGGCCAGACTGCGAAGGAGTTCCTCCCCGCCGGTGCCCTGGACGGCAGCCCTCAGCCTCGCTCTGCGGCCTCTGGCGAACCCGGCGGCAACCGCCAGCTGTACGACATTCTCTACACCGTGACGGCCACCATTACCAACACGGGCTCGGTCATGGACGACGCCGTTCCCCAGCTGTACCTGAGCCACGGCGGTCCCAACGAGCCGCCCAAGGTGCTGCGTGGCTTCGACCGCATCGAGCGCATTGCTCCCGGCCAGAGCGTCACGTTCAAGGCAGACCTGACGCGCCGTGACCTGTCCAACTGGGACACGAAGAAGCAGCAGTGGGTCATTACCGACTACCCCAAGACTGTGTACGTGGGCAGCTCCTCGCGCGACCTGCCGCTGAGCGCCCGCCTGCCATGA
SEQ ID NO:8Bgl3(或Tr3B)(得自里氏木霉的GH3家族β-葡萄糖 苷酶)的蛋白质序列
MKTLSVFAAALLAAVAEANPYPPPHSNQAYSPPFYPSPWMDPSAPGWEQAYAQAKEFVSGLTLLEKVNLTTGVGWMGEKCVGNVGTVPRLGMRSLCMQDGPLGLRFNTYNSAFSVGLTAAASWSRHLWVDRGTALGSEAKGKGVDVLLGPVAGPLGRNPNGGRNVEGFGSDPYLAGLALADTVTGIQNAGTIACAKHFLLNEQEHFRQVGEANGYGYPITEALSSNVDDKTIHEVYGWPFQDAVKAGVGSFMCSYNQVNNSYACQNSKLINGLLKEEYGFQGFVMSDWQAQHTGVASAVAGLDMTMPGDTAFNTGASYFGSNLTLAVLNGTVPEWRIDDMVMRIMAPFFKVGKTVDSLIDTNFDSWTNGEYGYVQAAVNENWEKVNYGVDVRANHANHIREVGAKGTVIFKNNGILPLKKPKFLTVIGEDAGGNPAGPNGCGDRGCDDGTLAMEWGSGTTNFPYLVTPDAALQSQALQDGTRYESILSNYAISQTQALVSQPDAIAIVFANSDSGEGYINVDGNEGDRKNLTLWKNGDDLIKTVAAVNPKTIVVIHSTGPVILKDYANHPNISAILWAGAPGQESGNSLVDILYGKQSPGRTPFTWGPSLESYGVSVMTTPNNGNGAPQDNFNEGAFIDYRYFDKVAPGKPRSSDKAPTYEFGFGLSWSTFKFSNLHIQKNNVGPMSPPNGKTIAAPSLGSFSKNLKDYGFPKNVRRIKEFIYPYLSTTTSGKEASGDAHYGQTAKEFLPAGALDGSPQPRSAASGEPGGNRQLYDILYTVTATITNTGSVMDDAVPQLYLSHGGPNEPPKVLRGFDRIERIAPGQSVTFKADLTRRDLSNWDTKKQQWVITDYPKTVYVGSSSRDLPLSARLP
SEQ ID NO:9编码Fv3C/Bgl3的核苷酸序列
SEQ ID NO:10Fv3C/Bgl3嵌合多肽序列(Bgl3嵌合部分以粗体和大写 标出)
MKLNWVAAALSIGAAGTDSAVALASAVPDTLAGVKKADAQKVVTRDTLAYSPPHYPSPWMDPNAVGWEEAYAKAKSFVSQLTLMEKVNLTTGVGWQGERCVGNVGSIPRLGMRGLCLQDGPLGIRLSDYNSAFPAGTTAGASWSKSLWYERGLLMGTEFKEKGIDIALGPATGPLGRTAAGGRNWEGFTVDPYMAGHAMAEAVKGIQDAGVIACAKHYIANEQEHFRQSGEVQSRKYNISESLSSNLDDKTMHELYAWPFADAVRAGVGSVMCSYNQINNSYGCQNSKLLNGILKDEMGFQGFVMSDWAAQHTGAASAVAGLDMSMPGDTAFDSGYSFWGGNLTLAVINGTVPAWRVDDMALRIMSAFFKVGKTIEDLPDINFSSWTRDTFGFVHTFAQENREQVNFGVNVQHDHKSHIREAAAKGSVVLKNTGSLPLKNPKFLAVIGEDAGPNPAGPNGCGDRGCDNGTLAMAWGSGTSQFPYLITPDQGLSNRATQDGTRYESILTNNEWASVQALVSQPNVTAIVFANADSGEGYIEVDGNFGDRKNLTLWQQGDELIKNVSSICPNTIVVLHTVGPVLLADYEKNPNITAIVWAGLPGQESGNAIADLLYGKVSPGRSPFTWGRTRESYGTEVLYEANNGRGAPQDDFSEGVFIDYRHFDRRSPSTDGKSSPNNTAAPLYEFGHGLSWSTFKFSNLHIQKNNVGPMSPPNGKTIAAPSLGSFSKNLKDYGFPKNVRRIKEFIYPYLSTTTSGKEASGDAHYGQTAKEFLPAGALDGSPQPRSAASGEPGGNRQLYDILYTVTATITNTGSVMDDAVPQLYLSHGGPNEPPKVLRGFDRIERIAPGQSVTFKADLTRRDLSNWDTKKQQWVITDYPKTVYVGSSSRDLPLSARLP
SEQ ID NO:11：编码Fv3C/Te3A/Bgl3嵌合体的核酸序列
ATGAAGCTGAATTGGGTCGCCGCAGCCCTGTCTATAGGTGCTGCTGGCACTGACAGCGCAGTTGCTCTTGCTTCTGCAGTTCCAGACACTTTGGCTGGTGTAAAGGTCAGTTTTTTTTCACCATTTCCTCGTCTAATCTCAGCCTTGTTGCCATATCGCCCTTGTTCGCTCGGACGCCACGCACCAGATCGCGATCATTTCCTCCCTTGCAGCCTTGGTTCCTCTTACGATCTTCCCTCCGCAATTATCAGCGCCCTTAGTCTACACAAAAACCCCCGAGACAGTCTTTCATTGAGTTTGTCGACATCAAGTTGCTTCTCAACTGTGCATTTGCGTGGCTGTCTACTTCTGCCTCTAGACAACCAAATCTGGGCGCAATTGACCGCTCAAACCTTGTTCAAATAACCTTTTTTATTCGAGACGCACATTTATAAATATGCGCCTTTCAATAATACCGACTTTATGCGCGGCGGCTGCTGTGGCGGTTGATCAGAAAGCTGACGCTCAAAAGGTTGTCACGAGAGATACACTCGCATACTCGCCGCCTCATTATCCTTCACCATGGATGGACCCTAATGCTGTTGGCTGGGAGGAAGCTTACGCCAAAGCCAAGAGCTTTGTGTCCCAACTCACTCTCATGGAAAAGGTCAACTTGACCACTGGTGTTGGGTAAGCAGCTCCTTGCAAACAGGGTATCTCAATCCCCTCAGCTAACAACTTCTCAGATGGCAAGGCGAACGCTGTGTAGGAAACGTGGGATCAATTCCTCGTCTCGGTATGCGAGGTCTCTGTCTCCAGGATGGTCCTCTTGGAATTCGTCTGTCCGACTACAACAGCGCTTTTCCCGCTGGCACCACAGCTGGTGCTTCTTGGAGCAAGTCTCTCTGGTATGAGAGAGGTCTCCTGATGGGCACTGAGTTCAAGGAGAAGGGTATCGATATCGCTCTTGGTCCTGCTACTGGACCTCTTGGTCGCACTGCTGCTGGTGGACGAAACTGGGAAGGCTTCACCGTTGATCCTTATATGGCTGGCCACGCCATGGCCGAGGCCGTCAAGGGTATTCAAGACGCAGGTGTCATTGCTTGTGCTAAGCATTACATCGCAAACGAGCAGGGTAAGCCACTTGGACGATTTGAGGAATTGACAGAGAACTGACCCTCTTGTAGAGCACTTCCGACAGAGTGGCGAGGTCCAGTCCCGCAAGTACAACATCTCCGAGTCTCTCTCCTCCAACCTGGATGACAAGACTATGCACGAGCTCTACGCCTGGCCCTTCGCTGACGCCGTCCGCGCCGGCGTCGGTTCCGTCATGTGCTCGTACAACCAGATCAACAACTCGTACGGTTGCCAGAACTCCAAGCTCCTCAACGGTATCCTCAAGGACGAGATGGGCTTCCAGGGTTTCGTCATGAGCGATTGGGCGGCCCAGCATACCGGTGCCGCTTCTGCCGTCGCTGGTCTCGATATGAGCATGCCTGGTGACACTGCCTTCGACAGCGGATACAGCTTCTGGGGCGGAAACTTGACTCTGGCTGTCATCAACGGAACTGTTCCCGCCTGGCGAGTTGATGACATGGCTCTGCGAATCATGTCTGCCTTCTTCAAGGTTGGAAAGACGATAGAGGATCTTCCCGACATCAACTTCTCCTCCTGGACCCGCGACACCTTCGGCTTCGTGCATACATTTGCTCAAGAGAACCGCGAGCAGGTCAACTTTGGAGTCAACGTCCAGCACGACCACAAGAGCCACATCCGTGAGGCCGCTGCCAAGGGAAGCGTCGTGCTCAAGAACACCGGGTCCCTTCCCCTCAAGAACCCAAAGTTCCTCGCTGTCATTGGTGAGGACGCCGGTCCCAACCCTGCTGGACCCAATGGTTGTGGTGACCGTGGTTGCGATAATGGTACCCTGGCTATGGCTTGGGGCTCGGGAACTTCCCAATTCCCTTACTTGATCACCCCCGATCAAGGGCTCTCTAATCGAGCTACTCAAGACGGAACTCGATATGAGAGCATCTTGACCAACAACGAATGGGCTTCAGTACAAGCTCTTGTCAGCCAGCCTAACGTGACCGCTATCGTTTTCGCCAATGCCGACTCTGGTGAGGGATACATTGAAGTCGACGGAAACTTTGGTGATCGCAAGAACCTCACCCTCTGGCAGCAGGGAGACGAGCTCATCAAGAACGTGTCGTCCATATGCCCCAACACCATTGTAGTTCTGCACACCGTCGGCCCTGTCCTACTCGCCGACTACGAGAAGAACCCCAACATCACTGCCATCGTCTGGGCTGGTCTTCCCGGCCAAGAGTCAGGCAATGCCATCGCTGATCTCCTCTACGGCAAGGTCAGCCCTGGCCGATCTCCCTTCACTTGGGGCCGCACCCGCGAGAGCTACGGTACTGAGGTTCTTTATGAGGCGAACAACGGCCGTGGCGCTCCTCAGGATGACTTCTCTGAGGGTGTCTTCATCGACTACCGTCACTTCGACAAGTACAACATCACGCCTATCTACGAGTTCGGTCACGGTCTATCTTGGTCGACGTTCAAGTTCTCCAACCTCCACATCCAGAAGAACAATGTCGGCCCCATGAGCCCGCCCAACGGCAAGACGATTGCGGCTCCCTCTCTGGGCAACTTCAGCAAGAACCTTAAGGACTATGGCTTCCCCAAGAACGTTCGCCGCATCAAGGAGTTTATCTACCCCTACCTGAACACCACTACCTCTGGCAAGGAGGCGTCGGGTGACGCTCACTACGGCCAGACTGCGAAGGAGTTCCTCCCCGCCGGTGCCCTGGACGGCAGCCCTCAGCCTCGCTCTGCGGCCTCTGGCGAACCCGGCGGCAACCGCCAGCTGTACGACATTCTCTACACCGTGACGGCCACCATTACCAACACGGGCTCGGTCATGGACGACGCCGTTCCCCAGCTGTACCTGAGCCACGGCGGTCCCAACGAGCCGCCCAAGGTGCTGCGTGGCTTCGACCGCATCGAGCGCATTGCTCCCGGCCAGAGCGTCACGTTCAAGGCAGACCTGACGCGCCGTGACCTGTCCAACTGGGACACGAAGAAGCAGCAGTGGGTCATTACCGACTACCCCAAGACTGTGTACGTGGGCAGCTCCTCGCGCGACCTGCCGCTGAGCGCCCGCCTGCCATGA
SEQ ID NO:12：Fv3C/Te3A/Bgl3嵌合体的氨基酸序列
MKLNWVAAALSIGAAGTDSAVALASAVPDTLAGVKKADAQKVVTRDTLAYSPPHYPSPWMDPNAVGWEEAYAKAKSFVSQLTLMEKVNLTTGVGWQGERCVGNVGSIPRLGMRGLCLQDGPLGIRLSDYNSAFPAGTTAGASWSKSLWYERGLLMGTEFKEKGIDIALGPATGPLGRTAAGGRNWEGFTVDPYMAGHAMAEAVKGIQDAGVIACAKHYIANEQEHFRQSGEVQSRKYNISESLSSNLDDKTMHELYAWPFADAVRAGVGSVMCSYNQINNSYGCQNSKLLNGILKDEMGFQGFVMSDWAAQHTGAASAVAGLDMSMPGDTAFDSGYSFWGGNLTLAVINGTVPAWRVDDMALRIMSAFFKVGKTIEDLPDINFSSWTRDTFGFVHTFAQENREQVNFGVNVQHDHKSHIREAAAKGSVVLKNTGSLPLKNPKFLAVIGEDAGPNPAGPNGCGDRGCDNGTLAMAWGSGTSQFPYLITPDQGLSNRATQDGTRYESILTNNEWASVQALVSQPNVTAIVFANADSGEGYIEVDGNFGDRKNLTLWQQGDELIKNVSSICPNTIVVLHTVGPVLLADYEKNPNITAIVWAGLPGQESGNAIADLLYGKVSPGRSPFTWGRTRESYGTEVLYEANNGRGAPQDDFSEGVFIDYRHFDKYNITPIYEFGHGLSWSTFKFSNLHIQKNNVGPMSPPNGKTIAAPSLGNFSKNLKDYGFPKNVRRIKEFIYPYLNTTTSGKEASGDAHYGQTAKEFLPAGALDGSPQPRSAASGEPGGNRQLYDILYTVTATITNTGSVMDDAVPQLYLSHGGPNEPPKVLRGFDRIERIAPGQSVTFKADLTRRDLSNWDTKKQQWVITDYPKTVYVGSSSRDLPLSARLP
SEQ ID NO:13：Fv43D(得自轮枝镰孢菌的GH43D家族酶)的核苷酸 序列
ATGCAGCTCAAGTTTCTGTCTTCAGCATTGTTGCTGTCTTTGACCGGCAATTGCGCTGCGCAAGACACTAATGATATCCCTCCTCTGATCACCGACCTCTGGTCTGCGGATCCCTCGGCTCATGTTTTCGAGGGCAAACTCTGGGTTTACCCATCTCACGACATCGAAGCCAATGTCGTCAACGGCACCGGAGGCGCTCAGTACGCCATGAGAGATTATCACACCTATTCCATGAAGACCATCTATGGAAAAGATCCCGTTATCGACCATGGCGTCGCTCTGTCAGTCGATGATGTCCCATGGGCCAAGCAGCAAATGTGGGCTCCTGACGCAGCTTACAAGAACGGCAAATATTATCTCTACTTCCCCGCCAAGGATAAAGATGAGATCTTCAGAATTGGAGTTGCTGTCTCCAACAAGCCCAGCGGTCCTTTCAAGGCCGACAAGAGCTGGATCCCCGGTACTTACAGTATCGATCCTGCTAGCTATGTCGACACTAATGGCGAGGCATACCTCATCTGGGGCGGTATCTGGGGCGGCCAGCTTCAGGCCTGGCAGGATCACAAGACCTTTAATGAGTCGTGGCTCGGCGACAAAGCTGCTCCCAACGGCACCAACGCCCTATCTCCTCAGATCGCCAAGCTAAGCAAGGACATGCACAAGATCACCGAGACACCCCGCGATCTCGTCATCCTGGCCCCCGAGACAGGCAAGCCCCTTCAAGCAGAGGACAATAAGCGACGATTTTTCGAGGGGCCCTGGGTTCACAAGCGCGGCAAGCTGTACTACCTCATGTACTCTACCGGCGACACGCACTTCCTCGTCTACGCGACTTCCAAGAACATCTACGGTCCTTATACCTATCAGGGCAAGATTCTCGACCCTGTTGATGGGTGGACTACGCATGGAAGTATTGTTGAGTACAAGGGACAGTGGTGGTTGTTCTTTGCGGATGCGCATACTTCTGGAAAGGATTATCTGAGACAGGTTAAGGCGAGGAAGATCTGGTATGACAAGGATGGCAAGATTTTGCTTACTCGTCCTAAGATTTAG
SEQ ID NO:14Fv43D的蛋白质序列
MQLKFLSSALLLSLTGNCAAQDTNDIPPLITDLWSADPSAHVFEGKLWVYPSHDIEANVVNGTGGAQYAMRDYHTYSMKTIYGKDPVIDHGVALSVDDVPWAKQQMWAPDAAYKNGKYYLYFPAKDKDEIFRIGVAVSNKPSGPFKADKSWIPGTYSIDPASYVDTNGEAYLIWGGIWGGQLQAWQDHKTFNESWLGDKAAPNGTNALSPQIAKLSKDMHKITETPRDLVILAPETGKPLQAEDNKRRFFEGPWVHKRGKLYYLMYSTGDTHFLVYATSKNIYGPYTYQGKILDPVDGWTTHGSIVEYKGQWWLFFADAHTSGKDYLRQVKARKIWYDKDGKILLTRPKI
SEQ ID NO:15正向引物MH234
5’-CACCATGAAGCTGAATTGGGTCGC-3’
SEQ ID NO:16反向引物MH235
5’-TTACTCCAACTTGGCGCTG-3’
SEQ ID NO:17MH255
5’-AAGCCAAGAGCTTTGTGTCC-3’
SEQ ID NO:18MH256
5’-TATGCACGAGCTCTACGCCT-3’
SEQ ID NO:19MH257
5’-ATGGTACCCTGGCTATGGCT-3’
SEQ ID NO:20MH258
5’-CGGTCACGGTCTATCTTGGT-3’
SEQ ID NO:21pDonor正向
5’-GCTAGCATGGATGTTTTCCCAGTCACGACGTTGTAAAACGACGGC-3’
SEQ ID NO:22Fv3C/Bgl3反向
5’-GGAGGTTGGAGAACTTGAACGTCGACCAAGATAGACCGTGACCGAAC TCGTAG3’
SEQ ID NO:23pDonor反向
5’-TGCCAGGAAACAGCTATGACCATGTAATACGACTCACTATAGG-3’
SEQ ID NO:24Fv3C/Bgl3正向
5’-CTACGAGTTCGGTCACGGTCTATCTTGGTCGACGTTCAAGTTCTCCAACCTCC-3’
SEQ ID NO:25Att L1正向
5’TAAGCTCGGGCCCCAAATAATGATTTTATTTTGACTGATAGT3’
SEQ ID NO:26AttL2反向
5’GGGATATCAGCTGGATGGCAAATAATGATTTTATTTTGACTGATA3’
SEQ ID NO:27Fv3C/Bgl3嵌合体的Fv3C第665-683位残基
RRSPSTDGKSSPNN TAAPL
SEQ ID NO:28Te3A第634-640位残基
KYNITPI
SEQ ID NO:29Pr CbhI正向
5’CGGAATGAGCTAGTAGGCAAAGTCAGC3’
SEQ ID NO:30725/751反向
5’-CTCCTTGATGCGGCGAACGTTCTTGGGGAAGCCATAGTCCTTAAGGTTCTTGCTGAAGTTGCCCAGAGAG3’
SEQ ID NO:31725/751正向
5’-GGCTTCCCCAAGAACGTTCGCCGCATCAAGGAGTTTATCTACCCCTACCTGAACACCACTACCTC3’
SEQ ID NO:32Ter CbhI反向
5’GATACACGAAGAGCGGCGATTCTACGG3’
SEQ ID NO:33Te3A反向
5’-GATAGACCGTGACCGAACTCGTAGATAGGCGTGATGTTGTACTTGTCGAAGTGACGGTAGTCGATGAAGAC3’
SEQ ID NO:34Te3A2正向
5’-GTCTTCATCGACTACCGTCACTTCGACAAGTACAACATCACGCCTATCTACGAGTTCGGTCACGGTCTATC-3’
SEQ ID NO:35正向引物SK943
5’–CACCATGAGATATAGAACAGCTGCCGCT-3’
SEQ ID NO:36反向引物SK941
5’-CGACCGCCCTGCGGAGTCTTGCCCAGTGGTCCCGCGACAG-3’
SEQ ID NO:37正向引物(SK940)
5’–CTGTCGCGGGACCACTGGGCAAGACTCCGCAGGGCGGTCG-3’
SEQ ID NO:38反向引物(SK942)
5’–CCTACGCTACCGACAGAGTG-3’
SEQ ID NO:39正向引物SK771
5’–GTCTAGACTGGAAACGCAAC-3’
SEQ ID NO:40反向引物SK745
5’–GAGTTGTGAAGTCGGTAATCC-3’
SEQ ID NO:41正向引物SK1322
5’–CACCATGCAGCTCAAGTTTCTGTC-3’
SEQ ID NO:42反向引物SK1297
5’–GGTTACTAGTCAACTGCCCGTTCTGTAGCGAG-3’
SEQ ID NO:43正向引物SK1236
5’–CATGCGATCGCGACGTTTTGGTCAGGTCG-3’
SEQ ID NO:44反向引物SK1321
5’-GACAGAAACTTGAGCTGCATGGTGTGGGACAACAAGAAGG-3’

Claims (48)

1.一种生成催化转化过程的酶混合物的方法，所述方法包括如下步骤：
在液体培养基中组合第一和第二细胞系，所述第一细胞系编码并适于表达第一组的一个或多个酶，所述第二细胞系编码并适于表达第二组的一个或多个酶，所述第一和第二组的酶具有增强所述转化过程的催化活性，所述第一组酶中的一者或多者对所述第一细胞系是外源性的，并且所述第二组酶中的一者或多者对所述第二细胞系是外源性的或不由所述第一细胞系编码或由所述第一细胞系以低水平表达；
培养所述组合的细胞系；从而所述细胞系将所述酶分泌至所述培养基，或裂解所述细胞系释放所述酶，从而按有效地增强所述转化过程的比例提供酶混合物。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述第二组酶中的一者或多者对所述第二细胞系是外源性的或不由所述第一细胞系编码。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述第二组酶中的一者或多者由所述第一细胞系以低水平表达。
4.根据权利要求1所述的方法，还包括：
鉴定催化所述转化过程的多个酶；
鉴定或构建编码并适于表达第一组的一个或多个所述已鉴定酶的第一细胞系、以及编码并适于表达第二组的所述一个或多个酶的第二细胞系，从而提供所述第一和第二细胞系。
5.根据权利要求1所述的方法，还包括：
鉴定或构建编码并适于表达不同组的催化转化过程的酶的细胞系，所述细胞系在选择压力下或在允许营养缺陷型生长的条件下生长，以保持其适于表达所述酶，从而形成细胞系库；其中所述多个细胞系包括编码并适于表达第一组的一个或多个酶的所述第一细胞系、以及编码并适于表达第二组的一个或多个酶的所述第二细胞系；从所述库选择所述第一和第二细胞系。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述细胞系在所述鉴定步骤中在不同的选择压力下生长，并且在所述培养步骤中无选择压力生长。
7.一种制备细胞库的方法，所述方法包括：
鉴定催化转化过程的多个酶；
鉴定或构建编码并适于表达所述多个酶中的不同组酶的多个细胞系；
使所述细胞系在不同的选择压力下或在允许营养缺陷型生长的条件下繁殖，以保持适于表达由细胞系编码的所述酶组，从而提供细胞库；以及
组合所述细胞系的不同组合，在液体培养基中培养所述组合的细胞系，其中所述酶是分泌的、或裂解所述细胞将所述酶释放到所述培养基，从而提供不同的酶混合物，以及比较所述酶增强所述转化过程的能力。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述第一和第二细胞系是工程改造为分别编码所述第一和第二组的一个或多个酶的相同细胞系。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述第二组的一个或多个酶由所述第二细胞系内源性表达。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中所述第一组的一个或多个酶中的至少一者不由所述第二细胞系编码，并且所述第二组的一个或多个酶中的至少一者不由所述第一细胞系编码。
11.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中所述第一细胞系编码并适于表达所述第二组的至少一个酶。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的方法，其中所述组合步骤包括组合第一、第二和第三细胞系，所述第三细胞系编码并适于表达第三组的一个或多个酶。
13.根据权利要求1-12中任一项所述的方法，其中所述第一组酶包括两个或更多个不同的酶，每个都具有增强所述转化过程的活性。
14.根据权利要求1-13中任一项所述的方法，还包括从所述培养的细胞分离所述酶混合物。
15.根据权利要求1-14中任一项所述的方法，还包括使所述酶混合物与底物组合，其中所述酶混合物增强所述底物向产物的转化。
16.根据权利要求1-15中任一项所述的方法，其中所述底物是纤维素和/或半纤维素，并且所述产物是葡萄糖，或其中所述底物是淀粉，并且所述产物是糖。
17.根据权利要求1-16中任一项所述的方法，还包括确定所述混合物中所述酶的比例。
18.根据权利要求1-17中任一项所述的方法，其中所述混合物中所述第一组酶的酶和所述第二组酶的酶的摩尔比与所述第一或第二细胞系单独表达的所述酶的摩尔比相差至少两倍。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述第二组酶的所述酶对所述第二细胞系是外源性的。
20.根据权利要求1-17中任一项所述的方法，其中分泌的所述第一组酶和分泌的所述第二组酶的摩尔比与所述第一或第二细胞系单独表达的所述酶的摩尔比相差至少两倍。
21.根据权利要求1-17中任一项所述的方法，其中对所述第一细胞系是外源性的所述第一组酶和对所述第二细胞系是外源性的所述第二组酶的摩尔比与所述第一或第二细胞系单独表达的所述酶的摩尔比相差至少两倍。
22.根据权利要求16所述的方法，其中所述混合物中所述第一组中最高表达的酶和所述第二组中最高表达的酶的摩尔比与所述第一或第二细胞系单独表达的所述酶的摩尔比相差至少两倍。
23.根据权利要求18-22中任一项所述的方法，其中所述摩尔比相差至少五倍。
24.根据权利要求18-23中任一项所述的方法，其中所述摩尔比在1:20至20:1的范围内。
25.根据权利要求18-23中任一项所述的方法，其中所述摩尔比在1:5至5:1的范围内。
26.根据权利要求18-23中任一项所述的方法，其中所述摩尔比在1:2至2:1的范围内。
27.根据权利要求1-26中任一项所述的方法，其中所述第一和第二细胞系是相同株。
28.根据权利要求27所述的方法，其中所述第一和第二细胞系是修饰为表达不同组的一个或多个外源性酶的相同株。
29.根据权利要求1-26中任一项所述的方法，其中所述第一和第二细胞系是微生物细胞系。
30.根据权利要求1-26中任一项所述的方法，其中所述第一和第二细胞系是真菌细胞系的细胞系。
31.根据权利要求1-26中任一项所述的方法，其中所述第一和第二细胞系是丝状真菌细胞系或细菌细胞系。
32.根据权利要求1-26中任一项所述的方法，其中所述第一和第二细胞系来自相同属的真菌细胞系。
33.根据权利要求1-26中任一项所述的方法，其中所述第一和第二细胞系是不同属的真菌细胞系。
34.根据权利要求1-26中任一项所述的方法，其中所述第一和第二细胞系是相同属不同种的真菌细胞系。
35.根据权利要求1-26中任一项所述的方法，其中所述第一和第二细胞系是相同种不同菌株的真菌细胞系。
36.根据权利要求1-26中任一项所述的方法，其中所述第一和第二细胞系是相同属不同种的真菌细胞系。
37.根据权利要求1-26中任一项所述的方法，其中所述第一细胞系是真菌细胞系，并且所述第二细胞系是细菌细胞系。
38.根据权利要求1-26中任一项所述的方法，其中所述第一和/或第二细胞系是真菌细胞系。
39.根据权利要求1-26中任一项所述的方法，其中所述第一和/或第二细胞系是里氏木霉(Trichoderma reesei)细胞系。
40.根据权利要求1-26中任一项所述的方法，其中所述第一和/或第二细胞系是细菌细胞系。
41.根据权利要求1-26中任一项所述的方法，其中所述第一和/或第二细胞系是芽孢杆菌属(Bacillus)细胞系。
42.根据权利要求1-41中任一项所述的方法，还包括在所述组合步骤之前确定所述细胞系的生长曲线。
43.根据权利要求42所述的方法，还包括根据所述生长曲线确定混合所述细胞系的比率。
44.根据权利要求42所述的方法，其中所述细胞系的生长曲线在不同的液体培养基中确定。
45.根据权利要求44所述的方法，还包括根据所述不同液体培养基中所述细胞系的生长曲线，选择用于培养所述组合细胞系的液体培养基。
46.根据权利要求42所述的方法，其中所述细胞系的生长曲线在相同的液体培养基中确定。
47.根据权利要求46所述的方法，还包括根据所述相同液体培养基中所述细胞系的生长曲线，选择用于培养所述组合细胞系的液体培养基。
48.根据权利要求46所述的方法，其中在选定液体培养基中所述细胞系的生长速率在彼此的2倍内。
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