ES2621181T3

ES2621181T3 - Levaduras que expresan celulasas para la sacarificación y fermentación simultáneas utilizando celulosa

Info

Publication number: ES2621181T3
Application number: ES09828362.5T
Authority: ES
Inventors: John Mcbride; Elena Brevnova; Chhayal Ghandi; Mark Mellon; Alan Froehlich; Kristen Deleault; Vineet Rajgarhia; Jim Flatt; Emile Van Zyl; Riaan Den Haan; Danie Lagrange; Shaunita Rose; Merja Penttila; Marja Ilmen; Matti Siika-Aho; Jaana Uusitalo; Heidi Hanson Hau; Charles Rice; Jeff Villari; Emily A. Stonehouse
Original assignee: Lallemand Hungary Liquidity Management LLC; Stellenbosch University
Current assignee: Lallemand Hungary Liquidity Management LLC; Stellenbosch University
Priority date: 2008-11-21
Filing date: 2009-11-23
Publication date: 2017-07-03
Anticipated expiration: 2029-11-23
Also published as: WO2010060056A2; CA2964245A1; US20160010117A1; US9102955B2; EP2361311A2; CN102272303A; CA2964245C; AU2009316309A1; NZ593469A; BRPI0921966B1; BRPI0921966A2; US20180258449A1; AU2009316309B2; EP2361311B1; WO2010060056A3; BRPI0921966A8; CA2744495C; CN108315272A; DK2361311T3; EP2361311A4

Abstract

Una célula hospedadora de levadura termotolerante transformada que comprende: (a) al menos un polinucleótido heterólogo que comprende un ácido nucleico que codifica una endoglucanasa; (b) al menos un polinucleótido heterólogo que comprende un ácido nucleico que codifica una ß-glucosidasa; (c) al menos un polinucleótido heterólogo que comprende un ácido nucleico que codifica una celobiohidrolasa I; y (d) al menos un polinucleótido heterólogo que comprende un ácido nucleico que codifica una celobiohidrolasa II; en la que la célula hospedadora de levadura puede producir etanol cuando se cultiva utilizando celulosa como una fuente de carbono.

Description

imagen1

imagen2

imagen3

imagen4

imagen5

imagen6

imagen7

5

15

25

35

45

55

65

90 % idénticos a las secuencias de ácidos nucleicos indicadas en el presente documento, o al menos aproximadamente 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, o 100 % idénticos a las secuencias de ácidos nucleicos indicadas en el presente documento. Los fragmentos de ácidos nucleicos adecuados no solamente tienen las identidades/similitudes anteriores, sino que codifican típicamente un polipéptido que tiene al menos 50 aminoácidos, al menos 100 aminoácidos, al menos 150 aminoácidos, al menos 200 aminoácidos o al menos 250 aminoácidos.

Una “región codificante” de ADN o ARNA es una molécula de ADN o ARN que se trascribe y/o traduce en un polipéptido en una célula in vitro o in vivo cuando se coloca bajo el control de secuencias reguladoras apropiadas. Las “regiones reguladoras adecuadas” se refieren a regiones de ácido nucleico localizadas cadena arriba (secuencias no codificantes en 5’), dentro, o cadena abajo (secuencias no codificantes en 3’) de una región codificante, y que influyen en la transcripción, procesamiento o estabilidad del ARN, o en la traducción de la región codificante asociada. Las regiones reguladoras pueden incluir promotores, secuencias líder de traducción, sitios de procesamiento de ARN, sitios de unión efectores y estructuras en bucle-tallo. Los límites de la región codificante se determinan mediante un codón de inicio en el extremo 5’ (amino) y un codón de terminación de la traducción en el extremo 3’ (carboxilo). Una región codificante puede incluir, pero sin limitación con, regiones procariotas, ADNc de ARNm, moléculas de ADN genómico, moléculas de ADN sintético, o moléculas de ARN. Si la región codificante está destinada para la expresión en una célula eucariota, normalmente una señal de poliadenilación y la secuencia de terminación de la transcripción estarán localizadas en 3’ con respecto a la región codificante.

Una “isoforma” es una proteína que tiene la misma función que otra proteína, pero que está codificada por un gen diferente y puede tener pequeñas diferencias en su secuencia.

Un “parálogo” es una proteína codificada con un gen relacionado con duplicación dentro de un genoma.

Un “ortólogo” es un gen de una especie diferente que ha evolucionado de un gen ancestral común por especiación. Normalmente, en el curso de la evolución, los ortólogos conservan la misma función que la del gen ancestral.

“Fase de lectura abierta”, abreviada como ORF (del inglés Open Reading Frame), significa una longitud de ácido nucleico, ya sea ADN, ADNc o bien ARN, que comprende una señal de inicio o un codón de inicio de la traducción, tal como un codón ATG o AUG, y un codón de terminación y puede traducirse posiblemente en una secuencia polipeptídica.

"Promotor" se refiere a un fragmento de ADN capaz de controlar la expresión de una secuencia codificante o ARN funcional. En general, una región codificante se localiza en 3’ con respecto a un promotor. Los promotores pueden proceder en su totalidad de un gen nativo, o pueden estar compuestos por elementos diferentes procedentes de diferentes promotores encontrados en la naturaleza, o incluso comprender segmentos de ADN sintéticos. Los expertos en la técnica saben que distintos promotores pueden dirigir la expresión de un gen en distintos tipos de tejidos o células, o a diferentes fases del desarrollo, o en respuesta a diferentes condiciones ambientales o fisiológicas. Los promotores que hacen que un gen se exprese en la mayoría de tipos de células en la mayoría de los casos, reciben comúnmente el nombre de “promotores constitutivos”. También se reconoce que, aunque en la mayoría de los casos los límites exactos de las secuencias reguladoras no se han definido por completo, los fragmentos de ADN de diferentes longitudes pueden tener la misma actividad promotora. Generalmente un promotor está limitado en su extremo 3’ por el sitio de inicio de la transcripción y se extiende cadena arriba (dirección 5’) para incluir el número mínimo de bases o elementos necesarios para iniciar la trascripción a niveles detectables por encima del fondo. Dentro del promotor se encontrará un sitio de inicio de la transcripción (definido convenientemente, por ejemplo, mapeando con nucleasa S1), así como dominios de unión a proteína (secuencias consenso) responsables de la unión de la ARN polimerasa.

Una región codificante está “bajo el control” de elementos de control transcripcionales y traduccionales en una célula cuando la ARN polimerasa transcribe la región codificante en ARNm, que después se corta y empalma en trans-ARN (si la región codificante contiene intrones) y se traduce en la proteína codificada por la región codificante.

“Las regiones de control transcripcionales y traduccionales” son secuencias reguladoras de ADN, tales como promotores, potenciadores, terminadores y similares, que proporcionan la expresión de una región codificante en una célula hospedadora. En las células eucariotas, las señales de poliadenilación son regiones de control.

La expresión “asociado operativamente” se refiere a la asociación de secuencias de ácido nucleico en un solo fragmento de ácido nucleico de tal manera que la función de una está afectada por la otra. Por ejemplo, un promotor está asociado operativamente con una región codificante cuando puede afectar a la expresión de esa región codificante (es decir, que la región codificante está bajo el control transcripcionales del promotor). Las regiones codificantes pueden asociarse operativamente a regiones reguladoras en orientación sentido o antisentido.

El término “expresión”, como se usa en el presente documento, se refiere a la transcripción y acumulación estable de ARN en sentido (ARNm) o antisentido procedente del fragmento de ácido nucleico de la invención. La expresión también puede referirse a la traducción de ARNm en un polipéptido.

9 5

15

25

35

45

55

65

Células hospedadoras que expresan celulasas heterólogas

Para abordar las limitaciones de sistemas previos, la presente invención proporciona células hospedadoras que expresan celulasas heterólogas que pueden utilizarse de manera efectiva y eficiente para producir etanol a partir de celulosa. Las células hospedadoras pueden ser una levadura. De acuerdo con la presente invención, la célula hospedadora de levadura puede ser, por ejemplo, de los géneros Saccharomyces, Kluyveromyces, Candida, Pichia, Schizosaccharomyces, Hansenula, Kloeckera, Schwanniomyces y Yarrowia. Las especies de levadura como células hospedadoras pueden incluir, por ejemplo, S. cerevisiae, S. bulderi, S. barnetti, S. exiguus, S. uvarum, S. diastaticus,

K. lactis, K. marxianus, o K. fragilis. En algunas realizaciones, la levadura se selecciona del grupo que consiste en Saccharomyces cerevisiae, Schizzosaccharomyces pombe, Candida albicans, Pichia pastoris, Pichia stipitis, Yarrowia lipolytica, Hansenula polymorpha, Phaffia rhodozyma, Candida utilis, Arxula adeninivorans, Debaryomyces hansenii, Debaryomyces polymorphus, Schizosaccharomyces pombe y Schwanniomyces occidentalis. En una realización particular, la levadura es Saccharomyces cerevisiae. En otra realización, la levadura es una Saccharomyces cerevisiae termotolerante. Se considera que la selección de un hospedador apropiado se incluye en el ámbito de los expertos en la materia a partir de las enseñanzas del presente documento.

En algunas realizaciones de la presente invención, la célula hospedadora es una célula oleaginosa. De acuerdo con la presente invención, la célula hospedadora oleaginosa puede ser una célula levadura oleaginosa. Por ejemplo, la célula hospedadora de levadura oleaginosa puede ser de los géneros Blakeslea, Candida, Cryptococcus, Cunninghamella, Lipomyces, Mortierella, Mucor, Phycomyces, Pythium, Rhodosporidum, Rhodotorula, Trichosporon

o Yarrowia. De acuerdo con la presente invención, la célula hospedadora oleaginosa puede ser una célula hospedadora de microalga oleaginosa. Por ejemplo, la célula hospedadora de microalga oleaginosa puede ser de los géneros Thraustochytrium o Schizochytrium. Por tanto, el biodiésel puede producirse a partir del triglicérido producido por los organismos oleaginosos utilizando procesos de transesterificación de lípidos convencionales. En algunas realizaciones particulares, las células hospedadoras oleaginosas pueden inducirse para secretar lípidos sintetizados. Las realizaciones en las que se utilizan células hospedadoras oleaginosas son ventajosas porque pueden producir biodiésel a partir de materias primas lignocelulósicas que, en relación con sustratos de semillas oleaginosas, son más asequibles, pueden crecer más densamente, mostrar emisiones más bajas de dióxido de carbono en el ciclo de vida y pueden cultivarse en terrenos marginales.

En algunas realizaciones de la presente invención, la célula hospedadora es una célula hospedadora termotolerante. Las células hospedadoras termotolerantes pueden ser particularmente útiles en procesos de sacarificación y fermentación simultáneas permitiendo que las celulasas se produzcan externamente y que las células hospedadoras productoras de etanol se comporten óptimamente en intervalos de temperatura similares.

Las células hospedadoras termotolerantes de la invención pueden incluir, por ejemplo, células hospedadoras de

Issatchenkia orientalis, Pichia mississippiensis, Pichia mexicana, Pichia farinosa, Clavispora opuntiae, Clavispora lusitaniae, Candida mexicana, Hansenula polymorpha y de Kluyveromyces. En algunas realizaciones, la célula termotolerante es una cepa de S. cerevisiae, u otra cepa de levadura, que se ha adaptado para crecer a altas temperaturas, por ejemplo, por selección para el crecimiento a altas temperaturas en un citostato.

En algunas realizaciones particulares de la presente invención, la célula hospedadora es una célula hospedadora de Kluyveromyces. Por ejemplo, la célula hospedadora de Kluyveromyces puede ser una célula hospedadora de K. lactis, K. marxianus, K. blattae, K. phaffii, K. yarrowii, K. aestuarii, K. dobzhanskii, K. wickerhamii K. thermotolerans,

o K. waltii. En una realización, la célula hospedadora es una célula hospedadora de K. lactis o K. marxianus. En otra realización, la célula hospedadora es una célula hospedadora de K. marxianus.

En algunas realizaciones de la presente invención la célula hospedadora termotolerante puede crecer a temperaturas por encima de aproximadamente 30 ºC, de aproximadamente 31 ºC, de aproximadamente 32 ºC, de aproximadamente 33 ºC, de aproximadamente 34 ºC, de aproximadamente 35 ºC, de aproximadamente 36 ºC, de aproximadamente 37 ºC, de aproximadamente 38 ºC, de aproximadamente 39 ºC, de aproximadamente 40 ºC, de aproximadamente 41 ºC o de aproximadamente 42 ºC. En algunas realizaciones de la presente invención la célula hospedadora termotolerante puede producir etanol a partir de celulosa a temperaturas por encima de aproximadamente 30 ºC, de aproximadamente 31°C, de aproximadamente 32 ºC, de aproximadamente 33 ºC, de aproximadamente 34 ºC, de aproximadamente 35 ºC, de aproximadamente 36 ºC, de aproximadamente 37 ºC, de aproximadamente 38 ºC, de aproximadamente 39 ºC, de aproximadamente 40 ºC, de aproximadamente 41 ºC, de aproximadamente 42 ºC, de aproximadamente 43 ºC, de aproximadamente 44 ºC, de aproximadamente 45 ºC, o de aproximadamente 50 ºC.

En algunas realizaciones de la presente invención, la célula hospedadora termotolerante puede crecer a temperaturas de aproximadamente 30 ºC a 60 ºC, de aproximadamente 30 ºC a 55 ºC, de aproximadamente 30 ºC a 50 ºC, de aproximadamente 40 ºC a 60 ºC, de aproximadamente 40 ºC a 55 ºC o, de aproximadamente 40 ºC a 50 ºC. En algunas realizaciones de la presente invención, la célula hospedadora termotolerante puede producir etanol a partir de celulosa a temperaturas de aproximadamente 30 ºC a 60 ºC, de aproximadamente 30 ºC a 55 ºC, de aproximadamente 30 ºC a 50° C, de aproximadamente 40 ºC a 60 ºC, de aproximadamente 40 ºC a 55 ºC o de aproximadamente 40 ºC a 50 ºC.

10 5

15

25

35

45

55

65

En algunos métodos descritos en el presente documento, la célula hospedadora tiene la capacidad de metabolizar xilosa. En las siguientes publicaciones puede encontrarse información detallada en lo que respecta al desarrollo de tecnología utilizando xilosa: Kuyper M et al. FEMS Yeast Res. 4: 655-64 (2004), Kuyper M et al. FEMS Yeast Res. 5:399-409 (2005), y Kuyper M et al. FEMS Yeast Res. 5:925-34 (2005).

Por ejemplo, la utilización de xilosa puede realizarse en S. cerevisiae expresando de manera heteróloga el gen de la xilosa isomerasa, XilA, por ejemplo, a partir del hongo anaerobio Piromyces sp. E2, sobreexpresando cinco enzimas de S. cerevisiae implicadas en la conversión de xilulosa a productos intermedios glucolíticos (xiluloquinasa, ribulosa 5-fosfato isomerasa, ribulosa 5-fosfato epimerasa, transcetolasa y transaldolasa) y delecionando el gen GRE3 que codifica la aldosa reductasa para minimizar la producción de xilitol.

De acuerdo con los métodos descritos en el presente documento, las células hospedadoras pueden contener marcadores antibióticos o pueden contener marcadores no antibióticos.

Las células hospedadoras se modifican por ingeniería genética (se transducen o se transforman o se transfectan) con los polinucleótidos que codifican las celulasas de esta invención que se describen con más detalle adelante. Los polinucleótidos que codifican las celulasas pueden introducirse en la célula hospedadora en un vector de la invención, que puede ser, por ejemplo, un vector de clonación o un vector de expresión que comprende una secuencia que codifique una celulosa heteróloga. Las células hospedadoras pueden comprender polinucleótidos de la invención como copias integradas o copias de plásmidos.

En determinados aspectos, la presente invención se refiere a células hospedadoras que contienen las construcciones de polinucleótidos descritas más adelante. Las células hospedadoras de la presente invención pueden expresar uno o más polipéptidos de celulasas heterólogas. En algunas realizaciones, la célula hospedadora comprende una combinación de polinucleótidos que codifican celulasas heterólogas o fragmentos, variantes o derivados de los mismos. La célula hospedadora puede comprender, por ejemplo, copias múltiples de la misma secuencia de ácido nucleico, por ejemplo, para aumentar los niveles de expresión, o la célula hospedadora puede comprender una combinación de polinucleótidos únicos. En otras realizaciones, la célula hospedadora comprende un solo polinucleótido que codifica una celulasa heteróloga o un fragmento, una variante o derivado de los mismos. En particular, dichas células hospedadoras que expresan una sola celulosa heteróloga pueden utilizarse en cocultivo con otras células hospedadoras de la invención que comprenden un polinucleótido que codifica al menos otra celulasa heteróloga distinta, o un fragmento, una variante o derivados de los mismos.

La introducción de un polinucleótido que codifica una celulosa heteróloga, en una célula hospedadora, puede realizarse por métodos conocidos en la técnica. La introducción de polinucleótidos que codifican celulosas heterólogas, por ejemplo, en células hospedadoras de levadura pueden verse afectadas por transformación con acetato de litio, transformación con esferoplastos, o transformación con electroporación, como se describe en Current Protocols in Molecular Biology, 13.7.1-13.7.10. La introducción de la construcción en otras células hospedadoras puede efectuarse mediante transfección con fosfato de calcio, transfección mediada con DEAE-Dextrano o electroporación (Davis, L., et al., Basic Methods in Molecular Biology, (1986)).

Las células hospedadoras transformadas o los cultivos celulares, como se ha descrito anteriormente, pueden examinarse con respecto al contenido de las proteínas endoglucanasa, celobiohidrolasa y/o β glucosidasa. Para el uso de las celulasas heterólogas secretadas, el contenido de las proteínas puede determinarse analizando los sobrenadantes de las células hospedadoras (por ejemplo, levaduras). En determinadas realizaciones, puede recuperarse material de alto peso molecular del sobrenadante de las células de levadura, bien mediante precipitación con acetona o tamponando las muestras con cartuchos desalinizantes desechables. Las proteínas, incluyendo las celulosas heterólogas ligadas, también pueden recuperarse y purificarse de cultivos de células de levaduras recombinantes por métodos que incluyen preparación y lisis de esferoplastos, alteración celular utilizando perlas de vidrio y alteración celular utilizando, por ejemplo, nitrógeno líquido. Como métodos de purificación de proteínas adicionales se incluyen precipitación con etanol o con sulfato de amonio, extracción con ácidos, cromatografía de intercambio aniónico o catiónico, cromatografía con fosfato de celulosa, cromatografía de interacción hidrófoba, cromatografía de afinidad, cromatografía de hidroxiapatita, filtración en gel o cromatografía de lectina. Las etapas de replegamiento de proteínas pueden utilizarse si fuera necesario, para completar la configuración de la proteína madura. Finalmente, para las etapas de purificación final, puede emplearse cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC).

Los métodos de análisis de proteínas incluyen métodos tales como el método de Lowry tradicional o el método de ensayo de proteínas de acuerdo con el protocolo del fabricante BioRad. Utilizando dichos métodos, puede estimarse el contenido proteico de las enzimas sacarolíticas. Adicionalmente, para medir con precisión la concentración proteica, una celulasa heteróloga puede expresarse con una etiqueta, por ejemplo, una etiqueta de His o una etiqueta de HA y purificarse por métodos convencionales utilizando, por ejemplo, anticuerpos contra la etiqueta, una técnica de purificación con resina de níquel convencional, o una estrategia similar.

Las células hospedadoras transformadas o los cultivos celulares, como se ha descrito anteriormente, pueden analizarse además por hidrólisis de celulosa (por ejemplo, mediante un ensayo de detección de azúcar), para un tipo

11 5

15

25

35

45

55

65

de actividad celulasa particular (por ejemplo, midiendo la actividad de endoglucanasa, celobiohidrolasa o βglucosidasa individual) o para la actividad celulasa total. La actividad de endoglucanasa puede determinarse, por ejemplo, midiendo un aumento de extremos reductores en un sustrato de CMC específico de endoglucanasa. La actividad de celobiohidrolasa puede medirse, por ejemplo, utilizando sustratos celulósicos insolubles tales como la celulosa hinchada con ácido fosfórico (PASC), un sustrato amorfo, o celulosa microcristalina (Avicel) y determinando el grado de hidrólisis del sustrato. La actividad β glucosidasa puede medirse por diversos ensayos, o utilizando, por ejemplo, celobiosa.

Una actividad celulasa total, que incluye a actividad de endoglucanasa, celobiohidrolasa y β-glucosidasa, puede hidrolizar sinérgicamente celulosa cristalina. Por tanto, la actividad celulasa total puede medirse utilizando sustratos insolubles que incluyen sustratos celulósicos puros tales como papel de filtro Whatman No. 1, borra de algodón, celulosa microcristalina, celulosa bacteriana, celulosa de algas y sustratos que contienen celulosa tales como celulosa teñida, alfa-celulosa o lignocelulosa pretratada. La actividad específica de las celulasas también puede detectarse por métodos conocidos por un experto habitual en la técnica, tales como el ensayo con Avicel (descrito anteriormente) que podría normalizarse por la concentración de proteína (celulasa) medida para la muestra.

Por tanto, un aspecto de la invención se refiere a la producción eficiente de celulasas para ayudar en la digestión de celulosa y en la generación de etanol. Una celulasa puede ser cualquier enzima implicada en la digestión, en el metabolismo y/o en la hidrolisis de celulasa, incluyendo una endoglucanasa, una exoglucanasa o una β-glucosidasa.

En realizaciones adicionales, las células hospedadoras transformadas o cultivos celulares se ensayan con respecto a la producción de etanol. La producción de etanol puede medirse por técnicas conocidas por un experto habitual en la materia, por ejemplo, mediante un método convencional de índice refractario por HPLC.

Celulasas heterólogas

De acuerdo con la presente invención, la expresión de celulasas heterólogas en una célula hospedadora puede utilizarse, de manera ventajosa, para producir etanol a partir de fuentes celulósicas. Las celulasas de diversas fuentes pueden expresarse de manera heteróloga para aumentar satisfactoriamente la eficiencia de la producción de etanol. Por ejemplo, las celulasas pueden proceder de fuentes tales como hongos, bacterias, plantas, protozoos o termitas. En algunas realizaciones, la celulasa es una celulasa de H. grisea, T. aurantiacus, T. emersonii, T. reesei,

C. lacteus, C. formosanus, N. takasagoensis, C. acinaciformis, M. darwinensis, N. walkeri, S. fibuligera, C. lucknowens, e R. speratus, Thermobfida fusca, Clostridum thermocellum, Clostridium cellulolyticum, Clostridum josui, Bacillus pumilis, Cellulomonas fimi, Saccharophagus degradans, Piromyces equii, Neocallimastixpatricarum, Aspergillus kawachii, Heterodera schachtii, H. jecorina, Orpinomyces sp., Irpex lacteus, Acremonium thermophilum, Neosartorya fischeri, Chaetomium globosum, Chaetomium thermophilum, Aspergillus fumigatus, Aspergillus terreus, Neurospora Crassa, o de Arabidopsis thaliana.

En algunas realizaciones de la invención, celulasas múltiples de un solo organismo se coexpresan en la misma célula hospedadora. En algunas realizaciones de la invención, celulasas múltiples de diferentes organismos se coexpresan en la misma célula hospedadora. En particular, celulasas de dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o más organismos pueden coexpresarse en la misma célula hospedadora. De manera similar, la invención puede incluir cocultivos de cepas de levadura, en el que las cepas de levadura expresan diferentes celulasas. Los cocultivos pueden incluir cepas de levadura que expresan celulasas heterólogas del mismo organismo o de organismos diferentes. Los cocultivos pueden incluir cepas de levadura que expresen celulasas de dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o más organismos.

Las celulasas de la presente invención incluyen tanto endoglucanasas como exoglucanasas. Las celulasas pueden ser, por ejemplo, endoglucanasas, β-glucosidasas o celobiohidrolasas.

En determinadas realizaciones de la invención, la endoglucanasa(s) puede ser endoglucanasa I o una isoforma, un parálogo u ortólogo de una endoglucanasa II. En algunas realizaciones, la endoglucanasa expresada por las células hospedadoras de la presente invención puede ser una endo-1,4-β-glucanasa recombinante. En realizaciones particulares, la endoglucanasa es una endoglucanasa de T. reesei, C. lacteus, C. formosanus, N. takasagoensis, C. acinaciformis, M. darwinensis, N. walkeri, R. speratus Aspergillus kawachii, Heterodera schachtii, H. jecorina, Orpinomycess, Irpex lacteus, C. lucknowense, C. globosum, Aspergillus terreus, Aspergillus fumigatus, Neurospora crassa o de Acremonium thermophilum. En una realización particular, la endoglucanasa comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de las SEQ ID NO: 30-39 o 52-56, como se muestra en la Tabla 1 a continuación. En determinadas otras realizaciones, la endoglucanasa comprende la secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente 70, aproximadamente 80, aproximadamente 90, aproximadamente 95, aproximadamente 96, aproximadamente 97, aproximadamente 98, aproximadamente 99 o 100% idéntica a una secuencia de aminoácidos seleccionada de las SEQ ID NO: 30-39 o 52-56.

En la práctica, si cualquier polinucleótido es al menos 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% idéntico a un polinucleótido de la presente invención, puede determinarse convencionalmente utilizando programas informáticos conocidos. Los métodos para determinar el porcentaje de identidad, como se indica con más detalle

12 5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

más adelante en relación a la identidad de polinucleótidos, son también relevantes para evaluar la identidad de secuencia del polipéptido.

En una realización particular, la endoglucanasa es una endoglucanasa (“eg1") de Trichoderma reesei. En determinadas realizaciones, la endoglucanasa comprende una secuencia de aminoácidos al menos aproximadamente 70, aproximadamente 80, aproximadamente 90, aproximadamente 95, aproximadamente 96, aproximadamente 97, aproximadamente 98, aproximadamente 99 o 100% idéntica a SEQ ID NO:39.

En otra realización particular, la endoglucanasa es una endoglucanasa de C. formosanus. En determinadas realizaciones, la endoglucanasa comprende una secuencia de aminoácidos al menos aproximadamente 70, aproximadamente 80, aproximadamente 90, aproximadamente 95, aproximadamente 96, aproximadamente 97, aproximadamente 98, aproximadamente 99 o 100% idéntica a SEQ ID NO:31.

En otra realización particular, la endoglucanasa es una endoglucanasa de H. jecorina. En determinadas realizaciones, la endoglucanasa comprende una secuencia de aminoácidos al menos aproximadamente 70, aproximadamente 80, aproximadamente 90, aproximadamente 95, aproximadamente 96, aproximadamente 97, aproximadamente 98, aproximadamente 99 o 100% idéntica a SEQ ID NO:54.

En determinadas realizaciones, la ß-glucosidasa es una ß-glucosidasa I o una isoforma, un parálogo o un ortólogo de ß-glucosidasa II. En determinadas realizaciones de la presente invención, la ß-glucosidasa procede de Saccharomycopsis fibuligera. En realizaciones particulares, la ß-glucosidasa comprende una secuencia de aminoácidos al menos aproximadamente 70, aproximadamente 80, aproximadamente 90, aproximadamente 95, aproximadamente 96, aproximadamente 97, aproximadamente 98, aproximadamente 99, o 100% idéntica a SEQ ID NO:40.

En determinadas realizaciones de la invención, la celobiohidrolasa(s) puede ser una celobiohidrolasa I y/o una isoforma, un parálogo o un ortólogo de celobiohidrolasa II. En una realización particular, la celobiohidrolasa comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de las SEQ ID NO: 21-29 o 46, como se muestra en la siguiente Tabla 1. En realizaciones particulares de la presente invención, la celobiohidrolasa es una celobiohidrolasa I o II de Trichoderma reesei. En otra realización, una celobiohidrolasa comprende una secuencia de al menos aproximadamente 70, aproximadamente 80, aproximadamente 90, aproximadamente 95, aproximadamente 96, aproximadamente 97, aproximadamente 98, aproximadamente 99, o 100% idéntica a SEQ ID NO:27 o SEQ ID NO:28.

En otras realizaciones particulares de la presente invención la celobiohidrolasa es una celobiohidrolasa I o II de T. emersonii. En otra realización, la celobiohidrolasa comprende una secuencia de al menos aproximadamente 70, aproximadamente 80, aproximadamente 90, aproximadamente 95, aproximadamente 96, aproximadamente 97, aproximadamente 98, aproximadamente 99, o 100% idéntica a SEQ ID NO:23 o SEQ ID NO:24.

En otra realización, la celobiohidrolasa de la invención es una celobiohidrolasa de C. lucknowense. En una realización particular, la celobiohidrolasa es celobiohidrolasa Cbh2b de C. lucknowense. En una realización, la celobiohidrolasa comprende una secuencia al menos aproximadamente 70, aproximadamente 80, aproximadamente 90, aproximadamente 95, aproximadamente 96, aproximadamente 97, aproximadamente 98, aproximadamente 99, o 100% idéntica a SEQ ID NO:25.

En algunas realizaciones particulares de la invención, la celulasa comprende una secuencia seleccionada de las secuencias indicadas en la Tabla 1 a continuación. Las celulasas de la invención también incluyen celulasas que comprende una secuencia al menos aproximadamente 70, aproximadamente 80, aproximadamente 90, aproximadamente 95, aproximadamente 96, aproximadamente 97, aproximadamente 98, aproximadamente 99 o 100% idéntica a las secuencias de la Tabla 1.

Algunas realizaciones de la invención incluyen un polipéptido que comprende al menos 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, o 500 o más aminoácidos consecutivos de cualquiera de las SEQ ID NO: 21-40, 46 o 5256, o dominios, fragmentos, variantes o derivados de las mismas.

13

imagen8

14

imagen9

imagen10

16

imagen11

17

imagen12

18

imagen13

imagen14

imagen15

imagen16

imagen17

imagen18

imagen19

imagen20

imagen21

imagen22

imagen23

imagen24

imagen25

imagen26

imagen27

imagen28

imagen29

imagen30

imagen31

imagen32

imagen33

imagen34

imagen35

imagen36

imagen37

imagen38

imagen39

imagen40

imagen41

imagen42

imagen43

imagen44

imagen45

imagen46

imagen47

imagen48

imagen49

imagen50

imagen51

imagen52

imagen53

Muchos organismos presentan un sesgo para el uso de codones particulares para codificar la inserción de un aminoácido particular en una cadena peptídica en crecimiento. La degeneración del código genético permite establecer diferencias de preferencia codónica o sesgo codónico, en el uso de codones entre organismos, y está bien documentada en muchos organismos. El sesgo codónico a menudo se correlaciona con la eficacia de la

5 traducción del ARN mensajero (ARNm) que, a su vez, se piensa que depende, entre otras cosas, de las propiedades de los codones que se están traduciendo y de la disponibilidad de moléculas de ARN de transferencia (ARNt) particulares. La predominancia de los ARNt seleccionados en una célula es generalmente un reflejo de los codones más frecuentemente utilizados en la síntesis peptídica. Por consiguiente, los genes pueden adaptarse para una expresión génica óptima en un organismo determinado basándose en la optimización de los codones.

10 Dado el gran número de secuencias génicas disponibles para una amplia variedad de especies de animales, plantas y microbios, es posible calcular las frecuencias relativas del uso de codones. Las tablas del uso de codones se encuentran fácilmente disponibles, por ejemplo, en la http://phenotype.biosci.umbc.edu/codon/sgd/index.php (visitada el 7 de mayo de 2008) o en la http://www.kazusa.or.jp/codon/ (visitada el 20 de marzo de 2008) y estas

15 tablas pueden adaptarse de diversas maneras. Véase nakamura, Y., et al “Codon usage tabulated from the international DNA sequence databases: status for the year 2000" Nucl. Acids Res. 28:292 (2000). Las tablas del uso de codones para levaduras, calculadas del GenBank Release 128.0 [15 de febrero de 2002], se reproducen en la Tabla 3 más adelante. Esta Tabla utiliza nomenclatura de ARNm, y por tanto en lugar de timina (T) que se encuentra en el ADN, las tablas utilizan uracilo (U) que se encuentra en el ARN. La Tabla se ha adaptado de manera que estas

20 frecuencias se calculan para cada aminoácido, en lugar de para los 64 codones.

Tabla 3: Tabla de uso de codones para genes de Saccharomyces cerevisiae

Aminoácido: Codón Número Frecuencia por ciento

Phe: UUU 170666 26,1

Phe: UUC 120510 18,4

Total

Leu: UUA 170884 26,2

Leu: UUG 177573 27,2

Leu: CUU 80076 12,3

Leu: CUC 35545 5,4

Leu: CUA 87619 13,4

Leu: CUG 68494 10,5

Total

Ile: AUU 196893 30,1

Ile: AUC 112176 17,2

He: AUA 116254 17,8

Total

Met: AUG 136805 20,9

Total

Val: GUU 144243 22,1

Val: GUC 76947 11,8

Val: GUA 76927 11,8

Val: GUG 70337 10,8

Total

60

Aminoácido: Codón Número Frecuencia por ciento

Ser: UCU 153557 23,5

Ser: UCC 92923 14,2

Ser: UCA 122028 18,7

Ser: UCG 55951 8,6

Ser: AGU 92466 14,2

Ser: AGC 63726 9,8

Total

Pro: CCU 88263 13,5

Pro: CCC 44309 6,8

Pro: CCA 119641 18,3

Pro: CCG 34597 5,3

Total

Thr: ACU 132522 20,3

Thr: ACC 83207 12,7

Thr: ACA 116084 17,8

Thr: ACG 52045 8,0

Total

Ala: GCU 138358 21,2

Ala: GCC 82357 12,6

Ala: GCA 105910 16,2

Ala: GCG 40358 6,2

Total

Tyr: UAU 122728 18,8

Tyr: UAC 96596 14,8

Total

His: CAU 89007 13,6

His: CAC 50785 7,8

Total

Gln: CAA 178251 27,3

Gln: CAG 79121 12,1

Total

61 62

Aminoácido: Codón Número Frecuencia por ciento

Asn: AAU 233124 35,7

Asn: AAC 162199 24,8

Total

Lys: AAA 273618 41,9

Lys: AAG 201361 30,8

Total

Asp: GAU 245641 37,6

Asp: GAC 132048 20,2

Total

Glu: GAA 297944 45,6

Glu: GAG 125717 19,2

Total

Cys: UGU 52903 8,1

Cys: UGC 31095 4,8

Total

Trp: UGG 67789 10,4

Total

Arg: CGU 41791 6,4

Arg: CGC 16993 2,6

Arg: CGA 19562 3,0

Arg: CGG 11351 1,7

Arg: AGA 139081 21,3

Arg: AGG 60289 9,2

Total

Gly: GGU 156109 23,9

Gly: GGC 63903 9,8

Gly: GGA 71216 10,9

Gly: GGG 39359 6,0

Total

imagen54

imagen55

imagen56

imagen57

imagen58

imagen59

Plásmido: Genotipo

pRDH104: bla URA3 ENO1P-sTa.cbh1-ENO1T

pRDH105: bla URA3 ENO1P-sT.e.cbh1-ENO1T

pRDH106: bla URA3 ENO1P-sT.e.cbh2-ENO1T

pRDH107: bla URA3 PGK1P-sT.r.cbh2-PGK1T

pRDH108: bla URA3 PGK1P-sT.r.cbh2-PGK1T & ENO1P-sT.e.cbh1-ENO1T

pRDH118: bla URA3 PGK1P-sT.r.cbh2-PGK1T & ENO1P-sH.g.cbh1-ENO1T

pRDH120: bla URA3 PGK1 P-sT.r.cbh2-PGK1T & ENO1P-sTa.cbh1-ENO1mT

pDF1 La Grange et al. (1996): bla furl::LEU2

pCEL5 Den Haan et al. 2007: vector de 2 μm (micrómetros) para la expresión de BGLI S.f. y de EGI T.r. (secuencia nativa)

pMU185: pUG66 (loxp-zeo-loxp)

pKLAC1 New England Biolabs: Vector de expresión de K. lactis para la integración en el locus lac4, selección con acetamida

pRS426: Vector de 2 μm para ligamiento mediado por levadura (YML)

pMU289: pRS426 con parte de pKLAC1 para la inserción de EG1 T.r. (a partir de pBKD_11621, como se detalla en el ejemplo 1) en el locus lac4 creado por YML

pMU291: pRS426 con parte de pKLAC1 para la inserción de CBH2Tr (a partir de pBZD_20641, como se detalla en el ejemplo 1) en el locus lac4 creado por YML

pMU398: ENO1P-sTe.cbh1-ENO1T a partir de pRDH105 en pMU289 (clonación por YML)

pMU451: pRDH105 con enlazador PacI/AscI (formado utilizando cebadores) insertado en EcoRI/XhoI

pMU458: construcción sintética para EG N.f. insertada en su interior

pMU451 (PacI/AscI digerido de ambas partes)

pMU463: TrEG1 a partir de pBKD1-BGLI-sEGI en pMU451 (PacI/AscI digerido de ambas partes)

pMU465: construcción sintética para EG C.I.(a) insertada en pMU451 (PacI/AscI digerido de ambas partes)

pMU469: construcción sintética para EG R.f. insertada en pMU451 (PacI/AscI digerido de ambas partes)

pict471: construcción sintética para EG C.f. insertada en pMU451 (PacI/AscI digerido de ambas partes)

pMU472: construcción sintética para EG N.t. insertada en pMU451 (PacI/AscI digerido de ambas partes)

pMU473: construcción sintética para EG C.a. insertada en eMu451 (PacI/AscI digerido de ambas partes)

pMU475: construcción sintética para CBH2 T.r. derivada de pBKD 20641 con contacto retirado (del ejemplo 1) insertada en pMU451 (PacI/AscI digerido de ambas partes)

pMU499: construcción sintética para EG M.d. insertada en pMU451 (PacI/AscI digerido de ambas partes)

pMU500: construcción sintética para EG R.s insertada en pMU451 (PacI/AscI digerido de ambas partes)

pMU503: construcción sintética para EG N.w. insertada en pMU451 (PacI/AscI digerido de ambas partes)

69 70

Plásmido: Genotipo

pMU624/pMI529: vector de 2 μm para la expresión de CBH1 T.e. con CBD (fragmentos de PCR para enzima quimérica con pRDH105 digerido con PmlI-XhoI)

pMU326: construcción sintética para EG R.s. de Codon Devices

pMU784/pMI574: vector de 2 μm para la expresión de CBH2 C.l.(b) (construcción sintética para) CBH2 C.1.(b) insertada en pMU624 digerido con PacI/AscI)

pMU562: pBKD_2 con loxp-zeo-loxp insertado (Notl digerido de ambas partes)

pMU576: ENOlp-T.r.cbh1-ENO1T (a partir de pMU291) en pMU562 (PacI/AscI digerido de ambas partes)

pMU577: ENOlp-T.e.cbh1-ENO1T en (a partir de pMU398) en pMU562 (PacI/AscI digerido de ambas partes)

emu661: ENOIp-T.r. EG1-ENO1T (a partir de pMU463) en pMU562 (PacI/AscI digerido de ambas partes)

pMU662: ENO1p-C.1.(a) EG1-ENO1T (a partir de pMU465) en pMU562 (PacI/AscI digerido de ambas partes)

pMU663: ENOlp-C.f. EG1-ENO1T (a partir de pMU471) en pMU562 (PacI/AscI digerido de ambas partes)

pMU664: ENO1p-N.t. EG1-ENO1T (a partir de pMU472) en pMU562 (PacI/AscI digerido de ambas partes)

pMU665: ENOlp-C.a. EGI -ENO 1 (a partir de pMU473) en pMU562 (PacI/AscI digerido de ambas partes)

pMU666: ENOlp-T.r.CBH2-ENO1T (a partir de pMU475) en pMU562 (PacI/AscI digerido de ambas partes)

pMU667: ENOlp-M.d.-EG1-ENO1T (a partir de pMU499) en pMU562 (PacI/AscI digerido de ambas partes)

pMU668: ENOlp-N.w.-EG1-ENO1T (a partir de pMU503) en pMU562 (PacI/AscI digerido de ambas partes)

pMU755: ENOlp-T.e.CBHl con/CBD-ENO1T (a partir de pMU624) en pMU562 (PacI/AscI digerido de ambas partes)

pMU750: ENOlp-R.s.-EG2-ENO1T (a partir de pMU326) en pMU562 (PacI/AscI digerido de ambas piezas)

emu809: ENO1p-C.1.(b) CBH2b-ENO1T (a partir de pMU784) en pMU562 (PacI/AscI digerido de ambas partes)

pMU721: pMU562 con el gen hph (marcador de resistencia a higromicina) reemplazando el marcador de zeocina (Notl digerido de ambos fragmentos)

pMU760: ENO 1 p-T.e.CBHl 1 con CBD-ENO 1 a partir de pMU624 en pMU721 (MheI/AscI digerido de ambos fragmentos)

pMU761: ENO1p-T.r.CBH2-ENO1T a partir de pMU291 en pMU721 (PacI/AscI digerido de ambos fragmentos)

pMI553: vector de 2 μm para la expresión de CBH2 T.r. y de CBH1 T.e.+MUC

pMI568: vector de 2 μm para la expresión de EG1 T.r., por favor véase el texto de la descripción de cómo se construyó esta construcción.

pMI574: vector de 2 μm para la expresión de CBH2 C.l.(b)

pMI577: vector de 2 μm para la expresión de CBH2 T.r y de CBH1 H.g.

Plásmido: Genotipo

pMI578: vector de 2 μm para la expresión de CBH2 T.r. y de CBH1 T.e

pMI579: vector de 2 μm para la expresión de CBH2 T.r. y de CBH1 C.l.(b)

pMI580: vector de 2 μm para la expresión de CBH2 C.I.(b) y de CBH1 T.e. +MUC

pMI581: vector de 2 μm para la expresión de CBH2 C.I.(b) y de CBH1 T.e.

pMI582: vector de 2 μm para la expresión de CBH2 C.I.(b) y de CBH1 H.g.

pMI583: vector de 2 μm para la expresión de CBH2 C.I.(b) y de CBH1 C.t.

Abreviaturas: ENO1P/T = promotor/terminador del gen de enolasa 1; PGK1P/T = promotor y terminador del gen de la fosfoglicerato quinasa 1; T.r. = Trichoderma reesei; H.g. = Humicola grisea; T.a. = Thermoascus aurantiacus; T.e. = Talaromyces emersonii, Sf = Saccharomycopsis fibuligera; C.l. (a) = Coptotermes lacteus; C.f. = Coptotermes formosa-nus; N.t. = Nasutitermes takasagoensis; C.a. = Coptotermes acinaciformis; M.d. = Mastotermes darwinensis; N.w. = Nasutitermes walkeri; R.s. = Reticulitermes speratus; C.l. (b) = Chrysosporium lucknowense; N.f. = Neosartorya fischeri; R.f. = Reticulitermes flavipes; C.t. = Chaetomium thermophilum

Tabla 5: cebadores utilizados

sCBHl/2-L

sCBHl-R

sCBH2-R

395 Te cbh1 Sint1 PacI-ATG

398 Te cbh1 núcleo sint SmaI

399Trcbh1 sint MUC5 MlyIHincII

400 Trcbh1 sint MUC AscIXhoI

379 ScPGK1prom -786 SacI+ApaI

380 ScPGK1prom EcoRI-PacI

381 CBH2 WT EcoRI-PacI-ATG

386 CBH2 WT TAA-AscI-EcoRI

10 El vector de expresión de levadura YEpENO-BBH se creó para facilitar la expresión heteróloga bajo el control del promotor y terminador del gen de enolasa 1 (ENO1) de S. cerevisiae. El vector también fue útil porque el casete de expresión de este vector pudo escindirse simplemente utilizando una digestión con BamHI, BglII. YEpENO1 (Den Haan et al., Metabolic Engineering, 9: 87-942007) contiene la estructura YEp352 con las secuencias promotoras y

15 terminadoras del gen de ENO1 clonadas en los sitios BamHI y HindIII. Este plásmido se digirió con BamHI y el saliente se cargó con polimerasa Klenow y con los dNTP para retirar el sitio BamHI. El plásmido volvió a ligarse para generar YEpENO-B. Utilizando el mismo método, los sitios BglII y después HindIII se destruyeron posteriormente para crear el molde YEpENO-BBH. El molde YEpENO-BB se utilizó como molde para una reacción de PCR con los cebadores ENOBB-izquierda (5’-GATCGGATCCCAATTAATGT-GAGTTACCTCA-3’) y ENOBB-derecha (5’

20 GTACAAGCTTAGATCTCCTATGCGGTGTTAGATCTCCTATGCGGTGTGAAATA-3’) en el que el casete ENO1 se amplificó junto con una región flanqueante de 150 pb cadena arriba y de 220 pb cadena abajo. Este producto se digirió con BamHI y HindIII y los salientes se cargaron por tratamiento con polimerasa Klenow y con los dNTP y se clonó entre los dos sitios PvuII en yENO1 reemplazando de un modo eficaz el casete ENO1 original y generando YEpENO-BBH.

25

71

imagen60

imagen61

Nombre: Cepa de fondo Genes expresados y/o inactivados Construcciones

M0249: M0013 Ninguno (control); delta FUR1 pJC1; pDF1

M0265: M0013 CBHIHg; delta FUR1 pRDH103; pDF1

M0266: M0013 CBHITa; delta FUR1 pRDH104; pDF1

M0282: M0248 BGLISf, EGITr, CBH2Tr, CBH1Te; delta FUR1 pBKD1-BGLI-sEGI; pRDH108; pDF1

M0284: M0243 BGLISf, EGITr, CBH2Tr, CBH1Hg; delta FUR1 pBKD1-BGLI-sEGI; pRDH118;pDF1

M0286: M0243 BGLISf, EGITr, CBH2Tr, CBH1Ta; delta FUR1 pBKD1-BGLI-sEGI; pRDH120; pDF1

M0288: M0243 BGLISf, EGITr, CBH2Tr, CBH1Te; delta FUR1 pBKD1-BGLI-sEGI; pRDH108; pDF1

M0289: M0013 CBH2Tr, CBH1Hg; delta FUR1 pRDH118; pDF1

M0291: M0013 CBH2Tr, CBH1Ta; delta FUR1 pRDH120; pDF1

M0358: M0282 BGLISf, EGITr, TrCBH2, CBH1Te; delta FUR1; Trp1; His3 pBKD1-BGLI-sEGI; pRDH108; pDF1

M0359: M0288 BGLISf, EGITr, TrCBH2, CBH1Te; delta FUR1; Trp1; His3 pBKD1-BGLI-sEGI; pRDH108; pDF1

M0361: M0249 Ninguno (control); delta FUR1; Trp1; His3 pJC1; pDF1

M0157: Kluyveromyces marxianus (ATCC N.º 10606) Ninguno Ninguna

M0158: Kluyveromyces lactis (ATCC N.º 34440) Ninguno Ninguna

M0411: M0158 (colonia N.º 1) BGLISf, EGITr pBKD1-BGLI-sEGI;

M0412: M0158 (colonia N.º 2) BGLISf, EGITr pBKD1-BGLI-sEGI;

M0413: M0157 (colonia N.º 1) BGLISf, EGITr pBKD1-BGLI-sEGI;

M0414: M0157 (colonia N.º 2) BGLISf, EGITr pBKD1-BGLI-sEGI;

M0491: M0414 BGLISf, EGITr, TeCBH1, TrCBH2 pBKD1-BGLI-sEGI; pMU576andpMU577

M0599: M0414 BGLISf, EGITr, TeCBH1, TrCBH2 pBKD1-BGLI-sEGI; pMU760 and pMU761

M0600: M0414 BGLISf, EGITr, TeCBH1, TrCBH2 pBKD1-BGLI-sEGI; pMU760 and pMU761

de M0601 a M0604; de M0611 a M0617: M0414 (11 colonias muestran mayor actividad avicelasa) BGLISf, EGITr, C1(a)EG, EGCf, EGNt, EGCa, EGMd, EGNw, EGRs, CBH1Te, CBH1Te+CBD, CBH2Tr, CBH2 C1(b) pBKD1-BGLI-sEGI; pMU663, pMU755, pMU809, pMU576, pMU661, pMU662, pMU664, pMU665, pMU667, pMU668, pMU750, pMU577

de M0618 a M0625: M0157(8 colonias muestran mayor actividad avicelasa) C1(a)EG, EGCf, EGNt, EGCa, EGMd, EGNw, EGRs, CBH1Te, CBH1Te+CBD, CBH2Tr, CBH2 C1(b) pMU663, pMU755, pMU809, pMU576, pMU661, pMU662, pMU664, pMU665, pMU667, pMU668, pMU750, pMU577

yENO1: M0013 ENO1P/T YEpENO-BBH; pDF1

M0419: M0013 ENO1P/T pMU451

M0420: M0013 CBH1Te pMU272

M0423: M0013 EG1Tr pMU463

M0424: M0013 BGL1Sf pMU464

M0426: M0013 EGRf pMU469

M0446: M0013 EG C1(a) pMU465

74

Nombre: Cepa de fondo Genes expresados y/o inactivados Construcciones

M0449: M0013 EGCf pMU471

M0450: M0013 EGNt pMU472

M0460: M0013 EGMd pMU499

M0461: M0013 EGRs pMU500

M0464: M0013 EGNw pMU503

M0476: M0013 EGNf pMU458

Y294/pMI529 fur1Δ: M0013 CBH1Te+MUC pMU624

Y294/pMI553 fur1Δ: M0013 CBH2Tr, CBH1Te+MUC pMI553

Y294/pMI574 fur1Δ: M0013 CBH2C1(b) pMI574

Y294/pMI577 fur1Δ: M0013 CBH2Tr, CBH1Hg pMI577

Y294/pMI578 fur1Δ: M0013 CBH2Tr, CBH1Te pMI578

Y294/pMI579 fur1Δ: M0013 CBH2Tr, CBH1 C1(b) pMI579

Y294/pMI580 fur1Δ: M0013 CBH2 C1(b), CBH1Te+MUC pMI580

Y294/pMI581 fur1Δ: M0013 CBH2 C1(b), CBH1Te pMI581

Y294/pMI582 fur1Δ: M0013 CBH2 C1(b), CBH1Hg pMI582

Y294/pMI583 fur1Δ: M0013 CBH2 C1(b), CBH1 C1(b) pMI583

El plásmido pBKD1-BGL1-sEG1 (pMU276) se digirió con AccI y se transformó en Y294 de S. cerevisiae por electrotransformación para crear una cepa con copias integradas en delta en BGLISf y EGITr, denominada M0243. Después, plásmidos episomales se transformaron en Y294 y/o M0243 de S. cerevisiae.

5 Para crear cepas autoselectivas de S. cerevisiae, es decir, cepas que pueden cultivarse en medio sin requerir presión selectiva para mantener el plásmido episomal, las cepas se transformaron con pDF1 digeridas con NsiI y NcoI y se seleccionaron en placas con SC-ura-leu. Esto condujo a la alteración del gen FUR1 de S. cerevisiae. Se utilizó PCR para confirmar la alteración de FUR1 con los cebadores FUR1-izquierdo (5’

10 ATTTCTTCTTGAACCATGAAC-3’) y FUR1-derecho (5’-CTTAATCAAGACTTCTGTAGCC-3’), donde un tramo de 2568 pb indicó una alteración.

M0282 se creó transformando M0248 con pBKD1-BGLI-sEGI digerido con AccI, como se ha descrito anteriormente, excepto que la mezcla de transformación se esparció sobre la placa que contenía celulosa microcristalina 15 bacteriana, CMCB, con extracto de levadura 10 g/l y peptona 20 g/l.

La presencia de genes integrados se verificó por PCR para colonias para cepas de Kluyveromyces. Las cepas de levadura seleccionadas se volvieron prototróficas por transformacón con productos de PCR para genes para complementar sus auxotrofias.

20 Sustratos celulósicos para ensayos enzimáticos

La celulosa microcristalina bacteriana (CMCB) fue un obsequio de la compañía CP Kelco. La CMCB recibida se agitó durante una noche a 4 ºC en agua. Después de rehidratar el sustrato, se lavó 6 veces con agua y se resuspendió en 25 agua. El peso seco del sustrato se midió secando las muestras a 105 ºC hasta que se obtuvo un peso constante.

Se usó Avicel PH105 (FMC Biopolymers) proporcionado tal cual por el fabricante.

Se generaron maderas duras mixtas pretratadas por autohidrólisis del sustrato a 160 PSI durante 10 minutos. El

30 material pretratado se lavó 5 veces para retirar inhibidores y azúcares solubles y se resuspendió en agua destilada. Las muestras se secaron durante una noche a 105 ºC para determinar el peso seco. El análisis del contenido de azúcar por sacarificación cuantitativa mostró un contenido de glucano de 50 %.

75

imagen62

imagen63

imagen64

imagen65

imagen66

imagen67

imagen68

imagen69

imagen70

imagen71

suministraron a cinco momentos (0, 3, 6, 24 y 48 horas) en suministros del mismo tamaño de TS al 3,6 %. MO1360 se creó a partir de M1254 utilizando las condiciones progresivas descritas en la Tabla 12 siguiente. Tabla 12: Condiciones para generar M1360 a partir de M1254.

Cepa(s) precursora(s): Condición progresiva Nueva Cepa

M1254: Complejo con bajo contenido de xilosa + acetato 8 g/l, pH 5,4, 40 ºC M1339

M1339: Complejo de xilosa + mezcla de inhibidor sintético (incluyendo acetato 8 g/l), pH 5,4, 40 ºC M1360

M1360, aunque aun sustancialmente inhibida por la mezcla de inhibidor sintético, crecía a 40 ºC con un tiempo de generación de aproximadamente 5 horas. Figura 25. En un medio industrialmente relevante, M1360 puede generar

10 más de 60 g/l de etanol a partir de glucosa junto con 5 g/l de peso seco de células en 48 horas a 40 ºC comenzando solo con 60 mg/l de peso seco de células. Figura 26.

Se sabe que la actividad enzimática aumenta a medida que aumenta la temperatura, y por eso es deseable tener cepas de S. cerevisiae termotolerantes. La Figura 27 muestra tres SFS equivalentes con sólidos de madera dura

15 pretratada, PHW, cargados al 18 %. Las reacciones realizadas a 40 ºC muestran aproximadamente un 17 % más de etanol producido en comparación con la reacción de control realizada a 35 ºC, cuando ambas reacciones se realizaron a la misma carga enzimática externa (4 mg/g). Este comportamiento aumentado representa un ahorro sustancial del proceso.

20 Ejemplo 15: expresión de celulasas en una cepa fuerte que utiliza xilosa

M1088 puede secretar tres enzimas celulolíticas distintas: β glucosidasa de S. fibuligera (BGLSf), celobiohidrolasa 2b de C. lucknowense (CBH2b C1) y celobiohidrolasa I de T. emersonii fusionada al dominio de unión de celulosa de celobiohidrolasa I de T. reesei (CBH1Te + CBDCBH1Tr). El genoma de M1088 también contiene genes que

25 codifican polipéptidos que pueden proporcionar resistencia a los siguientes antibióticos: kanamicina, nourseotricina e higromicina B. El plásmido pMU624, que también está presente en M1088, contiene un gen que codifica un polipéptido que puede proporcionar resistencia a ampicilina. Las etapas que se utilizaron para generar M1088 y M0963 a partir de M0509 se resumen en la Tabla 13 siguiente.

30 Tabla 13: cepas utilizadas para generar las cepas M1088 y M0963

Cepa: Genotipo Precursor Descripción

M0509: gre3::loxP/gre3::loxP TAL1+/loxP-PTPI-TAL1 RKI1+/loxP-PTPI-RKI1 RPE1+/loxP-PTPI-RPE1 TKL+/loxP-PTPI-TKL delta::PTPI-xylA PADH1XKS::delta

M0539: URA-3/ura-3::kanMX gre3::loxP/gre3::loxP TAL1+/1oxP-PTPI-TAL1 RKI1+/loxP-PTPI-RKI1 RPE1+/loxP-PTPI-RPE1 TKL+/loxP-PTPI-TKL delta::PTPI-xylA PADH1-XKS::delta M0509 Una sola copia del gen URA-3 genómico se delecionó y se reemplazó con un casete kanMX. El casete genico KanMX proporciona resistencia a kanamicina (un antibiótico aminoglucósido).

M0544: ura-3::kanMX/ura-3::kanMX gre3::loxP/gre3::loxP TAL1+/loxP-PTPI-TAL1 RKI1+/loxP-PTPI-RKI1 RPE1+/loxP-PTPI-RPE1 M0539 La segunda copia del gen URA-3 genómico se delecionó y se reemplazó con un casete kanMX.

TKL+/loxP-PTPI-TKL delta::PTPI-xylA PADH1XKS::delta

M0749: ura-3::kanMX/ura-3::kanMX gre3::loxPIgre3::loxP TAL1+/loxP-PTPI-TAL1 RKI1+/loxP-PTPI-RK11 RPE1 +loxP-PTPI-RPE1 TKL+/loxP-PTPI-TKL delta::PTPI-xylA PADH1-XKS::delta (pMU782)fur1::nat M0544 Una sola copia del gen FUR-1 genómico se delecionó y reemplazó con un casete nat1 de Streptomyces noursei. El casete del gen nat1 proporciona resistencia al antibiótico nourseotricina/clonNAT (un antibiótico aminoglucósido).

M0867: FUR-1/fur-1::nat ura-3::kanMX/ura-3::kanMX gre3::loxP/gre3::loxP TAL1+/loxP-PTPI-TAL1 RKI1+/loxP-PTPI-RKI1 RPE1 +/loxP-PTPI-RPE1 TKL+/loxP-PTPI-TKL delta::PTPI-xylA PADH1XKS::delta (pMU782)fur1::nat; [pMU624] M0749 El plásmido pMU624 se transformó en la cepa. pMU624 puede replicarse en S. cerevisiae (ori 2 micrómetros y URA-3) y E. coli (ori pBMR y gen de resistencia a ampicilina: antibiótico beta lactámico). pMU624 también lleva el gen CBH1 de

86

Cepa: Genotipo Precursor Descripción

T.emersonii+CBDCBH1Tr regulado por el promotor y terminador ENO1.

M0759: fur-1::hyg/fur-1::nat ura-3::kanMX/ura-3::kanMX gre3::loxP/gre3::loxP TAL1+/loxP-PTPI-TAL1RKI1+/loxP-PTPI-RKI1 RPE1+/loxP-PTPI-RPE1 TKL+/loxP-PTPI-TKL delta::PTPI-xylA PADH1-XKS::delta (pMU782) fur1::nat; [pMU624]; (pMU1037) fur1::hyg M0867 La segunda copia del gen FUR-1 genómico se delecionó y se reemplazó con un casete hygMX. El casete del gen hygMX codifica una higromicina B fosfotransferasa que confiere resistencia a higromicina B (un antibiótico aminoglucósido).

M1088: fur-1::hyg/fur-1::nat ura-3::kanMX/ura-3::kanMX gre3::loxPIgre3::loxP TAL1+/loxP-PTPI-TAL1 RKI1+/loxP-PTPI-RKI1 RPE1 +/loxP-PTPI-RPE1 TKL+/loxP-PTPI-TKL delta::PTPI-xylA PADH1XKS::delta [pMU624] (pMU1260) delta::PGKprom-SfBGL-PGKterm, ENO1prom-TeCBH+TrCBD-ENO1term (pMU1169) delta::PGKprom-SfBGL-PGKterm, ENO1prom-ClCBH2-ENO1term M0759 Dos casetes de integración distintos se transformaron en la cepa y se integraron múltiples copias en el genoma en el sitio delta. Un casete contenía los genes celulolíticos BGL de S. fibuligeria y CBH2b de C. lucknowense. El otro casete contenía los genes celulolíticos BGL de S. fibuligeria y CBH1 quimérica de T. emersonii.

M0963: fur-1::hyg/fur-1::nat ura-3::kanMX/ura-3::kanMX gre3::loxP/gre3::loxP TAL1+/loxP-PTPI-TAL1 RKI1+/loxP-PTPI-RKI1 RPE1+/loxP-PTPI-RPE1 TKL+/loxP-PTPI-TKL delta::PTPI-xylA PADH1XKS::delta M0759 El ADN lineal de los 4 plásmidos mostrados se transformó en M0759. 24 de las colonias resultantes se cultivaron después en pases durante una semana en medio YPD que contenían zeocina a bajo nivel (50 ug/ml) y se sometió a ensayo. La cepa resultante M0963 fue la mejor de las

(pMU782) fur1::nat; [pMU624]; (pMU1037) fur1::hyg; (pMU755) delta::ZeoMX, ENO1prom-TeCBH1w/TrCBD-ENO1term; (pMU809) delta::ZeoMX, ENO1prom-C1CBH2b-ENO1term; (pMU663) delta::ZeoMX, ENO1prom-CfEG-ENO1term; (pMU864) delta::ZeoMX, ENO1promSfBGL-ENO1term: encontradas en el ensayo con avicel.

Ejemplo 16: selección de una endogluconasa para la expresión en una cepa fuerte que utiliza xilosa

Las endoglucanasas aumentan la actividad de las celobiohidrolasas, y por lo tanto, se investigó la capacidad de

5 endoglucanasas de 5 familias para complementar la CBH1 y CBH2 previamente identificadas. Se seleccionaron cinco endoglucanas de cinco familias y se clonaron y clonaron bajo el control del promotor/terminador ENO1 utilizando el plásmido de expresión pRDH122 como se muestra en la Tabla 14.

Tabla 14: endoglucanasas de 5 familias expresadas en S. cerevisiae. 10

Organismo y gen:: Domino del Módulo de Unión a Celulosa, MUC: Plásmido expresión: de Tamaño teórico de la enzima Da*

Aspergillus kawachii egA: MUC1 C terminal pRDH145 55034,58

Heterodera schachtii eng1: MUC2 C terminal pRDH146 43739,46

Hypocrea jecorina (anamorfo: reesei) eg2: Trichoderma MUC1 N terminal pRDH147 44226,91

Orpinomyces sp.PC-2 celB: MUC10 2x C terminal pRDH148 53103,40

Irpex lacteus en1: MUC1 N terminal pRDH149 42357,15

Todos los plásmidos que expresaban las 5 nuevas celulasas de tipo EG2 se transformaron en Y294 (una cepa de 87

imagen72

Tabla 15: cepas de levaduras que expresan endogluconasa.

Cepa: Genotipo Precursor Descripción

M1403: (pMU1339) delta::MET3prom-SfBGL-PGKterm, ENO1prom-TeCBH1+TrCBD-ENO1term (pMU1260) delta::PGKprom-SfBGL-PGKterm, ENO1prom-TeCBH+TrCBD-ENO1term (pMU1169) delta::PGKprom-SfBGL-PGKterm, ENO1prom-ClCBH2-ENO1term (pMU1409) rDNA::ZeoMX, EN01promHjEG2-ENO1term M1254 Casetes de ADN lineales creados por digestiones de restricción de plásmidos se integraron en múltiples copias en el genoma en los sitios Ty1 delta y en sitios de ADNr.

M0991: gre3::loxP/gre3::loxP TAL1+/loxP-PTPI-TAL1 RKI1+/loxP-PTPI-RKI1 RPE1 +/loxP-PTPI-RPE1 TKL+/loxP-PTPI-TKL delta::PTPI-xylA PTPI-XKS LEU2/leu2D::hph M0509 Una sola copia del gen LEU-2 genómico se delecionó y se reemplazó con un casete hygMX.

M0992: gre3::IoxP/gre3::loxP TAL1+/loxP-PTPI-TAL1 RKI1+/loxP-PTPI-RK11 RPE1 +loxP-PTPI-RPE1 TKL+/loxP-PTPI-TKL delta::PTPI-xylA PTPI-XKS leu2D::hph/ leu2D::nat M0991 La segunda copia del gen LEU-2 genómico se delecionó y reemplazó con un casete nat1 de Streptomyces noursei.

M1162: gre3::loxP/gre3::loxP TAL1+/loxP-PTPI-TAL1 RKI1+/loxP-PTPI-RKI1 RPE1+loxP-PTPI-RPE1 TKL+/loxP-PTPI-TKL delta::PTPI xylA PTPI-XKS leu2D::hph/ leu2D::nat (pMU1379) delta::leu219, ENO1prom-TeCBH+TrCBD-ENOl term M0992 Un casete de ADN lineal creado por digestiones de restricción del plásmido pMU1379 se integró en múltiples copias en el genoma en los sitios Ty1 delta.

M1284: gre3::loxP/gre3::loxP TALI+/loxP-PTPI-TAL1 RKl1+/loxP-PTPI-RKI1 RPE1+loxP-PTPI-RPE1 TKL+/loxP-PTPI-TKL delta::PTPI-xylA PTPI-XKS leu2D::hph/ leu2D::nat (pMU1379) delta::leu2-19, ENO1prom-TeCBH+TrCBD-ENO1term (pMU1169) delta::PGKprom-SfBGL-PGKterm, ENO1prom-ClCBH2-ENO1term (pMU1409)rDNA::ZeoMX, ENO1promHjEG2-ENO1term M1162 Casetes de ADN lineales creados por digestiones de restricción de los plásmidos pMLT1169 y pMU1409 se integraron en múltiples copias en el genoma en los sitios Ty1 delta y en sitios de ADNr.

Ejemplo 18: Conversión de sustratos lignocelulósicos mediante cepas de levadura CBP

5 La expresión de celulasas en levaduras, particularmente CBH1 (CBH1 de T. emersonii con el CBD de T. reesei unido), CBH2 (CBH2b de C. lucknowense), EG2 (EG2 de T. reesei) y BGL (BGL de S. fibuligera) reduce drásticamente la necesidad de añadir externamente enzimas durante la conversión enzimática de lignocelulosa a etanol. Para ensayar el efecto de sobreexpresión de estas enzimas, se construyeron diversas cepas y se ensayaron en diversos sustratos.

10 La Figura 33 presenta datos de una fermentación con BPC (bioprocesamiento consolidado) en lodo de papel mediante una cepa hospedadora de S. cerevisiae termotolerante modificada por ingeniería genética (cepa precursora M1254, derivado celulolítico M1403). Los datos para M1254 en solitario demuestran que se requiere la adición de celulasa (es decir, zoomerasa) para la producción de etanol a partir de lodo de papel. Los datos para

15 M1430 donde no se añadía celulasa externa (cuadrados color naranja), demuestran que esta cepa puede convertir una fracción sustancial (~80 %) del sustrato “convertible” debido a sus celulasas expresadas. Las fermentaciones con celulasa externa adicional añadida a la cepa M1403, demuestran el extremo potencial de conversión enzimática para el sustrato de lodo de papel. Inspecciones visuales demuestran que la cepa sin BPC no pudo licuar el sustrato, mientras que sí podía la cepa con BPC.

20 Además, la cepa M1179 con BPC, que expresaba CBH1, CBH2, EG2 y BGL, podía convertir lodo de papel a un mayor grado sin enzima celulasa añadida. Figura 34. En esta reacción, la cepa de control M0509, fabricó solamente una pequeña cantidad de etanol durante esta reacción. Los datos también muestran que M1179 puede convertir este material cuando se carga a una densidad celular más baja (1 g/l) a diferencia de cuando se carga una densidad

25 celular más alta (10 g/l) utilizada en otras reacciones. Esto implica que la cepa puede cultivarse y producir celulasa durante los experimentos de fermentación.

La madera dura pretratada (PHW) también puede convertirse por cepas mediante BPC. La Figura 35 muestra el efecto del uso de una cepa que expresa celulasa (M0963) en comparación con una cepa de control que no expresa

30 celulasa (M0509) durante la fermentación de PHW. La comparación demuestra que la cepa con BPC puede obtener la misma producción de etanol a partir de PHW cuando solamente se cargan 2 mg/g de enzima externa en comparación con cuando se cargan 4 mg/g de M0509 en el proceso. Esta doble reducción en cuanto a la necesidad de enzima externa representa un gran potencial de reducción de costes en el proceso.

35 Las cepas de BPC pueden producir también altas cantidades de etanol a partir de PHW. La Figura 36 muestra que

89

Claims

imagen1

imagen2