ES2837856T3

ES2837856T3 - Moléculas efectoras quiméricas etiquetadas y receptores de las mismas

Info

Publication number: ES2837856T3
Application number: ES14830770T
Authority: ES
Inventors: Stanley Riddell; Lingfeng Liu
Original assignee: Fred Hutchinson Cancer Research Center
Current assignee: Fred Hutchinson Cancer Center
Priority date: 2013-12-20
Filing date: 2014-12-22
Publication date: 2021-07-01
Anticipated expiration: 2034-12-22
Also published as: LT3083671T; HUE052573T2; JP2022176327A; CY1123747T1; PT3083671T; US20170267756A1; AU2014368892A1; JP2021164482A; KR20160101947A; WO2015095895A8; MY178233A; US11046766B2; BR112016014156A2; WO2015095895A1; NZ759969A; US11993652B2; KR102483822B1; JP2019083821A; NZ720520A; RU2016129045A

Abstract

Proteína de fusión de cadena sencilla, que comprende una porción hidrófoba dispuesta entre un componente extracelular y un componente intracelular, en la que el componente extracelular comprende una pluralidad de casetes de etiqueta y una región conectora que comprende una bisagra, en la que el componente intracelular comprende un dominio efector, y en la que cada una de la pluralidad de casetes de etiqueta comprende una Strep tag, en la que cada Strep tag tiene estreptavidina, StrepTactin o ambas como pareja de unión relacionada.

Description

DESCRIPCIÓN

Moléculas efectoras quiméricas etiquetadas y receptores de las mismas

Declaración de interés del gobierno

Esta invención se realizó con el apoyo del gobierno bajo la subvención/contrato n.° CA136551 otorgado por los Institutos Nacionales de Salud. El gobierno tiene determinados derechos sobre esta invención.

Declaración sobre la lista de secuencias

La lista de secuencias asociada con esta solicitud se proporciona en formato de texto en lugar de una copia en papel, y por el presente documento forma parte de la memoria descriptiva. El nombre del archivo de texto que contiene la lista de secuencias es 360056_426WO_SEQUENCE_LISTING.txt. El archivo de texto pesa 32,3 KB, se creó el 22 de diciembre de 2014 y se presenta electrónicamente a través de EFS-Web.

Antecedentes

Campo técnico

La presente divulgación se refiere a proteínas de fusión que contienen un casete de etiqueta y, más particularmente, a moléculas efectoras quiméricas etiquetadas (Key-ChEM) y a moléculas de receptor de antígeno quimérico etiquetadas (T-ChARM), y a células huésped recombinantes que producen tales proteínas de fusión, en las que las células huésped recombinantes pueden identificarse, aislarse, clasificarse, inducirse a proliferar, rastrearse, eliminarse y/o usarse como tratamiento terapéutico (por ejemplo, en inmunoterapia adoptiva).

Descripción de la técnica relacionada

Las inmunoterapias basadas en células T comenzaron a desarrollarse cuando se encontraron células T reactivas a tumores entre una población de linfocitos infiltrantes de tumor (TIL) (Clark et al., Cancer Res. 29: 705, 1969). Una estrategia, conocida como transferencia adoptiva de células T, implica el aislamiento de linfocitos infiltrantes de tumor preseleccionados para reactividad tumoral, la expansión clonal de células T reactivas a tumores inducida por anticuerpos anti-CD3 y anti-CD28 en presencia de IL-2 y finalmente la infusión de la población celular expandida de nuevo al paciente que porta el tumor (junto con quimioterapia y administración repetida de IL-2) (Dudley et al., Science 298: 850, 2002). Esta forma de terapia adoptiva de células T con linfocitos infiltrantes de tumor es técnicamente complicada y conduce a una remisión completa en sólo una pequeña fracción de los pacientes con melanoma y rara vez es eficaz en otros cánceres (Besser et al., Clin. Cancer Res. 16: 2646, 2010).

El aislamiento de clones de células T reactivas a tumores condujo al desarrollo de otro enfoque inmunoterapéutico: la generación de receptores de células T (TCR) recombinantes específicos para antígenos particulares, que se introducen en células T usando un sistema de administración de vectores para conferir especificidad para un péptido asociado a tumor presentado por una molécula de CMH expresada en una célula tumoral. Un enfoque similar introduce un receptor sintético, denominado receptor de antígeno quimérico (CAR), que contiene un dominio de unión a antígeno que, por ejemplo, en el contexto de la terapia antitumoral, puede unirse a un antígeno asociado o específico de tumor, unido a uno o más componentes intracelulares que comprenden dominios efectores, tales como un TCR y/o dominios de señalización coestimuladores. A diferencia de los TIL, el procedimiento básico para la inmunoterapia de células T con TCR o CAR es modificar genéticamente las células T humanas con un transgén que codifica para un resto de direccionamiento tumoral, expandir ex vivo las células T recombinantes y transfundir las células T recombinantes expandidas de nuevo a los pacientes. En el caso de la terapia adoptiva de células T con CAR, la composición de la estructura de CAR sintético, así como la calidad y pureza de las células T modificadas genéticamente, determinarán la eficacia terapéutica contra los tumores in vivo. No obstante, existen desafíos para expandir y seleccionar las poblaciones de células recombinantes, así como para asegurarse de que las células sean lo suficientemente eficaces y específicas in vivo para evitar efectos secundarios autoinmuntarios graves.

Actualmente, existe una necesidad en el campo de la inmunoterapia de composiciones y métodos para identificar, aislar/clasificar eficazmente, expandir selectivamente, rastrear in vivo y controlar o eliminar células modificadas por ingeniería genética, tales como células inmunitarias modificadas por ingeniería genética (por ejemplo, células T).

Bowdish y Gordon, 2009. Immunol Rev. 227 (1): 19-31 describen la reclasificación de receptores eliminadores de clase A basándose en descubrimientos recientes.

Jensen y Riddell, 2014. Immunol Rev. 257 (1): 127-44 es un artículo de revisión que analiza temas de investigación que se centran en el diseño y la implementación de la terapia adoptiva de células T con células T modificadas con CAR.

El documento WO 2008/045437 A2 describe ácidos nucleicos, vectores y células asociados con la producción de una proteína de membrana quimérica, así como métodos para tratar tumores que portan EGFRvIlI, un receptor del factor de crecimiento epidérmico mutante.

Darcy et al., 1998. Eur J Immunol. 28 (5): 1663-72 describen la expresión de un receptor quimérico que consiste en los dominios variables de cadena sencilla del AcM del antígeno embrionario anti-carcinoma unido a una cadena del receptor Fcgamma mediante una bisagra de CD8 en una línea celular de hibridoma de linfocitos T citotóxicos de ratón MD45.

Dotti et al., 2014. Immunol Rev. 257 (1): 107-26 es un artículo de revisión que describe los diseños básicos de los CAR, cómo se seleccionan las dianas antigénicas y la experiencia clínica inicial con las células T con CAR.

El documento WO 2013/123061 A1 se refiere a un receptor de antígeno quimérico biespecífico, que comprende: (a) al menos dos regiones de direccionamiento específicas de antígeno; (b) un dominio espaciador extracelular; (c) un dominio transmembrana; (d) al menos un dominio coestimulador; y (e) un dominio de señalización intracelular, en el que cada región de direccionamiento específica de antígeno comprende un fragmento Fv de cadena sencilla específico de antígeno y se une a un antígeno diferente, y en el que el receptor de antígeno quimérico biespecífico se expresa conjuntamente con un control terapéutico.

El documento WO 2011/041093 A1 describe CAR que comprenden un dominio de unión a antígeno de un anticuerpo KDR-1121 o DC101, un dominio bisagra extracelular, un dominio transmembrana de receptor de células T y un dominio de señalización de receptor de células T de dominio intracelular.

El documento WO 2012/127464 A2 describe proteínas quiméricas que comprenden TLR4 constitutivamente activo, un miembro constitutivamente activo del receptor coestimulador de células T de la familia del receptor del factor de necrosis tumoral o una citocina unida a la membrana.

El documento WO 2013/044225 A1 describe células T recombinantes que expresan un receptor inmunitario universal que comprende un dominio de unión a marcador extracelular, un dominio transmembrana y un dominio citoplásmico.

Liu et al., 2014. Molecular therapy. 22: S164 (https://doi.org/10.1016/S1525-0016(16)35441-7) describen un CAR multifuncional que incorpora una o más secuencias de StrepTag II (ST II) de 8 aminoácidos en la porción extracelular del CAR (Tag/CAR), y demostraron que estas secuencias permiten la selección in vitro, la activación/expansión y el rastreo in vivo de células T CAR+ usando StrepTactin o fluoróforos o perlas marcados con AcM anti-STII.

En Hudeck et al., 2015. Cancer Immunol Res. 3 (2): 125-35, los autores analizan la influencia de la longitud y la composición de los dominios espaciadores extracelulares derivados de IgG sobre la función de los CAR.

Breve sumario

La presente invención proporciona una proteína de fusión de cadena sencilla, que comprende una porción hidrófoba dispuesta entre un componente extracelular y un componente intracelular, en la que el componente extracelular comprende una pluralidad de casetes de etiqueta y una región conectora que comprende una bisagra, en la que el componente intracelular comprende un dominio efector, y en la que cada uno de la pluralidad de casetes de etiqueta comprende una Strep tag, en la que cada Strep tag tiene estreptavidina, StrepTactin o ambas como pareja de unión relacionada.

La presente invención también proporciona una molécula de ácido nucleico que codifica para una proteína de fusión según la presente invención.

La presente invención también proporciona un vector que comprende las moléculas de ácido nucleico de la presente invención.

La presente invención también proporciona una célula huésped que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica para una proteína de fusión según la presente invención. La presente invención también proporciona una composición farmacéutica que comprende la célula huésped de la presente invención y un portador, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable.

La presente invención proporciona la célula huésped de la presente invención para su uso en el tratamiento de una enfermedad o un estado. La presente invención también proporciona la célula huésped de la presente invención para su uso en un método para agotar células para el tratamiento de cáncer o una enfermedad infecciosa, que comprende poner en contacto una célula que comprende una molécula de ácido nucleico de la presente invención o la proteína de fusión de la presente invención con un dominio de unión específico para el casete de etiqueta, en el que la unión del dominio de unión específico para el casete de etiqueta conduce a la muerte celular de las células huésped que expresan la proteína de fusión.

La presente invención también proporciona un método in vitro para activar una célula, que comprende poner en contacto una célula que comprende una proteína de fusión según la presente invención y/o la molécula de ácido nucleico de la presente invención con un dominio de unión específico para uno o más de los uno o más casetes de etiqueta.

La presente invención también proporciona un método in vitro para fomentar la proliferación celular, que comprende poner en contacto una célula no natural que comprende una proteína de fusión de la presente invención y/o la molécula de ácido nucleico de la presente invención con un dominio de unión específico para uno o más de los uno o más casetes de etiqueta y una citocina de factor de crecimiento durante un tiempo suficiente para permitir el crecimiento celular.

La presente invención también proporciona un método in vitro para identificar una célula, comprendiendo el método: poner en contacto una muestra que comprende una célula que comprende una proteína de fusión de la presente invención y/o la molécula de ácido nucleico de la presente invención con un dominio de unión específico para uno o más de uno o más casetes de etiqueta, en los que el dominio de unión específico para el casete de etiqueta comprende un resto detectable, y detectar la presencia de la célula en la muestra.

La presente invención también proporciona un método in vitro para clasificar o seleccionar una célula o población de células, comprendiendo el método: poner en contacto una muestra que comprende una célula T que comprende una proteína de fusión de la presente invención y/o la molécula de ácido nucleico de la presente invención, con un dominio de unión específico para uno o más de uno o más casetes de etiqueta, y seleccionar o separar de otras células la(s) célula(s) que se une(n) específicamente mediante el dominio de unión, seleccionando o separando de ese modo de otras células la célula o población de células.

La presente invención también proporciona un método in vitro para enriquecer o aislar una célula o población de la misma, comprendiendo el método poner en contacto una muestra que comprende la célula que comprende la molécula de ácido nucleico de la presente invención y/o la proteína de fusión de la presente invención con un dominio de unión específico para uno o más del uno o más casetes de etiqueta, y el enriquecer o aislar la célula de otras células que no expresan la proteína de fusión o el receptor en la muestra.

En las reivindicaciones se proporcionan aspectos adicionales de la invención.

En determinados aspectos, la presente divulgación se refiere a una proteína de fusión de cadena sencilla, que comprende un componente extracelular y un componente intracelular conectados mediante una porción hidrófoba, en la que el componente extracelular comprende un dominio de unión que se une específicamente a una diana, un casete de etiqueta y una región conectora que comprende una bisagra, y en la que el componente intracelular comprende un dominio efector.

En algunos aspectos, la presente divulgación se refiere a una molécula de receptor de antígeno quimérico, que comprende una proteína de fusión que tiene uno o más casetes de etiqueta extracelulares (a) ubicados en el extremo amino-terminal de un dominio de unión extracelular, (b) incrustados dentro de un domino de unión extracelular o (c) dispuestos entre y conectando un dominio de unión extracelular y un componente intracelular que comprende un dominio efector.

En aspectos adicionales, la presente divulgación se refiere a una proteína de fusión de cadena sencilla, que comprende una porción hidrófoba dispuesta entre y conectando un componente extracelular y un componente intracelular, en la que el componente extracelular comprende un casete de etiqueta y una región conectora que comprende una bisagra, y en la que el componente intracelular comprende un dominio efector.

En todavía aspectos adicionales, la presente divulgación se refiere a un método para activar una célula, tal como una célula T (por ejemplo, una célula T no natural), que comprende poner en contacto una célula con un dominio de unión específico para un casete de etiqueta, en el que la célula comprende una molécula de ácido nucleico que codifica para una proteína de fusión según esta divulgación y el dominio de unión específico para el casete de etiqueta se une a una superficie sólida.

En aún aspectos adicionales, la presente divulgación se refiere a un método para fomentar la proliferación celular, tal como la proliferación de células T, que comprende poner en contacto una célula (por ejemplo, una célula T no natural) con un dominio de unión específico para un casete de etiqueta y una citocina de factor de crecimiento durante un tiempo suficiente para permitir el crecimiento celular, en el que la célula comprende una molécula de ácido nucleico que codifica para una proteína de fusión según esta divulgación y el dominio de unión específico para el casete de etiqueta se une a una superficie sólida.

En otros determinados aspectos, la presente divulgación se refiere a un método para identificar una célula, tal como una célula T, que comprende poner en contacto una muestra que comprende una célula, tal como una célula T (por ejemplo, una célula T no natural), con un dominio de unión específico para un casete de etiqueta, en el que la célula comprende una molécula de ácido nucleico que codifica para una proteína de fusión según esta divulgación y el dominio de unión específico para el casete de etiqueta comprende un resto detectable, y detectar la presencia de la célula que expresa un proteína de fusión en la muestra.

En determinados aspectos adicionales, la presente divulgación se refiere a un método para clasificar una célula T, que comprende poner en contacto una muestra que comprende una célula T no natural con un dominio de unión específico para un casete de etiqueta, en el que la célula T no natural comprende una molécula de ácido nucleico que codifica para una proteína de fusión según esta divulgación y el dominio de unión específico para el casete de etiqueta comprende un resto detectable, y separar la célula T no natural que expresa una proteína de fusión de otras células que no expresan una proteína de fusión en la muestra.

En determinados aspectos, la presente divulgación se refiere a un método para enriquecer o aislar una célula T, que comprende poner en contacto una muestra que comprende una célula T no natural con un dominio de unión específico para un casete de etiqueta, en el que la célula T no natural comprende la molécula de ácido nucleico que codifica para una proteína de fusión según esta divulgación y el dominio de unión específico para el casete de etiqueta comprende un resto detectable, y enriquecer o aislar la célula T no natural que expresa una proteína de fusión de otras células que no expresan una proteína de fusión en la muestra.

En aspectos adicionales, la presente divulgación se refiere a un método para agotar determinadas células T, que comprende poner en contacto una célula T no natural con un dominio de unión específico para un casete de etiqueta, en el que la célula T no natural comprende una molécula de ácido nucleico que codifica para un proteína de fusión según esta divulgación, y en la que la unión del dominio de unión específico para el casete de etiqueta conduce a la muerte celular de las células T que expresan una proteína de fusión.

Estos y otros aspectos de la presente divulgación resultarán evidentes con referencia a la siguiente descripción detallada y los dibujos adjuntos.

Breve descripción de los dibujos

Las figuras 1A - 1H muestran ilustraciones de diversas moléculas efectoras quiméricas de cadena sencilla que contienen uno o más casetes de etiqueta de afinidad (A-D, denominadas en el presente documento Key-ChEM) y que contienen opcionalmente uno o más dominios de unión específicos (E-G, denominadas en el presente documento T-ChARM). Las ChEM y ChARM de cadena sencilla contienen un dominio intracelular. Los casetes de etiqueta pueden ser cualquier tipo de etiqueta de afinidad, tal como Strep tag® II (SEQ ID NO.:1), etiqueta Myc (SEQ ID n O.:7), etiqueta V5 (SEQ ID ⁿO.:8), etiqueta Flag® (SEQ ID NO.:3), etiqueta His u otros péptidos o moléculas, que se reconocen por una pareja de unión relacionada no endógena (por ejemplo, receptor, proteína, anticuerpo). Tal como se muestra, una Key-ChEM puede contener (A, B) un casete de etiqueta, (C) dos casetes de etiqueta (Key-ChEM2), (D) tres casetes de etiqueta (Key-ChEM3) o más. Además, las moléculas quiméricas pueden tener múltiples dominios efectores (por ejemplo, las moléculas de A y C-G tienen dos, mientras que la molécula que se muestra en B tiene tres dominios efectores), y los casetes de etiqueta pueden colocarse en diversas áreas diferentes de una molécula Key-ChEM o T-ChARM. En estos ejemplos particulares, las T-ChARM tienen un casete de etiqueta ubicado entre el dominio de unión específico y el dominio efector (E), en el extremo distal (por ejemplo, extremo amino-terminal) del dominio de unión específico (F), integrado dentro del dominio de unión específico (G) (por ejemplo, ubicado dentro del ligador flexible entre las cadenas VH y VL de un scFv) y teniendo dos etiquetas diferentes: una C-terminal del dominio de unión y una N-terminal del dominio de unión (H). Las T-ChARM también pueden tener dos, tres o más casetes de etiqueta, tal como se muestra para las Key-ChEM. Tal como resulta evidente en estas ilustraciones, un casete de etiqueta puede conectarse a otro componente Key-ChEM o T-ChARM u otra etiqueta mediante un módulo de ligador (por ejemplo, un módulo de ligador flexible (GlyXSer)n). La longitud del ligador puede adaptarse para que sea más larga o más corta para lograr la mejor interacción de un dominio de unión específico con un ligando o antígeno diana y para lograr la mejor interacción entre la célula que expresa la ChEM o T-ChARM y la célula diana.

Las figuras 2A - 2D muestran la actividad citolítica de células T efectoras humanas que expresan diversos tipos de T-ChARM anti-CD19 y CAR anti-C19 convencionales (que carecen de un casete de etiqueta y con dominios espaciadores cortos, intermedios y largos) contra las células de leucemia K562 transfectadas para expresar CD19 o ROR1 (control), células de linfoma Raji CD19+/ROR1 y células B transformadas con VEB que expresan un anticuerpo de cadena sencilla AcM anti-CD3 unido a membrana (scFv de OKT3) para activar todas las células T efectoras.

Las figuras 3A - 3F muestran los resultados de un ensayo múltiple de citocinas (Luminex®) de sobrenadantes obtenidos 24 horas después de que las células T que expresan diversas T-ChARM anti-CD19 (A-C) y los CAR anti-C19 convencionales (D-F) se cultivaran conjuntamente con células K562 que expresan o bien CD19 (A y D) o bien ROR1 (control negativo; B y E) y con PMA/ionomicina (control positivo; C y F).

Las figuras 4A y 4B muestran los resultados de un ensayo múltiple de citocinas (Luminex®) de sobrenadantes obtenidos 24 horas después de que las células T que expresan diversas T-ChARM anti-CD19 (A) y CAR CD19 (B) después del cultivo conjunto con células Raji CD19+.

La figura 5 muestra los resultados de un ensayo de proliferación de células T, en el que la dilución del colorante carboxifluoresceína indica que las células T CD8+ anti-CD19 que expresan T-ChARM (que contienen uno, dos o tres casetes de etiqueta) o un CAR convencional (CD19 (largo)) proliferaron en respuesta a las células tumorales que expresan CD19 (azul), mientras que no proliferaron en presencia de células tumorales que expresan ROR1 (rojo).

Las figuras 6A - 6E muestran que las células T humanas anti-CD19 que expresan o bien un T-ChARM (que contiene uno, dos o tres casetes de etiqueta) o bien CAR convencionales (que contienen regiones conectoras cortas o intermedias) pueden erradicar los tumores Raji establecidos en ratones NSG. En estos experimentos, las células Raji se transfectan para expresar el gen de luciferasa de luciérnaga, y el crecimiento tumoral se mide inyectando luciferina a los ratones y obteniendo imágenes mediante bioluminiscencia.

La figura 7 muestra que CAR anti-CD19 y T-ChARM que expresan células T humanas pueden persistir en la sangre después de la transferencia adoptiva a ratones NSG que se inocularon con linfoma Raji. Las células T humanas se distinguen mediante la tinción con anticuerpos monoclonales específicos para las moléculas de superficie celular CD8 y CD45 humanas.

Las figuras 8A - 8D muestran que las células T que expresan T-ChARM pueden identificarse mediante citometría de flujo usando un agente de unión específico de etiqueta. En los ejemplos, las células T que expresan T-ChARM purificadas se detectan mediante el marcador de expresión tEGFR (A), se detectan mediante anticuerpo anti-Strep tag II (STII) (B) o con StrepTactin APC (C, D).

La figura 9 muestra que las células T que expresan T-ChARM pueden clasificarse mediante citometría de flujo de baja pureza (15% en el ejemplo) a alta pureza (99% en el ejemplo) con un agente de unión específico de etiqueta unido a un fluorocromo. En el ejemplo, la etiqueta es StrepTag II y el agente de unión específico de etiqueta es AcM anti-STII unido a un fluorocromo.

La figura 10 muestra el enriquecimiento directo de células T que expresan T-ChARM (que contienen tres casetes de etiqueta Strep-tag) mediante el uso de perlas de Strep-Tactin® de diversos tamaños. Los paneles de la izquierda muestran la tinción de la fracción enriquecida y los paneles de la derecha muestran el efluente (fracción no enriquecida).

La figura 11 muestra fotomicrografías de luz de T-ChARM (que contienen uno, dos o tres casetes de etiqueta) o células T que expresan CAR anti-CD19 convencionales (CD19 largo) que se han cultivado conjuntamente con perlas unidas al ligando de unión (Strep-Tactin®) para la secuencia de etiqueta. Las fotomicrofotografías demuestran la agrupación selectiva y la proliferación de células T que expresan T-ChARM.

La figura 12 muestra la curva de crecimiento de células T que expresan T-ChARM (que contienen uno, dos o tres casetes de etiqueta) durante 10 días de cultivo con microperlas de Strep-Tactin®.

Las figuras 13A y 13B muestran la activación de células T que expresan T-ChARM tal como se determina mediante regulación por incremento de CD25 y CD69 después de la unión del casete de etiqueta mediante microperlas de Streptactin, nanoperlas o AcM anti-StrepTag II solo o en combinación con AcM anti-CD28. Los datos se muestran después de (A) 24 horas y (B) 48 horas de estimulación.

Las figuras 14A y 14B muestran la expansión selectiva de células T que expresan T-ChARM. Células T transducidas con T-CHARM1/4-1BB y T-ChARM1/CD28 (CD8+ y CD4+) sin clasificar cultivadas con anticuerpo anti-Strep tag/anti-CD28-MB durante 9 días. El porcentaje de células que expresan T-ChARM se evaluó mediante (A) detección de flujo de la expresión de Strep tag en células T antes y después del cultivo. Como control se usaron células de cultivo tratadas con anticuerpo anti-CD3/anti-CD28-MB solo. (B) Células T que expresan ChARM anti-CD19 EGFR+ clasificadas por FACS después de la expansión de la línea de células B inmortalizadas CD19+ (TM-LCL). Tinción con anticuerpos anti-EGFR (fila superior) y anti-Streptag II (fila inferior), respectivamente

La figura 15 muestra la proliferación de células T que expresan T-ChARM anti-CD19 (que contienen uno, dos o tres casetes de etiqueta) tal como se mide mediante el nivel de proteína Ki-67 7 días después de la estimulación con cantidades variables de perlas de Strep-Tactin®. En los paneles inferiores se muestra la expresión de Ki-67 en células T que expresan T-ChARM después de la estimulación a través del componente de unión anti-CD19 de T-ChARM con VEB-LCL CD19+ (TM-LCL).

La figura 16 muestra la curva de crecimiento de células T que expresan T-ChARM cultivadas en diferentes tipos de perlas conjugadas con StrepTactin, anticuerpo anti-Streptag II o anticuerpo antiCD3/anti-CD28.

Las figuras 17A y 17B muestran la expansión selectiva de células T que expresan T-ChARM anti-CD19 en perlas de Strep-Tactin (A). Las células T que expresan T-ChARM anti-CD19 pueden expandirse posteriormente mediante estimulación a través del receptor quimérico anti-CD19 con LCL CD19+ (B).

Las figuras 18A - 18D muestran que las células T pueden transducirse con dos tipos de T-ChARM (dominio efector de 4-1BB/CD3^ (A y B) o CD28/CD3^ (C y D)) después del cultivo en presencia de IL-7 e IL-15 sin activación previa con perlas anti-CD3/anti-CD28. Las células T que expresan T-ChARM transducidas pueden expandirse y enriquecerse selectivamente añadiendo perlas anti-Strep tag II al cultivo (B y D) (incluso en ausencia de estimulación con perlas anti-CD3/anti-CD28), pero no se expanden cuando no se añaden perlas anti-Strep tag II al cultivo (A y C).

Las figuras 19A - 19D muestran que las células T que expresan T-CHARM1 anti-CD19 que se expandieron mediante estimulación con microperlas de Strep-Tactin® conservan una capacidad comparable o superior de producir citocinas (GM-CSF, interferón-y, IL-2 y TNF -a ) tras la reestimulación con células tumorales positivas para CD19 (A. K562/CD19; B- Raji) como células T de control que expresan el CAR anti-CD19 (corto) (CD19-S). Las células k 562 (C) y PMA-ionomicina (D) sirvieron como controles negativo y positivo, respectivamente.

La figura 20 muestra que las células T que expresan T-ChARM pueden inducirse para formar grupos y proliferar con perlas anti-Strep tag solas o con perlas que contienen anticuerpos anti-Strep tag y anti-CD27 o que contienen anticuerpos anti-Strep tag y anti-CD28.

La figura 21 muestra el análisis de citometría de flujo (IFM) de células T que expresan ChARM anti-CD19 EGFR+ clasificadas por FACS después de la expansión de la línea de células B inmortalizadas CD19+ (TM-LCL). Tinción con anticuerpos anti-EGFR (fila superior) y anti-Streptag II (fila inferior), respectivamente.

La figura 22 muestra los resultados del ensayo de liberación de cromo para examinar el efecto citolítico de diversas células T transducidas con ChARM anti-CD19 (efectores) contra las células K562 transducidas con CD19 (K562/CD19) o ROR1 (K562/ROR1) o células tumorales Raji CD19+ (dianas). E/T = razón efector/diana.

Las figuras 23A y 23B muestran la actividad citolítica de células T que expresan (A) anticuerpo anti-CD19 corto, T-ChARM1, T-CHARM2, T-CHARM3 con un dominio efector CD28/CD3 ^y (B) que tienen un anticuerpo anti-ROR1 R12 corto y T-ChARM1 con un dominio efector 41BB/CD3 .^ Se sometieron a prueba las células para determinar la actividad citolítica contra células K562 transducidas con CD19 (K562/CD19) o Ro R1 (K562/ROR1) o células tumorales Raji CD19+ (dianas). E/T = razón efector/diana.

La figura 24 muestra la producción de IL2/IFN-y de diversas células T transducidas con T-ChARM anti-CD19 (efector) contra células K562 transducidas con CD19 (K562/CD19) o ROR1 (K562/ROR1) o células tumorales Raji CD19+ (diana).

Las figuras 25A-25C muestran el análisis múltiple de citocinas Luminex de sobrenadantes de cultivo conjunto por triplicado de células T transducidas con ChARM con células Raji CD19+ (razón 1:4) después de 24 h. Los datos se derivan de tres experimentos independientes que usan células T de donantes diferentes, y todos los datos se expresan como media ± DE. Se realizó la prueba de la t de Student. * P<0,01. (A) Comparación de la producción de citocinas por células T CD8+ que expresan el CAR anti-CD19 con espaciadores largos (CH3-CH2-bisagra), intermedios (CH3-bisagra) y cortos (sólo bisagra). Se normalizaron los datos múltiples de citocinas de 3 experimentos independientes (liberación de citocinas por CD19-CAR 'largo/41BB' = 1); (B) comparación de la producción de citocinas por células T CD8+ que expresan T-ChARM1 (1ST), T-CHARM2 (2ST), T-CHARM3 (3ST) anti-CD19 con un dominio efector de 4-1BB/CD3 ên comparación con CAR-corto anti-CD19 con dominio efector de 4-1BB/CD3 .^ Se normalizaron los datos múltiples de citocinas de 3 experimentos independientes (liberación de citocinas por CD19-CAR-corto: Hi/4-1BB = 1); y (C) comparación de la producción de citocinas por células T CD8+ que expresan T-ChARM1 (1ST), T-CHARM2 (2ST), T-CHARM3 (3ST) anti-CD19 con un dominio efector de CD28/CD3 ên comparación con CAR-corto anti-CD19 con dominio efector de CD28/CD3 .^ Se normalizaron los datos múltiples de citocinas de 3 experimentos independientes (liberación de citocinas por CD19-CAR-corto: Hi/CD28 = 1).

La figura 26 muestra la dilución de colorante CFSE usada para medir la proliferación de células T que expresan ChARM anti-CD19 4-1BB o CD28 5 días después de la estimulación con células tumorales Raji CD19+ (gris sólido) o sólo medio (líneas grises) sin adición de citocinas exógenas.

Las figuras 27A-27D muestran ChARM anti-CD19 EGFR+ clasificadas por FACS (A) células T CD8+ (CAR de CD19-Hi/4-1BB, ST-CD19/4-1BB, CD19(VH-ST-VL)/4-1BB; CD19-1ST/4-1BB, CD19-2ST/4-1BB, CD19-3ST/4-1BB); (B) células T CD4+ (CAR de CD19-Hi/4-1BB, ST-CD19/4-1BB, CD19(VH-ST-VL)/4-1BB; CD19-1ST/4-1BB, CD19-2ST/4-1BB, CD19-3ST/4-1BB); (C) células T CD8+ que expresan ChARM anti-CD19 (CAR de CD19-Hi/CD28, CD19-1ST/CD28, CD19-2ST/CD28, CD19-3ST/CD28); y (D) células T que expresan ChARM anti-ROR1 R12 (R12-Hi/4-1BB, R12-1ST/4-1BB), que se estimularon con microperlas recubiertas con StrepTactin (StrepTactin-MB), anticuerpo anti-Streptag o microperlas recubiertas con anticuerpo anti-Streptag/anti-CD28 (aStrep tag-MB y aStrep tag/CD28-MB) en el cultivo con IL2. Después de 48 horas de estimulación, se recogieron las células y se evaluó el marcador de activación de células T CD25 mediante citometría de flujo. Se usaron células no tratadas (medio) como controles.

La figura 28 muestra imágenes microscópicas representativas de células T que expresan ChARM anti-CD19 4-1BB EGFR+ (CD8+) clasificadas por FACS que se estimularon con StrepTactin-MB, aStrep tag-MB y aStrep tag/CD28-MB en presencia de IL2. Se usaron células no tratadas (medio) como control. Se tomaron imágenes microscópicas después de 48 h de estimulación.

Las figuras 29A y 29B muestran curvas de crecimiento de células T que expresan ChARM. Se cultivaron células T que expresan ChARM anti-CD19 EGFR+ (A) CD8+ y (B) CD4+ clasificadas por FACS en medio CTL con StrepTactin-MB, aStrep tag-MB y aStrep tag/CD28-MB en presencia de IL2.

Las figuras 30A-30F muestran células T CD8+ estimuladas con microperlas anti-CD3/anti-CD28 transducidas con CAR anti-CD19-1ST/4-1BB o CD19-1ST/CD28; después de la tinción y clasificación con EGFR, se expandieron las células T con CAR puras con TM-LCL o aStrep tag-MB o aStrep tag/CD28-MB durante 8 días. Se llevaron a cabo pruebas de funcionalidad in vitro para evaluar la función de las células T con CAR antes (aCD3/CD28-MB) o después (TM-LCL o aStrep tag-MB o aStrep tag/CD28-MB) de la expansión. (A) Se llevaron a cabo ensayos de liberación de cromo para examinar el efecto citolítico de las células T que expresan ChARM contra células diana (K562/CD19) o células de control (K562/ROR1). E/T: razón efector/diana; (B) se midió la producción de citocinas mediante ELISA para evaluar IFN-y e IL2 en sobrenadantes obtenidos después de 24 horas de cultivos conjuntos de 5 * 104 células T que expresan ChARM anti-CD19 con células diana (K562/CD19) o células de control (K562/ROR1). Se usaron células T estimuladas con PMA/ionomicina como control positivo (n = 3; * P<0,05); (C) ensayo de proliferación con CFSE de células T que expresan ChARM 5 días después de la estimulación con células diana (K562/CD19) (gris sólido) o células de control (K562/ROR1) (líneas grises) sin adición de citocinas exógenas. Para el análisis, se agruparon pocillos por triplicado y se analizó la proliferación de células T con CAR positivas para EGFR vivas (PI-); (D) detección de flujo de la expresión de CD45RO, CD62L, CD28 y CD27 en células T que expresan ChARM antes (aCD3/CD28-MB) o después (TM-LCL o aStrep tag-MB o aStrep tag/CD28-MB) de la expansión; (E) se inocularon cohortes de ratones con Raji-ffluc mediante inyección en la vena de la cola el día 1 y luego se administraron 5 x 106 células T que expresan ChARM CD8+ (CD19-Hi/4-1BB y CD19-1ST/4-1BB), que se expandieron en CD19+ B LCL o aStrep tag/CD28-MB, 7 días después del injerto del tumor. La progresión y distribución del tumor se evaluó mediante obtención de imágenes de bioluminiscencia en serie después de la inyección de sustrato de luciferina; y (F) persistencia de células T que expresan ChARM anti-CD19 después de la transferencia adoptiva a ratones NSG/Raji. Análisis de citometría de flujo de células T que expresan ChARM en la sangre periférica (hemorragias oculares) de la cohorte de ratones tratados con diversas células T transducidas con ChARM en diferentes puntos de tiempo después de la infusión de células T. Se usó la frecuencia de células T CD8+ tEGFR+ y ChARM+ como porcentaje de células de sangre periférica vivas.

La figura 31 muestra la dilución de colorante CFSE usada para medir la proliferación de CAR-corto, T-ChARM1, T-CHARM3 y Myc-ChARM anti-CD19 con células T que expresan 4-1BB 5 días después de la estimulación con CD19 (K562/CD19), ROR1 (K562/ROR1), medio solo o células tumorales Raji CD19+ sin adición de citocinas exógenas.

La figura 32 muestra ensayos de liberación de cromo llevados a cabo para examinar el efecto citolítico de CAR-corto, T-ChARM1, T-CHARM3 y Myc-ChARM anti-CD19 con células T que expresan 4-1BB contra células diana (K562/CD19) o células de control (K562/ROR1). E/T: razón efector/diana.

Descripción detallada

La presente divulgación proporciona composiciones y métodos para generar diversas proteínas de fusión que contienen uno o más casetes de etiqueta de afinidad, que son moléculas efectoras quiméricas (ChEM) que funcionan como una “ llave” para acceder y manipular (es decir, activar/desactivar o modular) cualquiera de una variedad de rutas biológicas. Estas moléculas efectoras quiméricas se denominan en el presente documento Key-ChEM. Las de moléculas de ácido nucleico que codifican para tales proteínas de fusión pueden usarse para generar células huésped modificadas en las que se provocan, controlan o ambas respuestas celulares específicas, tales como proliferación o destrucción. Por ejemplo, pueden obtenerse determinados tipos de células progenitoras de un sujeto, modificarse para expresar una proteína de fusión que comprende un casete de etiqueta, inducirse para proliferar y luego volver a infundirse al sujeto para un efecto terapéutico particular (por ejemplo, reconstituir el sistema inmunitario debilitado de un sujeto). Alternativamente, tales proteínas de fusión que contienen una etiqueta pueden tener además un dominio de unión específico para una diana particular (por ejemplo, un antígeno tumoral). En tales ejemplos, estas proteínas de fusión son moléculas de receptor de antígeno quimérico etiquetadas (T-ChARM) que pueden introducirse en una célula particular y luego usarse para identificar, clasificar, activar o expandir esa célula modificada. Tales moléculas quiméricas etiquetadas pueden transducirse a y expresarse en células, tales como células inmunitarias (por ejemplo, células T).

En determinados aspectos, la presente divulgación proporciona además métodos para activar selectivamente, fomentar la proliferación, identificar, clasificar, enriquecer, aislar, rastrear o agotar células (por ejemplo, células T), que comprenden una molécula de ácido nucleico que codifica para una proteína de fusión que tiene uno o más casetes de etiqueta (Key-ChEM o T-ChARM). Además, esta divulgación proporciona Key-ChEM o T-ChARM, así como células, composiciones y métodos para usar las Key-ChEM o T-ChARM de esta divulgación en diversas aplicaciones terapéuticas, incluyendo el tratamiento de una enfermedad en sujeto (por ejemplo, cáncer, enfermedad infecciosa, enfermedad inflamatoria, enfermedad inmunitaria, enfermedad asociada a la edad).

Antes de exponer esta divulgación con más detalle, puede ser útil para la comprensión de la misma proporcionar definiciones de determinados términos que van a usarse en el presente documento. A lo largo de esta divulgación se exponen definiciones adicionales.

En la presente descripción, debe entenderse que cualquier intervalo de concentraciones, intervalo de porcentajes, intervalo de razones o intervalo de números enteros incluye el valor de cualquier número entero dentro del intervalo enumerado y, cuando sea apropiado, fracciones del mismo (tal como una décima parte y una centésima de un número entero), a menos que se indique lo contrario. Además, debe entenderse que cualquier intervalo de números enumerado en el presente documento que se refiera a cualquier característica física, tal como subunidades de polímero, tamaño o grosor, incluye cualquier número entero dentro del intervalo enumerado, a menos que se indique lo contrario. Tal como se usa en el presente documento, el término “aproximadamente” significa ± 20% del intervalo, valor o estructura indicados, a menos que se indique lo contrario. Debe entenderse que los términos “un” y “una”, tal como se usan en el presente documento, se refieren a “uno o más” de los componentes enumerados. Debe entenderse que el uso de la alternativa (por ejemplo, “o”) significa o bien uno, ambos, o bien cualquier combinación de los mismos de las alternativas. Tal como se usa en el presente documento, los términos “ incluir”, “tener” y “comprender” se usan como sinónimos, cuyos términos y variantes de los mismos deben interpretarse como no limitativos.

Además, debe entenderse que los compuestos individuales, o grupos de compuestos, derivados de las diversas combinaciones de las estructuras y sustituyentes descritos en el presente documento se divulgan por la presente solicitud en la misma medida que si cada compuesto o grupo de compuestos se expusiera individualmente. Por tanto, la selección de estructuras particulares o sustituyentes particulares está dentro del alcance de la presente divulgación.

El término “que consiste esencialmente en” limita el alcance de una reivindicación a los materiales o las etapas especificados, o a aquellos que no afectan materialmente a las características básicas de una invención reivindicada. Por ejemplo, un dominio, una región, un módulo o un casete de proteína (por ejemplo, un dominio de unión, una región bisagra, un módulo de ligador, un casete de etiqueta) o una proteína (que puede tener uno o más dominios, regiones, módulos o casetes) “consiste esencialmente en” una secuencia de aminoácidos particular cuando la secuencia de aminoácidos de un dominio, una región, un módulo, un casete o una proteína incluye extensiones, deleciones, mutaciones o una combinación de las mismas (por ejemplo, aminoácidos en el extremo amino-terminal o carboxiloterminal o entre dominios) que, en combinación, contribuyen a, como máximo, el 20% (por ejemplo, como máximo, el 15%, el 10%, el 8%, el 6%, el 5%, el 4%, el 3%, el 2% o el 1%) de la longitud de un dominio, una región, un módulo, un casete o una proteína y que no afectan sustancialmente a (es decir, no reducen la actividad en más del 50%, tal como no más del 40%, el 30%, el 25%, el 20%, el 15%, el 10%, el 5% o el 1%) la actividad del/de los dominio(s), región/regiones, módulo(s), casete(s) o proteína(s) (por ejemplo, la afinidad de unión a diana de un proteína de unión o un casete de etiqueta).

Un “dominio de unión” (también denominado “región de unión” o “resto de unión”), tal como se usa en el presente documento, se refiere a una molécula, tal como un péptido, un oligopéptido, un polipéptido o una proteína que posee la capacidad de asociar, unirse o combinarse de manera específica y no covalente con una molécula diana (por ejemplo, CD19, CD20, CD22, ROR1, mesotelina, PD-L1, PD-L2, PSMA). Un dominio de unión incluye cualquier pareja de unión que se produce de manera natural, sintética, semisintética o producida de manera recombinante para una molécula biológica u otra diana de interés. En algunas realizaciones, el dominio de unión es un dominio de unión a antígeno, tal como un anticuerpo o un receptor de células T (TCR) o un dominio de unión funcional o fragmento de unión a antígeno del mismo. Los dominios de unión a modo de ejemplo incluyen regiones variables de anticuerpo de cadena sencilla (por ejemplo, anticuerpos de dominio, sFv, scFv, Fab), ectodominios de receptor (por ejemplo, TNF-a ), ligandos (por ejemplo, citocinas, quimiocinas), regiones de unión a antígeno de receptores de células T (TCR), tal como TCR de cadena sencilla (scTCR), o polipéptidos sintéticos seleccionados por la capacidad específica de unirse a una molécula biológica.

Tal como se usa en el presente documento, “se une específicamente” se refiere a una asociación o unión de un dominio de unión, o una proteína de fusión del mismo, a una molécula diana con una afinidad o Ka (es decir, una constante de asociación en equilibrio de una interacción de unión particular con unidades de 1/M) igual a o mayor de 105 M-1, mientras que no se asocia ni une significativamente con ninguna otra molécula u otro componente en una muestra. Los dominios de unión (o proteínas de fusión de los mismos) pueden clasificarse como dominios de unión de “alta afinidad” (o proteínas de fusión de los mismos) o dominios de unión de “baja afinidad” (o proteínas de fusión de los mismos). Dominios de unión de “alta afinidad” se refieren a aquellos dominios de unión con una Ka de al menos 107 M-1, al menos 108M'1, al menos 109M'1, al menos 101°M '1, al menos 1011 M-1, al menos 1012M'1 o al menos 1013 M-1. Dominios de unión de “baja afinidad” se refieren a aquellos dominios de unión con una Ka de hasta 107 M-1, hasta 106 M-1, hasta 105 M-1. Alternativamente, la afinidad puede definirse como una constante de disociación en equilibrio (Kd) de una interacción de unión particular con unidades de M (por ejemplo, de 10-5M a 10-13M). En determinadas realizaciones, un dominio de unión puede tener “afinidad potenciada”, que se refiere a un dominio de unión seleccionado o modificado por ingeniería genética con unión a un antígeno diana más fuerte que un dominio de unión de tipo natural (o parental). Por ejemplo, la afinidad potenciada puede deberse a una Ka (constante de asociación en equilibrio) para el antígeno diana que es mayor que la del dominio de unión de tipo natural, o deberse a una Kd (constante de disociación) para el antígeno diana que es menor que la del dominio de unión de tipo natural, o deberse a una tasa de disociación ( K f para el antígeno diana que es menor que la del dominio de unión de tipo natural. Se conocen una variedad de ensayos para identificar dominios de unión de la presente divulgación que se unen específicamente a una diana particular, así como determinar afinidades de dominios de unión o proteínas de fusión, tales como inmunotransferencia de tipo Western, ELISA y análisis Biacore® (véanse también, por ejemplo, Scatchard et al., Ann. N.Y. Acad. Sci. 51:660, 1949; y las patentes estadounidenses n.os 5.283.173, 5.468.614 o equivalentes).

Tal como se usa en el presente documento, “heterólogo” o “no endógeno” o “exógeno” se refiere a cualquier gen, proteína, compuesto, molécula o actividad que no es nativo de una célula huésped o un sujeto, o es cualquier gen, proteína, compuesto, molécula o actividad nativo de un huésped o una célula huésped pero que se ha alterado o mutado, de tal manera que la estructura, actividad o ambas es diferente entre las moléculas nativa y mutada. En determinadas realizaciones, las moléculas heterólogas, no endógenas o exógenas (por ejemplo, receptores, ligandos) pueden no ser endógenas de una célula huésped o un sujeto, pero en su lugar pueden haberse añadido ácidos nucleicos que codifican para tales moléculas a una célula huésped mediante conjugación, transformación, transfección, electroporación o similares, en las que la molécula de ácido nucleico añadida puede integrarse en un genoma de la célula huésped o puede existir como material genético extracromosómico (por ejemplo, como un plásmido u otro vector autorreplicante). El término “homólogo” se refiere a una molécula o actividad encontrada en o derivada de una célula huésped, especie o cepa. Por ejemplo, un gen o una molécula heterólogos o exógenos que codifican para la molécula puede ser homólogo de un gen o una molécula de célula huésped o un huésped nativos que codifican para la molécula, respectivamente, pero pueden tener una estructura, secuencia, nivel de expresión alterados o combinaciones de los mismos. Una molécula no endógena puede ser de la misma especie, de una especie diferente o una combinación de las mismas.

Tal como se usa en el presente documento, el término “endógeno” o “nativo” se refiere a un gen, una proteína, un compuesto, una molécula o una actividad que está presente normalmente en un huésped o una célula huésped.

Tal como se usa en el presente documento, “casete de etiqueta” se refiere a una secuencia de péptido única fijada a, fusionada con o que forma parte de una proteína de interés, a la que puede unirse específicamente una molécula de unión relacionada heteróloga o no endógena (por ejemplo, receptor, ligando, anticuerpo u otra pareja de unión), en la que la propiedad de unión puede usarse para detectar, identificar, aislar o purificar, rastrear, enriquecer o seleccionar como diana una proteína etiquetada o células que expresan una proteína etiquetada, particularmente cuando una proteína etiquetada forma parte de una población heterogénea de proteínas u otro material, o cuando las células que expresan una proteína etiquetada forman parte de una población heterogénea de células (por ejemplo, una muestra biológica como sangre periférica). En determinadas realizaciones, una célula que expresa una proteína etiquetada puede ponerse en contacto con una molécula de unión relacionada heteróloga o no endógena e inducir una respuesta biológica, tal como fomentar la activación celular, la proliferación celular o la muerte celular. En las proteínas de fusión proporcionadas, la capacidad del/de los casete(s) de etiqueta de unirse específicamente mediante la(s) molécula(s) de unión relacionada(s) es distinta de o además de la capacidad del/de los dominio(s) de unión de unirse específicamente a la(s) molécula(s) diana. El casete de etiqueta no es generalmente una molécula de unión a antígeno, por ejemplo, no es un anticuerpo o TCR o una porción de unión a antígeno del mismo.

Tal como se usa en el presente documento, una “región bisagra” o una “bisagra” se refiere a (a) una secuencia bisagra de inmunoglobulina (que se compone de, por ejemplo, regiones superior y central) o un fragmento o una variante funcional de la misma, (b) una región de interdominio (tallo) de lectina C de tipo II o un fragmento o una variante funcional de la misma, o (c) una región de tallo de moléculas de grupo de diferenciación (CD) o una variante funcional de la misma. Tal como se usa en el presente documento, una “región bisagra de inmunoglobulina de tipo natural” se refiere a secuencias de aminoácidos bisagra superiores y medias que se producen de manera natural interpuestas entre y que conectan los dominios CH1 y CH2 (para IgG, IgA e IgD) o interpuestas entre y que conectan los dominios CH1 y CH3 (para IgE e IgM) encontradas en la cadena pesada de un anticuerpo. En determinadas realizaciones, una región bisagra es humana y, en realizaciones particulares, comprende una región bisagra de IgG humana.

Tal como se usa en el presente documento, una “región conectora” se refiere a una o más proteínas, polipéptidos, oligopéptidos, péptidos, dominios, regiones, módulos, casetes, motivos o cualquier combinación de los mismos que unen dos o más proteínas, polipéptidos, oligopéptidos, péptidos, dominios, regiones, módulos, casetes, motivos o cualquier combinación de los mismos en una proteína de fusión. Por ejemplo, una región conectora puede proporcionar una función espaciadora para facilitar la interacción de dos proteínas de fusión de cadena sencilla o el posicionamiento de uno o más dominios de unión, de modo que la estructura de polipéptido resultante mantiene una afinidad de unión específica para una molécula diana o mantiene actividad de señalización (por ejemplo, actividad de dominio efector), o ambas. En determinadas realizaciones, una región conectora puede comprender un “módulo de ligador” que es una secuencia de aminoácidos que tiene desde aproximadamente dos hasta aproximadamente 500 aminoácidos, que puede proporcionar flexibilidad y sitio para el movimiento conformacional entre dos regiones, dominios, motivos, casetes o módulos conectados mediante un ligador. Los módulos de ligador a modo de ejemplo incluyen aquellos que tienen desde uno hasta aproximadamente diez repeticiones de GlyxSery, en la que x e y son independientemente un número entero desde 0 hasta 10 siempre que x e y no sean ambos 0 (por ejemplo, (Gly4Ser)2 (SEQ ID NO.: 67), (Gly3Ser)2 (SEQ ID NO.: 68), Gly2Ser o a combinación de las mismas, tal como (Gly3Ser)2Gly2Ser (SEQ ID NO.: 69). En otras determinadas realizaciones, una región conectora puede tener un módulo de ligador que comprende una o más regiones constantes de cadena pesada de inmunoglobulina, tales como un CH3 solo o un CH2CH3. En realizaciones adicionales, una región conectora puede comprender una región bisagra o un casete de etiqueta. Cada uno de tales componentes conectores no es mutuamente excluyente. Por ejemplo, una región conectora puede comprender una bisagra y uno o más módulos de ligador, o una región conectora puede comprender una bisagra, uno o más módulos de ligador y uno o más casetes de etiqueta. Las regiones conectoras a modo de ejemplo pueden variar en longitud, por ejemplo, desde aproximadamente cinco hasta aproximadamente 500 aminoácidos, o desde aproximadamente diez hasta aproximadamente 350 aminoácidos, o desde aproximadamente 15 hasta aproximadamente 100 aminoácidos, o desde aproximadamente 20 hasta aproximadamente 75 aminoácidos, o desde aproximadamente 25 hasta aproximadamente 35 aminoácidos.

Una “porción hidrófoba”, tal como se usa en el presente documento, significa cualquier secuencia de aminoácidos que tiene una estructura tridimensional que es termodinámicamente estable en una membrana celular, y oscila generalmente en longitud desde aproximadamente 15 aminoácidos hasta aproximadamente 30 aminoácidos. La estructura de un dominio hidrófobo puede comprender una hélice alfa, un barril beta, una lámina beta, una hélice beta o cualquier combinación de los mismos.

Tal como se usa en el presente documento, un “dominio efector” es una porción intracelular de una proteína de fusión o un receptor que puede fomentar directa o indirectamente una respuesta biológica o fisiológica en una célula cuando recibe la señal apropiada. En determinadas realizaciones, un dominio efector forma parte de una proteína o un complejo proteico que recibe una señal cuando está unido, o se une directamente a una molécula diana, que desencadena una señal a partir del dominio efector. Un dominio efector puede fomentar directamente una respuesta celular cuando contiene uno o más motivos o dominios de señalización, tales como un motivo de activación inmunorreceptor basado en tirosina (ITAM). En otras realizaciones, un dominio efector fomentará indirectamente una respuesta celular mediante la asociación con una o más de otras proteínas que fomentan directamente una respuesta celular.

Un “ ligador de región variable” se refiere específicamente a una secuencia de cinco a aproximadamente 35 aminoácidos que conecta una región variable de inmunoglobulina cadena pesada con una región variable de inmunoglobulina de cadena ligera, o conecta las cadenas Va/p y Ca/p del receptor de células T (por ejemplo, Va-Ca, Vp-Cp, Va-Vp) o conecta cada par Va-Ca, Vp-Cp, Va-Vp con una bisagra o un dominio hidrófobo, lo que proporciona una función espaciadora y flexibilidad suficiente para la interacción de los dos subdominios de unión, de modo que el polipéptido de cadena sencilla resultante conserva una afinidad de unión específica para la misma molécula diana que un anticuerpo o receptor de células T. En determinadas realizaciones, un ligador de región variable comprende desde aproximadamente diez hasta aproximadamente 30 aminoácidos o desde aproximadamente 15 hasta aproximadamente 25 aminoácidos. En realizaciones particulares, un péptido ligador de región variable comprende desde una hasta diez repeticiones de GlyxSery, en la que x e y son independientemente un número entero desde 0 hasta 10 siempre que x e y no sean ambos 0 (por ejemplo, Gly4Ser (^sE^qID NO.: 10), GlypSer (SEQ ID NO.: 71), Gly2Ser, o (GlyaSer)n(Gly4Ser)1 (SEQ ID NO.: 72), (Gly3Ser)n(Gly2Ser)n, (SEQ ID NO.: 73) (Gly3Ser)n(Gly4Ser)n (SEQ ID NO.: 72) o (Gly4Ser)n (SEQ ⁱD NO.: 10), en las que n es un número entero de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10) y en las que las regiones variables unidas forman un dominio de unión similar a inmunoglobulina funcional (por ejemplo, scFv, scTCR). Los ligadores de región variable a modo de ejemplo incluyen aquellas secuencias de aminoácidos expuestas en las S^eQ ID NO.: 44, 65-69 y 71-73, y (Gly4Ser)n (SEQ ID NO.: 10), en la que n es 3, tal como se encuentran en la T-ChARM que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO.: 57.

“Aminoácidos de unión” o “residuos de aminoácido de unión” se refieren a uno o más (por ejemplo, aproximadamente 2-20) residuos de aminoácido entre dos motivos, regiones o dominios adyacentes de un polipéptido, tal como entre un dominio de unión y una región de ligador adyacente o entre un dominio hidrófobo y un dominio efector adyacente o en uno o ambos extremos de una región de ligador que une dos motivos, regiones o dominios (por ejemplo, entre un ligador y un dominio de unión adyacente y/o entre un ligador y una bisagra adyacente). Los aminoácidos de unión pueden resultar del diseño de construcción de una proteína de fusión (por ejemplo, residuos de aminoácido que resultan del uso de un sitio de enzima de restricción durante la construcción de una molécula de ácido nucleico que codifica para una proteína de fusión). Por ejemplo, un aminoácido de unión individual, asparagina, está codificado por el codón AAT encontrado entre la secuencia de ácido nucleico que codifica para la secuencia señal secretora (SEQ ID NO.: 63) y la secuencia que codifica para el casete de etiqueta (SEQ ID NO.: 38) en la T-ChARM codificada por la secuencia de ácido nucleico expuesta en SEQ ID NO.: 58. De manera similar, un aminoácido de unión asparagina (N) se encuentra entre la secuencia de aminoácidos de ligador flexible de GGSGSG (SEQ ID NO.: 65) y la secuencia de aminoácidos de etiqueta WSHPQFEK (SEQ ID NO.: 1) encontrada en la T-ChARM que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO.: 54.

A los términos comprendidos por los expertos en la técnica de tecnología de anticuerpos se les proporciona a cada uno el significado adquirido en la técnica, a menos que se definan expresamente de distinta manera en el presente documento. El término “anticuerpo” se refiere a un anticuerpo intacto que comprende al menos dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) interconectadas mediante enlaces disulfuro, así como una porción de unión a antígeno de un anticuerpo intacto que tiene o conserva la capacidad de unirse a una molécula diana. Un anticuerpo monoclonal o una porción de unión a antígeno del mismo puede ser no humano, quimérico, humanizado o humano, preferiblemente humanizado o humano. La estructura y función de las inmunoglobulinas se revisan, por ejemplo, en Harlow et al., Eds., Antibodies: A Laboratory Manual, capítulo 14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, 1988).

Por ejemplo, los términos “Vl” y “Vh” se refieren a la región de unión variable de una cadena ligera y pesada de anticuerpo, respectivamente. Las regiones de unión variables están constituidas por subregiones discretas y bien definidas denominadas “regiones determinantes de complementariedad” (CDR) y “regiones de entramado” (FR). El término “CL” se refiere a una “región constante de cadena ligera de inmunoglobulina” o una “región constante de cadena ligera”, es decir, una región constante de una cadena ligera de anticuerpo. El término “CH” se refiere a una “región constante de cadena pesada de inmunoglobulina” o una “región constante de cadena pesada”, que además es divisible, dependiendo del isotipo de anticuerpo, en los dominios CH1, CH2 y CH3 (IgA, IgD, IgG) o CH1, CH2, CH3 y CH4 (IgE, IgM). Un “Fab” (fragmento de unión a antígeno) es la parte de un anticuerpo que se une a los antígenos e incluye la región variable y CH1 de la cadena pesada unido a la cadena ligera mediante un enlace disulfuro entre cadenas.

Tal como se usa en el presente documento, “porción de región Fc” se refiere al segmento de región constante de cadena pesada del fragmento Fc (la región de “fragmento cristalizable” o región Fc) de un anticuerpo, que puede incluir uno o más dominios constantes, tales como CH2, CH3, CH4 o cualquier combinación de los mismos. En determinadas realizaciones, una porción de región Fc incluye los dominios CH2 y CH3 de un anticuerpo IgG, IgA o IgD o cualquier combinación de los mismos, o los dominios CH3 y CH4 de un anticuerpo IgM o IgE y cualquier combinación de los mismos. En otras realizaciones, una estructura CH2CH3 o CH3CH4 tiene dominios de subregión del mismo isotipo de anticuerpo y es humana, tal como IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgD, IgE o IgM humanas (por ejemplo, CH2CH3 de IgG1 humana). Por medio de antecedentes, una región Fc es responsable de las funciones efectoras de una inmunoglobulina, tal como ADCC (citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos), CDC (citotoxicidad dependiente del complemento) y fijación del complemento, unión a receptores de Fc(por ejemplo, CD16, CD32, FcRn), mayor semivida in vivo en relación con un polipéptido que carece de una región Fc, unión a proteínas A y quizás incluso transferencia placentaria (véase Capon et al., Nature 337:525, 1989). En determinadas realizaciones, una porción de región Fc encontrada en proteínas de fusión de la presente divulgación será capaz de mediar en uno o más de estas funciones efectoras, o carecerá de una o más o todas de estas actividades por medio de, por ejemplo, una o más mutaciones conocidas en la técnica.

Además, los anticuerpos tienen una secuencia bisagra que se sitúa normalmente entre el Fab y la región Fc (pero una sección menor de la bisagra puede incluir una porción amino-terminal de la región Fc). Por medio de antecedentes, una bisagra de inmunoglobulina actúa como un espaciador flexible para permitir que la porción Fab se mueva libremente en el espacio. A diferencia de las regiones constantes, las bisagras son estructuralmente diversas, variando tanto en secuencia como en longitud entre clases e incluso entre subclases de inmunoglobulinas. Por ejemplo, una región bisagra de IgG1 humana es libremente flexible, lo que permite que los fragmentos Fab roten sobre sus ejes de simetría y se muevan dentro de una esfera centrada en el primero de los dos puentes disulfuro entre cadenas pesadas. Por comparación, una bisagra de IgG2 humana es relativamente corta y contiene una doble hélice de poli-prolina rígida estabilizada por cuatro puentes disulfuro entre cadenas pesadas, lo que restringe la flexibilidad. Una bisagra de IgG3 humana difiere de las otras subclases por su única región bisagra extendida (tan larga como aproximadamente cuatro veces la bisagra de IgG1), que contiene 62 aminoácidos (incluyendo 21 prolinas y 11 cisteínas), que forma una doble hélice de poli-prolina inflexible y que proporciona una mayor flexibilidad porque los fragmentos Fab están relativamente lejos del fragmento de Fc. Una bisagra de IgG4 humana es más corta que la de IgG1 pero tiene la misma longitud que la de IgG2, y su flexibilidad es intermedia entre la de IgG1 y la de IgG2.

“Receptor de células T” (TCR) se refiere a una molécula encontrada en la superficie de células T (o linfocitos T) que, en asociación con CD3, es generalmente responsable del reconocimiento de antígenos unidos a moléculas de complejo mayor de histocompatibilidad (CMH). El TCR tiene un heterodímero unido por disulfuro de las cadenas a y P altamente variables (también denominadas TCRa y TCRp, respectivamente) en la mayoría de células T. En un pequeño subconjunto de células T, el TCR está constituido por un heterodímero de cadenas y y 8 variables (también denominadas TCRy y TCR8, respectivamente). Cada cadena del TCR es un miembro de la superfamilia de inmunoglobulinas y posee un dominio variable de inmunoglobulina N-terminal, un dominio constante de inmunoglobulina, una región transmembrana y una cola citoplásmica corta en el extremo C-terminal (véase Janeway et al., Immunobiology: The Immune System in Health and Disease, 3a ed., Current Biology Publications, pág. 4:33, 1997). El TCR, tal como se usa en la presente divulgación, puede ser de diversas especies de animales, incluyendo humano, ratón, rata, gato, perro, cabra, caballo u otros mamíferos. Los TCR pueden estar unidos a células (es decir, tienen un dominio o una región transmembrana) o en forma soluble.

“Moléculas de complejo mayor de histocompatibilidad” (moléculas de CMH) se refieren a glicoproteínas que administran antígenos peptídicos a una superficie celular. Las moléculas de CMH de clase I son heterodímero que consisten en una cadena a que atraviesa la membrana (con tres dominios a ) y una microglobulina P2 asociada de manera no covalente. Las moléculas de CMH de clase II se componen de dos glicoproteínas transmembrana, a y P, ambas de las cuales atraviesan la membrana. Cada cadena tiene dos dominios. Las moléculas de CMH de clase I administran péptidos que se originan en el citosol a la superficie celular, en la que las células T CD8+ reconocen el complejo péptido:CMH. Las moléculas de CMH de clase II administran péptidos que se originan en el sistema vesicular a la superficie celular, en la que las células T CD4+ los reconocen. Una molécula de CMH puede ser de diversas especies de animales, incluyendo humano, ratón, rata u otros mamíferos.

Un “vector” es una molécula de ácido nucleico que es capaz de transportar otro ácido nucleico. Los vectores pueden ser, por ejemplo, plásmidos, cósmidos, virus o fago. Un “vector de expresión” es un vector que es capaz de dirigir la expresión de una proteína codificada por uno o más genes portados por el vector cuando está presente en el entorno apropiado.

Los “retrovirus” son virus que tienen un genoma de ARN. “Gammaretrovims” se refiere a un género de la familia Retroviridae. Los gammaretrovims a modo de ejemplo incluyen virus de células madre de ratón, virus de leucemia murina, virus de leucemia felina, virus de sarcoma felino y virus de reticuloendoteliosis aviar.

“Lentivirus” se refiere a un género de retrovirus que son capaces de infectar células en división y en no división. Varios ejemplos de lentivirus incluyen VIH (virus de inmunodeficiencia humana: incluyendo VIH de tipo 1 y VIH de tipo 2); virus de anemia infecciosa equina; virus de inmunodeficiencia felina (VIF); virus de inmunodeficiencia bovina (VIB); y virus de inmunodeficiencia en simios (VIS).

Una “célula progenitora hematopoyética” es una célula derivada de células madre hematopoyéticas que es capaz de diferenciarse adicionalmente en tipos de células maduras (por ejemplo, células del linaje de células T). En determinadas realizaciones, las células progenitoras hematopoyéticas CD24l° Lin- CD117+ son útiles. Las células progenitoras hematopoyéticas pueden ser de diversas especies de animales, incluyendo humano, ratón, rata u otros mamíferos. Una “célula progenitora timocítica” o “timocito” es una célula progenitora hematopoyética presente en el timo.

“Células madre hematopoyéticas” se refieren a células hematopoyéticas indiferenciadas que son capaces de autorrenovación in vivo, propagación esencialmente ilimitada in vitro y capaces de diferenciación en otros tipos de células incluyendo células del linaje de células T. Las células madre hematopoyéticas pueden aislarse de, por ejemplo, pero sin limitarse a, hígado fetal, médula ósea, sangre de cordón umbilical.

“Células madre embrionarias” o “células ES” o “ESC” se refieren a células madre embrionarias indiferenciadas que tienen la capacidad de integrarse en y volverse parte de la línea germinal de un embrión en desarrollo. Las células madre embrionarias son capaces de diferenciarse en células progenitoras hematopoyéticas y cualquier tejido u órgano. Las células madre embrionarias incluyen células de la línea de células ES J1, línea de células ES 129J, línea de células madre murina D3 (Colección Americana de Cultivos Tipo), las líneas de células R1 o E14K derivadas de ratones 129/Sv, líneas de células derivadas de ratones Balb/c y C57B1/6 y células madre embrionarias humanas.

“Células del linaje de células T” se refieren a células que muestran al menos una característica fenotípica de una célula T o un precursor o progenitor de la misma que distingue las células de otras células linfoides, y células de los linajes eritroides o mieloides. Tales características fenotípicas pueden incluir la expresión de una o más proteínas específicas para células T (por ejemplo, CD3+, CD4+, CD8+) o una característica fisiológica, morfológica, funcional o inmunológica específica para una célula T. Por ejemplo, las células del linaje de células T pueden ser células progenitoras o precursoras comprometidas con el linaje de células T; células T CD25+ inmaduras e inactivadas; células que se han comprometido con el linaje de CD4 o CD8; células progenitoras timocíticas que son doblemente positivas CD4+CD8+; de positivo único CD4+ o CD8+; TCRap o TCRyS; o células T maduras y funcionales o activadas.

La “molécula de ácido nucleico”, o los polinucleótidos, pueden estar en forma de ARN o ADN, que incluyen ADNc, ADN genómico y ADN sintético. Una molécula de ácido nucleico puede ser bicatenaria o monocatenaria y, si es monocatenaria, puede ser la hebra codificante o no codificante (hebra antisentido). Una molécula codificante puede tener una secuencia codificante idéntica a una secuencia codificante conocida en la técnica o puede tener una secuencia codificante diferente que, como resultado de la redundancia o degeneración del código genético, o mediante corte y empalme, puede codificar para el mismo polipéptido.

“Tratar” o “tratamiento” o “mejorar” se refiere a la gestión médica de una enfermedad, un trastorno o un estado de un sujeto (por ejemplo, un humano o un mamífero no humano, tal como un primate, un caballo, un perro, un ratón, una rata). En general, una dosis o un régimen de tratamiento apropiado que comprende una célula huésped que expresa una Key-ChEM o T-ChARM de esta divulgación y, opcionalmente, un adyuvante, se administra en una cantidad suficiente para provocar un beneficio terapéutico o profiláctico. El beneficio terapéutico o profiláctico/preventivo incluye desenlace clínico mejorado; reducción o alivio de los síntomas asociados con una enfermedad; aparición disminuida de síntomas; calidad de vida mejorada; estado libre de enfermedad más duradero; disminución del grado de la enfermedad, estabilización del estado patológico; retraso de la progresión de la enfermedad; remisión; supervivencia; supervivencia prolongada; o cualquier combinación de los mismos.

Una “cantidad terapéuticamente eficaz” o “cantidad eficaz” de una proteína de fusión o célula que expresa una proteína de fusión de esta divulgación (por ejemplo, Key-ChEM, T-ChARM) se refiere a esa cantidad de compuesto o células suficiente para dar como resultado la mejora de uno o más síntomas de la enfermedad que está tratándose de una manera estadísticamente significativa. Cuando se hace referencia a un principio activo individual o una célula que expresa un único principio activo, administrado solo, una dosis terapéuticamente eficaz se refiere a los efectos de ese principio o esa célula que expresa ese principio solo. Cuando se hace referencia a una combinación, una dosis terapéuticamente eficaz se refiere a las cantidades combinadas de principios activos o al principio activo adyuvante combinado con una célula que expresa un principio activo que da como resultado un efecto terapéutico, ya sea administrado en serie o simultáneamente. Otra combinación puede ser una célula que expresa más de un principio activo, tal como dos T-ChARM diferentes, una T-ChARM y un TCR, una T-ChARM y un CAR, o combinaciones de los mismos.

A lo largo de la presente divulgación se proporcionan definiciones adicionales.

Key-ChEM y T-ChARM

En determinados aspectos, la presente divulgación proporciona una proteína de fusión de cadena sencilla, denominada Key-ChEM, que comprende un componente extracelular y un componente intracelular conectados por una porción hidrófoba, en la que el componente extracelular comprende un casete de etiqueta y una región conectora que comprende una bisagra, y en la que el componente intracelular comprende un dominio efector. En determinados casos, una región conectora comprende además un módulo de ligador, o uno o más casetes de etiqueta se ubican dentro de la región conectora. En otros determinados casos, uno o más casetes de etiqueta se unen a la región conectora mediante un módulo de ligador.

En algunos casos, la proteína de fusión comprende desde el extremo amino-terminal hasta el extremo carboxiloterminal: un casete de etiqueta, una región conectora que comprende una bisagra, una porción hidrófoba y un componente intracelular que comprende un dominio efector (véanse, por ejemplo, las figuras 1A y 1B). En todavía casos adicionales, la proteína de fusión comprende desde el extremo amino-terminal hasta el extremo carboxiloterminal: una primera región conectora, un casete de etiqueta, una segunda región conectora que comprende una bisagra, una porción hidrófoba y un componente intracelular que comprende un dominio efector. En determinados casos, la proteína de fusión comprende desde el extremo amino-terminal hasta el extremo carboxilo-terminal: un primer casete de etiqueta, una primera región conectora, un segundo casete de etiqueta, una segunda región conectora que comprende una bisagra, una porción hidrófoba y un componente intracelular que comprende un dominio efector (véase, por ejemplo, la figura 1C). En incluso casos adicionales, la proteína de fusión comprende desde el extremo amino-terminal hasta el extremo carboxilo-terminal: un primer casete de etiqueta, una primera región conectora, un segundo casete de etiqueta, una segunda región conectora, un tercer casete de etiqueta, una tercera región conectora que comprende una bisagra, una porción hidrófoba y un componente intracelular que comprende un dominio efector (véase, por ejemplo, la figura 1D).

En otros determinados casos, la proteína de fusión comprende además un dominio de unión asociado de manera no covalente, tal como un dominio de unión asociado con el casete de etiqueta (es decir, una T-ChARM de múltiples cadenas). En todavía otros casos, el domino de unión asociado de manera no covalente es biespecífico, en el que el primer extremo de unión es específico para el casete de etiqueta y el segundo dominio de unión es específico para una diana distinta del casete de etiqueta, o los extremos de unión primero y segundo son ambos específicos para el casete de etiqueta. En aún otros casos, el domino de unión asociado de manera no covalente es multiespecífico, en el que un primer extremo se une a un casete de etiqueta y un segundo extremo es específico para una o más dianas distintas del casete de etiqueta. En tales casos, una Key-ChEM comprende una proteína multimérica. En algunos casos, tales Key-ChEM que comprenden uno o más dominios de unión asociados de manera no covalente comprenden heteromultímeros.

En otros aspectos, la presente divulgación proporciona una proteína de fusión de cadena sencilla, denominada T-ChARM, que comprende un componente extracelular y un componente intracelular conectados por una porción hidrófoba, en la que el componente extracelular comprende un dominio de unión que se une específicamente a una diana, un casete de etiqueta y una región conectora que comprende una bisagra, y en la que el componente intracelular comprende un dominio efector. En determinados casos, un dominio de unión de T-ChARM es un scFv, scTCR, ectodominio de receptor o ligando.

En algunos casos, la proteína de fusión comprende desde el extremo amino-terminal hasta el extremo carboxiloterminal: un dominio de unión extracelular, un casete de etiqueta, una región conectora que comprende una bisagra, una porción hidrófoba y un componente intracelular que comprende un dominio efector (véase, por ejemplo, la figura 1E). En todavía casos adicionales, la proteína de fusión comprende desde el extremo amino-terminal hasta el extremo carboxilo-terminal: un dominio de unión extracelular, una primera región conectora, un casete de etiqueta, una segunda región conectora que comprende una bisagra, una porción hidrófoba y un componente intracelular que comprende un dominio efector. En aún casos adicionales, la proteína de fusión comprende desde el extremo amino-terminal hasta el extremo carboxilo-terminal: un dominio de unión extracelular, un primer casete de etiqueta, una primera región conectora, un segundo casete de etiqueta, una segunda región conectora que comprende una bisagra, una porción hidrófoba y un componente intracelular que comprende un dominio efector. En incluso casos adicionales, la proteína de fusión comprende desde el extremo amino-terminal hasta el extremo carboxilo-terminal: un dominio de unión extracelular, un primer casete de etiqueta, una primera región conectora, un segundo casete de etiqueta, una segunda región conectora, un tercer casete de etiqueta, una tercera región conectora que comprende una bisagra, una porción hidrófoba y un componente intracelular que comprende un dominio efector.

En otros determinados casos, la proteína de fusión comprende desde el extremo amino-terminal hasta el extremo carboxilo-terminal: un casete de etiqueta, un dominio de unión extracelular, una región conectora que comprende una bisagra, una porción hidrófoba y un componente intracelular que comprende un dominio efector (véase, por ejemplo, la figura 1F). En todavía otros casos, la proteína de fusión comprende desde el extremo amino-terminal hasta el extremo carboxilo-terminal: un scFv extracelular o dominio de unión a scTCR que comprende un ligador de región variable que contiene un casete de etiqueta dispuesto entre las regiones variables (por ejemplo, en o cercano al extremo N-terminal del ligador de región variable, en o cercano al extremo C-terminal del ligador de región variable o incrustado más cerca del centro del ligador de región variable), una región conectora que comprende una bisagra, una porción hidrófoba y un componente intracelular que comprende un dominio efector. Un casete de etiqueta a modo de ejemplo incrustado en un ligador de región variable comprende GGSGSG(X)nWSHPQFEKGSGSG (SEQ ID NO.: 45), en la que X es opcional, puede ser cualquier aminoácido y n es 0, 1,2, 3, 4 ó 5. En SEQ ID NO.: 54, está presente un ligador de región variable de este tipo que tiene una etiqueta incrustada, en el que n es 1 y X es asparagina (N).

Una Key-ChEM o T-ChARM puede estar unida a células (por ejemplo, expresada en una superficie celular) o en forma soluble. En determinados casos, las moléculas de ácido nucleico que codifican para proteínas de fusión Key-ChEM o T-ChARM pueden estar optimizado por codón para potenciar o maximizar la expresión en determinados tipos de células, tales como células T (Scholten et al., Clin. Immunol. 119:135, 2006).

En otros casos, la Key-ChEM o T-ChARM puede comprender además un componente citotóxico (por ejemplo, fármacos quimioterápicos tales como antimitóticos (por ejemplo, vindesina), antifolatos, agentes alquilantes (por ejemplo, temozolomida), toxinas bacterianas, ricina, antivíricos, radioisótopos, radiometales), que es útil para la destrucción o incapacitación específica de un célula cancerosa, célula infectada u otra célula enferma. En casos adicionales, la Key-ChEM o T-ChARM puede comprender además un componente detectable (por ejemplo, biotina, resto fluorescente, radionúclido), que es útil para rastrear u obtener imágenes de células cancerosas, células infectadas u otros tejidos (por ejemplo, tejido bajo ataque autoinmunitario). En todavía casos adicionales, la Key-ChEM o T-ChARM puede comprender además un componente funcional (por ejemplo, un resto inmunoestimulador, una citocina, un modulador inmunitario, una proteína inmunoglobulina o similares).

Las partes componentes de las proteínas de fusión de la presente divulgación se describen adicionalmente con detalle en el presente documento.

Casete de etiqueta

Un casete de etiqueta contenido en una proteína de fusión de cadena sencilla según la presente divulgación (por ejemplo, Key-ChEM o T-ChARM) será un componente extracelular que puede unirse específicamente a un receptor o una pareja de unión relacionados (por ejemplo, anticuerpo) con alta afinidad o avidez, en el que el receptor o la pareja de unión relacionados es heterólogo o no endógeno de un huésped o una célula que expresa una Key-ChEM o T-ChARM. Dentro de una estructura de proteína de fusión de cadena sencilla, un casete de etiqueta puede ubicarse (a) inmediatamente amino-terminal con respecto a una región conectora, (b) interpuesto entre y conectando módulos de ligador, (c) inmediatamente carboxilo-terminal con respecto a un dominio de unión, (d) interpuesto entre y conectando un dominio de unión (por ejemplo, scFv) con un dominio efector, (e) interpuesto entre y conectando subunidades de un dominio de unión o (f) en el extremo amino-terminal de una proteína de fusión de cadena sencilla de esta divulgación. En determinados casos, uno o más aminoácidos de unión pueden estar dispuestos entre y conectando un casete de etiqueta con una porción hidrófoba, o dispuestos entre y conectando un casete de etiqueta con una región conectora, o dispuestos entre y conectando un casete de etiqueta con un módulo de ligador, o dispuestos entre y conectando un casete de etiqueta con un dominio de unión.

Los casetes de etiqueta a modo de ejemplo incluyen Strep tag (que se refiere a la Strep® tag original, la Strep® tag II o cualquier variante de las mismas; véase, por ejemplo, la patente estadounidense n.° 7.981.632), etiqueta His, etiqueta Flag (SEQ ID NO.: 3), etiqueta Xpress (Se Q ID NO.: 4), etiqueta Avi (SEQ ID NO.: 5), etiqueta de calmodulina (^sE^qID NO.: 19), etiqueta de poliglutamato, etiqueta HA (SEQ ID NO.: 6), etiqueta Myc (SEQ ID NO.: 7), etiqueta Nus, etiqueta S, etiqueta SBP, Softag 1 (SEQ ID NO.: 9), Softag 3 (SEQ ID NO.: 32), etiqueta V5 (SEQ ID NO.: 8), proteína de unión a CREB (CBP), glutatión S-transferasa (GST), proteína de unión a maltosa (MBP), proteína fluorescente verde (GFP), etiqueta de tiorredoxina o cualquier combinación de las mismas. En determinadas realizaciones, un casete de etiqueta es una Strep tag que tiene una secuencia de aminoácidos de Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (SEQ ID NO.: 1) o Trp-Arg-His-Pro-Gln-Phe-Gly-Gly (SEQ ID NO.: 2). En el presente documento se divulga que un casete de etiqueta puede ser un sitio de afinidad modificado por ingeniería genética, tal como un sitio de quelación mínima (por ejemplo, HGGHHG, SEQ ID NO.: 33).

Los casetes de etiqueta pueden estar presentes en múltiples copias en proteínas de fusión de esta divulgación. Por ejemplo, una proteína de fusión de esta divulgación puede tener uno, dos, tres, cuatro o cinco casetes de etiqueta (por ejemplo, Strep tag). En determinados casos, una región conectora de una Key-ChEM o T-ChARM incluye un casete de etiqueta, dos casetes de etiqueta, tres casetes de etiqueta, cuatro casetes de etiqueta o cinco casetes de etiqueta. Cada uno de la pluralidad de casetes de etiqueta pueden ser iguales o diferentes. En el presente documento se divulga una Key-ChEM o T-ChARM que tiene una Strep tag y un casete de Strep tag, o una etiqueta His y un casete de Strep tag, o una etiqueta HA y un casete de Strep tag, o una etiqueta Myc y un casete de Strep tag. Alternativamente, una Key-ChEM o T-ChARM tendrá múltiples casetes de etiqueta del mismo tipo o de la misma secuencia de aminoácidos, tal como dos, tres, cuatro o cinco casetes de Strep tag (por ejemplo, Strep tag II).

Por ejemplo, una Key-ChEM o T-ChARM puede tener al menos dos casetes de etiqueta diferentes. En algunos casos, un primer casete de etiqueta puede proporcionar una señal de estimulación y un segundo casete de etiqueta distinto podría usarse para asociarse con un reactivo de detección o asociarse con un conjugado de anticuerpo-toxina o con un conjugado de anticuerpo-agente de obtención de imágenes. En casos adicionales, los dos o más primeros casetes de etiqueta pueden ubicarse en diferentes áreas de una Key-ChEM o T-ChARM. En determinados casos, un primer casete de etiqueta se ubica en la región conectora y un segundo casete de etiqueta se ubica en el extremo aminoterminal o carboxilo-terminal o ambos de una Key-ChEM o T-ChARM (véase, por ejemplo, la figura 1H).

En determinadas realizaciones, un casete de etiqueta comprende desde aproximadamente cinco hasta aproximadamente 500 aminoácidos, o desde aproximadamente seis hasta aproximadamente 100 aminoácidos, o desde aproximadamente siete hasta aproximadamente 50 aminoácidos, o desde aproximadamente ocho hasta aproximadamente 20 aminoácidos. En algunas realizaciones, un casete de etiqueta tiene de siete a diez aminoácidos. Preferiblemente, un casete de etiqueta es no inmunogénico o mínimamente inmunogénico. Esencialmente, un casete de etiqueta puede funcionar como un mango o una baliza para permitir la identificación, el enriquecimiento, el aislamiento, el fomento de la proliferación, la activación, el rastreo o la eliminación de células que expresan una Key-ChEM o T-ChARM.

En determinadas realizaciones, un casete de etiqueta se ubica dentro de una región conectora de una proteína de fusión de esta divulgación. Por ejemplo, una región conectora puede comprender además un módulo de ligador adyacente a un casete de etiqueta, en la que el módulo de ligador con el casete de etiqueta tiene una secuencia de aminoácidos de (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)2-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (SEQ ID NO.: 20), Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)2 (SEQ ID NO.: 21), (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)2-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(Gly-Gly-Gly-Ser)2-Gly-Gly-Ser-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (SEQ ID NO.: 22), Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(Gly-Gly-Gly-Ser)2-Gly-Gly-Ser-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)2 (SEQ ID NO.: 23), (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)2-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(Gly-Gly-Gly-Ser)2-Gly-Gly-Ser-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)2-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (SEQID NO.:24), o Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)2-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(Gly-Gly-Gly-Ser)2-Gly-Gly-Ser-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)2 (SEQ ID NO.: 25).

Una proteína de fusión de cadena sencilla que comprende uno o más casetes de etiqueta tal como se describe en el presente documento será capaz de asociarse con una pareja de unión relacionada, en la que la pareja de unión relacionada es heteróloga del huésped o de la célula que expresa una proteína de fusión que comprende un casete de etiqueta tal como se describe en el presente documento. Un casete de etiqueta presente en una Key-ChEM o T-ChARM de cadena sencilla de esta divulgación es una Strep tag, que tiene estreptavidina, Streptactin o ambas como pareja de unión relacionada. En determinadas realizaciones, la pareja de unión relacionada (por ejemplo, receptor, proteína, anticuerpo) puede ser soluble, formar parte de una composición de matriz o estar conjugada con una superficie sólida (por ejemplo, placa, perla). Las superficies sólidas a modo de ejemplo incluyen perlas y partículas (por ejemplo, micropartículas y nanopartículas), tales como partículas y perlas magnéticas.

En realizaciones de proteínas de fusión T-ChARM de cadena sencilla, puede formarse un complejo proteico entre una proteína de fusión y una pareja de unión de casete de etiqueta relacionada, que es el resultado de la unión entre el casete de etiqueta y la pareja de unión. En determinadas realizaciones, una T-ChARM comprende un scFv o dominio de unión a scTCR, en la que el casete de etiqueta se ubica dentro del ligador de región variable (entre las subunidades del dominio de unión). En otras realizaciones, una T-ChARM tiene un casete de etiqueta ubicada en el extremo aminoterminal del dominio de unión. En tales complejos proteicos o estructuras de proteína de fusión, un dominio de unión de T-ChARM conservará su especificidad por la diana o su afinidad de unión a diana específica.

Región conectora y bisagra

Una región conectora que comprende una bisagra en una proteína de fusión de cadena sencilla según la presente divulgación puede ubicarse (a) inmediatamente amino-terminal con respecto a una porción hidrófoba, (b) interpuesta entre y conectando un casete de etiqueta (por ejemplo, Strep tag) y un dominio efector, (c) inmediatamente carboxiloterminal con respecto a un dominio de unión o (d) interpuesta entre y conectando un módulo de ligador y un dominio efector. Una proteína de fusión de cadena sencilla que comprende una región conectora con una bisagra tal como se describe en el presente documento será capaz de asociarse con otra proteína de fusión de cadena sencilla para formar un dímero (por ejemplo, homodímero o heterodímero), en la que un dímero de Key-ChEM o T-ChARM contendrá uno o más casetes de etiqueta capaces de unirse a una pareja de unión relacionada, y un dímero de T-ChARM comprenderá además un dominio de unión que conserva su especificidad por la diana o su afinidad de unión a diana específica.

Una región conectora puede componerse de sólo una bisagra, sólo módulos de ligador, una bisagra y módulos de ligador, o una bisagra, uno o más módulos de ligador y uno o más casetes de etiqueta. En determinadas realizaciones, los módulos de ligador incluyen desde aproximadamente dos hasta aproximadamente 20 aminoácidos que forman una estructura flexible. Los módulos de ligador a modo de ejemplo incluyen una inmunoglobulina CH2CH3, una inmunoglobulina CH3 o una o más GlyxSery, en la que x e y son independientemente un número entero desde 0 hasta 10 siempre que x e y no sean ambos 0 (por ejemplo, (Gly4Ser)2 (SEQ ID NO.: 67), (Gly3Ser)2 (SEQ ID NO.: 68), Gly2Ser o una combinación de las mismas, tal como (Gly3Ser)2Gly2Ser (SEQ ID NO.: 69). En realizaciones adicionales, una región conectora comprende un casete de etiqueta. Por ejemplo, una región conectora contiene desde uno hasta cinco casetes de etiqueta, en la que cada casete de etiqueta se conecta a uno o dos módulos de ligador que comprenden una (GlyxSery)n, en la que n es un número entero desde 1 hasta 10 y x e y son independientemente un número entero desde 0 hasta 10 siempre que x e y no sean ambos 0. Los módulos de ligador a modo de ejemplo tienen una secuencia de aminoácidos de Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (SEQ ID NO.: 10), (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)2 (SEQ ID NO.: 11), (Gly-Gly-Gly-Ser)2-Gly-Gly-Ser (SEQ ID ⁿO.: 12), que puede estar presente en cualquier combinación dentro de una región conectora.

En determinados casos, una bisagra presente en una Key-ChEM o T-ChARM de cadena sencilla de esta divulgación puede ser una región bisagra de inmunoglobulina, tal como una región bisagra de inmunoglobulina de tipo natural o una región bisagra de inmunoglobulina alterada de la misma. En determinadas realizaciones, una bisagra es una región bisagra de inmunoglobulina humana de tipo natural. En otras determinadas realizaciones, pueden añadirse uno o más residuos de aminoácido en el extremo amino-terminal o carboxilo-terminal de una región bisagra de inmunoglobulina de tipo natural como parte de un diseño de constructo de proteína de fusión. Por ejemplo, pueden estar presentes uno, dos o tres residuos de aminoácido de unión adicionales en el extremo amino-terminal o carboxiloterminal de la bisagra, o una bisagra puede contener una deleción terminal o interna y haber vuelto a añadir uno, dos o tres residuos de aminoácido de unión adicionales.

En determinadas realizaciones, una bisagra es una bisagra de inmunoglobulina alterada en la que se sustituyen uno o más residuos de cisteína en una región bisagra de inmunoglobulina de tipo natural por uno o más de otros residuos de aminoácido. Las bisagras de inmunoglobulina alteradas a modo de ejemplo incluyen una región bisagra de inmunoglobulina humana IgG1, IgG2 o IgG4 que tiene uno, dos o tres residuos de cisteína encontrados en una bisagra de IgG1, IgG2 o IgG4 humana de tipo natural sustituidos por uno, dos o tres residuos de aminoácido diferentes (por ejemplo, serina o alanina). En determinadas realizaciones, un polipéptido bisagra comprende o es una secuencia que es al menos el 80%, al menos el 81%, al menos el 82%, al menos el 83%, al menos el 84%, al menos el 85%, al menos el 86%, al menos el 87%, al menos el 88%, al menos el 89%, al menos el 90%, al menos el 91%, al menos el 92%, al menos el 93%, al menos el 94%, al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98%, al menos el 99% idéntica a una región bisagra de inmunoglobulina de tipo natural, tal como una bisagra de IgG1 humana de tipo natural, una bisagra de IgG2 humana de tipo natural o una bisagra de IgG4 humana de tipo natural.

En algunos casos, una bisagra presente en una Key-ChEM o T-ChARM de cadena sencilla de esta divulgación puede ser una bisagra que no se basa en o deriva de una bisagra de inmunoglobulina (es decir, no es una bisagra de inmunoglobulina de tipo natural ni una bisagra de inmunoglobulina alterada). Los ejemplos de tales bisagras incluyen péptidos de aproximadamente cinco a aproximadamente 150 aminoácidos de la región de tallo de lectinas C de tipo II o moléculas de CD, incluyendo péptidos de aproximadamente ocho a aproximadamente 25 aminoácidos o péptidos de aproximadamente siete a aproximadamente 18 aminoácidos, o variantes de los mismos.

Una “región de tallo” de una lectina C de tipo II o molécula de CD se refiere a la porción del dominio extracelular de la lectina C de tipo II o molécula de CD que se ubica entre el dominio similar a lectina de tipo C (CTLD; por ejemplo, similar a CTLD de receptores de linfocitos citolíticos naturales) y la porción hidrófoba (dominio transmembrana). Por ejemplo, el dominio extracelular de CD94 humana (n.° de registro de GenBank AAC50291.1) corresponde a los residuos de aminoácido 34-179, pero el CTLD corresponde a los residuos de aminoácido 61-176, por tanto, la región de tallo de la molécula de CD94 humana comprende los residuos de aminoácido 34-60, que se ubican entre la porción hidrófoba (dominio transmembrana) y el CTLD (véase Boyington et al., Immunity 10:75, 1999; para descripciones de otras regiones de tallo, véanse también Beavil et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 89:753, 1992; y Figdor et al., Nat. Rev. Immunol. 2:77, 2002). Estas lectinas C de tipo II o moléculas de CD también pueden tener aminoácidos de unión entre la región de tallo y la región transmembrana o el CTLD. En otro ejemplo, la proteína NKG2A humana de 233 aminoácidos (n.° de registro de GenBank P26715.1) tiene una porción hidrófoba (dominio transmembrana) que oscila desde los aminoácidos 71-93 y un dominio extracelular que oscila desde los aminoácidos 94-233. El CTLD comprende los aminoácidos 119-231 y la región de tallo comprende los aminoácidos 99-116, que pueden estar flanqueados por aminoácidos de unión adicionales. En la técnica se conocen otras lectinas C de tipo II o moléculas de CD, así como sus dominios de unión a ligando extracelulares, regiones de tallo y CTLD (véanse, por ejemplo, los n.os de registro de GenBank NP_001993.2; AAH07037.1; NP_001773.1; AAL65234.1; CAA04925.1; para las secuencias de CD23, CD69, CD72, NKG2A y NKG2D humanas y sus descripciones, respectivamente).

Un “derivado” de una bisagra de región de tallo, o fragmento de la misma, de una lectina C de tipo II o molécula de CD incluye una secuencia de aproximadamente ocho a aproximadamente 150 aminoácidos, en la que uno, dos o tres aminoácidos de la región de tallo de una lectina C de tipo II o molécula de CD de tipo natural tienen una deleción, inserción, sustitución o cualquier combinación de las mismas. Por ejemplo, un derivado puede comprender una o más sustituciones de aminoácido y/o una deleción de aminoácido. En determinadas realizaciones, un derivado de una región de tallo es más resistente a la escisión proteolítica en comparación con la secuencia de región de tallo de tipo natural, tal como aquellos derivados de aproximadamente ocho a aproximadamente 20 aminoácidos de NKG2A, NKG2D, CD23, CD64, CD72 o CD94.

En determinadas realizaciones, las bisagras de región de tallo pueden comprender desde aproximadamente siete hasta aproximadamente 18 aminoácidos y pueden formar una estructura de bobina en espiral a-helicoidal. En determinadas realizaciones, las bisagras de región de tallo contienen 0, 1, 2, 3 ó 4 cisteínas. Las bisagras de región de tallo a modo de ejemplo incluyen fragmentos de las regiones de tallo, tales como aquellas porciones que comprenden desde aproximadamente diez hasta aproximadamente 150 aminoácidos de las regiones de tallo de CD69, CD72, CD94, NKG2A y NKG2D.

Las bisagras alternativas que pueden usarse en Key-ChEM o T-ChARM de cadena sencilla de esta divulgación son de porciones de receptores de superficie celular (regiones interdominio) que conectan dominios de tipo V de inmunoglobulina o de tipo C de inmunoglobulina. Las regiones entre dominios de tipo V de Ig, en los que el receptor de superficie celular contiene múltiples dominios de tipo V de Ig en tándem, y entre dominios de tipo C de Ig, en los que el receptor de superficie celular contiene múltiples regiones de tipo C de Ig en tándem, también se contemplan como bisagras útiles en Key-ChEM o T-ChARM de cadena sencilla de esta divulgación. En determinadas realizaciones, las secuencias de bisagra comprendidas de regiones interdominio de receptor de superficie celular pueden contener además un motivo que se produce de manera natural o añadido, tal como una secuencia de bisagra central de IgG para proporcionar uno o más enlaces disulfuro para estabilizar la formación de dímero Key-ChEM o T-ChARM. Los ejemplos de bisagras incluyen regiones interdominio entre las regiones de tipo V de Ig y de tipo C de Ig de CD2, CD4, CD22, CD33, CD48, CD58, CD66, CD80, CD86, CD150, CD166 o CD244.

En determinadas realizaciones, las secuencias de bisagra tienen desde aproximadamente 5 hasta aproximadamente 150 aminoácidos, desde aproximadamente 5 hasta aproximadamente 10 aminoácidos, desde aproximadamente 10 hasta aproximadamente 20 aminoácidos, desde aproximadamente 20 hasta aproximadamente 30 aminoácidos, desde aproximadamente 30 hasta aproximadamente 40 aminoácidos, desde aproximadamente 40 hasta aproximadamente 50 aminoácidos, desde aproximadamente 50 hasta aproximadamente 60 aminoácidos, desde aproximadamente 5 hasta aproximadamente 60 aminoácidos, desde aproximadamente 5 hasta aproximadamente 40 aminoácidos, por ejemplo, desde aproximadamente 8 hasta aproximadamente 20 aminoácidos o desde aproximadamente 10 hasta aproximadamente 15 aminoácidos. Las bisagras pueden ser principalmente flexibles, pero también pueden proporcionar características más rígidas o pueden contener principalmente una estructura a-helicoidal con mínima estructura de lámina p.

En determinadas realizaciones, una secuencia de bisagra es estable en plasma y suero y es resistente a la escisión proteolítica. Por ejemplo, puede mutarse o delecionarse la primera lisina en una región bisagra superior de IgG1 para minimizar la escisión proteolítica, y las bisagras pueden incluir aminoácidos de unión. En algunas realizaciones, una secuencia de bisagra puede contener un motivo que se produce de manera natural o añadido, tal como una estructura central de bisagra de inmunoglobulina CPPCP (SEQ ID NO.: 26) que otorga la capacidad de formar un enlace disulfuro o múltiples enlaces disulfuro para estabilizar la formación de dímeros.

Porción hidrófoba

Una porción hidrófoba contenida en una proteína de fusión de cadena sencilla de la presente divulgación (por ejemplo, Key-ChEM o T-ChARM) permitirá que una proteína de fusión de esta divulgación se asocie con una membrana celular, de tal manera que una porción de la proteína de fusión se ubicará extracelularmente (por ejemplo, casete de etiqueta, dominio conector, dominio de unión) y una porción se ubicará intracelularmente (por ejemplo, dominio efector). Una porción hidrófoba estará dispuesta generalmente dentro de la bicapa fosfolipídica de la membrana celular. En determinadas realizaciones, uno o más aminoácidos de unión pueden estar dispuestos entre y conectando una porción hidrófoba con un dominio efector, o dispuestos entre y conectando una porción hidrófoba con una región conectora, o dispuestos entre y conectando una porción hidrófoba con un casete de etiqueta.

En determinadas realizaciones, una dominio hidrófobo es un dominio transmembrana, tal como uno derivado de una proteína de membrana integral (por ejemplo, receptor, molécula de agrupación de diferenciación (CD), enzima, transportador, molécula de adhesión de células o similares). En realizaciones particulares, una porción hidrófoba es un dominio transmembrana de CD4, CD8, CD27 o CD28. En determinadas realizaciones, un dominio transmembrana es un dominio transmembrana de CD28 que tiene un aminoácido tal como se expone en SEQ ID NO.: 16.

Dominio efector

Un dominio efector contenido en una proteína de fusión de cadena sencilla de la presente divulgación (por ejemplo, Key-ChEM o T-ChARM) será un componente intracelular y capaz de transmitir señales funcionales a una célula. En determinados casos, una Key-ChEM o T-ChARM de cadena sencilla formará un dímero con una segunda Key-ChEM o T-ChARM de cadena sencilla, respectivamente, en la que la dimerización permite que el componente intracelular que comprende un dominio efector esté en la proximidad cercana y fomente la transducción de señales cuando se expone a la señal apropiada. Además de formar tales complejos proteicos diméricos, los dominios efectores pueden asociarse además con otros factores de señalización, tales como factores coestimuladores, para formar complejos multiproteicos que producen una señal intracelular. En determinadas realizaciones, un dominio efector fomentará indirectamente una respuesta celular mediante la asociación con uno o más de otras proteínas que fomentan directamente una respuesta celular. Un dominio efector puede incluir uno, dos, tres o más dominios de señalización del receptor, dominios coestimuladores o combinaciones de los mismos. Cualquier componente intracelular que comprende un dominio efector, un dominio coestimulador o ambos de cualquiera de una variedad de moléculas de señalización (por ejemplo, receptores de transducción de señales) puede usarse en la proteínas de fusión de esta divulgación.

Un dominio efector útil en las proteínas de fusión de esta divulgación puede ser de una proteína de una ruta de señalización Wnt (por ejemplo, LRP, Ryk, ROR2), ruta de señalización NOTCH (por ejemplo, NOTCH1, NTOCH2, NOTCH3, NOTCH4), ruta de señalización Hedgehog (por ejemplo, PTCH, SMO), tirosina cinasas receptoras (RTK) (por ejemplo, familia del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGF), familia del receptor del factor de crecimiento de fibroblastos (f Gf ), familia del receptor del factor de crecimiento de hepatocitos (HGF), familia del receptor de insulina (IR), familia del receptor del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), familia del receptor del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), familia del receptor de cinasas receptoras de tropomicina (Trk), familia del receptor de efrina (Eph), familia del receptor de AXL, familia del receptor de tirosina cinasas de leucocitos (LTK), familia del receptor tirosina cinasa con dominios 1 de tipo inmunoglobulina y de tipo EGF (TIE), familia de receptores huérfanos similares a tirosina cinasas receptoras (ROR), familia del receptor del dominio de discoidina (DDR), familia del receptor reordenado durante la transfección (RET), familia del receptor de proteínas tirosina cinasas (PTK7), familia del receptor relacionado con el receptor de tirosina cinasas (RYK), familia del receptor de cinasas específicas de músculo (MuSK)); receptores acoplados a proteínas G, GPCR (Frizzled, Smoothened); receptores serina/treonina cinasas (BMPR, TGFR); o receptores de citocinas (IL1R, IL2R, IL7R, IL15R).

En determinadas realizaciones, un dominio efector comprende un dominio de señalización de receptores de linfocitos o comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una o una pluralidad de motivos de activación inmunorreceptores basados en tirosina (ITAM). En todavía realizaciones adicionales, un dominio efector comprende una porción citoplásmica que se asocia con una proteína de señalización citoplásmica, en el que la proteína de señalización citoplásmica es un receptor de linfocitos o dominio de señalización del mismo, una proteína que comprende una pluralidad de ITAM, un factor coestimulador o cualquier combinación de los mismos.

Los dominios efectores a modo de ejemplo incluyen aquellos de 4-1BB (por ejemplo, SEQ ID NO.: 17), CD3e, CD38, CD3C (por ejemplo, SEQ ID NO.: 18), CD27, CD28 (por ejemplo, SEQ ID NO.: 35), CD79A, CD79B, CARD11, DAP10, FcRa , FcRp, FcRy, Fyn, HVEM, ICOS, Lck, LAG3, LAT, LRP, NOTCH1, Wnt, NKG2D, OX40, ROR2, Ryk, SLAMF1, Slp76, pTa , TCRa , TCRp, TRIM, Zap70, PTCH2 o cualquier combinación de los mismos.

En casos particulares, un dominio efector de una Key-ChEM o T-ChARM de la presente divulgación es CD3 ^y CD28, es CD3C y 4-1BB, o es CD3C, CD28 y 4-1BB.

Dominio de unión

Tal como se describe en el presente documento, una proteína de fusión T-ChARM de cadena sencilla de la presente divulgación comprende un dominio de unión que se une específicamente a una diana. La unión de una diana mediante el dominio de unión puede bloquear la interacción entre la diana (por ejemplo, un receptor o un ligando) y otra molécula y, por ejemplo, interferir, reducir o eliminar determinadas funciones de la diana (por ejemplo, transducción de señales), o la unión de una diana puede inducir determinadas rutas biológicas o identificar la diana para su eliminación.

Un dominio de unión puede ser cualquier péptido que se une específicamente a una diana de interés. Las fuentes de dominios de unión incluyen regiones variables de anticuerpo de diversas especies (que pueden estar en forma de anticuerpos, sFv, scFv, Fab, grababody basado en scFv, o dominio VH soluble o anticuerpos de dominio), incluyendo humano, roedor, aviar u ovino. Las fuentes adicionales de dominios de unión incluyen regiones variables de anticuerpos de otras especies, tales como camélido (de camellos, dromedarios o llamas; Ghahroudi et al., FEBS Lett.

414:521, 1997; Vincke et al., J. Biol. Chem. 284:3273, 2009; Hamers-Casterman et al., Nature 363:446, 1993 y Nguyen et al., J. Mol. Biol. 275:413, 1998), tiburones nodriza (Roux et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. (USA) 95:11804, 1998), quimera americana (Nguyen et al., Immunogen. 54:39, 2002) o lamprea (Herrin et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. (USA) 105:2040, 2008 y Alder et al. Nat. Immunol. 9:319, 2008). Estos anticuerpos pueden formar regiones de unión a antígeno usando sólo una región variable de cadena pesada, es decir, estos anticuerpos funcionales son homodímeros de cadenas pesadas sólo (denominados “anticuerpos de cadena pesada”) (Jespers et al., Nat. Biotechnol. 22:1161, 2004; Cortez-Retamozo et al., Cancer Res. 64:2853, 2004; Baral et al., Nature Med. 12:580, 2006; y Barthelemy et al., J. Biol. Chem. 283:3639, 2008).

Una fuente alternativa de dominios de unión de esta divulgación incluye secuencias que codifican para bibliotecas de péptidos al azar o secuencias que codifican para una diversidad modificada por ingeniería genética de aminoácidos en regiones de bucle de armazones alternativos sin anticuerpos, tales como scTCR (véanse, por ejemplo, Lake et al., Int. Immunol. 11:745, 1999; Maynard et al., J. Immunol. Methods 306:51, 2005; la patente estadounidense n.° 8.361.794), dominios de fibrinógeno (véase, por ejemplo, Weisel et al., Science 230:1388, 1985), dominios de Kunitz (véase, por ejemplo, la patente estadounidense n.° 6.423.498), proteínas con repeticiones de anquirina diseñadas (DARPin) (Binz et al., J. Mol. Biol. 332:489, 2003 y Binz et al., Nat. Biotechnol. 22:575, 2004), dominios de unión a fibronectina (adnectinas o monocuerpos) (Richards et al., J. Mol. Biol. 326:1475, 2003; Parker et al., Protein Eng. Des. Selec. 18:435, 2005 y Hackel et al. (2008) J. Mol. Biol. 381:1238-1252), miniproteínas de nudos de cisteínas (Vita et al. (1995) Proc. Nat'l. Acad. Sci. (USA) 92:6404-6408; Martin et al. (2002) Nat. Biotechnol. 21:71, 2002 y Huang et al.

(2005) Structure 13:755, 2005), dominios de repeticiones de tetratricopéptido (Main et al., Structure 11:497, 2003 y Cortajarena et al., ACS Chem. Biol. 3:161,2008), dominios de repeticiones ricas en leucina (Stumpp et al., J. Mol. Biol.

332:471, 2003), dominios de lipocalina (véase, por ejemplo, el documento WO 2006/095164, Beste et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. (USA) 96:1898, 1999 y Schonfeld et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. (USA) 106:8198, 2009), dominios de tipo V (véase, por ejemplo, la publicación de solicitud de patente estadounidense n.° 2007/0065431), dominios de lectinas de tipo C (Zelensky y Gready, FEBSJ. 272:6179, 2005; Beavil et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. (USA) 89:753, 1992 y Sato et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. (USA) 100:7779, 2003), mAb2 o Fcab™ (véanse, por ejemplo, las publicaciones de solicitud de patente PCT n.os W o 2007/098934; WO 2006/072620), proteínas con repeticiones de armadillo (véanse, por ejemplo, Madhurantakam et al., Protein Sci. 21: 1015, 2012; la publicación de solicitud de patente PCT n.° WO 2009/040338), afilina (Ebersbach et al., J. Mol. Biol. 372: 172, 2007), affibody, avímeros, knottinas, finómeros, atrímeros, proteína 4 asociada a linfocitos T citotóxicos (Weidle et al., Cancer Gen. Proteo. 10:155, 2013) o similares (Nord et al., Protein Eng. 8:601, 1995; Nord et al., Nat. Biotechnol. 15:772, 1997; Nord et al., Euro. J. Biochem.

268:4269, 2001; Binz et al., Nat. Biotechnol. 23:1257, 2005; Boersma y Pluckthun, Curr. Opin. Biotechnol. 22:849, 20 11 ).

Los dominios de unión de esta divulgación pueden generarse tal como se describe en el presente documento o mediante una variedad de métodos conocidos en la técnica (véanse, por ejemplo, las patentes estadounidenses n.os 6.291.161 y 6.291.158). Por ejemplo, los dominios de unión de esta divulgación pueden identificarse seleccionando una biblioteca de fagos de Fab para fragmentos Fab que se unen específicamente a una diana de interés (véase Hoet et al., Nat. Biotechnol. 23:344, 2005). Además, pueden usarse estrategias tradicionales para el desarrollo del hibridoma usando una diana de interés como inmunógeno en sistemas convenientes (por ejemplo, ratones, HuMAb mouse®, TC mouse™, KM-mouse®, llamas, gallinas, ratas, hámsteres, conejos, etc.) para desarrollar los dominios de unión de esta divulgación.

En algunas realizaciones, un dominio de unión es un fragmento Fv de cadena sencilla (scFv) que comprende regiones VH y VL específicas para una diana de interés. En determinadas realizaciones, las regiones Vh y Vl son humanas. Las regiones Vh y Vl a modo de ejemplo incluyen los segmentos de anticuerpo monoclonal específico anti-CD 19 FMC63 (véanse, por ejemplo, las SEQ ID NO.: 51 y 52, respectivamente).

En determinadas realizaciones, un dominio de unión comprende o es una secuencia que es al menos el 90%, al menos el 91%, al menos el 92%, al menos el 93%, al menos el 94%, al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98%, al menos el 99%, al menos el 99,5% o el 100% idéntica a una secuencia de aminoácidos de una región variable de cadena ligera (Vl) (por ejemplo, de FMC63, SEQ ID NO.: 52; de R12, SEQ ID NO.: 56) o a una región variable de cadena pesada (Vh) (por ejemplo, de FMC63, SEQ ID NO.: 51; de R12, SEQ ID NO.: 55), o ambas, en el que cada CDR no comprende ningún cambio o comprende como máximo uno, dos o tres cambios, de un anticuerpo monoclonal o fragmento o derivado del mismo que se une específicamente a una diana de interés (por ejemplo, CD19, ROR1).

En determinadas realizaciones, una región Vh de dominio de unión de la presente divulgación puede derivarse de o basarse en una V^hde un anticuerpo monoclonal conocido y contener una o más (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10) inserciones, una o más (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10) deleciones, una o más (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10) sustituciones de aminoácido (por ejemplo, sustituciones conservadoras de aminoácido o sustituciones no conservadoras de aminoácido), o una combinación de los cambios indicados anteriormente, en comparación con la Vh de un anticuerpo monoclonal conocido. Una inserción, deleción o sustitución puede estar en cualquier parte en la región Vh, incluyendo en el extremo amino-terminal o carboxilo-terminal o ambos extremos de esta región, siempre que cada CDR no comprenda ningún cambio o comprenda como máximo uno, dos o tres cambios y siempre que un dominio de unión que contiene la región Vh modificada todavía pueda unirse específicamente a su diana con una afinidad similar al dominio de unión de tipo natural.

En realizaciones adicionales, una región Vl en un dominio de unión de la presente divulgación se deriva de o se basa en una V^lde un anticuerpo monoclonal conocido y contiene una o más (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10) inserciones, una o más (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10) deleciones, una o más (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10) sustituciones de aminoácido (por ejemplo, sustituciones conservadoras de aminoácido o sustituciones no conservadoras de aminoácido), o una combinación de los cambios indicados anteriormente, en comparación con la Vl del anticuerpo monoclonal conocido. Una inserción, deleción o sustitución puede estar en cualquier parte en la región Vl, incluyendo en el extremo amino-terminal o carboxilo-terminal o ambos extremos de esta región, siempre que cada CDR no comprenda ningún cambio o comprenda como máximo uno, dos o tres cambios y siempre que un dominio de unión que contiene la región Vl modificada todavía pueda unirse específicamente a su diana con una afinidad similar al dominio de unión de tipo natural.

Los dominios Vh y Vl pueden estar dispuestos en cualquier orientación (es decir, desde el extremo amino-terminal hasta el extremo carboxilo-terminal, Vh-Vl o Vl-Vh) y pueden estar unidos mediante una secuencia de aminoácidos (por ejemplo, que tiene una longitud de aproximadamente cinco a aproximadamente 35 aminoácidos) capaz de proporcionar una función espaciadora de tal manera que los dos subdominios de unión pueden interaccionar para formar un dominio de unión funcional. En determinadas realizaciones, un ligador de región variable que une los dominios V^hy V^lincluye aquellos pertenecientes a la familia de (GlynSer), tales como (Gly3Ser)n(Gly4Ser)1 (SEQ ID NO.: 72), (Gly3Ser)i(Gly4Ser)n (SEQ ID NO.: 72), (Gly3Ser)n(Gly4Ser)n (SEQ ID NO.: 72) o (Gly4Ser)n (SEQ ID NO.: 10), en las que n es un número entero de 1 a 5. En determinadas realizaciones, el ligador es (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)3 (^sE^qID NO.: 13) o Gly-Gly-Gly-Ser)4 (SEQ ID NO.: 14). En determinadas realizaciones, estos ligadores basados en (GlynSer) se usan para unir los dominios Vh y Vl en un dominio de unión, y estos ligadores también pueden usarse para unir el dominio de unión a una región conectora o a un casete de etiqueta, o para unir un casete de etiqueta a un dominio efector. En otras determinadas realizaciones, un casete de etiqueta forma parte de o se ubica dentro de un ligador basado en (GlynSer) usado para unir los dominios Vh y Vl de un dominio de unión. En algunos casos, un ligador basado en (GlynSer) puede usarse para conectar uno o más casetes de etiqueta con el extremo N-terminal de un dominio de unión de T-ChARM.

En algunas realizaciones, un dominio de unión es un receptor de células T de cadena sencilla (scTCR) que comprende cadenas Va/p y Ca/p (por ejemplo, Va-Ca, Vp-Cp, Va-Vp) o que comprende el par Va-Ca, Vp-Cp, Va-Vp específico para una diana de interés (por ejemplo, complejo de péptido-CMH).

En determinadas realizaciones, un dominio de unión comprende o es una secuencia que es al menos el 90%, al menos el 91%, al menos el 92%, al menos el 93%, al menos el 94%, al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98%, al menos el 99%, al menos el 99,5% o el 100% idéntica a una secuencia de aminoácidos de una Va, Vp, Ca o Cp de TCR, en el que cada CDR no comprende ningún cambio o comprende como máximo uno, dos o tres cambios, de un TCR o fragmento o derivado del mismo que se une específicamente a una diana de interés.

En determinadas realizaciones, una región Va, Vp, Ca o Cp de dominio de unión de la presente divulgación puede derivarse de o basarse en una Va, Vp, Ca o Cp de un TCR conocido (por ejemplo, un TCR de alta afinidad) y contener una o más (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10) inserciones, una o más (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10) deleciones, una o más (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10) sustituciones de aminoácido (por ejemplo, sustituciones conservadoras de aminoácido o sustituciones no conservadoras de aminoácido), o una combinación de los cambios indicados anteriormente, en comparación con la Va, Vp, Ca o Cp de un TCR conocido. Una inserción, deleción o sustitución puede estar en cualquier parte en una región Va, Vp, Ca o Cp, incluyendo en el extremo amino-terminal o carboxilo-terminal o ambos extremos de estas regiones, siempre que cada CDR no comprenda ningún cambio o comprenda como máximo uno, dos o tres cambios y siempre que un dominio de unión que contiene una región Va, Vp, Ca o Cp modificada todavía pueda unirse específicamente a su diana con una afinidad similar al de tipo natural.

Una molécula diana, que está unida específicamente mediante un dominio de unión contenido en una proteína de fusión T-ChARM de cadena sencilla de la presente divulgación, puede encontrarse en o en asociación con una célula de interés (“célula diana”). Las células diana a modo de ejemplo incluyen una célula cancerosa, una célula asociada con un trastorno o una enfermedad autoinmunitaria o con un trastorno o una enfermedad inflamatoria, y una célula o un organismo infecciosos (por ejemplo, bacteria, virus, célula infectada por virus). Una célula de un organismo infeccioso, tal como un parásito de mamífero, también se contempla como un célula diana.

En determinados casos, los dominios de unión de una proteína de fusión T-ChARM de cadena sencilla de la presente divulgación reconocen una diana seleccionada de un antígeno tumoral, una célula B diana, un miembro de la superfamilia de receptores de TNF, un miembro de la familia de Hedgehog, una tirosina cinasa receptora, una molécula relacionada con proteoglicanos, un miembro de la superfamilia de TGF-p, una molécula relacionada con Wnt, una diana de células T, una diana de células dendríticas, una diana de células NK, una diana de células monocíticas/macrófagas o una diana de angiogénesis. En casos adicionales, los dominios de unión de una proteína de fusión T-ChARM de cadena sencilla de la presente divulgación se unen a una proteína receptora, tal como proteínas receptoras de membrana periférica o proteínas receptoras transmembrana.

En determinados casos, una proteína de fusión T-ChARM de cadena sencilla de la presente divulgación se une específicamente a una diana, tal como CD3, CEACAM6, c-Met, EGFR, EGFRvIII, ErbB2, ErbB3, ErbB4, EphA2, IGF1R, GD2, O-acetil GD2, O-acetil GD3, GHRHR, GHR, FLT1, KDR, FLT4, CD44v6, CD151, CA125, CEA, CTLA-4, GITR, BTLA, TGFBR2, TGFBR1, IL6R, gp130, Lewis A, Lewis Y, TNFR1, TNFR2, PD1, PD-L1, PD-L2, HVEM, MAGE-A, mesotelina, NY-ESO-1, PSMA, RANK, ROR1, TNFRSF4, CD40, CD137, TWEAK-R, HLA, péptidos derivados de tumor o patógeno unidos a HLA (tal como de hTERT, tirosinasa o WT-1), LTpR, LIFRp, LRP5, MUC1, OSMRp, TCRa, TCRp, CD19, CD20, CD22, CD25, CD28, CD30, CD33, CD52, CD56, CD80, CD81, CD86, CD123, CD171, CD276, B7H4, TLR7, TLR9, PTCH1, PTCH1, Robo1, a-fetoproteína (AFP), Frizzled, OX40 (también denominada CD134) o CD79b. En determinados casos, una proteína de fusión T-ChARM de cadena sencilla de la presente divulgación se une específicamente a una molécula específica de patógeno expresada en células infectadas, tales como moléculas de un adenovirus, bunyavirus, virus del herpes (por ejemplo, virus de Epstein Barr, citomegalovirus), papovavirus, papilomavirus (por ejemplo, virus del papiloma humano, v Ph ), paramixovirus, picornavirus, rabdovirus (por ejemplo, rabia), ortomixovirus (por ejemplo, gripe), poxvirus (por ejemplo, Vaccinia), reovirus, retrovirus, lentivirus (por ejemplo, virus de inmunodeficiencia humano, VIH), flavivirus (por ejemplo, virus de la hepatitis C, VHC; virus de la hepatitis B, VHB).

Células huésped y ácidos nucleicos

En determinados aspectos, la presente divulgación proporciona moléculas de ácido nucleico que codifican para una cualquiera o más de las Key-ChEM o T-ChARM descritas en el presente documento. Tales moléculas de ácido nucleico pueden insertarse en un vector apropiado (por ejemplo, vector viral o vector plasmídico no viral) para su introducción en una célula huésped de interés (por ejemplo, célula progenitora hematopoyética, célula T).

Tal como se usa en el presente documento, el término “recombinante” o “no natural” se refiere a un organismo, un microorganismo, una célula, una molécula de ácido nucleico o un vector que incluye al menos una alteración genética o que se ha modificado mediante la introducción de una molécula de ácido nucleico exógena, en los que tales alteraciones o modificaciones se introducen mediante ingeniería genética. Las alteraciones genéticas incluyen, por ejemplo, modificaciones que introducen moléculas de ácido nucleico expresables que codifican para proteínas, proteínas de fusión o enzimas, u otras adiciones, deleciones, sustituciones u otras perturbaciones funcionales de la molécula de ácido nucleico del material genético de una célula. Las modificaciones adicionales incluyen, por ejemplo, regiones reguladoras no codificantes en las que las modificaciones alteran la expresión de un gen u operón. En determinados casos, una célula, tal como una célula T, obtenida de un sujeto puede convertirse en una célula no natural o recombinante (por ejemplo, una célula T no natural o recombinante) mediante la introducción de un ácido nucleico que codifica para una Key-ChEM o T-ChARM tal como se describe en el presente documento y mediante lo cual la célula expresa una Key-ChEM o T-ChARM ubicada en la superficie celular.

Un vector que codifica para un virus central se denomina en el presente documento “vector viral”. Existen varios vectores virales disponibles adecuados para su uso con las composiciones de la presente divulgación, incluyendo aquellos identificados para aplicaciones de terapia génica en humanos (véase Pfeifer y Verma, Ann. Rev. Genomics Hum. Genet. 2:177, 2001). Los vectores virales adecuados incluyen vectores basados en virus del ARN, tales como vectores derivados de retrovirus, por ejemplo, vectores derivados del virus de leucemia murina (VLM) de Moloney, e incluyen vectores derivados de retrovirus más complejos, por ejemplo, vectores derivados de lentivirus. Los vectores derivados de VIH-1 pertenecen a esta categoría. Otros ejemplos incluyen vectores de lentivirus derivados de VIH-2, VIF, virus de anemia infecciosa equina, VIS y virus de Maedi-Visna (lentivirus ovino). En la técnica se conocen métodos de uso de vectores virales retrovirales y lentivirales y el acondicionamiento de células para la transducción de células huésped de mamífero con partículas virales que contienen transgenes de receptor de antígeno quimérico y se han descrito previamente, por ejemplo, en la patente estadounidense 8.119.772; Walchli etal., PLoS One 6:327930, 2011; Zhao et al., J. Immunol. 174:4415, 2005; Engels et al., Hum. Gene Ther. 14:1155, 2003; Frecha et al., Mol. Ther.

18:1748, 2010; Verhoeyen et al., Métodos Mol. Biol. 506:97, 2009. También están disponibles comercialmente sistemas de expresión y constructos de vectores retrovirales y lentivirales.

En determinadas realizaciones, se usa un vector viral para introducir una secuencia de ácido nucleico no endógena que codifica para una Key-ChEM o una secuencia de ácido nucleico no endógena que codifica para una T-ChARM específica para una diana. Un vector viral puede ser un vector retroviral o un vector lentiviral. Un vector viral también puede incluir secuencias de ácido nucleico que codifican para un marcador para la transducción. En la técnica se conocen marcadores de transducción para vectores virales e incluyen marcadores de selección, que pueden otorgar farmacorresistencia, o marcadores detectables, tales como marcadores fluorescentes o proteínas de superficie celular que pueden detectarse mediante métodos tales como citometría de flujo. En realizaciones particulares, un vector viral comprende además un marcador génico para la transducción que comprende proteína fluorescente verde, un dominio extracelular de CD2 humana o un EGf R humano truncado (huEGFRt; véase Wang et al., Blood 118:1255, 2011). Cuando un genoma de vector viral comprende una pluralidad de secuencias de ácido nucleico que van a expresarse en una célula huésped como transcritos independientes, el vector viral también puede comprender secuencias adicionales entre los dos (o más) transcritos permitiendo una expresión bicistrónica o multicistrónica. Los ejemplos de tales secuencias usadas en vectores virales incluyen sitios internos de entrada al ribosoma (IRES), sitios de escisión de furina, péptido 2A viral o cualquier combinación de los mismos.

También pueden usarse otros vectores para la administración de polinucleótidos, incluyendo vectores virales de ADN, incluyendo, por ejemplo, vectores basados en adenovirus y vectores basados en virus adenoasociados (AAV); vectores derivados de virus del herpes simple (VHS), incluyendo vectores de amplicones, VHS deficiente en la replicación y VHS atenuado (Krisky et al., Gene Ther. 5: 1517, 1998).

También pueden usarse otros vectores descubiertos recientemente para usos en terapia génica con las composiciones y los métodos de esta divulgación. Tales vectores incluyen aquello derivados de baculovirus y a-virus (Jolly, D J. 1999. Emerging Viral Vectors. Págs. 209-40 en Friedmann T. ed. The Development of Human Gene Therapy. Nueva York: Cold Spring Harbor Lab) o vectores plasmídicos (tales como el vector Sleeping Beauty u otros vectores de transposones). En algunas realizaciones, un vector viral o plasmídico comprende además un marcador génico para la transducción (por ejemplo, proteína fluorescente verde, huEGFRt).

En determinados casos, las células progenitoras hematopoyéticas o células madre embrionarias se modifican para comprender una molécula de ácido nucleico no endógena que codifica para una Key-ChEM o T-ChARM de esta divulgación. Las células progenitoras hematopoyéticas pueden comprender células progenitoras timocíticas o células madre pluripotentes inducidas, que pueden derivarse de u originarse a partir de tejido de hígado fetal, médula ósea, sangre de cordón umbilical o sangre periférica. Las células progenitoras hematopoyéticas pueden ser de humano, ratón, rata u otros mamíferos. En realizaciones particulares, se usan células progenitoras timocíticas CD24lD Lin CD117+.

En determinadas realizaciones, las condiciones de cultivo implican el cultivo de las células progenitoras hematopoyéticas que expresan las proteínas de fusión de esta divulgación durante un tiempo suficiente para inducir la proliferación o diferenciación. En general, las células se mantienen en cultivo durante de aproximadamente 3 días a aproximadamente 5 días, o de aproximadamente 4 a aproximadamente 10 días, o de aproximadamente 5 a aproximadamente 20 días. Se apreciará que las células pueden mantenerse durante una cantidad apropiada de tiempo requerido para lograr el resultado deseado, es decir, una composición celular o un nivel de proliferación deseados. Por ejemplo, para generar una composición celular que comprende principalmente células T inmaduras e inactivadas, las células pueden mantenerse en cultivo durante de aproximadamente 5 a aproximadamente 20 días. Las células pueden mantenerse en cultivo durante de aproximadamente 20 a aproximadamente 30 días para generar una composición celular que comprende principalmente células T maduras. Las células no adherentes también pueden recogerse del cultivo en diversos puntos de tiempo, tal como desde aproximadamente varios días hasta aproximadamente 25 días. En determinadas realizaciones, las células madre hematopoyéticas se cultivan conjuntamente en líneas de células estromales (patente estadounidense n.° 7.575.925; Schmitt et al., Nat. Immunol.

5:410, 2004; Schmitt et al., Immunity 17:749, 2002).

Pueden añadirse al cultivo una o más citocinas que fomentan el compromiso o la diferenciación de células progenitoras hematopoyéticas. Las citocinas pueden ser humanas o no humanas. Los ejemplos representativos de citocinas que pueden usarse incluyen todos los miembros de la familia de FGF, incluyendo f GF-4 y FGF-2; ligando Flt-3, factor de células madre (SCF), trombopoyetina (TPO) e IL-7. Pueden usarse citocinas en combinación con un glicosaminoglicano, tal como sulfato de heparina.

En algunas realizaciones, las células capaces de expresar una proteína de fusión de esta divulgación en la superficie celular son células T, incluyendo células primarias o líneas de células derivadas de humano, ratón, rata u otros mamíferos. Si se obtiene de un mamífero, una célula T puede obtenerse de numerosas fuentes, incluyendo sangre, médula ósea, ganglio linfático, timo u otros tejidos o fluidos. Una célula T puede enriquecerse o purificarse. En la técnica se conocen bien líneas de células T, algunas de las cuales se describe en Sandberg et al., Leukemia 21:230, 2000. En determinadas realizaciones, se usan células T que carecen de expresión endógena de las cadenas TCRa y P de. Tales células T pueden carecer de manera natural de la expresión endógena de las cadenas TCRa y p o pueden haberse modificado para bloquear la expresión (por ejemplo, células T de un ratón transgénico que no expresa las cadenas a y p de TCR o células que se han manipulado para inhibir la expresión de las cadenas a y p de TCR) o para silenciar la cadena TCRa , la cadena TCRp o ambos genes. En determinadas realizaciones, las células capaces de expresar una proteína de fusión de esta divulgación en la superficie celular no son células T ni células de un linaje de células T, sino células que son células progenitoras, células madre o células que se han modificado para expresar anticuerpos anti-CD3 de superficie celular.

En determinados casos, la célula T huésped transfectada para expresar una Key-ChEM o T-ChARM de esta divulgación es un célula T funcional, tal como una célula T específica de virus, una célula T citotóxica específica de antígeno tumoral, una célula T indiferenciada, una célula T madre de memoria, una célula T de memoria central o efectora o una célula T reguladora CD4+ CD25+.

Pueden añadirse al cultivo una o más citocinas de factores de crecimiento que fomentan la proliferación de células T que expresan una Key-ChEM o T-ChARM de esta divulgación. Las citocinas pueden ser humana o no humanas. Las citocinas de factores de crecimiento a modo de ejemplo que pueden usarse para fomentar la proliferación de células T incluyen IL2, IL15 o similares.

Usos

Las enfermedades que pueden tratarse con células que expresan Key-ChEM o T-ChARM tal como se describen en la presente divulgación incluyen cáncer, enfermedades infecciosas (infecciones virales, bacterianas, protozoarias), enfermedades inmunitarias (por ejemplo, autoinmunitarias) o enfermedades asociadas a la edad (por ejemplo, senescencia). La terapia génica y la inmunoterapia adoptiva son tratamientos prometedores para diversos tipos de cáncer (Morgan et al., Science 314:126, 2006; Schmitt et al., Hum. Gene Ther. 20:1240, 2009; June, J. Clin. Invest.

117:1466, 2007) y de enfermedad infecciosa (Kitchen et al., PLoS One 4:38208, 2009; Rossi et al., Nat. Biotechnol.

25:1444, 2007; Zhang et al., PLoS Pathog. 6:e1001018, 2010; Luo et al., J. Mol. Med. 89:903, 2011).

Una amplia variedad de cánceres, incluyendo tumores sólidos y leucemias son susceptibles de las composiciones y los métodos divulgados en el presente documento. Los tipos de cáncer a modo de ejemplo que pueden tratarse incluyen adenocarcinoma de mama, próstata y colon; todas las formas de carcinoma broncogénico de pulmón; leucemia mielógena; melanoma; hepatoma; neuroblastoma; papiloma; apudoma; coristoma; branquioma; síndrome carcinoide maligno; cardiopatía carcinoide; y carcinoma (por ejemplo, Walker, de células basales, basoescamoso, Brown-Pearce, ductal, tumor de Ehrlich, Krebs 2, de células de Merkel, mucinoso, de pulmón de células no pequeñas, microcítico, papilar, escirroso, bronquiolar, broncogénico, de células escamosas y de células transicionales). Los tipos de cánceres adicionales que pueden tratarse incluyen trastornos histiocíticos; histiocitosis maligna; leucemia; enfermedad de Hodgkin; inmunoproliferativo pequeño; linfoma no Hodgkin; plasmocitoma; reticuloendoteliosis; melanoma; condroblastoma; condroma; condrosarcoma; fibroma; fibrosarcoma; tumores de células gigantes; histiocitoma; lipoma; liposarcoma; mesotelioma; mixoma; mixosarcoma; osteoma; osteosarcoma; cordoma; craneofaringioma; disgerminoma; hamartoma; mesenquimoma; mesonefroma; miosarcoma; ameloblastoma; cementoma; odontoma; teratoma; timoma; tumor trofoblástico. Además, los siguientes tipos de cánceres también se contemplan como susceptibles de tratamiento: adenoma; colangioma; colesteatoma; ciclindroma; cistoadenocarcinoma; cistoadenoma; tumor de células de la granulosa; ginandroblastoma; hepatoma; hidradenoma; insulinoma; tumor de células de Leydig; papiloma; tumor de células de Sertoli; tumor de células de la teca; leimioma; leiomiosarcoma; mioblastoma; mioma; miosarcoma; rabdomioma; rabdomiosarcoma; ependimoma; ganglioneuroma; glioma; meduloblastoma; meningioma; neurilemoma; neuroblastoma; neuroepitelioma; neurofibroma; neuroma; feocromocitoma; quimiodectoma. Los tipos de cánceres que pueden tratarse también incluyen angioqueratoma; hiperplasia angiolinfoide con eosinofilia; angioma esclerosante; angiomatosis; glomangioma; hemangioendotelioma; hemangioma; hemangiopericitoma; hemangiosarcoma; linfangioma; linfangiomioma; linfangiosarcoma; pinealoma; carcinosarcoma; condrosarcoma; cistosarcoma filoides; fibrosarcoma; hemangiosarcoma; leiomiosarcoma; leucosarcoma; liposarcoma; linfangiosarcoma; miosarcoma; mixosarcoma; carcinoma de ovario; rabdomiosarcoma; sarcoma; neoplasias malignas; neurofibromatosis; y displasia de cuello uterino.

Los ejemplos de la variedad de trastornos hiperproliferativos susceptibles de terapia con Key-ChEM o T-ChARM son cánceres de células B, incluyendo linfomas de células B (tales como diversas formas de enfermedad de Hodgkin, linfoma no Hodgkin (LNH) o linfomas del sistema nervioso central), leucemias (tales como leucemia linfoblástica aguda (LLA), leucemia linfocítica crónica (LLC), leucemia de células pilosas, transformación blástica de células B de leucemia mielógena crónica) y mielomas (tal como mieloma múltiple). Los cánceres de células B adicionales incluyen linfoma linfocítico pequeño, leucemia prolinfocítica de células B, linfoma linfoplasmacítico, linfoma esplénico de la zona marginal, mieloma de célula plasmáticas, plasmocitoma óseo solitario, plasmocitoma extraóseo, linfoma extranodal de células B de la zona marginal de tejido linfoide asociado a mucosa (MALT), linfoma nodal de células B de la zona marginal, linfoma folicular, linfoma de células del manto, linfoma difuso de células B grandes, linfoma mediastínico (tímico) de células B grandes, linfoma intravascular de células B grandes, linfoma primario de efusiones, linfoma/leucemia de Burkitt, proliferaciones de células B de potencial maligno incierto, granulomatosis linfomatoide y trastorno linfoproliferativo postrasplante.

Las enfermedades inflamatorias y autoinmunitarias incluyen artritis, artritis reumatoide, artritis reumatoide juvenil, osteoartritis, policondritis, artritis psoriásica, psoriasis, dermatitis, polimiositis/dermatomiositis, miositis por cuerpos de inclusión, miositis inflamatoria, necrólisis epidérmica tóxica, escleroderma sistémico y esclerosis, síndrome de CREST, enfermedad inflamatoria intestinal, enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, síndrome de dificultad respiratoria, síndrome de dificultad respiratoria en adultos (SDRA), meningitis, encefalitis, uveítis, colitis, glomerulonefritis, estados alérgicos, eccema, asma, estados que implican la infiltración de células T y respuestas inflamatorias crónicas, aterosclerosis, miocarditis autoinmunitaria, deficiencia de adhesión de leucocitos, lupus eritematoso sistémico (LES), lupus eritematoso cutáneo subagudo, lupus discoide, mielitis lúpica, cerebritis lúpica, diabetes juvenil, esclerosis múltiple, encefalomielitis alérgica, neuromielitis óptica, fiebre reumática, corea de Sydenham, respuestas inmunitarias asociadas con hipersensibilidad aguda y retardada mediada por citocinas y linfocitos T, tuberculosis, sarcoidosis, granulomatosis incluyendo granulomatosis de Wegener y enfermedad de Churg-Strauss, agranulocitosis, vasculitis (incluyendo vasculitis/angitis por hipersensibilidad, ANCA y vasculitis reumatoide), anemia aplásica, anemia de Diamond-Blackfan, anemia hemolítica inmunitaria incluyendo anemia hemolítica autoinmunitaria (AHAI), anemia perniciosa, aplasia pura de glóbulos rojos (PRCA), deficiencia de factor VIII, hemofilia A, neutropenia autoinmunitaria, pancitopenia, leucopenia, enfermedades que implican diapédesis de leucocitos, trastornos inflamatorios del sistema nervioso central (SNC), síndrome de disfunción multiorgánica, miastenia grave, enfermedades mediadas por complejos de antígeno-anticuerpo, enfermedad de anticuerpos anti-membrana basal glomerular, síndrome de anticuerpos antifosfolipídicos, neuritis alérgica, enfermedad de Behcet, síndrome de Castleman, síndrome de Goodpasture, síndrome miasténico de Lambert-Eaton, síndrome de Reynaud, síndrome de Sjorgen, síndrome de Stevens-Johnson, rechazo de trasplante de órganos sólidos, enfermedad de injerto contra huésped (EICH), penfigoide ampolloso, pénfigo, poliendocrinopatías autoinmunitarias, espondiloartropatías seronegativas, enfermedad de Reiter, síndrome de la persona rígida, arteritis de células gigantes, nefritis del complejo inmunitario, nefropatía por IgA, polineuropatías por IgM o neuropatía mediada por IgM, púrpura trombocitopénica idiopática (PTI), púrpura trombocitopénica trombótica (PTT), púrpura de Henoch-Schonlein, trombocitopenia autoinmunitaria, enfermedad autoinmunitaria de los testículos y los ovarios incluyendo orquitis y ooforitis autoinmunitarias, hipotiroidismo primario; enfermedades endocrinas autoinmunitarias incluyendo tiroiditis autoinmunitaria, tiroiditis crónica (tiroiditis de Hashimoto), tiroiditis subaguda, hipotiroidismo idiopático, enfermedad de Addison, enfermedad de Graves, síndromes poliglandulares autoinmunitarios (o síndromes por endocrinopatías poliglandulares), diabetes de tipo I también denominada diabetes mellitus insulinodependiente (DMID) y síndrome de Sheehan; hepatitis autoinmunitaria, neumonitis intersticial linfoidea (NIL), bronquiolitis obliterante (sin trasplante), neumonía intersticial inespecífica (NII), síndrome de Guillain-Barré, vasculitis de vasos grandes (incluyendo polimialgia reumática y arteritis (de Takayasu) de células gigantes), vasculitis de vasos medios (incluyendo enfermedad de Kawasaki y poliarteritis nudosa), poliarteritis nudosa (PAN), espondilitis anquilosante, enfermedad de Berger (nefropatía por IgA), glomerulonefritis rápidamente progresiva, cirrosis biliar primaria, celiaquía (enteropatía por gluten), crioglobulinemia, crioglobulinemia asociada con hepatitis, esclerosis lateral amiotrófica (ELA), arteriopatía coronaria, poliserositis familiar recurrente, poliangitis microscópica, síndrome de Cogan, síndrome de Whiskott-Aldrich y tromboangitis obliterante.

En casos particulares, un método de tratamiento de un sujeto con la Key-ChEM o T-ChARM tal como se divulga en el presente documento incluye leucemia mielógena aguda, leucemia linfocítica aguda y leucemia mielógena crónica.

Las enfermedades infecciosas incluyen aquellas asociadas con agentes infecciosos, e incluyen cualquiera de una variedad de bacterias (por ejemplo, E. coli, S. typhimurium, P. aeruginosa, B. anthracis, C. botulinum, C. difficile, C. perfringens, H. pylori, V. cholerae, Listeria spp., Rickettsia spp., Chlamydia spp. patógenos y similares), micobacterias y parásitos (incluyendo cualquier miembro parasitario conocido de los protozoos). Los virus infecciosos incluyen virus eucariotas, tales como adenovirus, bunyavirus, virus del herpes, papovavirus, papilomavirus (por ejemplo, VPH), paramixovirus, picornavirus, rabdovirus (por ejemplo, rabia), ortomixovirus (por ejemplo, gripe), poxvirus (por ejemplo, Vaccinia), reovirus, retrovirus, lentivirus (por ejemplo, VIH), flavivirus (por ejemplo, v Hc , VHB) o similares. En determinados casos, la infección con patógenos citosólicos cuyos antígenos se procesan y visualizan con moléculas de CMH clase I se trata con Key-ChEM o T-ChARM de esta divulgación.

Una Key-ChEM o T-ChARM de esta divulgación puede administrarse a un sujeto en forma unida a células (por ejemplo, terapia génica de una población de células diana (células T maduras (por ejemplo, células T CD8+ o CD4+) u otras células del linaje de células T)). En una realización particular, las células del linaje de células T que expresan Key-ChEM o T-ChARM administradas a un sujeto son células singénicas, alogénicas o autólogas. En otros casos, la Key-ChEM o T-ChARM puede administrarse a un sujeto en forma soluble. En la técnica se conocen TCR solubles (véanse, por ejemplo, Molloy et al., Curr. Opin. Pharmacol. 5:438, 2005; la patente estadounidense n.° 6.759.243).

Las composiciones farmacéuticas que incluyen Key-ChEM o T-ChARM de esta divulgación pueden administrarse de una manera apropiada para la enfermedad o el estado que va a tratarse (o prevenirse) tal como determinan los expertos en la técnica médica. La dosis apropiada, la duración adecuada y la frecuencia de administración de las composiciones se determinarán por factores tales como el estado del paciente, el tamaño, el tipo y la gravedad de la enfermedad, la forma particular del principio activo y el método de administración. La presente divulgación proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden células que expresan una Key-ChEM o T-ChARM tal como se divulga en el presente documento y un portador, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable. Los excipientes adecuados incluyen agua, solución salina, dextrosa, glicerol o similares, y combinaciones de los mismos.

Una ventaja de la presente divulgación es que la Key-ChEM o T-ChARM que expresa células administradas a un paciente pueden agotarse usando la pareja de unión relacionada con un casete de etiqueta. La presente divulgación proporciona un método para agotar una célula T que expresa una Key-ChEM o T-ChARM usando un anticuerpo específico para el casete de etiqueta, usando una pareja de unión relacionada específica para el casete de etiqueta o usando una segunda célula T que expresa un CAR y que tiene especificidad por el casete de etiqueta. En determinados casos, un casete de etiqueta permite el agotamiento inmunitario de una célula T que expresa una Key-ChEM o T-ChARM de esta divulgación. La eliminación de células T modificadas por ingeniería puede lograrse usando agentes de agotamiento específicos para un casete de etiqueta. Por ejemplo, si se usa una Strep tag, entonces puede usarse un anticuerpo anti-Strep tag, un scFv anti-Strep tag o una Streptactin, cada uno fusionado a o conjugado con un reactivo tóxico para las células (tal como una toxina, un radiometal), o puede usarse un scFv biespecífico anti-Strep tag/anti-CD3 o una célula T con CAR anti-Strep tag.

En otros determinados casos, las células que expresan una Key-ChEM o T-ChARM de esta divulgación pueden identificarse, clasificarse, enriquecerse o aislarse mediante la unión a anticuerpos que tienen especificidad para un casete de etiqueta (por ejemplo, anticuerpos anti-etiqueta) o por otras proteínas que se unen específicamente a un casete de etiqueta (por ejemplo, unión de Streptactin a la Strep tag), que se conjugan con perlas, una placa de cultivo celular, agarosa o cualquier otra matriz de superficie sólida. En determinados casos, tales células se clasifican, enriquecen o aíslan usando una columna de afinidad.

La presente divulgación proporciona un método para activar selectivamente una célula T poniendo en contacto una célula T no natural o recombinante que expresa una Key-ChEM o T-ChARM con un dominio de unión específico para un casete de etiqueta y unidos a una superficie sólida o como parte de una matriz biocompatible (por ejemplo, alginato, matriz de la membrana basal (Matrigel®), biopolímero). La célula T recombinante comprende una molécula de ácido nucleico exógena que codifica para una proteína de fusión Key-ChEM o T-ChARM de esta divulgación. Por ejemplo, una célula T que expresa una Key-ChEM o T-ChARM puede activarse con perlas recubiertas o conjugadas con una pareja de unión relacionada (por ejemplo, anticuerpo) específica para el casete de etiqueta. Por ejemplo, si el casete de etiqueta es una Strep tag, entonces pueden usarse perlas recubiertas con Streptactin o perlas conjugadas con anticuerpo anti-Strep tag para inducir la activación de células T. En determinados casos, el método comprende la activación ex vivo de células T recombinantes que expresan una Key-ChEM o T-ChARM de esta divulgación y opcionalmente que expresan además un receptor de antígeno quimérico (CAR). Tales células T activadas son útiles en los métodos de tratamiento de enfermedades descritos en el presente documento.

La presente divulgación proporciona un método para fomentar selectivamente la proliferación de una célula T recombinante que expresa una Key-ChEM o T-ChARM de esta divulgación. En determinados casos, el método comprende la proliferación ex vivo selectiva de células T que expresan una Key-ChEM o T-ChARM usando una pareja de unión a etiqueta, tal como un anticuerpo. En casos adicionales, el método comprende la expansión de células T funcionales (por ejemplo, específicas de virus, CTL específicos de AAT (antígeno asociado a tumor) o subconjuntos de células T específicas, tales como células T indiferenciadas, células T madre de memoria, células T de memoria central o efectora, células T reguladoras CD4+ CD25+) con una pareja de unión a etiqueta, tal como un anticuerpo, que puede realizarse opcionalmente en presencia de una pareja de unión a molécula coestimuladora (tal como un anticuerpo anti-CD27 o anti-CD28). En determinados casos, pueden usarse parejas de unión anti-etiqueta para activar una Key-ChEM (por ejemplo, una Key-ChEM Wnt o Notch), una célula madre hematopoyética transducida, una célula madre embrionaria o una célula madre tisular (por ejemplo, célula madre neural) para autorrenovarse, proliferar o diferenciarse en uno o más fenotipos deseados para su uso terapéutico.

En todavía casos adicionales, una Key-ChEM o T-ChARM permite el fomento selectivo de la proliferación de células T in vivo al expresar una Key-ChEM o T-ChARM de esta divulgación. En determinados casos, una célula T que expresa un CAR que comprende un casete de etiqueta permite la expansión de las células T con CAR in vivo al poner en contacto células que expresan un ligando (por ejemplo, incluyendo los ligandos celulares supresores de células T PD-L1, PD-L2). Tales células T expandidas son útiles en los métodos de tratamiento de enfermedades descritos en el presente documento. En determinados casos, la proliferación o expansión de células que expresan una Key-ChEM o T-ChARM tal como se divulga en el presente documento se induce in vivo, que puede inducirse con una pareja de unión a casete de etiqueta (tal como un anticuerpo anti-etiqueta) y opcionalmente una pareja de unión a molécula coestimuladora (tal como un anticuerpo anti-CD27 o anti-CD28).

En determinados casos adicionales, las células que expresan una Key-ChEM o T-ChARM tal como se divulga en el presente documento se activan in vivo, tal como en el sitio de un tumor. Por ejemplo, puede usarse una composición (por ejemplo, alginato, matriz de la membrana basal (Matrigel®), biopolímero u otra matriz) o un portador (por ejemplo, microperla, nanopartícula u otra superficie sólida) que comprende una pareja de unión a casete de etiqueta (tal como un anticuerpo anti-etiqueta) y una pareja de unión a molécula coestimuladora (tal como un anticuerpo anti-CD27 o anti-CD28) activar localmente en el sitio de un tumor (por ejemplo, un tumor sólido) una célula T que expresa una Key-ChEM o T-ChARM tal como se divulga en el presente documento.

En determinadas realizaciones, pueden detectarse o rastrearse in vivo células recombinantes que expresan una Key-ChEM o T-ChARM usando anticuerpos que se unen con especificidad a un casete de etiqueta (por ejemplo, anticuerpos anti-etiqueta) o por otras proteínas de unión relacionadas que se unen específicamente a la secuencia del casete de etiqueta (por ejemplo, unión de Streptactin a Strep tag), cuyas parejas de unión para el casete de etiqueta se conjugan con un colorante fluorescente, un radiomarcador, una nanopartícula de óxido de hierro u otro agente de obtención de imágenes conocido en la técnica para la detección mediante rayos X, TAC, exploración por IRM, exploración por PET, ecografía, citometría de flujo, sistemas de obtención de imágenes en el infrarrojo cercano u otras modalidades de obtención de imágenes (véase, por ejemplo, Yu et al., Theranostics 2:3, 2012).

En realizaciones adicionales, pueden usarse células que expresan Key-ChEM o T-ChARM de la presente divulgación en métodos de diagnóstico o métodos de obtención de imágenes, incluyendo los métodos usados en relación con las indicaciones o los estados identificados en el presente documento.

Ejemplos

Ejemplo 1

Moléculas efectoras quiméricas llave (Key-ChEM) y moléculas de receptor de antígeno quimérico etiquetadas (T-ChARM), y derivados de las mismas

En la figura 1 se ilustran proteínas de fusión quiméricas a modo de ejemplo que contienen uno o más casetes de etiqueta de afinidad. Los casetes de etiqueta son generalmente pequeños (es decir, mínimamente inmunogénicos o no inmunogénicos) y no se asocian ni se unen a ninguna molécula endógena a un huésped o célula huésped. Las etiquetas se unen específicamente a un receptor análogo heterólogo (por ejemplo, ligando, anticuerpo u otra pareja de unión), cuya unión puede usarse en el contexto de estas moléculas efectoras quiméricas (ChEM) como una “llave” para acceder y manipular (es decir, encender, apagar o modular) cualquiera de una variedad de rutas celulares (denominadas en el presente documento Key-ChEM). Estas proteínas de fusión quiméricas etiquetadas pueden comprender además un dominio de unión específico para una diana particular (por ejemplo, un antígeno tumoral). Por ejemplo, las proteínas de fusión quiméricas etiquetadas incluyen moléculas de receptor de antígeno quimérico (denominadas en el presente documento T-ChARM).

Una molécula de ácido nucleico a modo de ejemplo que codifica una Key-ChEM (figura 1A) comprende los siguientes elementos (de 5' a 3'): Strep tag® II (SEQ ID NO.:38 que codifica para el péptido Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys tal como se expone en SEQ ID NO.:1), una porción de conector que incluye un módulo ligador (SEQ ID NO.:42 que codifica para el péptido (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)2 tal como se expone en SEQ ID NO.:11) y una bisagra de IgG4 modificada (SEQ ID NO.:27 que codifica para el péptido Glu-Ser-Lys-Tyr-Gly-Pro-Pro-Cys-Pro-Pro-Cys-Pro tal como se expone en SEQ ID NO.15), un dominio transmembrana CD28 (SEQ ID NO.:27 que codifica para un péptido tal como se expone en SEQ ID NO.:16), y un componente intracelular que comprende un dominio efector que comprende una porción 4-1BB (SEQ ID NO.:29 que codifica para un péptido tal como se expone en SEQ ID NO.:17) y una porción CD3^ (SEQ ID NO.:30 que codifica para un péptido tal como se expone en SEQ ID NO.:18; Kowolik et al., Cancer Res. 66: 10995, 2006). Esta molécula de ácido nucleico que codifica para Key-ChEM (etiqueta única) se clonó en un vector lentiviral epHIV7, tal como se describe en Yam et al. (Mol. Ther. 5: 479, 2002) y Wang et al. (Blood 118: 1255, 20 11 ).

El vector lentiviral epHIV7 se derivó a partir del vector pHIV7 reemplazando el promotor de citomegalovirus de pHIV7 con un promotor ^eF-1 (Wang et al., 2011 ; Yam et al., 2002). El vector lentiviral también codifica para un polipéptido EGFR humano truncado (huEGFRt) que carece de dominios de unión de ligando N-terminal extracelulares y actividad tirosina cinasa receptora intracelular, pero conserva la secuencia de aminoácidos nativa, la localización de la superficie celular transmembrana de tipo I y un epítopo de unión intacta a nivel de conformación del anticuerpo monoclonal anti-EGFR, cetuximab (Wang et al., 2011). Los vectores lentivirales expresan coordinadamente una Key-ChEM y huEGFRt separados por una secuencia T2A de autoescisión (Szymczak et al., Nat. Biotechnol. 22: 589, 2004), en los que el huEGFRt sirve como un epítopo de selección alternativo para células positivas para Key-ChEM mediante el uso de cetuximab biotinilado junto con microperlas inmunomagnéticas anti-biotina.

Una molécula de ácido nucleico a modo de ejemplo que codifica para una T-ChARM (figura 1E) comprende los siguientes elementos: un scFv que contiene segmentos génicos VH y VL del anticuerpo monoclonal FMC63 específico de CD19 (SEQ ID NO.:36; Wang et al., 2011), una Strep tag® II (Se Q ID NO.:38, que codifica para el péptido Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys tal como se expone en SEQ ID NO.:1), una porción de conector que incluye un módulo ligador (SEQ ID NO.:39, 40 ó 41, que codifica para el péptido (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)2 tal como se expone en SEQ ID NO.:11) y una bisagra de IgG4 (SEQ ID NO.:27), un dominio transmembrana de CD28 (SEQ ID NO.:28) y un componente intracelular que comprende un dominio efector que comprende una porción 4-1BB (SEQ ID NO.:29) y una porción CD3^ (SEQ ID NO.:30). Un ejemplo de T-ChARM que comprende dos etiquetas (T-ChARM2) difiere de la T-ChARM de una etiqueta (T-ChARM1) al incluir un segundo módulo ligador (que codifica para el péptido (Gly-Gly-Gly-Ser)2-Gly-Gly-Ser tal como se expone en SEQ ID NO.:12) entre las Strep tag primera y segunda. Un ejemplo de T-ChARM que comprende tres etiquetas (T-ChARM3) se diferencia de la T-ChARM de dos etiquetas al incluir un tercer módulo ligador (que codifica para el péptido (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)2 tal como se expone en SEQ ID NO.:11) entre las Strep tag segunda y tercera. En determinados casos, un scFv incluye regiones VH y VL del anticuerpo monoclonal R12 específico para ROR1 (Yang et al., PLoS One 6: e21018, 2011) tal como se expone en SEQ ⁱD NO.:57) y un ligador de dominio variable tal como se expone en SEQ ID NO.:13. Además, las T-ChARM tanto anti-CD19 como anti-ROR1 se construyeron alternativamente con un componente intracelular que comprende un dominio efector que comprende una porción de CD28 (SEQ ID NO.:35) en lugar de una porción 4-1BB.

En determinados casos, cualquiera de las proteínas de fusión descritas en el presente documento comprende desde el extremo amino-terminal hasta el extremo carboxilo-terminal: un dominio de unión scFv o scTCR extracelular, un casete de etiqueta, una región conectora que comprende una bisagra de IgG, un dominio transmembrana y un componente intracelular que comprende un dominio efector. En algunos casos, un dominio efector comprende un apareamiento de 4-1BB y CD3C, CD27 y CD3C, CD28 y CD3C, OX40 y CD3C, CD28, 4-1BB y CD3C, OX40, 4-1BB y CD3^, o CD28, OX40 y CD3^. Tal como se define en el presente documento, un dominio efector para cualquiera de estas moléculas puede ser la porción intracelular completa o puede incluir sólo una porción efectora de la molécula seleccionada.

Una molécula de ácido nucleico a modo de ejemplo que codifica para una T-ChARM (N1ChARM; figura 1F; SEQ ID NO.:58) que tiene una etiqueta N-terminal comprende los siguientes elementos: una secuencia señal secretora (SEQ ID NO.:63, que codifica para el péptido MLLLv Ts LLLCELPHPAFLLIP tal como se expone en SEQ ID NO.:47, que se escinde de la proteína madura), un aminoácido de unión de asparagina, una Strep tag® II (SEQ ID NO.:38, que codifica para el péptido Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys tal como se expone en SEQ ID NO.:1), un módulo ligador (SEQ ID NO.:42, que codifica para el péptido (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)2 tal como se expone en SEQ ID NO.:11), scFv de los segmentos génicos VH y VL del anticuerpo monoclonal FMC63 específico de CD19 (SEQ ID NO.:36; Wang et al., 2011), una bisagra de IgG4 (SEQ ID NO.:27), un dominio transmembrana de CD28 (Se Q ID NO.:28) y un componente intracelular que comprende un dominio efector que comprende una porción 4-1BB (SEQ ID NO.:29) y una porción de CD3C (SEQ ID NO.:30).

Una molécula de ácido nucleico a modo de ejemplo que codifica para una T-ChARM (Ch1ARM; figura 1G; SEQ ID NO.:59) que tiene una etiqueta incrustada en el ligador de región variable comprende los siguientes elementos: una secuencia señal secretora (SEQ ID NO.:63, que codifica para el péptido MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIP tal como se expone en SEQ ID NO.:47, que se escinde de la proteína madura), el segmento del gen VH del anticuerpo monoclonal FMC63 específico de CD19 (que codifica para la secuencia de aminoácidos tal como se expone en SEQ ID NO.:51), un primer módulo ligador (que codifica para el péptido Gly-Gly-Ser-Gly-Ser-Gly tal como se expone en SEQ ID NO.:65), un aminoácido de unión de asparagina, una Strep tag® II (SEQ ID No .:38, que codifica para el péptido Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu Lys tal como se expone en SEQ ID NO.:1), un segundo módulo ligador (que codifica para el péptido Gly-Ser-Gly-Ser-Gly tal como se expone en SEQ ID NO.:66), el segmento del gen VL de anticuerpo monoclonal FMC63 específico de CD19 (que codifica para la secuencia de aminoácidos tal como se expone en SEQ ID NO.:52), una bisagra de IgG4 (Se Q ID NO.:27), un dominio transmembrana CD28 (SEQ ID NO.:28) y un componente intracelular que comprende un dominio efector que comprende una porción de 4-1BB (SEQ ID NO.:29) y una porción de CD3^ (SEQ ID NO.:30).

Las moléculas de ácido nucleico que codifican para cada una de estas T-ChARM a modo de ejemplo (por ejemplo, con una etiqueta, dos etiquetas o tres etiquetas, con etiqueta N-terminal, con etiqueta incrustada, con scFv indicados) se clonaron individualmente en un vector lentiviral epHIV7, tal como describen Yam et al. (Mol. Ther. 5: 479, 2002), y se usaron para transducir células T tal como se describe en los ejemplos en el presente documento. En determinados casos, las moléculas de ácido nucleico que codifican para Key-ChARM de la presente divulgación tienen codones optimizados antes de la clonación en el vector lentiviral epHIV7. Los sobrenadantes de lentivirus que codifican para T-ChARM se produjeron en células 293T cotransfectadas con cada uno de los plásmidos del vector lentiviral y los vectores de empaquetamiento pCHGP-2, pCMV-Rev2 y pCMV-G usando reactivo de transfección Calphos (Clontech, Mountain View, c A). El medio se cambió 16 horas tras la transfección y se recogió el lentivirus después de 24, 48 y 72 horas.

Ejemplo 2

Producción de células T recombinantes y expresión de T-ChARM

Se aislaron CD8+ y CD4+ a partir de PBMC de donantes normales usando el kit de aislamiento de células T CD8+/CD4+ (Miltenyi Biotec), se activaron con perlas anti-CD3/CD28 (Life Technologies) según las instrucciones del fabricante y se transdujeron con un sobrenadante lentiviral (tal como se indica en cada ejemplo) (MOI = 3) complementado con polibreno 0,8 |ig/ml (Millipore, Bedford, MA) el día 3 después de la activación mediante centrifugación a 2.100 rpm durante 45 min a 32°C. Se expandieron las células T en RPMI, suero humano al 10%, L-glutamina 2 mM y penicilina-estreptomicina al 1% (medio CTL), complementadas con IL-2 humana recombinante (rh) hasta una concentración final de 50 U/ml cada 48 horas. Después de la expansión, se tiñó una alícuota de cada línea de células T transducidas con anticuerpo anti-EGFR conjugado con biotina y estreptavidina-PE (Miltenyi, Auburn, CA). Se aislaron las células T tEGFR+ clasificándolas en un clasificador de células FACS-Aria (Becton Dickinson). A continuación, se estimuló el subconjunto de células T tEGFR+ con CD19+ B-LCL irradiado (8.000 rad) a una razón de células T:LCL de 1:7, y se expandió durante 8 días en medio CTL con la adición de rh IL-250 U/ml cada 48 horas o usando un protocolo de expansión rápida para R12 T-ChARM (Riddell y Greenberg, J. Immunol. Methods 128: 189, 1990).

Se usaron los siguientes anticuerpos conjugados para el fenotipado y análisis de citometría de flujo: CD4, CD8, CD25, CD137, CD45, anexina V, CD62L, CD27, CD28 (BD Biosciences), anticuerpo anti-Streptag II (Genscript), anticuerpo EGFR (ImClone Systems Incorporated, Branchburg, NJ); estreptavidina-PE (BD Biosciences, San José, CA). Se realizó tinción con yoduro de propidio (PI, BD Biosciences) para la discriminación de células vivas/muertas según las instrucciones del fabricante. Se realizaron los análisis de flujo en un aparato FACS Canto II, purificaciones de clasificación en un aparato FACS AriaII (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) y se analizaron los datos usando el software FlowJo (Treestar, Ashland, OR).

Para examinar la expresión de T-ChARM en la superficie celular, se clasificaron las células T transducidas para determinar la expresión de EGFRt y se evaluaron mediante tinción con AcM anti-Streptag marcado con fluorocromo. La intensidad de fluorescencia media (IFM) de la tinción de EGFR fue similar en las células T transducidas con cada una de las T-ChARM y CAR CD19-Corto, lo que indica que la introducción de una etiqueta en un CAR para producir una ChARM no interfirió con la expresión del transgén (figura 21). Un AcM anti-Streptag tiñó específicamente células T transducidas con las diversas T-ChARM, independientemente de la posición o el número de secuencias de etiquetas en cada ChARM. La IFM de la tinción con anticuerpo anti-Streptag fue mayor para las células T transducidas con T-ChARM2 y T-CHARM3 en comparación con T-ChARM1, presumiblemente debido a la existencia de más sitios en cada T-CHARM2 y T-CHARM3 para la unión del conjugado anticuerpo-fluorocromo (figura 21).

Ejemplo 3

Actividad citolítica de células T que expresan T-ChARM

Se comparó la función efectora in vitro de células T CD8+ en masa modificadas por ingeniería genética para expresar T-ChARM1, T-CHARM2 o T-CHARM3 anti-CD19 (scFv) con la función efectora de células T modificadas por ingeniería genética para expresar CAR anti-CD19 que contienen regiones conectoras de diferentes longitudes: una bisagra de IgG4 solamente (corta), una bisagra y CH3 de IgG4 (intermedia) y una bisagra y CH2CH3 de IgG4 (larga), respectivamente, en un ensayo de liberación de cromo. En resumen, se marcaron células diana con 51Cr (PerkinElmer, Norwalk, CT) durante la noche, se lavaron y se incubaron por triplicado a 1-2 x 103 células/pocillo con células T efectoras en diversas razones de efector con respecto a diana (E:T). Se recogieron los sobrenadantes para el recuento y después de incubar durante 4 horas y se calculó la lisis específica usando una fórmula convencional. Las células diana usadas fueron Raji/ROR1 (naturalmente CD19+, transducidas para expresar el antígeno no relacionado ROR1) y K562/CD19 (transducidas para expresar CD19), con K562/ROR1 (naturalmente CD19-, transducidas para expresar el antígeno no relacionado ROR1) usadas como control negativo y células LCL-OKT3 (transducidas para expresar anti-CD3 de superficie celular) usadas como control positivo. Se usaron células de la línea de células linfoblastoides (LCL) modificadas por ingeniería genética para expresar un scFv anti-CD3 unido a la membrana (LCL-OKT3) como patrón de referencia para el potencial de activación máximo de una línea de células T, ya que estas células que expresan OKT3 activan las células T al unirse al complejo CD3.

Las células T que expresan cada uno de los diferentes constructos de CAR y T-ChARM anti-CD19 no fueron citotóxicas para células K562/ROR1 (figura 2C), pero se activaron para ser citolíticas en presencia de células LCL/OKT3 que expresan anti-CD3 (figura 2D). Además, las células T que expresan T-ChARM o CAR conferían actividad citolítica específica contra células CD19+, células Raji (figura 2B) y K562/CD19 (figura 2A). Se obtuvieron resultados similares cuando la etiqueta se ubicó en el extremo amino-terminal del T-ChARM (N1ChARM) o se incrustó en el scFv (VH-etiqueta-VL; Ch1ARMN) (véase la figura 22). Además, la eficacia de la lisis no se vio afectada por el dominio efector (CD28 en lugar de 4-1BB; véase la figura 23A), dominio de unión (anti-ROR1 en lugar de anti-CD19; véase la figura 23B), o la etiqueta usada (la figura 32 muestra el efecto citolítico de una ChARM etiquetada con Myc). Las células que expresan T-ChARM destruyeron las células tumorales tan eficazmente como los CAR que contienen los espaciadores Fc de IgG4 cortos, intermedios y largos.

Ejemplo 4

Liberación de citocinas por células T que expresan T-ChARM cultivadas conjuntamente con células K562

Para el análisis de secreción de citocinas, se cultivaron conjuntamente células efectoras (E) (células T que expresan CAR y T-ChARM anti-CD19) y células diana (T) (K562/CD19 y K562/ROR1, control negativo) por triplicado en una razón E:T de 4:1, se incubaron durante 24 horas, y luego se midieron los sobrenadantes para determinar los niveles de GM-CSF, IFN-y, IL-2 y TNF -a usando un inmunoensayo mútilple de citocinas (Luminex®).

Los resultados (figura 3D) muestran que las células que expresan CAR anti-CD19 con una región conectora corta producen mayores cantidades de citocina después de acoplar células diana que las células T que expresan CAR anti-CD19 con regiones conectoras intermedias o largas. Se observó un patrón similar con las células que expresan T-ChARM anti-CD19, en el que células T-ChARM1 (figura 3A) que tienen un ligador más corto y una sola etiqueta producen mayores cantidades de citocina después de acoplar células diana que las células T-ChARM2 o T-CHARM3 que tienen dos etiquetas y tres etiquetas, respectivamente. Los niveles de citocinas producidas fueron similares para las células CAR anti-CD19 y T-ChARM anti-CD19, aunque las células que expresan T-ChARM indujeron un nivel significativamente más alto de producción de IFN-y que las células que expresan CAR. Las figuras 3B y 3E muestran que la producción de citocinas no se indujo en células K562 que no expresan CD19. Las figuras 3C y 3F muestran los resultados del control positivo, que es la estimulación con PMA/ionomicina. Se observaron resultados similares al examinar constructos de N1ChARM y Ch1ARM (véase la figura 24). Además, la jerarquía de la producción de citocinas y la proliferación de células T transducidas con ChARM anti-CD19 era independiente del dominio coestimulador (4-1BB o CD28) usado en la ChARM (figura 25).

Ejemplo 5

Liberación de citocinas por células T que expresan moléculas T-ChARM cultivadas conjuntamente con células de linfoma de células B Raji

Se cultivaron conjuntamente células T que expresan diversos CAR o T-ChARM anti-CD19 con células Raji CD19+ durante 24 horas y se examinaron los sobrenadantes en un ensayo mútilple de citocinas (Luminex®). Para el análisis de la secreción de citocinas, se cultivaron conjuntamente las células efectoras (E) (células T que expresan CAR y T-ChARM anti-CD19) y las células diana (T) (Raji) por triplicado en una razón E:T de 2:1 , se incubaron durante 24 horas, y luego se midieron los sobrenadantes para determinar los niveles de GM-CSF, IFN-y, IL-2 y TNF-a usando un inmunoensayo mútilple de citocinas (Luminex®).

Los resultados indican que las células T que expresan T-ChARM anti-CD19 con uno, dos o tres casetes de etiqueta fueron capaces de producir niveles mucho más altos de IFN-y y GM-CSF cuando se cultivaron conjuntamente con células Raji (figura 4A) en comparación a las células T que expresan cualquiera de los CAR anti-CD19 convencionales (figura 4B).

Ejemplo 6

Proliferación de células T que expresan moléculas T-ChARM

Para el análisis de la proliferación celular, se marcaron células T que expresan CAR o T-ChARM anti-CD19 con éster succinimidílico de carboxifluoresceína 0,2 |iM (CFSE, Invitrogen), que se une a proteínas intracelulares y hace que las células sean visibles mediante citometría de flujo en el canal FITC. Después del marcaje, se lavaron y se sembraron las células en placas por triplicado con células estimulantes en una razón de 4:1 (K562/CD19 o K562/ROR1, control negativo) en medio CTL sin citocinas exógenas. Después de incubar 72 horas, se marcaron las células con PI para excluir las células muertas del análisis. Se analizaron las muestras mediante citometría de flujo y se evaluó la división celular de las células T CD3+ vivas mediante el grado de dilución de CFSE (es decir, la dilución del tinte es un indicador de proliferación ya que la concentración del marcador se diluye a la mitad con cada división celular).

Para el análisis, se agruparon pocilios por triplicado y se midió la proliferación de células T CD8+ vivas. La columna más a la izquierda es un gráfico de dispersión delantera/dispersión lateral del número total de células, la columna del medio es un gráfico basado en la activación de células T ^cD8+ y la columna más a la derecha es un histograma que muestra la dilución de CFSE en el subconjunto de células T CD8+ (dilución aumentada hacia la izquierda). El pico rojo en la columna más a la derecha indica que no hay división celular, y los picos azules representan una división celular >3, 2 ó 1 y los tres números en cada uno de los histogramas indican el porcentaje de células que tienen CFSE diluido y se han sometido a más que 3, 2 ó 1 división celular, respectivamente. El histograma muestra que las células T que expresan T-ChARM y CAR proliferaron vigorosamente durante las 72 horas posteriores a la estimulación del cultivo conjunto con células K562/CD19 (azul), pero no con las células de control negativo K562/ROR1 (rojo) (figura 5). El número promedio de divisiones celulares fue mayor en células T que expresan T-ChARM1 y T-CHARM2 en comparación con células T que expresan T-ChARM3 o CAR (largo). De manera similar, el nivel de proliferación fue independiente del dominio coestimulador (4-1BB o CD28) usado en la ChARM (figura 26) e independiente de la etiqueta usada (la figura 31 muestra la misma proliferación cuando se usa una etiqueta Myc).

Ejemplo 7

Transferencia adoptiva in vivo de células T que expresan moléculas T-ChARM

Se obtuvieron ratones hembra de seis a ocho semanas NOD.CB17-Prkdcscid/J (NOD/SCID) o NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) de Jackson Laboratory o se criaron internamente. Se inyectó a los ratones por vía intravenosa (i.v.) 0,5x106 células tumorales de linfoma Raji transfectadas con luciferasa de luciérnaga (Raji-ffluc) a través de la vena de la cola y se dejó que se produjera el injerto del tumor durante 6 días. El día 7, los ratones recibieron una única inyección intravenosa (i.v.) de 5 x 106 de células T transducidas con una de células T humanas con T-ChARM1, T-CHARM2, T-CHARM3, c Ar (corto), CAR (medio) y CAR (largo) anti-CD19 (scFv). Para verificar el injerto del tumor, se obtuvieron imágenes de bioluminiscencia el día 6 después de la inoculación con Raji-ffluc (figura 6A). Para monitorizar la actividad antitumoral de la terapia adoptiva de células T, se obtuvieron imágenes de bioluminiscencia el día 7 (figura 6B), el día 11 (figura 6C), el día 18 (figura 6D) y el día 26 (figura 6E) después de la administración de células T.

Para la obtención de imágenes de bioluminiscencia de células tumorales, los ratones recibieron inyecciones intraperitoneales (i.p.) de sustrato de luciferina (CaliperLife Sciences, Hopkinton, MA) resuspendido en PBS (15 |ig/g de peso corporal). Se anestesiaron los ratones con isoflurano en una cámara de inducción y se obtuvieron imágenes usando un sistema de obtención de imágenes in vivo Xenogen IVIS (Caliper Life Sciences) 10, 12 y 14 minutos después de la inyección de luciferina en modo de discretización pequeña en un tiempo de adquisición de 1 segundo-1 minuto para obtener imágenes insaturadas. La actividad de la luciferasa se analizó usando el software Living Image (Caliper Life Sciences) y el flujo de fotones se analizó dentro de las regiones de interés que abarcaban todo el cuerpo de cada ratón individual.

Las imágenes de bioluminiscencia muestran que las células T que expresan T-ChARM1, T-CHARM2 o T-CHARM3 anti-CD19 erradicaron el tumor con tanta eficacia como las células T que expresan CAR (corto) o CAR (intermedio)anti-CD19, mientras que las células T que expresan CAR (largo) no fueron muy eficaces para este constructo y/o diana particular (figura 6).

Ejemplo 8

Persistencia in vivo de células T que expresan moléculas T-ChARM

Se trató una cohorte de ratones NSG que tenían tumores Raji con 5 x 106 células T humanas que expresan T-ChARM/huEGFRt o CAR/huEGFRt anti-CD19, y 3 semanas después se analizó sangre periférica (hemorragias oculares) mediante citometría de flujo usando anticuerpos monoclonales anti-huEGFR, anti-CD8 humano y anti-CD45 humano. La frecuencia de células T CD8+ huEGFRt+ (Wang et al., 2011) se muestra como un porcentaje de células sanguíneas periféricas vivas en la figura 7. El nivel de huEGFRt detectable se correlaciona con el nivel de células T que expresan T-ChARM.

Aunque las células T que expresan anti-CD19 CAR (largo) no fueron uniformemente prominentes después de 3 semanas, todas las demás células T que expresan CAR y T-ChARM anti-CD19 se detectaron fácilmente en la sangre periférica de ratones NSG durante al menos 3 semanas después de la transferencia adoptiva y erradicación de tumores. Estos resultados indican que las células T que expresan CAR y T-ChARM anti-CD19 pueden persistir durante un periodo prolongado in vivo y mediar en la actividad antitumoral.

Ejemplo 9

Identificación de células T que expresan moléculas T-ChARM

Se tiñeron células T que expresan T-ChARM/huEFRt anti-CD19 con EGFR Ac-biotina/estreptavidina-PE, anticuerpo anti-Strep tag II-FITC, Strep-Tactin®-APC (aloficocianina), y luego se analizaron mediante citometría de flujo. Se usaron células T transducidas con CAR anti-CD19 (corto) como control. Todas las células T transducidas con T-ChARM y CAR anti-CD19 (corto) se tiñeron positivamente con el AcM anti-EGFR, lo que indica que se transdujeron y expresaron huEGFRT (figura 8A).

Los resultados muestran que las células T transducidas con T-ChARM2 y T-CHARM3 podrían distinguirse fácilmente de las células no transducidas con reactivos que tiñeron la secuencia de etiqueta expresada en las células T-ChARM (figura 8B, C). Las células T transducidas con T-CHARM1, T-CHARM2 y T-CHARM3, pero no el CAR anti-CD19 (corto), se tiñeron positivamente con el anticuerpo anti-Strep tag II-FITC (figura 8B). Aquellas con más copias de la secuencia de etiqueta tenían una señal de tinción aumentada. Las células T-ChARM también se tiñeron con Streptactin APC (figura 8C), lo que demuestra que en el caso de Strep tag, puede usarse más de un reactivo de tinción para detectar las células T.

Ejemplo 10

Clasificación de células T que expresan moléculas T-ChARM

Se tiñeron células T transducidas con T-CHARM2 con anticuerpo anti-Strep tag-FITC marcado y luego se clasificaron usando un clasificador de células FACS de mesa (clasificador de células BD FACSAria II, BD Biosciences, San José, CA). La figura 9 muestra las poblaciones de células antes de la clasificación (fila superior) y después de la clasificación (fila inferior). El panel más a la derecha (después de la clasificación) muestra que las células T que expresan T-ChARM2 se enriquecieron desde una población celular del 15,8% hasta una población celular superior al 99% de células T que expresan T-ChARM2.

Ejemplo 11

Enriquecimiento de células T que expresan moléculas T-ChARM mediante selección inmunomagnética

Se incubaron células con microperlas o nanoperlas de Streptactin (IBA, Goettingen, Alemania), luego se cargaron en una columna MACS (Miltenyi Biotec) en un separador magnético. La columna se lavó 3 veces con 3 ml de tampón MACS. Después, la columna se retiró del separador y las perlas magnéticas de Streptactin® con las células T unidas que expresaban Strep tag se eliminaron por lavado presionando firmemente un émbolo en la columna. Se marcaron células T transducidas con T-CHARM3 mezcladas con células T de control con uno de los siguientes tipos de perlas: microperlas de Strep-Tactin 1# (generalmente usadas para la purificación de proteínas, tamaño de aproximadamente 0,5 a 1,5 |im); microperlas de Strep-Tactin 2# (generalmente usadas para el aislamiento celular con Fab Streptamers® [fragmento Fab etiquetado con Strep], tamaño de aproximadamente 0,5 |im); nanoperlas de Strep-Tactin 3# (generalmente usadas para el aislamiento celular con Streptamers CMH I [monómero CMHI etiquetado con Strep], tamaño de aproximadamente 100 nm); se cargaron en una columna MACS® (Miltenyi) y se insertaron en un separador magnético. Se tiñeron individualmente el efluente directo y las fracciones retenidas con un anticuerpo marcado anti-Strep tag-FITC y se analizaron mediante citometría de flujo.

La primera fila de la figura 10 muestra las poblaciones de células antes de aplicarse a una columna de perlas de Strep-Tactin, mientras que las filas segunda, tercera y cuarta de la figura 10 muestran las poblaciones de células de cada muestra después del paso a través de la columna de perlas 1#, 2# y 3#, respectivamente. La segunda fila muestra que hubo cierta pérdida de células, que puede deberse al tamaño de las microperlas de Strep-Tactin 1# que no permiten que algunas células pasen a través de la columna. En general, los datos muestran que cualquier tipo de perla de Strep-Tactin sometida a prueba fue útil para enriquecer directamente las células T que expresan T-ChARM.

Ejemplo 12

Activación de células T que expresan T-ChARM de superficie celular con reactivos de unión a etiquetas

La activación y proliferación de las células T requiere dos señales mediadas a través del acoplamiento del receptor específico del antígeno (TCR) de las células T y una señal coestimuladora, más normalmente la unión de CD28 por ^cD80 y CD86 (Ledbetter et al., Blood 75: 1531, 1990). Por consiguiente, se han desarrollado microperlas recubiertas con AcM anti-CD3/CD28 para proporcionar ambas señales necesarias, y activar no específicamente y expandir células T para aplicaciones clínicas (Riddell y Greenberg, 1990). La estimulación anti CD3/CD28 de las células T también facilita la transducción con vectores retrovirales o lentivirales que codifican para CAR, pero no expande selectivamente las células T transducidas.

Se cultivaron células T transducidas con T-ChARM3 anti-CD19 durante 48 h en medio CTL o bien sin tratamiento (control negativo) o bien con uno de los siguientes tratamientos: (a) microperlas de Strep-Tactin® 1#; (b) microperlas de Strep-Tactin 2#; (c) nanoperlas de Strep-Tactin 3#; (d) anticuerpo anti-Strep tag conjugado con perlas de proteína G (tamaño de aproximadamente 2 |im); (e) perlas de proteína G conjugada dual de anticuerpo anti-Strep tag/anticuerpo anti-CD28, o (f) se cultivaron conjuntamente con células TM-LCL irradiadas más IL2 50 U/ml (control positivo). Para determinar si las células estaban activándose después de cultivar durante 24 h y 48 h, se examinaron las células para determinar la presencia de CD25/CD69 usando tinción de inmunofluorescencia y citometría de flujo. Las células T expresan moléculas de activación de novo, incluyendo CD69 y CD25, después de la activación a través del receptor de superficie de la célula T o mediante la señalización a través de un CAR que expresa CD3^. CD69 es uno de los primeros marcadores de activación de la superficie celular y puede estar implicado en el proceso de activación en curso. La síntesis de CD25 (la cadena a del receptor de IL2), junto con la propia IL2, se induce mediante la activación de las células T cuando se encuentra inicialmente con un antígeno.

Los datos muestran inesperadamente que la unión de Strep tag de las células T que expresan T-ChARM a través de perlas recubiertas con anticuerpos anti-Strep tag o Strep-Tactin activó significativamente estas células T, y muestra además que el tamaño de la perla también puede tener un efecto en el nivel de activación de células T (figura 13).

En experimentos adicionales con constructos adicionales, las microperlas de Strep-Tactin indujeron la regulación por incremento de CD25 en células T CD8+ (figura 27A) y CD4+ (figura 27B) que expresaban ChARM2 y CHARM3, pero no las células T que expresaron ChARM1 o CAR que carecían de una etiqueta, lo que indica que la afinidad de ChARM1 por la unión a microperlas de Strep-Tactin es subóptima en la activación de células T basada en ChARM. Sin embargo, las microperlas recubiertas con anticuerpo anti-Strep tag, que tienen una afinidad de unión a Strep tag (Kd = ~10nm) 100 veces mayor que Strep-Tactin (Kd = ~1uM), activaron diversas células T que expresan ChARM, independientemente del número de copia o la ubicación de la etiqueta en la ChARM (figuras 27A y B). En particular, la activación mediada por la unión a Strep-tag podría encontrarse en células T que expresan ChARM 4-1BB y CD28 (figura 27C) y en células T que expresan ChARM que no seleccionan como diana CD 19 (figura 27D, ChARM1 R12 que selecciona como diana ROR1 ).

Ejemplo 13

Proliferación de células T que expresan T-ChARM de superficie celular con reactivos de unión a etiquetas

Células T transducidas con T-ChARM1, T-CHARM2, T-CHARM3 y CAR (largo) anti-CD19 (control negativo) que se cultivaron individualmente en medio CTL con microperlas de StrepTactin® e IL250 U/ml. La obtención de imágenes de microscopía en el día 5 revela que las células T que expresan T-ChARM2 y T-CHARM3 desarrollaron sorprendentemente grandes agrupaciones alrededor de las perlas, indicativo de la proliferación celular en las perlas de Strep-Tactin, que no fue evidente con las células T que expresan CAR (largo) anti-CD19 (figura 11). Las células T que expresan T-CHARM1 mostraron agrupaciones de células menos expansivas, pero hubo claramente expansión celular ya que había más células visibles en la placa en comparación con el control negativo. En experimentos adicionales, diversas células T que expresan ChARM diferentes (incluyendo N1ChARM y Ch1ARM) mostraron agrupaciones de proliferación que aparecieron dentro de las 48 horas posteriores a la estimulación con microperlas de StrepTactin o microperlas de anticuerpos anti-Streptag (figura 28). Como control negativo se usaron células T con CAR con espaciador corto convencional (CD19-Hi).

Se determinó la curva de crecimiento de células T que expresan T-ChARM cultivadas en microperlas de Strep-Tactin® (véanse las figuras 12 y 29). Un total de aproximadamente 1 x 106 células T transducidas con T-CHARM1, T-CHARM2 y T-CHARM3 anti-CD19 se sembró individualmente en medio CTL con microperlas de Strep-Tactin, AcM anti-Strep tag o microperlas recubiertas con AcM anti-Strep tag/anti-CD28 (figura 28) en presencia de IL250 U/ml y IL155 ng/ml y se cultivó durante 10 días. Los números de células de cada pocillo se contaron los días 3, 6 y 9. Los datos muestran que las células T transducidas con T-ChARM3 tuvieron la tasa de crecimiento más alta durante 9 días cuando se estimularon mediante perlas de Strep-Tactin. Con estimulación con microperlas de Strep-Tactin, las células T CD8+ o CD4+ que expresan ChARM anti-CD19 se expandieron de aproximadamente 20 a aproximadamente 100 veces, y la mayor expansión se observó en células T que expresan ChARM3 (figuras 29A y B). Las perlas recubiertas con anticuerpo anti-Strep tag y anti-Strep tag/anti-CD28 indujeron una expansión aún mayor (de 100 a 250 veces) en los números totales de células T que expresan ChARM y, a diferencia de la estimulación con perlas de StrepTactin, las células T CD8+ y CD4+ que expresan una CHARM1 presentaron una tendencia hacia una mayor expansión que las células T que expresan ChARM2 o CHARM3. Las células T que expresaron una ChARM CD28 o una ChARM anti-ROR1 también se expandieron eficazmente con microperlas de anticuerpo anti-Strep tag/anti-CD28, lo que demuestra la aplicabilidad de este enfoque para expandir células T que expresan ChARM con diferentes dominios coestimuladores y especificidad para diferentes dianas tumorales (datos no mostrados).

En otro ensayo de curva de crecimiento, un total de aproximadamente 5 x 105 células T transducidas con T-CHARM3 anti-CD19 se sembró en medio CTL con IL250 U/ml; una de las siguientes perlas: (a) microperlas de Strep-Tactin 1#, (b) microperlas de Strep-Tactin 2#, (c) nanoperlas de Strep-Tactin 3#, (d) anticuerpo anti-Strep tag conjugado con perlas de proteína G, (e) perlas de proteína G conjugada dual de anticuerpo anti-Strep tag/anticuerpo anti-CD28, o (f) perlas de anticuerpo dual anti-CD3/anti-CD28 (control positivo); y se cultivaron durante 7 días. Se contó el número de células para cada pocillo en el día 3, el día 5 y el día 7. Los datos muestran que las perlas de proteína G conjugada dual de anticuerpo anti-Strep tag/anticuerpo anti-CD28 promovieron la máxima proliferación de células T que expresan T-ChARM3 el día 5, que fue significativamente mejor que el control positivo con anticuerpo anti-CD3/anti-CD28 (figura 16). Los reactivos que se acoplan a Strep tag, distintos de las microperlas de Strep-Tactin 2#, promovieron la proliferación de células T que expresan T-ChARM hasta aproximadamente el mismo nivel que el control positivo con anticuerpo anti-CD3/anti-CD28.

Para verificar adicionalmente la proliferación de células T que expresan T-ChARM, se midió el nivel de proteína Ki-67 como una medida sustituta de la proliferación. Ki-67 es una proteína nuclear asociada a y posiblemente necesaria para la proliferación celular. Las células T transducidas con T-ChARM3 anti-CD19 se cultivaron durante 5 días en medio CTL en presencia de uno de los siguientes tratamientos: (a) microperlas de Strep-Tactin® 1#; (b) microperlas de Strep-Tactin 2#; (c) nanoperlas de Strep-Tactin 3#; (d) anticuerpo anti-Strep tag conjugado con perlas de proteína G; (e) perlas de proteína G conjugada dual de anticuerpo anti-Strep tag/anticuerpo anti-CD28, o (f) perlas de anticuerpo dual anti-CD3/anti-CD28 (control positivo). Después de cultivar durante 5 días, se fijaron las células, se permeabilizaron, se tiñeron con anticuerpo conjugado anti-Ki-67-FITC y se analizaron mediante citometría de flujo.

Estos datos muestran que las perlas de Strep-Tactin o las perlas de anticuerpo anti-Strep tag pueden fomentar la proliferación celular selectiva y la proliferación tal como se miden mediante tinción con Ki-67 fue mejor que la observada con el control positivo con anticuerpo anti-CD3/anti-CD28 (figura 14).

Un nivel adicional de proteína Ki-67 tal como se realizó en células T transducidas con T-ChARM1, T-CHARM2 o T-CHARM3 anti-CD19y se cultivó durante 7 días en medio CTL en presencia de: (a) ningún tratamiento; (b) microperlas de Strep-Tactin® 1# a una dosis de 15 |ig, 50 |ig ó 150 |ig por 1 x 106 células; o (c) se cultivaron conjuntamente con células TM-LCL irradiadas más IL250 U/ml (control positivo). Después de cultivar durante 7 días, se fijaron las células, se permeabilizaron, se tiñeron con anticuerpo conjugado anti-Ki-67-FITC y se analizaron mediante citometría de flujo. Estos resultados también muestran que las perlas de Strep-Tactin pueden fomentar la proliferación en células T que expresan T-ChARM independientemente de la cantidad de perlas usadas, particularmente para células que expresan T-ChARM.2 y T-CHARM3 (figura 15). Además, cada una de las células T que expresan T-ChARM proliferó en presencia de perlas de Strep-Tactin tan bien o mejor que la estimulación de control positivo con TM-LCL.

Ejemplo 14

Expansión selectiva de células T que expresan moléculas T-ChARM

Se estimuló un total de aproximadamente 5 x 105 células T CD8+ humanas con perlas anti-CD3/anti-CD28. El día 2, las células tratadas se transdujeron con un lentivirus que contenía una molécula de ácido nucleico que codificaba para una T-ChARMVhuEGFRt anti-CD19. El día 5, se eliminaron las perlas anti-CD3/anti-CD28. En este punto, las células tratadas se dividieron en dos grupos, un grupo no se trató más y el otro grupo se trató con microperlas de Strep-Tactin® (de aproximadamente 0,5 |im a aproximadamente 1,5 |im). El día 10, se recogieron las células de cada grupo, se tiñeron con anticuerpo anti-Strep tag inmunofluorescente y se analizaron mediante citometría de flujo. La curva de crecimiento muestra que, después de la eliminación de las microperlas anti-CD3/anti-CD28, la adición de microperlas de Strep-Tactin continuó fomentando una proliferación significativa de células T (figura 17A). El análisis de citometría de flujo muestra que las células que proliferaban eran, de hecho, células T que expresaban T-ChARM, ya que había un porcentaje significativamente mayor de células T que expresaban T-ChARM (tal como se mide mediante tinción con huEGFRt) en el grupo tratado con microperlas de Strep-Tactin (panel inferior) en comparación con el grupo de control (panel superior) (figura 17B). Las células de cada grupo se clasificaron posteriormente usando el marcador huEGFRt, luego se expandieron 5,0 x 105 células mediante estimulación con TM-LCL CD19+. Las células previamente tratadas con microperlas de StrepTactin experimentaron una proliferación rápida y significativa hasta un nivel de aproximadamente 8,0 x 107 células en 7 días en comparación con sólo 4,0 x 106 células en el grupo de control. Esto demuestra que después de la estimulación con microperlas de Strep-Tactin a través de la secuencia de etiqueta de T-ChARM, la reestimulación posterior a través del componente scFv anti-CD19 de T-ChARM es altamente eficaz.

Para determinar si la estimulación con perlas anti-CD3/anti-CD28 era necesaria para expandir las células T que expresan T-ChARM, se examinó si las células T podían transducirse para expresar T-ChARM con estimulación de citocinas sola y luego expandirse selectivamente mediante tratamiento con solamente perlas anti-Strep tag. Se cultivó un total de aproximadamente 5 x 105 células T CD8+ humanas con IL-75 ng/ml e IL-1510 ng/ml durante 24 h y luego se transdujeron con el mismo título de virus que codifica para dos tipos de T-ChARM3 anti-CD19 (dominios efectores 41BB o c D28). Las células transducidas se trataron con anticuerpo anti-Strep tag conjugado con perlas de proteína G el día 2, y luego el día 7 se recogieron, se tiñeron con anticuerpo anti-Strep tag II inmunofluorescente y se analizaron mediante citometría de flujo.

Los datos muestran que el anticuerpo anti-Strep tag conjugado con perlas de proteína G fomentó la proliferación de células T que expresan T-ChARM en más del 60% de las células en el cultivo (figuras 18B y 18D) en ausencia de estimulación con perlas anti-CD3/anti-CD28. Cuando las células transducidas no se expusieron a perlas de anticuerpos anti-Strep tag, entonces proliferaría menos del 1% de las células transducidas (figuras 18A y 18C).

Se sometió a prueba la funcionalidad de las células T que expresan ChARM después de la expansión en microperlas recubiertas con anticuerpo anti-Strep tag solo o AcM anti-Strep tag/anti-CD28 para asegurar que la estimulación a través de ChARM no tendría efectos perjudiciales en el reconocimiento de tumores in vitro o en vivo. Independientemente del dominio coestimulador en el diseño, las células T que expresan ChARM expandidas en microperlas anti-Strep tag mostraron una potente actividad citolítica, liberaron citocinas de manera eficaz y retuvieron una amplia capacidad de proliferación entre la estimulación antigénica en comparación con las células antes de la

Claims

REIVINDICACIONES

i. Proteína de fusión de cadena sencilla, que comprende una porción hidrófoba dispuesta entre un componente extracelular y un componente intracelular,

en la que el componente extracelular comprende una pluralidad de casetes de etiqueta y una región conectora que comprende una bisagra,

en la que el componente intracelular comprende un dominio efector, y

en la que cada una de la pluralidad de casetes de etiqueta comprende una Strep tag, en la que cada Strep tag tiene estreptavidina, StrepTactin o ambas como pareja de unión relacionada.

2. Proteína de fusión de cadena sencilla según la reivindicación 1, en la que la región conectora comprende además:

(a) un módulo de ligador; y/o

(b) un módulo de ligador, en la que el módulo de ligador comprende una o más GlyxSery, en la que x e y son independientemente un número entero desde 0 hasta 10 siempre que x e y no sean ambos 0; y/o

(c) un módulo de ligador, en la que el módulo de ligador es una (GlyxSer)n, en la que x es un número entero desde 1 hasta 5 y n es un número entero desde 1 hasta 10; y/o

(d) un módulo de ligador, en la que el módulo de ligador es un CH2CH3 de inmunoglobulina o un CH3 de inmunoglobulina.

3. Proteína de fusión de cadena sencilla según la reivindicación 1 ó 2, en la que la región conectora comprende:

(a) desde uno hasta cinco de la pluralidad de casetes de etiqueta; y/o

(b) desde uno hasta cinco de la pluralidad de casetes de etiqueta, en la que cada casete de etiqueta se conecta a uno o dos módulos de ligador que comprenden una (GlyxSery)n, en la que n es un número entero desde 1 hasta 10, y x e y son independientemente un número entero desde 0 hasta 10 siempre que x e y no sean ambos 0; y/o

(c) desde uno hasta cinco de la pluralidad de casetes de etiqueta, en la que cada casete de etiqueta se conecta a uno o dos módulos de ligador que tienen la secuencia de aminoácidos de Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (SEQ ID NO.:10), (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)2 (SEQ ID NO.:11), (Gly-Gly-Gly-Ser)2-Gly-Gly-Ser (SEQ ID NO.:12) o cualquier combinación de las mismas.

4. Proteína de fusión de cadena sencilla según una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en la que la proteína

de fusión de cadena sencilla comprende además una etiqueta His, una etiqueta Flag, una etiqueta Xpress, una etiqueta Avi, una etiqueta de calmodulina, una etiqueta de poliglutamato, una etiqueta HA, una etiqueta

Myc, una etiqueta Nus, una etiqueta S, una etiqueta SBP, una Softag, una etiqueta V5, una CBP, una GST, una MBP, una GFP, una etiqueta de tiorredoxina o cualquier combinación de las mismas.

5. Proteína de fusión de cadena sencilla según una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en la que la Strep

tag comprende un secuencia de aminoácidos de Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (SEQ ID n O.:1) o Trp-Arg-His-Pro-Gln-Phe-Gly-Gly (SEQ ID NO.:2).

6. Proteína de fusión de cadena sencilla según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que la porción hidrófoba es un dominio transmembrana de CD4, CD8, CD28 o CD27.

7. Proteína de fusión de cadena sencilla según una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en la que:

(a) el dominio efector es de CD3e, CD38, CD3C, CD27, CD28, CD79A, CD79B, CD137, CARD11, DAP10,

FcRa , FcRp, FcRy, Fyn, HVEM, ICOS, Lck, LAG3, LAT, LRP, NKG2D, NOTCH1, NOTCH2, NOTCH3, NOTCH4, ROR2, Ryk, SLAMF1, Slp76, pTa , TCRa , TCRp, TRIM, Zap70, PTCH2 o cualquier combinación de los mismos, en la que, opcionalmente, el dominio efector es de LRP, NOTCH1, NOTCH2, NOTCH3, NOTCH4, ROR2 o Ryk; o

(b) el dominio efector es de (i) CD3 ^y (ii) uno o más de 4-1BB (CD137), CD27, CD28 y OX40 (CD134).

8. Proteína de fusión de cadena sencilla según una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en la que la proteína

de fusión comprende desde el extremo amino-terminal hasta el extremo carboxilo-terminal:

(a) un casete de etiqueta, una región conectora que comprende una bisagra, una porción hidrófoba y un componente intracelular que comprende un dominio efector; o

(b) una primera región conectora, un casete de etiqueta, una segunda región conectora que comprende una bisagra, una porción hidrófoba y un componente intracelular que comprende un dominio efector; o

(c) un primer casete de etiqueta, una primera región conectora, un segundo casete de etiqueta, una segunda región conectora que comprende una bisagra, una porción hidrófoba y un componente intracelular que comprende un dominio efector; o

(d) un primer casete de etiqueta, una primera región conectora, un segundo casete de etiqueta, una segunda región conectora, un tercer casete de etiqueta, una tercera región conectora que comprende una bisagra, una porción hidrófoba y un componente intracelular que comprende un dominio efector; o

(e) de dos a cinco casetes de etiqueta, una región conectora que comprende una bisagra, una porción hidrófoba y un componente intracelular que comprende un dominio efector; o

(f) un casete de etiqueta, una región conectora que comprende una bisagra de IgG, un dominio transmembrana y un componente intracelular que comprende un dominio efector de 4-1BB y CD3Q CD27 y CD3C; CD28 y CD3C; o CD28, 4-1BB y CD3C; o

(g) un casete de etiqueta, una región conectora que comprende una bisagra, una porción hidrófoba y un componente intracelular que comprende un dominio efector de LRP, NOTCH1, NOTCH2, NOTCH3, NOTCH4, ROR2 o Ryk.

Proteína de fusión de cadena sencilla según una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en la que el componente extracelular comprende además un dominio de unión que se une específicamente a una diana. Proteína de fusión de cadena sencilla según la reivindicación 9, en la que el dominio de unión es un scFv, scTCR, ectodominio de receptor o ligando.

Proteína de fusión de cadena sencilla o receptor según la reivindicación 9 ó 10, en los que la proteína de fusión comprende desde el extremo amino-terminal hasta el extremo carboxilo-terminal:

(a) un dominio de unión extracelular, un casete de etiqueta, una región conectora que comprende una bisagra, una porción hidrófoba y un componente intracelular que comprende un dominio efector; o

(b) un dominio de unión extracelular, una primera región conectora, un casete de etiqueta, una segunda región conectora que comprende una bisagra, una porción hidrófoba y un componente intracelular que comprende un dominio efector; o

(c) un dominio de unión extracelular, un primer casete de etiqueta, una primera región conectora, un segundo casete de etiqueta, una segunda región conectora que comprende una bisagra, una porción hidrófoba y un componente intracelular que comprende un dominio efector; o

(d) un dominio de unión extracelular, un primer casete de etiqueta, una primera región conectora, un segundo casete de etiqueta, una segunda región conectora, un tercer casete de etiqueta, una tercera región conectora que comprende una bisagra, una porción hidrófoba y un componente intracelular que comprende un dominio efector; o

(e) un casete de etiqueta, un dominio de unión extracelular, una región conectora que comprende una bisagra, una porción hidrófoba y un componente intracelular que comprende un dominio efector; o

(f) un dominio de unión a scFv o scTCR extracelular que comprende un ligador de región variable que contiene un casete de etiqueta dispuesto entre las regiones variables, una región conectora que comprende una bisagra, una porción hidrófoba y un componente intracelular que comprende un dominio efector; o

(g) un dominio de unión a scFv o scTCR extracelular, un casete de etiqueta, una región conectora que comprende una bisagra de IgG, un dominio transmembrana y un componente intracelular que comprende un dominio efector, en la que el dominio efector es de: (A) 4-1BB y CD3^, (B) CD27 y CD3^, (C) CD28 y CD3^, (D) OX40 y CD3C, (E) CD28, 4-1BB y CD3C, (F) OX40, 4-1BB y CD3C o (G) CD28, OX40 y CD3Q o (h) un dominio de unión extracelular que comprende un ectodominio de receptor, un casete de etiqueta, una región conectora que comprende una bisagra, una porción hidrófoba y un componente intracelular que comprende un dominio efector, en la que el dominio efector es de 4-1BB, CD27, CD28 u OX40.

12. Proteína de fusión de cadena sencilla según una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en la que la proteína de fusión comprende además:

(a) un dominio de unión asociado de manera no covalente; y/o

(b) un dominio de unión asociado de manera no covalente, en la que el dominio de unión asociado de manera no covalente se asocia con un casete de etiqueta; y/o

(c) un dominio de unión asociado de manera no covalente, en la que el domino de unión asociado de manera no covalente es un scFv, scTCR, ectodominio de receptor o ligando; y/o

(d) un dominio de unión biespecífico asociado de manera no covalente, en la que el primer extremo de unión es específico para el casete de etiqueta y el segundo extremo de unión es específico para una diana distinta del casete de etiqueta; y/o

(e) un dominio de unión biespecífico asociado de manera no covalente, en la que los extremos de unión primero y segundo son específicos para el casete de etiqueta; y/o

(f) un dominio de unión multiespecífico asociado de manera no covalente, en la que un primer extremo se une al casete de etiqueta y un segundo extremo de unión es específico para una o más dianas distintas del casete de etiqueta.

13. Proteína de fusión de cadena sencilla según una cualquiera de las reivindicaciones 9-12, en la que la diana comprende CD3, CEACAM6, c-Met, EGFR, EGFRvIII, ErbB2, ErbB3, ErbB4, EphA2, IGF1R, GD2, O-acetil GD2, O-acetil GD3, GHRHR, GHR, FLT1, KDR, FLT4, CD44v6, CD151, CA125, CEA, CTLA-4, GITR, BTLA, TGFBR2, TGFBR1, IL6R, gp130, Lewis A, Lewis Y, TNFR1, TNFR2, PD1, PD-L1, PD-L2, HVEM, MAGE-A, mesotelina, NY-ESO-1, PSMA, RANK, ROR1, TNFRSF4, CD40, CD137, TWEAK-R, HLA, péptido asociado a tumor o patógeno unido a HLA, péptido hTERT unido a HLA, péptido tirosinasa unido a HLA, péptido WT-1 unido a HLA, LTpR, LIFRp, LRP5, MUC1, OSMRp, TCRa, TCRp, CD19, CD20, CD22, CD25, CD28, CD30, CD33, CD52, CD56, CD80, CD81, CD86, CD123, CD171, CD276, B7H4, TLR7, TLR9, PTCH1, WT-1, Robo1, a-fetoproteína (AFP), Frizzled, OX40 o CD79b.

14. Molécula de ácido nucleico que codifica para una proteína de fusión según una cualquiera de las reivindicaciones 1-13.

15. Vector que comprende una molécula de ácido nucleico según la reivindicación 14.

16. Vector según la reivindicación 15, en el que el vector es un vector viral; opcionalmente un vector retroviral o vector lentiviral.

17. Célula huésped, que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica para una proteína de fusión según una cualquiera de las reivindicaciones 1-13, opcionalmente en la que la célula huésped es una célula T.

18. Método in vitro para activar una célula, que comprende poner en contacto una célula que comprende una proteína de fusión según una cualquiera de las reivindicaciones 1-13 y/o la molécula de ácido nucleico según la reivindicación 14 con un dominio de unión específico para uno o más del uno o más casetes de etiqueta.

19. Método in vitro para fomentar la proliferación celular, que comprende poner en contacto una célula no natural que comprende una proteína de fusión según una cualquiera de las reivindicaciones 1-13 y/o la molécula de ácido nucleico según la reivindicación 14 con un dominio de unión específico para uno o más del uno o más casetes de etiqueta y una citocina de factor de crecimiento durante un tiempo suficiente para permitir el crecimiento celular.

20. Método in vitro para identificar una célula, comprendiendo el método:

poner en contacto una muestra que comprende una célula que comprende una proteína de fusión según una cualquiera de las reivindicaciones 1-13 y/o la molécula de ácido nucleico según la reivindicación 14 con un dominio de unión específico para uno o más del uno o más casetes de etiqueta, en el que el dominio de unión específico para el casete de etiqueta comprende un resto detectable, y

detectar la presencia de la célula en la muestra.

21. Método in vitro para clasificar o seleccionar una célula o población de células, comprendiendo el método: poner en contacto una muestra que comprende una célula T que comprende una proteína de fusión según una cualquiera de las reivindicaciones 1-13 y/o la molécula de ácido nucleico según la reivindicación 14 con un dominio de unión específico para uno o más del uno o más casetes de etiqueta, y

seleccionar o separar de otras células la(s) célula(s) que se une(n) específicamente mediante el dominio de unión, seleccionando o separando de ese modo de otras células la célula o población de células.

Método in vitro para enriquecer o aislar una célula o población de la misma, comprendiendo el método poner en contacto una muestra que comprende la célula que comprende la molécula de ácido nucleico según la reivindicación 14 y/o la proteína de fusión según cualquiera de las reivindicaciones 1-13 con un dominio de unión específico para uno o más del uno o más casetes de etiqueta y enriquecer o aislar la célula de otras células que no expresan la proteína de fusión o el receptor en la muestra.

Célula huésped según la reivindicación 17, para su uso en un método para agotar células para el tratamiento de cáncer o una enfermedad infecciosa, que comprende poner en contacto una célula que comprende una molécula de ácido nucleico según la reivindicación 14 o la proteína de fusión según cualquiera de las reivindicaciones 1-13 con un dominio de unión específico para el casete de etiqueta, en la que la unión del dominio de unión específico para el casete de etiqueta conduce a la muerte celular de las células huésped que expresan la proteína de fusión, opcionalmente en la que el método comprende además monitorizar los niveles de citocinas en el sujeto después de administrar el dominio de unión específico para uno o más del uno o más casetes de etiqueta.

Célula huésped según la reivindicación 17, para su uso en el tratamiento de una enfermedad o un estado.

Composición farmacéutica que comprende la célula huésped según la reivindicación 17 y un portador, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable.