CN103409333B

CN103409333B - 一株持续高效分泌β-葡萄糖苷酶的重组酿酒酵母菌株及其应用

Info

Publication number: CN103409333B
Application number: CN201310187648.XA
Authority: CN
Inventors: 侯进; 沈煜; 鲍晓明; 汤红婷
Original assignee: Shandong University
Current assignee: Shandong University
Priority date: 2013-05-20
Filing date: 2013-05-20
Publication date: 2015-01-28
Anticipated expiration: 2033-05-20
Also published as: CN103409333A

Abstract

本发明提供了一株持续高效分泌β-葡萄糖苷酶的重组酿酒酵母菌株，该菌株命名为酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）102SB，已于2013年04月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.7450。本发明的重组酿酒酵母菌能够在复杂的非选择性培养基中高效分泌β-葡萄糖苷酶，胞外酶活可达到1005.3U/g干重。该菌株利用纤维二糖的最大比生长速率与葡萄糖一致，在限氧条件下达到0.29h^-1。在以纤维素材料为底物的SSF中，以微晶纤维素为底物的乙醇产量提高了110%，以酸水解玉米芯为底物的乙醇产量提高了89%。本发明的重组酿酒酵母菌株对降低纤维素乙醇生产过程中同步糖化发酵的生产成本，简化生产工艺具有重要的意义。

Description

一株持续高效分泌β-葡萄糖苷酶的重组酿酒酵母菌株及其应用

技术领域

本发明涉及一株持续高效分泌扣囊复膜孢酵母源β-葡萄糖苷酶BGL1的重组酿酒酵

母菌株及其在同步糖化发酵工艺（SSF）中以木质纤维素为原料生产生物乙醇的应用。

背景技术

木质纤维素是地球上最丰富的可再生资源之一，利用纤维素原料生产生物燃料如生物乙醇具有广泛的应用前景（Lynd LR et al.,2002）。纤维乙醇的生产首先将纤维素原料水解为还原性糖类，再通过发酵转化为乙醇。由于纤维素酶的低降解效率和高酶解成本，木质纤维素转化为还原性糖一直被认为是工业生产乙醇的限制性步骤(van Rooyen et al.,2005)。木质纤维素同步糖化发酵（Simultaneous Saccharification and fermentation,SSF）转化为乙醇能促进纤维素酶的水解效率，提高生物乙醇产量。在SSF中，持续性的消耗木质纤维素降解产生的还原糖可以消除纤维素酶的反馈抑制并且代谢物乙醇能够降低染菌的危险(Stenberg et al.,2000)。

纤维素原料高效的水解需要纤维素酶之间的协同作用，最基本的三种纤维素酶包括内切葡聚糖酶（水解纤维素内部糖苷键产纤维二糖和寡聚糖，EG），纤维二糖水解酶（从纤维素的还原端或非还原端作用产纤维二糖，CBH）以及β-葡萄糖苷酶（将纤维二糖转化为葡萄糖，BGL）(Gurgu et al.,2011)。来源于不同真菌的纤维素酶如瑞氏木霉源的纤维素酶在工业应用中占有主导地位，但是这类酶系大多缺乏β-葡萄糖苷酶活性(Gusakov et al.,1992;Nagaret al.,2010;Nieves et al.,1997)。瑞氏木霉源纤维素酶系水解纤维素的主要降解产物为纤维二糖，而纤维二糖是纤维素酶尤其是纤维二糖水解酶的抑制物(et al.,2010)。因此，β-葡萄糖苷酶不仅对葡萄糖的产生起关键作用，也是消除其他纤维素酶在水解过程受抑制的重要角色(Bezerra and Dias,2005;Du et al.,2010)。在SSF生产工艺中，消除纤维二糖的抑制可以采用添加外源β-葡萄糖苷酶或者构建具有高分泌β-葡萄糖苷酶的重组酵母解决(HariKrishna and Chowdary,2000;Spindler et al.,1989;Stenberg et al.,2000)。

酿酒酵母作为传统的乙醇生产菌株，具有生长速度快，乙醇产率高，对抑制物的耐受性好等特点(Hahn-Hagerdal et al.,2001;Ilmen et al.,2011)。然而，由于缺乏纤维二糖转运蛋白和纤维二糖水解酶活性，酿酒酵母不能吸收代谢纤维二糖。因此，赋予酿酒酵母高效利用纤维二糖能力是提高SSF乙醇产率所必要的。

在酿酒酵母中表达不同来源的β-葡萄糖苷酶能够赋予重组菌株利用纤维二糖能力。Wilde et al.在酿酒酵母中比较了来源于12种真菌的35个β-葡萄糖苷酶，如黑曲霉，米曲霉等，发现黑曲霉源的β-葡萄糖苷酶具有最高的表达活性(Wilde et al.,2012)。扣囊复膜孢酵母的BGL1也被广泛的表达于酿酒酵母中，并且具有较高的酶活性(Den Haan et al.,2007;Gurgu et al.,2011;Shen et al.,2008;Zhang et al.,2012)。此外，来源于细菌的β-葡萄糖苷酶如双氮纤维单胞菌等也在酿酒酵母中表达(Ragauskas et al.,2006)。但在这些研究中，β-葡萄糖苷酶基因主要是克隆在以营养缺陷型为筛选标记的表达载体中，如酵母质粒pYES2,Yeplac195以及ySFI，这些表达载体需要相应的选择性培养基来维持其稳定性，且菌株分泌表达β-葡萄糖苷酶的效率也较弱。为了获得能够广泛应用于SSF过程中的重组菌株，可在非选择压力下持续高效的表达分泌β-葡萄糖苷酶是必要的。检索表明，相关的可在非选择培养基上持续高效分泌β-葡萄糖苷酶并具有高纤维二糖代谢能力的重组酿酒酵母菌株及其在以木质纤维素为原料的同步糖化发酵工艺（SSF）中应用的文献和专利还未见报道。

发明内容

针对现有技术不足，本发明要解决的问题是提供一株可在非选择培养基上持续高效分泌扣囊复膜孢酵母源β-葡萄糖苷酶BGL1的重组酿酒酵母菌株及其在同步糖化发酵工艺中以木质纤维素为原料生产生物乙醇的应用。

本发明的技术方案是：构建含有β-葡萄糖苷酶表达框的重组表达载体；构建敲除磷酸丙糖异构酶基因TPI1的酿酒酵母表达宿主；将构建的重组表达质粒转化到酿酒酵母表达宿主中，通过筛选得到转化成功的转化子，获得含有上述重组表达载体的重组酿酒酵母表达菌株；应用上述重组酿酒酵母表达菌株在同步糖化发酵工艺中以木质纤维素为原料生产生物乙醇。

本发明所述的持续高效分泌β-葡萄糖苷酶的重组酿酒酵母菌株，其特征在于该菌株能在非选择性培养基如各种纤维素原料的培养基上持续高效分泌β-葡萄糖苷酶，因此可高效水解纤维二糖为葡萄糖：所述菌株命名为酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）102SB，已于2013年04月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.7450。

上述分泌β-葡萄糖苷酶的重组酿酒酵母菌株的制备方法，步骤是：

（1）构建含有β-葡萄糖苷酶表达框的表达载体：

将载体CPOT(Liu et al.2012)用XhoI和KpnI双酶切，得到8000bp片段，再用带有质粒两端同源臂的引物扩增β-葡萄糖苷酶表达盒，通过DNA一步等温连接方法连接，转化大肠杆菌Tran5α感受态细胞后得到重组表达载体CPOTSB，其中所述重组质粒CPOTSB的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；

（2）构建敲除磷酸丙糖异构酶基因TPI1的酿酒酵母表达宿主：

从CEN.PK530-1D(Hou et al.,2012)基因组上扩增得到的kanMX4转化到酿酒酵母CEN.PK102-3A（EUROSCARF购得）中，通过选择性培养基（10g/L酵母膏，20g/L蛋白胨,20g/L乙醇）并且添加200μg/ml G418的培养条件下筛选得到转化成功的转化子，获得宿主酿酒酵母，命名为宿主酿酒酵母102-ΔTPI1；

（3）含有β-葡萄糖苷酶表达载体的重组酿酒酵母表达菌株的构建：

将步骤（1）中建立的重组质粒102SB转化到（2）中构建的宿主酿酒酵母102-ΔTPI中，通过YPD(酵母提取物10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L，自然pH值)筛选得到转化成功的转化子，即为分泌β-葡萄糖苷酶的重组酿酒酵母菌株，命名为酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）102SB。

上述分泌β-葡萄糖苷酶的重组酿酒酵母菌株在同步糖化发酵工艺中以木质纤维素为原料生产生物乙醇的应用：

将步骤（3）构建的含有β-葡萄糖苷酶表达载体的重组酿酒酵母102SB分泌的β-葡萄糖苷酶的活性进行测定，发现其在非选择性YPD培养基中分泌的β-葡萄糖苷酶的酶活可达到1005.3U/g干重(即5220mU/ml)，远高于其他文献在营养缺陷型的选择性培养基中的报道的水平。该菌株纤维二糖代谢能力很强，接近于菌株对葡萄糖的代谢能力。

在以微晶纤维素为底物进行同步糖化发酵时，利用瑞氏木霉纤维素酶对原料进行酶解，并用重组酿酒酵母102SB发酵，与不表达β-葡萄糖苷酶的对照菌株相比，乙醇的产量提高了110%，纤维二糖积累减少。而在以木质纤维素粗原料--酸水解玉米芯为底物进行同步糖化发酵时，其发酵过程中的纤维二糖积累也比对照菌株显著减少，且乙醇产量提高了89%，达到21g/L。

本发明针对现有技术的不足提供了一株持续高效分泌β-葡萄糖苷酶并具有高纤维二糖代谢能力的重组酿酒酵母菌株。本发明的重组酿酒酵母菌株分泌的β-葡萄糖苷酶的酶活可达到1005.3U/g干重(即5220mU/ml)。具有高效的纤维二糖代谢能力，利用纤维二糖发酵在限氧条件下比生长速率可达到0.29h^-1，其代谢能力与葡萄糖相当。在以纤维素为底物的同步糖化发酵中，重组菌株高效β-葡萄糖苷酶分泌大大提高了酶解效率，减少了纤维二糖的积累。在利用瑞氏木霉纤维素酶进行水解，重组菌株102SB进行发酵过程中，以微晶纤维素为底物时乙醇产量提高了110%，以酸水解玉米芯为底物为底物是乙醇产量提高了89%，并且通过纤维二糖的高效水解为葡萄糖而解除了其对纤维素酶的抑制作用。不仅降低了SSF的生产成本，简化了生产工艺，还对解决当前能源危机具有极其重要的意义。

附图说明

本发明涉及的酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）102SB，已于2013年04月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.7450。

图1：PCR产物为扣囊复膜孢酵母β-葡萄糖苷酶BGL1片段。

图2：PCR产物为带有TPI1基因上下游序列的loxP-KanMX4-loxP敲除盒。

图3：PCR验证TPI1基因被正确敲除的转化子。

图4：质粒CPOTSB图谱。

图5：重组酿酒酵母表达菌株β-葡萄糖苷酶酶活测定（其中符号表示:■,重组菌株102SB;●,对照菌株）。

图6：重组菌株与对照菌株以葡萄糖和纤维二糖的有氧和限氧发酵（A,葡萄糖有氧发酵B,葡萄糖限氧发酵C，纤维二糖有氧发酵D，纤维二糖限氧发酵；其中符号表示:■or□,纤维二糖;▲or△,葡萄糖;●or○,乙醇）。

图7：重组菌株与对照菌株通过商业纤维素酶和瑞氏木霉纤维素酶水解微晶纤维素的限氧发酵（A,商业纤维素酶水解微晶纤维素的发酵结果B，瑞氏木霉T1纤维素酶水解微晶纤维素的发酵结果；其中符号表示:■or□,纤维二糖;▲or△,葡萄糖;●or○,乙醇）。

图8：重组菌株通过瑞氏木霉纤维素酶水解酸水解玉米芯的限氧发酵（重组菌株102SB的限氧发酵结果；其中符号表示:■,纤维二糖;▲,葡萄糖;●,乙醇）。

具体实施方式

木质纤维素是生产生物燃料如生物乙醇的最具潜力但未被开发利用的原材料。同步糖化发酵（SSF）纤维素物质能够很大程度的提高生物乙醇产量，但是在SSF生产工艺中，酶解产物纤维二糖会对纤维素酶产生抑制作用。消除抑制作用可以采用添加外源β-葡萄糖苷酶或者构建具有高β-葡萄糖苷酶分泌活性的重组酵母解决。本发明中提供一株持续高效分泌β-葡萄糖苷酶的重组酿酒酵母菌株对SSF具有重要作用。

实施例1：以染色体DNA为模板，分离、克隆和测序β-葡萄糖苷酶基因

提取扣囊复膜孢酵母（购自ATCC）染色体DNA，以染色体DNA为模板，SF-F和SF-R为引物，全式金公司生产的Fast Pfu聚合酶进行PCR，扩增产物为2700bp左右条带（图1）。

其中，上述SF-F和SF-R引物序列为：

SF-F:5’-TATAACTACAAAAAACACATACATAAACTAAAAGGTACCATGTTGATGATAGTACAGC-3’

SF-R:5’-TTTTATATAATTATATTAATCTTAGTTTCTAGACTCGAGTCAAATAGTAAACAGGACAG-3’

PCR反应体系如下：(引物浓度为10μM)

PCR反应条件：95℃预变性2分钟，30个循环：95℃变性20秒，54℃退火20秒，72℃延伸1min15s。72℃延伸5分钟，4℃保存。胶回收纯化浓缩PCR产物。

实施例2：带有TPI1基因上下游序列的loxP-KanMX4-loxP敲除盒的获取

（1）培养酿酒酵母CEN.PK530-1D(Hou et al.2012)，提取染色体DNA。以染色体DNA为模板，TPI-F和TPI-R为引物，全式金公司生产的Fast Pfu聚合酶进行PCR两端带有重组臂以及带有loxP位点的G418抗性的筛选标记基因片段。

其中，上述TPI-F和TPI-R引物序列为：

TPI-F：5’-ACCCATCAGGTTGGTGGAAG-3’

TPI-R：5’-CAACGCGAAAATGACGCCTC-3

PCR反应体系如下：(引物浓度为10μM)

PCR反应条件：95℃预变性2分钟，30个循环：95℃变性20秒，54℃退火20秒，72℃延伸1min15s。72℃延伸5分钟，4℃保存。扩增得到大小为2300bp左右的基因片段胶回收纯化浓缩PCR产物。

同源重组片段转化敲除TPI1基因：转化25微升PCR得到的基因片段于酿酒酵母CEN.PK102-3A（购自ERUOSCARF），通过含200μg/ml G418的YPE（2%Ethnol）平板筛选转化子；

（2）PCR验证酿酒酵母转化子：提取步骤（1）所得转化子的基因组，以基因组为模板，用引物TPI-F和引物TPI-R以及TPI-F和Kan-down，PCR扩增得到2300bp的同源重组臂之间的基因片段和1700bp的G418抗性基因片段（图3）；

其中，上述Kan-down引物序列为：

Kan-down：CTGATTAGAAAAACTCATCGAGCATC

PCR反应条件：94℃预变性5分钟，94℃变性30秒，56℃退火30秒，72℃延伸2min30，30个循环后72℃延伸10分钟，4℃保存。

实施例3：重组表达质粒的构建

将载体CPOT用XhoI单切，得到的8000bp片段与实施例1图1所示带有质粒两端同源臂的引物扩增β-葡萄糖苷酶的表达盒，通过DNA一步等温连接方法连接，转化大肠杆菌Tran5α感受态细胞后得到重组表达载体（图4）。

实施例4：重组酿酒酵母表达菌株的构建

将实例3中建立的重组质粒CPOTSB转化到实例2构建的酿酒酵母102-ΔTPI中，通过YPD筛选得到转化成功的转化子，即为分泌β-葡萄糖苷酶的重组酿酒酵母菌株，命名为酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）102SB。

实施例5：重组酿酒酵母表达菌株β-葡萄糖苷酶酶活测定

从实施例4中获得的转化子接种于YPD液体培养基，30℃、300rpm培养进行一次活化，再转接至YPD液体培养基中进行二次活化。将活化菌接种到装有40ml YPD培养基的100ml三角瓶中，起始接种OD6000.2，棉塞封口，30℃、300rpm培养。定期取样用pNPG(p-nitrophenyl-β-D-glucopyranoside，Sigma)作为底物测定β-葡萄糖苷酶酶活。方法如下：1、制作标准曲线：6个灭菌的5ml离心管中，分别加入不同量的10mM对硝基酚(p-nitrophenol，pNP)，制作出梯度浓度(0，0.04，0.08，0.12，0.16，0.20mM)的pNP溶液150ul，然后加入150ul10%Na2CO3，室温放置5min，于405nm处测定其吸光值，所得数据用于制作标准曲线。2、取适量菌液测定OD600，并13000rpm、4℃离心4min，取上清液测定酶活。加入适量上清（加入的量以最终测定的OD405在0.3-1.5之间为准)，控制反应最终总体积为150ul，其组分终浓度：5mM pNPG，50mM sodium acetate，pH5.0。50℃反应30分钟。加入150ul10%Na2CO3溶液终止反应，室温放置5分钟后测定405nm处的吸光值。对照标准曲线换算出生成的pNP数量，计算酶活。1个酶活单位(1U)为在测定条件下1分钟内水解产生1μmol pNP所需的酶量。

结果如图5所示。胞外β-葡萄糖苷酶酶活可以达到1005.3U/g干重(即5220mU/ml)。

实施例6:重组酿酒酵母表达菌株以葡萄糖和纤维二糖为底物的有氧和限氧发酵

同实施例5活化菌株。

将活化菌接种到装有40ml YPD或YPC培养基的100ml三角瓶（棉塞封口）中或厌氧瓶中，起始接种OD₆₀₀0.2，30℃，300rpm培养。生长过程中定时取样，测定OD₆₀₀值所示，并离心取上清进行HPLC分析。以发酵时间h为横轴，代谢物量为纵轴，绘制重组菌株在不同条件下的发酵曲线，结果见图6和表1。

由A和B图以及表1可知，102SB和对照菌株在以葡萄糖为唯一碳源时，最大比生长速率，葡萄糖利用以及乙醇产量基本一致，说明β-葡萄糖苷酶的表达分泌对菌株生长代谢几乎没有影响。由C和D图可知，对照菌株不能利用纤维二糖，102SB不管在有氧条件或厌氧条件下都能很快的消耗纤维二糖生长并产乙醇。

由表1可知，102SB利用纤维二糖能力与对照利用葡萄糖的能力相当，说明重组菌株适用于发酵产乙醇的工艺中。

表1重组菌株的发酵特性

实施例7：重组菌株以微晶纤维素为底物的同步糖化发酵

商业纤维素酶购买于Gennecor(E-072095,USA)，FPA（滤纸酶活）为82.40IU/ml，BGL1（β-葡萄糖苷酶的酶活）为602.00IU/ml。瑞氏木霉T1的纤维素酶直接来源于离心后的发酵液，FPA为6.34IU/ml，BGL1为3.38IU/ml.

同实施例5活化菌株。

在限氧瓶中配制含有30g/L的微晶纤维素的培养基，灭菌，然后加入30IU/g底物的纤维素酶,于45℃,300rpm的摇床中预酶解2h后冷却，并将活化的菌接种入发酵液中，初始OD₆₀₀为1.0，30℃、300rpm培养。生长过程中定时取样，测定OD₆₀₀值所示，并离心取上清进行HPLC分析。以发酵时间h为横轴，代谢物量为纵轴，绘制重组菌株在不同条件下的发酵曲线，结果见图7。

由图A可知，商业纤维素酶水解微晶纤维素时，对照菌株和102SB菌株对葡萄糖的利用和乙醇的产量一致（～8.2g/L），并且无纤维二糖的积累，说明纤维素酶系中β-葡萄糖苷酶酶活足够时，增加其量并不能再提高纤维素酶的水解效率。由图B可知，瑞氏木霉T1的纤维素酶作用时，对照菌株发酵液中明显积累了大量的纤维二糖，并且乙醇产量低（～4g/L）。而102SB的乙醇产量提高110%（～8.2g/L，与商业纤维素酶水解产乙醇量一致），发酵液中也无纤维二糖的积累，说明了重组菌株能够促进瑞氏木霉纤维素酶的水解效率，提高SSF的乙醇产量。

实施例8：重组菌株以酸水解玉米芯为底物的同步糖化发酵

同实施例5活化菌株。

将活化菌接种到装有40ml25IU/g底物的纤维素酶的预酶解液（2g/L(NH4)₂SO4,5g/LKH₂PO₄,2g/L MgSO₄·7H₂O,0.2g/L CaCl₂,80g/L酸水解玉米芯（纤维素含量为70%）,pH4.8）的100ml厌氧瓶中，起始OD600为1.0，30℃，300rpm培养。生长过程中定时取样，离心取上清进行HPLC分析。以发酵时间h为横轴，代谢物量为纵轴，绘制重组菌株以酸水解玉米芯为底物的限氧发酵曲线,结果见图7。

由图7可知，对照菌株有明显的纤维二糖的积累，而102SB快速的将纤维二糖消耗到很低的水平，并在96h时产生了21.5g/L的乙醇，相对于对照菌株提高了89%，乙醇转化率达到38%。

本实验所使用的大肠杆菌Trans5α感受态细胞以及Taq酶均购于北京全式金生物技术有限公司；限制性核酸内切酶购于Fermentas；质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒以及酶切产物纯化试剂盒均购于OMEGA bio-tek（USA）。相应的实验操作按产品说明书进行。

Claims

1.一株持续高效分泌β-葡萄糖苷酶的重组酿酒酵母菌株，该菌株能持续高效分泌扣囊复膜孢酵母源β-葡萄糖苷酶BGL1，其特征在于：所述菌株命名为酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)102SB，已于2013年04月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.7450。

2.权利要求1所述分泌β-葡萄糖苷酶的重组酿酒酵母菌株在同步糖化发酵工艺中以木质纤维素为原料生产生物乙醇的应用。