CN104560919B - 一种扣囊复膜孢酵母菌多克隆抗体及制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于动物基因工程领域，具体涉及一种扣囊复膜孢酵母菌多克隆抗体及制备方法。本发明分离的扣囊复膜孢酵母菌CB蛋白的BGL1基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，该基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。对扣囊复膜孢酵母菌CB蛋白抗原表位预测分析,得到含抗原表位较多的片段，构建大肠杆菌重组表达载体，用该表达载体转化大肠杆菌，得到表达CB蛋白的重组株。对重组株进行诱导表达和对CB蛋白大量表达、纯化，以纯化的CB蛋白作扣囊复膜孢酵母菌多克隆抗体的免疫原免疫动物得到多克隆抗体。本发明的多抗特异性好，纯度和效价高，保存期长，可用于遗传工程中的免疫印迹、免疫组化分析等。

Description

一种扣囊复膜孢酵母菌多克隆抗体及制备方法
技术领域
本发明属于动物基因工程技术领域，具体涉及一种扣囊复膜孢酵母菌多克隆抗体及制备方法。
背景技术
扣囊复膜孢酵母菌(Saccharomycopsis fibuligera)，又称扣囊拟内孢霉(Endomycopsis fibuligera)，是真菌的一种，能够表达生淀粉液化酶和糖化酶，扣囊复膜孢酵母菌被认为是产生淀粉分解酶类的最好的子囊酵母菌之一。
本发明中的β-葡萄糖苷酶(β-D-Glucosidase，简称CB)是由来源于扣囊复膜酵母的BGL1基因表达产生的一种纤维素酶。纤维素酶是一个多酶组分的复杂酶系，广泛存在于自然界中，细菌、真菌、动物体内等都能产生纤维素酶，但一般用于生产的纤维素酶来自于真菌。纤维素酶主要由由内切葡萄糖苷酶、外切葡萄糖苷酶和β-葡萄糖苷酶三种酶组成。在降解纤维素所需的3三种酶中,β-葡萄糖苷酶所占比例最小,这直接影响了纤维素酶系的水解效率。因此，为了提高纤维素的利用率，近年来有关利用基因工程技术,提高β-葡萄糖苷酶表达效率的相关报道越来越多。扣囊复膜酵母菌的BGL1基因也应用于动物转基因技术，使BGL1基因在动物体内产生β-葡萄糖苷酶，旨在提高非反刍动物对饲料中纤维素的消化利用率。
来源于扣囊复膜孢酵母菌的BGL1基因在基因工程领域中的应用报道也越来越多。目前市场上销售的β-葡萄糖苷酶抗体种类繁多，但无专门针对来源于扣囊复膜孢酵母菌的β-葡萄糖苷酶抗体。
目前，本领域迫切需要制备出一种抗扣囊复膜孢酵母菌β-葡萄糖苷酶(β-D-Glucosidase，CB)抗原的多克隆抗体。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种体外表达扣囊复膜孢酵母菌多克隆抗体及制备方法。
本发明的技术方案如下所述：
申请人通过克隆技术得到一种原核表达的扣囊复膜孢酵母菌CB蛋白，该扣囊复膜孢酵母菌CB蛋白编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。
申请人提供了一种扣囊复膜孢酵母菌CB蛋白的体外原核表达方法，其包括下列步骤：
(1)对扣囊复膜孢酵母菌CB蛋白序列(氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示)进行抗原表位的预测与分析，该序列是SEQ ID NO：1所述的核苷酸序列的表达产物；
(2)预测分析选出一段抗原表位较多的氨基酸序列，所述的氨基酸序列如SEQ IDNO：4所述，该序列是SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列的表达产物；
(3)克隆如SEQ ID NO：3所示的的核苷酸序列，制备重组表达载体pET-21a(+)-BGL1；
(4)将构建成功的重组表达载体pET-21a(+)-BGL1转化到大肠杆菌DH5α，构建得到表达CB蛋白的重组菌株；
(5)对所得重组菌株进行诱导表达，并进行表达形式的检测；
(6)对所得的扣囊复膜孢酵母菌CB蛋白进行大量表达及纯化，通过免疫动物得到得到抗血清，进一步纯化得到多克隆抗体。
在上述步骤(3)中构建重组载体时，克隆扣囊复膜孢酵母菌BGL1基因的插入位点为EcoRI和XhoI酶切位点。
在上述步骤(3)中构建重组载体时，所用的引物序列如下所示：
正向引物F：5’—CCGGAATTCGGTGACAGATCCGGGACTGCT—3’(下划线部分为EcoR Ⅰ位点)，
反向引物R：5’—CCGCTCGAGTCTCAAAAGCTCAAACTCAAC—3’(下划线部分Xho Ⅰ位点)。
在上述步骤(5)中，诱导蛋白表达所用方法为自诱导培养基诱导蛋白的表达，所述的自诱导培养基成分如下所述：
酵母提取物0.5％；Na2HPO450mM；KH2PO450mM；(NH4)2SO425mM；MgSO42mM；甘油0.5％；葡萄糖0.05％；乳糖0.2％。
在上述步骤(6)中，所述纯化是用镍柱亲和层析法中的变性条件进行纯化，所述的变性条件如下：
先用含8M尿素的Binding buffer平衡柱子，由于目的蛋白和杂蛋白对不同浓度的咪唑有不同的结合能力，所以用含8M尿素且有如下咪唑浓度的Wash buffer洗脱杂蛋白，最后用含8M尿素且有如下咪唑浓度的Elute buffer洗脱，最终收集到目的蛋白。所述的洗脱液成分如下所述。
洗脱液成分
本发明得到的扣囊复膜孢酵母菌CB蛋白的C端带有6个组氨酸标签。
作为优选方案，所述的免疫动物为新西兰兔。
作为优选方案，所述纯化为蛋白A亲和纯化。
作为优选方案，本发明还包括利用ELISA和Western Blot方法，对制备得到的抗扣囊复膜孢酵母菌CB抗原的多克隆抗体进行鉴定。
本发明制备的多克隆抗体具有特异性好、纯度及效价高以及能长期保存等突出优点，可用于免疫印迹和免疫组化分析的相关领域中。
附图说明
序列表SEQ ID NO:1是扣囊复膜孢酵母菌CB抗原目的基因的部分核苷酸序列(1-2577bp)，同时该片段也是扣囊复膜孢酵母菌CB抗原目的基因对应编码的氨基酸序列(即CDS区，1-2577bp)，编码859个氨基酸序列。
序列表SEQ ID NO:2是扣囊复膜孢酵母菌CB抗原目的基因编码的蛋白质序列。
序列表SEQ ID NO:3是扣囊复膜孢酵母菌CB抗原目的基因含有较多抗原表位的核苷酸序列，序列长度为726bp(1-726bp)，也是该片段编码的氨基酸序列(1-726bp)；编码242个氨基酸序列。
序列表SEQ ID NO:4是扣囊复膜孢酵母菌CB抗原目的基因含有较多抗原表位的蛋白片段编码的蛋白质序列。
图1：是本发明的扣囊复膜孢酵母菌CB抗原目的基因的PCR扩增产物。附图标记说明：M：DNA分子量标准DL2000；泳道1-3：目的基因的PCR产物。
图2：重组菌的PCR鉴定结果。附图标记说明：M：DNA分子量标准DL2000；泳道1-6：重组菌液；泳道7：阴性对照。
图3：是pET-21a(+)-BGL1重组质粒的双酶切鉴定。附图标记说明：M：DNA分子量标准DL2000；泳道1-3：pET-21a(+)-BGL1重组质粒；方框标注的基因为目的基因。
图4：利用ZYP-5052自诱导培养基诱导扣囊复膜孢酵母菌CB蛋白的表达。附图标记说明：M：蛋白分子标记；泳道1：诱导前菌体总蛋白；泳道2：诱导后菌体总蛋白。箭头所指为目的蛋白位置。
图5：重组表达载体pET-21a(+)-BGL1表达产物的可溶性分析图。其中图5A：网站预测表达蛋白疏水性，分值在零以下为疏水性，得分在零以上为亲水性。图5B：通过鉴定获得的目的蛋白表达形式的SDS-PAGE图谱；附图标记说明：泳道0：诱导前菌体总蛋白；M：蛋白分子标记；泳道1：诱导后的菌体总蛋白；泳道2：超声波破碎后的上清；泳道3：超声波破碎后的沉淀；箭头所指为目的蛋白位置。
图6：纯化后目的蛋白的SDS-PAGE图谱。附图标记说明：M：蛋白分子标记；泳道1：诱导前的菌体总蛋白；泳道2、3：诱导后的菌体总蛋白；泳道4、5：穿透液；泳道6：纯化后的目的蛋白。
图7：多克隆抗体的效价测定结果。其中：图7A：第1只兔子的抗体效价测定结果；图7B：第2只兔子的抗体效价测定结果。
图8：制备的抗体与原核表达的扣囊复膜孢酵母菌CB蛋白的Western Blot图谱。附图标记说明：泳道1：抗体上样浓度为8ug/ml；泳道2：抗体上样浓度为4ug/ml；泳道3：抗体上样浓度为2ug/ml；泳道4：阳性血清；泳道5：阴性血清。其中每孔蛋白上样量为0.016ug，阳性及阴性血清稀释体积比为1:1500。
图9：是公开号CN 103421793A专利文献报道的pTTRs-BGLhis-contro质粒的图谱。
图10：是pET-21a(+)质粒图谱(空载体)。
图11：是本发明制备的重组表达载体pET-21a(+)-BGL1的图谱。
图12：是重组表达载体pET-21a(+)-BGL1的构建流程图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中及附图，对本发明的技术方案进行进行进一步描述，显然，所述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明的保护范围。
实施例1：大肠杆菌重组表达载体pET--21a(+)--BGL1与重组菌的构建与鉴定
对扣囊复膜孢酵母菌CB蛋白(GeneBank登录号：HQ891006.1)序列进行抗原表位分析与预测，该段氨基酸序列由2577bp的核苷酸序列(如序列表SEQ ID NO：1所示)编码表达859个氨基酸(如序列表SEQ ID NO：2所示)，经预测分析最终获得到含有较多抗原表位的蛋白片段，编码242个氨基酸(如序列表SEQ ID NO：4所示)，由SEQ ID NO：3所示的726bp的核苷酸序列表达产生。
1.1部分BGL1基因的克隆
1.1.1引物设计：
利用Primer5.0软件，参考BGL1基因序列(GeneBank登录号：HQ891006.1)由宝生物工程大连有限公司合成引物。在上游引物的5’端加入EcoRI酶切位点及CCG保护碱基，在下游引物5’端加入了XhoI酶切位点及CCG保护碱基，引物的具体序列如下所示：
F:CCGGAATTCGGTGACAGATCCGGGACTGCT(下划线部分为EcoRⅠ位点)；
R:CCGCTCGAGTCTCAAAAGCTCAAACTCAAC(下划线部分XhoⅠ位点)。
合成后，以适量的去离子水溶解，使其终浓度为10uM，于-20℃保存备用。
1.1.2PCR扩增SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列
以申请人所在实验室保存的含有2577bp BGL1基因CDS序列的pTTRs-BGLhis-control质粒(质粒构建方法参见公开号CN 103421793A专利文献，该pTTRs-BGLhis-contro质粒图见9所示)为模板，利用上述引物扩增。
PCR反应体系(总反应体系为50uL)：
模板1uL,上下游引物(10uM)各1uL,2×Mix 25uL，用ddH2O补至50uL。
PCR反应条件为：95℃预变性3min；95℃变性30s；60℃退火45s；72℃延伸1min；35个循环；最后72℃延伸10min；25℃保温。
PCR产物采用1.2％琼脂糖进行凝胶电泳进行鉴定，结果如图1所示，所得亮带与预期结果相符合。
1.2重组表达载体pET-21a(+)-BGL1及重组菌株的构建及鉴定
PCR产物采用OMEGA公司Plasmid Mini KitⅠ胶回收试剂盒回收PCR产物，具体方法参考该试剂盒的说明书。回收后的PCR产物用EcoRI和XhoI进行双酶切后通过T4连接酶连接到经同样双酶切的pET-21a(+)表达载体(来源：购自Merck Millipore.Novagen公司，pET-21a(+)表达载体图谱见图10)中，在16℃水浴条件下连接过夜，构建pET-21a(+)-BGL1重组表达载体。将重组表达载体转化到大肠杆菌菌株DH5α中，在LB固体平板(含50ug/ml氨苄)上37℃培养12到16h，共挑取6个菌落，筛选重组子。经菌落PCR鉴定正确后(见图2)，再通过DNA测序验证序列的正确性。测序结果表明，所获得的本段BGL1CDS序列与GeneBank上的该段序列为100％同源。申请人将构建的重组表达载体命名为pET-21a(+)-BGL1(重组表达载体图谱见图11，其构建流程见图12)。
实施例2：重组表达载体pET--21a(+)--BGL1在大肠杆菌BL21中的表达
2.1重组质粒的提取与鉴定
将要进行质粒提取的菌液和LB培养基(含Amp 50ug/ml)的以体积比为1:1000进行扩大培养，37℃，220r/min摇晃培养12-15h。将测序正确的菌液参考TIANGEN公司质粒小提试剂盒进行质粒提取，具体方法参照试剂盒说明书，对提取出的质粒采用EcoRI和XhoI双酶切1h后，经1％的琼脂糖凝胶电泳鉴定(见图3)。电泳结果显示切出与预期结果相符的条带。
2.2重组质粒pET-21a(+)-BGL1的诱导表达
将测序正确的重组表达载体转化BL21感受态细胞，挑取单克隆接种至3ml P-0.5G培养基中(见表1)，在摇床中37℃250rpm培养8h；将培养菌液按体积比为1：1000转接至1000ml ZYP-5052自诱导培养基(见表1)中进行诱导蛋白表达，于摇床中37℃250rpm培养过夜；次日，收集1ml培养菌液6000rpm离心5min，弃上清，收集菌体，用10ul 5×蛋白上样缓冲液(购自湖北晶茂生物技术有限公司)重悬菌体至终浓度为1×，100℃水浴加热5min使蛋白质变性，置于冰上冷却后，取5ul进行SDS-PAGE凝胶电泳。如图4所示，实验结果表明：经ZYP-5052自诱导培养基能够自动诱导扣囊复膜孢酵母菌CB蛋白表达。
表1本发明的P--0..5G和ZYP--5052培养基的配方
2.3重组质粒pET-21a(+)-BGL1表达产物的可溶性分析
用以下网站进行疏水性分析：http://web.expasy.org/protscale/所得结果如图5所示，分值在零以下代表疏水，零以上为亲水，初步判断该表达产物不溶于水，是以包涵体形式存在。为进一步验证，取诱导后的培养菌液，6000rpm离心5min，弃上清，收集菌体，加入裂解液重悬菌体，重悬后的菌液于冰上超声波破碎(600w，运行5s间隔10s，约25次)至半透明，13000rpm 4℃离心15min，收集上清和沉淀(包涵体)后进行SDS-PAGE电泳，经过考马斯亮蓝染色、脱色后经凝胶成像系统分析。
结果如图5所示，表明CB蛋白主要以包涵体的形式表达。
实施例3：扣囊复膜孢酵母菌CB蛋白的大量表达及纯化
3.1CB蛋白大量表达，具体操作步骤如下：
(1)将测序正确的质粒转化BL21感受态细胞，挑取单克隆接种至3ml P-0.5G培养基中，37℃250rpm培养8h；
(2)将培养菌液按体积比为1：1000转接至1000ml ZYP-5052培养基中，37℃250rpm培养过夜；
(3)6000rpm离心5min，弃上清，收集菌体；
(4)加入30-50ml裂解液重悬菌体，重悬后的菌液于冰上超声波破碎(600w，运行5s间隔10s，约25次)至半透明；
(5)13000rpm 4℃离心15min，收集上清和沉淀(包涵体)，将包涵体用含8M尿素的bindingbuffer室温搅拌溶解，于冰上超声波破碎(500w，运行5s间隔10s，约10次)至半透明；13000rpm 4℃离心15min，收集上清液进行纯化。
3.2CB蛋白的包涵体纯化与收集
本发明中所用的表达载体pET21a(+)中含有一个编码多聚组氨酸的序列，即His-Tag，因此会获得带有His-Tag的重组目标蛋白。His-Tag可与金属Ni2+离子结合，从而有利于目标蛋白的纯化。
纯化的具体操作步骤如下：
(1)将2ml Ni-NTA Agarose加入到多聚色谱柱中，10倍柱床体积水、5倍柱床体积binding buffer(表2)先后洗涤树脂，将实施例3.1中得到的包涵体上清液用滤纸过滤后直接上Ni柱，流速控制在1ml/min；
(2)用含8M尿素的wash buffer(表2)洗脱杂蛋白，用考马斯亮蓝法检测蛋白质含量，洗至穿透液滴入考蓝不变蓝；
(3)用含8M尿素的elute buffer(表2)洗脱蛋白；将洗脱液滴入考马斯亮蓝中，如变蓝，开始收集蛋白，每收集1-2ml测一次，直到洗脱液滴入考蓝不变色，停止收样。洗脱的组分分别测定浓度和SDS-PAGE电泳检测蛋白纯度。
纯化结果如图6所示。纯化后得到扣囊复膜孢酵母菌CB蛋白8.5ml，其浓度0.92mg/ml，纯度为90％。可用于后续实验，免疫动物。
表2洗脱液成分表
实施例4：抗扣囊复膜孢酵母菌CB抗原的多克隆抗体的制备
4.1将制得的扣囊复膜孢酵母菌CB蛋白作为抗原按下面的免疫程序分别免疫两只新西兰兔，具体操作步骤如下：
(1)免疫前采血2ml，收集血清作为阴性血清；
(2)首免：将扣囊复膜孢酵母菌CB蛋白抗原与弗氏完全佐剂等体积混合，抗原量为200ug，分别免疫2只新西兰兔；
(3)二免：2周后，同首免，用相同的免疫剂量与免疫方法再次免疫；
(4)三免：4周后，将扣囊复膜孢酵母菌CB蛋白抗原与弗氏不完全佐剂等体积混合，抗原量为100ug，分别免疫2只新西兰兔；
(5)取血检测：
第一次：第34天，采血10ml，做ELISA检测；
第二次：第36天，采血10ml，做ELISA检测。
(6)四免：6周后，同三免；
(7)五免：8周后，同三免；
(8)取血检测：
第三次：第58天，采血10ml，做ELISA检测；
第四次：第60天，采血10ml，做ELISA检测；
第五次：第69天，每只新西兰兔放血，收集30-50ml阳性血。
4.2效价的测定
经过3次免疫后，两只新西兰兔各采血10ml，用间接ELISA法检测血清中的抗体效价。
4.2.1溶液准备：
包被液：50mM Na2CO3(pH9.6)，20mMTris-HCl(pH8.5)或10mM PBS(pH7.4)；封闭液：一般封闭用牛血清白蛋白(BSA)、脱脂奶粉、酪蛋白或明胶等；
洗涤液：常用的PBST或纯水
4.2.2实验操作步骤如下：
(1)将抗原以1ug/ml的浓度溶解于包被液中；
(2)在对应的孔中加入100μl抗原，4℃过夜；
(3)倒空液体并拍干残留液体，洗涤液冲洗3次；
(4)每孔加200μl封闭液，37℃孵育1h；
(5)倒空液体并拍干残留液体，用洗涤液冲洗3次；
(6)每孔加100μl稀释后的抗扣囊复膜孢酵母菌多克隆抗体，37℃孵育1h；
(7)倒空液体并拍干残留液体，用洗涤液冲洗3次；
(8)每孔加100μl加辣根过氧化物酶标记的二抗，37℃孵育1h；
(9)倒空液体并拍干残留液体，用洗涤液冲洗5次；
(10)拍干孔中残留液体，每孔加100μl显色液，37℃避光显色10min；
(11)每孔加50μl 2M H2SO4终止显色，并立即读取450nm OD值。
抗体效价定义为稀释后的抗血清在OD450nm吸光度大于免疫前(阴性对照)血清2.1倍时的最高稀释倍数。
两只新西兰兔ELISA检测结果如图7所示，血清ELISA检测结果均转阳(血清在1：4000稀释时，OD450值>1.0)。其中，第一只新西兰兔在抗血清稀释比例为1:32000时的ELISA检测结果为0.603，而阴性血清的ELISA检测结果仅为0.055，远高于阴性值的2.1倍；第二只新西兰兔在抗血清稀释比例为1:32000时的ELISA检测结果为0.673，阴性血清的ELISA检测结果为0.069，也远高于阴性检测值的2.1倍。从结果可以看出，该抗体效价较高。
4.3抗血清的纯化
当血清效价达到最高时，用颈动脉放血的方法大量采血，分离抗血清。进行蛋白A亲和纯化，具体操作步骤为：
(1)取适量proA填料，PBS平衡10个柱床体积；
(2)血清上样，流速1ml/min；或填料与血清过夜孵育；
(3)重复上样一次；
(4)PBS平衡10个柱床体积；
(5)Ph2.5甘氨酸洗脱抗体，蛋白检测仪进行监测；
(6)2MTris溶液中和抗体；
(7)PBS中透析抗体、浓缩，测定最终所得抗体的浓度浓度并再次进行ELISA检测，结果如表3所示。
表3抗体的亲和纯化及ELISA检测结果
结果显示，最终获得的抗体ELISA检测为阳性，且效价较高。
实施例5：抗体的Wsetern Blot检测
5.1溶液准备
转印缓冲液：0.025M Tris base，0.187M甘氨酸，25％甲醇
1×TBST：25mM Tris-HCl(pH 8.0)，0.2M NaCl，0.1％Tween 20
封闭液：1×TBST，3％脱脂奶粉
洗涤液：1×TBST
5.2具体操作步骤：
1.PVDF膜的转印：
(1)将蛋白进行SDS-PAGE电泳，先80v，30min后120v 90min；
(2)PVDF膜在甲醇中浸泡约30秒左右和滤纸浸泡在转印缓冲液预湿；
(3)半干法转染到PVDF膜上，15v，80min；
(4)用氨基黑染色5min，再用甲醇褪去背景色，观察条带。
2.膜的准备：
根据所需的膜大小，将需要的转印后的PVDF膜浸在甲醇中活化，室温条件下在摇床上摇1min，去除甲醇用纯水洗两遍和TBST洗三遍，清洗后，3％脱脂奶粉室温封闭2h。
3.抗体检测：
(1)将一抗24μg、12μg、6μg纯化抗体以及1.5μl阳性和阴性血清分别溶解于3ml封闭液中，加入封闭好的膜条，4℃孵育过夜；
(2)用洗涤液洗涤3次，每次5min；
(3)用封闭液来稀释二抗(HRP标记的羊抗兔二抗)，室温下孵育2h；
(4)用洗涤液洗涤3次，每次5min；
(5)化学检测法，按照Thermo公司的SuperSignal West Piro Trial试剂盒说明书进行操作，暗室曝光，采集图像。
利用Wsetern Blot检测稀释不同浓度后的抗体，得到如图8所示的结果。检测结果显示所得到特异性的目的条带。

Claims (1)

1.一种原核表达的扣囊复膜孢酵母菌CB蛋白在制备一种抗扣囊复膜孢酵母菌β-葡萄糖苷酶抗原的多克隆抗体中的应用，其特征在于该扣囊复膜孢酵母菌CB蛋白的序列如SEQID NO：4所示，该扣囊复膜孢酵母菌CB蛋白的C端带有6个组氨酸标签；通过如下步骤制备得到CB蛋白：
(1)对如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的扣囊复膜孢酵母菌CB蛋白进行抗原表位的预测与分析；
(2)筛选得到一段抗原表位较多的片段，该片段的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示；
(3)克隆SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列，得到重组表达载体pET-21a(+)-BGL1；
(4)将重组表达载体pET-21a(+)-BGL1转化大肠杆菌DH5α，构建表达CB蛋白的重组菌株；
(5)对重组菌株进行诱导表达，并进行表达形式的检测；
(6)用镍柱亲和层析法对扣囊复膜孢酵母菌CB蛋白进行纯化，通过抗血清制备，进一步纯化得到多克隆抗体；
其中：
步骤(3)构建重组载体时，克隆扣囊复膜孢酵母菌BGL1基因的插入位点为EcoRI和XhoI酶切位点；
步骤(3)中，构建重组载体所用的引物序列如下所示：
正向引物F：CCGGAATTCGGTGACAGATCCGGGACTGCT，
反向引物R：CCGCTCGAGTCTCAAAAGCTCAAACTCAAC；
步骤(5)中对重组菌株进行诱导，采用自诱导培养基诱导蛋白的表达，该自诱导培养基的成分为：酵母提取物0.5％；Na2HPO4 50mM；KH2PO4 50mM；(NH4)2SO4 25mM；MgSO4 2mM；甘油0.5％；葡萄糖0.05％；乳糖0.2％。
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