KR20180124584A

KR20180124584A - 재조합 n 단백질에 대한 단클론항체를 이용한 아까바네바이러스 블러킹 효소결합면역측정법

Info

Publication number: KR20180124584A
Application number: KR1020170059370A
Authority: KR
Inventors: 김연희; 이경기; 엄재구; 김성희; 이은용; 소병재; 장상호; 이은선; 정광면
Original assignee: 대한민국(농림축산식품부 농림축산검역본부장); 주식회사 메디안디노스틱
Priority date: 2017-05-12
Filing date: 2017-05-12
Publication date: 2018-11-21
Also published as: KR102086089B1

Abstract

본 발명은 아까바네 바이러스의 재조합 N 단백질에 대한 단클론항체 5B56을 생산함을 특징으로 특징으로 하는 하이브리도마 세포주 KCTC18469P, 상기 세포주로부터 생산되는 단클론항체 5B56, 상기 단클론항체를 포함하는 진단용키트, 상기 단클론항체와 검사대상 시료를 반응시켜 항원-항체 결합한 검출표지 수준을 측정하는 아까바네바이러스 감염 진단 방법 관한 것이다. 본 발명에 따른 아까바네바이러스 병의 진단방법에서 이용하는 아까바네바이러스 N 재조합단백질에 대한 단클론항체를 이용하는 경우, N 재조합단백질 항원에 대한 결합능력이 우수하고 지속적인 생산이 가능하여 검출 민감도 및 특이도가 우수한 바, 종래의 혈청검사 방법보다 더 신속하게 대량으로 바이러스항체를 진단할 수 있으므로 동물의 질병 모니터링에 매우 용이하여, 효과적인 아까바네바이러스 병의 진단방법 및 진단키트로 유용하게 사용될 수 있다. 또한, 진단키트 제작에 국내 분리 아까바네바이러스 항원을 사용함으로써, 우리나라에서 유행하는 바이러스 감염항체를 좀 더 민감하게 검출 할 수 있다.

Description

재조합 N 단백질에 대한 단클론항체를 이용한 아까바네바이러스 블러킹 효소결합면역측정법{Akabane viruses blocking ELISA using monoclonal antibodies against recombinant N protein}

본 발명은 아까바네 바이러스의 재조합 N 단백질에 대한 단클론항체 5B56을 생산함을 특징으로 하는 하이브리도마 세포주 KCTC18469P, 상기 세포주로부터 생산되는 단클론항체 5B56, 상기 단클론항체를 포함하는 진단용키트, 상기 단클론항체와 검사대상 시료를 반응시켜 항원-항체 결합한 검출표지 수준을 측정하는 아까바네바이러스 감염 진단 방법에 관한 것이다.

아보바이러스는 모기, 등애모기, 진드기와 같이 흡혈하는 매개곤충에 의해 질병이 전파되는 바이러스를 의미하며, 소에서 질병을 유발하는 아보바이러스 종류에는 소 아까바네병, 아이노바이러스감염증, 츄잔병, 이바라끼병 등이 있으며 국내에서는 아까바네바이러스에 의한 피해가 가장 심각한 것으로 알려져 있다. 아까바네병은 아까바네바이러스(akabane virus)에 의하여 감염되는 소의 질병으로 소, 면양, 산양의 임신기간 동안에 감염하여 태아의 유사산 및 선천성의 관절만곡증과 뇌수두증을 동반한 이상자우의 분만을 유발하며, 감염모우는 불현성 감염이지만 바이러스는 수직전파에 의해 이행되는 질병이다. 이 질병은 유사산을 일으켜 경제적으로 큰 피해를 입힐 수 있어 세계동물보건기구(OIE)에서 동물의 수·출입시 고려해야할 중요질병 리스트에 있으며, 국내 가축전염병예방법상 제3종 가축전염병으로 분류되어있는 전염병이다. 지구 온난화 등으로 매개성질병에 대한 발생위험이 높아짐에 따라 질병 발생이 의심될 경우 신속한 진단을 통해 방역조치가 수행되어야만 이 질병으로 인한 축산업의 경제적 피해를 최소화할 수 있다.

아까바네바이러스는 바이러스 분류학상 Bunyaviridae과에 속하는 Orthobunyavirus 속의 바이러스이다. 아까바네바이러스는 직경 약 90~100nm의 구형입자로 유전자는 3분절의 negative single-stranded RNA 게놈 (L: Large, M: Medium, S: Small RNA)으로 되어 있다. L RNA가 RNA 폴리머라아제를, M RNA가 바이러스 표면당단백질 Gn(G2), Gc(G1)과 바이러스 비구조단백질 NSm을, S RNA가 핵단백질 N과 바이러스 비구조단백질 Nss를 코드한다. 아까바네바이러스는 감염동물로부터 아까바네바이러스 항원을 검출하는 방법(항원검사법)과 감염동물에서 감염으로 인하여 생성되는 면역산물인 아까바네바이러스 항체를 검사하는 방법(항체검사법) 등 크게 두 가지 방법에 의하여 진단이 이루어진다.

항체검사를 위한 혈청학적 검사법으로는 바이러스 중화시험법, 효소면역측정법 등이 이용되고 있다. 중화시험의 경우 혈청에 존재하는 아까바네바이러스에 대한 특이항체를 세포배양법을 이용하여 바이러스항원과 반응시켜 항체가를 측정하는 방법으로 세포 및 바이러스를 직접 이용해야 하므로 무균대, 이산화탄소배양기와 같은 실험실의 특수장비가 필요하며, 세포 배양에 숙련된 인력과 배양시간이 최소 3-7일의 시간이 소요되고 신속한 진단의 어려움이 있는 것과는 달리, 효소면역측정법(ELISA)에 의한 진단은 분광광도계의 실험장비가 있는 실험실에서 손쉽게 수행 가능하며, 우군의 대량 모니터링 검사방법으로 빠른 시일내에 대량의 시료를 처리하고 결과를 확인할 수 있는 장점이 있어 국내 분리주를 이용한 아까바네바이러스 항체검출을 위한 효소결합면역측정법(ELISA)의 개발 및 적용이 필요하다.

이에, 본 발명자들은 기존 진단법보다 안전하면서 신속하게 아까바네바이러스 병을 진단할 필요성을 느끼게 되어 N 단백질에 대한 단클론항체를 이용하여 진단시간을 단축시킬 수 있는 블러킹 효소면역측정법을 연구하였고, 그 결과 아까바네바이러스 항원을 불활화하여 코팅하고 검사시료혈청을 반응시킨 후 효소가 접합된 N 단백질에 대한 단클론항체를 첨가하여 발색여부에 따라 아까바네바이러스 항체를 검출할 수 있는 효소면역측정법을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 아까바네바이러스의 재조합 N 단백질에 대한 단클론항체를 생산하는 하이브리도마, 그로부터 생산된 단클론항체 및 이를 이용한 블러킹 효소면역측정법을 이용한 아까바네바이러스의 감염 진단 방법, 진단시료 및 진단용 키트를 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 아까바네바이러스의 재조합 N 단백질에 대한 단클론항체 5B56를 생산함을 특징으로 하는 하이브리도마 세포주 KCTC18469P와 이로부터 생산된 단클론항체 5B56를 제공한다.

또한 본 발명은 단클론항체 5B56을 포함하는 것을 특징으로 하는 아까바네바이러스 감염 진단 시약을 제공한다.

또한 본 발명은 단클론항체 5B56을 포함하는 아까바네바이러스 감염 진단용 키트를 제공한다.

또한 본 발명은 검사대상시료 및 검출표지가 결합된 단클론항체를 고체상 지지체에 고정된 진단용 항원과 반응시키는 단계; 및 상기 진단용 항원에 항원-항체 결합한 단클론항체의 검출표지의 수준을 측정하는 단계;를 포함하고, 상기 단클론항체는 하이브리도마 세포주 KCTC18469P로부터 생산되는 단클론항체인 것을 특징으로 하는 아까바네바이러스 감염 진단 방법을 제공한다.

본 발명의 아까바네바이러스 N 재조합단백질에 대한 단클론항체를 이용하는 경우, N 재조합단백질 항원에 대한 결합능력이 우수하고 지속적인 생산이 가능하여 검출 민감도 및 특이도가 우수한 바, 종래의 혈청검사 방법보다 더 신속하게 대량으로 바이러스 항체를 진단할 수 있으므로 동물의 질병 모니터링에 매우 용이하여, 효과적인 아까바네바이러스 병의 진단방법 및 진단키트로 유용하게 사용될 수 있다. 또한, 진단키트 제작에 국내 분리 아까바네바이러스 항원을 사용함으로써, 우리나라에서 유행하는 바이러스 감염항체를 좀 더 민감하게 검출 할 수 있다.

도 1은 아까바네바이러스 N 재조합 단백질의 염기서열 및 아미노산 서열을 나타낸 도이다.
도 2는 아까바네바이러스 N 재조합 단백질 발현(A) 및 정제도(B)를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 아까바네바이러스 N 재조합 단백질에 대한 단클론항체들과 아까바네바이러스 정제항원과의 블러킹 정도를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 단클론항체 5B56과 아까바네바이러스 N 재조합단백질 및 아까바네바이러스 정제항원의 결합을 웨스턴 블롯을 이용하여 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 5는 아까바네바이러스에 관한 블러킹 ELISA 방법을 나타낸 도이다.
도 6는 블로킹 효소면역측정법의 cut-off 설정결과를 나타낸 도이다.

본 발명은 아까바네바이러스의 재조합 N 단백질에 대한 단클론항체 5B56를 생산함을 특징으로 하는 하이브리도마 세포주 KCTC18469P와 이로부터 생산된 단클론항체 5B56를 제공한다.

이하, 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.

상기 본 발명의 본 발명에 사용한 아까바네바이러스 N 단백질(AKAV N) 유전자는 93FMX strain의 S segment 부위의 일부로서, 93FMX strain은 유사산태아에서 분리된 국내분리주일 수 있다. 그 유전자 서열은 국제유전자은행(NCBI, Genbank) 등록번호 제 FJ498797.1호로 등록된 것이다. 상기 아까바네바이러스 N 재조합단백질은 아까바네바이러스 N 단백질 유전자 부위를 pBAD_HisA vector에 PCR 클로닝하여 생산한 대장균 재조합 단백질일 수 있다.

본 발명의 아까바네바이러스의 재조합 N 단백질 항원은 서열번호 3으로 표시되는 염기서열에 의해 암호화된 것을 특징으로 할 수 있다. 또한 이는 바람직하게는 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 및 상기 폴리펩티드의 기능적 동등물을 포함한다. 상기 "기능적 동등물"이란 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 상기 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 4로 표시되는 단백질과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 폴리펩티드를 말한다.

본 발명의 서열번호 4의 폴리펩티드는 이의 천연형 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드뿐만 아니라 이의 아미노산 서열 변이체가 또한 본 발명의 범위에 포함된다. 서열번호 4의 폴리펩티드의 변이체란 서열번호 4의 폴리펩티드 천연 아미노산 서열과 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합에 의하여 상이한 서열을 가지는 폴리펩티드을 의미한다. 분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질 및 펩티드에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다(H.Neurath, R.L.Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979). 가장 통상적으로 일어나는 교환은 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly 간의 교환이다. 경우에 따라서는 인산화(phosphorylation), 황화(sulfation), 아세틸화(acetylation), 당화(glycosylation), 메틸화(methylation), 파렌실화(farnesylation) 등으로 수식(modification)될 수도 있다.

상기 N 단백질은 숙주세포내에서 뉴클레오캡시드를 구성하는 주된 단백질로서, 감염세포에서 바이러스 구조 단백질 중 가장 많이 생산되기 때문에 강한 체액성 및 세포성 면역반응을 유발할 수 있으며, 이로 인해 효소결합면역측정법에서 질병 진단을 위한 항원으로서 적절하게 이용할 수 있다.

상기 클로닝에는 대장균, 슈도모나스, 바실러스, 스트렙토마이세스, 효모와 같은 주지의 진핵 및 원핵 숙주들, 스포도프테라 프루기페르다와 같은 곤충 세포를 이용하는 발현시스템을 사용할 수 있다. 또한, 아데노바이러스와 같은 바이러스를 이용하는 발현시스템을 사용할 수도 있다.

본 발명의 한 양태로서, 본 발명에서는 대장균 발현시스템을 이용하여 아까바네바이러스의 N 단백질을 생산하였다. 본 발명의 대장균벡터(이하 pBAD/AKAVN 이라 약칭함)는 게놈내에 아까바네바이러스의 N 단백질 유전자를 함유하고 있으며, 본 발명의 진단방법에 사용되는 단클론항체를 생산하기 위하여 사용됨을 특징으로 한다. 또한, 상기에 의해 발현된 단백질 항원은 6개의 히스티딘(Histidine)을 융합시킨 형태의 재조합 N 단백질을 생산하도록 작성함으로써 단백질 발현 확인 및 정제가 용이하다.

본 명세서에서 사용된 용어 '단클론항체'는 당해 분야에 공지된 용어로서 단일 항원성 부위에 대해서 고도의 특이적인 항체를 의미한다. 통상적으로, 상이한 에피토프에 대해 특이적인 상이한 항체들을 포함하는 다클론항체와는 달리 단클론항체는 항원상의 단일 에피토프에 대해 특이적으로 결합한다. 단클론항체는 항원-항체 결합을 이용하는 진단 및 분석 방법의 선택성과 특이성을 개선시키는 장점이 있으며, 또한 융합 배양에 의해 합성되기 때문에 다른 면역글로불린에 의해 오염되지 않는 추가 장점을 갖는다.

또한 본 발명의 단클론항체는 서열번호 3으로 표시되는 염기서열에 의해 암호화된 것을 특징으로 하는 아까바네바이러스 N 단백질에 특이적으로 면역반응성을 나타낸다. 따라서 시료에 존재하는 아까바네바이러스를 용이하게 검출할 수 있다.

아까바네바이러스의 검출을 보다 용이하게 하기 위해 본 발명의 단클론항체에 검출표지물질을 결합할 수 있다. 이때 검출표지로는 항원-항체 결합반응 시의 조건, 검출대상시료의 상태, 검출의 가시화 방법 등에 따라 공지된 다양한 표지물질을 적용할 수 있다.

재조합단백질에 대한 단클론항체를 제작하기 위해 실험동물에 면역(immunization)을 실시하였다. 단클론항체 제조 방법을 간략히 설명하면 다음과 같다. 항원을 이용하여 동물에 부스팅시킨 후, 비장을 제거하고 비장세포를 추출하여 당해 분야에 공지된 방법으로 골수종세포와 융합시킨다. 항원으로써 아까바네바이러스 N 재조합 단백질을 0.5mg/ml 농도로 준비하고 재조합단백질 200ul와 Freund's Adjuvant(FA) 200ul를 혼합하여 Balb/C 마우스 복강에 2주 간격으로 1-3차 면역을 실시하였다. 퓨전 면역 검사를 위해 3차 면역 1주 후, 마우스 혈청을 이용하여 간접(indirect) ELISA 검사를 실시하였다. 최종 부스팅을 위해 재조합단백질 100ul를 복강으로 면역하고 4일 후 세포융합에 사용하였다.

본 발명은 아까바네바이러스의 재조합 N 단백질에 대한 단클론항체 5B56을 생산함을 특징으로 하는 하이브리도마 세포주 KCTC18469P에 관한 것이다.

상기 하이브리도마 세포는 당업계에 통상적인 방법(Kohler and Milstein, Nature 256: 495-497(1975); and Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1988)에 의해서 제조될 수 있고, 예를 들어 HAT 선택법 등을 이용하여 제조될 수 있다. 또한 N 단백질 항원에 대한 단클론항체를 생산하는 하이브리도마 세포들 중에서, N 단백질 항원에 대한 결합능력이 우수하고, 면역원성이 강한 N 단백질상의 에피토프(Epitope)에 반응하는 단클론항체 5B56을 생산하는 하이브리도마 세포를 선택하여 사용할 수 있다. 본 발명자들은 상기 하이브리도마 세포를 한국생물공학연구원 생물자원센터에 2016년 05월 26일자로 기탁하여 수탁번호 KCTC18469P를 부여받았다.

바이러스 불활화 방법은 당해분야에 공지된 방법으로 BEI 또는 포르말린을 이용하는 방법이 있을 수 있으며, 본 발명의 실시예에서는 바이러스 배양액에 최종농도 0.2%가 되도록 포르말린을 첨가한 후 37℃에서 24시간 동안 혼합 교반하여 불활화 시키는 단계를 포함할 수 있다.

본 발명의 단클론항체는 아까바네바이러스의 N 단백질에 특이적으로 면역반응성을 나타내어 아까바네바이러스를 용이하게 검출할 수 있으므로, 이를 바이러스 진단 시약의 항체로 적용하면 아까바네바이러스의 감염을 효과적으로 진단할 수 있는 시약이 될 수 있다. 본 발명의 아까바네바이러스 감염 진단 시약에는 항체의 활성 유지 및 항원-항체 결합을 확인하기 위한 보조물질 등 통상의 바이러스 검출용 항체 시약에 포함될 수 있는 첨가물이 더 포함될 수 있다.

상기 아까바네바이러스 감염 진단 키트는 아까바네바이러스 감염 진단 시약을 포함할 수 있다. 본 발명의 아까바네바이러스 감염 진단 키트에는 검사대상의 혈청을 채취 또는 진단 시약을 적용하기 위한 도구, 항원-항체 결합을 확인하기 위한 시약 또는 장치 등 항체를 사용하여 생물학적 시료로부터 바이러스의 존재유무를 확인하는 통상의 진단키트에 포함될 수 있는 도구, 장치 또는 시약이 더 포함될 수 있다.

본 발명의 아까바네바이러스 감염 진단용 키트는 바람직하게 블러킹 효소결합면역측정용일 수 있다.

본 발명의 진단방법에 있어서, '검사대상시료'는 바람직하게는 혈청일 수 있고, 상기 검사대상시료는 각종 반추류 등에서 분리된 것일 수 있으며, 바람직하게는 소, 염소 또는 양으로부터 분리된 것일 수 있다.

본 발명의 아까바네바이러스 감염 진단 방법은 항원에 대해 검사혈청과 진단용 항체가 경쟁적으로 반응하도록 한 다음 항원에 결합한 진단용 항체의 농도를 바탕으로 검사혈청 내에 아까바네바이러스에 대한 항체가 존재하는지의 여부를 확인하는 방법이다.

여기서, 검출표지가 결합된 단클론항체는 아까바네바이러스의 N단백질에 대한 단클론항체에 효소를 접합시킴으로써 제조할 수 있다. 상기 효소는 항원항체 복합체의 형성을 정성 또는 정량적으로 측정가능 하도록 하기 위한 표지물질로서, 예를 들면, 이에 한정되지는 않으나 β-글루쿠로니다제, β-D-글루코시다제, 우레아제, 퍼옥시다아제, 알칼라인 포스파타아제, 아세틸콜린에스터라아제, 글리코즈 옥시다아제, 헥소키나제, 말레이트 디하이드로게나아제, 글루코스-6-인산디하이드로게나아제, 인버타아제 등을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 퍼옥시다아제를 사용할 수 있다.

상기 단클론항체에 효소를 접합시키는 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 본 발명의 실시예에서는 본 발명의 단클론항체에 HRPO(horseradish peroxidase)를 공지된 Nakane 법으로 접합시켜 효소표지항체를 제조할 수 있다.

본 발명의 단클론항체는 재조합 N 단백질에 대한 항체, 바람직하게는 서열번호 3으로 표시되는 염기서열에 의해 암호화된 것을 특징으로 하는 것을 제공한다.

상기 언급한 단계에서 검사혈청 중의 아까바네바이러스 단백질에 대한 항체 수준의 측정법은 표지물질에 따라 달라질 수 있으며, 예를 들어, 표지물질이 효소인 경우 효소와 기질의 반응을 통한 발색반응의 흡광도를 측정 할 수 있다.

이하, 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1. 아까바네바이러스 N 단백질의 합성

본 발명에 사용한 아까바네바이러스 N 단백질(AKAV N) 유전자는 93FMX strain의 S segment 부위의 일부로서, 93FMX strain은 유사산태아에서 분리된 국내분리주를 이용하였다. 아까바네바이러스 N 단백질의 유전자를 증폭하기 위해서 아까바네바이러스 N 단백질(702bp)에 대하여 먼저 중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction; PCR)을 수행하였다.

서열번호 1의 포워드 프라이머(Forward primer), 서열번호 2의 리버스 프라이머(reverse primer)를 PCR 튜브에 첨가하여 94℃에서 3분간 처리한 후 94℃에서 30초, 55℃에서 30초, 72℃에서 1분을 1사이클로 하여 PCR 증폭기에서 35사이클 반복하여 PCR 증폭을 실시한 후 마지막으로 72℃에서 10분간 합성을 수행하였다.

상기 PCR에 사용된 프라이머 서열은 다음과 같다.

서열번호 1 (포워드 프라이머) : 5'-CGCCTCGAGATGGCAAATCAATTCATTTTCAAC-3`

서열번호 2 (리버스 프라이머) : 5'-CGCGAATTCTTAGATCTGGATACCAAATTGAGCCA-3`

상기에서 증폭된 N 단백질의 유전자 단편은 바로 pBAD_HisA 벡터(pBAD/AKAVN)에 클로닝하였다. 그 후 콜로니를 선별하여 인덕션하고, 이를 통해 얻어진 N 단백질을 sequencing 하여 염기서열을 확인하였다. 아까바네바이러스의 N 재조합단백질의 뉴클레오타이드 및 아미노산 서열은 도 1에 나타내었으며, 뉴클레오타이드를 서열번호 3으로, 아미노산 서열을 서열번호 4에 나타내었다.

실시예 2. 아까바네바이러스 재조합 단백질의 N 단백질 발현 및 정제

실시예 1을 통해 얻어진 유전자 단편을 대장균에 형질도입하여 soluble protein으로 다량 발현된 N 단백질을 분리하여 정제하기 위해 SDS-PAGE 실험을 수행하였다. 6개의 히스티딘을 융합시킨 재조합단백질에 대한 정제방법은 당업계에 공지된 방법을 사용하였다. 정제된 단백질의 크기를 알아보기 위한 실험에서 대장균 발현에는 형질전환 세포인 Top10 세포를 이용하였으며, 배양액 전체(total), 배양 상층액(sup.), 및 원심분리 후 펠렛(pellet)을 이용하여 재조합 N 단백질과의 대조로 비교하였다. 실험의 재현성을 위해서 콜로니를 2개(colony 1, colony 2)를 사용하여 실험하였고, 본 실험의 결과를 도 2A에 나타내었다.

또한, 추가적으로 정제방법에 따른 N 단백질의 정제도를 확인하기 위한 실험에서는 니켈 결합 레진에 단백질이 결합하는 특성을 이용하는 친화 크로마토그래피(affinity chromatography)를 사용하여 pH변화에 따라 회수가능한 방법으로 N 단백질을 정제하였으며, 이에 대한 실험결과를 재조합 N 단백질의 전체 세포용액(total lysate), 상층액(sup.), 컬럼을 통과한 용액(FT), 20mM 세척 후 컬럼을 통과한 용액(20), 40mM 세척 후 컬럼을 통과한 용액(40), 최종 추출 후 용액(E)로 표시하여, 도 2B에 나타내었다.

도 2A에서 확인한 바와 같이, 정제된 N 재조합단백질의 크기는 27kDa임을 확인하였다. 도 2B에서는 실험방법에 따른 N 재조합 단백질의 정제도를 확인할 수 있었으며, 친화 크로마토그래프의 용출법에 의해서 N 단백질의 정제가 가장 우수한 것을 확인하였다.

실시예 3. 아까바네바이러스 N 단백질에 대한 단클론항체를 생산하는 하이브리도마의 생산

단클론항체를 생산하기 위하여 실시예 2를 통해 정제 농축한 재조합 아까바네바이러스 N 단백질을 이용하여 실험동물에 면역을 실시하여 하이브리도마를 생산하였다. 항원으로써 아까바네바이러스 N 재조합 단백질을 0.5 mg/ml 농도로 준비하고 재조합단백질 200ul와 Freund's Adjuvant(FA) 200 ul를 혼합하여 Balb/C 마우스 복강에 2주 간격으로 1-3차 면역을 실시하였다. 퓨전 면역 검사를 위해 3차 면역 1주 후, 마우스 혈청을 이용하여 간접(indirect) ELISA 검사를 실시하였다. 최종 부스팅을 위해 재조합단백질 100 ul를 복강으로 면역하고 4일 후 세포융합에 사용하여 하이브리도마 세포주를 확립하였다. 상기 세포주를 대량배양하여 Balb/c 마우스 복강에 접종하여 항체가 다량 함유된 복수를 얻고 프로테인 A/G 겔(protein A/G gel)을 이용하여 IgG 항체를 정제하여 얻은 단클론항체 생산 세포주 및 이의 특성을 표 1로 나타내었다.

[표 1]

아까바네바이러스 N재조합단백질에 대한 단클론항체 특성확인

표 1에서 확인한 바와 같이, 아카바네바이러스 N 재조합단백질로 만든 단클론항체는 6종임을 확인하였다.

실시예 4. 블러킹 ELISA의 진단항체용 단클론항체 5B56의 선발

실시예 4-1. 아까바네바이러스 N 단백질과 단클론항체의 블러킹능의 확인

상기 실시예 3의 단클론항체들 중에서, 아까바네바이러스 재조합 N 단백질 정제항원과의 블러킹능을 확인하기 위하여 ELISA를 수행하였다. 아까바네바이러스 정체항원을 ELISA 플레이트에 코팅하고 희석버퍼(50ul)로 표준양성혈청 및 표준음성혈청시료 50ul을 각각 1:1로 희석하여 사용하였으며 1시간을 반응시켰다. 그 후 HRP접합된 단클론항체를 반응시킨 후에 세척하고 기질과 반응시켜 450nm에서 흡광도를 측정하였으며, 이를 도 3에 나타내었다.

도 3에서 확인한 바와 같이, 5B56, 1D4, 6E62 항체 (총 3개)만이 블러킹능이 우수하였다.

실시예 4-2. ELISA에 이용하기 위한 단클론항체의 선발

단클론항체들이 인식하는 아미노산 서열부위의 형태(conformational type 혹은 sequential type)를 결정하기 위하여 아까바네바이러스 N 재조합단백질을 사용하여 웨스턴블롯(western blotting)과 단클론항체를 선별하기 위해 blocking ELISA를 수행하였다. 웨스턴 블롯은 Invitrogen iBlot^® Gel transfer kit를 이용하여 PVDF 막에 전사하여 각각의 단클론항체를 1시간씩 반응하여 실시하였으며, 이에 대한 실험의 결과를 도 4에 나타내었다.

단클론항체 중 1D4 및 6E62 항체는 웨스턴블롯에서는 비특이적 반응으로 반응 결과가 나타나지 않았으며, 도 4에서 확인한 바와 같이, 실험 결과 아까바네바이러스와 블러킹능이 있는 3개의 단클론항체들 중 5B56 항체만이 웨스턴블롯에서 반응을 나타내었다. 그러므로 5B56 단클론항체는 sequential type의 항체이며, 나머지 1D4 및 6E62 단클론항체는 conformation type의 항체인 것을 확인하였다.

또한, 단클론항체를 선발하기 위해서 3종(5B56, 1D4, 6E62)의 단클론항체를 이용한 시제품을 제작하고 구축된 혈청패널인 양성 및 음성혈청시료를 이용하여 중화시험결과와 Blocking ELISA와의 비교실험 결과하였으며, 이에 대한 실험의 결과를 표 2에 나타내었다.

[표 2]

3종의 단클론항체를 이용한 Blocking ELISA 결과

표 2에서 나타낸 바와 같이, blocking ELISA의 비교실험 결과에서 다른 단클론항체보다 민감도와 특이도가 우수한 5B56 단클론항체를 선택하였다.

실시예 5. 아까바네바이러스 진단을 위한 블러킹 ELISA 방법 및 유효성 평가

실시예 5-1. 아까바네바이러스 진단을 위한 블러킹 ELISA 방법

선발된 단클론항체와 아까바네바이러스와의 블로킹 여부를 블로킹 ELISA 법을 이용하여 확인하였다. 바이러스 배양액에 최종농도 0.2%가 되도록 포르말린을 첨가한 후 37℃에서 24시간 동안 혼합 교반하여 불활화 시키는 단계를 포함한 불활화된 아까바네바이러스 정제 항원이 코팅된 플레이트에 음성 및 양성혈청을 0.1% PBST buffer에 1/2 희석 후 100ul씩 첨가한 다음 37℃에서 1시간 반응시켰다. 반응 후, 0.05% PBST buffer로 3회 세척하였다. 단클론항체 반응조건은 HRPO가 접합된 단클론항체를 플레이트에 100ul씩 분주해 37℃ 1시간 반응시킨 후 0.05% PBST buffer로 3회 세척하였다. 기질액(TMB)을 플레이트에 100ul씩 분주해 상온에서 10분 반응 후 정지액을 플레이트에 50ul씩 분주한 뒤 ELISA reader를 이용하여 450nm에서 흡광도를 측정하였다. 본 블러킹 ELISA 방법을 도 5로 나타내었다.

실시예 5-2. 아까바네바이러스 진단 블러킹 ELISA 키트의 Cut-off 값 설정

Blocking ELISA의 cut-off 설정을 위해 100개의 음성시료를 이용하여 PI(Percent inhibition)값을 구하였고, 아래의 계산식을 이용하여 설정하였으며, 본 실험의 결과를 도 6에 나타내었다. 다음과 같은 식을 통해 PI 값을 계산하였다.

PI= (1 - 시료의 O.D./단클론항체 O.D.)ｘ100

도 6에서 확인한 바와 같이, 평균값 + 3SD(표준편차)로 계산한 결과 35%를 Cut-off값으로 설정하였다.

실시예 5-3. 블러킹 ELISA의 유효성평가

블러킹 ELISA로 생산한 키트에 대한 민감도와 특이도를 알아보기 위해 유효성평가를 야외시료 207개를 이용하여 Blocking ELISA 방식으로 수행하였다. 비교군으로는 일본에서 생산하는 외산키트를 이용하였다. 실험실간, 실험자간 비교 실험을 실시하였으며, 3곳의 실험실, 3명의 실험자 ELISA간 비교실험시 양성, 음성혈청이 재현성 있게 나타났고, 유효성평가 결과 95% 신뢰 구간에서 ROC 값이 0.977 (P<0.0001)로 나타났으며, 이를 표 3에 나타내었다.

[표 3]

개발된 Blocking-ELISA와 외산 키트와의 비교평가

표 2에서 확인한 바와 같이, 외산키트 대비 대비 민감도 92.3%, 특이도 90.3%으로 확인되어 아까바네바이러스 병의 진단을 정확하고 신속하게 측정할 수 있음을 확인하였다.

한국생명공학연구원

KCTC18469P

20160526

<110> REPUBLIC OF KOREA(Animal and Plant Quarantine Agency) MEDIAN Diagnostics Inc. <120> Akabane viruses blocking ELISA using monoclonal antibodies against recombinant N protein <130> 1-82P <160> 4 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer of akabane virus recombinant N protein <400> 1 cgcctcgaga tggcaaatca attcattttc aac 33 <210> 2 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer of akabane virus recombinant N protein <400> 2 cgcgaattct tagatctgga taccaaattg agcca 35 <210> 3 <211> 702 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of Akabane virus recombinant N protein <400> 3 atggcaaatc aattcatttt caacgatgtt ccacaacgga atgcagctac atttaatccg 60 gatgcagggt atgtggcatt tatcagtaag tatgggcagc agctcaactt tactgttgct 120 agagtcttct tcctcaacca gaagaaggcc aagatggtct tacataagac accacaacca 180 agtgtcgatc ttacttttgc aggggtcaaa tttacagtgg ttaataacca ttttccccag 240 tacactgcaa atccagtgtc agacactgcc tttacgcttc accgcatctc gggctactta 300 gctcgctggg ttgctgagca gtgcaaggct aatcagatca aatttgcaga ggcagctgcc 360 acaattgtga tgccactggt tgaggtgaag ggttgcactt ggagtgacgg gtatgcaatg 420 tacctgggat ttgcccctgg tgctgagatg tttctggaaa cctttgagtt ttacccactg 480 gttatcgaca tgcaccgtgt gataaaggat ggaatggatg tcaacttcat gaggaaggtc 540 ttacgtcaga ggtatgggca gctgactgca gaagagtgga tgacatctaa gttggacgca 600 gtcaaggctg catttggctc agttgcccaa atatcctggg ctaaatctgg cttctcacct 660 gcagctagag ctttcctggc tcaatttggt atccagatct aa 702 <210> 4 <211> 233 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of Akabane virus recombinant N protein <400> 4 Met Ala Asn Gln Phe Ile Phe Asn Asp Val Pro Gln Arg Asn Ala Ala 1 5 10 15 Thr Phe Asn Pro Asp Ala Gly Tyr Val Ala Phe Ile Ser Lys Tyr Gly 20 25 30 Gln Gln Leu Asn Phe Thr Val Ala Arg Val Phe Phe Leu Asn Gln Lys 35 40 45 Lys Ala Lys Met Val Leu His Lys Thr Pro Gln Pro Ser Val Asp Leu 50 55 60 Thr Phe Ala Gly Val Lys Phe Thr Val Val Asn Asn His Phe Pro Gln 65 70 75 80 Tyr Thr Ala Asn Pro Val Ser Asp Thr Ala Phe Thr Leu His Arg Ile 85 90 95 Ser Gly Tyr Leu Ala Arg Trp Val Ala Glu Gln Cys Lys Ala Asn Gln 100 105 110 Ile Lys Phe Ala Glu Ala Ala Ala Thr Ile Val Met Pro Leu Val Glu 115 120 125 Val Lys Gly Cys Thr Trp Ser Asp Gly Tyr Ala Met Tyr Leu Gly Phe 130 135 140 Ala Pro Gly Ala Glu Met Phe Leu Glu Thr Phe Glu Phe Tyr Pro Leu 145 150 155 160 Val Ile Asp Met His Arg Val Ile Lys Asp Gly Met Asp Val Asn Phe 165 170 175 Met Arg Lys Val Leu Arg Gln Arg Tyr Gly Gln Leu Thr Ala Glu Glu 180 185 190 Trp Met Thr Ser Lys Leu Asp Ala Val Lys Ala Ala Phe Gly Ser Val 195 200 205 Ala Gln Ile Ser Trp Ala Lys Ser Gly Phe Ser Pro Ala Ala Arg Ala 210 215 220 Phe Leu Ala Gln Phe Gly Ile Gln Ile 225 230

Claims

아까바네바이러스의 재조합 N 단백질에 대한 단클론항체 5B56을 생산함을 특징으로 하는 하이브리도마 세포주 KCTC18469P.
제1항에 따른 하이브리도마 세포주로부터 생산되는 단클론항체 5B56.
제2항의 단클론항체 5B56을 포함하는 것을 특징으로 하는 아까바네바이러스 감염 진단 시약.
제2항의 단클론항체 5B56을 포함하는 아까바네바이러스 감염 진단용 키트.
제4항에 있어서, 상기 키트는 블러킹 효소결합면역측정용인 것을 특징으로 하는 아까바네바이러스 감염 진단용 키트.
검사대상시료 및 검출표지가 결합된 단클론항체를 고체상 지지체에 고정된 진단용 항원과 반응시키는 단계; 및
상기 진단용 항원에 항원-항체 결합한 단클론항체의 검출표지의 수준을 측정하는 단계;를 포함하고,
상기 단클론항체는 하이브리도마 세포주 KCTC18469P로부터 생산되는 단클론항체인 것을 특징으로 하는 아까바네바이러스 감염 진단 방법.
제6항에 있어서, 상기 단클론항체는 재조합 N 단백질에 대한 항체인 것을 특징으로 하는 아까바네바이러스 감염 진단 방법.
제7항에 있어서, 재조합 N 단백질은 서열번호 3으로 표시되는 염기서열에 의해 암호화된 것을 특징으로 하는 아까바네바이러스 감염 진단 방법.