KR101511619B1 - 개 인플루엔자 바이러스 h3n2의 ha1 단백질을 항원으로 포함하는 개 인플루엔자 바이러스 h3n2에 특이적인 혈청 진단용 키트 - Google Patents

개 인플루엔자 바이러스 h3n2의 ha1 단백질을 항원으로 포함하는 개 인플루엔자 바이러스 h3n2에 특이적인 혈청 진단용 키트 Download PDF

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Abstract

본 발명은 개 인플루엔자 바이러스 (canine influenza virus, CIV) H3N2의 HA1 (hemagglutinin 1) 단백질을 항원으로 포함하는 개 인플루엔자 바이러스 H3N2에 특이적인 혈청 진단용 키트 및 진단 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 진단 키트는 기존의 진단 키트보다 높은 민감도 및 특이도를 가지고 있으며, 다량의 샘플로부터 간단한 공정을 통해 개 인플루엔자 바이러스 H3N2에 특이적인 혈청형을 진단할 수 있고, 특히 개 인플루엔자 바이러스 H3N2에 특이적인 중화항체를 확인할 수 있어 백신 연구 및 역학 조사 등에 다양하게 응용할 수 있다.

Description

개 인플루엔자 바이러스 H3N2의 HA1 단백질을 항원으로 포함하는 개 인플루엔자 바이러스 H3N2에 특이적인 혈청 진단용 키트 {Serodiagnosis kit for canine influenza virus H3N2 comprising HA1 protein of canine influenza virus H3N2 as antigen}
본 발명은 개 인플루엔자 바이러스(canine influenza virus, CIV) H3N2의 HA1 단백질을 항원으로 포함하는 개 인플루엔자 바이러스 H3N2에 특이적인 혈청 진단용 키트 및 진단 방법에 관한 것이다.
인플루엔자(Influenza)는 오르소믹소비리데(Orthomyxoviridae)의 인플루엔자 바이러스 타입 A (Infuenza virus type A)에 의해 유발되는 질병으로서, 사람, 돼지, 말, 조류 등에서 중요한 질병이다.
인플루엔자 바이러스의 혈청형은 두 가지 단백질 즉, 헤마글루티닌(Hemagglutinin) 및 뉴라미니다아제(Neuraminidase)의 종류에 따라 구분되며 H 혈청형과 N 혈청형이 있다. 조류 인플루엔자 바이러스는 H 혈청형이 16가지, N 혈청형이 9가지 종류가 있으며, 산술적으로 존재 가능한 조류 인플루엔자 바이러스의 혈청형은 144가지이다.
인플루엔자는 인수 공통 전염병으로서, 인플루엔자 바이러스는 변이성이 크며 한 종에서 다른 종으로 바로 전파될 수 있는 가능성을 가지고 있어, 고병원성 인플루엔자의 세계적인 전파를 해결하는 일이 큰 과제로 떠오르고 있다.
한편, 최근 개 인플루엔자 바이러스가 새롭게 분리, 동정되었으며, 이러한 개 인플루엔자 바이러스는 급성 호흡기 질환을 야기하고, 심한 기침, 열, 비강의 분비물등의 임상 증상을 가진다고 알려졌다.
기존에는 개 인플루엔자 바이러스 (canine influenza virus) H3N2의 혈청학적 진단을 위해서 혈구응집억제(Hemagglutination inhibition, HI) 테스트가 이용되었다. 그러나 이 테스트는 비교적 저가인 반면, 시간이 많이 걸리는 분석 방법이고 대량으로 실시하기에는 어렵다는 문제점이 있었다(Skibbe et al., 2004). 또한, NP 단백질을 이용하여 조류 인플루엔자 A 바이러스 특이적인 항체를 검출하는 경쟁적 ELISA 시스템을 이용하기도 하였으나, 이 경우 개 인플루엔자 바이러스 H3N2에 의한 것인지, 다른 조류 인플루엔자 바이러스에 의한 것인지가 불분명한 문제점이 있었다. 현재까지 개 인플루엔자 바이러스 H3N2에 특이적인 혈청 진단을 위한 키트에 대해서는 개발된 바가 없다.
이에 본 발명자들은 개 인플루엔자 바이러스 H3N2에 특이적인 혈청 진단 방법을 개발하기 위해 노력한 결과, 개 인플루엔자 바이러스 H3N2의 HA1 단백질을 항원으로 이용한 간접 ELISA 시스템을 개발하고, 상기 시스템을 이용할 경우 높은 민감도 및 특이도를 가지고 다량의 샘플로부터 간단한 공정을 통해 개 인플루엔자 바이러스 H3N2에 특이적인 혈청형을 진단할 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 개 인플루엔자 바이러스(canine influenza virus, CIV) H3N2의 HA1 단백질을 항원으로 포함하는 개 인플루엔자 바이러스 H3N2에 특이적인 혈청 진단용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 개 인플루엔자 바이러스(canine influenza virus, CIV) H3N2의 HA1 단백질 항원을 이용한 개 인플루엔자 바이러스 H3N2에 특이적인 혈청 진단 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 개 인플루엔자 바이러스(canine influenza virus, CIV) H3N2의 HA1 단백질 항원을 이용한 개 인플루엔자 바이러스 H3N2에 특이적인 중화항체의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.
상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 개 인플루엔자 바이러스(canine influenza virus, CIV) H3N2의 HA1 단백질을 항원으로 포함하는 개 인플루엔자 바이러스 H3N2에 특이적인 혈청 진단용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 (a) 개 인플루엔자 바이러스(canine influenza virus, CIV) H3N2의 HA1 단백질 항원과 동물의 혈청 시료를 접촉시키는 단계; 및 (b) 상기 (a) 단계의 혈청 시료 중 상기 개 인플루엔자 바이러스 H3N2의 HA1 단백질 항원과 결합된 항체의 존재를 검출하는 단계;를 포함하는, 개 인플루엔자 바이러스 H3N2에 특이적인 혈청 진단 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 (a) 개 인플루엔자 바이러스(canine influenza virus, CIV) H3N2의 HA1 단백질 항원과 동물의 혈청 시료를 접촉시키는 단계; 및 (b) 상기 (a) 단계의 혈청 시료 중 상기 개 인플루엔자 바이러스 H3N2의 HA1 단백질 항원과 결합된 항체의 존재를 검출하는 단계;를 포함하는, 개 인플루엔자 바이러스 H3N2에 특이적인 중화항체의 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 진단 키트는 기존의 진단 키트보다 높은 민감도 및 특이도를 가지고 있으며, 다량의 샘플로부터 간단한 공정을 통해 개 인플루엔자 바이러스 H3N2에 특이적인 혈청형을 진단할 수 있고, 특히 개 인플루엔자 바이러스 H3N2에 특이적인 중화항체를 확인할 수 있어 백신 연구 및 역학 조사 등에 다양하게 응용할 수 있다.
도 1은 본 발명의 간접 ELISA와 HI 테스트의 ROS 커브 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 2는 HI 역가에 따라 희석한 혈청에서 본 발명의 간접 ELISA와 HI 테스트의 결과를 비교 분석하여 나타낸 도이다.
이하, 본 발명에 대하여 보다 상세히 설명한다.
본 발명은 개 인플루엔자 바이러스(canine influenza virus, CIV) H3N2의 HA1 단백질을 항원으로 포함하는 개 인플루엔자 바이러스 H3N2에 특이적인 혈청 진단용 키트를 제공한다.
상기 개 인플루엔자 바이러스 H3N2의 HA1 단백질은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있으며, 상기 단백질의 기능적 동등물을 포함한다. 상기 “기능적 동등물”이란 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과 상기 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 단백질과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 단백질을 말한다.
상기 개 인플루엔자 바이러스 H3N2의 HA1 단백질은 재조합 단백질일 수 있으며, 개 인플루엔자 바이러스 H3N2의 HA1 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 배큘로바이러스를 이용하여 곤충세포에서 생산되는 단백질일 수 있다.
본 발명의 키트는 진단 및 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액 또는 장치로 구성된다.
바람직하게는 본 발명의 키트는 효소면역측정법(ELISA)을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 것을 특징으로 하는 키트일 수 있다. 상기 ELISA 키트는 항원 단백질에 대한 특이적인 항체를 포함하며, 상기 단백질 수준을 측정하는 제제를 포함한다. 상기 ELISA 키트는 “항원-항체 복합체”를 형성한 항체를 검출할 수 있는 시약, 예를 들면 표지된 2차 항체, 발색단(chromopores), 효소(예:항체와 접합) 및 그의 기질을 포함할 수 있다. 또한, 정량 대조구 단백질에 특이적인 항체를 포함할 수 있다.
본 발명에서 "ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay)"란 항체에 효소를 결합시켜 항원-항체 반응을 확인하는 방법을 말한다. ELISA에는 항원을 검출하는 직접 ELISA와 항체를 검출하는 간접 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 표지된 또 다른 항체를 이용하는 직접적 샌드위치 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 또 다른 항체와 반응시킨 후 이 항체를 인지하는 표지된 2차 항체를 이용하는 간접적 샌드위치 ELISA 등이 있으나, 이에 제한되지 않으며, 본 발명의 일 실시예에서는 간접 ELISA를 이용하였다.
본 발명에 따른 진단 키트는 기존의 진단 키트보다 높은 민감도 및 특이도를 가지고 있으며, 다량의 샘플로부터 간단한 공정을 통해 개 인플루엔자 바이러스 H3N2에 특이적인 혈청형을 진단할 수 있고, 특히 개 인플루엔자 바이러스 H3N2에 특이적인 중화항체를 확인할 수 있어 백신 연구 및 역학 조사 등에 다양하게 응용할 수 있다.
또한, 본 발명은
(a) 개 인플루엔자 바이러스(canine influenza virus, CIV) H3N2의 HA1 단백질 항원과 동물의 혈청 시료를 접촉시키는 단계; 및
(b) 상기 (a) 단계의 혈청 시료 중 상기 개 인플루엔자 바이러스 H3N2의 HA1 단백질 항원과 결합된 항체의 존재를 검출하는 단계;를 포함하는, 개 인플루엔자 바이러스 H3N2에 특이적인 혈청 진단 방법을 제공한다.
상기 (a) 단계의 개 인플루엔자 바이러스 H3N2의 HA1 단백질은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있으며, 상기 단백질의 기능적 동등물을 포함한다.
상기 (b) 단계에서 항체의 검출 단계는 개 인플루엔자 바이러스 H3N2의 HA1 단백질 항원과 직접 결합하는 항체를 검출하는 방법 또는 상기 항체와 결합하는 2차 항체를 검출하는 방법 등을 포함하며, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은
(a) 개 인플루엔자 바이러스(canine influenza virus, CIV) H3N2의 HA1 단백질 항원과 동물의 혈청 시료를 접촉시키는 단계; 및
(b) 상기 (a) 단계의 혈청 시료 중 상기 개 인플루엔자 바이러스 H3N2의 HA1 단백질 항원과 결합된 항체의 존재를 검출하는 단계;를 포함하는, 개 인플루엔자 바이러스 H3N2에 특이적인 중화항체의 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 개 인플루엔자 바이러스 H3N2의 HA1 단백질은 바이러스 중화 활성에 관련되기 때문에, 상기 단백질과 결합하는 중화항체가를 측정함으로써, 개 인플루엔자 바이러스 H3N2에 대한 혈청 전환을 감시하고, 백신의 효과를 검증할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의거하여 보다 구체적으로 설명한다. 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예 1. pAcGP67A-cH3N2 HA1-6Xhis의 클로닝
바이오니아(Daejoen, South Korea)사에서 올리고뉴클레오티드를 합성하였다. 5’ 올리고뉴클레오티드 (5'-CAGGATCCCAATCTTCCAGGAAATGAAAATAA, 서열번호 2)는 BamHI 부위 및 개 인플루엔자 바이러스 H3N2의 HA1 단백질의 N-말단 아미노산 잔기를 코딩하는 염기서열을 포함하고 있으며, 3’ 올리고뉴클레오티드 (5'-CAGCGGCCGCTCAATGGTGATGGTGATGATGGGTTTGCCTCTCAGGGAC, 서열번호 3)는 NotI 부위, 종결 코돈, C-말단 6XHis tag 및 개 인플루엔자 바이러스 H3N2의 HA1 단백질의 C-말단 아미노산 잔기를 코딩하는 염기서열을 포함하고 있다.
상기 올리고뉴클레오티드를 이용하여, 종래 공지된 방법에 따라 PCR을 수행하여 개 인플루엔자 바이러스 H3N2의 HA1 단백질을 코딩하는 염기서열 부위를 증폭시켰다. PCR 산물은 QIAquick PCR purification kit (Qiagen)를 이용하여 정제하였으며, BamHI 및 NotI 제한효소로 절단한 후 동일한 키트로 재정제하였다. 그 후 정제된 PCR 산물을 BamHI-NotI로 절단한 pAcGP67A 벡터에 클로닝하였다. 최종 염기서열은 Macrogen (Seoul, South Korea)에서 확인하였다.
실시예 2. 재조합 배큘로바이러스의 분리
sf9 S. frugiperda 세포는 10% 소태아혈청(fetal bovine serum)을 포함하는 Sf-900 II SFM 배지에서 유지되었다. 상기 실시예 1에서 제조한 pAcGP67A-cH3N2 HA1 DNA (2 ug)를 0.5ug의 BaculoGold AcNPV DNA와 함께 2 x 106 Hi5 곤충 세포에 종래 공지된 방법에 따라 공-형질전환하였다. 형질전환 후 5일째 되는 날, 배지를 원심분리하고, 그 상층액을 Sf9 세포와 함께 한계 희석 어세이(limiting dilution assay)를 수행하였다. 2 x 106 Sf9 세포는 상층액의 10배 희석과 함께 6 웰 플레이트에서 배양하였다. 형질전환 후 8일째 되는 날, 상층액을 원심분리하고, 그 상층액을 Sf9 세포와 함께 한계 희석 어세이를 수행하였다. 2 x 106 Sf9 세포는 상층액의 10배 희석과 함께 T-75 플라스크에서 배양하였다. 상층액 내의 재조합 바이러스는 감염된 Sf9 세포에 의해 증폭되었다.
실시예 3. Sf9 세포 내의 개 H3N2 HA1 단백질의 분리
Sf-900 II SFM 배지내의 2 x 106 Hi5 세포는 교반용 플라스크에서 0.01-10 m.o.i의 재조합 배큘로바이러스로 감염되었다. 상층액을 3일간 배양한 후, 3000 g에서 10분간 원심분리하여 세포 잔해를 제거하였다. 상기 상층액을 Ni-NTA 레진(resin)에 로드한 후, 20 mM Tris-HCl (pH8.0), 0.5M NaCl 및 5 mM 이미다졸로 평형화하였다. 5 mM 이미다졸로 레진을 세척한 후, 250 mM 이미다졸로 단백질을 분리하였다. 분리된 단백질인 개 H3N2 HA1을 20 mM Tris-HCl (pH8.0) 및 10% 글리세롤로 투석하였다.
실시예 4. 항원 특이적인 항체를 확인하기 위한 간접 ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay) 제조
상기 실시예 3에서 제조한 개 H3N2 HA1 단백질을 항원으로 이용하여 이에 특이적인 항체를 확인하기 위한 간접 ELISA를 제조하였다. 먼저, ELISA 플레이트 (Greiner bio-one, Germany)를 차가운 탄산염 완충액 (carbonate buffer)내의 개 H3N2로부터 유래한 HA1 단백질 (50 ng/well)로 코팅한 후, 4°C에서 밤새 배양하였다. 항원이 존재하지 않는 탄산염 완충액 (Antigen-free carbonate buffer)은 엔드포인트 어세이를 위해 코팅되었다. 0.05% 트윈20을 포함하는 PBS (phosphate buffered saline, T-PBS)에 0.2% 스킴 밀크를 녹인 용액을 이용하여, 37 °C에서 1시간 동안 블락킹하였다. 상기 플레이트를 세척한 후, 100 배 희석한 개 혈청 샘플(serum diluent: 0.2% skim milk in T-PBS including 10 ug/ml of hi5 culture soup)을 항원이 코팅된 웰과 그렇지 않은 웰에 2회씩 처리한 후, 37 °C에서 90분간 배양하였다. 그 후, 양 항-개 IgG (sheep anti-dog IgG, 1:1,000)를 각 웰에 처리한 후, 같은 조건에서 동일하게 배양하였다. 상기 플레이트를 세척한 후, 항-양 IgG-HRP (anti-sheep IgG-HRP, 1:5,000)를 각 웰에 처리한 후, 60분간 배양하였다. 발색반응을 위하여, 100 ㎕의 산성 완충액에 녹인 TMB (3,3’,5,5’-tetra-methylbezidine)를 포함하고 있는 TMB 마이크로웰 퍼옥시다제 기질 (KPL; Gaithersburg, MD)을 각 웰에 처리한 후, 상온에서 5분간 배양하였다. 종결 반응을 위해, 동일한 부피의 제조사에서 추천하는 용액 (1N HCl)을 처리한 후, 30분 이내에 450 nm의 파장에서 흡광도를 측정하였다. 개 H3N2-HA1-특이적인 IgG 항체의 엔드포인트 역가는 항원인 HA1 단백질이 코팅된 웰의 OD값에서 항원이 코팅되지 않은 웰의 OD값을 빼서 계산하였다.
실시예 5. 간접 ELISA의 민감도 및 특이도 결정
5-1. HI 테스트
HI 테스트는 개 인플루엔자 바이러스 H3N2의 4HA 유닛을 이용하여, OIE 매뉴얼에 따라 수행되었다. 총 65개의 개 혈청이 간접 ELISA에 이용되었다. HI 역가가 10 이하일 때 음성 혈청(44 Experimental dogs’sera)으로 판단되었다. 양성 혈청은 16개였으며(160 ~ >1280 HI titers), 개 인플루엔자 H3N2바이러스에 대한 항-혈청 (anti-sera)은 5개였다(160 ~ 640 HI titers).
5-2. ROC 분석 및 컷-오프 값 결정
상기 실시예 3에서 제조한 본 발명의 간접 ELISA와 기존의 HI 테스트의 ROC 분석은 web-based ROC analysis tool (Eng, 2007)을 이용하여 수행되었다. 그 결과를 도 1에 나타내었다.
도 1에 나타낸 바와 같이, AUV (area under curve) 값은 0.993이었다.
컷 오프 값은 민감도(sensitivity) 및 특이도(specificity)의 최적 값이 수득될 때로 정하였으며, 상기 ROS 커브 분석 결과를 토대로, 컷 오프 값을 0.17로 할 때, 본 발명의 간접 ELISA 시스템의 민감도 및 특이도는 각각 95.7% 및 94.7%로 나타났다. 또한, 컷 오프 값을 0.36으로 할 때, 본 발명의 간접 ELISA 시스템의 민감도 및 특이도는 각각 93.5% 및 94.7%로 나타났다. 따라서, 본 발명의 간접 ELISA의 컷 오프 값은 보정된 OD 값이 0.17일 때로 정해졌다.
상기 컷 오프 값을 입증하기 위하여, 개 인플루엔자 바이러스 H3N2에 대한 항혈청을 순차적으로 희석하여 40, 80, 160 및 320 HI 역가가 되게 하였다. 희석된 개 혈청이 40, 80, 160 및 320의 HI 역가일 때, 상기 실시예 3에서 제조한 간접 ELISA를 수행한 결과를 도 2에 나타내었다.
도 2에 나타낸 바와 같이, 보정된 OD값이 0.17 보다 높게 나오는 것은 희석된 개 혈청이 160 HI 역가일 때부터로 확인되었다. 상기 결과에 따라, 본 발명의 간접 ELISA 시스템에서의 컷 오프 값은 HI 역가가 80~160 범위일 때와 밀접하게 관련되어 있음을 확인하였다.
실시예 6. HI 테스트, 경쟁적 ELISA 및 간접 ELISA의 비교 실험
개 H3N2, 계절성 H3N2 및 유행성 H1N1 인플루엔자 바이러스를 각각 개의 비강 내에 접종하고, 10일 후에 개의 혈청을 수득하였다. 수득된 혈청을 가지고 종래 HI 테스트, 상용화되고 있는 경쟁적 ELISA 및 상기 실시예 3에서 제조한 간접 ELISA 시스템을 이용하여 테스트하였다. 경쟁적 ELISA (Bionote LtD.)는 제조사의 매뉴얼에 따라 수행되었으며, 이는 NP 단백질을 이용하여 조류 인플루엔자 A 바이러스 특이적인 항체를 검출하는 형태이고, 결과값은 양성 또는 음성으로 나타났다(PI 값이 50 이상이면 양성). 그 결과를 표 1에 나타내었다.
혈청 정보 HI 테스트 경쟁적 ELISA 간접 ELISA
감염 바이러스 개체
Canine H3N2 U-45 320 + + (0.75)
U-46 <10 + + (0.36)
U-54 640 + + (0.74)
Seasonal H3N2 U-47 <10 + + (0.72)
U-52 <10 + - (0.00)
U-51 <10 + - (0.00)
Pandemic H1N1 U-48 <10 + - (0.04)
U-40 <10 + - (0.03)
U-59 <10 - - (0.01)
U-53 <10 - - (0.02)
상기 표 1에 나타낸 바와 같이, HI 테스트 결과, 개 인플루엔자 바이러스 H3N2를 감염시킨 후 10일 뒤에 수득된 개 혈청 샘플 3개중 2개가 양성으로 나타났으며, 각각 HI 역가가 320 및 640이었다. 반면, 경쟁적 ELISA 및 간접 ELISA 시스템에서는 모든 개 혈청 샘플은 양성으로 나타났다.
또한, 계절성 H3N2 및 유행성 H1N1로 감염된 개로부터 분리된 개 혈청의 경우, HI 테스트 결과, 모든 혈청의 HI 역가는 10 이하로 나타났다. 반면, 경쟁적 ELISA는 계절성 H3N2 및 유행성 H1N1에 대해 각각 3/3 및 2/4가 양성으로 확인되어, 상기 시스템은 교차 반응의 문제가 있음을 확인하였다. 또한, 본 발명의 간접 ELISA는 동일한 샘플에서 계절성 H3N2에 대해서는 1/3이 양성으로 확인되었으나, 유행성 H1N1에 대해 모두 음성으로 확인되어, 기존의 ELISA에 비해 교차 반응성에 대한 문제점이 개선된 것을 확인하였다.
따라서, 이상의 실험 결과를 통하여, 본 발명의 간접 ELISA 시스템은 민감도와 특이도가 우수하여, 개 인플루엔자 바이러스 H3N2에 특이적인 혈청 진단 및 중화항체 스크리닝에 이용할 수 있음을 확인하였다.
<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology Industry-Academic Cooperation Foundation, Yonsei University <120> Serodiagnosis kit for canine influenza virus H3N2 comprising HA1 protein of canine influenza virus H3N2 as antigen <130> 0014 <160> 3 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 327 <212> PRT <213> canine influenza virus <400> 1 Asn Leu Pro Gly Asn Glu Asn Asn Ala Ala Thr Leu Cys Leu Gly His 1 5 10 15 His Ala Val Pro Asn Gly Thr Ile Val Lys Thr Ile Thr Asp Asp Gln 20 25 30 Ile Glu Val Thr Asn Ala Thr Glu Leu Val Gln Asn Ser Ser Thr Gly 35 40 45 Lys Ile Cys Asn Asn Pro His Lys Ile Leu Asp Gly Arg Asp Cys Thr 50 55 60 Leu Ile Asp Ala Leu Leu Gly Asp Pro His Cys Asp Val Phe Gln Asn 65 70 75 80 Glu Thr Trp Asp Leu Phe Val Glu Arg Ser Asn Ala Phe Ser Asn Cys 85 90 95 Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Ser Leu Arg Ser Ile Val Ala 100 105 110 Ser Ser Gly Thr Leu Glu Phe Ile Thr Glu Gly Phe Thr Trp Ala Gly 115 120 125 Val Thr Gln Asn Gly Gly Ser Gly Ala Cys Lys Lys Gly Pro Ala Asn 130 135 140 Gly Phe Phe Ser Arg Leu Asn Trp Leu Thr Lys Ser Gly Asn Thr Tyr 145 150 155 160 Pro Val Leu Asn Val Thr Met Pro Asn Asn Asn Asn Phe Asp Lys Leu 165 170 175 Tyr Ile Trp Gly Val His His Pro Ser Thr Asn Gln Glu Gln Thr Ser 180 185 190 Leu Tyr Ile Gln Ala Ser Gly Arg Val Lys Val Ser Thr Arg Arg Ser 195 200 205 Gln Gln Thr Ile Ile Pro Asn Ile Gly Ser Arg Pro Leu Val Arg Gly 210 215 220 Gln Ser Gly Arg Ile Ser Val Tyr Trp Thr Ile Val Lys Pro Gly Asp 225 230 235 240 Val Leu Val Ile Asn Ser Asn Gly Asn Leu Ile Ala Pro Arg Gly Tyr 245 250 255 Phe Lys Met Arg Ile Gly Lys Ser Ser Ile Met Arg Ser Asp Ala Pro 260 265 270 Ile Asp Thr Cys Ile Ser Glu Cys Ile Thr Pro Asn Gly Ser Ile Pro 275 280 285 Asn Glu Lys Pro Phe Gln Asn Val Asn Lys Ile Thr Tyr Gly Ala Cys 290 295 300 Pro Lys Tyr Val Lys Gln Asn Thr Leu Lys Leu Ala Thr Gly Met Arg 305 310 315 320 Asn Val Pro Glu Arg Gln Thr 325 <210> 2 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> canine influenza virus F <400> 2 caggatccca atcttccagg aaatgaaaat aa 32 <210> 3 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> canine influenza virus R <400> 3 cagcggccgc tcaatggtga tggtgatgat gggtttgcct ctcagggac 49

Claims (8)

  1. 서열번호 1로 표시되는 아미노산으로 이루어진, 개 인플루엔자 바이러스(canine influenza virus, CIV) H3N2의 HA1 단백질을 항원으로 포함하는 개 인플루엔자 바이러스 H3N2에 특이적인 혈청 진단용 또는 중화항체 스크리닝용 키트.
  2. 삭제
  3. 제 1항에 있어서, 상기 키트는 효소면역측정법(Enzyme Linked Immunosorbent Assay, ELISA) 키트인 것을 특징으로 하는, 혈청 진단용 또는 중화항체 스크리닝용 키트.
  4. 제 3항에 있어서, 상기 ELISA는 직접 ELISA, 간접 ELISA, 직접적 샌드위치 ELISA 및 간접적 샌드위치 ELISA로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 혈청 진단용 또는 중화항체 스크리닝용 키트.
  5. 제 1항에 있어서, 상기 키트는 개 인플루엔자 바이러스 H3N2에 특이적인 중화항체를 확인하는 것을 특징으로 하는, 혈청 진단용 또는 중화항체 스크리닝용 키트.
  6. (a) 서열번호 1로 표시되는 아미노산으로 이루어진, 개 인플루엔자 바이러스(canine influenza virus, CIV) H3N2의 HA1 단백질 항원과 인간을 제외한 동물의 혈청 시료를 접촉시키는 단계; 및
    (b) 상기 (a) 단계의 혈청 시료 중 상기 개 인플루엔자 바이러스 H3N2의 HA1 단백질 항원과 결합된 항체의 존재를 검출하는 단계;를 포함하는, 개 인플루엔자 바이러스 H3N2에 특이적인 혈청 진단 방법.
  7. 삭제
  8. (a) 서열번호 1로 표시되는 아미노산으로 이루어진, 개 인플루엔자 바이러스(canine influenza virus, CIV) H3N2의 HA1 단백질 항원과 동물의 혈청 시료를 접촉시키는 단계; 및
    (b) 상기 (a) 단계의 혈청 시료 중 상기 개 인플루엔자 바이러스 H3N2의 HA1 단백질 항원과 결합된 항체의 존재를 검출하는 단계;를 포함하는, 개 인플루엔자 바이러스 H3N2에 특이적인 중화항체의 스크리닝 방법.
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