KR101421460B1 - Ｈ５ 조류 인플루엔자 진단 및 감시를 위해 유용한 ｈ５ 서브타입-특이적 결합 단백질 - Google Patents
Ｈ５ 조류 인플루엔자 진단 및 감시를 위해 유용한 ｈ５ 서브타입-특이적 결합 단백질 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 조류 인플루엔자 바이러스(avian influenza virus, "AIV")의 H5 서브타입의 외피 당단백질에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체 및 관련된 결합 단백질을 제공한다. 상기 단일클론 항체 및 관련된 결합 단백질은 병원성 H5N1 서브타입을 포함한, AIV의 H5 서브타입의 검출을 위해 유용하다. 바이러스는 포르말린 중에 보존되고 파라핀 포매된 표본 및 동결된 표본 및 생물학적 유체(biological fluid)에서 검출될 수 있다. 따라서, 본 발명은 위험한 바이러스 감염의 진단 및 감시를 위한 수단을 제공한다.
조류 인플루엔자 바이러스, AIV, 단일클론 항체.
Description
본 발명은 조류 인플루엔자 바이러스(avian influenza virus, "AIV")의 검출을 위한 항체 및 관련된 결합 단백질에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 AIV의 고 병원성 H5 서브타입의 검출을 위해 유용한 단일클론 항체 및 관련된 결합 단백질, 및 동물 및 인간에서 그와 같은 AIV 감염의 진단 및 감시를 위한 방법 및 제품에 관한 것이다.
조류 인플루엔자는 조류에서 흔한 질병이다. 서브타입 H5N1 AIV는 세계의 다수의 지역으로 끊임없이 확산되고 있는 조류 인플루엔자의 발생을 유발했다(14).1 영향받은 영역은 유럽, 중동 및 특히 아시아를 포함한다. 세계보건기구("WHO")에 따르면, 2006년 4월 현재, H5N1 조류 인플루엔자의 결과 약 100명의 사망이 발생했고, 상황이 악화되고 있는 것으로 보인다. WHO 웹사이트를 참조한다(11). 사람에서 AIV 감염은 드무나, 종간 장벽(species barrier)을 넘을 수 있는 신종 AIV 서브타입의 발생이 치명적인 인플루엔자 유행을 유발했던 경우가 과거에 수차례 있었 다(2, 8, 10).
인플루엔자 바이러스는 그들의 핵단백질(nucleoprotein) 및 기질 단백질(matrix protein) 항원 특이성에 따라 분류된다. 이 바이러스는 주로 A, B 및 C혈청형(serotype)으로 분류되고, 타입 A는 10개의 바이러스 단백질을 코딩하는 8개의 RNA 세그먼트를 갖는다. 모든 공지된 타입 A 인플루엔자 바이러스는 조류에서 기원했다. 이 카테고리의 바이러스는 말, 돼지, 올빼미 및 물개와 같은 다른 종을 감염시킬 수 있고, 사람에게도 위협을 가한다(22). 인플루엔자 A 바이러스는 외피 당단백질(envelope glycoprotein), 헤마글루티닌(hemagglutinin, "HA")의 항원성에 따라 서브타입, H1 내지 H6 및 뉴라미니다아제(neuraminidase, "NA")의 항원성에 따라 N1 내지 N9로 더 분류된다(10, 12, 19). HA1-HA2 접합부(junction)에서 HA 단백질의 단백질분해효소에 의한 절단(proteolytic cleavage)이 조류 스트레인에서 병원성과 관련되고 이 절단 부위 주위에 소수성 아미노산의 존재가 H5 서브타입의 특징으로 사료된다. 또한, HA 단백질은 숙주 세포 시알로시드 수용체(sialoside receptor)로의 부착 및 막 융합에 의한 뒤이은 진입을 매개하는 것으로 사료되고(17), HA 단백질은 중화 항체(neutralizing antibody)에 대한 주요 표적으로 작용하는 것으로 생각된다(19).
본 발명은 AIV에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체 및 관련된 결합 단백질에 관한 것이다. 단일클론 항체("mAb")는 단일 항체-생산 세포로부터 유래된 항체들의 실질적으로 균질한 집단이다. 따라서, 집단 내의 모든 항체들은 동일하고 주어진 에피토프에 대해 동일한 특이성을 갖는다(5). mAb 반응의 특이성은 효과적인 진단 시약을 위한 기반을 제공한다. 단일클론 항체 및 그들로부터 유래된 결합 단백질도 치료제로서의 유용성을 확인하였다.
AIV 감염이 야생생물, 가축 및 인간에 가하는 위험 때문에, 조직 표본에서 바이러스를 검출하는 신속하고, 특이적이고 신뢰할 수 있는 방법에 대한 긴급한 필요성이 있다. 특히, 파라핀에 포매된 포르말린 고정 표본과 같은 보존된 표본에서 바이러스를 검출하는 능력이 질병을 진단하고 그의 진행을 모니터링하는 능력에 중요하다. 현재까지, H5 서브타입 단일클론 항체를 이용하여 고병원성 H5N1 AIV 스트레인의 진단을 위한 효과적인 방법에 대한 보고는 없었다. 따라서, 본 발명은 H5N1 및 다른 H5 스트레인의 진단 및 감시(surveillance)에서 진전을 나타낸다.
발명의 요약
본 발명에 따라, H5-서브타입 헤마글루티닌 당단백질의 선형 에피토프 및 입체형태(conformational) 에피토프에 대해 특이적인 단일클론 항체 및 관련된 결합 단백질이 제공된다. 선형 H5 에피토프에 대한 mAb는 포르말린-고정 조직 표본(formalin-fixed tissue specimen)과 같은, 변성된(denatured) 표본에서 H5N1 바이러스 및 기타 H5 서브타입 바이러스 스트레인을 우수한 특이성 및 민감도로 검출할 수 있고, 입체형태 에피토프를 표적화하는 mAb는 동결된 표본 및 기타 생물학적 유체(biological fluid) 중의 바이러스를 검출하기 위해 유용하다.
특히, 7H10으로 표시된 mAb는 헤마글루티닌의 선형 에피토프를 표적화하고 포르말린-고정 조직 중의 바이러스 항원에 대해 높은 효능 및 민감도를 보이나, 동결 조직 절편에 대해서는 최소 효과를 가졌다. 6B8로 표시된 mAb는 입체형태 헤마글루티닌 에피토프를 표적화하고 동결된 조직 표본 및 기타 생물학적 조직 및 유체와 같이, 전-처리되지 않았던 조직 중의 바이러스 항원을 인식하고 결합할 수 있다. 8F10 및 2D10으로 표시된 단일클론 항체도 입체형태 헤마글루티닌 에피토프를 표적화하고 mAb 6B8과 유사한 응용을 제공한다.
따라서, 본 발명은 실질적으로 mAb 7H10과 같이 선형 H5-서브타입 헤마글루티닌 에피토프에 대한 면역학적 결합 특징(immunological binding characteristics)을 갖는 결합 단백질을 포함한다. 본 발명은 또한, 실질적으로 mAb 6B8, 8F10 또는 2D10과 같이 입체형태(conformational) H5-서브타입 헤마글루티닌 에피토프에 대한 면역학적 결합 특징을 갖는 결합 단백질을 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 실질적으로 단일클론 항체(mAb) 7H10의 면역학적 결합 특징을 갖는 mAb 또는 결합 단백질에 의한 AIV의 결합을 검출하는 단계를 포함하는, 표본에서 H5 서브타입 AIV를 검출하는 방법을 포함한다. 또 다른 양태에서, 본 발명은 실질적으로 mAb 6B8, 8F10 또는 2D10의 면역학적 결합 특징을 갖는 mAb 또는 결합 단백질에 의한 AIV의 결합을 검출하는 단계를 포함하는, 표본에서 AIV를 검출하는 방법을 포함한다. 특히, 본 발명은 그와 같은 결합 단백질을 이용하는 면역형광 분석법, 면역조직화학적 분석법 및 ELISA 방법에 관한 것이다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 실질적으로 mAb 7H10 또는 mAb 6B8, 8F10 또는 2D10의 면역학적 결합 특징을 갖는 결합 단백질을 포함하는 AIV 검출용 키트에 관한 것이다.
본 발명은 또한 H5N1 AIV 스트레인과 같은 H5 AIV 스트레인에 의해 감염된 개체에게 실질적으로 mAb 6B8, 8F10 또는 2D10의 면역학적 결합 특징을 갖는 하나 이상의 단일클론 항체 또는 결합 단백질의 유효량을 투여하는 단계를 포함하는, H5 AIV 스트레인에 의해 감염된 개체를 치료하는 방법에 관한 것이다.
발명의 상세한 설명
본 발명은 AIV의 H5 서브타입의 헤마글루티닌 외피 당단백질에 특이적으로 결합하는 mAb 및 관련된 항원-결합 단백질에 관한 것이다. 특히, 상기 mAb 또는 관련된 항원-결합 단백질은 2007년 3월 20일자로 ATCC(American Type Culture Collection)에 기탁되고, 수탁번호 PTA-8243이 부여된, 하이브리도마(hybridoma) 7H10에 의해 생산되는 mAb 7H10, 2007년 3월 20일자로 ATCC(American Type Culture Collection)에 기탁되고, 수탁번호 PTA-8246이 부여된, 하이브리도마 6B8에 의해 생산되는 mAb 6B8, 2007년 3월 20일자로 ATCC(American Type Culture Collection)에 기탁되고, 수탁번호 PTA-8245가 부여된, 하이브리도마 8F10에 의해 생산되는 mAb 8F10, 또는 2007년 3월 20일자로 ATCC(American Type Culture Collection)에 기탁되고, 수탁번호 PTA-8248이 부여된, 하이브리도마 2D10에 의해 생산되는 mAb 2D10의 면역학적 결합 특징을 갖는다. 본 발명은 또한 상기 하이브리도마를 구현하고 본 발명의 mAb 및 결합 단백질의 지속적인 공급원을 제공한다. 본 발명은 또한 H5 서브타입 AIV 감염의 검출 및 진단 방법 및 본 발명의 mAb 또는 결합 단백질을 포함하는 분석 키트에 관한 것이다. 본 발명은 추가적으로 하나 이상의 본 발명의 항체 또는 관련된 결합 단백질의 유효량의 투여를 통해 H5 AIV 스트레인으로 감염된 개체를 치료하는 방법에 관한 것이다. 특히, 이 구체예에서, 상기 개체는 AIV의 H5N1 서브타입에 의해 감염된 것이다. 본 발명의 항체는 또한 가능한 인플루엔자 유행의 출현시 예방적 수단으로 개체에게 투여될 수 있다. 이 경우, 투여될 항체의 유효량은 H5 AIV 감염을 치료하기 위해 이용되는 양의 약 절반이다.
본 명세서에서, 하기 의미를 갖는 다양한 용어들이 이용된다:
모든 문법적 형태의 용어 mAb 또는 관련된 결합 단백질의 "면역학적 결합 특징(imunological binding characteristics)"은 그의 항원에 대한 mAb 또는 결합 단백질의 특이성, 친화도 및 교차-반응성(cross-reactivity)을 의미한다.
용어 "선형 에피토프(linear epitope)"는 항체 결합 부위를 형성하는 약 4개 내지 약 12개의 아미노산의 연속된 서열을 의미한다. 본 발명의 mAb의 선형 에피토프는 바람직하게는 HA1 바이러스 유전자에 의해 코딩된 헤마글루티닌 단백질의 약 244번 아미노산부터 약 251번 아미노산까지의 영역에 존재한다. mAb 또는 결합 단백질에 결합하는 형태의 선형 에피토프는 실질적으로 삼차 구조를 갖지 않는 변성된 단백질에 존재할 수 있다.
용어 "입체형태 에피토프(conformational epitope)"는 그의 원형의(native) 3차원 형태인 H5-서브타입 헤마글루티닌 당단백질에 존재하는 mAb 또는 관련된 결합 단백질 결합 부위를 의미한다.
용어 "결합 단백질(binding protein)"은 본 발명의 mAb의 항원 결합 부위를 포함하는 하기에 기술된 것을 포함한 단백질, 또는 본 발명의 mAb의 면역학적 결합 특징을 갖는 mAb를 의미한다.
본 발명은 유용하게, 동물을 AVI 서브타입 H5N1(PR8)으로 면역화시키는 것에 의해 mAb 8F10 또는 2D10의 결합 특징을 갖는 단일클론 항체를 제조하는 방법, 동물을 H5N3 단백질로 면역화시키는 것에 의해 6B8의 결합 특징을 갖는 단일클론 항체를 제조하는 방법, 및 동물을 H5 HA1 단백질로 면역화시키는 것에 의해 7H10의 결합 특징을 갖는 단일클론 항체를 제조하는 방법을 제공한다. 임의의 그와 같은 항원이 원하는 면역학적 결합 특징을 갖는 항체를 생성하기 위해 면역원(immunogen)으로 이용될 수 있다. 그와 같은 항체는 단일클론 항체, 키메라 항체, 단쇄 항체(single chain antibody), Fab 단편, 및 mAb 7H10, 6B8, 8F10 또는 2D10의 항원 결합 서열을 포함하는 단백질을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 mAb는 배양되는 연속적인 세포주에 의한 항체 분자의 생성을 제공하는 기법에 의해 생산될 수 있다. 그와 같은 방법은 Kohler 및 Milstein에 의해 최초에 개발되었던 하이브리도마 기법(1975, Nature 256:495-497), 및 트리오마(trioma) 기법, 인간 B-세포 하이브리도마 기법(Kozbor et al., 1983, Immunology Today 4:72), 및 인간 단일클론 항체를 생성하기 위한 EBV-하이브리도마 기법(Cole et al., 1985, in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 인간 항체가 이용될 수 있고 인간 하이브리도마를 이용하거나(Cote et al., 1983, Proc. Nat'l. Acad. Sd. U.S.A., 80:2026-2030) 또는 인 비트로에서 EBV 바이러스에 의해 인간 B 세포를 형질전환시키는 것에 의해(Cole et al., 1985, in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, pp. 77-96) 수득될 수 있다. 또한, 본 발명의 마우스 항체(murine antibody) 분자, 예를 들면, mAb 7H10, 6B8, 8F10 또는 2D10으로부터의 서열을 적합한 생물학적 활성의 인간 항체 분자로부터의 유전자와 함께 도입하는 것에 의해 "키메라 항체" 또는 인간화 항체"의 생산을 위해 개발된 기법들(Morrison et al., 1984, J. Bacteriol 159-870; Neuberger et al., 1984, Nature 322:604-608; Takeda et al., 1985, Nature 3/4:452-454)이 이용될 수 있다. 키메라 항체는 인간 Fc 부분과 마우스(또는 기타 비-인간(non-human)) Fv 부분을 포함하는 항체이다. 인간화 항체는 마우스(또는 기타 비-인간) 상보성 결정 영역(complementarity determining region, CDR)이 인간 항체에 결합된 것인 항체이다. 키메라 항체와 인간화 항체는 모두 단일클론 항체이다. 그와 같은 인간 항체, 또는 인간화 키메라 항체가 인간 질병 또는 질환의 인 비보 진단 또는 치료에서의 사용을 위해 바람직하다.
본 발명에 따르면, 단쇄 항체(single chain antibody)의 생산을 위해 기재된 기법(미국특허 제4,946,778호)이 본 발명의 단쇄 항체를 제공하기 위해 개조될 수 있다. 본 발명의 추가적인 구체예는 본 발명의 항체, 또는 그의 유도체, 또는 유사체(analog)에 대한 원하는 특이성을 갖는 단일클론 Fab 단편의 신속하고 용이한 확인을 가능하게 하기 위해 Fab 발현 라이브러리의 구축(Huse et al., 1989, Science 246: 1275-1281)을 위해 기재된 기법들을 이용한다.
항체 분자의 이디오타입(idiotype)을 포함하는 항체 단편이 공지된 기법에 의해 생성될 수 있다. 예를 들면, 그와 같은 단편은 항체 분자의 펩신 처리에 의해 생성될 수 있는 F(ab')2 단편; F(ab')2 단편의 디술피드 결합(disulfide bridge)을 환원시키는 것에 의해 생성될 수 있는 Fab' 단편, 및 항체 분자를 파파인(papain) 및 환원제에 의해 처리하는 것에 의해 생성될 수 있는 Fab 단편을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 그와 같은 항체 단편은 본 발명의 다중클론(polyclonal) 또는 단일클론 항체로부터 생성될 수 있다.
항체의 생산에서, 원하는 항체의 스크리닝은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 공지된 기법, 예를 들면, 방사성면역분석법(radioimmunoassay), ELISA (enzyme- linked immunosorbent assay), "샌드위치(sandwich)" 면역분석법, 면역방사능 분석법(immunoradiometric assay), 겔 확산 침전 반응(gel diffusion precipitin reaction), 면역확산 분석법(immunodiffusion assay), 인 시투 면역분석법(in situ immunoassay)(예를 들면, 콜로이드 골드(colloidal gold), 효소 또는 방사성동위원소 표지 이용), 웨스턴 블롯, 침전 반응, 응집 분석법(agglutination assay)(예를 들면, 겔 응집 분석법, 적혈구 응집 분석법(hemagglutination assay)), 면역형광 분석법(immunofluorescence assay) 및 면역전기영동 분석법(immunoelectrophoresis assay), 등에 의해 달성될 수 있다. 일 구체예에서, 항체 결합은 일차 항체(primary antibody) 상의 표지를 검출하는 것에 의해 검출된다. 또 다른 구체예에서, 일차 항체는 이차 항체 또는 다른 시약의 일차 항체로의 결합을 검출하는 것에 의해 검출된다. 또 다른 구체예에서, 이차 항체는 표지된다. 면역분석법에서 결합을 검출하기 위한 수단들이 본 발명이 속하는 기술 분야에서 알려져 있고 본 발명의 범위 내에 속한다.
전술된 항체들은 AIV의 H5 서브타입의 검출 또는 위치결정(localization)과 관련된 기술 분야에서 공지된 방법, 예를 들면, 웨스턴 블롯팅, ELISA, 방사성면역분석법, 면역형광 분석법, 면역조직화학적 분석법(immunohistochemical assay), 등에서 이용될 수 있다. 본 명세서에 개시된 기법들은 AIV의 H5 서브타입의 정성적 및 정량적 측정 및 상기 바이러스에 의해 감염된 동물 또는 인간의 진단 및 감시(sruveillance)에 적용될 수 있다.
본 발명은 또한 AIV의 H5 서브타입의 정성적 및/또는 정량적 측정을 위한 분석 및 테스트 키트를 포함한다. 그와 같은 분석 시스템 및 테스트 키트는 예를 들면, 방사성 원자, 형광 그룹, 또는 효소에 의해 표지화하거나, 표지를 본 발명의 mAb 또는 관련된 결합 단백질, 또는 그의 결합 파트너(binding partner)에 결합시키는 것에 의해 제조된 표지된 성분을 포함할 수 있다. 그와 같은 분석 또는 테스트 키트는 또한 면역분석 기법의 당업자에게 잘 알려진 바와 같이, 시약, 희석제 및 사용 설명서를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 일부 구체예에서, 그와 같은 키트는 적어도 본 발명의 mAb 또는 관련된 결합 단백질, 상기 mAb 또는 관련된 단백질의 생물학적 시료 중 AIV로의 면역 특이적 결합을 검출하기 위한 수단, 선택된 방법, 예를 들면, "경쟁적(competitive)", "샌드위치", "DASP" 등에 따른, 사용 설명서를 포함할 것이다. 키트는 또한 양성 대조군 및 음성 대조군을 포함할 수 있다. 그들은 자동화된 분석기 또는 자동화된 면역조직화학적 슬라이드 염색(staining) 장치와 함께 이용되도록 배열될 수 있다.
본 발명의 분석 키트는 표지화될 수 있거나, 또는 고체 지지체로의 결합을 위해 제공될 수 있거나(또는 고체 지지체에 결합된) 제2 항체 또는 결합 단백질을 더 포함할 수 있다. 그와 같은 항체 또는 결합 단백질은 예를 들면, AIV에 결합하는 항체 또는 결합 단백질일 수 있다. 그와 같은 제2 항체 또는 결합 단백질은 다중클론 항체 또는 단일클론 항체일 수 있다.
H5-서브타입 헤마글루티닌(hemagglutinin) 단백질에 대한 단일클론 항체는 동물을 AIV 또는 H5 단백질 또는 그의 단편으로 면역화시키는 것에 의해 제조될 수 있다. 바람직한 방법은 H5-서브타입 HA1 유전자의 증폭 및 뒤이은 상기 유전자의 발현, H5 서브타입 재조합 단백질의 회수 및 정제 및 상기 정제된 단백질의 면역원으로서의 이용을 포함한다. 예를 들면, H5N1 AIV는 상기 바이러스의 이용가능한 스트레인의 병아리 배아로의 접종에 의해 증식되고, 뒤이어 바이러스 RNA가 분리된다. HA1 유전자는 RT-PCR(reverse transcriptase polymerase chain reaction)에 의해 증폭되고 그 후, 곤충 세포에서 H5 단백질을 발현시키기 위해 이용되는 바큘로바이러스 벡터(baculovirus vector) 내로 클로닝될 수 있다. 상기와 같이 생산된 단백질이 하이브리도마의 제조를 위해 마우스 또는 다른 적합한 종을 면역화시키기 위해 이용될 수 있다.
하이브리도마는 H5 단백질에 특이적으로 결합할 수 있고 H5 단백질을 다른 AIV 서브타입들과 구별할 수 있는 고 친화성(high affinity) mAb를 안정적으로 생산할 수 있는 능력에 대해 스크리닝된다. 본 발명에 따라, 바이러스 중화(virus neutralization) 능력을 갖는 항체가 H5-서브타입 헤마글루티닌 단백질의 입체형태 에피토프(conformational epitope)를 인식할 수 있는 것으로 확인되었다. 이 발견은 1 내지 2회의 MDCK(Madin-Darby canine kidney) 세포의 선택 후에 각각의 중화 mAb의 존재 하에 바이러스 이탈 돌연변이체(virus escape mutant)의 생성으로부터 유래되었다. 이 중화 이탈 돌연변이체로부터 RT-PCR에 의해 HA1 유전자가 클로닝되고 점 돌연변이(point mutation)를 확인하기 위해 서열결정되었다. 이 패널의 항체에서, mAb 6B8, 8F10 및 2D10에서, 3개의 중화 에피토프, 즉, 1, 2, 및 3이 발견되었다. 적혈구 응집 억제 분석법(hemagglutination inhibition assay)을 이용하여 중화-이탈 능력을 확인하였다.
HAl은 338개의 아미노산을 포함한다. 상기 단백질 상의 선형 에피토프의 분포를 연구하기 위해, 절단된(truncated) 단편 및 돌연변이된 단편이 예를 들면, 웨스턴 블롯 또는 유사한 기법에 의해 mAb와의 결합에 대해 유용하게 테스트된다. 변성된 H5 서브타입 단백질, 예를 들면, 포르말린-고정 조직에서 나타나는 변성된 단백질의 검출에서 우수한 성능을 가져오는 mAb에 대한 결합 표적인 선형 에피토프가 면역조직화학적 염색 방법을 이용하여 식별될 수 있다. 이 방식에 의한 H5 서브타입 mAb의 맵핑은 추가적인 연구 및 감염성 H5N1 AIV의 보다 효과적인 임상적 진단을 위한 플랫폼을 제공한다.
본 발명은 또한 AIV의 H5 서브타입의 헤마글루티닌 분자의 항원 구조의 보다 명확한 이해를 제공했다. 본 발명의 mAb 및 관련된 결합 단백질은 파라핀 중에 고정된 변성된 조직 및 동결된 절편(frozen section) 및 생물학적 표본에서 이 고 병원성 바이러스를 검출하기 위한 수단을 제공한다.
파라핀 절편에서 바이러스를 검출하는 능력은 매우 중요하다. 대부분의 경우, 감염된 조직 절편 중의 H5N1 항원은 고정(fixation) 방법에 의해 파괴된다. 포르말린과 에탄올은 지질 외피(lipid envelope) 및 헤마글루티닌을 포함한 외피 당단백질을 제거할 가능성을 가져서, 바이러스 항원 검출의 어려움을 증가시킨다. 따라서, 이 형태의 진단은 H5 감염 동물 및 인간 조직에서 보다 안전하고 보다 정확한 진단을 제공할 가능성을 갖는다.
하기에 제시된 실시예에 의해 예시되는 바와 같이, mAb 7H10은 포르말린-고정 조직 중의 바이러스 항원에 매우 효과적인 민감하나, 동결 조직 절편에 대해서는 최소 효과(minimal effet)를 갖는다. 이 항체는 감염된 조직이 광학 현미경 하에서 용이하게 시각화될 수 있게 한다. 항체 7H10은 적혈구 응집 억제 또는 바이러스 중화 활성을 갖지 않으나, 면역형광 분석법 및 웨스턴 블롯 분석에서 양성 결과를 보이며, 재조합 H5NI-HA 단백질(MW 36kDa)에 해당하는 강한 밴드가 관찰된다.
대조적으로, mAb 6B8, 8F10 및 2D10은 동결 조직 절편에 대해 매우 효과적이나, 포르말린-고정 조직 중의 항원을 검출하지 않는다. 이 결과는 두 그룹의 mAb가 상이한 바이러스 에피토프와 반응한다는 것을 시사한다. 에피토프 맵핑(epitope mapping)을 통해, mAb 7H10은 선형 에피토프를 표적화하는 것으로 결정되었다. mAb 7H10은 조직에 강한 열처리(intensive heat treatment)가 수행된 경우, 바이러스 항원을 검출할 수 있을 뿐이다. 그와 같은 가혹한 항원 재생(harsh antigen retrieval) 방법 하에서, 바이러스의 표면 단백질이 파괴되고 H5N1 바이러스의 핵단백질이 노출되었다. 따라서, 선형 에피토프를 표적화하는 mAb는 동결 조직 절편에 대해 잘 작용하지 않았다.
단일클론 항체 6B8, 8F10 및 2D10은 에피토프 맵핑에 의해 H5N1 바이러스의 입체형태 에피토프를 표적화하는 것으로 결정되었다. 이 항체들은 조직 절편에 대한 전 처리 없이 이 바이러스 항원을 인식하고 결합할 수 있었다.
면역조직화학적 분석에서 관찰된 상이한 조직 표본 상에서 염색 강도의 차이는 바이러스 침윤(viral infiltration)의 수준이 조직별로 상이하다는 것을 반영한다. 예를 들면, 뇌 조직 및 신장 조직에서, 개별적인 세포들은 진하게 염색되었고 또한 뇌 조직 및 신장 조직에 염색된 세포들의 큰 분포가 있었다. 이 발견은 폐가 바이러스혈증(viremia)의 후기 단계에 가장 심각하게 감염되는 기관이 아닐 수 있다는 것을 나타낸다. 이전에, H5N1 감염 동물의 폐에서 심한 병변(intensive lesion)이 보고되었다(2, 13, 14). 그러나, 본 발명의 발견은 폐가 신장보다 더 적은 수의 병변을 갖는다는 것을 나타냈다. 본 발명을 가져온 실험에서 이용된 조직 표본은 감염의 말기에 있는 조류로부터 수득되었기 때문에, 이 결과들은 폐가 일반적으로 감염의 초기에 높은 수준의 바이러스혈증을 가지며, 후기 동안 바이러스가 확산되어 신장에 집중될 것이라는 것을 시사할 수 있다. 따라서, 이 결과는 H5N1 AIV에 의한 감염이 의심되는 동물로부터의 진단용 표본이 폐 조직 뿐 아니라 뇌 조직 및 신장 조직을 포함해야 한다는 것을 보여준다.
본 발명은 H5 서브타입 AIV를 검출하기 위한 편리하고, 특이성이 높고 민감한 수단을 제공한다. 하나의 그와 같은 수단은 ELISA 포맷(format)이다. 바람직한 구체예에서, mAb 7H10 및 6B8은 포획 항체(capture antibody)로 이용된다. 이 조합은 항체 단독 또는 다른 조합에 비해 H5-서브타입 AIV의 검출에서 높은 광학적 강도(optical density) 판독을 제공하는 것으로 확인되었다. 특정한 이론에 의해 한정되지 않으면서, 이 결과들의 가능한 설명은 두 개의 항체가 HA1 단백질 상의 상이한 에피토프와 반응하고 상이한 항체 서브클래스이어서, 복수 개의 결합 부위를 제공한다는 것이다.
입체형태 에피토프에 대한 단일클론 항체는 적혈구 응집 억제 및 중화 활성과 같은 중요한 생물학적 기능을 유지하고, 선형 에피토프에 대한 mAb는 또한 진단 용도를 위해 유리하다. 따라서, 각각 선형 에피토프 및 입체형태 에피토프에 대한 것이고 항원-항체 상호작용에서 IgG와 IgM의 면역학적 특성을 조합하는 mAb 7H10 및 6B8의 적용은 ELISA 방법의 고 민감도에 크게 기여할 수 있다. 두 개의 mAb를 이용하는 방법은 또한 예를 들면, 도트-블롯(dot-blot) 및 인 시투 혼성화 포맷(in situ hybridization format)과 같은, H5 바이러스를 검출하는 다른 면역학적 방법을 개발하기 위해 이용될 수 있다.
본 발명의 바람직한 ELISA 테스트는 중국에서 가금류를 감염시키고 베트남에서 사람을 감염시킨 H5N1 조류 인플루엔자 바이러스로부터의 HA 항원을 검출할 수 있고, 이는 조류 및 인간 H5N1 감염 모두를 검출하기 위한 본 발명의 유용성을 나타낸다.
본 발명의 H5-서브타입 mAb는 진단 도구로서 다른 현재의 방법들에 비해 적어도 3가지의 장점을 갖는다. 첫째, mAb는 고 감염성 H5-서브타입 AIV에 대해 높은 특이성을 갖는다. 상기 특이성은 다양한 출처로부터 2002년부터 2006년까지 수득된 다양한 H5N1-감염 조직 표본에서 확인되었다. 그와 같은 고 특이성 단일클론 항체는 조류 인플루엔자 진단 분야에서 진전을 의미한다. 둘째, 이 mAb가 감염된 포르말린-고정 조직 및 HI 및 IFA와 같은 혈청학적 테스트에서 H5 바이러스 항원을 검출하고 정확하게 위치를 파악하는 능력은 구별되는 장점이다. 세째, 이 mAb는 H5 AIV의 검출을 위한 안전하고 편리한 진단 방법을 제공한다. 이 항체들이 파라핀 절편에서 바이러스 항원을 검출하는 능력은 인간을 감염시키지 않거나, 환경으로 감염성 바이러스 입자들을 방출할 가능성을 갖지 않는 감염된 표본의 수송 및 진단을 촉진한다. 또한, 동결 절편 슬라이드는 장기간 동안 초저온으로(cryogenically) 보관될 수 있고 감염의 추가적인 진단 및 감시를 촉진할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구체예는 H5 조류 인플루엔자의 중화 이탈 돌연변이체(neutralization escape mutant)에 관한 것이다. 용어 "중화 이탈 돌연변이체(neutralization escape mutant)"는 H5 바이러스에서 항원 소변이(antigenic drift)를 유발하고 중화 에피토프(neutralization epitope)에 영향을 미치는, 헤마글루티닌을 코딩하는 유전자의 점 돌연변이에 의해 발생한 돌연변이 바이러스를 의미한다. 중화 이탈 돌연변이체는 그의 모 바이러스(parent virus)를 중화시키기에 효과적인 특정한 단일클론 항체에 의한 중화를 회피할 수 있다. 이탈 돌연변이체에 대한 수동 스크리닝(manual screening)에서, 모 바이러스가 특정한 중화 항체와 함께 인큐베이션되고 MDCK 세포 또는 병아리 배아와 같은 숙주에 접종된다. 2 내지 3회의 스크리닝 후에, 중화 mAb에 대한 이탈 돌연변이체가 클로닝되고 HA1 유전자의 서열결정이 수행된다. 돌연변이된 아미노산은 모 바이러스 서열과의 정렬에 의해 결정되고, 돌연변이 부위는 정확하게 중화 mAb에 의해 인식되는 중화 에피토프를 구성하는 아미노산 중 하나를 나타낸다.
본 발명에서, 6B8 이탈 돌연변이체는 6B8 중화 단일클론 항체에 의해 H5N3 AIV로부터 유래된다. 8F10 이탈 돌연변이체는 8F10 중화 단일클론 항체에 의해 H5N1(PR8) AIV로부터 유래되며, 2D10 이탈 돌연변이체는 2D10 중화 단일클론 항체에 의해 H5N1(PR8) AIV로부터 유래된다. 돌연변이 부위는 하기의 실시예 3, 표 3에 열거된다.
중화 이탈 돌연변이체는 그들이 더 이상 모 바이러스에 특이적으로 결합하는 특정 중화 항체에 의해 인식될 수 없다는 점에서 그들의 모 바이러스와 상이하다. 이 점에서, 이 돌연변이체들은 전술된 교시에 따라, 새로운 단일클론 항체 생산을 위해 마우스를 면역화시키기 위해 이용될 수 있다. 새로운 mAb 중에, 돌연변이된 에피토프를 정확하게 인식하는 단일클론 항체가 스크리닝되고, 모 바이러스와 상이한 조류 인플루엔자 바이러스에 대한 상보적인 감시(complementary surveillance)를 제공하기 위해 이용될 수 있다. 여러 세대를 통해 이 과정을 반복하는 것에 의해, 추가적인 이탈 돌연변이체가 발견되고 추가적인 중화 항체가 수득될 수 있다. 이 항체들이 본 발명의 방법에서 이용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 본 발명의 항체 및 관련된 결합 단백질이 H5 AIV 감염, 특히, AIV의 H5N1 서브타입에 의한 감염을 앓는 개체를 치료하기 위해 투여될 수 있다. 본 발명의 항체 및 관련된 결합 단백질은 또한 인플루엔자 유행 발생 시 또는 유행이 위협되는 경우, 예방적 조치로 개체에게 투여될 수 있다. 상기 항체 및 관련된 결합 단백질은 단일 투여량으로 또는 반복적인 투여로 투여될 수 있고, 선택적으로 서방형(slow release form)으로 투여될 수 있다. 투여는 상기 항체가 치료 대상 개체의 신체 내의 작용 부위에 도달할 수 있게 하는 수단에 의해, 예를 들면, 정맥내로, 근육내로, 피내로(intradermally), 경구로 또는 비강으로 이루어질 수 있다. 일반적으로, 항체는 멸균수용액과 같은 약제학적으로 허용가능한 희석제 또는 담체 중에 담겨서 투여되고, 그 조성물은 하나 이상의 안정화제, 아쥬반트(adjuvant), 가용화제(solubilizer), 완충액 등을 더 포함할 수 있다. 개체의 개별적인 니즈에 따라, 개체의 연령, 체중, 전반적인 건강, 및 개체의 증상의 속성 및 정도 및 적용되는 치료 빈도와 같은 인자들을 고려하여, 정확한 투여 방법, 조성 및 특정한 투여량이 결정되고 적용시 조정될 것이다. 일반적으로, 투여되는 항체의 용량은 항체가 H5N1 감염을 앓는 환자를 치료하기 위해 투여되는 경우, 약 0.1 mg/kg 내지 약 l mg/kg 체중의 범위에 속한다. 통상적으로, 투여량은 예방적 수단으로 투여되는 경우, 약 절반으로, 즉, 약 0.05 mg/kg 내지 약 0.5 mg/kg 체중의 범위로 감소된다.
본 발명의 단일 항체 또는 결합 단백질이 치료적 목적을 위해 투여될 수 있거나, 둘 이상의 조합이 투여될 수 있다. 한 세대 이상의 중화 이탈 돌연변이체에 대한 항체가 생산된 경우, 그와 같은 항체 및 전술된 6B8, 8F10 및/또는 2D10 항체가 치료 항체 "칵테일(cocktail)"로 투여될 수 있다.
하기의 실시예는 본 발명을 실시하는 바람직한 방식을 예시하기 위해 제공된다. 본 발명은 실시예의 세부사항에 한정되지 않으나, 첨부된 청구항의 완전한 범위와 동일한다.
도 1. 90일의 기간 동안의 mAb 역가(titer)의 분포. 도 1의 데이터는 mAb가 상당한 기간 동안 안정하게 유지될 수 있었다는 것을 보여준다.
도 2. HI 분석법에서 측정된 H5 서브타입 mAb의 비-H5(non-H5) 서브타입 바이러스 및 H5 서브타입 바이러스와의 교차-반응성(cross-reactivity). 개별적인 바이러스에 대한 혈청 항체 역가가 하기와 같이 표시된다: 밝은 명암(light shade) - HI 활성 부재, 어두운 명암(dark shade) - > 16.
도 3. 웨스턴 블롯 분석. 대장균의 총 세포 용해액(total cell lysate)에서 발현된 H5N1 바이러스의 HA1 단백질과 개별적인 mAb의 반응성. RPMI 1640을 mAb에 대한 대조군으로 이용하였다.
도 4. 상이한 조직 표본에서 신호의 강도의 분포. 표본은 H5N1 AVI 감염된 Magpie Robin이었다(도면에서 신호/병변이 화살표로 표시됨).
a) 뇌 동결 절편(Brain frozen section). mAb 6B8과 인큐베이션된 조직. 양성 신호의 높은 강도가 다수의 적색 스팟으로 관찰되었다. 뉴런에서 병변이 관찰되었다.
b) 뇌 동결 절편. RPMI 1640이 mAb 6B8에 대한 대조군으로 적용되었다. 신호가 관찰되지 않았다.
c) 간 파라핀 절편(Liver paraffin section). mAb 7H10과 인큐베이션된 조 직. 담관의 내피에서 최소 병변이 관찰되었다.
d) 간 파라핀 절편. RPMI 1640이 mAb 7H10에 대한 대조군으로 적용되었다. 신호가 관찰되지 않았다.
e) 폐 파라핀 절편. mAb 7H10과 인큐베이션된 조직. 상피 조직의 내층(lining)에서만 병변이 관찰되었다.
f) 폐 파라핀 절편. RPMI 1640이 mAb 7H10에 대한 대조군으로 적용되었다. 신호가 관찰되지 않았다.
g) 폐 파라핀 절편. mAb 7H10과 인큐베이션된 조직. 폐포 조직에서 병변이 관찰되었다.
h) 폐 파라핀 절편. RPMI 1640이 mAb 7H10에 대한 대조군으로 적용되었다. 신호가 관찰되지 않았다.
i) 신장 파라핀 절편. mAb 7H10과 인큐베이션된 조직. 다량의 고 강도 신호가 신장 세포 전체에 걸쳐 분포되었다.
j) 신장 파라핀 절편. RPMI 1640이 mAb 7H10에 대한 대조군으로 적용되었다. 신호가 관찰되지 않았다.
k) 간 파라핀 절편. mAb 7H10과 인큐베이션된 조직. 간세포에서 병변이 관찰되었다.
l) 간 파라핀 절편. RPMI 1640이 mAb 7H10에 대한 대조군으로 적용되었다. 신호가 관찰되지 않았다.
도 5. H5 서브타입 mAb는 2002년에 수득된 H5N1 감염 조직으로부터 신호를 검출할 수 있었다.
a) 집 까마귀(House Crow)의 뇌 조직.
b) 백로(Pond Heron)의 폐 조직.
c) 왜가리(Grey Heron)의 뇌 조직.
d) 닭의 뇌 조직.
도 6. AC-ELISA 포맷에서 포획(capture) 항체 및 검출(detection) 항체의 반응성. (a) AC ELISA 테스트를 이용하여 상이한 AIV 서브타입을 테스트하였다. 이 테스트의 특이성은 H5 AIV 만이 양성 결과를 생성하는 경우 확인된다. "N Ctrl"은 바이러스가 웰에 첨가되지 않은 것인 음성 대조군이다. (b) 상이한 H5 AIV를 연속적으로 PBS로 희석하고 AC ELISA로 테스트하였다. 0.100을 양성 결과와 음성 결과 간의 컷-오프 값으로 이용하여, AC ELISA 테스트로 검출될 수 있는 H5 AIV의 최소량은 평균 약 0.5 HA 유닛, 7H10 및 6B8인 것으로 확인되었다;
도 7. 7H10에 대한 에피토프의 맵핑. A. HA1 단편의 상이한 길이의 발현을 위한 클론 구조물 및 그들의 mAb 7H10과의 반응성을 보여주는, 헤마글루티닌 단백질 1의 개략도(schematic diagram). aa, 아미노산(amino acid). B. 대장균 BL21에서 발현된 12개의 재조합 융합 단백질의 웨스턴 블롯. 시료는 총 세포 용해액으로부터 채취하였다. M, 마커; NC, 음성 대조군; HAl, 전장(full-length) HAl 단백질; A- K, 상이한 단편. C. HA1 단편 상의 상이한 돌연변이의 발현을 위한 클론 구조물 및 그들의 mAb 710과의 반응성을 보여주는, 돌연변이 헤마글루티닌 1 단편의 개략도. D. 대장균 BL21에서 발현된 9개의 재조합 융합 단백질의 웨스턴 블롯. 시료는 총 세포 용해액으로부터 채취하였다. M, 마커; NC, 음성 대조군; J, B의 단편 J.
실시예 1
하이브리도마의 생성
H5N1/PR8로 표시된 바이러스는 질병통제센터(the Center for Disease Control)(USA)로부터 수득하였다. 상기 바이러스는 베트남에서 사람을 감염시켰던 AIV H5N1 바이러스(A/Viemam/1203/2004)의 HA 유전자 및 NA 유전자를 포함하는 비-병원성 재조합 H5N1 인플루엔자 바이러스이다. 또 다른 AIV 서브타입, H5N3 (A/chicken/Singapore/97)는 싱가포르의 AVA(AgriFood & Veterinary Authority)로부터 수득하였다. 상기 두 바이러스 스톡을 이용하여 9일 내지 11일령의 부화된 계란(embryonated chicken eggs)(Chew's Poultry Farm, Singapore)을 감염시키고 두 세대 동안 복제되게 하였다. 그 후, 부화된 계란으로부터 요막액을 채취하고 적혈구응집 분석법(hemagglutination assay, HA)을 이용하여 바이러스 역가(viral titer)를 결정하였다. 상기 H5N1 및 H5N3 바이러스의 정제는 바이러스-함유 요막액을 10,000 rpm으로 30분동안 원심분리하여 조직파편을 제거하고 뒤이어 40,000 rpm에서 3시간 동안 상층액을 초원심분리하여 수행하였다. 바이러스 펠렛(virus pellet)을 PBS에 재현탁시켰다.
단백질 A 친화도 컬럼(Sigma Aldrich; St. Louis, MO, USA) 및 Immunopure® IgM 정제 키트(Pierce Biotechnology; Rockford, Illinois, USA)를 이용하여 제조 사의 설명서에 따라, 투명해진 용액으로부터 단일클론 항체(IgG 및 IgM)를 정제하였다. IgG 및 IgM의 농도를 ND-1000 분광광도계(NanoDrop Technologies; Wilmington, Delaware, USA)를 이용하여 측정하였다.
불활성화된 H5N1 AVI (A/goose/Guangdong/97)을 에피토프 맵핑(epitope mapping)을 위해 RT-PCR에 의해 HA1 유전자를 증폭시키기 위한 RNA의 공급원으로 이용하였다. 제조사에 의해 설명된 바와 같이, LS Trizol 시약(Invitrogen)을 이용하여 바이러스-감염된 세포로부터 바이러스 RNA를 분리하였다. H5 서브타입의 HA1 유전자에 대한 특이적 프라이머를 이용하여 역 전사(reverse transcription) 및 PCR을 수행하였다. 그 후, PCR 산물을 표준 절차에 따라 서열결정하였다. 증폭된 DNA를 pQE-30 벡터에 클로닝하고, 뒤이어 대장균 BL-21 적격 세포(competent cell)의 형질전환을 위해 이용하였다. 바큘로바이러스-매개 단백질 발현을 위해, 유전자를 pFASTBAC Ta 벡터 내로 클로닝시켜 H5N1 HA1 유전자를 포함하는 재조합 바큘로바이러스를 제조하였다. 뒤이어 상기 바큘로바이러스를 재조합 바이러스의 증폭을 위해 SF9 곤충 세포주에 감염시켰다. 이탈 돌연변이체의 선택을 위해, H5N1 AIV (A/Vietnam/1203/2004/H5Nl)를 RNA의 공급원으로 이용하였다.
정제된 H5-서브타입 바이러스 또는 바큘로바이러스로부터 정제된 H5 HA1 단백질을 이용하여 6 내지 8주령의 암컷 BALB/c 마우스에 2주의 간격으로 2회 근육내로 면역화시켰다. 각 동물에 동일 부피의 아쥬반트(SEPPIC, France)로 유화된 20-60 ㎍의 정제된 H5-서브타입 AIV를 접종하였다. 세포 융합 3일 전에, 마우스에 동일 용량의 바이러스의 복막내 추가접종(intraperitoneal booster)을 실시하였다. 그 후, 상기 마우스로부터 유래된 혈청을 웨스턴 블롯에 의해 스크리닝하고 가장 높은 항체 역가를 갖는 마우스를 세포 융합을 위해 선택하였다. 상기 선택된 마우스로부터 수득된 비장세포(splenocyte)를 50% 폴리에틸렌 글리콜(Sigma, mol. wt. 3350) 중에 1:10의 비율로 SP2/0 골수종 세포와 조합하여 상기 세포들을 융합시키고 하이브리도마를 생성하였다(21).
살아있는 바이러스에 의한 모든 실험은 BMBL(Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories) 4판에 규정된 바와 같이, CDC/NIH 생물학적 안전성(biosafety) 요건을 충족시키는 생물학적 안전성 수준 3 봉쇄 실험실(containment laboratory)(20)에서 수행하였다. 상기 실험은 또한 싱가포르의 AVA 및 MOH(Ministry of Health)에 의해 승인된 요건 및 적용되는 WHO 요건을 충족했다.
실시예 2
하이브리도마의 스크리닝
하기에 기술되는 바와 같이, HI(hemagglutination inhibition) 테스트 및 면역형광 분석법(IFA)에 의해 하이브리도마 배양물 상층액을 스크리닝하였다.
적혈구 응집 억제(Hemagglultination Inhibition) 테스트. CDC로부터 수득된 H5N1/PR8 바이러스를 이용하여 9일 내지 11일령의 부화된 계란(Chew's Poultry Farm, Singapore)을 감염시키고 35℃에서 72 내지 96 시간 동안 인큐베이션시켰다. 상기 바이러스의 증식 후에, 병아리 배아로부터의 요막액을 추출하고 H5N1 바이러 스 항원으로 이용하였다. 전술된 바와 같이, 응집을 위한 닭 적혈구 및 4 적혈구응집 유닛(hematogglutination unit)의 H5N1/PR8 바이러스 스트레인을 이용하여 전술된 바와 같이(15) 개별적인 하이브리도마 배양물 상층액을 대상으로 HI 테스트를 수행하였다. 하이브리도마 상층액의 연속적인 희석액(serial dilutions)은 먼저 1:50으로 희석하고 웰당 4 HA 유닛의 병아리 배아에서 증식된(0.1% 베타-프로피오락톤에 의해 불활성화됨) H5N1/PR8 바이러스 및 닭 적혈구의 0.5%(vol/vol) 현탁액와 함께 인큐베이션시켰다. 적혈구 응집을 억제한 최고 희석비율의 역수에 해당하는 항체 역가를 기하평균 역가(geometric mean titer, GMT)로 표현하였다.
면역형광 테스트: 96-웰 플레이트에서 24시간 동안 배양된 MDCK(Madin Darby Canine Kidney) 세포를 개별적인 요막액으로부터의 H5N1/PR8, H5N2 및 H5N3 바이러스로 감염시켰다. 한행 다음 행의 웰들을 음성 대조군(비감염 MDCK 세포)을 위해 이용하였다. 상기 96-웰 플레이트를 습윤(humidified) 35℃, 5% CO2 인큐베이터에 18 내지 22시간 동안 배치하였다. 감염된 세포들이 75%의 세포병변효과(cytopathic effect, CPE)에 도달했을 때, 이들을 실온에서 100 ㎕의 절대 에탄올로 10분 동안 고정시켰다. 그 후, 96-웰 플레이트 중의 세포들을 PBS, pH 7.4로 3회 세척하였다. 뒤이어, 고정된 세포들을 50 ㎕의 개별적인 하이브리도마 상층액과 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 3회의 세척 후에, 항원을 FITC(fluorescein isothiocyanate)-접합된 항-마우스 Ig(1:100 DAKO, Denmark)과 반응시키고 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. IFA에 의한 mAb의 스크리닝의 보다 차별적인 방 법을 위해, 추가적인 대조군을 이용하였다. 전술된 바와 같이, 비감염 MDCK 세포를 음성 대조군으로 이용하였다. 추가적인 음성 대조군으로서, 세포들을 RPMI 1640과 인큐베이션시켰다. 양성 대조군으로서, 100-배 희석액으로 면역화된 마우스로부터 수득된 혈청을 이용하였다. 개별적인 하이브리도마 상층액과 인큐베이션시킨 MDCK 세포를 상이한 대조군들과 비교하는 것에 의해, 양성 염색을 가져온 하이브리도마 상층액을 제한 희석(limiting dilution)에 의한 클로닝을 위해 선택하였다. 이 방법에 의해 안정한 mAb 생성 하이드리도마를 수득하였다.
실시예 3
H5-서브타입 단일클론 항체의 특성규명
mAb의 안정성. 세포주의 안정성을 평가하기 위해 상이한 시기(7일차, 30일차, 45일차, 60일차, 70일차 및 90일차)에 수득된 개별적인 하이브리도마 상층액에 대해 적혈구 응집 억제(HI) 테스트를 수행하였다. 종말점(end point)을 계산하기 위해 희석을 수행하였다. mAb 6B8의 하이브리도마 상층액은 29의 HI 역가를 가졌다. 상기 역가는 90일차에도 안정적으로 유지되었다(도 1 참조). 따라서, H5 항원에 대한 mAb를 분비하는 하이브리도마 클론은 장기간 동안 높은 역가를 유지할 수 있었다.
mAb의 이소형 결정(isotyping). 마우스 mAb 이소형결정(isotyping) 키트(Amersham Bioscience, England)를 이용하여 이소형 결정을 수행하였다(데이터는 도시되지 않음). 6B8, 8F10 및 2D10의 이소형은 IgM으로 결정되고 7H10의 이소형은 IgGl으로 결정되었다.
MAb 특이성 분석. H5-서브타입 mAb는 관련된 H5 서브타입, AIV H5N2 및 H5N3 및 비-H5 서브타입 인플루엔자 바이러스, H3N2, H4N1, H7N1, H9N2 및 H10N5와 교차-반응하였다. 교차-반응성(cross-reactivity)을 테스트하기 위해 HI 테스트를 이용하였다. 도 2에 도시된 결과는 H5-서브타입 mAb가 비-H5 서브타입 바이러스 H3N2, H4N1, H7N1, H9N2 및 H10N5에 노출된 경우, 교차 반응이 없었다는 것을 보여주었다. MAb 6B8, 2D10 및 8F10은 H5N2 및 H5N3과 교차-반응성을 가졌다. 표 1은 동결 조직 및 포르말린-고정 조직에서의 개별적인 H5 서브타입 mAb의 효능을 보여준다. 표 1에서, 하기와 같이 관찰된 신호의 강도에 대해 반-정량적(semi-quantitative) 점수를 부여하였다: 없음(absent)(-), 약함(mild)(+), 중간(moderate)(++), 강함(strong) (+++) 및 매우 강함(very strong)(++++). RPMI 1640을 H5-서브타입 mAb의 대조군으로 이용하고, 뉴캐슬 병(Newcastle disease)에 걸린 닭 조직을 H5N1 감염 조직에 대한 대조군으로 이용하였다. 다른 출처로부터의 AI 및 H5 mAb를 본 발명의 H5-서브타입 mAb와의 비교를 위해 이용하였다.
표 1
| mAb | mAb의 유래 | 동결 절편 조직 (frozen sectioned tissue) |
파라핀 절편 조직 |
| 6B8 | F59/04/98 | ++++ | - |
| 7H10 | A/goose/Guandong/97 | - | ++++ |
| AI | 기타 출처 | ++ | - |
| H5 | 기타 출처 | ++ | - |
하기에서 검토된, 면역조직화학적 염색이 H5N AIV에 대한 이 H5 서브타입의 특이성을 확인하였다.
mAb의 바이러스 중화(neutralization). MDCK 세포 및 10일령 배아를 이용하여 50% 조직 배양 감염량(50% tissue culture infections dosage, TCID50) 및 50% 배아 감염량(50% embryo infectious dosage, EID50)을 각각 결정하였다. MDCK 세포들(2 x 104 /ml)을 70% -90%의 합류점(confluence)까지 증식시켰다. 10-1 내지 10-8의 일련의 희석 인자를 이용하여, 개별적인 바이러스로 감염된 요막액을 대상으로 지수성장기(바이러스 감염에 대해 최고 민감도를 갖는 시기)의 MDCK 세포 및 10일령 병아리 배아를 감염시켜 TCID50 및 EID50에 대해 테스트하였다. 비감염 MDCK 세포 및 요막액을 음성 대조군으로 이용하였다. 세포들을 35℃에서 인큐베이션시키고 CPE를 관찰하였다. Reed 및 Muench 수학적 기법(9)을 이용하여, 감염가(infectivity titer)를 TCED50/100 ㎕ 및 1000 EID50/200 ㎕로 표현하고, 개별적인 바이러스를 각각 150 ㎕ 및 100 ㎕ 중에 100 TCID50 및 500 EID50를 갖도록 희석시켰다. 연속적으로 희석된 mAb 6B8은 감염된 MDCK 세포 및 배아에서 바이러스의 100 TCID50 및 500 EID50의 최종 농도를 중화시킬 수 있었다. 표 2를 참조한다. 표 2에 제시된 데이터는 또한 mAb 6B8이 H5N1 바이러스에 대한 중화 활성을 생성할 수 있었다는 것을 보여준다. 표 2의 수치들은 mAb가 감염된 MDCK 세포 및 배아 중 100 TCID50 및 500 EID50의 최종 농도에서 여전히 바이러스를 검출하고 중화시킬 수 있는 것인 H5N1 바이러스의 최고 희석 비율을 반영한다.
표 2
| 감염된 세포 |
mAb | |||
| 6B8 | 7H10 | 8F10 | 2D10 | |
| MDCK 세포 | 130 | 0 | 200 | 200 |
| 배아 | 40 | 0 | 160 | 40 |
이탈 돌연변이체의 선택. 모 바이러스의 연속적인 10-배 희석액을 동일한 부피의 mAb와 혼합하였다. 실온에서 1시간의 인큐베이션 후에, 상기 혼합물을 200 ㎍/ml TPCK-처리 트립신(Sigma) 및 0.001 % DEAE-덱스트란(Sigma)을 포함하는 DMEM 배지 중의 MDCK 세포의 단일층 상에 접종하였다. 35℃에서 7일 후에, 바이러스 상층액을 회수하고 추가적인 선택을 수행하였다. 이탈 돌연변이체의 선택을 위해, H5N1 AIV (A/Vietnam/1203/2004/H5Nl)를 RNA의 공급원으로 이용하였다. 이탈 돌연변이체는 모 서열(parental sequence)와 비교될 클론이었다. 중화성 mAb 6B8을 이용하여 이탈 돌연변이체를 선택하였다. mAb 6B8 중화에 대한 내성을 유발한 점 돌연변이는 HA1 서열 상의 614번 뉴클레오티드에서 일어난 것으로 결정되었다. 상기 돌연변이는 614번 뉴클레오티드의 "A"에서 "C"로의 변화를 포함했고, 이는 205번 아미노산의 라이신으로부터 쓰레오닌으로의 돌연변이를 초래했다. 이 돌연변이가 상기 돌연변이체 바이러스가 mAb 6B8 중화를 회피할 수 있게 하는 능력은 중화 분석법 및 적혈구 응집 억제 분석법에 의해 확인하였다. 이 결과는 mAb 6B8이 헤마글루티닌 상의 205번 아미노산을 포함하는 에피토프를 표적화한다는 것을 나타냈다. 동일한 방법에 의해 mAb 8F10 및 2D10 각각에 대해 두개의 다른 중화 에피토프를 확인하였다. 결과가 표 3에 표시되며, 이는 AIV (A/Vietnam/1203/2004 H5N1)의 헤마글루티닌 분자 상의 mAb 중화 에피토프의 위치를 보여준다.
표 3
| 이탈 돌연변이체 |
에피토프 | 뉴클레오티드 | 뉴클레오티드 변화 |
아미노산 | 아미노산 변화 |
| 6B8a | 1 | 614 | A → C | 205 | Lys → Thr |
| 6B8b | 1 | 615 | G → T | 205 | Lys → Asn |
| 8F10a | 2 | 629 | C → T | 210 | Pro → Leu |
| 8F10b | 2 | 628 | C → T | 210 | Pro → Ser |
| 2D10a | 3 | 524 | C → T | 175 | Thr → Ser |
| 2D10b | 3 | 523 | A → G | 175 | Thr → Ala |
웨스턴 블롯. 재조합 H5N1-HA1 단백질에 10% SDS-PAGE를 수행하였다. 분리된 단백질을 니트로셀룰로오스 막에 고정화시켰다. 상기 막을 Tween-20을 함유한 PBS 중의 5% 탈지유로 1시간 동안 블록킹시켰다. PBS-Tween으로 5분씩 3회 세척한 후, 상기 막을 개별적인 mAb와 인큐베이션시키고, 뒤이어 HRP-접합 토끼 항-마우스 Ig (1:2000)와 인큐베이션시켰다. 그 후, 상기 막을 3,3'-디아미노벤지딘(DAB)으로 5분 동안 현상시켰다. PBS-Tween에 의한 세정으로 상기 반응을 중단시켰다. 각 인큐베이션 후에, 시약을 5분씩 3회, PBS-Tween으로 세척하였다. MAb 7H10는 정제된 재조합 HA1으로부터 유래되었기 때문에, 이를 양성 대조군으로 이용하였고, RPMI 1640을 음성 대조군으로 이용하였다. 도 3에 도시된 바와 같이, H5-서브타입 MAb 7H10은 재조합 H5N1-HA1 단백질과 반응할 수 있다. 니트로셀룰로오스 막에 형성된 밴드는 36 kDa이었다. 이는 재조합 단백질의 분자량과 동등했다. 반면에, mAb 6B8, 8F10, 2D10 및 RPMI 1640은 음성 결과를 가져왔다. 6B8 및 나머지 mAb는 원형 형태(native form)의 바이러스 단백질을 표적화하기 때문에, 이 그룹의 mAb는 웨스턴 블롯에 의해 상기 바이러스 단백질을 검출할 수 없을 것이다. 웨스턴 블롯에서 이용된 SDS-PAGE는 원형 단백질을 언폴딩(unfold)시키고 그들을 선형화하여, 검출을 불가능하게 할 것이다.
실시예 4
mAb 7H10의 선형 에피토프의 맵핑
H5-서브타입 AIV의 HA1 유전자를 PCR에 의해 3개의 중첩 단편으로 나누고 히스티딘 융합 단백질(histidine fusion protein)로 발현시켰다. mAb 7H10에 의한 웨스턴 블롯 분석은 에피토프가 주로 단편 B 및 C의 중첩 영역(아미노산 201-226)에서 발견된다는 것을 밝혔다. 이 에피토프의 C 말단의 위치를 결정하기 위해, 8개의 절단된 단편들을 설계하고 웨스턴 블롯에 의해 mAb 7H10으로 스크리닝하였다(도 7a 및 7b). HA1 상의 251번 아미노산이 7H10에 대한 에피토프의 C-말단 아미노산으로 확인되었다. 이 에피토프의 N 말단의 위치를 결정하기 위해, 8개의 돌연변이된 단편들을 설계하고 mAb 7H10으로 스크리닝하였다. 8개의 돌연변이체 중에서, HA1 상의 240번 내지 247번 아미노산을 특정한 프라이머에 의해 개별적으로 알라닌으로 변화시켰다. 웨스턴 블롯 결과에 따르면, 상기 에피토프의 N-말단 아미노산은 HA1 상의 244번 아미노산이다(도 7c 및 7d). 이 결과들은 mAb 7H10에 의해 표적화된 선형 에피토프가 H5-서브타입 AW의 헤마글루티닌 상의 244번 아미노산 내지 251번 아미노산에 위치한다는 것을 나타냈다.
실시예 5
면역조직화학
2002년부터 2006년까지의 30개의 H5N1-감염 표본을 테스트하였다. 상기 표본들은 뇌, 신장, 간, 폐 및 췌장과 같은 상이한 종류의 조직 기관을 포함했다. 그들은 파라핀-절편 표본(paraffin-sectioned specimen) 또는 동결 절편(frozen section)의 형태였다. 상기 표본을 위해 상업적으로 구입가능한 면역퍼옥시다아제 염색 시스템(immunoperoxidase staining system)(Dako Cytomation EnVision + System-HRP (AEC))을 이용하였다. 염색 기법은 2차 항체에 접합된 호스래디쉬 퍼옥시다아제(horseradish peroxidase) 표지된 중합체에 기반하여 결합된 항체(20)를 인식하기 위한 2 단계(16)를 포함한다. 이 키트는 아비딘 또는 비오틴을 포함하지 않기 때문에, 비-특이적 내생 아비딘-비오틴 활성이 상당히 감소된다.
파라핀-절편(Paraffin-sectioned). 파라핀-절편 표본의 염색 결과가 도 4에 도시된다. 감염된 신장 조직에서 매우 강한 신호가 관찰되었다. 신장 조직 전체를 통해 광범위한 신호의 분포가 관찰되었고, 각 신호는 매우 높은 강도를 가졌다. 반면에, 폐는 분포 및 강도 측면에서 그와 같은 강한 신호를 보이지 않았다. 폐 조직의 상피 내층만이 약하게 염색되었다. 간 조직의 경우, 신호는 드물게 분포되었다. 그러나, 검출된 각 신호는 강력했다. 또한, 감염된 간 조직의 경우, 신호들이 주로 담관의 상피를 따라 검출되었다는 것이 주목되었다. 보다 상세한 조사시, 담관은 흡충(fluke)에 의해 감염된 것으로 관찰되었다. 이 결과는 mAb 7H10이 H5N1 감염 포르말린-고정 조직으로부터 H5 항원을 재생(retrieval)시킬 수 있는 H5-서브타입 AIV 단일클론 항체라는 것을 보여준다.
동결-절편(Frozen-sectioned). 동결-절편 표본의 염색 결과가 도 5에 도시된다. 항체 6B8은 상이한 년도로부터의 모든 표본에 대해 양성 신호를 강력하게 검출할 수 있었다. 이 염색된 조직들의 현미경 사진은 염색된 것이 이 감염된 뇌 조직의 뉴런이라는 것을 명확하게 보여준다. 동결 절편 및 파라핀 절편 모두에 대해, 조직의 종류에 관계 없이, 조직의 핵만이 염색된다는 것이 명확하게 관찰되었다. H5N1 바이러스로 감염된 조류의 주요한 병변(20)은 신장 및 뇌 조직이었다. 상기 표 1의 데이터는 본 발명의 mAb가 H5-서브타입 AIV를 다른 출처로부터의 조류 인플루엔자로부터 구별할 수 있는 능력을 갖는다는 것을 입증한다.
실시예 6
AC-ELISA의 수행(development)
하기와 같이 ELISA 방법으로 단일클론 항체 7H10 및 6B8을 평가하였다: 6B8 (IgM)을 반-로그 증가(half-log increment)로 연속적으로 희석하고 96-웰 편평-기부 마이크로타이터 플레이트(flat-bottomed microtiter plate) (Nunc, Demark)를 코팅하기 위해 이용하였다. 포획 항체(capture antibody)를 50 ㎕의 탄산염 완충액(73 mM 탄산수소 나트륨 및 30 mM 탄산 나트륨)에 현탁시켰다. 그 후, 상기 마이크로타이터 플레이트를 37℃에서 1시간 동안 또는 4℃에서 밤새 인큐베이션시켰다. 상기 플레이트를 모든 이후의 인큐베이션 단계들 사이에 0.05% Tween 20을 함유한 PBS(phosphate-buffered saline)(PBS-T)로 3회 세척하고, 모든 희석은 1% 탈지유 함유 PBST로 수행하였다. 상기 플레이트를 50 ㎕의 블록킹 용액(PBS-T 중의 5% 탈지유)와 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하는 것에 의해 블록킹시키고, 세정하고 50 ㎕의 정제된 재조합 H5N1 재조합 HAl (100 ng) 또는 H5 AIV와 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 세정 후에, 50 ㎕의 기니어 피그 단특이성 항체(monospecific antibody) IgG (1:480으로 희석됨)를 첨가하고, 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션시키고, 세척하고, 1:1000으로 희석된 HRP-접합 토끼 항-기니어 피그 면역글로불린 50 ㎕와 인큐베이션시켰다. 50 ㎕의 새로 제조된 기질 용액(o-페닐렌디아민 (OPD))의 첨가에 의해 색을 발색시키고, 490 nm에서의 흡광도를 ELISA 판독기(Tecan, Switzerland)로 판독하였다. mAb 및 단특이성 항체의 최적 유효 희석(optimal working dilution)을 체크보드 적정(checkerboard titration)에 의해 결정하였다. 최적 조건은 본 분석에서 최고 신호-대-잡음 비를 달성하기 위해 H5 AIV (H5N1, H5N2, H5N3)와 비-H5 AIV (H7N1 및 H9N2) 반응을 비교하는 것에 의해 결정하였다. 신호-대-잡음 비(signal-to-noise ratio)는 동종 항원(homologous antigen)의 흡광도를 이종 항원의 흡광도로 나누는 것에 의해 계산하였다.
단일클론 항체 6B8을 AC-ELISA에서 포획 항체 및 검출 항체로 이용하였다. 단일클론 항체 6B8은 ELISA에서 다른 단일클론 항체보다 더 강한 반응성을 보였다. 그와 같은 6B8에 의한 AC-ELISA는 H5 서브타입 AIV 검출에 특이적으로 적용될 수 있고 다른 AIV 서브타입과 반응하지 않는다(도 6a). AC-ELISA의 검출 한계는 0.5 HA 유닛 미만이다(도 6b). 체크보드 적정 후에, 포획 ELISA를 위한 최적 항체 농도는 각 mAb에 대해 포획 항체로서 웰당 600ng이고 검출 다중클론 항체로서 웰당 800 ng으로 결정되었다.
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Claims (48)
- 조류 인플루엔자 바이러스의 H5 서브타입의 헤마글루티닌 외피 당단백질의 입체형태 에피토프(conformational epitope)에 특이적으로 결합하고, ATCC(American Type Culture Collection)에 수탁번호 PTA-8246으로 기탁된 하이브리도마 6B8에 의해 생산되는 단일클론 항체 6B8의 면역학적 결합 특징을 갖는 항체로서, 상기 면역학적 결합 특징은 단일클론 항체 6B8에 의해 결합되는 에피토프로의 결합을 포함하고, 상기 입체형태 에피토프는 GenBank Accession No. AAW80717의 205번 아미노산인 라이신을 포함하는 것인 항체.
- 청구항 1에 있어서, 상기 항체는 단일클론 항체, 단쇄 항체, 항체 단편, 키메라 항체 또는 인간화 항체인 것인 항체.
- 청구항 1에 있어서, 상기 항체는 단일클론 항체인 것인 항체.
- ATCC(American Type Culture Collection)에 수탁번호 PTA-8246으로 기탁된 하이브리도마 6B8에 의해 생산되는 단일클론 항체 6B8.
- 생물학적 표본을 청구항 1, 2, 3, 또는 4에 따른 항체와 접촉시키는 단계를 포함하는, 생물학적 표본에서 H5 서브타입 조류 인플루엔자 바이러스를 검출하는 방법.
- 청구항 5에 있어서, 상기 표본을 조류 인플루엔자 바이러스의 H5 서브타입의 외피 당단백질에 특이적으로 결합하는 결합 단백질과 접촉시키는 단계를 포함하고, 상기 항체는 포획 항체(capture antibody)이고 상기 결합 단백질은 방사성 원자를 포함하거나, 형광 분자에 접합되거나, 또는 효소에 접합된 검출 결합 단백질(detector binding protein)인 것인 방법.
- 청구항 6에 있어서, 상기 항체와 상기 결합 단백질 중 하나 이상은 단일클론 항체인 것인 방법.
- 청구항 6에 있어서, 상기 항체는 고체 표면에 고정화된 것인 방법.
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- 청구항 1, 2, 3, 또는 4에 따른 항체와 상기 항체의 H5 서브타입 조류 인플루엔자 바이러스의 외피 당단백질로의 결합을 검출하는, 하나 이상의 시약을 포함하는, 생물학적 표본에서 H5 서브타입 조류 인플루엔자 바이러스를 검출하기 위한 키트.
- 청구항 10에 있어서, 조류 인플루엔자 바이러스의 H5 서브타입의 외피 당단백질에 특이적으로 결합하는 결합 단백질을 더 포함하고, 상기 항체는 포획 항체이고 상기 결합 단백질은 방사성 원자를 포함하거나, 형광 분자에 접합되거나, 또는 효소에 접합된 검출 결합 단백질인 것인 키트.
- 청구항 11에 있어서, 상기 항체 및 상기 결합 단백질 중 하나 이상은 단일클론 항체인 것인 키트.
- 청구항 11에 있어서, 상기 항체는 고체 표면에 고정화된 것인 키트.
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- H5 서브타입 조류 인플루엔자 바이러스에 감염된 개체의 치료를 위해 사용되는, 청구항 1, 2, 3, 또는 4에 따른 항체.
- 청구항 1, 2, 3, 또는 4에 따른 항체를 포함하는, H5 서브타입 조류 인플루엔자 바이러스에 감염된 개체의 치료용 약제.
- ATCC(American Type Culture Collection)에 수탁번호 PTA-8246으로 기탁된 하이브리도마 6B8에 의해 생산되는 단일클론 항체 6B8에 의해 인식되는 조류 인플루엔자 바이러스 스트레인 A/Vietnam/1203/2004 H5N1의 HA 서열의 에피토프 내에 돌연변이를 포함하여 상기 항체에 의해 중화될 수 없고, 상기 돌연변이는 GenBank Accession No. AAW80717의 205번 아미노산 Lys이 Thr 또는 Asn에 의해 치환된 것인 조류 인플루엔자 바이러스 스트레인 A/Vietnam/1203/2004 H5N1의 중화 이탈 돌연변이체(neutralization escape mutant).
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