CN108693352B - 新城疫病毒抗体检测试剂盒 - Google Patents
新城疫病毒抗体检测试剂盒 Download PDFInfo
- Publication number
- CN108693352B CN108693352B CN201810507579.9A CN201810507579A CN108693352B CN 108693352 B CN108693352 B CN 108693352B CN 201810507579 A CN201810507579 A CN 201810507579A CN 108693352 B CN108693352 B CN 108693352B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- seq
- newcastle disease
- disease virus
- kit
- polypeptide
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 241000711404 Avian avulavirus 1 Species 0.000 title claims abstract description 43
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title abstract description 35
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims abstract description 60
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 59
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 59
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 claims description 21
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 10
- 208000010359 Newcastle Disease Diseases 0.000 claims description 10
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 10
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims description 10
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 claims description 7
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 5
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 5
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 claims description 5
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 claims description 3
- 239000007787 solid Substances 0.000 abstract description 14
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 22
- 238000000034 method Methods 0.000 description 20
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 13
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 12
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 11
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 9
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 8
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 8
- 238000010211 hemagglutination inhibition (HI) assay Methods 0.000 description 7
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 6
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 6
- 101710133291 Hemagglutinin-neuraminidase Proteins 0.000 description 5
- 108010068327 4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase Proteins 0.000 description 4
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 4
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 4
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 3
- 101710181008 P protein Proteins 0.000 description 3
- 101710177166 Phosphoprotein Proteins 0.000 description 3
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 3
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 3
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 3
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 3
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 101001065501 Escherichia phage MS2 Lysis protein Proteins 0.000 description 2
- 102000005348 Neuraminidase Human genes 0.000 description 2
- 108010006232 Neuraminidase Proteins 0.000 description 2
- 102100034574 P protein Human genes 0.000 description 2
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 2
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 2
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 2
- 239000012470 diluted sample Substances 0.000 description 2
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 2
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 239000008213 purified water Substances 0.000 description 2
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 2
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 2
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 2
- DCVYRWFAMZFSDA-ZLUOBGJFSA-N Ala-Ser-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O DCVYRWFAMZFSDA-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- YWENWUYXQUWRHQ-LPEHRKFASA-N Arg-Cys-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)N)C(=O)O YWENWUYXQUWRHQ-LPEHRKFASA-N 0.000 description 1
- RWDVGVPHEWOZMO-GUBZILKMSA-N Arg-Cys-Val Chemical compound CC(C)[C@H](NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N)C(O)=O RWDVGVPHEWOZMO-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- VCJCPARXDBEGNE-GUBZILKMSA-N Asn-Pro-Pro Chemical compound NC(=O)C[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N1[C@H](C(O)=O)CCC1 VCJCPARXDBEGNE-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- KYQJHBWHRASMKG-ZLUOBGJFSA-N Asn-Ser-Cys Chemical compound NC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O KYQJHBWHRASMKG-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- 241000035315 Avulavirus Species 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- LBSKYJOZIIOZIO-DCAQKATOSA-N Cys-Lys-Met Chemical compound CSCC[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CS)N LBSKYJOZIIOZIO-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 1
- 238000009007 Diagnostic Kit Methods 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- QXPRJQPCFXMCIY-NKWVEPMBSA-N Gly-Ala-Pro Chemical compound C[C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)CN QXPRJQPCFXMCIY-NKWVEPMBSA-N 0.000 description 1
- GMTXWRIDLGTVFC-IUCAKERBSA-N Gly-Lys-Glu Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O GMTXWRIDLGTVFC-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- VNNRLUNBJSWZPF-ZKWXMUAHSA-N Gly-Ser-Ile Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O VNNRLUNBJSWZPF-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 1
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- LQSBBHNVAVNZSX-GHCJXIJMSA-N Ile-Ala-Asn Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)O)N LQSBBHNVAVNZSX-GHCJXIJMSA-N 0.000 description 1
- CDGLBYSAZFIIJO-RCOVLWMOSA-N Ile-Gly-Gly Chemical compound CC[C@H](C)[C@H]([NH3+])C(=O)NCC(=O)NCC([O-])=O CDGLBYSAZFIIJO-RCOVLWMOSA-N 0.000 description 1
- UQXADIGYEYBJEI-DJFWLOJKSA-N Ile-His-Asp Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CN=CN1)C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O)N UQXADIGYEYBJEI-DJFWLOJKSA-N 0.000 description 1
- PFPUFNLHBXKPHY-HTFCKZLJSA-N Ile-Ile-Ser Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)O)N PFPUFNLHBXKPHY-HTFCKZLJSA-N 0.000 description 1
- 101710085938 Matrix protein Proteins 0.000 description 1
- 101710127721 Membrane protein Proteins 0.000 description 1
- 206010061298 Mucosal haemorrhage Diseases 0.000 description 1
- YBAFDPFAUTYYRW-UHFFFAOYSA-N N-L-alpha-glutamyl-L-leucine Natural products CC(C)CC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CCC(O)=O YBAFDPFAUTYYRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020004711 Nucleic Acid Probes Proteins 0.000 description 1
- 108090001074 Nucleocapsid Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000711504 Paramyxoviridae Species 0.000 description 1
- DEDANIDYQAPTFI-IHRRRGAJSA-N Pro-Asp-Tyr Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O DEDANIDYQAPTFI-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- DIZLUAZLNDFDPR-CIUDSAMLSA-N Pro-Cys-Gln Chemical compound NC(=O)CC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 DIZLUAZLNDFDPR-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- CXBFHZLODKPIJY-AAEUAGOBSA-N Ser-Gly-Trp Chemical compound C1=CC=C2C(=C1)C(=CN2)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CO)N CXBFHZLODKPIJY-AAEUAGOBSA-N 0.000 description 1
- TZQWJCGVCIJDMU-HEIBUPTGSA-N Thr-Thr-Cys Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)N)O TZQWJCGVCIJDMU-HEIBUPTGSA-N 0.000 description 1
- 108010003533 Viral Envelope Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108020000999 Viral RNA Proteins 0.000 description 1
- 230000010530 Virus Neutralization Effects 0.000 description 1
- 238000012459 agar diffusion assay Methods 0.000 description 1
- 238000007818 agglutination assay Methods 0.000 description 1
- 108010093581 aspartyl-proline Proteins 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 238000010170 biological method Methods 0.000 description 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 241001493065 dsRNA viruses Species 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 1
- 230000035931 haemagglutination Effects 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 239000002198 insoluble material Substances 0.000 description 1
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 1
- 239000004816 latex Substances 0.000 description 1
- 229920000126 latex Polymers 0.000 description 1
- 239000006210 lotion Substances 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 210000004779 membrane envelope Anatomy 0.000 description 1
- 230000034217 membrane fusion Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 1
- 239000002853 nucleic acid probe Substances 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 230000001124 posttranscriptional effect Effects 0.000 description 1
- 244000144977 poultry Species 0.000 description 1
- 108010029020 prolylglycine Proteins 0.000 description 1
- 108010015796 prolylisoleucine Proteins 0.000 description 1
- 230000007026 protein scission Effects 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 210000002345 respiratory system Anatomy 0.000 description 1
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 1
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
- 238000009736 wetting Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
- G01N33/56983—Viruses
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Virology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
本发明涉及新城疫病毒抗体检测试剂盒。本发明的检测试剂盒包括一个或多个固体载体，以及独立地连接于所述一个或多个固体载体上的特定多肽或多肽组合。
Description
技术领域
本发明主要涉及禽用试剂盒及诊断方法。具体而言，本发明涉及可用于对新城疫抗体检测的试剂盒以及检测方法。
背景技术
新城疫(ND)是由NDV(Newcastle disease virus,新城疫病毒)引起的一种极易传染的毁灭性疾病，其死亡率常高达100％，广泛分布于许多国家,OIE将其列为A类疫病。本病的典型特征是呼吸道、消化道粘膜出血，人也有易感性。本病在1926年最早发现于印度尼西亚的巴塔维亚，同年发现于英国新城，因此而得名。
NDV为副黏病毒科副黏病毒属(Avulavirus)的禽副黏病毒I型(APMV-1)。该病毒具有囊膜结构，基因组为单股负链不分节段的RNA病毒，由6种结构蛋白组成，分别为NP、P、M、F、HN和L蛋白。NP蛋白为核衣壳蛋白，氨基酸保守性较高，大部分NDV病毒在NP蛋白443-460位置都具有一高度保守的B细胞表位；P蛋白是病毒RNA合成的必需因子；M、F和HN蛋白与病毒囊膜的形成相关；F蛋白(融合蛋白)和HN蛋白(血凝素神经氨酸酶蛋白)是病毒的主要免疫原性蛋白，可以诱导机体产生中和抗体。F蛋白介导病毒与宿主细胞的膜融合，其蛋白裂解位点与病毒毒力有关。HN蛋白具有神经氨酸酶及促进融合等作用；此外，该蛋白还与病毒毒力相关。L蛋白为病毒最大的蛋白，它在NDV6种结构蛋白中最为保守，具有RNA聚合酶、转录后修饰等生物学活性，可与NP和P蛋白共同构成病毒复制复合体，该复合体参与病毒基因组的转录和复制。
目前，新城疫的实验室检测技术主要包括：常规分离鉴定，血清学方法(血凝试验(HA)、血凝抑制试验(HI)、琼脂扩散实验(AGP)、荧光抗体技术(FA)、酶联免疫吸附试验(ELISA)、病毒中和试验(VNT)、乳胶凝集试验(LAT)、神经氨酸酶试验(NIT)、放射免疫试验(RIA)，分子生物学方法(RNA指纹图谱、核酸探针技术、RT-PCR技术)等。这其中，酶联免疫测定的特异性和敏感性较高且适合检测大量样品，因此，被广泛应用于新城疫病毒抗体的检测。
用于新城疫病毒抗体检测的酶联免疫测定方法主要包括竞争酶联免疫测定(c-ELISA)、阻断酶联免疫测定(b-ELISA)和间接阻断酶联免疫测定。
c-ELISA和b-ELISA的特异性和敏感性都比较高，是被临床普遍接受的新城疫病毒抗体检测方法。但是，c-ELISA和b-ELISA均需使用单克隆抗体，这造成检测成本大幅提高；而且，c-ELISA和b-ELISA的操作繁琐、检测时间长、判据复杂。另一方面，传统的间接ELISA使用源自新城疫病毒的完整蛋白或重组蛋白作为包被抗原来检测血清中的抗体，其成本低于c-ELISA和b-ELISA；但是，由于该方法使用完整蛋白作为抗原，容易发生抗体的错误识别和非特异性识别，因此，其特异性和敏感性都不及c-ELISA和b-ELISA。
因此，需要开发出检测成本低、检测时间短、操作简便、特异性和敏感性高的新城疫病毒抗体检测试剂盒。
发明内容
鉴于上述现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种检测成本低、检测时间短、操作简便、特异性和敏感性高的新城疫病毒抗体检测试剂盒，以及能够用于制备该试剂盒的多肽或多肽组合。
发明人发现：基于抗原表位多肽的间接ELISA方法由于使用抗原表位多肽(20个氨基酸左右的单条多肽通常只包含一个抗原表位)作为包被抗原，因此，特异性很高；但该方法的敏感性往往偏低，单条多肽的敏感性一般不会超过50％。如果能够找到敏感性高的抗原表位多肽，就可以克服传统的间接ELISA的缺点，开发出特异性和敏感性均可媲美c-ELISA和b-ELISA、甚至更高的新城疫病毒抗体检测试剂盒。
发明人为解决上述技术问题进行了深入研究，结果发现了SEQ ID NO：1所示的多肽，用该多肽单独检测新城疫病毒抗体的敏感性为66％、特异性为100％。特别是，当用SEQID NO：1所示的多肽与SEQ ID NO：2所示的多肽组合检测新城疫病毒抗体时，敏感性为83％、特异性为100％；而当用SEQ ID NO：1所示的多肽、SEQ ID NO：2所示的多肽和SEQ IDNO：3所示的多肽组合检测新城疫病毒抗体时，敏感性为86％、特异性为100％；完全可以与c-ELISA方法和b-ELISA方法媲美。
因此，本发明包括：
1.SEQ ID NO：1所示的多肽。
2.SEQ ID NO：1所示的多肽与SEQ ID NO：2所示的多肽的组合。
3.SEQ ID NO：1所示的多肽、SEQ ID NO：2与SEQ ID NO：3所示的多肽的组合
4.上述多肽或多肽组合在制备用于检测对象生物来源的生物样本中是否存在抗新城疫病毒的抗体(IgY)的试剂盒中的用途。
5.一种新城疫病毒抗体(IgY)检测试剂盒，其包括一个或多个固体载体，以及独立地连接于所述一个或多个固体载体上的下述多肽组合1；
多肽组合1
SEQ ID NO：1所示的多肽，以及
SEQ ID NO：2所示的多肽。
6.一种新城疫病毒抗体检测试剂盒，其包括一个或多个固体载体，以及独立地连接于所述一个或多个固体载体上的下述多肽组合2；
多肽组合2
SEQ ID NO：1所示的多肽，
SEQ ID NO：2所示的多肽，以及
SEQ ID NO：3所示的多肽。
7.根据权利要求5或6所述的新城疫病毒抗体(IgY)检测试剂盒，其不包含其它用于检测新城疫病毒抗体(IgY)的探针分子(例如多肽、蛋白或核酸)。
8.下述多肽组合1在制备用于检测对象生物来源的生物样本中是否存在抗新城疫病毒的抗体(IgY)的试剂盒中的用途；
多肽组合1
SEQ ID NO：1所示的多肽，以及
SEQ ID NO：2所示的多肽。
11.下述多肽组合2在制备用于检测对象生物来源的生物样本中是否存在抗新城疫病毒的抗体(IgY)的试剂盒中的用途；
多肽组合2
SEQ ID NO：1所示的多肽，
SEQ ID NO：2所示的多肽，以及
SEQ ID NO：3所示的多肽。
在本说明书中，所述对象生物优选为禽类，更优选为鸡。
在本说明书中，所述生物样本可以是全血、血浆或血清。
上述多肽及试剂盒可以用于检测对象生物来源的生物样本中是否存在抗新城疫病毒的抗体(IgY)。通常，生物样本中的新城疫病毒抗体是由于对象生物被新城疫病毒感染或被新城疫疫苗免疫而产生的，因此，上述多肽及试剂盒可以用于诊断对象生物是否被新城疫病毒感染或新城疫疫苗免疫。
发明的具体实施方式
首先，本发明提供SEQ ID NO：1所示的多肽。发明人发现，用该多肽单独检测新城疫病毒抗体的敏感性为66％、特异性为100％。与基于抗原表位多肽的间接ELISA方法中，单条多肽的一般不超过50％的敏感性相比，SEQ ID NO：1所示的多肽的敏感性是惊人的，而且，其还具有基本上100％特异性，因此，其取得了预料不到的技术效果。
本说明书中，敏感性是指：用“金标准”方法确认的阳性样本中，被其他方法测定为阳性样本的比例。特异性是指：用“金标准”方法确认的阴性样本中，被其他方法测定为阴性样本的比例。对于新城疫病毒抗体的检测而言，本技术领域的“金标准”是血凝抑制试验(HI)。
所述SEQ ID NO：1所示的多肽可以作为检测探针用于制备检测对象生物来源的生物样本中是否存在抗新城疫病毒的抗体的试剂盒。
发明人还发现，当用SEQ ID NO：1所示的多肽与SEQ ID NO：2所示的多肽组合检测新城疫病毒抗体时，敏感性为83％、特异性为100％；而当用SEQ ID NO：1所示的多肽、SEQID NO：2所示的多肽与SEQ ID NO：3所示的多肽组合检测新城疫病毒抗体时，敏感性为86％、特异性为100％；完全可以与c-ELISA方法和b-ELISA方法媲美。因此，本发明还提供下述多肽组合1～3。
多肽组合1
SEQ ID NO：1所示的多肽，以及
SEQ ID NO：2所示的多肽。
多肽组合2
SEQ ID NO：1所示的多肽，以及
SEQ ID NO：3所示的多肽。
多肽组合3
SEQ ID NO：1所示的多肽，
SEQ ID NO：2所示的多肽，以及
SEQ ID NO：3所示的多肽。
上述多肽组合可以作为检测探针用于制备检测对象生物来源的生物样本中是否存在抗新城疫病毒的抗体的试剂盒。
因此，本发明还提供一种新城疫病毒抗体检测试剂盒，其包括一个或多个固体载体，以及独立地连接于所述一个或多个固体载体上的上述多肽组合1、2或者3。
在本说明书中，固体载体可以是一个，也可以是多个，但优选为一个，即全部多肽独立地连接于同一固体载体上。在本发明中，对固体载体没有特殊限制，只要是作为固体或不溶性材料的载体即可。多肽与固体载体的连接可以采用本领域技术人员公知的多肽与固体载体的连接方法来进行。
在本说明书中，所述对象生物优选为禽类，更优选为鸡。
在本说明书中，所述生物样本可以是全血、血浆或血清。
在使用上述试剂盒检测对象生物来源的生物样本中是否存在抗新城疫病毒的抗体的情况下，当所述多肽组合1、2或3中的任意一条或多条多肽对对象生物来源的生物样本有响应时，判定为该对象生物来源的生物样本中存在抗新城疫病毒的抗体(即阳性)；反之，当所述多肽组合1、2或3中没有任何一条多肽对对象生物来源的生物样本有响应时，判定为该对象生物来源的生物样本中不存在抗新城疫病毒的抗体(即阴性)。
在本说明书中，“响应”是指：TMB显色试验中，肉眼可见强于阴性对照点的蓝紫色信号。
实施例
1.多肽的制备与确认
实施例中使用的多肽由吉尔生化(上海)有限公司合成，并通过质谱对其进行了确认。其中，
SEQ ID NO：1：SGWGAPIHDPDYIGGIGKEL。
SEQ ID NO：2：IANCKMTTCRCVNPPGIISQ。
SEQ ID NO：3：GSIPCQASARCPNSCVTGVY。
2.试剂盒(检测芯片)的制备
试剂盒1
采用常规方法在常规的ELISA用固相载体上分别点样上述SEQ ID NO：1所示的多肽的溶液，另外点样一个鸡IgY点作为阳性质控点以及一个PB点作为阴性质控点，制备了检测芯片。
试剂盒2
除了在固相载体上分别点样上述SEQ ID NO：1和2所示的多肽的溶液外，按照与上述试剂盒1相同的制备方法制备了检测芯片，即为试剂盒2。试剂盒3
除了在固相载体上分别点样上述SEQ ID NO：1、2和3所示的多肽的溶液外，按照与上述试剂盒1相同的制备方法制备了检测芯片，即为试剂盒3。
3.用试剂盒进行检测
检验步骤
1)平衡试剂：将所有试剂从冰箱取出后，平衡放置至室温备用。
2)配制洗液：用纯化水或蒸馏水按1:9稀释浓缩洗液，例：50mL浓缩洗液用纯化水或蒸馏水配置成500mL的洗液，并充分混匀。未用完的洗液放4℃冰箱保存，3个月内用完。
3)稀释样品：取待测样品，用血清稀释液，按1:100稀释，例：198uL血清稀释液中加入2uL待测样本，并充分混匀。一次样本检测需使用200uL稀释后的样品。
4)润湿芯片：取出检测所需的检测芯片。加入1mL洗液浸润芯片表面，3min，随后弃去洗液。
5)加样：在本实施案例中，使用单面生物孵育反应器。将稀释完成的样品用移液枪通过加液通气孔加到反应器中，用量为200uL。加样完毕后，用密封帖封闭加液通气孔。
6)样品孵育：将加好样的反应器置于水平摇床上，室温下以150rpm孵育30min。
7)清洗：将反应柱从反应腔中取出，弃去反应液，用洗液冲洗芯片表面和反应腔内部，重复3次(每次用量约12mL，时间1-2min)。
8)酶标二抗孵育：将反应柱与反应腔重新组合并卡紧。揭去密封帖，通过加液通气孔加入辣根过氧化物酶标记的羊抗鸡IgY溶液200uL。再次封闭加液通气孔。随后置于水平摇床上，室温下以150rpm孵育30min。
9)再清洗：将反应柱从反应腔中取出，弃去反应液，用洗液冲洗芯片表面和反应腔内部，重复3次(每次用量约12mL，时间1-2min)。
10)显色：分别在每个反应柱芯片表面加TMB显色液100uL，显色液需均匀的铺于芯片表面。
结果判定：通过肉眼观察，统计每份血清作用下多肽的响应情况(肉眼可见强于阴性对照点的蓝紫色信号，判读为有响应)。即，
对于上述试剂盒1，当检测到SEQ ID NO：1所示的多肽有响应时，判定为新城疫病毒抗体阳性；反之，判定为阴性。
对于上述试剂盒2，当检测到SEQ ID NO：1和/或2所示的多肽有响应时，判定为新城疫病毒抗体阳性；反之，判定为阴性。
对于上述试剂盒3，当检测到SEQ ID NO：1和/或2和/或3所示的多肽有响应时，判定为新城疫病毒抗体阳性；反之，判定为阴性。
对于870份来自中国各地区的鸡血清样本，分别采用上述步骤2中制备的试剂盒(按上述3的步骤)以及常规的血凝抑制试验(HI)进行检测，检测结果如下所示。
表1
敏感性＝536/750*100％＝66％
特异性＝120/120＝100％
表2
敏感性＝623/750*100％＝83％
特异性＝120/120＝100％
表3
敏感性＝645/750*100％＝86％
特异性＝120/120＝100％
由以上可知，上述试剂盒1、2、3仅仅使用了一条或两条或三条多肽作为检测探针即实现了70％或80％或85％以上的检测敏感性，且特异性为100％(而且是采用HI方法验证，不是采用对照试剂盒方法验证)，足以媲美采用c-ELISA方法或b-ELISA方法的试剂盒。需要说明的是，通常认为临床上有应用价值的诊断试剂盒的敏感性和特异性都应在85％以上。
以下，通过实施例对本发明进行更具体的说明，但并不是对本发明技术范围的限定。通过本说明书的记载，本领域技术人员可以容易的对本发明进行修饰/改变，这些包含在本发明的技术范围内。
序列表
<110> 苏州艾比拓生物技术有限公司
<120> 新城疫病毒抗体检测试剂盒
<130> PB00189
<141> 2018-05-24
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Ser Gly Trp Gly Ala Pro Ile His Asp Pro Asp Tyr Ile Gly Gly Ile
1 5 10 15
Gly Lys Glu Leu
20
<210> 2
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Ile Ala Asn Cys Lys Met Thr Thr Cys Arg Cys Val Asn Pro Pro Gly
1 5 10 15
Ile Ile Ser Gln
20
<210> 3
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Gly Ser Ile Pro Cys Gln Ala Ser Ala Arg Cys Pro Asn Ser Cys Val
1 5 10 15
Thr Gly Val Tyr
20
Claims (4)
1.SEQ ID NO：1所示的多肽在制备用于检测对象生物来源的生物样本中是否存在抗新城疫病毒的抗体IgY的试剂盒中的用途，其中，所述对象生物是鸡，所述生物样本是全血、血浆或血清。
2.下述多肽组合1在制备用于检测对象生物来源的生物样本中是否存在抗新城疫病毒的抗体IgY的试剂盒中的用途，其中，所述对象生物是鸡，所述生物样本是全血、血浆或血清；
多肽组合1
SEQ ID NO：1所示的多肽，以及
SEQ ID NO：2所示的多肽。
3.下述多肽组合2在制备用于检测对象生物来源的生物样本中是否存在抗新城疫病毒的抗体IgY的试剂盒中的用途，其中，所述对象生物是鸡，所述生物样本是全血、血浆或血清；
多肽组合2
SEQ ID NO：1所示的多肽，
SEQ ID NO：2所示的多肽，以及
SEQ ID NO：3所示的多肽。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的用途，其中，所述试剂盒用于诊断对象生物是否被新城疫病毒感染或新城疫疫苗免疫。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201810507579.9A CN108693352B (zh) | 2018-05-24 | 2018-05-24 | 新城疫病毒抗体检测试剂盒 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201810507579.9A CN108693352B (zh) | 2018-05-24 | 2018-05-24 | 新城疫病毒抗体检测试剂盒 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN108693352A CN108693352A (zh) | 2018-10-23 |
| CN108693352B true CN108693352B (zh) | 2020-05-01 |
Family
ID=63847911
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201810507579.9A Expired - Fee Related CN108693352B (zh) | 2018-05-24 | 2018-05-24 | 新城疫病毒抗体检测试剂盒 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN108693352B (zh) |
-
2018
- 2018-05-24 CN CN201810507579.9A patent/CN108693352B/zh not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN108693352A (zh) | 2018-10-23 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP3584990B2 (ja) | 抗ヒトインフルエンザウイルス抗体 | |
| JP5432453B2 (ja) | Ａ型インフルエンザウイルス強毒株の検出法 | |
| CN110240635B (zh) | 检测新城疫病毒抗体的多肽及其elisa检测试剂盒 | |
| JPWO2007074812A1 (ja) | Ａ型インフルエンザウイルスｈ５亜型の検出法 | |
| JP5827701B2 (ja) | インフルエンザウイルスｈ５亜型の免疫検出法 | |
| JP5435844B2 (ja) | インフルエンザウイルスｈ５亜型の免疫検出法 | |
| CN108956986B (zh) | 新城疫病毒抗体检测试剂盒 | |
| CN116519944B (zh) | 一种鸡新城疫病毒抗体间接elisa检测方法及其试剂盒 | |
| CN108717124A (zh) | 新城疫病毒抗体检测试剂盒 | |
| CN108727478B (zh) | 一种ibv特异性多肽抗原、抗体、elisa检测试剂盒及其应用 | |
| CN108693352B (zh) | 新城疫病毒抗体检测试剂盒 | |
| CN115112885B (zh) | 一种hpv检测试剂盒及其制备方法和应用 | |
| CN110531079B (zh) | 新城疫病毒抗体检测试剂盒 | |
| CN110531081B (zh) | 新城疫病毒抗体检测试剂盒 | |
| CN110531080B (zh) | 新城疫病毒抗体检测试剂盒 | |
| CN110498844B (zh) | 小反刍兽疫诊断试剂盒 | |
| CN110488017B (zh) | 新城疫病毒抗体检测试剂盒 | |
| CN110488010B (zh) | 新城疫病毒抗体检测试剂盒 | |
| CN110488011B (zh) | 新城疫病毒抗体检测试剂盒 | |
| CN110498845B (zh) | 小反刍兽疫诊断试剂盒 | |
| CN111537736A (zh) | 一种鸡毒支原体抗体的间接elisa检测试剂盒及检测方法 | |
| CN111995666A (zh) | 用于检测微生物的干扰肽和方法 | |
| US8809004B2 (en) | Detection of feline immunodeficiency virus | |
| CN114230642B (zh) | 一种区分h7n9亚型禽流感病毒感染与免疫动物的多肽及检测方法 | |
| US20130137083A1 (en) | Detection of H5N1 Influenza Infection |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| TA01 | Transfer of patent application right |
Effective date of registration: 20191217 Address after: 215123 unit 11, floor 5, building 24, No. 388, Xinping street, Suzhou Industrial Park, Suzhou City, Jiangsu Province Applicant after: Suzhou Youdi Biotechnology Co.,Ltd. Address before: 215123 A4 building, bio nano Park, 218 Xing Hu Street, Suzhou Industrial Park, Suzhou, Jiangsu. Applicant before: SUZHOU EPITOPE BIOTECH INC. |
|
| TA01 | Transfer of patent application right | ||
| TA01 | Transfer of patent application right |
Effective date of registration: 20200325 Address after: 215123 Suzhou Jiangsu Industrial Park, No., No. 398, building D, No. 11 Applicant after: SUZHOU INDUSTRIAL PARK QIANGDONG PHARMACEUTICAL TECHNOLOGY Co.,Ltd. Applicant after: Suzhou Youdi Biotechnology Co.,Ltd. Address before: 215123 unit 11, floor 5, building 24, No. 388, Xinping street, Suzhou Industrial Park, Suzhou City, Jiangsu Province Applicant before: Suzhou Youdi Biotechnology Co.,Ltd. |
|
| TA01 | Transfer of patent application right | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20200501 |
|
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |