JP3584990B2 - 抗ヒトインフルエンザウイルス抗体 - Google Patents
抗ヒトインフルエンザウイルス抗体 Download PDFInfo
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、ヒトインフルエンザウイルスの感染による発症の診断、予防に利用される抗ヒトインフルエンザウイルス抗体に関する。
【０００２】
【従来の技術】
インフルエンザウイルスには３つの型（Ａ、Ｂ及びＣ）があり、インフルエンザの世界的な流行を起こし、多くの死者がでるのはＡ型のヒトインフルエンザウイルスによるものである。
インフルエンザＡ型ウイルスは更にウイルス表面タンパク質であるヘマグルチニン（ ｈａｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ：以下、ＨＡと略す）及びノイラミニダーゼ（以下、ＮＡと略す）の抗原性により多くのサブタイプに分類され、ヒトインフルエンザＡ型ウイルスとしてはＨ１Ｎ１サブクラス、Ｈ２Ｎ２サブクラス、Ｈ３Ｎ２サブクラスの３種が現在知られている。
これらのサブクラス中、Ｈ１Ｎ１サブクラス、Ｈ３Ｎ２サブクラスのウイルスが現在流行しているヒトインフルエンザＡ型ウイルスであり、Ｈ２Ｎ２サブクラスのウイルスは消滅し、１９６８年以降、日本においての分離例は無い。
このインフルエンザＡ型ウイルスのＨＡは、球状部領域（ ｈｅａｄ ｒｅｇｉｏｎ ） と幹領域（ ｓｔｅｍ ｒｅｇｉｏｎ ） という二つの構造の異なった領域で構成され、球状部領域は、ウイルスが標的細胞に結合するための受容体結合部位を含みＨＡの血球凝集活性に関与し、一方、幹領域は、ウイルスのエンベロープと細胞のエンドソーム膜間の膜融合に必要な融合ペプチドを含み、融合活性に関与している〔ウイリー（ Ｗｉｌｅｙ ） ら、アニュアル レビュー オブ バイオケミストリー（ Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ）、第５６巻、第３６５〜３９４頁（１９８７）〕。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
ヒトインフルエンザＡ型ウイルスは周期的にＨＡとＮＡの型を変えて大流行を引起こし、インフルエンザの流行期である冬期前にワクチン接種を受けても、別の型のウイルスによるインフルエンザが流行するためワクチンの効果が期待できないことが多い。しかし、ＨＡ分子やＮＡ分子中の、ウイルスのサブタイプに共通で、抗原変異の生じ難い抗原部位、特に立体構造を認識する抗体を得ることができれば、この抗体はＡ型ウイルスの感染による発症の診断、予防に利用できる。
本発明の目的は、ヒトインフルエンザＡ型ウイルスのサブタイプを特異的に認識する抗体、該抗体を用いるヒトインフルエンザウイルスの検出方法、及び該方法に使用するキットを提供することにある。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明を概説すれば、本発明の第１の発明は抗ヒトインフルエンザウイルス抗体に関し、ハイブリドーマＡＩ３Ｃ（ＦＥＲＭ ＢＰ−４５１６）由来の、下記特性（ａ）及び（ｂ）を有することを特徴とする。
（ａ）ヒトインフルエンザＡ型ウイルスのＨ３Ｎ２サブタイプのヘマグルチニン分子中の幹領域の配列表の配列番号１で表されるＴＧＭＲＮポリペプチド配列と配列表の配列番号２で表されるＱＩＮＧＫＬＮＲ（Ｌ／Ｖ）ＩＥＫポリペプチド配列とを認識する。
（ｂ）ヒトインフルエンザＡ型ウイルスのＨ１Ｎ１サブタイプとＨ２Ｎ２サブタイプのヘマグルチニン分子中の幹領域の配列表の配列番号３で表されるＴＧＬＲＮポリペプチド配列と、配列表の配列番号４で表されるＧＩＴＮＫＶＮＳＶＩＥＫポリペプチド配列とを認識しない。
また本発明の第２の発明はヒトインフルエンザウイルスの検出方法に関し、本発明の第１の発明の抗ヒトインフルエンザウイルス抗体をＨ３Ｎ２サブタイプのヒトインフルエンザウイルスに結合させる工程を包含することを特徴とする。更に本発明の第３の発明は、本発明の第２の発明の方法を用いて検出を行うためのヒトインフルエンザウイルス検出キットに関し、本発明の第１の発明の抗ヒトインフルエンザウイルス抗体を含有していることを特徴とする。
【０００５】
本発明者らは鋭意研究の結果、ヒトインフルエンザＡ型ウイルスのＨ３Ｎ２サブタイプの幹領域に、共通に保存された抗原部位に対する抗体を得ることに成功し、次に、該抗体がヒトインフルエンザＡ型ウイルスのＨ１Ｎ１サブタイプ、Ｈ２Ｎ２サブタイプに全く交さ認識性を示さないことより、Ｈ３Ｎ２サブタイプの確定診断に有用であることを見出し、本発明を完成した。
【０００６】
ヒトインフルエンザＡ型ウイルスのＨ３Ｎ２サブタイプのＨＡ分子幹領域中の共通部位を特異的に認識する抗体は、モノクローナル抗体として、次の様に調製することができる。例えばマウス、モルモット、ウサギのような、ほ乳動物を下記抗原で免疫する。抗原としては次のような物質を使用することができる。Ｈ３Ｎ２サブタイプ、例えばＡ／Ｆｕｋｕｏｋａ ／Ｃ２９／８５、Ａ／Ｓｉｃｈｕａｎ ／２／８７、Ａ／Ｉｂａｒａｋｉ ／１／９０、Ａ／Ｓｕｉｔａ ／１／９０（以上、大阪大学微生物病研究所保存株）、Ａ／Ｐｏｒｔ Ｃｈａｌｍｅｒｓ ／１／７３〔インフルエンザＡ（Ｈ３Ｎ２）、ＡＴＣＣ ＶＲ−８１０〕、Ａ２／Ａｉｃｈｉ ／２／６８〔インフルエンザＡ、ＡＴＣＣ ＶＲ−５４７〕より選択されるウイルス粒子を使用することができる。あるいはこれらのウイルスから得られるＨＡ分子、若しくは遺伝子組換え技術を用いて調製されるＨＡポリペプチド、若しくは本発明の抗体の認識部位、すなわちＨＡ分子中の幹領域の抗原部位を分子内に含有する組換えポリペプチド、又はＨＡ分子中の幹領域の抗原部位を分子内に含有する合成ポリペプチドで免疫することができる。
【０００７】
次に免疫動物より得られた脾臓細胞を、例えばマウスのミエローマ細胞と融合させ、得られるハイブリドーマから、下記（Ａ）〜（Ｃ）の性質を有する抗体を産生する細胞を選択し、該細胞を培養することによって調製することができる。（Ａ）Ｈ３Ｎ２のサブタイプウイルスに結合性を有する。
（Ｂ）Ｈ１Ｎ１サブタイプ及びＨ２Ｎ２サブタイプのウイルス、Ｈ１Ｎ１サブタイプとしては例えばＡ／Ｂａｎｇｋｏｋ ／１０／８３、Ａ／Ｙａｍａｇａｔａ／１２０／８６、Ａ／Ｏｓａｋａ ／９３０／８８、Ａ／Ｓｕｉｔａ ／１／８９（以上、大阪大学微生物病研究所保存株）、Ａ／ＰＲ／８／３４〔インフルエンザ（Ｈ１Ｎ１）、ＡＴＣＣ
ＶＲ−９５〕、Ａ１／ＦＭ／１／４７〔インフルエンザＡ（Ｈ１Ｎ１）、ＡＴＣＣ ＶＲ−９７〕、Ａ／Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ／８／７６〔インフルエンザＡ（Ｈ１Ｎ１）、ＡＴＣＣ ＶＲ−８９７〕、Ａ／ＮＷＳ／３３〔インフルエンザＡ（Ｈ１Ｎ１）、ＡＴＣＣ ＶＲ−２１９〕、Ａ／Ｗｅｉｓｓ ／４３〔インフルエンザＡ（Ｈ１Ｎ１）、ＡＴＣＣ ＶＲ−９６〕、Ａ／ＷＳ／３３〔インフルエンザＡ（Ｈ１Ｎ１）、ＡＴＣＣ ＶＲ−８２５〕、Ｈ２Ｎ２サブタイプとしては例えばＡ／Ｏｋｕｄａ ／５７、Ａ／Ａｄａｃｈｉ／２／５７、Ａ／Ｋｕｍａｍｏｔｏ／１ ／６５、Ａ／Ｋａｉｚｕｋａ ／２／６５、Ａ／Ｉｚｕｍｉ ／５／６５（以上、大阪大学微生物病研究所保存株）、Ａ２／Ｊａｐａｎ ／３０５／５７〔インフルエンザＡ（Ｈ２Ｎ２）、ＡＴＣＣ ＶＲ−１００〕、及びＢ型のウイルス、例えばＢ／Ｎａｇａｓａｋｉ／１／８７（大阪大学微生物病研究所保存株）、Ｂ／Ａｌｌｅｎ ／４５〔インフルエンザＢ、ＡＴＣＣ ＶＲ−１０２〕には結合性を有さない。
【０００８】
ＨＡ分子幹領域中に配列表の配列番号１で表されるアミノ酸配列、及び配列表の配列番号５又は６で表されるアミノ酸配列を有するヒト以外のインフルエンザウイルス、例えばＡ／ｄｕｃｋ／Ｃｚｅｃｈｏｓｌｏｖａｋｉａ／１／５６（Ｈ４Ｎ６）、Ａ／ｃｈｉｋｅｎ／Ｇｅｒｍａｎｙ “Ｎ”／４９（Ｈ１０Ｎ７）（以上、大阪大学微生物病研究所保存株）には結合性を有し、これらのアミノ酸配列を有さないヒト以外のインフルエンザウイルス、例えばＡ／ｗｈｉｓｔｌｉｎｇ ｓｗａｎ／Ｓｈｉｍａｎｅ ／４７６／８３（Ｈ５Ｎ３）、Ａ／ｗｈｉｓｔｌｉｎｇ ｓｗａｎ／Ｓｈｉｍａｎｅ ／３７／８０（Ｈ６Ｎ６）、Ａ／ｔｕｆｔｅｄ ｄｕｃｋ ／Ｓｈｉｍａｎｅ ／１２４Ｒ／８０（Ｈ７Ｎ７）、Ａ／ｔｕｒｋｅｙ／Ｏｎｔａｒｉｏ ／６１１８／６８（Ｈ８Ｎ４）、Ａ／ｔｕｒｋｅｙ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ ／６６（Ｈ９Ｎ２）、Ａ／ｄｕｃｋ／Ｅｎｇｌａｎｄ ／５６（Ｈ１１Ｎ６）（以上、大阪大学微生物病研究所保存株）には結合性を有さない。
【０００９】
（Ｃ）Ｈ３Ｎ２サブタイプのＨＡ分子は認識するが、ＨＡ分子中の球状部領域が関与する血球凝集活性は阻害しない。
【００１０】
このハイブリドーマの調製に関しては、ネーチャー（ Ｎａｔｕｒｅ ）、第２５６巻、第４９５〜４９７頁（１９７５）を基に行う。免疫用マウスとしては、Ｂａｌｂ／ｃ系マウス、Ｂａｌｂ／ｃ系マウスと他系マウスとのＦ１マウスなどが用いられる。免疫はマウス１匹に対して、例えばウイルス粒子（１００〜１０００ＨＡ単位）を抗原として用い、２〜５月間に例えば３回行う。なおマウスの飼育及び脾臓細胞の採取は常法に従う。
【００１１】
ミエローマ細胞としてはＳＰ２／０−Ａｇ１４（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１５８１）、ｐ３×６３Ａｇ８Ｕ．１（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１５９７）、ｐ３×６３Ａｇ８（ＡＴＣＣ ＴＩＢ９）、ｐ３×６３−Ａｇ８．６５３（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１５８０）等が好適に用いられる。脾臓細胞とミエローマ細胞は１：１〜１０：１の割合で混合し、融合はＮａＣｌ（約０．８５％）、ジメチルスルホキシド〔１０〜２０％（ｖ／ｖ）〕及び分子量１０００〜６０００のポリエチレングリコールを含有するリン酸緩衝液（ｐＨ７．２〜７．４）中で、両細胞の混合物を３５〜３７℃で１〜５分間保温することによって行う。融合細胞の選択は、ＨＡＴ培地を用い、生育してくる細胞として選択する。融合細胞のクローン化は限界希釈法にて少なくとも３回繰返して行う。
【００１２】
ハイブリドーマを通常の動物細胞と同様にして培養すれば、その結果培地中に本発明の抗体を得ることができる。また該ハイブリドーマをプリスタン処理のヌードマウス、又はＢａｌｂ／ｃマウスの腹腔内に移植して増殖させることにより腹水中に本発明の抗体を蓄積させることができる。すなわち、これらのマウス腹腔内にプリスタン０．５〜１ｍｇを接種し、その後２〜３週目に腹腔に５×１０６ 〜１×１０７ 個のハイブリドーマを移植する。通常７〜１０日後に腹水が蓄積し、これを採取する。培養物及び腹水中のモノクローナル抗体は通常の手段で精製される。
【００１３】
得られたモノクローナル抗体はＨ３Ｎ２サブタイプのＨＡ分子の幹領域を認識し、詳細には以下の性状を有している。
【００１４】
（ａ）染色試験により、Ｈ３Ｎ２サブタイプで感染したＭＤＣＫ細胞（ＡＴＣＣＣＣＬ３４）を認識し、Ｈ１Ｎ１サブタイプ及びＨ２Ｎ２サブタイプで感染したＭＤＣＫ細胞は認識しない。染色試験は４種類の抗体（本発明のモノクローナル抗体、ウサギ抗マウスイムノグロブリンＧ血清、ヤギ抗ウサギイムノグロブリンＧ血清、ペルオキシダーゼ−ウサギ抗ペルオキシダーゼ複合体）を用い、ジャーナル オブ クリニカル ミクロバイオロジー（Ｊ．Ｃｌｉｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ） 、第２８巻、第１３０８〜１３１３頁（１９９０）に記載の方法に準じ行う。
【００１５】
（ｂ）免疫沈降法により、Ｈ３Ｎ２サブタイプのＨＡ分子を認識し、Ｈ１Ｎ１サブタイプ及びＨ２Ｎ２サブタイプのＨＡ分子は認識しない。
【００１６】
（ｃ）血球凝集試験において、Ｈ１Ｎ１サブタイプ、Ｈ２Ｎ２サブタイプ、Ｈ３Ｎ２サブタイプのそれぞれの血球凝集活性を阻害しない。
【００１７】
（ｄ）ＨＡ分子をコードする遺伝子解析により特定される、Ｈ３Ｎ２サブタイプのＨＡ分子中の幹領域に特有の共通保存領域を認識し、Ｈ１Ｎ１サブタイプ及びＨ２Ｎ２サブタイプのＨＡ分子中の幹領域に特有の共通保存領域は認識しない。
【００１８】
Ｈ３Ｎ２サブタイプのＨＡ分子中の共通保存領域としては、ジャーナル オブビロロジー（Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ）、第６７巻、第２５５２〜２５５８頁（１９９３）に記載のＨ３Ｎ２サブタイプのＨＡ分子中の幹領域の配列表の配列番号１で表されるＴＧＭＲＮポリペプチド配列と配列表の配列番号２で表されるＱＩＮＧＫＬＮＲ（Ｌ／Ｖ）ＩＥＫポリペプチド配列がある。図１にＨＡ分子中の三次構造の模式図〔前出ウイリーら〕、及びＨ３Ｎ２サブタイプのＨＡ分子中の共通保存領域の位置を示す。図中Ａ領域、Ｂ領域で示す両ポリペプチド配列は、図１に示す様にＨＡ分子中の幹領域の中央で互に近接して位置しており、抗体の一例のＨｙｂｒｉｄｏｍａ ＡＩ３Ｃ（ＦＥＲＭ ＢＰ−４５１６）の生産するモノクローナル抗体ＡＩ３Ｃは、該ＨＡ分子中の幹領域の配列表の配列番号１で表されるＴＧＭＲＮポリペプチド配列と配列表の配列番号２で表されるＱＩＮＧＫＬＮＲ（Ｌ／Ｖ）ＩＥＫポリペプチド配列とを認識する。
【００１９】
Ｈ１Ｎ１サブタイプ、及びＨ２Ｎ２サブタイプのＨＡ分子中の共通保存領域としては、前出ジャーナル オブ ビロロジーに記載の、Ｈ１Ｎ１サブタイプ及びＨ２Ｎ２サブタイプのＨＡ分子中の幹領域の配列表の配列番号３で表されるＴＧＬＲＮポリペプチド配列と配列表の配列番号４で表されるＧＩＴＮＫＶＮＳＶＩＥＫポリペプチド配列があるが、本発明の抗体はこれらの部位は認識しない。
【００２０】
本発明により得られる抗体、又は抗体由来のＦａｂ、抗体をコードする遺伝子より調製した抗体、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ等はヒトインフルエンザＡ型ウイルスのＨ３Ｎ２サブクラスのＨＡ分子中の幹領域に特有の共通保存領域を特異的に認識する。したがって、球状部領域の抗原変異に全く影響されることなく、ヒトインフルエンザＡ型ウイルスのＨ３Ｎ２サブクラスを特異的に検出することができ、ヒトインフルエンザウイルスによる発症の診断や予防のための、ヒトインフルエンザウイルスの検出、特に、流行中のウイルスをＨ１Ｎ１サブクラス、Ｈ３Ｎ２サブクラス、Ｂ型ウイルスにタイピングする際に有用である。
【００２１】
ヒトインフルエンザウイルスの検出に際しては、ヒトインフルエンザＡ型ウイルスのＨ１Ｎ１サブクラス、Ｈ２Ｎ２サブクラスは認識し、Ｈ３Ｎ２サブクラスは認識しない抗体、例えばＨｙｂｒｉｄｏｍａ Ｃ１７９（ＦＥＲＭ ＢＰ−４５１７）より産生され（特願平４−２７２５３８号）、前出ジャーナル オブ ビロロジーに記載のモノクローナル抗体、Ｃ１７９と組合せ使用することにより、検体中のＨ１Ｎ１サブクラス、Ｈ２Ｎ２サブクラスとＨ３Ｎ２サブクラスの分別検出を簡便に行うことができる。更に抗Ｂ型ウイルス抗体を組合せることにより、流行中のヒトインフルエンザウイルス（Ｈ１Ｎ１サブタイプ、Ｈ３Ｎ２サブタイプ、Ｂ型ウイルス）のタイピングを正確、迅速、簡便に行うことができる。
【００２２】
本発明の抗体を用いるＨ３Ｎ２サブクラスの検出方法としては、従来この分野でよく知られた免疫測定法、すなわち酵素免疫測定法、ラジオイムノアッセイ免疫比濁法、ラテックス凝集法等が使用でき、中でも酵素免疫測定法が、感度、簡便さにおいて最も実用的である。
【００２３】
検体としては、うがい液より調製したウイルス液、鼻汁より調製したウイルス液、咽頭ぬぐい液より調製したウイルス液等を使用するのが最も簡便である。例えばウイルス液中のウイルスをヒトインフルエンザウイルス高感受性のＭＤＣＫ細胞に感染させ、モノクローナル抗体ＡＩ３Ｃを用い、前出の染色試験を行うことにより、高感度、簡便にＨ３Ｎ２サブタイプを検出することができる。この時、Ｃ１７９、抗Ｂ型ウイルス抗体と併用すれば、検体中のヒトインフルエンザウイルスの検出を効率よく行うことができる。また各ウイルスが混合感染した場合の検体中からも、各型のウイルスを効率よく分別、検出することができる。
【００２４】
また本発明の抗ヒトインフルエンザウイルス抗体を含有するキットを用いることにより、ヒトインフルエンザＡ型ウイルス、Ｈ３Ｎ２サブクラスの検出を簡便に行うことができる。なおキット中には、Ｈ１Ｎ１サブクラス検出用のＣ１７９、Ｂ型ウイルス検出用の抗Ｂ血清を含有させることにより更に簡便に、ヒトインフルエンザウイルスを検出することができる。なおキットに用いる試薬は溶液状でも良いし、凍結乾燥物でも良い。
【００２５】
【実施例】
以下に本発明を実施例により説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００２６】
実施例１
１．ウイルスの調製
Ｈ１Ｎ１サブタイプとしてＡ／ＰＲ／８／３４、Ａ／Ｂａｎｇｋｏｋ ／１０／８３、Ａ／Ｙａｍａｇａｔａ／１２０／８６、Ａ／Ｏｓａｋａ ／９３０／８８、Ａ／Ｓｕｉｔａ ／１／８９、Ｈ２Ｎ２サブタイプとしてＡ／Ｏｋｕｄａ ／５７、Ａ／Ａｄａｃｈｉ／２／５７、Ａ／Ｋｕｍａｍｏｔｏ／１／６５、Ａ／Ｋａｉｚｕｋａ ／２／６５、Ａ／Ｉｚｕｍｉ ／５／６５、Ｈ３Ｎ２サブタイプとしてＡ２／Ａｉｃｈｉ ／２／６８、Ａ／Ｆｕｋｕｏｋａ ／Ｃ２９／８５、Ａ／Ｓｉｃｈｕａｎ ／２／８７、Ａ／Ｉｂａｒａｋｉ ／１／９０、Ａ／Ｓｕｉｔａ ／１／９０、Ｂ型ウイルスとしてＢ／Ｎａｇａｓａｋｉ／１／８７を用い、ヒト以外のインフルエンザウイルスとして、Ｈ４Ｎ６サブタイプとしてはＡ／ｄｕｃｋ／Ｃｚｅｃｈｏｓｌｏｖａｋｉａ／１／５６、Ｈ５Ｎ３サブタイプとしてはＡ／ｗｈｉｓｔｌｉｎｇ ｓｗａｎ／Ｓｈｉｍａｎｅ ／４７６／８３、Ｈ６Ｎ６サブタイプとしてはＡ／ｗｈｉｓｔｌｉｎｇ ｓｗａｎ／Ｓｈｉｍａｎｅ ／３７／８０、Ｈ７Ｎ７サブタイプとしてはＡ／ｔｕｒｆｔｅｄ ｄｕｃｋ／Ｓｈｉｍａｎｅ ／１２４Ｒ／８０、Ｈ８Ｎ４サブタイプとしてはＡ／ｔｕｒｋｅｙ／Ｏｎｔａｒｉｏ ／６１１８／６８、Ｈ９Ｎ２サブタイプとしてはＡ／ｔｕｒｋｅｙ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ ／６６、Ｈ１０Ｎ７サブタイプとしてはＡ／ｃｈｉｃｋｅｎ ／Ｇｅｒｍａｎｙ “Ｎ”／４９、Ｈ１１Ｎ６サブタイプとしてはＡ／ｄｕｃｋ／Ｅｎｇｌａｎｄ ／５６を用い、それぞれのウイルスを１１日齢の発育鶏卵の尿膜腔内に接種し、３４℃で４日間培養後、各ウイルス液を採取した。
【００２７】
２．モノクローナル抗体の調製
（１）実施例１−１で調製したＡ２／Ａｉｃｈｉ ２／６８のウイルス（３２０ＨＡ単位）をフロイント完全アジュバントに使用前に懸濁し、１ヵ月間隔で、Ｂａｌｂ／ｃマウス腹腔内注射により、２度免疫し、その１ヵ月後に、同抗原（３２０ＨＡ単位）のＰＢＳ懸濁液を用い腹腔内注射しブーストした。その３日後に、マウスより脾臓を摘出し、脾細胞を調製した。
マウスミエローマとしてはｐ３×６３Ａｇ８を１０％牛胎児血清添加ＤＭＥ培地で継代後２日間培養したものを、細胞融合前に生理食塩水で洗浄し、調製した。次に脾細胞とミエローマ細胞を細胞数１：５の割合で混合し、遠心分離して上清を除き、沈殿した細胞塊を充分ほぐした後、かくはんしながら、１ｍｌの混合液〔ポリエチレングリコール−４０００（２ｇ）、ＭＥＭ（２ｍｌ）、ジメチルスルホキシド〕に加え、５分間３７℃に保温した後、液の全量が１０ｍｌになるようにゆっくりＭＥＭを加えた。次に、遠心分離後、上清を除き、ゆるやかに細胞をほぐした。これに正常培地〔ＰＲＭＩ−１６４０に牛胎児血清１０％を加えたもの〕３０ｍｌを加え、メスピペットを用いてゆるやかに細胞を懸濁した。
【００２８】
懸濁液を９６穴の培養プレートに分注し、５％のＣＯ２ を含む培養器中で、３７℃で２４時間培養した。次にＨＡＴ培地を加え、１０〜１４日間培養した。続いて培養上清の一部を採り、ハイブリドーマのスクリーニングを行った。
【００２９】
（２）インフルエンザＡ型ウイルスのＨ３Ｎ２サブタイプに保存されているＡ領域、Ｂ領域に反応するモノクローナル抗体を得るために、希釈していない、上記培養上清を１次抗体として用い、３種のサブタイプ（Ｈ３Ｎ２、Ｈ１０Ｎ７、Ｈ１Ｎ１）のそれぞれに感染したＭＤＣＫ細胞の染色試験を行った。染色試験は前出のジャーナル オブ クリニカル ミクロバイオロジーに記載の方法に準じて行った。すなわち９６穴マイクロタイタープレート（ファルコン３０７２：ベクトン ディキンソン社製）上で、ヒトインフルエンザＡ型ウイルスの各サブタイプ株（Ｈ３Ｎ２：Ａ２／Ａｉｃｈｉ ／２／６８、Ｈ１０Ｎ７：Ａ／ｃｈｉｃｋｅｎ ／Ｇｅｒｍａｎｙ “Ｎ”／４９、Ｈ１Ｎ１：Ａ／ＰＲ／８／３４）に感染させたＭＤＣＫ細胞を、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で洗浄後、無水エタノールで室温下、１０分間固定した。次にこれらの細胞を４種類の抗体〔モノクローナル抗体を含有する前記培養上清、ウサギ抗マウスイムノグロブリンＧ血清（オルガノテクニカ社製）の１０００倍希釈液、ヤギ抗ウサギイムノグロブリンＧ血清（オルガノテクニカ社製）の５００倍希釈液、ペルオキシダーゼ−ウサギ抗ペルオキシダーゼ複合体（オルガノテクニカ社製）の１０００倍希釈液〕で連続的に、３７℃、３０分間ずつ反応させ、処理細胞をＰＢＳで洗浄した。最後にペルオキシダーゼ反応を、０．０１％のＨ２ Ｏ２ と０．３ｍｇ／ｍｌの３，３′−ジアミノベンジジン四塩酸のＰＢＳ溶液を用い、グラハム、カルノフスキー（ Ｇｒａｈａｍ、Ｋａｒｎｏｖｓｋｙ ） の方法で行った。染色された細胞は通常の光学顕微鏡で観察し、Ｈ３Ｎ２サブタイプ感染のＭＤＣＫ細胞及びＨ１０Ｎ７サブタイプ感染のＭＤＣＫ細胞をそれぞれ認識する抗体を選抜した。次に該抗体産生の確認された細胞が増殖している穴の細胞を取り出し、限界希釈法を３回行い、目的の細胞をクローニングし、クローニングされたハイブリドーマ株をＨｙｂｒｉｄｏｍａ ＡＩ３Ｃ、該ハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体をモノクローナル抗体ＡＩ３Ｃと命名した。
なお、該モノクローナル抗体ＡＩ３Ｃの開発名はモノクロナール抗体Ｆ４９である。
【００３０】
このＨｙｂｒｉｄｏｍａ ＡＩ３Ｃは、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ ＡＩ３Ｃと表示して、工業技術院生命工学工業技術研究所に、ＦＥＲＭ ＢＰ−４５１６として寄託されている。
【００３１】
（３）プリスタン処理したＢａｌｂ／ｃマウスに上記ハイブリドーマ株を５×１０６ 個／匹マウスの腹腔内に投与した。１０〜２１日後に、腹水ガンが誘発されたマウスから腹水を採り、３０００ｒｐｍ ／５分の遠心処理により固型成分を除去し、腹水液を調製した。腹水液１ｍｌ中には約５ｍｇのモノクローナル抗体ＡＩ３Ｃ（以下、単にＡＩ３Ｃと略す）が含有されていた。ＡＩ３ＣはプロテインＡ−セファロース４Ｂ（ファルマシア社製）で精製された。
【００３２】
３．モノクローナル抗体の性状
（１）実施例１−２−（３）記載の腹水液の１００倍希釈液を段階希釈し、実施例２−（２）記載の染色試験を行い、ＡＩ３Ｃの抗原認識性を検討した。Ｈ１Ｎ１サブタイプとしてはＡ／ＰＲ／８／３４、Ａ／Ｂａｎｇｋｏｋ ／１０／８３、Ａ／Ｙａｍａｇａｔａ／１２０／８６、Ａ／Ｏｓａｋａ ／９３０／８８、Ａ／Ｓｕｉｔａ ／１／８９、Ａ１／ＦＭ／１／４７、Ｈ２Ｎ２サブタイプとしてはＡ／Ｏｋｕｄａ ／５７、Ａ／Ａｄａｃｈｉ／２／５７、Ａ／Ｋｕｍａｍｏｔｏ／１／６５、Ａ／Ｋａｉｚｕｋａ ／２／６５、Ａ／Ｉｚｕｍｉ ／５／６５、Ｈ３Ｎ２サブタイプとしてＡ／Ａｉｃｈｉ ／２／６８、Ａ／Ｆｕｋｕｏｋａ ／Ｃ２９／８５、Ａ／Ｓｉｃｈｕａｎ ／２／８７、Ａ／Ｉｂａｒａｋｉ ／１／９０、Ａ／Ｓｕｉｔａ ／１／９０、Ａ／Ｋｉｔａｋｙｕｓｈｕ／１５９／９３、更にインフルエンザＢ型ウイルスとしてＢ／Ｎａｇａｓａｋｉ／１／８７を用い、ヒトインフルエンザウイルス以外の実施例１−１記載のウイルスも用いた。その結果を表１、表２に示す。
【００３３】
【表１】
【００３４】
【表２】
【００３５】
表１、表２中の数字は実施例１−２−（３）の腹水液の希釈倍数であり、染色力価は染色試験で細胞を染色可能な該腹水液の最大希釈倍数を示す。また表２中のＡ領域アミノ酸配列、Ｂ領域アミノ酸配列とは各サブタイプにおいてＨ３Ｎ２サブタイプのＡ領域、Ｂ領域にそれぞれ対応する領域のアミノ酸配列を配列表の配列番号で示したものであり、配列表の配列番号１、及び配列番号５又は６で示すアミノ酸配列を有するサブタイプのウイルスをＡＩ３Ｃは認識する。
【００３６】
以上、ＡＩ３ＣはすべてのＨ３Ｎ２サブタイプ及びＡ／ｄｕｃｋ／Ｃｚｅｃｈｏｓｌｏｖａｋｉａ／１／５６、Ａ／ｃｈｉｃｋｅｎ ／Ｇｅｖｍａｎｙ “Ｎ”／４９を認識し、他のサブタイプ、Ｂ型ウイルスは認識しなかった。
【００３７】
（２）抗体の血球凝集阻害活性（ＨＩ）は次の様に行った。
抗体としては実施例１−（３）の腹水液を用い、該抗体は使用前に３倍容のレセプター分解酵素（ＲＤＥ：武田薬品工業社製）溶液を加え、３７℃、１８時間反応後、５６℃、４５分間の加熱処理でＲＤＥを失活させ、最終的に腹水液の１６倍希釈液として調製し、被検液とし、その段階希釈液を調製し、次に実施例１−１記載の各ウイルス（１６ＨＡ単位）と混合し、室温で３０分間反応させた。その後、ニワトリ赤血球を加えよく混和し、各ウイルスで赤血球凝集活性に及ぼす抗体の影響を検討した。ＡＩ３Ｃはすべてのサブタイプのウイルスの血球凝集活性に影響を与えなかった。
【００３８】
４．エピトープの決定
ＡＩ３Ｃの認識タンパク質がＨＡ分子であることを免疫沈降反応によって決定した。すなわち、Ｈ３Ｎ２サブタイプのＡ２／Ａｉｃｈｉ ／２／６８を３０分間ＭＤＣＫ細胞に吸着、感染させた後、培地中のメチオニンを１０μＣｉの「３５Ｓ〕メチオニンで置換したＭＥＭで２４時間培養し、感染細胞を標識した。次に該細胞を集め、次にＲＩＰＡ緩衝液〔５０ｍＭトリス（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１％ノニデットＰ−４０、１％デオキシコール酸、０．１％ＳＤＳ〕に再懸濁した。続いて不溶物を遠心除去した後、上清を得た。次に該上清をＡＩ３Ｃと混合し、１時間、４℃で保温した後、プロテインＡ−セファロースＣＬ４Ｂビーズを添加し、室温で２時間保持し、免疫沈降物をビーズに吸着させた。次に該ビーズを集め、ＲＩＰＡ緩衝液で５回洗浄した後、沸騰し、ＡＩ３Ｃの結合タンパク質を遊離させた。次に該タンパク質のＳＤＳ−１２．５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行い、ゲルを固定し、１Ｍサリチル酸ナトリウムに浸してから乾かし、オートラジオグラフィーを行った。ＡＩ３Ｃの結合する標識タンパク質は、その電気泳動パターンより、Ａ２／Ａｉｃｈｉ ／２／６８のＨＡ分子と同定された。同様の試験をＨ１Ｎ１サブタイプ、Ｈ２Ｎ２サブタイプ、他のＨ３Ｎ２サブタイプ及び実施例１−１記載のＢ型ウイルス、ヒト以外のウイルスをそれぞれ用い行った。ＡＩ３ＣはすべてのＨ３Ｎ２サブタイプ、Ａ／ｄｕｃｋ／Ｃｚｅｃｈｏｓｌｏｖａｋｉａ／１／５６、及びＡ／ｃｈｉｃｋｅｎ ／Ｇｅｒｍａｎｙ “ Ｎ ”／４９のＨＡ分子と特異的に免疫沈降した。これらのウイルスのＨＡ分子の幹領域に共通に保存されているアミノ酸配列は前出の配列番号１で表されるアミノ酸配列、及び配列番号２、５、６で表されるアミノ酸配列であり、ＡＩ３Ｃのエピトープはこの両アミノ酸配列と決定した。
【００３９】
実施例２
１．Ｃ１７９の調製
プリスタン処理したＢａｌｂ／ｃマウスにＨｙｂｒｉｄｏｍａ Ｃ１７９（ＦＥＲＭ ＢＰ−４５１７）を５×１０６ 個／匹マウスの腹腔内に投与した。１０〜２１日後に、腹水ガンが誘発されたマウスから腹水を採り、３０００ｒｐｍ ／５分の遠心処理により固型成分を除去し、腹水液を調製した。腹水液１ｍｌ中には約５ｍｇのモノクローナル抗体Ｃ１７９（以下、単にＣ１７９と略す）が含有されていた。Ｃ１７９はプロテインＡ−セファロース４Ｂ（ファルマシア社製）で精製した。
【００４０】
２．抗Ｂ型ウイルス抗体の調製
実施例１−１に記載のヒトインフルエンザＢ型ウイルス、Ｂ／Ｎａｇａｓａｋｉ／１／８７の５０００ＨＡ単位をフロイント完全アジュバントに使用前に懸濁し、１ヵ月間隔で、ウサギ筋肉内に注射し、二度免疫した。二度目の免疫の１０日後に、心臓より全採血し、抗Ｂ型ウイルス血清を調製した。
【００４１】
３．ヒトインフルエンザウイルス検出キットの作製
実施例１−２−（３）記載のＡＩ３ＣのＰＢＳ溶液（１ｍｇ／ｍｌ）１ｍｌ、実施例２−１記載のＣ１７９のＰＢＳ溶液（１ｍｇ／ｍｌ）１ｍｌ、及び実施例２−２記載の抗Ｂ型ウイルス血清１ｍｌをそれぞれ５ｍｌ容のバイアルに分注し、凍結乾燥を行い、それぞれの凍結乾燥標品を得た。次にこれらの標品と、抗体溶解、希釈用の１％ブロックエース（雪印社製）含有ＰＢＳ１００ｍｌ入バイアルを組合せ、ヒトインフルエンザウイルス検出キットを作製した。
【００４２】
実施例３
１．臨床分離株のタイピング
１９６８年以降に患者より分離された分離株８０株（大阪府立公衆衛生研究所保存株）のタイピングを行った。
すなわち、９６穴マイクロプレート（コーニング２６８６０）の各穴にＭＤＣＫ細胞を１×１０４ 個ずつ分注し、翌日、各分離株のウイルス液２５μｌを１株につき３穴分注し、３５℃、４５分間保温し、ウイルスを感染させた。
各穴をＰＢＳで洗浄後、０．５％トラガカントゴム（和光純薬社製）、及び５μｇ／ｍｌのトリプシンを含有するイーグルＭＥＭ１００μｌを添加した。これを３５℃で１６時間保温した後、添加液を除去し、各穴をＰＢＳで洗浄した。次に各穴の細胞を、室温下、無水エタノールで１０分間固定した。次に実施例２で作製したキットを用い、ＡＩ３Ｃ溶液（１ｍｇ／ｍｌ）の１０００倍希釈液、Ｃ１７９溶液（１ｍｇ／ｍｌ）の１０００倍希釈液、抗Ｂ型血清（原血清濃度）の１０００倍希釈液を調製し、これらの抗体希釈液を用い、各細胞の染色試験を行った。すなわち、各分離株が感染した３穴のうち、１穴にはＡＩ３Ｃ希釈液、他の１穴にはＣ１７９希釈液、残りの１穴には抗Ｂ型ウイルス血清希釈液の各１００μｌをそれぞれの穴で反応させた後、ウサギ抗マウスイムノグロブリンＧ血清の１０００倍希釈液１００μｌ、ヤギ抗ウサギイムノグロブリン血清の５００倍希釈液１００μｌ、ペルオキシダーゼ−ウサギ抗ペルオキシダーゼ複合体の１０００倍希釈液１００μｌで連続的に、３７℃、３０分間ずつ反応させ、処理細胞をＰＢＳで洗浄した。最後にペルオキシダーゼ反応を、０．０１％のＨ２ Ｏ２ と０．３ｍｇ／ｍｌの３，３′−ジアミノベンジジン四塩酸のＰＢＳ溶液１００μｌを用い、各細胞を染色し、各穴を水道水で洗浄し、乾燥させた。染色させた細胞はフォーカスとして３穴のうち、いずれか１穴分に形成され、可視化できた。可視化が困難な場合は通常の光学顕微鏡で観察し、Ｈ１Ｎ１サブタイプ、Ｈ３Ｎ２サブタイプ及びＢ型のいずれかであるかのタイピングを行った。該方法に従って行われたタイピングの結果を、従来法の血清学的に赤血球凝集抑制反応でタイピングされた結果と比較した。その結果を下記表３に示す。
【００４３】
【表３】
【００４４】
表３に示す様に従来法ではＨ１Ｎ１サブタイプと判定されていた２分離株が、Ｈ１Ｎ１サブタイプとＨ３Ｎ２サブタイプのウイルスの混合物であることも判明し、本発明により各分離株のタイピングを正確に行うことができた。
【００４５】
なおフェレット免疫血清としては、Ａ／Ｋｕｍａｍｏｔｏ／３７／７９（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／Ｂａｎｇｋｏｋ ／１０／８３（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／Ｙａｍａｇａｔａ／１２０／８６（Ｈ１Ｎ１）でそれぞれフェレットを免疫して得たＨ１Ｎ１サブタイプ判定用血清、Ａ／Ｉｓｈｉｋａｗａ／７／３２（Ｈ３Ｎ２）、Ａ／Ｐｈｉｌｌｉｐｐｉｎ／２／８２（Ｈ３Ｎ２）、Ａ／Ｆｕｋｕｏｋａ ／Ｃ２９／８５（Ｈ３Ｎ２）、Ａ／Ｓｉｃｈｕａｎ ／２／８７（Ｈ３Ｎ２）でそれぞれフェレットを免疫して得たＨ３Ｎ２サブタイプ判定用血清、Ｂ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ ／２２２／７９、Ｂ／Ｉｂａｒａｋｉ ／２／８５、Ｂ／Ｙａｍａｇａｔａ／１６／８８、Ｂ／Ａｉｃｈｉ ／５／８８でそれぞれフェレットを免疫して得たＢ型ウイルス判定用血清（以上、大阪府立公衆衛生研究所保有）を用いた。
【００４６】
２．臨床検体中のウイルスのタイピング
１９９３〜１９９４年発症の患者のうがい液１０ｍｌを４℃、３０００回転、３０分間の遠心分離を行い、上澄液を調製した。次にこの上澄液をウイルス液検体とし、実施例３−１に従い、ウイルス感染細胞の染色試験を行った。
すなわち、２４穴マイクロプレート（コーニング２５８２０１）の各穴にＭＤＣＫ細胞を１×１０４ 個ずつ分注し、翌日、ウイルス液検体０．８ｍｌを１検体につき３穴分注し、３５℃、４５分間保温し、ウイルスを感染させた。次に各穴をＰＢＳで洗浄後、５μｇ／ｍｌのトリプシンを含有するイーグルＭＥＭ１ｍｌを添加した。これを３５℃で４０時間保温後、添加液を除去し、各穴をＰＢＳで洗浄し、以下、ＡＩ３Ｃ、Ｃ１７９、抗Ｂ型ウイルス血清を用い、各細胞の染色試験を行った。
また、ウイルス感染後、３５℃で４日間保温した各細胞についても、同様に染色試験を行った。
なお、従来法として、２４穴マイクロプレートの各穴にＭＤＣＫ細胞を１×１０４ 個ずつ分注し、翌日、ウイルス液検体０．８ｍｌを１検体につき４穴分注し、３５℃、４５分間保温し、ウイルスを感染させた。
【００４７】
各穴をＰＢＳで洗浄後、５μｇ／ｍｌのトリプシンを含有するイーグルＭＥＭ１ｍｌを添加し、３５℃、４日間培養した。培養４日目に細胞変性を観察し、変性のみられた検体につき当該穴の細胞培養液の血球凝集活性を測定した。また変性のみられなかった検体については再度、ウイルス液によるＭＤＣＫ細胞感染を行い、４日後に再度細胞変性の有無を確認し、細胞変性のみられた検体は当該穴の細胞培養液の血球凝集活性を測定した。
すなわち、０．５％ヒヨコ赤血球５０μｌに細胞培養液５０μｌを混合し、３０分後の凝集の有無より、ヒトインフルエンザウイルスの有無を判定した。ヒトインフルエンザウイルスの存在が確認された細胞培養液については、Ｈ１Ｎ１サブタイプ、Ｈ３Ｎ２サブタイプ、Ｂ型ウイルス判定用のフェレット免疫血清、すなわち、Ａ／Ｙａｍａｇａｔａ／３２／８９（Ｈ１Ｎ１）でフェレットを免疫して得たＨ１Ｎ１サブタイプ判定用血清、Ａ／Ｏｓａｋａ ／１０８９／９３（Ｈ３Ｎ２）、及びＡ／Ｋｉｔａｋｙｕｓｈｕ／１５９／９３（Ｈ３Ｎ２）でそれぞれフェレットを免疫して得たＨ３Ｎ２サブタイプ判定用血清、Ｂ／Ｂａｎｇｋｏｋ ／６３／９０及びＢ／Ｍｉｅ ／１／９３でそれぞれフェレットを免疫し得たＢ型ウイルス判定用血清（以上、大阪府立公衆衛生研究所保有）を用い、該各血清の赤血球凝集抑制反応でタイピングを行った。すなわち各血清２５μｌごとに、細胞培養液２５μｌを添加し、３７℃、１時間保温した後、０．５％ヒヨコ赤血球５０μｌを混合し、３０分後の凝集の有無より、ヒトインフルエンザウイルスのタイピングを行った。
本発明の方法と、従来法の結果を表４に示す。
【００４８】
【表４】
【００４９】
本発明方法ではうがい液より調製したウイルス液検体を細胞に感染後、２日後には、２５／３３（７６％）をタイピングすることができ、更に保温を続けた場合、従来法のタイピングと結果が完全に一致し、１９９３〜１９９４年に流行のウイルスはＨ３Ｎ２サブタイプと決定した。
【００５０】
従来法において使用するフェレット血清は、流行中のヒトインフルエンザウイルス株を分離し、フェレットを免疫し、調製して得ているため、ヒトインフルエンザウイルスの抗原性の変化により、その結合活性消失が生じること、よって常に、最新、複数の抗血清を準備する必要がある。また、最近、フェレットが入手困難であり、自家繁殖の結果、高力価血清の調製が困難となっている。
【００５１】
一方、本発明方法は、検体調製後、ウイルスの増殖力が強い場合は２日後に、タイピングが可能なこと、Ｈ１Ｎ１サブタイプ検出用抗体、Ｈ３Ｎ２サブタイプ検出用抗体が、それぞれのサブタイプの抗原変化の影響を受けないこと、高力価の抗体がモノクローナル抗体として常に安定して供給されること等で特に優れている。
【００５２】
【発明の効果】
本発明の抗ヒトインフルエンザウイルス抗体、その検出方法及び本発明のキットを用いることにより、インフルエンザウイルス分離株だけでなく、患者のうがい液からも迅速に高感度でかつ正確にインフルエンザウイルスを検出でき、しかも、同時にタイピングを行うことができる。
その結果、短時間に大量の検体のタイピングが可能となり、その年におけるインフルエンザの流行予測が迅速に行えることになる。
【００５３】
【配列表】
【００５４】
【００５５】
【００５６】
【００５７】
【００５８】
【００５９】
【００６０】
【００６１】
【００６２】
【００６３】
【００６４】
【００６５】
【００６６】
【図面の簡単な説明】
【図１】ヘマグルチニン分子の三次構造の模式図である。
【産業上の利用分野】
本発明は、ヒトインフルエンザウイルスの感染による発症の診断、予防に利用される抗ヒトインフルエンザウイルス抗体に関する。
【０００２】
【従来の技術】
インフルエンザウイルスには３つの型（Ａ、Ｂ及びＣ）があり、インフルエンザの世界的な流行を起こし、多くの死者がでるのはＡ型のヒトインフルエンザウイルスによるものである。
インフルエンザＡ型ウイルスは更にウイルス表面タンパク質であるヘマグルチニン（ ｈａｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ：以下、ＨＡと略す）及びノイラミニダーゼ（以下、ＮＡと略す）の抗原性により多くのサブタイプに分類され、ヒトインフルエンザＡ型ウイルスとしてはＨ１Ｎ１サブクラス、Ｈ２Ｎ２サブクラス、Ｈ３Ｎ２サブクラスの３種が現在知られている。
これらのサブクラス中、Ｈ１Ｎ１サブクラス、Ｈ３Ｎ２サブクラスのウイルスが現在流行しているヒトインフルエンザＡ型ウイルスであり、Ｈ２Ｎ２サブクラスのウイルスは消滅し、１９６８年以降、日本においての分離例は無い。
このインフルエンザＡ型ウイルスのＨＡは、球状部領域（ ｈｅａｄ ｒｅｇｉｏｎ ） と幹領域（ ｓｔｅｍ ｒｅｇｉｏｎ ） という二つの構造の異なった領域で構成され、球状部領域は、ウイルスが標的細胞に結合するための受容体結合部位を含みＨＡの血球凝集活性に関与し、一方、幹領域は、ウイルスのエンベロープと細胞のエンドソーム膜間の膜融合に必要な融合ペプチドを含み、融合活性に関与している〔ウイリー（ Ｗｉｌｅｙ ） ら、アニュアル レビュー オブ バイオケミストリー（ Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ）、第５６巻、第３６５〜３９４頁（１９８７）〕。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
ヒトインフルエンザＡ型ウイルスは周期的にＨＡとＮＡの型を変えて大流行を引起こし、インフルエンザの流行期である冬期前にワクチン接種を受けても、別の型のウイルスによるインフルエンザが流行するためワクチンの効果が期待できないことが多い。しかし、ＨＡ分子やＮＡ分子中の、ウイルスのサブタイプに共通で、抗原変異の生じ難い抗原部位、特に立体構造を認識する抗体を得ることができれば、この抗体はＡ型ウイルスの感染による発症の診断、予防に利用できる。
本発明の目的は、ヒトインフルエンザＡ型ウイルスのサブタイプを特異的に認識する抗体、該抗体を用いるヒトインフルエンザウイルスの検出方法、及び該方法に使用するキットを提供することにある。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明を概説すれば、本発明の第１の発明は抗ヒトインフルエンザウイルス抗体に関し、ハイブリドーマＡＩ３Ｃ（ＦＥＲＭ ＢＰ−４５１６）由来の、下記特性（ａ）及び（ｂ）を有することを特徴とする。
（ａ）ヒトインフルエンザＡ型ウイルスのＨ３Ｎ２サブタイプのヘマグルチニン分子中の幹領域の配列表の配列番号１で表されるＴＧＭＲＮポリペプチド配列と配列表の配列番号２で表されるＱＩＮＧＫＬＮＲ（Ｌ／Ｖ）ＩＥＫポリペプチド配列とを認識する。
（ｂ）ヒトインフルエンザＡ型ウイルスのＨ１Ｎ１サブタイプとＨ２Ｎ２サブタイプのヘマグルチニン分子中の幹領域の配列表の配列番号３で表されるＴＧＬＲＮポリペプチド配列と、配列表の配列番号４で表されるＧＩＴＮＫＶＮＳＶＩＥＫポリペプチド配列とを認識しない。
また本発明の第２の発明はヒトインフルエンザウイルスの検出方法に関し、本発明の第１の発明の抗ヒトインフルエンザウイルス抗体をＨ３Ｎ２サブタイプのヒトインフルエンザウイルスに結合させる工程を包含することを特徴とする。更に本発明の第３の発明は、本発明の第２の発明の方法を用いて検出を行うためのヒトインフルエンザウイルス検出キットに関し、本発明の第１の発明の抗ヒトインフルエンザウイルス抗体を含有していることを特徴とする。
【０００５】
本発明者らは鋭意研究の結果、ヒトインフルエンザＡ型ウイルスのＨ３Ｎ２サブタイプの幹領域に、共通に保存された抗原部位に対する抗体を得ることに成功し、次に、該抗体がヒトインフルエンザＡ型ウイルスのＨ１Ｎ１サブタイプ、Ｈ２Ｎ２サブタイプに全く交さ認識性を示さないことより、Ｈ３Ｎ２サブタイプの確定診断に有用であることを見出し、本発明を完成した。
【０００６】
ヒトインフルエンザＡ型ウイルスのＨ３Ｎ２サブタイプのＨＡ分子幹領域中の共通部位を特異的に認識する抗体は、モノクローナル抗体として、次の様に調製することができる。例えばマウス、モルモット、ウサギのような、ほ乳動物を下記抗原で免疫する。抗原としては次のような物質を使用することができる。Ｈ３Ｎ２サブタイプ、例えばＡ／Ｆｕｋｕｏｋａ ／Ｃ２９／８５、Ａ／Ｓｉｃｈｕａｎ ／２／８７、Ａ／Ｉｂａｒａｋｉ ／１／９０、Ａ／Ｓｕｉｔａ ／１／９０（以上、大阪大学微生物病研究所保存株）、Ａ／Ｐｏｒｔ Ｃｈａｌｍｅｒｓ ／１／７３〔インフルエンザＡ（Ｈ３Ｎ２）、ＡＴＣＣ ＶＲ−８１０〕、Ａ２／Ａｉｃｈｉ ／２／６８〔インフルエンザＡ、ＡＴＣＣ ＶＲ−５４７〕より選択されるウイルス粒子を使用することができる。あるいはこれらのウイルスから得られるＨＡ分子、若しくは遺伝子組換え技術を用いて調製されるＨＡポリペプチド、若しくは本発明の抗体の認識部位、すなわちＨＡ分子中の幹領域の抗原部位を分子内に含有する組換えポリペプチド、又はＨＡ分子中の幹領域の抗原部位を分子内に含有する合成ポリペプチドで免疫することができる。
【０００７】
次に免疫動物より得られた脾臓細胞を、例えばマウスのミエローマ細胞と融合させ、得られるハイブリドーマから、下記（Ａ）〜（Ｃ）の性質を有する抗体を産生する細胞を選択し、該細胞を培養することによって調製することができる。（Ａ）Ｈ３Ｎ２のサブタイプウイルスに結合性を有する。
（Ｂ）Ｈ１Ｎ１サブタイプ及びＨ２Ｎ２サブタイプのウイルス、Ｈ１Ｎ１サブタイプとしては例えばＡ／Ｂａｎｇｋｏｋ ／１０／８３、Ａ／Ｙａｍａｇａｔａ／１２０／８６、Ａ／Ｏｓａｋａ ／９３０／８８、Ａ／Ｓｕｉｔａ ／１／８９（以上、大阪大学微生物病研究所保存株）、Ａ／ＰＲ／８／３４〔インフルエンザ（Ｈ１Ｎ１）、ＡＴＣＣ
ＶＲ−９５〕、Ａ１／ＦＭ／１／４７〔インフルエンザＡ（Ｈ１Ｎ１）、ＡＴＣＣ ＶＲ−９７〕、Ａ／Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ／８／７６〔インフルエンザＡ（Ｈ１Ｎ１）、ＡＴＣＣ ＶＲ−８９７〕、Ａ／ＮＷＳ／３３〔インフルエンザＡ（Ｈ１Ｎ１）、ＡＴＣＣ ＶＲ−２１９〕、Ａ／Ｗｅｉｓｓ ／４３〔インフルエンザＡ（Ｈ１Ｎ１）、ＡＴＣＣ ＶＲ−９６〕、Ａ／ＷＳ／３３〔インフルエンザＡ（Ｈ１Ｎ１）、ＡＴＣＣ ＶＲ−８２５〕、Ｈ２Ｎ２サブタイプとしては例えばＡ／Ｏｋｕｄａ ／５７、Ａ／Ａｄａｃｈｉ／２／５７、Ａ／Ｋｕｍａｍｏｔｏ／１ ／６５、Ａ／Ｋａｉｚｕｋａ ／２／６５、Ａ／Ｉｚｕｍｉ ／５／６５（以上、大阪大学微生物病研究所保存株）、Ａ２／Ｊａｐａｎ ／３０５／５７〔インフルエンザＡ（Ｈ２Ｎ２）、ＡＴＣＣ ＶＲ−１００〕、及びＢ型のウイルス、例えばＢ／Ｎａｇａｓａｋｉ／１／８７（大阪大学微生物病研究所保存株）、Ｂ／Ａｌｌｅｎ ／４５〔インフルエンザＢ、ＡＴＣＣ ＶＲ−１０２〕には結合性を有さない。
【０００８】
ＨＡ分子幹領域中に配列表の配列番号１で表されるアミノ酸配列、及び配列表の配列番号５又は６で表されるアミノ酸配列を有するヒト以外のインフルエンザウイルス、例えばＡ／ｄｕｃｋ／Ｃｚｅｃｈｏｓｌｏｖａｋｉａ／１／５６（Ｈ４Ｎ６）、Ａ／ｃｈｉｋｅｎ／Ｇｅｒｍａｎｙ “Ｎ”／４９（Ｈ１０Ｎ７）（以上、大阪大学微生物病研究所保存株）には結合性を有し、これらのアミノ酸配列を有さないヒト以外のインフルエンザウイルス、例えばＡ／ｗｈｉｓｔｌｉｎｇ ｓｗａｎ／Ｓｈｉｍａｎｅ ／４７６／８３（Ｈ５Ｎ３）、Ａ／ｗｈｉｓｔｌｉｎｇ ｓｗａｎ／Ｓｈｉｍａｎｅ ／３７／８０（Ｈ６Ｎ６）、Ａ／ｔｕｆｔｅｄ ｄｕｃｋ ／Ｓｈｉｍａｎｅ ／１２４Ｒ／８０（Ｈ７Ｎ７）、Ａ／ｔｕｒｋｅｙ／Ｏｎｔａｒｉｏ ／６１１８／６８（Ｈ８Ｎ４）、Ａ／ｔｕｒｋｅｙ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ ／６６（Ｈ９Ｎ２）、Ａ／ｄｕｃｋ／Ｅｎｇｌａｎｄ ／５６（Ｈ１１Ｎ６）（以上、大阪大学微生物病研究所保存株）には結合性を有さない。
【０００９】
（Ｃ）Ｈ３Ｎ２サブタイプのＨＡ分子は認識するが、ＨＡ分子中の球状部領域が関与する血球凝集活性は阻害しない。
【００１０】
このハイブリドーマの調製に関しては、ネーチャー（ Ｎａｔｕｒｅ ）、第２５６巻、第４９５〜４９７頁（１９７５）を基に行う。免疫用マウスとしては、Ｂａｌｂ／ｃ系マウス、Ｂａｌｂ／ｃ系マウスと他系マウスとのＦ１マウスなどが用いられる。免疫はマウス１匹に対して、例えばウイルス粒子（１００〜１０００ＨＡ単位）を抗原として用い、２〜５月間に例えば３回行う。なおマウスの飼育及び脾臓細胞の採取は常法に従う。
【００１１】
ミエローマ細胞としてはＳＰ２／０−Ａｇ１４（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１５８１）、ｐ３×６３Ａｇ８Ｕ．１（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１５９７）、ｐ３×６３Ａｇ８（ＡＴＣＣ ＴＩＢ９）、ｐ３×６３−Ａｇ８．６５３（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１５８０）等が好適に用いられる。脾臓細胞とミエローマ細胞は１：１〜１０：１の割合で混合し、融合はＮａＣｌ（約０．８５％）、ジメチルスルホキシド〔１０〜２０％（ｖ／ｖ）〕及び分子量１０００〜６０００のポリエチレングリコールを含有するリン酸緩衝液（ｐＨ７．２〜７．４）中で、両細胞の混合物を３５〜３７℃で１〜５分間保温することによって行う。融合細胞の選択は、ＨＡＴ培地を用い、生育してくる細胞として選択する。融合細胞のクローン化は限界希釈法にて少なくとも３回繰返して行う。
【００１２】
ハイブリドーマを通常の動物細胞と同様にして培養すれば、その結果培地中に本発明の抗体を得ることができる。また該ハイブリドーマをプリスタン処理のヌードマウス、又はＢａｌｂ／ｃマウスの腹腔内に移植して増殖させることにより腹水中に本発明の抗体を蓄積させることができる。すなわち、これらのマウス腹腔内にプリスタン０．５〜１ｍｇを接種し、その後２〜３週目に腹腔に５×１０６ 〜１×１０７ 個のハイブリドーマを移植する。通常７〜１０日後に腹水が蓄積し、これを採取する。培養物及び腹水中のモノクローナル抗体は通常の手段で精製される。
【００１３】
得られたモノクローナル抗体はＨ３Ｎ２サブタイプのＨＡ分子の幹領域を認識し、詳細には以下の性状を有している。
【００１４】
（ａ）染色試験により、Ｈ３Ｎ２サブタイプで感染したＭＤＣＫ細胞（ＡＴＣＣＣＣＬ３４）を認識し、Ｈ１Ｎ１サブタイプ及びＨ２Ｎ２サブタイプで感染したＭＤＣＫ細胞は認識しない。染色試験は４種類の抗体（本発明のモノクローナル抗体、ウサギ抗マウスイムノグロブリンＧ血清、ヤギ抗ウサギイムノグロブリンＧ血清、ペルオキシダーゼ−ウサギ抗ペルオキシダーゼ複合体）を用い、ジャーナル オブ クリニカル ミクロバイオロジー（Ｊ．Ｃｌｉｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ） 、第２８巻、第１３０８〜１３１３頁（１９９０）に記載の方法に準じ行う。
【００１５】
（ｂ）免疫沈降法により、Ｈ３Ｎ２サブタイプのＨＡ分子を認識し、Ｈ１Ｎ１サブタイプ及びＨ２Ｎ２サブタイプのＨＡ分子は認識しない。
【００１６】
（ｃ）血球凝集試験において、Ｈ１Ｎ１サブタイプ、Ｈ２Ｎ２サブタイプ、Ｈ３Ｎ２サブタイプのそれぞれの血球凝集活性を阻害しない。
【００１７】
（ｄ）ＨＡ分子をコードする遺伝子解析により特定される、Ｈ３Ｎ２サブタイプのＨＡ分子中の幹領域に特有の共通保存領域を認識し、Ｈ１Ｎ１サブタイプ及びＨ２Ｎ２サブタイプのＨＡ分子中の幹領域に特有の共通保存領域は認識しない。
【００１８】
Ｈ３Ｎ２サブタイプのＨＡ分子中の共通保存領域としては、ジャーナル オブビロロジー（Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ）、第６７巻、第２５５２〜２５５８頁（１９９３）に記載のＨ３Ｎ２サブタイプのＨＡ分子中の幹領域の配列表の配列番号１で表されるＴＧＭＲＮポリペプチド配列と配列表の配列番号２で表されるＱＩＮＧＫＬＮＲ（Ｌ／Ｖ）ＩＥＫポリペプチド配列がある。図１にＨＡ分子中の三次構造の模式図〔前出ウイリーら〕、及びＨ３Ｎ２サブタイプのＨＡ分子中の共通保存領域の位置を示す。図中Ａ領域、Ｂ領域で示す両ポリペプチド配列は、図１に示す様にＨＡ分子中の幹領域の中央で互に近接して位置しており、抗体の一例のＨｙｂｒｉｄｏｍａ ＡＩ３Ｃ（ＦＥＲＭ ＢＰ−４５１６）の生産するモノクローナル抗体ＡＩ３Ｃは、該ＨＡ分子中の幹領域の配列表の配列番号１で表されるＴＧＭＲＮポリペプチド配列と配列表の配列番号２で表されるＱＩＮＧＫＬＮＲ（Ｌ／Ｖ）ＩＥＫポリペプチド配列とを認識する。
【００１９】
Ｈ１Ｎ１サブタイプ、及びＨ２Ｎ２サブタイプのＨＡ分子中の共通保存領域としては、前出ジャーナル オブ ビロロジーに記載の、Ｈ１Ｎ１サブタイプ及びＨ２Ｎ２サブタイプのＨＡ分子中の幹領域の配列表の配列番号３で表されるＴＧＬＲＮポリペプチド配列と配列表の配列番号４で表されるＧＩＴＮＫＶＮＳＶＩＥＫポリペプチド配列があるが、本発明の抗体はこれらの部位は認識しない。
【００２０】
本発明により得られる抗体、又は抗体由来のＦａｂ、抗体をコードする遺伝子より調製した抗体、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ等はヒトインフルエンザＡ型ウイルスのＨ３Ｎ２サブクラスのＨＡ分子中の幹領域に特有の共通保存領域を特異的に認識する。したがって、球状部領域の抗原変異に全く影響されることなく、ヒトインフルエンザＡ型ウイルスのＨ３Ｎ２サブクラスを特異的に検出することができ、ヒトインフルエンザウイルスによる発症の診断や予防のための、ヒトインフルエンザウイルスの検出、特に、流行中のウイルスをＨ１Ｎ１サブクラス、Ｈ３Ｎ２サブクラス、Ｂ型ウイルスにタイピングする際に有用である。
【００２１】
ヒトインフルエンザウイルスの検出に際しては、ヒトインフルエンザＡ型ウイルスのＨ１Ｎ１サブクラス、Ｈ２Ｎ２サブクラスは認識し、Ｈ３Ｎ２サブクラスは認識しない抗体、例えばＨｙｂｒｉｄｏｍａ Ｃ１７９（ＦＥＲＭ ＢＰ−４５１７）より産生され（特願平４−２７２５３８号）、前出ジャーナル オブ ビロロジーに記載のモノクローナル抗体、Ｃ１７９と組合せ使用することにより、検体中のＨ１Ｎ１サブクラス、Ｈ２Ｎ２サブクラスとＨ３Ｎ２サブクラスの分別検出を簡便に行うことができる。更に抗Ｂ型ウイルス抗体を組合せることにより、流行中のヒトインフルエンザウイルス（Ｈ１Ｎ１サブタイプ、Ｈ３Ｎ２サブタイプ、Ｂ型ウイルス）のタイピングを正確、迅速、簡便に行うことができる。
【００２２】
本発明の抗体を用いるＨ３Ｎ２サブクラスの検出方法としては、従来この分野でよく知られた免疫測定法、すなわち酵素免疫測定法、ラジオイムノアッセイ免疫比濁法、ラテックス凝集法等が使用でき、中でも酵素免疫測定法が、感度、簡便さにおいて最も実用的である。
【００２３】
検体としては、うがい液より調製したウイルス液、鼻汁より調製したウイルス液、咽頭ぬぐい液より調製したウイルス液等を使用するのが最も簡便である。例えばウイルス液中のウイルスをヒトインフルエンザウイルス高感受性のＭＤＣＫ細胞に感染させ、モノクローナル抗体ＡＩ３Ｃを用い、前出の染色試験を行うことにより、高感度、簡便にＨ３Ｎ２サブタイプを検出することができる。この時、Ｃ１７９、抗Ｂ型ウイルス抗体と併用すれば、検体中のヒトインフルエンザウイルスの検出を効率よく行うことができる。また各ウイルスが混合感染した場合の検体中からも、各型のウイルスを効率よく分別、検出することができる。
【００２４】
また本発明の抗ヒトインフルエンザウイルス抗体を含有するキットを用いることにより、ヒトインフルエンザＡ型ウイルス、Ｈ３Ｎ２サブクラスの検出を簡便に行うことができる。なおキット中には、Ｈ１Ｎ１サブクラス検出用のＣ１７９、Ｂ型ウイルス検出用の抗Ｂ血清を含有させることにより更に簡便に、ヒトインフルエンザウイルスを検出することができる。なおキットに用いる試薬は溶液状でも良いし、凍結乾燥物でも良い。
【００２５】
【実施例】
以下に本発明を実施例により説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００２６】
実施例１
１．ウイルスの調製
Ｈ１Ｎ１サブタイプとしてＡ／ＰＲ／８／３４、Ａ／Ｂａｎｇｋｏｋ ／１０／８３、Ａ／Ｙａｍａｇａｔａ／１２０／８６、Ａ／Ｏｓａｋａ ／９３０／８８、Ａ／Ｓｕｉｔａ ／１／８９、Ｈ２Ｎ２サブタイプとしてＡ／Ｏｋｕｄａ ／５７、Ａ／Ａｄａｃｈｉ／２／５７、Ａ／Ｋｕｍａｍｏｔｏ／１／６５、Ａ／Ｋａｉｚｕｋａ ／２／６５、Ａ／Ｉｚｕｍｉ ／５／６５、Ｈ３Ｎ２サブタイプとしてＡ２／Ａｉｃｈｉ ／２／６８、Ａ／Ｆｕｋｕｏｋａ ／Ｃ２９／８５、Ａ／Ｓｉｃｈｕａｎ ／２／８７、Ａ／Ｉｂａｒａｋｉ ／１／９０、Ａ／Ｓｕｉｔａ ／１／９０、Ｂ型ウイルスとしてＢ／Ｎａｇａｓａｋｉ／１／８７を用い、ヒト以外のインフルエンザウイルスとして、Ｈ４Ｎ６サブタイプとしてはＡ／ｄｕｃｋ／Ｃｚｅｃｈｏｓｌｏｖａｋｉａ／１／５６、Ｈ５Ｎ３サブタイプとしてはＡ／ｗｈｉｓｔｌｉｎｇ ｓｗａｎ／Ｓｈｉｍａｎｅ ／４７６／８３、Ｈ６Ｎ６サブタイプとしてはＡ／ｗｈｉｓｔｌｉｎｇ ｓｗａｎ／Ｓｈｉｍａｎｅ ／３７／８０、Ｈ７Ｎ７サブタイプとしてはＡ／ｔｕｒｆｔｅｄ ｄｕｃｋ／Ｓｈｉｍａｎｅ ／１２４Ｒ／８０、Ｈ８Ｎ４サブタイプとしてはＡ／ｔｕｒｋｅｙ／Ｏｎｔａｒｉｏ ／６１１８／６８、Ｈ９Ｎ２サブタイプとしてはＡ／ｔｕｒｋｅｙ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ ／６６、Ｈ１０Ｎ７サブタイプとしてはＡ／ｃｈｉｃｋｅｎ ／Ｇｅｒｍａｎｙ “Ｎ”／４９、Ｈ１１Ｎ６サブタイプとしてはＡ／ｄｕｃｋ／Ｅｎｇｌａｎｄ ／５６を用い、それぞれのウイルスを１１日齢の発育鶏卵の尿膜腔内に接種し、３４℃で４日間培養後、各ウイルス液を採取した。
【００２７】
２．モノクローナル抗体の調製
（１）実施例１−１で調製したＡ２／Ａｉｃｈｉ ２／６８のウイルス（３２０ＨＡ単位）をフロイント完全アジュバントに使用前に懸濁し、１ヵ月間隔で、Ｂａｌｂ／ｃマウス腹腔内注射により、２度免疫し、その１ヵ月後に、同抗原（３２０ＨＡ単位）のＰＢＳ懸濁液を用い腹腔内注射しブーストした。その３日後に、マウスより脾臓を摘出し、脾細胞を調製した。
マウスミエローマとしてはｐ３×６３Ａｇ８を１０％牛胎児血清添加ＤＭＥ培地で継代後２日間培養したものを、細胞融合前に生理食塩水で洗浄し、調製した。次に脾細胞とミエローマ細胞を細胞数１：５の割合で混合し、遠心分離して上清を除き、沈殿した細胞塊を充分ほぐした後、かくはんしながら、１ｍｌの混合液〔ポリエチレングリコール−４０００（２ｇ）、ＭＥＭ（２ｍｌ）、ジメチルスルホキシド〕に加え、５分間３７℃に保温した後、液の全量が１０ｍｌになるようにゆっくりＭＥＭを加えた。次に、遠心分離後、上清を除き、ゆるやかに細胞をほぐした。これに正常培地〔ＰＲＭＩ−１６４０に牛胎児血清１０％を加えたもの〕３０ｍｌを加え、メスピペットを用いてゆるやかに細胞を懸濁した。
【００２８】
懸濁液を９６穴の培養プレートに分注し、５％のＣＯ２ を含む培養器中で、３７℃で２４時間培養した。次にＨＡＴ培地を加え、１０〜１４日間培養した。続いて培養上清の一部を採り、ハイブリドーマのスクリーニングを行った。
【００２９】
（２）インフルエンザＡ型ウイルスのＨ３Ｎ２サブタイプに保存されているＡ領域、Ｂ領域に反応するモノクローナル抗体を得るために、希釈していない、上記培養上清を１次抗体として用い、３種のサブタイプ（Ｈ３Ｎ２、Ｈ１０Ｎ７、Ｈ１Ｎ１）のそれぞれに感染したＭＤＣＫ細胞の染色試験を行った。染色試験は前出のジャーナル オブ クリニカル ミクロバイオロジーに記載の方法に準じて行った。すなわち９６穴マイクロタイタープレート（ファルコン３０７２：ベクトン ディキンソン社製）上で、ヒトインフルエンザＡ型ウイルスの各サブタイプ株（Ｈ３Ｎ２：Ａ２／Ａｉｃｈｉ ／２／６８、Ｈ１０Ｎ７：Ａ／ｃｈｉｃｋｅｎ ／Ｇｅｒｍａｎｙ “Ｎ”／４９、Ｈ１Ｎ１：Ａ／ＰＲ／８／３４）に感染させたＭＤＣＫ細胞を、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で洗浄後、無水エタノールで室温下、１０分間固定した。次にこれらの細胞を４種類の抗体〔モノクローナル抗体を含有する前記培養上清、ウサギ抗マウスイムノグロブリンＧ血清（オルガノテクニカ社製）の１０００倍希釈液、ヤギ抗ウサギイムノグロブリンＧ血清（オルガノテクニカ社製）の５００倍希釈液、ペルオキシダーゼ−ウサギ抗ペルオキシダーゼ複合体（オルガノテクニカ社製）の１０００倍希釈液〕で連続的に、３７℃、３０分間ずつ反応させ、処理細胞をＰＢＳで洗浄した。最後にペルオキシダーゼ反応を、０．０１％のＨ２ Ｏ２ と０．３ｍｇ／ｍｌの３，３′−ジアミノベンジジン四塩酸のＰＢＳ溶液を用い、グラハム、カルノフスキー（ Ｇｒａｈａｍ、Ｋａｒｎｏｖｓｋｙ ） の方法で行った。染色された細胞は通常の光学顕微鏡で観察し、Ｈ３Ｎ２サブタイプ感染のＭＤＣＫ細胞及びＨ１０Ｎ７サブタイプ感染のＭＤＣＫ細胞をそれぞれ認識する抗体を選抜した。次に該抗体産生の確認された細胞が増殖している穴の細胞を取り出し、限界希釈法を３回行い、目的の細胞をクローニングし、クローニングされたハイブリドーマ株をＨｙｂｒｉｄｏｍａ ＡＩ３Ｃ、該ハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体をモノクローナル抗体ＡＩ３Ｃと命名した。
なお、該モノクローナル抗体ＡＩ３Ｃの開発名はモノクロナール抗体Ｆ４９である。
【００３０】
このＨｙｂｒｉｄｏｍａ ＡＩ３Ｃは、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ ＡＩ３Ｃと表示して、工業技術院生命工学工業技術研究所に、ＦＥＲＭ ＢＰ−４５１６として寄託されている。
【００３１】
（３）プリスタン処理したＢａｌｂ／ｃマウスに上記ハイブリドーマ株を５×１０６ 個／匹マウスの腹腔内に投与した。１０〜２１日後に、腹水ガンが誘発されたマウスから腹水を採り、３０００ｒｐｍ ／５分の遠心処理により固型成分を除去し、腹水液を調製した。腹水液１ｍｌ中には約５ｍｇのモノクローナル抗体ＡＩ３Ｃ（以下、単にＡＩ３Ｃと略す）が含有されていた。ＡＩ３ＣはプロテインＡ−セファロース４Ｂ（ファルマシア社製）で精製された。
【００３２】
３．モノクローナル抗体の性状
（１）実施例１−２−（３）記載の腹水液の１００倍希釈液を段階希釈し、実施例２−（２）記載の染色試験を行い、ＡＩ３Ｃの抗原認識性を検討した。Ｈ１Ｎ１サブタイプとしてはＡ／ＰＲ／８／３４、Ａ／Ｂａｎｇｋｏｋ ／１０／８３、Ａ／Ｙａｍａｇａｔａ／１２０／８６、Ａ／Ｏｓａｋａ ／９３０／８８、Ａ／Ｓｕｉｔａ ／１／８９、Ａ１／ＦＭ／１／４７、Ｈ２Ｎ２サブタイプとしてはＡ／Ｏｋｕｄａ ／５７、Ａ／Ａｄａｃｈｉ／２／５７、Ａ／Ｋｕｍａｍｏｔｏ／１／６５、Ａ／Ｋａｉｚｕｋａ ／２／６５、Ａ／Ｉｚｕｍｉ ／５／６５、Ｈ３Ｎ２サブタイプとしてＡ／Ａｉｃｈｉ ／２／６８、Ａ／Ｆｕｋｕｏｋａ ／Ｃ２９／８５、Ａ／Ｓｉｃｈｕａｎ ／２／８７、Ａ／Ｉｂａｒａｋｉ ／１／９０、Ａ／Ｓｕｉｔａ ／１／９０、Ａ／Ｋｉｔａｋｙｕｓｈｕ／１５９／９３、更にインフルエンザＢ型ウイルスとしてＢ／Ｎａｇａｓａｋｉ／１／８７を用い、ヒトインフルエンザウイルス以外の実施例１−１記載のウイルスも用いた。その結果を表１、表２に示す。
【００３３】
【表１】
【表２】
表１、表２中の数字は実施例１−２−（３）の腹水液の希釈倍数であり、染色力価は染色試験で細胞を染色可能な該腹水液の最大希釈倍数を示す。また表２中のＡ領域アミノ酸配列、Ｂ領域アミノ酸配列とは各サブタイプにおいてＨ３Ｎ２サブタイプのＡ領域、Ｂ領域にそれぞれ対応する領域のアミノ酸配列を配列表の配列番号で示したものであり、配列表の配列番号１、及び配列番号５又は６で示すアミノ酸配列を有するサブタイプのウイルスをＡＩ３Ｃは認識する。
【００３６】
以上、ＡＩ３ＣはすべてのＨ３Ｎ２サブタイプ及びＡ／ｄｕｃｋ／Ｃｚｅｃｈｏｓｌｏｖａｋｉａ／１／５６、Ａ／ｃｈｉｃｋｅｎ ／Ｇｅｖｍａｎｙ “Ｎ”／４９を認識し、他のサブタイプ、Ｂ型ウイルスは認識しなかった。
【００３７】
（２）抗体の血球凝集阻害活性（ＨＩ）は次の様に行った。
抗体としては実施例１−（３）の腹水液を用い、該抗体は使用前に３倍容のレセプター分解酵素（ＲＤＥ：武田薬品工業社製）溶液を加え、３７℃、１８時間反応後、５６℃、４５分間の加熱処理でＲＤＥを失活させ、最終的に腹水液の１６倍希釈液として調製し、被検液とし、その段階希釈液を調製し、次に実施例１−１記載の各ウイルス（１６ＨＡ単位）と混合し、室温で３０分間反応させた。その後、ニワトリ赤血球を加えよく混和し、各ウイルスで赤血球凝集活性に及ぼす抗体の影響を検討した。ＡＩ３Ｃはすべてのサブタイプのウイルスの血球凝集活性に影響を与えなかった。
【００３８】
４．エピトープの決定
ＡＩ３Ｃの認識タンパク質がＨＡ分子であることを免疫沈降反応によって決定した。すなわち、Ｈ３Ｎ２サブタイプのＡ２／Ａｉｃｈｉ ／２／６８を３０分間ＭＤＣＫ細胞に吸着、感染させた後、培地中のメチオニンを１０μＣｉの「３５Ｓ〕メチオニンで置換したＭＥＭで２４時間培養し、感染細胞を標識した。次に該細胞を集め、次にＲＩＰＡ緩衝液〔５０ｍＭトリス（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１％ノニデットＰ−４０、１％デオキシコール酸、０．１％ＳＤＳ〕に再懸濁した。続いて不溶物を遠心除去した後、上清を得た。次に該上清をＡＩ３Ｃと混合し、１時間、４℃で保温した後、プロテインＡ−セファロースＣＬ４Ｂビーズを添加し、室温で２時間保持し、免疫沈降物をビーズに吸着させた。次に該ビーズを集め、ＲＩＰＡ緩衝液で５回洗浄した後、沸騰し、ＡＩ３Ｃの結合タンパク質を遊離させた。次に該タンパク質のＳＤＳ−１２．５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行い、ゲルを固定し、１Ｍサリチル酸ナトリウムに浸してから乾かし、オートラジオグラフィーを行った。ＡＩ３Ｃの結合する標識タンパク質は、その電気泳動パターンより、Ａ２／Ａｉｃｈｉ ／２／６８のＨＡ分子と同定された。同様の試験をＨ１Ｎ１サブタイプ、Ｈ２Ｎ２サブタイプ、他のＨ３Ｎ２サブタイプ及び実施例１−１記載のＢ型ウイルス、ヒト以外のウイルスをそれぞれ用い行った。ＡＩ３ＣはすべてのＨ３Ｎ２サブタイプ、Ａ／ｄｕｃｋ／Ｃｚｅｃｈｏｓｌｏｖａｋｉａ／１／５６、及びＡ／ｃｈｉｃｋｅｎ ／Ｇｅｒｍａｎｙ “ Ｎ ”／４９のＨＡ分子と特異的に免疫沈降した。これらのウイルスのＨＡ分子の幹領域に共通に保存されているアミノ酸配列は前出の配列番号１で表されるアミノ酸配列、及び配列番号２、５、６で表されるアミノ酸配列であり、ＡＩ３Ｃのエピトープはこの両アミノ酸配列と決定した。
【００３９】
実施例２
１．Ｃ１７９の調製
プリスタン処理したＢａｌｂ／ｃマウスにＨｙｂｒｉｄｏｍａ Ｃ１７９（ＦＥＲＭ ＢＰ−４５１７）を５×１０６ 個／匹マウスの腹腔内に投与した。１０〜２１日後に、腹水ガンが誘発されたマウスから腹水を採り、３０００ｒｐｍ ／５分の遠心処理により固型成分を除去し、腹水液を調製した。腹水液１ｍｌ中には約５ｍｇのモノクローナル抗体Ｃ１７９（以下、単にＣ１７９と略す）が含有されていた。Ｃ１７９はプロテインＡ−セファロース４Ｂ（ファルマシア社製）で精製した。
【００４０】
２．抗Ｂ型ウイルス抗体の調製
実施例１−１に記載のヒトインフルエンザＢ型ウイルス、Ｂ／Ｎａｇａｓａｋｉ／１／８７の５０００ＨＡ単位をフロイント完全アジュバントに使用前に懸濁し、１ヵ月間隔で、ウサギ筋肉内に注射し、二度免疫した。二度目の免疫の１０日後に、心臓より全採血し、抗Ｂ型ウイルス血清を調製した。
【００４１】
３．ヒトインフルエンザウイルス検出キットの作製
実施例１−２−（３）記載のＡＩ３ＣのＰＢＳ溶液（１ｍｇ／ｍｌ）１ｍｌ、実施例２−１記載のＣ１７９のＰＢＳ溶液（１ｍｇ／ｍｌ）１ｍｌ、及び実施例２−２記載の抗Ｂ型ウイルス血清１ｍｌをそれぞれ５ｍｌ容のバイアルに分注し、凍結乾燥を行い、それぞれの凍結乾燥標品を得た。次にこれらの標品と、抗体溶解、希釈用の１％ブロックエース（雪印社製）含有ＰＢＳ１００ｍｌ入バイアルを組合せ、ヒトインフルエンザウイルス検出キットを作製した。
【００４２】
実施例３
１．臨床分離株のタイピング
１９６８年以降に患者より分離された分離株８０株（大阪府立公衆衛生研究所保存株）のタイピングを行った。
すなわち、９６穴マイクロプレート（コーニング２６８６０）の各穴にＭＤＣＫ細胞を１×１０４ 個ずつ分注し、翌日、各分離株のウイルス液２５μｌを１株につき３穴分注し、３５℃、４５分間保温し、ウイルスを感染させた。
各穴をＰＢＳで洗浄後、０．５％トラガカントゴム（和光純薬社製）、及び５μｇ／ｍｌのトリプシンを含有するイーグルＭＥＭ１００μｌを添加した。これを３５℃で１６時間保温した後、添加液を除去し、各穴をＰＢＳで洗浄した。次に各穴の細胞を、室温下、無水エタノールで１０分間固定した。次に実施例２で作製したキットを用い、ＡＩ３Ｃ溶液（１ｍｇ／ｍｌ）の１０００倍希釈液、Ｃ１７９溶液（１ｍｇ／ｍｌ）の１０００倍希釈液、抗Ｂ型血清（原血清濃度）の１０００倍希釈液を調製し、これらの抗体希釈液を用い、各細胞の染色試験を行った。すなわち、各分離株が感染した３穴のうち、１穴にはＡＩ３Ｃ希釈液、他の１穴にはＣ１７９希釈液、残りの１穴には抗Ｂ型ウイルス血清希釈液の各１００μｌをそれぞれの穴で反応させた後、ウサギ抗マウスイムノグロブリンＧ血清の１０００倍希釈液１００μｌ、ヤギ抗ウサギイムノグロブリン血清の５００倍希釈液１００μｌ、ペルオキシダーゼ−ウサギ抗ペルオキシダーゼ複合体の１０００倍希釈液１００μｌで連続的に、３７℃、３０分間ずつ反応させ、処理細胞をＰＢＳで洗浄した。最後にペルオキシダーゼ反応を、０．０１％のＨ２ Ｏ２ と０．３ｍｇ／ｍｌの３，３′−ジアミノベンジジン四塩酸のＰＢＳ溶液１００μｌを用い、各細胞を染色し、各穴を水道水で洗浄し、乾燥させた。染色させた細胞はフォーカスとして３穴のうち、いずれか１穴分に形成され、可視化できた。可視化が困難な場合は通常の光学顕微鏡で観察し、Ｈ１Ｎ１サブタイプ、Ｈ３Ｎ２サブタイプ及びＢ型のいずれかであるかのタイピングを行った。該方法に従って行われたタイピングの結果を、従来法の血清学的に赤血球凝集抑制反応でタイピングされた結果と比較した。その結果を下記表３に示す。
【００４３】
【表３】
表３に示す様に従来法ではＨ１Ｎ１サブタイプと判定されていた２分離株が、Ｈ１Ｎ１サブタイプとＨ３Ｎ２サブタイプのウイルスの混合物であることも判明し、本発明により各分離株のタイピングを正確に行うことができた。
【００４５】
なおフェレット免疫血清としては、Ａ／Ｋｕｍａｍｏｔｏ／３７／７９（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／Ｂａｎｇｋｏｋ ／１０／８３（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／Ｙａｍａｇａｔａ／１２０／８６（Ｈ１Ｎ１）でそれぞれフェレットを免疫して得たＨ１Ｎ１サブタイプ判定用血清、Ａ／Ｉｓｈｉｋａｗａ／７／３２（Ｈ３Ｎ２）、Ａ／Ｐｈｉｌｌｉｐｐｉｎ／２／８２（Ｈ３Ｎ２）、Ａ／Ｆｕｋｕｏｋａ ／Ｃ２９／８５（Ｈ３Ｎ２）、Ａ／Ｓｉｃｈｕａｎ ／２／８７（Ｈ３Ｎ２）でそれぞれフェレットを免疫して得たＨ３Ｎ２サブタイプ判定用血清、Ｂ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ ／２２２／７９、Ｂ／Ｉｂａｒａｋｉ ／２／８５、Ｂ／Ｙａｍａｇａｔａ／１６／８８、Ｂ／Ａｉｃｈｉ ／５／８８でそれぞれフェレットを免疫して得たＢ型ウイルス判定用血清（以上、大阪府立公衆衛生研究所保有）を用いた。
【００４６】
２．臨床検体中のウイルスのタイピング
１９９３〜１９９４年発症の患者のうがい液１０ｍｌを４℃、３０００回転、３０分間の遠心分離を行い、上澄液を調製した。次にこの上澄液をウイルス液検体とし、実施例３−１に従い、ウイルス感染細胞の染色試験を行った。
すなわち、２４穴マイクロプレート（コーニング２５８２０１）の各穴にＭＤＣＫ細胞を１×１０４ 個ずつ分注し、翌日、ウイルス液検体０．８ｍｌを１検体につき３穴分注し、３５℃、４５分間保温し、ウイルスを感染させた。次に各穴をＰＢＳで洗浄後、５μｇ／ｍｌのトリプシンを含有するイーグルＭＥＭ１ｍｌを添加した。これを３５℃で４０時間保温後、添加液を除去し、各穴をＰＢＳで洗浄し、以下、ＡＩ３Ｃ、Ｃ１７９、抗Ｂ型ウイルス血清を用い、各細胞の染色試験を行った。
また、ウイルス感染後、３５℃で４日間保温した各細胞についても、同様に染色試験を行った。
なお、従来法として、２４穴マイクロプレートの各穴にＭＤＣＫ細胞を１×１０４ 個ずつ分注し、翌日、ウイルス液検体０．８ｍｌを１検体につき４穴分注し、３５℃、４５分間保温し、ウイルスを感染させた。
【００４７】
各穴をＰＢＳで洗浄後、５μｇ／ｍｌのトリプシンを含有するイーグルＭＥＭ１ｍｌを添加し、３５℃、４日間培養した。培養４日目に細胞変性を観察し、変性のみられた検体につき当該穴の細胞培養液の血球凝集活性を測定した。また変性のみられなかった検体については再度、ウイルス液によるＭＤＣＫ細胞感染を行い、４日後に再度細胞変性の有無を確認し、細胞変性のみられた検体は当該穴の細胞培養液の血球凝集活性を測定した。
すなわち、０．５％ヒヨコ赤血球５０μｌに細胞培養液５０μｌを混合し、３０分後の凝集の有無より、ヒトインフルエンザウイルスの有無を判定した。ヒトインフルエンザウイルスの存在が確認された細胞培養液については、Ｈ１Ｎ１サブタイプ、Ｈ３Ｎ２サブタイプ、Ｂ型ウイルス判定用のフェレット免疫血清、すなわち、Ａ／Ｙａｍａｇａｔａ／３２／８９（Ｈ１Ｎ１）でフェレットを免疫して得たＨ１Ｎ１サブタイプ判定用血清、Ａ／Ｏｓａｋａ ／１０８９／９３（Ｈ３Ｎ２）、及びＡ／Ｋｉｔａｋｙｕｓｈｕ／１５９／９３（Ｈ３Ｎ２）でそれぞれフェレットを免疫して得たＨ３Ｎ２サブタイプ判定用血清、Ｂ／Ｂａｎｇｋｏｋ ／６３／９０及びＢ／Ｍｉｅ ／１／９３でそれぞれフェレットを免疫し得たＢ型ウイルス判定用血清（以上、大阪府立公衆衛生研究所保有）を用い、該各血清の赤血球凝集抑制反応でタイピングを行った。すなわち各血清２５μｌごとに、細胞培養液２５μｌを添加し、３７℃、１時間保温した後、０．５％ヒヨコ赤血球５０μｌを混合し、３０分後の凝集の有無より、ヒトインフルエンザウイルスのタイピングを行った。
本発明の方法と、従来法の結果を表４に示す。
【００４８】
【表４】
本発明方法ではうがい液より調製したウイルス液検体を細胞に感染後、２日後には、２５／３３（７６％）をタイピングすることができ、更に保温を続けた場合、従来法のタイピングと結果が完全に一致し、１９９３〜１９９４年に流行のウイルスはＨ３Ｎ２サブタイプと決定した。
【００５０】
従来法において使用するフェレット血清は、流行中のヒトインフルエンザウイルス株を分離し、フェレットを免疫し、調製して得ているため、ヒトインフルエンザウイルスの抗原性の変化により、その結合活性消失が生じること、よって常に、最新、複数の抗血清を準備する必要がある。また、最近、フェレットが入手困難であり、自家繁殖の結果、高力価血清の調製が困難となっている。
【００５１】
一方、本発明方法は、検体調製後、ウイルスの増殖力が強い場合は２日後に、タイピングが可能なこと、Ｈ１Ｎ１サブタイプ検出用抗体、Ｈ３Ｎ２サブタイプ検出用抗体が、それぞれのサブタイプの抗原変化の影響を受けないこと、高力価の抗体がモノクローナル抗体として常に安定して供給されること等で特に優れている。
【００５２】
【発明の効果】
本発明の抗ヒトインフルエンザウイルス抗体、その検出方法及び本発明のキットを用いることにより、インフルエンザウイルス分離株だけでなく、患者のうがい液からも迅速に高感度でかつ正確にインフルエンザウイルスを検出でき、しかも、同時にタイピングを行うことができる。
その結果、短時間に大量の検体のタイピングが可能となり、その年におけるインフルエンザの流行予測が迅速に行えることになる。
【００５３】
【配列表】
【００５４】
【図面の簡単な説明】
【図１】ヘマグルチニン分子の三次構造の模式図である。
Claims (3)
- ハイブリドーマＡＩ３Ｃ（ＦＥＲＭ ＢＰ−４５１６）由来の、下記特性（ａ）及び（ｂ）を有する抗ヒトインフルエンザウイルス抗体。
（ａ）ヒトインフルエンザＡ型ウイルスのＨ３Ｎ２サブタイプのヘマグルチニン分子中の幹領域の配列表の配列番号１で表されるＴＧＭＲＮポリペプチド配列と配列表の配列番号２で表されるＱＩＮＧＫＬＮＲ（Ｌ／Ｖ）ＩＥＫポリペプチド配列とを認識する。
（ｂ）ヒトインフルエンザＡ型ウイルスのＨ１Ｎ１サブタイプとＨ２Ｎ２サブタイプのヘマグルチニン分子中の幹領域の配列表の配列番号３で表されるＴＧＬＲＮポリペプチド配列と、配列表の配列番号４で表されるＧＩＴＮＫＶＮＳＶＩＥＫポリペプチド配列とを認識しない。 - 請求項１記載の抗ヒトインフルエンザウイルス抗体をＨ３Ｎ２サブタイプのヒトインフルエンザＡ型ウイルスに結合させる工程を包含することを特徴とするヒトインフルエンザウイルスの検出方法。
- 請求項２記載の方法を用いて検出を行うための検出キットであって、請求項１記載の抗体を含有していることを特徴とするヒトインフルエンザウイルス検出キット。
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