CN116519944B - 一种鸡新城疫病毒抗体间接elisa检测方法及其试剂盒 - Google Patents

一种鸡新城疫病毒抗体间接elisa检测方法及其试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种检测鸡新城疫病毒抗体的间接ELISA试剂盒，该ELISA试剂盒包括包被有NP18蛋白的包被抗原，其中该NP18蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。该间接ELISA试剂盒及其相关ELISA检测方法一方面可检测鸡血清中是否存在新城疫病毒抗体，另一方面可以区分鸡新城疫疫苗(MG7株)免疫鸡血清和其他新城疫病毒感染鸡血清。

Description

一种鸡新城疫病毒抗体间接ELISA检测方法及其试剂盒
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种鸡新城疫病毒抗体间接ELISA检测方法及其试剂盒。
背景技术
新城疫(Newcastle Disease，ND)是由新城疫病毒(Newcastle Disease Virus，NDV)引起禽类的一种急性、高度传染性疾病，世界动物卫生组织(OIE)将新城疫列为必须上报的动物疫病之一。NDV属于副黏病毒科禽腮腺炎病毒属，其基因组为单股负链不分节段的RNA，依次编码6种结构蛋白，分别为NP、P、M、F、HN和L蛋白。NDV只有1种血清型，根据其F基因核苷酸序列特征将其分为18种基因型，其中基因VII型NDV是我国90年代以来引起禽类新城疫最主要的病原。由于流行株与疫苗株的遗传距离越来越远，导致当前广泛使用的疫苗株与流行株抗原匹配性不高，免疫保护效率不完全。
基于新城疫的流行病学，筛选优势基因VII型NDV毒株，通过反向遗传技术对其突变致弱，并在NP蛋白上缺失优势B细胞表位，进而制备抗原匹配性好，生长特性优，遗传稳定且具有独特标记的基因VII型新城疫标记疫苗株(MG7株)以及与其配套的检测鸡新城疫病毒抗体间接ELISA检测方法及其试剂盒。
发明内容
基于此，本发明提供了一种检测鸡新城疫病毒抗体的间接ELISA试剂盒，该ELISA试剂盒包括包被有NP18蛋白的包被抗原，其中该NP18蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
进一步地，该NP18蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
进一步地，该NP18蛋白为NP蛋白优势抗原表位443aa～460aa经GGGSGG进行串联3次表达的蛋白，其中该NP蛋白优势抗原表位443aa～460aa的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。
进一步地，该ELISA试剂盒进一步包括以下的一种或多种：阳性对照血清、阴性对照血清、酶标二抗、洗涤液、显色液、封闭液、稀释液、终止液、封板膜和说明书。
进一步地，该阴性对照血清为SPF鸡阴性血清和/或鸡新城疫疫苗免疫鸡血清。
进一步地，该鸡新城疫疫苗为鸡新城疫病毒(MG7株)标记疫苗。
进一步地，该阳性对照血清选自以下的一种或多种：基因Ⅶ型新城疫免疫鸡阳性血清、La Sota免疫鸡阳性血清和田间样品新城疫鸡阳性血清。
进一步地，该酶标二抗为HRP标记的山羊抗鸡IgG。
进一步地，该洗涤液为1×PBST洗涤液。
进一步地，该1×PBST洗涤液的配置方法为：使用ddH2O将25倍浓缩PBST溶液稀释为1×PBST洗涤液。
进一步地，该显色液为TMB显色液。
进一步地，该封闭液为约2％BSA-1×PBST溶液。
进一步地，该稀释液为血清稀释液。
进一步地，该终止液为约0.3mol/L硫酸溶液。
进一步地，判断标准为：S/P值＝(待检血清样品的OD 450nm值-阴性对照血清OD450nm平均值)/(阳性对照血清OD 450nm平均值-阴性对照血清OD 450nm平均值)，当S/P值<0.25，判为阴性，S/P值≥0.25，判为阳性。
进一步地，该包被抗原是通过如下方法制备的：(1)将该NP18蛋白的核苷酸序列连接PGEX-4T-1原核表达载体；(2)将测序正确的质粒转化至E.coli BL21感受态细胞；(3)挑取单克隆细菌，在约0.4mmol/L约16℃条件下经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导22～24小时，同时设立未诱导阴性对照；以及(4)离心收集菌体进行超声破碎离心后收集上清，12％SDS-PAGE电泳分析表达蛋白并使用GST标签进行纯化，当该NP18蛋白纯度在85％以上时，得到该包被抗原。
根据本发明的另一个方面，提供了一种检测鸡新城疫病毒抗体的间接ELISA检测方法，该间接ELISA检测方法包括以下步骤：
(1)包备：使用上述制备得到的包被抗原包备ELISA板，12.5～100ng/孔，4～6℃过夜；
(2)封闭：弃掉上清液，使用1×PBST洗涤液洗涤2～4遍后，使用约2％BSA-1×PBST溶液进行封闭，放置于约37℃下封闭0.5～2h；
(3)加入待检血清样品：将待检血清样品使用血清稀释液按照1∶25～1∶200的比例进行稀释，然后每孔加入经血清稀释液稀释的待检血清100μl，每板同时设置阴性对照和阳性对照各2～6孔，对照组同样按照上述方法稀释，使用封板膜封板后微量振荡器或手动方式，震动15～60s，放置于约37℃下孵育0.5～2h；
(4)揭掉封板膜，弃去各孔中液体并拍净之后，每孔加入200μl1×PBST洗涤液，静置15～60s，重复洗涤2～4次，在吸水纸上拍净；
(5)加入酶标二抗：使用血清稀释液将HRP酶标二抗按照1∶2000～1∶8000的比例进行稀释，然后每孔加入100μl，使用封板膜封板后在微量振荡器或手动方式，震动15～60s，放置于约37℃下孵育0.5～1h；
(6)重复洗涤3次；
(7)TMB显色：TMB底物A溶液与TMB底物B溶液按照1∶1的比例进行混匀后，每孔加入100μl，置于避光环境中，室温孵育5～10min；
(8)终止：每孔加入100μl终止液，终止反应后立即读值；
(9)读值：使用酶标仪，在450nm波长处测定各孔OD值，数据读取应在10min内完成；以及
(10)判断：标准为：S/P值＝(待检血清样品的OD 450nm值-阴性对照血清OD 450nm平均值)/(阳性对照血清OD 450nm平均值-阴性对照血清OD 450nm平均值)，当S/P值<0.25，判为阴性，S/P值≥0.25，判为阳性。
进一步地，在步骤(1)中，该包被抗原的量为约25ng/孔。
进一步地，在步骤(2)中，放置于约37℃下封闭约1h。
进一步地，在步骤(3)中，放置于约37℃下孵育约1h。
进一步地，在步骤(5)中，放置于约37℃下孵育约0.5h。
进一步地，在步骤(2)和(4)中，该1×PBST洗涤液的配置方法为：使用ddH2O将25倍浓缩PBST溶液稀释为1×PBST洗涤液。
进一步地，该待检血清样品的稀释度为约1∶100。
进一步地，该酶标二抗的稀释度为约1∶4000。
根据本发明的另一个方面，提供了一种上述间接ELISA试剂盒或上述间接ELISA检测方法在用于检测鸡血清中是否存在新城疫病毒抗体的用途。
根据本发明的另一个方面，提供了一种上述间接ELISA试剂盒或上述间接ELISA检测方法在用于区分鸡新城疫疫苗免疫鸡血清和其他新城疫病毒感染鸡血清的用途。
进一步地，该鸡新城疫疫苗为鸡新城疫病毒MG7株标记疫苗。
本发明的有益效果：
本发明公开了一种根据NDV MG7标记疫苗株的特点，将NP蛋白优势抗原表位aa443～460序列经GGGSGG进行3次串联后插入PGEX-4T-1载体，转化BL21感受态细胞，挑取单克隆细菌，加入IPTG诱导表达后收集菌体，超声破碎离心后收集上清，使用ProteinIso GSTResin纯化蛋白获得包被用抗原。
本发明利用368份鸡阴性对照血清(180份鸡新城疫MG7免疫鸡血清和188份SPF鸡阴性血清)和368份新城疫阳性对照血清(包括188份基因Ⅶ型新城疫免疫鸡阳性血清、90份La Sota免疫鸡阳性血清和90份田间样品新城疫鸡阳性血清)，通过矩阵法优化最佳的抗原包被浓度、最佳的血清和二抗稀释比例后，检测收集的阴阳性血清样品。以阴阳性血清群交叉最小为标准确定阈值，以该阈值为标准分别计算阴阳性血清样品中检测出的阴性血清样品数和阳性血清样品数，最终以确定的反应条件、步骤和判定阈值检测鸡常见病原阳性血清来评价检测方法的交叉反应性和符合性。在该检测方法中测出的OD 450nm值要换算成S/P值，S/P值＝(待检血清样品的OD 450nm值-阴性对照血清OD 450nm平均值)/(阳性对照血清OD450nm平均值-阴性对照血清OD 450nm平均值)，公式中的阴阳性对照血清是在检测方法建立时已经制备完成，而且所有的样品检测必须以此阴性对照和阳性对照血清为对照。
本发明成功建立了鸡新城疫病毒抗体间接ELISA检测试剂盒和间接ELISA检测方法。上述试剂盒和检测方法一方面可检测鸡血清中是否存在新城疫病毒抗体，另一方面可以区分鸡新城疫疫苗免疫鸡血清和其他新城疫病毒感染鸡血清。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，还可以根据这些附图获得其他的附图，而并不超出本发明要求保护的范围。
图1为SDS-PAGE鉴定包被有NP18蛋白的包被抗原的结果示意图。
图2为368份鸡阴性对照血清和368份新城疫阳性对照血清的样品区间分布示意图。
图3为本发明的鸡新城疫病毒抗体间接ELISA检测方法的特异性检测结果示意图。
图4为本发明的鸡新城疫病毒抗体间接ELISA检测方法与商品化试剂盒检测MG7血清的对比结果示意图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
除非另外说明，本文所用的所有技术和科学术语和缩略语具有本发明领域或该术语应用领域中普通技术人员通常所理解的含义。虽然本发明实施过程中可使用类似于或等价于本文公开的那些的任何方法、条件、物质或材料，但本文描述了优选的方法、条件物质或材料。
本发明有预期地涵盖所有的选择余地、变体和同等物，这些可能如权利要求所定义的那样包含在现有发明领域。所属领域的技术人员将识别许多类似或等同于在此所描述的方法和物质，这些可以应用于本发明的实践中去。本发明绝非限于方法和物质的描述。
除非上下文另外明确规定，否则如本说明书和权利要求书中所用，单数形式“一(a/an)”和“所述(the)”包括多个指示物。
在一定程度上，具体实施方式和/或权利要求中使用术语“包含”、“包括(including，includes)”和“具有(having，has，with)”或其变体，这些术语意在包括与术语“包含(comprising)”类似的方式。
正如背景技术部分所描述的，新城疫(Newcastle Disease，ND)流行株与疫苗株的遗传距离越来越远，导致当前广泛使用的疫苗株与流行株抗原匹配性不高，免疫保护效率不完全，缺乏相关基因VII型新城疫标记疫苗株以及与其配套的检测鸡新城疫病毒抗体的间接ELISA试剂盒及其检测方法的问题。为了解决上述问题，本发明提供了一种检测鸡新城疫病毒抗体的间接ELISA试剂盒，该ELISA试剂盒包括包被有NP18蛋白的包被抗原，其中该NP18蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
其中，SEQ ID NO：1如下所示：
GGGGAGACCCAATTCTTGGATTTTATGAGAGCAGTGGCGAACGG
CATGCGGGAAGGAGGAGGAAGTGGAGGAGGGGAGAC
CCAATTCTTGGATTTTATGAGAGCAGTGGCGAACGGCATGCGGG
AAGGAGGAGGAAGTGGAGGAGGGGAGACCCAATTCT
TGGATTTTATGAGAGCAGTGGCGAACGGCATGCGGGAAGGAGGA
GGAAGTGGAGGAGGGGAGACCCAATTCTTGGATTTT
ATGAGAGCAGTGGCGAACGGCATGCGGGAAGGAGGAGGAAGTG
GAGGAGGGGAGACCCAATTCTTGGATTTTATGAGAGC
AGTGGCGAACGGCATGCGGGAA
在一种优选的实施方式中，该NP18蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
其中，SEQ ID NO：2如下所示：
GETQFLDFMRAVANGMREGGGSGGGETQFLDFMRAVANGMREGG
GSGGGETQFLDFMRAVANGMREGGGSGGGETQFLDF
MRAVANGMREGGGSGGGETQFLDFMRAVANGMRE
在一种优选的实施方式中，该NP18蛋白为NP蛋白优势抗原表位443aa～460aa经GGGSGG进行串联3次表达的蛋白，其中该NP蛋白优势抗原表位443aa～460aa的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。
其中，SEQ ID NO：3如下所示：
GETQFLDFMRAVANGMRE
在一种优选的实施方式中，该ELISA试剂盒进一步包括以下的一种或多种：阳性对照血清、阴性对照血清、酶标二抗、洗涤液、显色液、封闭液、稀释液、终止液、封板膜和说明书。
在一种优选的实施方式中，该阴性对照血清为SPF鸡阴性血清和/或鸡新城疫疫苗免疫鸡血清。
在一种优选的实施方式中，该鸡新城疫疫苗为鸡新城疫病毒MG7株标记疫苗。
在一种优选的实施方式中，该阳性对照血清选自以下的一种或多种：基因Ⅶ型新城疫免疫鸡阳性血清、La Sota免疫鸡阳性血清和田间样品新城疫鸡阳性血清。
在一种优选的实施方式中，该酶标二抗为HRP标记的山羊抗鸡IgG。
在一种优选的实施方式中，该洗涤液为1×PBST洗涤液。
在一种优选的实施方式中，该1×PBST洗涤液的配置方法为：使用ddH2O将25倍浓缩PBST溶液稀释为1×PBST洗涤液。
在一种优选的实施方式中，该显色液为TMB显色液。
在一种优选的实施方式中，该封闭液为约2％BSA-1×PBST溶液。
在一种优选的实施方式中，该稀释液为血清稀释液。
在一种优选的实施方式中，该终止液为约0.3mol/L硫酸溶液。
在一种优选的实施方式中，判断标准为：S/P值＝(待检血清样品的OD 450nm值-阴性对照血清OD 450nm平均值)/(阳性对照血清OD 450nm平均值-阴性对照血清OD 450nm平均值)，当S/P值<0.25，判为阴性，S/P值≥0.25，判为阳性。
在一种优选的实施方式中，该包被抗原是通过如下方法制备的：(1)将该NP18蛋白的核苷酸序列连接PGEX-4T-1原核表达载体；(2)将测序正确的质粒转化至E.coli BL21感受态细胞；(3)挑取单克隆细菌，在约0.4mmol/L约16℃条件下异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导22～24小时，同时设立未诱导阴性对照；以及(4)离心收集菌体进行超声破碎离心后收集上清，12％SDS-PAGE电泳分析表达蛋白并使用GST标签进行纯化，当该NP18蛋白纯度在85％以上时，得到该包被抗原。
根据本发明的另一个方面，提供了一种检测鸡新城疫病毒抗体的间接ELISA检测方法，该间接ELISA检测方法包括以下步骤：
(1)包备：使用上述制备得到的包被抗原包备ELISA板，12.5～100ng/孔，4～6℃过夜；
(2)封闭：弃掉上清液，使用1×PBST洗涤液洗涤2～4遍后，使用约2％BSA-1×PBST溶液进行封闭，放置于约37℃下封闭0.5～2h；
(3)加入待检血清样品：将待检血清样品使用血清稀释液按照1∶25～1∶200的比例进行稀释，然后每孔加入经血清稀释液稀释的待检血清100μl，每板同时设置阴性对照和阳性对照各2～6孔，对照组同样按照上述方法稀释，使用封板膜封板后微量振荡器或手动方式，震动15～60s，放置于约37℃下孵育0.5～2h；
(4)揭掉封板膜，弃去各孔中液体并拍净之后，每孔加入200μl1×PBST洗涤液，静置15～60s，重复洗涤2～4次，在吸水纸上拍净；
(5)加入酶标二抗：使用血清稀释液将HRP酶标二抗按照1∶2000～1∶8000的比例进行稀释，然后每孔加入100μl，使用封板膜封板后在微量振荡器或手动方式，震动15～60s，放置于约37℃下孵育0.5～1h；
(6)重复洗涤3次；
(7)TMB显色：TMB底物A溶液与TMB底物B溶液按照1∶1的比例进行混匀后，每孔加入100μl，置于避光环境中，室温孵育5～10min；
(8)终止：每孔加入100μl终止液，终止反应后立即读值；
(9)读值：使用酶标仪，在450nm波长处测定各孔OD值，数据读取应在10min内完成；以及
(10)判断：标准为：S/P值＝(待检血清样品的OD 450nm值-阴性对照血清OD 450nm平均值)/(阳性对照血清OD 450nm平均值-阴性对照血清OD 450nm平均值)，当S/P值<0.25，判为阴性，S/P值≥0.25，判为阳性。
在一种优选的实施方式中，在步骤(1)中，该包被抗原的量为约25ng/孔。
在一种优选的实施方式中，在步骤(2)中，放置于约37℃下封闭约1h。
在一种优选的实施方式中，在步骤(3)中，放置于约37℃下孵育约1h。
在一种优选的实施方式中，在步骤(5)中，放置于约37℃下孵育约0.5h。
在一种优选的实施方式中，在步骤(2)和(4)中，该1×PBST洗涤液的配置方法为：使用ddH2O将25倍浓缩PBST溶液稀释为1×PBST洗涤液。
在一种优选的实施方式中，该待检血清样品的稀释度为约1∶100。
在一种优选的实施方式中，该酶标二抗的稀释度为约1∶4000。
本发明所用的术语“约”在此处使用来修饰数值并表明那个值附近的一个限定的范围。如果“X”是该值的话，“约X”通常是表明从0.95X至1.05X的一个值。每当提到“约X”时，最少表明至少这些值X、0.95X、0.96X、0.97X、0.98X、0.99X、1.01X、1.02X、1.03X、1.04X、1.05X。“约”还可包括该量中药品监管机构(例如NMPA、FDA或EMEA)会视作生物等效于所要求的量的各种变化。
根据本发明的另一个方面，提供了一种上述间接ELISA试剂盒或上述间接ELISA检测方法在用于检测鸡血清中是否存在新城疫病毒抗体的用途。
根据本发明的另一个方面，提供了一种上述间接ELISA试剂盒或上述间接ELISA检测方法在用于区分鸡新城疫疫苗免疫鸡血清和其他新城疫病毒感染鸡血清的用途。
在一种优选的实施方式中，该鸡新城疫疫苗为鸡新城疫病毒MG7株标记疫苗。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或制造厂商所建议的条件。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
本发明提到的上述特征，或实施例提到的特征可以任意组合。本专利说明书所揭示的所有特征可与任何组合物形式并用，说明书中所揭示的各个特征，可以任何可提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特别说明，所揭示的特征仅为均等或相似特征的一般性例子。
实施例
鸡新城疫病毒抗体间接ELISA检测方法的建立
1实验仪器与材料
ELISA板购买于Merck公司；BL21感受态细胞购买于宝日医生物技术(北京)有限公司，BSA和异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)购买于北京索莱宝生物科技有限公司，GSTbeads购买于博格隆(上海)生物技术有限公司；TMB A液、B液及终止液购买于兰州兽研科技有限公司；酶标仪购买于Thermo Fisher公司。
2实验方法
2.1NP蛋白aa443～460串联后的克隆、表达及纯化
将串联后的蛋白连接PGEX-4T-1原核表达载体，命名为PGEX-4T-1-NP18，将测序正确的质粒转化至E.coli BL21感受态细胞。0.4mmol/L16℃条件下诱导22～24小时，同时设立未诱导阴性对照。离心收集菌体进行超声破碎，12％SDS-PAGE电泳分析表达蛋白并纯化。
2.2封闭剂选择
使用纯化后的NP蛋白包被ELISA板，4℃过夜后PBST洗涤3次，分别用PBST，1％明胶-PBS，2％BSA-PBST溶液；2％BSA-1％马血清-PBST溶液，5％SPF鸡胚尿囊液-PBS封闭ELISA板。用酶标检测仪检测各孔OD 450nm值，根据阴阳性血清的比值筛选出最佳封闭剂。
2.3抗原抗体反应时间优化
在已包被抗原的ELISA板上用2％BSA-PBST分别倍比稀释基因Ⅶ型新城疫阳性对照血清和阴性对照血清，孵育时间分别设为0.5、1、1.5和2h，用酶标检测仪检测各孔OD450nm值，计算阴阳性比值，选择最佳反应时间。
2.4间接ELISA反应条件的优化
2.4.1抗原包被量及血清和酶标二抗最佳稀释度的确定
利用正交试验方法优化抗原最佳包被浓度，从12.5ng/孔、25ng/孔、50ng/孔和100ng/孔，每孔100μl；抗原包被后置湿盒内于4℃过夜，PBST洗涤4次，用2％的BSA(PBST配制)37℃封闭1小时，每孔100μl，洗涤3次；阴阳性对照鸡血清分别按照25倍、50倍、100倍和200倍进行稀释，每孔100μl，37℃作用1小时。洗涤3次，加入1∶2000、1∶4000、1∶6000和1∶8000倍稀释的HRP标记的抗鸡IgG二抗37℃作用30分钟。洗涤3次，加TMB，每孔100μl，室温作用5分钟。加终止液，每孔100μl，在酶标仪上读取OD450nm值。计算阴阳性对照血清每个稀释度的P/N比值(注：P/N值＝阳性对照血清OD 450nm平均值/阴性对照血清OD 450nm平均值)，对应阳性对照血清和阴性对照血清稀释度P/N比值最大的为抗原最佳包被浓度。
2.4.2阈值的确定
本试验利用368份鸡阴性血清(180份NDV MG7疫苗株免疫鸡血清和188份SPF鸡阴性血清)和368份新城疫阳性血清(188份基因Ⅶ型NDV G7免疫鸡阳性血清、90份La Sota免疫鸡阳性血清和90份田间样品新城疫鸡阳性血清)，通过实验数据的区间分布建立了鸡新城疫病毒抗体间接ELISA检测试剂盒的阴阳性判定标准。
2.4.3敏感性试验分析
根据鸡新城疫病毒抗体间接ELISA检测与判定方法检测NDV样品盘阳性血清90份(NDV97血清45份、La Sota血清45份)按照计算公式计算该检测方法的敏感性。
敏感性计算公式：敏感性(％)＝【阳性数÷(阳性数+阴性数)】×100％。
2.4.4特异性检测分析
按照新城疫灭活标记疫苗(MG7株)与野毒株的抗体ELISA检测试剂盒用法与判定，检测NDV样品盘阴性血清90份(MG7阳性血清45份、SPF鸡血清45份)，统计检测血清阴性数及阳性数，通过计算血清符合率比较试剂盒特异性。
2.4.5与商品化试剂盒的可比性分析
用确定的鸡新城疫病毒抗体间接ELISA检测试剂盒和爱德士鸡新城疫病毒抗体检测试剂盒(货号为99-09263)分别检测样品盘中40份SPF鸡阴性血清，40份NDV MG7疫苗免疫鸡血清，40份基因Ⅶ型NDV灭活疫苗G7株免疫SPF鸡阳性血清，40份La Sota免疫SPF鸡阳性血清，以评价该检测方法的符合性。
2.4.6重复性检测
用鸡新城疫病毒抗体间接ELISA检测试剂盒在不同的时间检测样品盘中相同的40份SPF鸡阴性血清、40份NDV MG7疫苗株免疫鸡血清、40份基因Ⅶ型NDV灭活疫苗G7株免疫SPF鸡阳性血清、40份La Sota免疫SPF鸡阳性血清和40份来自田间样品的新城疫鸡阳性血清，共检测3次，以评价该检测方法的重复性。
3实验结果
3.1NP蛋白优势抗原表位aa 443～460序列的表达与纯化
菌体经IPTG诱导后，使用GST标签纯化目的蛋白，脱1泳道为第一次使用洗脱缓冲液洗脱的目的蛋白、脱2泳道为第二次使用洗脱缓冲液洗脱的目的蛋白。其经SDS-PAGE分析，表达蛋白为34kD(包含GST标签蛋白)(如图1所示)，且脱2蛋白纯度高于脱1，当目的蛋白纯度在85％以上即为获得包被用抗原。后续试验使用纯度高的抗原(脱2)进行包被ELISA板。
3.2封闭剂选择
将已经包被有抗原的ELISA板分别用PBST，1％明胶-PBS，2％BSA-PBST溶液、2％BSA-1％马血清-PBST溶液和5％SPF鸡胚尿囊液-PBS封闭ELISA标板，并用酶标检测仪检测各孔OD450nm值，结果如表1所示，最终确定封闭剂为2％BSA-PBST溶液。
表1封闭液选择结果
3.3抗原抗体反应时间优化
将使用2％BSA-PBST倍比稀释后的基因Ⅶ型新城疫阳性对照血清和阴性对照血清加入到已经包被有抗原的ELISA板，孵育时间分别设为0.5、1、1.5和2h，用酶标检测仪检测各孔OD450 nm值，结果如表2所示，随着反应时间的延长，阴性对照血清的的OD值在逐渐升高，综合考虑，最终确定最佳反应时间为1h。
表2抗原抗体反应时间优化结果
3.4间接ELISA反应条件的优化
3.4.1抗原包被量及血清和酶标二抗最佳稀释度的确定
通过正交试验结果(如表3、表4、表5和表6所示)，综合考虑抗原包被剂量和二抗的使用量，针对MG7血清，最终确定NP蛋白aa443～460的质量浓度为50ng/孔，待检血清稀释度为1∶100，山羊抗鸡IgG-HRP二抗的稀释度为1∶4000(如表7所示)。
表3鸡新城疫病毒抗体间接ELISA检测方法确定抗原包备浓度、待检血清和二抗稀释比例-12.5ngNP蛋白包被ELISA板
表4鸡新城疫病毒抗体间接ELISA检测方法确定抗原包备浓度、待检血清和二抗稀释比例-25ngNP蛋白包被ELISA板
/>
表5鸡新城疫病毒抗体间接ELISA检测方法确定抗原包备浓度、待检血清和二抗稀释比例-50ngNP蛋白包被ELISA板
/>
表6鸡新城疫病毒抗体间接ELISA检测方法确定抗原包备浓度、待检血清和二抗稀释比例-100ngNP蛋白包被ELISA板
/>
表7最优实验条件
3.4.2阈值的确定
本试验通过上述建立的鸡新城疫病毒抗体间接ELISA检测方法测定368份鸡阴性血清(180份NDV MG7疫苗株免疫鸡血清和188份SPF鸡阴性血清)和368份新城疫阳性血清(188份基因Ⅶ型NDV G7免疫SPF鸡阳性血清、90份La Sota免疫SPF鸡阳性血清和90份田间样品新城疫鸡阳性血清)，具体操作步骤为：(1)包备：纯化的NP18蛋白包备ELISA板，25ng/孔，4度过夜；(2)封闭：弃掉上清液，用PBST溶液洗涤3遍后，使用2％BSA进行封闭，37度封闭1h；(3)加入待检血清：待检血清与血清稀释液按照1:100的比例进行稀释(即1μL待检血清加入100μL血清稀释液，混匀，备用)，然后每孔加入经血清稀释液稀释的待检血清100μL(每板同时设置阴性对照和阳性对照各2孔，对照组同样按照上述方法稀释)，使用封板膜封板后微量振荡器或手动方式，震动30秒，放置37℃孵育1小时；(4)小心揭掉封板膜，弃去各孔中液体、拍净。每孔加如入200μl 1×PBST，静置约30秒，重复洗涤3次，最后在吸水纸上拍净(注：1×PBST配置1ml 25倍PBST浓缩液加入24ml超纯水稀释，即为1×PBST；注意：在拍干ELISA板前配制好酶标二抗)；(5)加入酶标二抗：使用血清稀释液将HRP酶标二抗按照1:4000的比例进行稀释(即1μl酶标二抗加入1mL血清稀释液，在振荡器上震荡混匀，备用)，然后每孔加入100μl，使用封板膜封板后在微量振荡器或手动方式，震动30秒，37℃孵育30分钟；(6)重复洗涤3次；注意：在拍干ELISA板前配制好TMB显色液(避光放置)；(7)TMB显色：TMB底物A溶液与TMB底物B溶液按照1:1的比例进行混匀后，每孔加入100μl，置于避光环境中，室温孵育5分钟；(8)终止：每孔加入100μl终止液，终止反应后立即读值；以及(9)读值：使用酶标仪，在450nm波长处测定各孔OD，数据读取应在10分钟内完成。通过实验数据的区间分布建立了NDV抗体间接ELISA检测方法的阴阳性判定标准。
经数据分析，当阈值设在0.25时，阴阳性血清群交叉分布最小，即当血清样品S/P值≥0.25时，为阳性血清样品；当血清样品S/P值<0.25时，为阴性血清样品(如图2所示)。
3.4.3敏感性试验分析
已测试了NDV样品盘阳性血清90份(NDV97血清45份、La Sota血清45份)，阳性检出率94.0％。
3.4.4特异性检测分析
检测NDV样品盘阴性血清90份(MG7阳性血清45份、SPF鸡血清45份)，阴性检出率96.6％。进一步检测其他主要禽病病毒，结果显示无血清交叉反应(如图3所示)。
3.4.5与商品化试剂盒的可比性分析
对比商品化ELISA试剂盒，鸡新城疫病毒抗体间接ELISA检测方法能够区分MG7疫苗免疫和其他新城疫病毒感染的鸡血清(如图4所示)。
用确定的鸡新城疫病毒抗体间接ELISA检测试剂盒和爱德士鸡新城疫病毒抗体检测试剂盒分别检测样品盘中40份SPF鸡阴性血清，40份NDV MG7免疫鸡血清和基因VII型NDV灭活疫苗G7株与La Sota株免疫SPF鸡阳性血清(其中40份基因VII型NDV灭活疫苗免疫SPF鸡阳性血清，编号为1～40；40份La Sota免疫SPF鸡阳性血清，编号为41～80)，结果如表8、表9和表10所示。
表8SPF鸡阴性样品盘血清符合性检测
/>
从表8结果中可知，鸡新城疫病毒抗体间接ELISA检测试剂盒与爱德士鸡新城疫病毒抗体检测试剂盒检测SPF鸡阴性血清性结果符合性为100％。
表9新城疫灭活疫苗MG7株免疫SPF鸡样品盘血清符合性检测
/>
从表9结果中可知鸡新城疫病毒抗体间接ELISA检测试剂盒与爱德士鸡新城疫病毒抗体检测试剂盒检测阴阳性结果与预期完全一致。爱德士鸡新城疫病毒抗体检测试剂盒检测样品盘中NDV MG7免疫SPF鸡血清为阳性，而鸡新城疫病毒抗体间接ELISA检测其血清为阴性，此法可用于区分NDV MG7疫苗株免疫鸡血清和其他新城疫病毒感染的鸡血清。
表10基因VII型新城疫灭活疫苗G7株与新城疫灭活疫苗La Sota株免疫SPF鸡阳性样品盘血清符合性检测
/>
/>
/>
从表10结果中可知，鸡新城疫病毒抗体间接ELISA检测试剂盒与爱德士鸡新城疫病毒抗体检测试剂盒检测样品盘中新城疫鸡阳性血清的结果为：基因VII型新城疫灭活疫苗G7株免疫SPF鸡阳性血清符合性为95％；40份La Sota免疫SPF鸡阳性血清符合性为95％。
2.4.6重复性检测
用建立的方法在不同的时间分3次检测样品盘中相同的40份(1～40)SPF鸡阴性血清、40份(41-80)新城疫灭活疫苗MG7疫苗株免疫鸡血清、40份(81～120)基因VII型新城疫灭活疫苗G7株免疫鸡阳性样品盘血清、40份(121～160)La Sota株免疫鸡阳性样品盘血清和40份(161～200)来自田间样品的新城疫鸡阳性血清，结果如表11、表12和表13所示：
表11第一次检测结果
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表12第二次检测结果
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表13第三次检测结果
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从表11、表12和表13结果中可知，用建立的方法在不同的时间分3次检测样品盘中的血清，通过数据分析表明，SPF鸡阴性血清、新城疫灭活疫苗MG7疫苗株免疫鸡血清、基因VII型新城疫灭活疫苗G7株免疫鸡阳性血清和La Sota株免疫鸡阳性血清的符合率均为100％，这充分说明建立的检测方法有着很好的重复性。
以上对本发明实施例进行了详细介绍，本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明仅用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。同时，本领域技术人员依据本发明的思想，基于本发明的具体实施方式及应用范围上做出的改变或变形之处，都属于本发明保护的范围。综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。

Claims (10)

1.一种检测鸡新城疫病毒抗体的间接ELISA试剂盒，其特征在于，所述ELISA试剂盒包括包被有NP18蛋白的包被抗原，其中所述NP18蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，其中所述包被抗原的包被浓度为50ng/100μl；
其中，所述ELISA试剂盒进一步包括阳性对照血清、阴性对照血清、酶标二抗液、洗涤液、显色液、封闭液、稀释液、终止液、封板膜和说明书；
其中，所述阴性对照血清为鸡新城疫疫苗免疫鸡血清，所述鸡新城疫疫苗为鸡新城疫病毒MG7株标记疫苗；
其中，所述阳性对照血清选自以下的一种或多种：基因Ⅶ型新城疫免疫鸡阳性血清、LaSota免疫鸡阳性血清和田间样品新城疫鸡阳性血清；
其中，所述洗涤液为1×PBST洗涤液，所述1×PBST洗涤液的配置方法为：使用ddH2O将25倍浓缩PBST溶液稀释为1×PBST洗涤液；
其中，所述显色液为TMB显色液；
其中，所述封闭液为约2％BSA-1×PBST溶液；
其中，所述稀释液为血清稀释液；
其中，所述酶标二抗液为将HRP标记的山羊抗鸡IgG使用血清稀释液稀释4000倍制备而获得；
其中，所述终止液为约0.3mol/L硫酸溶液；
其中，将待检血清使用所述血清稀释液稀释100倍之后用于所述检测鸡新城疫病毒抗体的间接ELISA试剂盒；
其中，所述NP18蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示；
其中，所述NP18蛋白为NP蛋白优势抗原表位443aa～460aa经GGGSGG进行串联3次表达的蛋白，其中所述NP蛋白优势抗原表位443aa～460aa的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。
2.根据权利要求1所述的间接ELISA试剂盒，其特征在于，判断标准为：S/P值＝(待检血清样品的OD 450nm值-阴性对照血清OD 450nm平均值)/(阳性对照血清OD 450nm平均值-阴性对照血清OD 450nm平均值)，当S/P值<0.25，判为阴性，S/P值≥0.25，判为阳性。
3.根据权利要求1所述的间接ELISA试剂盒，其特征在于，所述包被抗原是通过如下方法制备的：(1)将所述NP18蛋白的核苷酸序列连接PGEX-4T-1原核表达载体；(2)将测序正确的质粒转化至E.coli BL21感受态细胞；(3)挑取单克隆细菌，在约0.4mmol/L约16℃条件下经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导22～24小时，同时设立未诱导阴性对照；以及(4)离心收集菌体进行超声破碎离心后收集上清，12％SDS-PAGE电泳分析表达蛋白并使用GST标签进行纯化，当所述NP18蛋白纯度在85％以上时，得到所述包被抗原。
4.一种检测鸡血清中是否存在鸡新城疫病毒抗体的间接ELISA检测方法，所述方法为非诊断目的的方法，其特征在于，所述间接ELISA检测方法包括以下步骤：
(1)包被：使用包被有NP18蛋白的包被抗原包被的ELISA板，50ng/100μl，4～6℃过夜，其中所述NP18蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；
(2)封闭：弃掉上清液，使用1×PBST洗涤液洗涤2～4遍后，使用约2％BSA-1×PBST溶液进行封闭，放置于约37℃下封闭0.5～2h；
(3)加入待检血清样品：将待检血清样品使用血清稀释液按照约1∶100的比例进行稀释，然后每孔加入经血清稀释液稀释的待检血清100μl，每板同时设置阴性对照和阳性对照各2～6孔，对照组同样按照上述方法稀释，使用封板膜封板后微量振荡器或手动方式，震动15～60s，放置于约37℃下孵育约1h；
(4)揭掉封板膜，弃去各孔中液体并拍净之后，每孔加入200μl1×PBST洗涤液，静置15～60s，重复洗涤2～4次，在吸水纸上拍净；
(5)加入酶标二抗：使用血清稀释液将HRP酶标二抗按照约1∶4000的比例进行稀释，然后每孔加入100μl，使用封板膜封板后在微量振荡器或手动方式，震动15～60s，放置于约37℃下孵育0.5～1h；
(6)重复洗涤3次；
(7)TMB显色：TMB底物A溶液与TMB底物B溶液按照1∶1的比例进行混匀后，每孔加入100μl，置于避光环境中，室温孵育5～10min；
(8)终止：每孔加入100μl终止液，终止反应后立即读值；
(9)读值：使用酶标仪，在450nm波长处测定各孔OD值，数据读取应在10min内完成；以及
(10)判断：标准为：S/P值＝(待检血清样品的OD 450nm值-阴性对照血清OD 450nm平均值)/(阳性对照血清OD 450nm平均值-阴性对照血清OD 450nm平均值)，当S/P值<0.25，判为阴性，S/P值≥0.25，判为阳性；
其中，所述阴性对照血清为鸡新城疫疫苗免疫鸡血清，所述鸡新城疫疫苗为鸡新城疫病毒MG7株标记疫苗；
其中，所述NP18蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示；
其中，所述NP18蛋白为NP蛋白优势抗原表位443aa～460aa经GGGSGG进行串联3次表达的蛋白，其中所述NP蛋白优势抗原表位443aa～460aa的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示；
其中，所述阳性对照血清选自以下的一种或多种：基因Ⅶ型新城疫免疫鸡阳性血清、LaSota免疫鸡阳性血清和田间样品新城疫鸡阳性血清。
5.根据权利要求4所述的间接ELISA检测方法，其特征在于，在步骤(2)中，放置于约37℃下封闭约1h。
6.根据权利要求4所述的间接ELISA检测方法，其特征在于，在步骤(5)中，放置于约37℃下孵育约0.5h。
7.根据权利要求4所述的间接ELISA检测方法，其特征在于，在步骤(2)和(4)中，所述1×PBST洗涤液的配置方法为：使用ddH2O将25倍浓缩PBST溶液稀释为1×PBST洗涤液。
8.根据权利要求4所述的间接ELISA检测方法，其特征在于，所述酶标二抗为HRP标记的山羊抗鸡IgG。
9.根据权利要求4所述的间接ELISA检测方法，其特征在于，所述终止液为约0.3mol/L硫酸溶液。
10.根据权利要求4至9中任一项所述的间接ELISA检测方法，其特征在于，所述包被抗原是通过如下方法制备的：(1)将所述NP18蛋白的核苷酸序列连接PGEX-4T-1原核表达载体；(2)将测序正确的质粒转化至E.coli BL21感受态细胞；(3)挑取单克隆细菌，在约0.4mmol/L约16℃条件下经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导22～24小时，同时设立未诱导阴性对照；以及(4)离心收集菌体进行超声破碎离心后收集上清，12％SDS-PAGE电泳分析表达蛋白并使用GST标签进行纯化，当所述NP18蛋白纯度在85％以上时，得到所述包被抗原。
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