CN112920268B - ASFV-p54蛋白特异性的纳米抗体-HRP融合蛋白及制备方法、应用 - Google Patents

ASFV-p54蛋白特异性的纳米抗体-HRP融合蛋白及制备方法、应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种ASFV‑p54蛋白特异性的纳米抗体‑HRP融合蛋白及制备方法、应用，涉及生物技术领域；本发明提供一种ASFV‑p54蛋白特异性的纳米抗体‑HRP融合蛋白由纳米抗体p54‑Nb83与HRP串联而成，所述纳米抗体p54‑Nb83的氨基酸序列如SEQ ID No：1所示；本发明还利用所述纳米抗体‑HRP融合蛋白作为灵敏探针，建立检测ASFV血清抗体的阻断ELISA，相比传统间接ELISA检测方法，所述阻断ELISA具有操作简单，成本低，灵敏度高，特异性强，稳定性好的优势，具有广阔的市场化及临床应用前景。

Description

ASFV-p54蛋白特异性的纳米抗体-HRP融合蛋白及制备方法、 应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别是涉及ASFV-p54蛋白特异性的纳米抗体-HRP融合蛋白及制备方法、应用。
背景技术
非洲猪瘟(African Swine Fever，ASF)是由非洲猪瘟病毒(African Swine FeverVirus，ASFV)感染家猪和野猪引起的一种高度接触性的烈性传染病，致死率几乎100％，世界动物卫生组织(OIE)将其列为法定报告传染病。该病于1921年首先在肯尼亚报道，2018年8月3日，中国正式报道了该病的存在，随后ASF在我国大面积暴发导致养猪业损失惨重，进而引起猪存栏数锐减、肉价飙升，对我国养猪业健康发展、猪肉稳定供应和经济稳定发展等带来严峻挑战。鉴于当前无有效商品化疫苗可用，ASF的早期快速准确诊断对该病的防控具有非常重要的意义。
ASFV为非洲猪瘟相关病毒科非洲猪瘟病毒属，是目前已知的唯一虫媒DNA病毒。ASFV病毒粒子直径约260-300nm，是有囊膜的二十面体线性双链DNA(Double-strandedDNA,dsDNA)病毒，属于核质大DNA病毒(Nucleo-cytoplasmic large DNA viruses,NCLDV)超家族。ASFV基因组长170-194kb，总共含有151-167个ORFs，编码包括p54、p72、p30在内的54种结构蛋白和100多种非结构蛋白。p54蛋白存在于病毒粒子内层囊膜，是ASFV重要的结构蛋白，由E183L基因编码。p54蛋白抗原性较好，动物实验表明，弱毒株攻毒后7-10天即可检测到p54抗体，因此其通常用与疫苗研制和血清学检测。
目前，间接ELISA是OIE指定的最常用的ASFV血清抗体检测方法。此外，国内外研究人员针对ASFV建立了多种核酸检测方法，主要有PCR、荧光定量PCR、数字PCR、恒温RPA-LFD以及纳米孔测序等，但这些方法存在检测时间长、操作繁琐、设备要求高、成本高、易污染等问题。目前，我国针对ASFV血清抗体的检测主要采用OIE推荐的间接ELISA检测方法，虽然该方法灵敏度较高且特异性较强，但是费时费力，生产成本高，周期长，严重阻碍了临床应用。建立新型的ASFV血清抗体ELISA检测方法是目前本领域亟待解决的问题。
在骆驼科动物体内存在一种天然缺失轻链和重链第一个恒定区的特殊IgG，被称作重链抗体(Heavy chain-only antibodies，HcAbs)，其抗原结合片段由一个单独的结构域构成，即重链抗体可变区(Variable domains of Camellidae heavychain-onlyantibodies，VHH)，又称为纳米抗体(nanobody，Nb)。纳米抗体具有分子量小(约15kDa)，高亲和力，高特异性，结构稳定，水溶性好，可以识别特殊的抗原表位且生产成本低等独特优点。相较于传统抗体，纳米抗体更易于进行遗传操作，可以和多种标记酶(如辣根过氧化物酶等)进行偶联。基于上述特点，纳米抗体成为比传统抗体更具优势的用于开发新型药物、病原诊断、治疗的有效工具。如Sheng等利用禽新城疫病毒(NDV)NP蛋白特异性纳米抗体-辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)偶联复合物作为反应抗体，成功建立NDV血清抗体新型、快速cELISA检测方法，该方法与传统ELISA检测结果符合率高，且比传统方法更灵敏，特异性更强，更快速。Sigal Gelkop等利用口蹄疫病毒(FMDV)的3ABC蛋白特异性纳米抗体建立检测FMDV血清抗体cELISA检测方法，和传统的间接ELISA方法相比，具有特异性更强，灵敏度更高的优势。上述研究表明，病毒相关蛋白的特异性纳米抗体能够用于建立病毒血清抗体新型ELISA检测方法，并且具有广阔的应用前景。因此，筛选和制备ASFV抗原蛋白的特异性纳米抗体，并建立高敏感性、高特异性的ASFV血清抗体阻断ELISA检测方法可以为临床监测猪体内的ASFV抗体水平提供有力的工具。
发明内容
本发明的目的是提供ASFV-p54蛋白特异性纳米抗体-HRP融合蛋白及其制备方法和应用，以解决上述现有技术存在的问题。
本发明的技术方案之一，一种抗ASFV p54蛋白的特异性纳米抗体p54-Nb83，所述纳米抗体p54-Nb83的氨基酸序列如SEQ ID No：1所示。
本发明的技术方案之二，一种编码所述纳米抗体氨基酸序列的核苷酸分子，所述核苷酸分子的核苷酸序列如SEQ ID No：2所示。
本发明的技术方案之三，一种融合蛋白p54-Nb83-HRP，所述融合蛋白p54-Nb83-HRP由所述的纳米抗体p54-Nb83与HRP串联而成。
本发明的技术方案之四，一种根据所述的融合蛋白p54-Nb83-HRP的制备方法，包括以下步骤：利用串联PCR将p54-Nb83基因序列与HRP基因序列串联，克隆入真核表达质粒中，构建重组表达质粒，将所述重组表达质粒转染宿主细胞后表达p54-Nb83-HRP融合蛋白。
进一步的，根据所述的制备方法，所述真核表达质粒为pCAGGS；所述重组表达质粒为pCAGGS-p54-Nb83-HRP；所述宿主细胞为HEK293T细胞。
本发明的技术方案之五，根据所述的融合蛋白p54-Nb83-HRP在制备检测抗ASFV抗体的产品中的应用。
进一步的，根据所述的应用，包括以下步骤：
(1)ELISA板上包被ASFV p54蛋白，得到已包被ASFV p54蛋白的ELISA板；(2)将待检猪血清与ELISA板孵育；(3)将融合蛋白p54-Nb83-HRP加入步骤(1)所述ELISA板中，孵育后加入显色液避光反应，加入3M硫酸终止反应后观察颜色，若待检样品中含有p54蛋白特异性抗体，则反应孔呈浅黄色或无色；若待检样品中无p54蛋白特异性抗体，则反应孔黄色较深。
本发明公开了以下技术效果：本发明利用噬菌体展示技术筛选出针对ASFV p54蛋白特异性纳米抗体p54-Nb83，并利用HEK293T细胞成功表达p54-Nb83-HRP融合蛋白。利用HEK293T表达系统有利于大规模、低成本的制备该酶标纳米抗体。利用此酶标纳米抗体作为灵敏探针，建立检测ASFV血清抗体的阻断ELISA。相比传统间接ELISA检测方法，该阻断ELISA具有操作简单，成本低，灵敏度高，特异性强，稳定性好的优势，具有广阔的市场化及临床应用前景。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为ELISA分析p54-Nb83的特异性和亲和力，其中A为ELISA分析不同纳米抗体粗提物与p54蛋白反应活性；B为不同株纳米抗体与p54蛋白反应特异性分析；C为不同株纳米抗体亲和力分析；
图2为p54-Nb83-HRP融合蛋白的表达及鉴定，其中A为Western blot鉴定p54-Nb83-HRP融合蛋白在HEK293T细胞中表达；B为IFA鉴定p54-Nb83-HRP融合蛋白在HEK293T细胞中表达；C为ELISA检测HEK293T细胞培养上清中p54-Nb83-HRP融合蛋与ASFV p54蛋白特异性结合；D为ELISA检测HEK293T细胞培养上清中p54-Nb83-HRP融合蛋与ASFV p54蛋白亲和力；
图3为阻断ELISA的重复性、特异性和敏感性分析，其中A为阻断ELISA重复性分析；B为不同病毒抗体阳性血清阻断效果分析；C为阻断ELSIA敏感性分析。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。
实施例1ASFV结构蛋白p54特异性纳米抗体筛选
原核表达纯化可溶性p54蛋白，测定浓度后，免疫双峰驼，共免疫4次。最后一次免疫后一周采血，分离外周血单核细胞，提取总RNA，反转录，建立cDNA文库作为模板进行PCR反应。将PCR产物酶切后连接入噬菌体展示载体上，利用噬菌体展示技术经过3轮淘选，筛选针对p54蛋白特异性纳米抗体。利用ELISA分析纳米抗体的特异性和亲和力，结果如图1所示，其中，A为ELISA分析不同纳米抗体粗提物与p54蛋白反应活性；B为不同株纳米抗体与p54蛋白反应特异性分析；C为不同株纳米抗体亲和力分析。
最终筛选到的针对p54蛋白的纳米抗体氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，其对应的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。将此纳米抗体命名为p54-Nb83。
实施例2p54-Nb83-HRP融合蛋白的制备
利用串联PCR将p54-Nb83基因序列与HRP基因序列串联，克隆入真核表达质粒pCAGGS中，构建重组表达质粒pCAGGS-p54-Nb83-HRP。测序正确后，将此质粒转染HEK293T细胞，转染后48h收取细胞培养上清，离心，浓缩后获取p54-Nb83-HRP融合蛋白。具体制备方法为：
(1)含有分泌信号肽序列的重组pCAGGS真核表达质粒由本实验室制备、保存。将Nb83序列(引物为F1和R1)和HRP序列(引物为F2和R2)利用overlap PCR串联，引物序列如下：F1：CGGAATTCATGCAGGTGACCAACTGGTCCAGTGG(SEQ ID No：3)；R1：GGTGTCGGTCTCCATGAATTCCATGCGGCCGCTGAGGAGACGGTGAC(SEQ ID No：4)；F2：GTCACCGTCTCCTCAGCGGCCGCATGGAATTCATGGAGACCGACA CC(SEQ ID No：5)；R2：CGGCTAGCTCTAGATTAGTGGTGATGGTGG(SEQ ID No：6)。经EoR I/Nhe I双酶切后，将上述融合基因克隆入pCAGGS质粒，构建重组表达质粒pCAGGS-p54-Nb83-HRP；
(2)状态良好的HEK-293T细胞铺6孔板，铺板密度为2.5×105个细胞/ml，2ml/孔；
(3)约24h后，待细胞达到80％汇合度时，利用罗氏X-tremeGENE HP DNATransfection Reagent进行转染，具体操作如下：
a：转染前2h，弃掉6孔板内旧培养基，1ml PBS/孔，洗1次；弃掉PBS，每孔加入1.8mlOpti-MEM，放置37℃培养箱继续培养；
b：于超净工作台内取1.5ml EP管，按照200μl/孔的体积加入Opti-MEM，然后加入质粒，2μg/孔，轻轻吹打混匀；
c：向稀释好的质粒中加入转染试剂，按照6μl/孔的量加入；轻轻吹打混匀，室温静置20min；
d：将转染复合物加入细胞培养孔中，200μl/孔，轻摇混匀，放入细胞培养箱中继续培养48h；
(4)收取细胞上清：在超净工作台内收取细胞上清，12,000g，4℃离心10min，除去细胞碎片，上清转移至新的1.5ml EP管中，分装保存至-80℃，待用；
(5)Western blot及IFA分析p54-Nb83-HRP融合蛋白在HEK-293T细胞中表达情况；直接ELISA检测HEK-293T细胞培养上清中p54-Nb83-HRP融合蛋白与ASFV p54蛋白特异性结合；上清中p54-Nb83-HRP融合蛋白按1:5，1:10，1:20，1:40，1:80，1:160稀释，直接ELISA分析该融合蛋白亲和力。
Western blot和IFA检测结果显示，p54-Nb83-HRP融合蛋白在HEK-293T细胞中成功表达(图2A和B)。直接ELISA方法检测p54-Nb83-HRP融合蛋白与p54结合的特异性，结果显示p54-Nb83-HRP融合蛋白可以特异性结合ASFV p54蛋白，与猪繁殖与呼吸综合征病毒N蛋白、猪流行性腹泻病毒N蛋白和ASFV p30蛋白没有交叉反应(图2C)。直接ELISA方法检测p54-Nb83-HRP亲和力结果表明，该重组纳米抗体与p54蛋白具有良好的亲和力(图2D)。
实施例3利用p54-Nb83-HRP融合蛋白建立ASFV血清抗体阻断ELISA检测方法
(1)不同浓度p54蛋白包板，4℃包被过夜；加入不同稀释比例的p54-Nb83-HRP细胞培养上清，进行直接ELISA检测，当OD450值为1.0时，即确定为最佳p54蛋白包被浓度和p54-Nb83-HRP稀释比例。
(2)包被抗原：可溶性p54蛋白包板，4℃包被过夜；
(3)封闭：100μl/孔2.5％脱脂奶粉37℃封闭1h；
(4)孵育猪血清：向反应孔中加入梯度稀释猪血清，100μl/孔，37℃条件下确定最佳孵育时间，PBS’T洗3次；
(5)孵育酶标二抗：向反应孔中加入p54-Nb83-HRP细胞培养上清，37℃条件下确定最佳孵育时间，PBS’T洗3次；
(6)显色：每孔加入100μl商品化的TMB底物显色液，室温避光孵育，确定最佳孵育时间，加入3M H2SO4终止显色，读取OD450吸光度值。
结果判定：在酶标仪上检测各样品的OD450值。试验成立的条件是：阴性对照孔平均OD450值＞1.04，阳性对照孔平均OD450值≤0.334。
计算待检样品阻断率(1-S/N)值，S为待检样品OD450值，N为阴性对照样品平均OD450值。若阻断率≥39.16％，判为阳性；若阻断率＜25.56％，判为阴性。若阻断率大于25.56％而小于39.16％则判定为可疑，需复检。
阻断ELISA最佳反应条件如下：p54抗原包被量为320ng/孔；猪血清最佳稀释比为1:10，最佳孵育时间为1h；p54-Nb83-HRP上清最佳稀释比例为1:10，最佳孵育时间为30min；TMB最佳显色时间为10min。
实施例4利用p54-Nb83-HRP融合探针建立阻断ELISA检测方法的重复性分析
按照已经优化好的最佳阻断ELISA反应条件，在不同时间，不同人员操作的情况下对6份血清(3份阳性，3份阴性)进行了3次试验，每次试验每份血清做3个重复孔，对阻断率进行统计分析，评价所建立方法的重复性。结果表明，在三次重复试验中，未出现假阴性与假阳性情况(图3A)。
实施例5利用p54-Nb83-HRP融合探针建立阻断ELISA检测方法的特异性分析
利用实施例3建立的阻断ELISA检测方法分别检测猪伪狂犬病毒抗体阳性血清、猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体阳性血清、猪传染性胃肠炎病毒抗体阳性血清、猪流行性腹泻病毒抗体阳性血清、猪细小病毒抗体阳性血清和猪瘟病毒抗体阳性血清，同时利用灭活的ASFV阳性血清作为阳性对照。分析上述阳性血清能否阻断p54-Nb83-HRP融合蛋白与p54蛋白结合。检测结果表明，除阳性对照血清外，其余血清均不能阻断p54-Nb83-HRP融合蛋白与p54蛋白结合，表明建立的阻断ELISA检测方法与目前猪场主要疫病阳性血清不发生交叉反应(结果如图3B所示)，本发明建立的阻断ELISA检测方法具有高度的特异性。
实施例6利用p54-Nb83-HRP融合探针建立阻断ELISA检测方法的敏感性分析
3份灭活的ASFV抗体阳性血清样品分别以1:5，1:10，1:20，1:40，1:80，1:160，1:320，1:640，1:1280，1:2560，1:5120，1:10240和1：20480比例稀释，然后利用实施例3建立的优化好的阻断ELISA检测方法对上述血清进行检测，确定ELISA的阻断率。检测结果表明，当血清稀释比例为1:5120时，阻断率仍可达到40％(图3C)，大于阳性截断率，说明本阻断ELISA检测灵敏度可以达到1:5120，具有很高的灵敏性。
实施例7阻断ELISA与商品化ELISA检测试剂盒一致性分析
利用实施例3建立的阻断ELISA检测方法和西班牙INGENASA ASFV血清抗体ELISA检测试剂盒分别检测96份灭活临床猪血清样品，其中包括85份ASFV抗体阴性血清样品，11份ASFV抗体阳性血清样品。p54-Nb83-HRP融合蛋白建立的优化好检测条件的阻断ELISA检测结果表明，96份血清样品中有85份ASFV抗体阴性样品，11份ASFV抗体阳性样品。用INGENASA的间接ELISA检测试剂盒检测结果显示，96份血清样品中有88份为ASFV抗体阴性血清，8份为ASFV抗体阳性样品。本实验所建立的方法与该商业检测试剂盒比较阳性符合率为90.00％，阴性符合率为98.82％，总体符合率为96.88％(表1)。前者灵敏度为90.00％，商品化试剂盒灵敏度为81.82％。表明该ELISA检测方法与商品化ELISA检测试剂盒相比，具有更高的敏感性。
表1本研究建立的阻断ELISA方法符合性试验结果
Figure BDA0002983489840000111
实施例8利用实施例3建立的阻断ELISA法检测猪血清中抗ASFV抗体的临床应用
按照建立的阻断ELISA优化后的反应条件，检测210份灭活临床猪血清样品。检测结果显示，210份血清样品中，17份为ASFV抗体阳性血清，193份为ASFV抗体阴性血清。表明建立的阻断ELISA能有效应用于临床样品检测。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
序列表
<110> 河南农业大学
<120> ASFV-p54蛋白特异性的纳米抗体-HRP融合蛋白及制备方法、应用
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Gln Val Thr Asn Trp Ser Ser Gly Gly Gly Ser Ala Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Ala Tyr Ser Ala Ser Ala Tyr Ser Leu Pro Phe
20 25 30
Met Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Arg Gly Glu Ser Gly Val Ile Ser
35 40 45
Gln Leu Arg Pro Gly Ala Gly Met Ala Tyr Lys Val Gly Ser Ser Asn
50 55 60
Pro Leu Ser Asn Phe Thr Ala Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln
65 70 75 80
Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Ala
85 90 95
Arg Thr Ser Ser Gly Ala Tyr Tyr Trp Gln Asp Arg Gly Arg Tyr Pro
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Ala Ala
115 120 125
<210> 2
<211> 386
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
caggtgacca actggtccag tgggggaggc tcggcgcagg ctggagggtc tctgagactc 60
tcctgagcct acagtgcatc tgcgtacagt ttgcccttca tggcgtggtt ccgccaggct 120
ccaagggggg agagcggcgt tatttcgcag ctgaggcctg gtgcgggtat ggcatactag 180
aaggtagggt cgtccaaccc gctctccaac ttcaccgcca acgccaagaa cacagtatat 240
ctgcagatga acagcctgaa acctgaggac actgccatgt actactgtgc ggcgagaacg 300
tcgagtggtg cttactactg gcaggaccgc ggacggtatc cttactgggg ccaggggacc 360
caggtcaccg tctcctcagc ggccgc 386
<210> 3
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cggaattcat gcaggtgacc aactggtcca gtgg 34
<210> 4
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ggtgtcggtc tccatgaatt ccatgcggcc gctgaggaga cggtgac 47
<210> 5
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gtcaccgtct cctcagcggc cgcatggaat tcatggagac cgacacc 47
<210> 6
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
cggctagctc tagattagtg gtgatggtgg 30

Claims (7)

1.一种抗ASFV-p54蛋白的纳米抗体p54-Nb83，其特征在于：所述纳米抗体p54-Nb83的氨基酸序列如SEQ ID No：1所示。
2.一种编码权利要求1所述纳米抗体氨基酸序列的核苷酸分子，其特征在于：所述核苷酸分子的核苷酸序列如SEQ ID No：2所示。
3.一种融合蛋白p54-Nb83-HRP，其特征在于：所述融合蛋白p54-Nb83-HRP由权利要求1所述的纳米抗体p54-Nb83与HRP串联而成。
4.一种根据权利要求3所述的融合蛋白p54-Nb83-HRP的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：利用串联PCR将p54-Nb83基因序列与HRP基因序列串联，克隆入真核表达质粒中，构建重组表达质粒，将所述重组表达质粒转染宿主细胞后表达p54-Nb83-HRP融合蛋白。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：所述真核表达质粒为pCAGGS；所述重组表达质粒为pCAGGS-p54-Nb83-HRP；所述宿主细胞为HEK293T细胞。
6.根据权利要求3所述的融合蛋白p54-Nb83-HRP在制备检测抗ASFV抗体的产品中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述检测包括以下步骤：
(1)ELISA板上包被ASFV p54蛋白，得到已包被ASFV p54蛋白的ELISA板；(2)将待检猪血清样品与步骤(1)包被蛋白孵育；(3)将融合蛋白p54-Nb83-HRP加至上述ELISA板上，孵育后加入显色液避光反应，加入3M硫酸终止反应后观察颜色，若待检样品中含有p54蛋白特异性抗体，则反应孔呈浅黄色或无色；若待检样品中无p54蛋白特异性抗体，则反应孔黄色较深。
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