CN114807178B - 非洲猪瘟病毒p72蛋白c末端多表位重组抗原及应用 - Google Patents

非洲猪瘟病毒p72蛋白c末端多表位重组抗原及应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于动物传染病及基因工程技术领域，公开了一种非洲猪瘟病毒P72蛋白C末端多表位重组抗原及应用，所述非洲猪瘟病毒P72蛋白C末端多表位重组抗原基因P72‑B的核苷酸序列为SEQ ID NO：1；所述非洲猪瘟病毒P72蛋白抗原表位基因序列表达载体的构建方法包括：根据P72‑B基因序列，设计引物P72‑BF和P72‑BR并合成，以合成的P72‑B基因序列为模版进行PCR扩增；将纯化回收的P72‑B基因序列用BamH I和Xho I双酶切，用BamH I和Xho I双酶切质粒载体Pet28a，将P72‑B序列片段同质粒载体Pet28a进行连接。本发明为非洲猪瘟的诊断及免疫反应研究提供重要帮助。

Description

非洲猪瘟病毒P72蛋白C末端多表位重组抗原及应用
技术领域
本发明属于动物转染病及基因工程技术领域，尤其涉及一种非洲猪瘟病毒P72蛋白C末端多表位重组抗原及应用。
背景技术
目前，非洲猪瘟病毒(African swine fever virus，ASFV)是一种核质巨双链DNA病毒，也是目前唯一已知的虫媒DNA病毒，不同毒株之间基因组大小存在一定差异，总体介于170～190kb之间，基因组可编码150多个开放阅读框，成熟病毒粒子中含有50种以上结构蛋白。在病毒分类中隶属于DNA病毒目、非洲猪瘟病毒科、非洲猪瘟病毒属。该病原对家猪和野猪较为易感，临床上可引起较高的发病率和死亡率。自2018年8月份我国确诊有非洲猪瘟疫情以来，给我国生猪养殖业带来了巨大的经济损失，严重影响了我国猪肉食品的市场供应，另外该病在东亚诸多国家相继有发生和报道，给全球生猪养殖业带来了巨大的危害。OIE将非洲猪瘟列为必须报告的动物疫病，我国也将其列为一类动物疫病。
筛选抗原性强和保守性好的抗原表位序列，并建立特异、敏感、快速、便于操作的血清学诊断方法，将为非洲猪瘟的防控和监测提供重要帮助。非洲猪瘟病毒P72蛋白是该病毒衣壳的主要组成部分，也是含量最多的病毒蛋白，占该病毒蛋白总量的32％。P72蛋白由B646L(VP72)基因编码，该蛋白具有高度的抗原性和免疫原性，病毒感染机体后可产生较高滴度的抗P72蛋白抗体。同时该蛋白序列也具有较高的保守性，分离来自不同区域的毒株，发现该蛋白的同源性可高达97.8～100％，所以在非洲猪瘟病原及血清学诊断中常被用作靶标序列。其中VP73蛋白是P72蛋白N端部分序列，VP73蛋白含有396个氨基酸，分子量约为44.8KDa。李秋霞等将非洲猪瘟病毒VP73全基因序列从重组质粒pPICZαA-VP73双酶切后，构建了pET32a-VP73表达载体，经诱导表达获得了VP73蛋白全序列；同时也对VP73蛋白N’端第246-326位区段氨基酸对应的基因序列进行了PCR扩增，构建了pET32a-VP73L表达载体，并将VP73蛋白N’端第246-326位区段氨基酸序列原核表达纯化后作为包被抗原，以辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔IgG为二抗，建立了检测非洲猪瘟病毒抗体的间接ELISA检测方法。曾少灵等设计相应引物从pDAB-VP73质粒上扩增了VP73基因全序列，构建了pFastBacHTA-VP73载体，转染昆虫细胞Sf9中成功表达了非洲猪瘟病毒VP73蛋白，以该蛋白为包被抗原初步建立了检测非洲猪瘟病毒抗体的间接ELISA方法。靳雯雯等合成非洲猪瘟病毒VP73全基因序列并构建原核表达载体pGEX-KG-VP73，经诱导表达后获得VP73蛋白全序列，作为包被抗原，建立了检测非洲猪瘟抗体的间接ELISA检测方法。上述研究主要是对非洲猪瘟P72蛋白N’端片段(VP73)进行了原核表达和真核表达，所表达的序列中还有一些非抗原表位序列，表达过程中可能会影响目的重组蛋白的剂量或造成目的重组蛋白不进行表达；另外带有非抗原表位序列的重组蛋白使有效的抗原表位不能完全呈现出来，在进行检测时影响目的抗体的吸附和结合，造成漏检或抗体效价偏低的现象，不能确切的反映抗体真实水平。另外非洲猪瘟P72蛋白N’端在不同基因型的非洲猪瘟病毒中存在相应的差异性，只能进行同一基因型病毒抗体的检测，作为检测抗原在临床应用中存在相应的局限性。当前对P72结构蛋白C末端相关表位的制备和应用还没有相关文献报道和研究。
通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：
(1)现有技术主要是对非洲猪瘟P72蛋白N’端片段(VP73)进行了原核表达和真核表达，所表达的序列中还有一些非抗原表位序列，表达过程中可能会影响目的重组蛋白的剂量或造成目的重组蛋白不进行表达。
(2)现有技术中，带有非抗原表位序列的重组蛋白使有效的抗原表位不能完全呈现出来，在进行检测时影响目的抗体的吸附和结合，造成漏检或抗体效价偏低的现象，不能确切的反映抗体真实水平。
(3)非洲猪瘟P72蛋白N’端在不同基因型的非洲猪瘟病毒中存在相应的差异性，只能进行同一基因型病毒抗体的检测，作为检测抗原在临床应用中存在相应的局限性。
(4)当前对P72结构蛋白C末端相关表位的制备和应用还没有相关文献报道和研究。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种非洲猪瘟病毒P72蛋白C末端多表位重组抗原及应用，尤其涉及一种非洲猪瘟病毒P72蛋白优势抗原表位基因序列的筛选、合成、原核表达、抗体的制备及诊断中的应用。
本发明是这样实现的，一种非洲猪瘟病毒P72蛋白C末端多表位重组抗原基因，所述非洲猪瘟病毒P72蛋白C末端多表位重组抗原基因P72-B的核苷酸序列为SEQ ID NO：1。
本发明的另一目的在于提供一种应用所述非洲猪瘟病毒P72蛋白C末端多表位重组抗原基因编码的蛋白质，所述蛋白质的氨基酸序列为SEQ ID NO：2。
本发明的另一目的在于提供一种应用所述非洲猪瘟病毒P72蛋白C末端多表位重组抗原基因构建的非洲猪瘟病毒P72蛋白抗原表位基因序列表达载体，所述非洲猪瘟病毒P72蛋白抗原表位基因序列表达载体的构建方法包括：
根据筛选合成的P72-B基因序列，设计引物P72-BF和P72-BR并进行合成，以合成的P72-B基因序列为模版进行PCR扩增。
将纯化回收的P72-B基因序列用BamHI和Xho I双酶切，用BamHI和Xho I双酶切质粒载体Pet28a，并将P72-B序列片段同质粒载体Pet28a进行连接。
进一步，所述引物P72-BF加有BamHI限制性酶切位点以及保护性碱基，所述引物核苷酸序列为SEQ ID NO：3；所述引物P72-BR加有Xho I限制性酶切位点以及保护性碱基，所述引物核苷酸序列为SEQ ID NO：4。
所述P72-B基因序列的PCR扩增体系为50μL：合成的模板2μL5×PrimeSTAR Buffer10μL，100μmol/L P72-BF/R引物各1μL，2.5mmol/L dNTP Mixture 4μL，2.5U/μL PrimeSTARHS DNA Polymerase 0.5μL，ddH2O 31.5μL。
所述PCR反应条件为：95℃变性5min后进入循环，循环参数为95℃50s，54℃20s，72℃50s，30个循环后，72℃延伸10min；结束后用浓度为1％的琼脂糖凝胶进行鉴定，并纯化回收P72-B基因序列600bp的特异性目的片段。
所述连接体系如下：BamHI-Xho I酶切的P72-B序列4μL，BamHI-Xho I酶切的Pet28a4μL，10×连接缓冲液1μL，T4 DNA连接酶1μL，4℃连接16h后热应激转化到BL21感受态中，涂布添加有终浓度50μg/mL卡那霉素LB平板上，37℃培养16h，挑取单菌落接种至含有50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，提取质粒进行鉴定；PCR鉴定筛选获得的转化质粒Pet28a-P72-B的BL21菌株。
本发明的另一目的在于提供一种应用所述非洲猪瘟病毒P72蛋白C末端多表位重组抗原基因的非洲猪病病毒P72蛋白抗原表位的表达、纯化及反应原性鉴定方法，所述非洲猪病病毒P72蛋白抗原表位的表达、纯化及反应原性鉴定方法包括：
(1)挑取E.Coli BL21/pET28a-P72-B单菌落过夜培养后，以1％接种量转接至新鲜配制的含有卡那霉素的LB液体培养基中，37℃，240rpm振荡培养2h，OD600nm至0.8～1.0，加入IPTG至终浓度1.0mmol/L，转移至37℃，240rpm振荡培养6h，离心收集菌体；将得到的菌体重悬于PBS中，加入溶菌酶终浓度为1mg/mL，冰上放置30min，超声裂解破碎细胞，4℃10000rpm离心15min，弃上清，得包涵体沉淀。
(2)将包涵体溶解于结合缓冲液，包涵体溶解后，4℃10000rpm离心15min，取上清；结合缓冲液预先平衡，与His-Bind树脂结合1h，弃掉过滤液，用漂洗液C洗涤过滤两次，再用漂洗液D洗涤过滤4次；用洗脱液收集目的蛋白。
(3)纯化后的重组蛋白放入预先处理好的半透膜中，并加入终浓度为1mg/mL的还原型谷胱甘肽；在4℃环境下，分别在含有4mol/L、3mol/L、2mol/L、1mol/L尿素的pH 8.5的PBS中缓慢透析，透析完后收集纯化的P72-B蛋白，测定蛋白浓度，并进行SDS-PAGE电泳鉴定，获得特异性的蛋白条带。
(4)SDS-PAGE电泳结束后进行Western-Blot鉴定蛋白的免疫原性，预先裁好与胶条同样大小的硝酸纤维素膜和滤纸，浸入电转缓冲液中；将凝胶卸下，在转移缓冲液中平衡后，按顺序铺设滤纸、NC膜、凝胶和滤纸，并用干净的玻棒轻轻滚过夹层；封紧后放入电转槽，加入电转液，并接好冷却装置，200mA恒流转移1h；转移完毕后取下NC膜，用TBST洗膜，5min×3次；将NC膜放入5％脱脂乳中，4℃封闭过夜，弃去封闭液，用TBST洗膜，5min×3次；
(5)按照1：100的比例加入一抗即用TBST稀释的非洲猪瘟抗体阳性猪血清，平稳摇动，室温1h，弃一抗，用TBST洗膜，5min×4次；加入辣根过氧化物酶标记的兔抗猪酶标二抗，用TBST按1：50000比例稀释，平稳摇动，室温1h，弃二抗，用TBST洗膜，5min×3次；将用二抗作用过的NC膜置于显色液中显色，待出现特异性反应条带后，终止反应并进行拍照保存。
进一步，所述卡那霉素的浓度为50μg/mL，所述超声裂解破碎细胞的功率为400W，超声破碎时间为5s，间隔时间为5s，超声时间为30min。
所述结合缓冲液包括8mol/L尿素，0.1mol/L NaH2PO4，0.01mol/L Tris-CL，pH8.0；
所述漂洗液C包括8mol/L尿素；0.1mol/L NaH2PO4；0.01mol/L Tris-CL pH6.3；
所述漂洗液D包括8mol/L尿素；0.1mol/L NaH2PO4；0.01mol/L Tris-CL pH5.9；
所述目的蛋白包括8mol/L尿素；0.1mol/L NaH2PO4；0.01mol/L Tris-CL pH4.5；
所述半透膜的预先处理方法为：在100℃水中煮沸10min。
本发明的另一目的在于提供一种所述的非洲猪瘟病毒P72蛋白C末端多表位重组抗原基因在血清学检测中的应用。
本发明的另一目的在于提供一种鉴定所述非洲猪瘟病毒P72蛋白C末端多表位重组抗原基因在血清学检测中应用的方法，所述鉴定非洲猪瘟病毒P72蛋白C末端多表位重组抗原基因在血清学检测中应用的方法包括：
利用表达纯化的P72蛋白抗原表位建立检测非洲猪瘟抗体的间接ELISA方法；将表达纯化的P72蛋白抗原表位用包被液稀释成2.5μg/mL，以100μL/孔的量加入酶标板中，4℃包被过夜；每孔加入PBST 300μL，洗涤2次，拍干后以封闭液100μL/孔于37℃封闭2h；每孔加入PBST 300μL，洗涤2次，拍干，每孔加入100μL 1：100稀释的待检猪血清。
设立非洲猪瘟血清抗体阳性对照样品两个孔，100μL/孔，阴性对照样品两个孔，100μL/孔，37℃温育30min后弃去孔中液体；每孔加入PBST 300μL，洗涤5次，拍干，每孔加入100μL 1：50000稀释的HRP标记的兔抗猪IgG，37℃作用30min后弃去孔中液体；每孔加入PBST 300μL，洗涤5次，拍干，每孔加入100μL TMB单组份显色液，避光显色10min；每孔加入100μL 2mol/L H2SO4终止显色，用酶标仪测定OD450nm值。
进一步，所述包被液包括0.05mol/L碳酸盐缓冲液pH 9.6，所述封闭液包括0.01g/mL的BSA；所述非洲猪瘟抗体检测方法的结果判定标准为：
当阴性对照OD450nm平均值N小于0.25，阳性对照OD450nm平均值P大于0.65时，样品OD450nm值S/阴性对照OD450nm平均值N≥2.1时判定为阳性，样品OD450nm值S/阴性对照OD450nm平均值N<2.1时判定为阴性。
本发明的另一目的在于提供一种所述的非洲猪瘟病毒P72蛋白C末端多表位重组抗原基因在抗非洲猪病病毒P72蛋白抗原表位多抗制备中的应用。
结合上述的技术方案和解决的技术问题，请从以下几方面分析本发明所要保护的技术方案所具备的优点及积极效果为：
第一、针对上述现有技术存在的技术问题以及解决该问题的难度，紧密结合本发明的所要保护的技术方案以及研发过程中结果和数据等，详细、深刻地分析本发明技术方案如何解决的技术问题，解决问题之后带来的一些具备创造性的技术效果。具体描述如下：
为了能使非洲猪瘟P72蛋白抗原表位充分呈现出来，提高该蛋白抗原在检测中的特异性和敏感性，本发明将非洲猪瘟病毒P72蛋白全基因序列用生物信息学相关软件进行分析，发现位于P72蛋白C末端的三个抗原表位具有更好的免疫反应原性，所呈现的表面可及性指数优于P72蛋白其它的抗原表位，且三个抗原表位在不同基因型的非洲猪瘟病毒中高度保守。本发明将筛选的非洲猪瘟病毒P72蛋白C末端优势抗原表位基因序列进行串联合成，然后构建PET28a载体，转化大肠杆菌进行大量诱导表达，提取多表位重组抗原进行Western-blot鉴定，结果显示与非洲猪瘟阳性血清具有良好的免疫反应原性。
本发明利用同一批次的该检测方法检测已知背景猪血清30份，其中非洲猪瘟抗体阳性血清12份，非洲猪瘟抗体阴性血清18份；对30份血清样本中每份样品进行3次重复检测，结果显示批内变异系数在1.00～8.84％之间，说明该试剂盒的批内重复性良好。本发明利用不同批次的该检测方法检测已知背景猪血清30份，其中非洲猪瘟抗体阳性血清12份，非洲猪瘟抗体阴性血清18份；对30份猪血清样本中每份血清同时进行3个批次检测方法的检测，结果显示批间变异系数在1.08～9.31％之间，说明该试剂盒的批间重复性良好
目前我国国内没有非洲猪瘟抗体检测试剂盒上市，国外的同类产品有西班牙INGENASA公司生产的非洲猪瘟抗体ELISA检测试剂盒。本发明将自己建立的检测方法与西班牙INGENASA公司生产的试剂盒进行了比较，检测100份临床猪血清，用建立的P72蛋白抗原表位的抗体ELISA检测试剂盒检测100份血清，结果阳性率为43.00％(43/100)，阴性率为57.00％(57/100)；用西班牙INGENASA公司生产的试剂盒检测的阳性率为39.00％(39/100)，阴性率为61.00％(61/100)；两者阳性符合率为90.70％(39/43)，阴性符合率为93.44％(57/61)，总符合率为96.00％(96/100)。
第二，把技术方案看做一个整体或者从产品的角度，本发明所要保护的技术方案具备的技术效果和优点，具体描述如下：
本发明利用表达纯化的重组多表位抗原建立了检测非洲猪瘟病毒抗体的间接ELISA方法，并将制备的重组多表位抗原免疫新西兰大白兔，制备特异性的多克隆抗体，为非洲猪瘟的诊断及免疫反应研究提供重要帮助。
第三，作为本发明的权利要求的创造性辅助证据，还体现在以下几个重要方面：
(1)本发明的技术方案转化后的预期收益和商业价值为：本发明技术利用生物信息学技术筛选出非洲猪瘟病毒P72蛋白C末端优势抗原表位，并进行串联表达获得稳定性抗原，利用该抗原建立了检测非洲猪瘟抗体的ELISA方法，可高效检测出生产中猪只的非洲猪瘟抗体水平，用于指导临床生产中非洲猪瘟的防控有重要帮助，利用该方法可检测出非洲猪瘟潜在感染的猪只，可对非洲猪瘟病原进行早期的监测和诊断，及时发现潜在感染猪只，快速的采取应对措施，更有利用防控该病的大面积传播和流行。另外P72蛋白C末端优势抗原表位在非洲猪瘟不同的基因型中具有高度的保守性，对临床上发生变异的非洲猪瘟病毒感染也可敏感、准确的监测和检测出。在非洲猪瘟的疫苗研发方面，亚单位疫苗是目前较为安全、理想的研究方向，P72蛋白C末端优势抗原表位在非洲感染的过程中可产生较为强烈的体液免疫，也是亚单疫苗研制过程中的重要目标蛋白，本发明技术在获得P72蛋白C末端优势抗原表位的基础上，免疫新西兰大白兔也产生了较高的抗体水平。所以本发明技术方案转化后将在非洲猪瘟的诊断及亚单疫苗的研发等方面产生巨大的效益及社会价值。
(2)本发明的技术方案填补了国内外业内技术空白：高效、快速、便捷、准确的诊断是防控非洲猪瘟的首要方法，目前国内有关非洲猪瘟的抗体诊断处在实验研发阶段，还没有高效、准确的抗体检测方法在市场上进行大量的推广应用，我国虽有相关文献报道建立了相应的检测方法，但没有把P72蛋白C末端优势抗原表位作为重要靶标检测抗原。国外虽然建立了检测非洲猪瘟P72蛋白抗体的检测方法，但选定的竞争抗体是P72蛋白的某个位点，由于非洲猪瘟病原P72蛋白在不同的血清型中存在变异，在临床应用中容易造成漏检等现象。本发明技术在国内外首次将非洲猪瘟P72蛋白C末端优势抗原表位进行筛选和串联，建立相应的检测方法，并制备了高效价的抗体；说明获得的非洲猪瘟P72蛋白C末端优势抗原表位在诊断及亚单位疫苗方法具有重大的应用价值。
(3)本发明的技术方案是否解决了人们一直渴望解决、但始终未能获得成功的技术难题：随着非洲猪瘟在我国的广泛流行和传播，研制出高效、便捷、准确的抗体诊断方法是我国相关科研工作者一直研究的热点问题，但在相应的抗体检测方法中抗原靶标的筛选尤为重要，现有的相关资料显示都是以连续的蛋白序列片段进行表达和纯化，在临床应用中容易产生非特异性反应，且优势表位不容易暴露出来，影响检测方法的敏感性。本发明技术利用非洲猪瘟P72蛋白C末端高度保守、且免疫原性和反应原性强的表位进行串联，在抗体检测兼具特异性和敏感性，另外免疫新西兰大巴兔不受非免疫原性蛋白的影响，可产生高效价的抗体，一定程度上创新了非洲猪瘟抗体检测方面及亚单位疫苗的创制。
(4)本发明的技术方案是否克服了技术偏见：在以往的靶标抗原研究中，都是选取靶标抗原整片段的连续序列进行克隆表达，获得的靶标抗原存在很多无用的序列，影响后期的诊断应用及亚单位疫苗抗原的免疫效果，该项目技术不同于以往传统的靶标抗原连续序列表达，而是筛选优势抗原表位进行克隆和表达，获得的抗原通过后期诊断方法的建立，及多抗的产生均获得了良好的效果。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对本发明实施例中所需要使用的附图做简单的介绍，显而易见地，下面所描述的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例提供的非洲猪瘟病毒P72蛋白C末端多表位基因序列表达载体的构建方法流程图；
图2是本发明实施例提供的VP72蛋白序列亲水性、抗原指数、及表面可及性预测结果示意图；
图3是本发明实施例提供的P72抗原筛选表位片段的扩增及载体构建的鉴定结果示意图；其中，M：DL2000 DNA Mark；1：PET28a空载体对照；2：P72抗原筛选表位片段PCR扩增结果；3：Pet28a-P72-BPC鉴定结果；
图4是本发明实施例提供的P72抗原筛选表位蛋白纯化SDS-PAGE电泳鉴定结果示意图；其中，M：蛋白Marker；1：表达纯化的P72抗原表位蛋白；
图5是本发明实施例提供的P72抗原筛选表位蛋白反应原性的鉴定结果示意图；其中，M：蛋白Marker；1：表达纯化的P72蛋白C末端多表位重组蛋白。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种非洲猪瘟病毒P72蛋白C末端多表位重组抗原及应用，下面结合附图对本发明作详细的描述。
一、解释说明实施例。为了使本领域技术人员充分了解本发明如何具体实现，该部分是对权利要求技术方案进行展开说明的解释说明实施例。
如图1所示，本发明实施例提供的非洲猪瘟病毒P72蛋白C末端多表位抗原基因序列表达载体的构建方法包括以下步骤：
S101，根据筛选合成的P72-B基因序列，设计引物P72-BF和P72-BR；
S102，合成引物，并以合成的P72-B基因序列为模版进行PCR扩增；
S103，将纯化回收的P72-B基因序列用BamHI和Xho I双酶切，用BamHI和Xho I双酶切质粒载体Pet28a；
S104，将P72-B序列片段同质粒载体Pet28a进行连接。
本发明利用表达纯化的重组多表位抗原建立了检测非洲猪瘟病毒抗体的间接ELISA方法，并将制备的重组多表位抗原免疫新西兰大白兔，制备特异性的多克隆抗体，为非洲猪瘟的诊断及免疫反应研究提供重要帮助。
一、非洲猪瘟病毒P72蛋白C末端抗原表位基因序列的筛选及合成
利用相关生物信息学软件对GenBank中非洲猪瘟分离株Pig/HLJ/2018(MK333180)P72蛋白二级结构的亲水性、抗原性、氨基酸生物表面可及性进行综合分析，筛选出用于本发明的序列有P72蛋白N’端第362-391区段30个氨基酸序列(N’-ASQKDLVNEFPGLFVRQSRFIAGRPSRRNI-C’)、第430-529区段100个氨基酸序列(N’-RVRFSLIRVHKTQVTHTNNNHHDEKLMSALKWPIEYMFIGLKPTWNISDQNPHQHRDWHKFGHVVNAIMQPTHHAEISFQDRDTALPDACSSISDISPVT-C’)、第551-620区段70个氨基酸(N’-DKFPSKFCSSYIPFHYGGNAIKTPDDPGAMMITFALKPREEYQPSGHINVSRAREFYISWDTDYVGSITT-C’)。N’端第362-391区段30个氨基酸对应的基因序列为(5’-gcatcgcaaaaggatttggtgaatgaatttcctggactttttgtacgccagtcacgttttatagctggacgccccagtagacgcaatata-3’，90bp)，第430-529区段100个氨基酸对应的基因序列为(5’-cgcgttcgcttttcgctgatacgtgtccataaaacgcaggtgacccacaccaacaataaccaccacgatgaaaaactaatgtctgctcttaaatggcccattgaatatatgtttataggattaaaacctacctggaacatctccgatcaaaatcctcatcaacaccgagattggcacaagttcggacatgttgttaacgccattatgcagcccactcaccacgcagagataagctttcaggatagagatacagctcttccagacgcatgttcatctatatctgatattagccccgttacg-3’，300bp)，第551-620区段70个氨基酸对应的基因序列为(5’-gataaatttccatcaaagttctgcagctcttacatacccttccactacggaggcaatgcgattaaaacccccgatgatccgggtgcgatgatgattacctttgctttgaagccacgggaggaataccaacccagtggtcatattaacgtatccagagcaagagaattttatattagttgggacacggattacgtggggtctatcactacg-3’，210bp)。将该三段氨基酸序列所对应的基因序列送上海生物工程有限公司进行串联合成，获得如下序列P72-B(600bp)(见SEQ IDNO：1)：
5’-gcatcgcaaaaggatttggtgaatgaatttcctggactttttgtacgccagtcacgttttatagctggacgccccagtagacgcaatatacgcgttcgcttttcgctgatacgtgtccataaaacgcaggtgacccacaccaacaataaccaccacgatgaaaaactaatgtctgctcttaaatggcccattgaatatatgtttataggattaaaacctacctggaacatctccgatcaaaatcctcatcaacaccgagattggcacaagttcggacatgttgttaacgccattatgcagcccactcaccacgcagagataagctttcaggatagagatacagctcttccagacgcatgttcatctatatctgatattagccccgttacggataaatttccatcaaagttctgcagctcttacatacccttccactacggaggcaatgcgattaaaacccccgatgatccgggtgcgatgatgattacctttgctttgaagccacgggaggaataccaacccagtggtcatattaacgtatccagagcaagagaattttatattagttgggacacggattacgtggggtctatcactacg-3’。
编码的氨基酸序列(362-391区段+430-529区段+551-620区段)(见SEQ ID NO：2)：N’-ASQKDLVNEFPGLFVRQSRFIAGRPSRRNIRVRFSLIRVHKTQVTHTNNNHHDEKLMSALKWPIEYMFIGLKPTWNISDQNPHQHRDWHKFGHVVNAIMQPTHHAEISFQDRDTALPDACSSISDISPVTDKFPSKFCSSYIPFHYGGNAIKTPDDPGAMMITFALKPREEYQPSGHINVSRAREFYISWDTDYVGSITT-C’。
VP72蛋白序列亲水性、抗原指数、及表面可及性预测如图2所示。
二、非洲猪瘟病毒P72蛋白C末端多表位抗原基因序列表达载体的构建
根据筛选合成的P72-B基因序列，设计引物P72-BF和P72-BR并送上海生物工程有限公司进行合成。其中引物P72-BF加有BamHI限制性酶切位点(下划线标出)以及保护性碱基；引物P72-BR加有Xho I限制性酶切位点(下划线标出)以及保护性碱基。以合成的P72-B基因序列(600bp)为模版进行PCR扩增。
P72-BF：5’-cgggatccgcatcgcaaaaggatttggt-3’(28bp)(BamHI酶切位点)(见SEQID NO：3)；
P72-BR：5’-ggctcgagcgtagtgatagaccccacgt-3’(28bp)(Xho I酶切位点)(见SEQID NO：4)。
P72-B基因序列的PCR扩增体系为50μL：合成的模板2μL 5×PrimeSTARBuffer 10μL，100μmol/L P72-BF/R引物各1μL，2.5mmol/L dNTP Mixture 4μL，2.5U/μL Prime STARHS DNA Polymerase 0.5μL，ddH2O 31.5μL。PCR反应条件为：95℃变性5min后进入循环，循环参数为95℃50s，54℃20s，72℃50s，30个循环后，72℃延伸10min。结束后用浓度为1％的琼脂糖凝胶进行鉴定，并纯化回收P72-B基因序列600bp的特异性目的片段(见图2)。
将纯化回收的P72-B基因序列用BamHI和Xho I双酶切，同时用BamHI和Xho I双酶切质粒载体Pet28a，然后将P72-B序列片段同质粒载体Pet28a进行连接。体系如下：P72-B序列(BamHI-Xho I酶切)4μL，Pet28a(BamHI-Xho I酶切)4μL，10×连接缓冲液1μL，T4 DNA连接酶1μL，4℃连接16小时，然后热应激转化到BL21(DE3)感受态中，涂布添加有终浓度50μg/mL卡那霉素LB平板上，37℃培养16小时，挑取单菌落接种至含有50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，提取质粒进行鉴定。PCR鉴定筛选获得的转化了质粒Pet28a-P72-B的BL21(DE3)菌株BL21(DE3)(Pet28a-P72-B)(见图3)。
三、非洲猪病病毒P72蛋白C末端多表位抗原的表达、纯化及反应原性
挑取E.Coli BL21/pET28a-P72-B单菌落过夜培养后，以1％接种量，转接至新鲜配制的含有卡那霉素(50μg/ml)的LB液体培养基中，37℃，240rpm振荡培养2h左右，OD600nm至0.8～1.0，加入IPTG至终浓度1.0mmol/L，转移至37℃，240rpm振荡培养6h，离心收集菌体。将得到的菌体重悬于PBS中，加入溶菌酶终浓度为1mg/ml，冰上放置30min，超声裂解破碎细胞(400W功率，超声破碎时间5s，间隔时间5s，超声30min)，4℃10000rpm离心15min，弃上清，得包涵体沉淀。然后将包涵体溶解于结合缓冲液(8mol/L尿素，0.1mol/L NaH2PO4，0.01mol/L Tris-CL，pH 8.0)，包涵体溶解后，4℃10000rpm离心15min，取上清，与His-Bind(结合缓冲液预先平衡)树脂结合1h，弃掉过滤液，用漂洗液C(8mol/L尿素；0.1mol/L NaH2PO4；0.01mol/L Tris-CL pH 6.3)进行洗涤过滤两次，再用漂洗液D(8mol/L尿素；0.1mol/LNaH2PO4；0.01mol/L Tris-CL pH 5.9)进行洗涤过滤4次，最后用洗脱液收集目的蛋白(8mol/L尿素；0.1mol/L NaH2PO4；0.01mol/L Tris-CL pH 4.5)。纯化后的重组蛋白放入预先处理好的半透膜(100℃水中煮沸10min)中，并在其中加入终浓度为1mg/mL的还原型谷胱甘肽。在4℃环境下，分别在含有4mol/L、3mol/L、2mol/L、1mol/L尿素的pH 8.5的PBS中缓慢透析，透析完后收集纯化的P72-B蛋白，测定蛋白浓度，并进行SDS-PAGE电泳鉴定，结果如图4所示获得了特异性的蛋白条带。
SDS-PAGE电泳结束后进行Western-Blot鉴定蛋白的免疫原性，预先裁好与胶条同样大小的硝酸纤维素膜(NC)和滤纸，浸入电转缓冲液中。将凝胶卸下，在转移缓冲液中平衡后，按顺序铺上膜、胶和滤纸，即滤纸-NC膜-凝胶-滤纸，并用干净的玻棒轻轻滚过夹层，以消除各层之间的气泡。封紧后放入电转槽，加入电转液，并接好冷却装置，200mA恒流转移1h。转移完毕后取下NC膜，用TBST洗膜，5min×3次；将NC膜放入5％脱脂乳中，4℃封闭过夜，弃去封闭液，用TBST洗膜，5min×3次；加入一抗即用TBST稀释(1：100)的非洲猪瘟抗体阳性猪血清，平稳摇动，室温1h，弃一抗，用TBST洗膜，5min×4次；加入辣根过氧化物酶标记的兔抗猪酶标二抗，用TBST按1：50000比例稀释，平稳摇动，室温1h，弃二抗，用TBST洗膜，5min×3次。将用二抗作用过的NC膜置于显色液中显色，待出现特异性反应条带后，终止反应并进行拍照保存。Western-blot分析结果显示，P72-B蛋白表位能被非洲猪瘟阳性血清所识别，结果见图5。
四、非洲猪病病毒P72蛋白C末端多表位抗原在血清学检测中的应用
利用表达纯化的P72蛋白C末端多表位抗原建立检测非洲猪瘟抗体的间接ELISA方法。将表达纯化的P72蛋白C末端多表位抗原用包被液(0.05mol/L碳酸盐缓冲液pH 9.6)稀释成2.5μg/mL，以100μL/孔的量加入酶标板中，4℃包被过夜；每孔加入PBST 300μL，洗涤2次，拍干后以封闭液(0.01g/mL的BSA)100μL/孔于37℃封闭2h；每孔加入PBST 300μL，洗涤2次，拍干，每孔加入100μL 1：100稀释的待检猪血清，同时设立非洲猪瘟血清抗体阳性对照样品两个孔(100μL/孔)，阴性对照样品两个孔(100μL/孔)，37℃温育30min后弃去孔中液体；每孔加入PBST 300μL，洗涤5次，拍干，每孔加入100μL 1：50000稀释的HRP标记的兔抗猪IgG，37℃作用30min后弃去孔中液体；每孔加入PBST300μL，洗涤5次，拍干，每孔加入100μLTMB单组份显色液，避光显色10min；最后每孔加入100μL 2mol/L H2SO4终止显色，用酶标仪测定OD450nm值。该非洲猪瘟抗体检测方法的结果判定标准为：当阴性对照OD450nm平均值(N)小于0.25，阳性对照OD450nm平均值(P)大于0.65时，样品OD450nm值(S)/阴性对照OD450nm平均值(N)≥2.1时判定为阳性，样品OD450nm值(S)/阴性对照OD450nm平均值(N)<2.1时判定为阴性。
1、该检测方法特异性的测定
用上述检测方法对猪蓝耳病毒抗体、猪圆环病毒抗体、经典猪瘟病毒抗体、猪口蹄疫病毒抗体、猪伪狂犬病毒抗体、猪乙脑病毒抗体、猪细小病毒抗体、副猪嗜血杆菌抗体、猪2型链球菌抗体阳性猪血清进行检测，结果均为阴性，说明该检测方法具有良好的特异性，结果见表1。
表1该检测方法对常见猪病阳性血清检测结果
注：本次检测阳性对照OD450nm的平均值为1.184，阴性对照OD450nm的平均值为0.227，S/N≥2.1时为阳性，S/N<2.1时判为阴性，“—”：结果为阴性。
2、该检测方法敏感性的测定
取6份非洲猪瘟抗体阳性猪血清按照1：50、1：100、1：200、1：400、1：800、1：1600进行稀释，分别用上述建立的该方法和西班牙INGENASA公司生产的非洲猪瘟P72抗体ELISA检测试剂盒进行检测，结果发现该检测方法检测的血清效价为1：400～1：800：西班牙INGENASA公司生产的试剂盒检测的血清最高效价为1：50，结果见表2～3。
表2建立的检测方法对不同稀释比例阳性血清检测结果
注：本次检测阳性对照OD450nm的平均值为1.184，阴性对照OD450nm的平均值为0.227，S/N≥2.1时为阳性，S/N<2.1时判为阴性，“+”：结果为阳性，“—”：结果为阴性。
表3西班牙INGENASA试剂盒对不同稀释比例阳性血清检测结果
注：本次检测阳性对照OD450nm的平均值为0.124，阴性对照OD450nm的平均值为1.827，样品阻断率(％)＝(阴性对照OD值-样品OD值)/(阴性对照OD值-阳性对照OD值)×100％，样品阻断率(％)≥50％时为阳性，样品阻断率(％)≤40％时判为阴性，“+”：结果为阳性，“—”：结果为阴性。
3、该检测方法重复性测定
3.1该检测方法批内重复性测定
利用同一批次的该检测方法检测已知背景猪血清30份，其中非洲猪瘟抗体阳性血清12份，非洲猪瘟抗体阴性血清18份。对30份血清样本中每份样品进行3次重复检测，结果显示批内变异系数在1.00～8.84％之间，说明该试剂盒的批内重复性良好(见表4)。
表4同一批次检测方法检测猪血清样品3次重复的结果
3.2批间可重复性试验
利用不同批次的该检测方法检测已知背景猪血清30份，其中非洲猪瘟抗体阳性血清12份，非洲猪瘟抗体阴性血清18份。对30份猪血清样本中每份血清同时进行3个批次检测方法的检测，结果显示批间变异系数在1.08～9.31％之间，说明该试剂盒的批间重复性良好(见表5)。
表5不同批次检测方法检测猪血清的结果
4、与同类检测方法的临床应用比较试验
目前我国国内没有非洲猪瘟抗体检测试剂盒上市，国外的同类产品有西班牙INGENASA公司生产的非洲猪瘟抗体ELISA检测试剂盒。本发明将自己建立的检测方法与西班牙INGENASA公司生产的试剂盒进行了比较，检测100份临床猪血清，用建立的P72蛋白抗原表位的抗体ELISA检测试剂盒检测100份血清，结果阳性率为43.00％(43/100)，阴性率为57.00％(57/100)；用西班牙INGENASA公司生产的试剂盒检测的阳性率为39.00％(39/100)，阴性率为61.00％(61/100)；两者阳性符合率为90.70％(39/43)，阴性符合率为93.44％(57/61)，总符合率为96.00％(96/100)。
五、抗非洲猪瘟病毒P72蛋白C末端多表位抗原多抗的制备
从广东省医学实验动物中心购买三只健康清洁级新西兰大白兔，雌性，体重1.5～2kg，选取其中两只兔子免疫表达纯化的P72蛋白C末端多表位抗原，另外一只兔子作为阴性对照。免疫接种采用背部皮下多点注射方式进行，首次免疫将表达纯化的P72蛋白C末端多表位抗原与等量的弗氏完全佐剂混合乳化，免疫组的每只兔子接种1mL，接种的蛋白含量为200μg/只，阴性对照组免疫PBS和弗氏完全佐剂乳化的混合剂1mL/只。后续免疫时将相应的抗原与弗氏不完全佐剂混合乳化，按同样的免疫剂量和方法进行，每次免疫间隔15天，第三次免疫后的第10天采血分离血清测定抗体效价。用表达纯化的非洲猪病毒P72蛋白C末端多表位抗原(2.5μg/mL)包被ELISA平板(100μL/孔)，4℃过夜，用PBST洗涤3次，用0.01g/mL的BSA按100μL/孔进行封闭，37℃作用2h后，用PBST洗涤3次，将三只兔子血清用PBS由1：1000依次进行倍比稀释，100μL/孔，37℃作用30min，用PBST洗涤3次；HRP标记的山羊抗兔酶标二抗1：50000进行稀释，100μL/孔，37℃作用30min，用PBST洗涤3次；将TMP单组分底物按100μL/孔加入，于37℃下显色10min，用2M的硫酸终止液终止反应，100μL/孔。用酶标检测仪读取OD450nm值。结果显示当实验兔子的血清稀释到1：128000时，免疫的两只兔子所对应的OD450nm值仍是阴性对照兔子OD450nm值的2.1倍，所以本次免疫抗原表位的兔子血清抗体效价为1：128000(见表6)。
表6实验兔子P72蛋白C末端多表位抗原抗体效价的测定
二、应用实施例。为了证明本发明的技术方案的创造性和技术价值，该部分是对权利要求技术方案进行具体产品上或相关技术上的应用实施例。
本发明技术利用生物信息学技术筛选出非洲猪瘟病毒P72蛋白C末端优势抗原表位，并进行串联表达获得稳定性抗原，利用该抗原建立了检测非洲猪瘟抗体的ELISA方法，可高效检测出生产中猪只的非洲猪瘟抗体水平，尤其对临床样品的检测中与国外的同类产品有西班牙INGENASA公司生产的非洲猪瘟抗体ELISA检测试剂盒进行比较中(4、与同类检测方法的临床应用比较试验)敏感性高于进口试剂盒，用该项目技术获得的多表位抗原建立的ELISA检测方法(阳性率为43.00％(43/100))的阳性率高于进口试剂盒(阳性率为39.00％(39/100))，用西班牙INGENASA公司生产的非洲猪瘟抗体ELISA检测试剂盒对个别阳性样品无法检出，由于本发明技术在检测中对应的是多表位抗原的抗体，而进口INGENASA公司生产的非洲猪瘟抗体ELISA检测方法是竞争性的单表位抗体，由于非洲猪瘟病毒表位多变，且单一表位抗体在结合反应中容易受到干扰，所以利用本技术抗原建立的检测方法由于进口试剂盒。另外利用本发明技术获得多表为抗原在免疫新西兰大白兔的过程中也产生了较高的抗体水平，说明获得的多表位抗原具有良好的免疫原性。将对非洲猪瘟的临床诊断及高效亚单位疫苗的研制提供重要帮助。
三、实施例相关效果的证据。本发明实施例在研发或者使用过程中取得了一些积极效果，和现有技术相比的确具备很大的优势，下面内容结合试验过程的数据、图表等进行描述。
用本发明技术获得的非洲猪瘟P72蛋白C末端优势抗原表位建立的非洲猪瘟抗体检测方法具有较高的敏感性和特异性性，由于本抗原表位是多个，相应的对应的抗体就广泛，敏感性就高，在血清中抗体水平较低的情况下就可检测到相应的抗体，在临床中应用中检测的阳性率高于进口试剂盒(2、该检测方法敏感性的测定，4、与同类检测方法的临床应用比较试验)。本发明技术随有多个抗原表位，但都是选取保守性强、特异性好的表位，所以建立的检测方法也表现出了较高的特异性(1、该检测方法特异性的测定)。另外用获得多表位抗原免疫新西兰大白兔获得了较高效价的抗体水平(五、抗非洲猪瘟病毒P72蛋白C末端多表位抗原多抗的制备，本次免疫抗原表位的兔子血清抗体效价为1：128000)。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 宋帅、李春玲、翟少伦、蒋智勇、勾红潮、李艳、楚品品、张昆丽、杨冬霞、卞志标
<120> 非洲猪瘟病毒P72蛋白C末端多表位重组抗原及应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 600
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gcatcgcaaa aggatttggt gaatgaattt cctggacttt ttgtacgcca gtcacgtttt 60
atagctggac gccccagtag acgcaatata cgcgttcgct tttcgctgat acgtgtccat 120
aaaacgcagg tgacccacac caacaataac caccacgatg aaaaactaat gtctgctctt 180
aaatggccca ttgaatatat gtttatagga ttaaaaccta cctggaacat ctccgatcaa 240
aatcctcatc aacaccgaga ttggcacaag ttcggacatg ttgttaacgc cattatgcag 300
cccactcacc acgcagagat aagctttcag gatagagata cagctcttcc agacgcatgt 360
tcatctatat ctgatattag ccccgttacg gataaatttc catcaaagtt ctgcagctct 420
tacataccct tccactacgg aggcaatgcg attaaaaccc ccgatgatcc gggtgcgatg 480
atgattacct ttgctttgaa gccacgggag gaataccaac ccagtggtca tattaacgta 540
tccagagcaa gagaatttta tattagttgg gacacggatt acgtggggtc tatcactacg 600
<210> 2
<211> 200
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Ala Ser Gln Lys Asp Leu Val Asn Glu Phe Pro Gly Leu Phe Val Arg
1 5 10 15
Gln Ser Arg Phe Ile Ala Gly Arg Pro Ser Arg Arg Asn Ile Arg Val
20 25 30
Arg Phe Ser Leu Ile Arg Val His Lys Thr Gln Val Thr His Thr Asn
35 40 45
Asn Asn His His Asp Glu Lys Leu Met Ser Ala Leu Lys Trp Pro Ile
50 55 60
Glu Tyr Met Phe Ile Gly Leu Lys Pro Thr Trp Asn Ile Ser Asp Gln
65 70 75 80
Asn Pro His Gln His Arg Asp Trp His Lys Phe Gly His Val Val Asn
85 90 95
Ala Ile Met Gln Pro Thr His His Ala Glu Ile Ser Phe Gln Asp Arg
100 105 110
Asp Thr Ala Leu Pro Asp Ala Cys Ser Ser Ile Ser Asp Ile Ser Pro
115 120 125
Val Thr Asp Lys Phe Pro Ser Lys Phe Cys Ser Ser Tyr Ile Pro Phe
130 135 140
His Tyr Gly Gly Asn Ala Ile Lys Thr Pro Asp Asp Pro Gly Ala Met
145 150 155 160
Met Ile Thr Phe Ala Leu Lys Pro Arg Glu Glu Tyr Gln Pro Ser Gly
165 170 175
His Ile Asn Val Ser Arg Ala Arg Glu Phe Tyr Ile Ser Trp Asp Thr
180 185 190
Asp Tyr Val Gly Ser Ile Thr Thr
195 200
<210> 3
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cgggatccgc atcgcaaaag gatttggt 28
<210> 4
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ggctcgagcg tagtgataga ccccacgt 28

Claims (8)

1.一种非洲猪瘟病毒P72蛋白C末端多表位重组抗原基因P72-B，其特征在于，所述非洲猪瘟病毒P72蛋白C末端多表位重组抗原基因P72-B的核苷酸序列为SEQ ID NO：1。
2.一种应用如权利要求1所述非洲猪瘟病毒P72蛋白C末端多表位重组抗原基因P72-B编码的蛋白质，其特征在于，所述蛋白质的氨基酸序列为SEQ ID NO：2。
3.一种应用如权利要求1所述非洲猪瘟病毒P72蛋白C末端多表位重组抗原基因P72-B构建的非洲猪瘟病毒P72蛋白抗原表位基因序列表达载体，其特征在于，所述非洲猪瘟病毒P72蛋白抗原表位基因序列表达载体的构建方法，包括：
根据筛选合成的P72-B基因序列，设计引物P72-BF和P72-BR并进行合成，以合成的P72-B基因序列为模版进行PCR扩增；
将纯化回收的P72-B基因序列用BamH I和Xho I双酶切，用BamH I和Xho I双酶切质粒载体Pet28a，并将P72-B序列片段同质粒载体Pet28a进行连接。
4.如权利要求3所述非洲猪瘟病毒P72蛋白抗原表位基因序列表达载体的构建方法，其特征在于，所述引物P72-BF加有BamH I限制性酶切位点以及保护性碱基，所述引物核苷酸序列为SEQ ID NO：3；所述引物P72-BR加有Xho I限制性酶切位点以及保护性碱基，所述引物核苷酸序列为SEQ ID NO：4；
所述P72-B基因序列的PCR扩增体系为50μL：合成的模板2μL，5×PrimeSTAR Buffer 10μL，100μmol/L P72-BF/R引物各1μL，2.5mmol/L dNTP Mixture 4μL，2.5U/μL PrimeSTARHSDNA Polymerase 0.5μL，ddH2O 31.5μL；
所述PCR反应条件为：95℃变性5min后进入循环，循环参数为95℃50s，54℃20s，72℃50s，30个循环后，72℃延伸10min；结束后用浓度为1％的琼脂糖凝胶进行鉴定，并纯化回收P72-B基因序列600bp的特异性目的片段；
所述连接体系如下：BamH I-Xho I酶切的P72-B序列4μL，BamH I-Xho I酶切的Pet28a4μL，10×连接缓冲液1μL，T4 DNA连接酶1μL，4℃连接16h后热应激转化到BL21感受态中，涂布添加有终浓度50μg/mL卡那霉素LB平板上，37℃培养16h，挑取单菌落接种至含有50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，提取质粒进行鉴定；PCR鉴定筛选获得的转化质粒Pet28a-P72-B的BL21菌株。
5.一种应用如权利要求1所述非洲猪瘟病毒P72蛋白C末端多表位重组抗原基因P72-B的非洲猪病病毒P72蛋白抗原表位的表达、纯化及免疫原性鉴定方法，其特征在于，所述非洲猪病病毒P72蛋白抗原表位的表达、纯化及免疫原性鉴定方法包括：
(1)挑取经权利要求4所述方法获得的E.Coli BL21/pET28a-P72-B单菌落过夜培养后，以1％接种量转接至新鲜配制的含有卡那霉素的LB液体培养基中，37℃，240rpm振荡培养2h，OD600nm至0.8～1.0，加入IPTG至终浓度1.0mmol/L，转移至37℃，240rpm振荡培养6h，离心收集菌体；将得到的菌体重悬于PBS中，加入溶菌酶终浓度为1mg/mL，冰上放置30min，超声裂解破碎细胞，4℃10000rpm离心15min，弃上清，得包涵体沉淀；
(2)将包涵体溶解于结合缓冲液，包涵体溶解后，4℃10000rpm离心15min，取上清；结合缓冲液预先平衡，与His-Bind树脂结合1h，弃掉过滤液，用漂洗液C洗涤过滤两次，再用漂洗液D洗涤过滤4次；用洗脱液收集目的蛋白；
(3)纯化后的重组蛋白放入预先处理好的半透膜中，并加入终浓度为1mg/mL的还原型谷胱甘肽；在4℃环境下，分别在含有4mol/L、3mol/L、2mol/L、1mol/L尿素的pH 8.5的PBS中缓慢透析，透析完后收集纯化的P72-B蛋白，测定蛋白浓度，并进行SDS-PAGE电泳鉴定，获得特异性的蛋白条带；
(4)SDS-PAGE电泳结束后进行Western-Blot鉴定蛋白的免疫原性，预先裁好与胶条同样大小的硝酸纤维素膜和滤纸，浸入电转缓冲液中；将凝胶卸下，在转移缓冲液中平衡后，按顺序铺设滤纸、NC膜、凝胶和滤纸，并用干净的玻棒轻轻滚过夹层；封紧后放入电转槽，加入电转液，并接好冷却装置，200mA恒流转移1h；转移完毕后取下NC膜，用TBST洗膜，5min×3次；将NC膜放入5％脱脂乳中，4℃封闭过夜，弃去封闭液，用TBST洗膜，5min×3次；
(5)按照1：100的比例加入一抗即用TBST稀释的非洲猪瘟抗体阳性猪血清，平稳摇动，室温1h，弃一抗，用TBST洗膜，5min×4次；加入辣根过氧化物酶标记的兔抗猪酶标二抗，用TBST按1：50000比例稀释，平稳摇动，室温1h，弃二抗，用TBST洗膜，5min×3次；将用二抗作用过的NC膜置于显色液中显色，待出现特异性反应条带后，终止反应并进行拍照保存；所述方法不包括疾病诊断或治疗。
6.如权利要求5所述非洲猪病病毒P72蛋白抗原表位的表达、纯化及免疫原性鉴定方法，其特征在于，所述卡那霉素的浓度为50μg/mL，所述超声裂解破碎细胞的功率为400W，超声破碎时间为5s，间隔时间为5s，超声时间为30min；
所述结合缓冲液包括8mol/L尿素，0.1mol/L NaH2PO4，0.01mol/L Tris-CL，pH 8.0；
所述漂洗液C包括8mol/L尿素；0.1mol/L NaH2PO4；0.01mol/L Tris-CL pH6.3；
所述漂洗液D包括8mol/L尿素；0.1mol/L NaH2PO4；0.01mol/L Tris-CL pH5.9；
所述目的蛋白包括8mol/L尿素；0.1mol/L NaH2PO4；0.01mol/L Tris-CL pH4.5；
所述半透膜的预先处理方法为：在100℃水中煮沸10min。
7.一种如权利要求1所述非洲猪瘟病毒P72蛋白C末端多表位重组抗原基因P72-B在制备血清学检测产品中的应用。
8.一种如权利要求1所述非洲猪瘟病毒P72蛋白C末端多表位重组抗原基因P72-B在制备抗非洲猪病病毒P72蛋白抗原表位多抗中的应用。
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