CN109085354B

CN109085354B - 水痘-带状疱疹病毒中和抗体的检测试剂盒及其检测方法

Info

Publication number: CN109085354B
Application number: CN201810825412.7A
Authority: CN
Inventors: 王诺; 曾强; 彭芳霁; 黄晶; 吴边; 谢张婷; 徐云; 尹新涛; 丁建华; 张薇; 尹碧
Original assignee: Wuhan Life Technology Co ltd
Current assignee: Wuhan Life Technology Co ltd
Priority date: 2018-07-25
Filing date: 2018-07-25
Publication date: 2021-07-23
Anticipated expiration: 2038-07-25
Also published as: CN109085354A

Abstract

本发明涉及一种水痘‑带状疱疹病毒中和抗体的检测试剂盒及其检测方法，该试剂盒包括重组表达水痘‑带状疱疹病毒糖蛋白E抗原、样品稀释液、20倍浓缩洗涤液、酶标二抗、底物、终止液、标准血清和阴性对照；其中重组表达水痘‑带状疱疹病毒糖蛋白E抗原为优化为大肠杆菌偏爱密码子的VZV‑gE基因与重组表达载体pET‑32a(+)载体连接构建的重组表达质粒转化大肠杆菌，克隆培养并诱导表达的重组蛋白。本发明的试剂盒所使用的抗原为重组表达水痘‑带状疱疹病毒糖蛋白E抗原，安全性好，不会对环境造成污染。该抗原由基因工程方法制备，专一性强，品质纯，成本相对低廉；抗原位点选择准确，耦合性好，能有效的排除非特异性结合，减小测量误差，降低假阴假阳的出现。

Description

水痘-带状疱疹病毒中和抗体的检测试剂盒及其检测方法

技术领域

本发明涉及体外诊断试剂的技术领域，具体是一种水痘-带状疱疹病毒中和抗体的检测试剂盒及其检测方法。

背景技术

水痘病毒属于疱疹病毒科，病毒粒子呈多边形或球形，外被囊膜，糖蛋白组成的钉状物分布于表面。研究表明，水痘-带状疱疹病毒(VZV)颗粒表面带有7种病毒糖蛋白，这些糖蛋白分别与病毒的侵入、繁殖等感染过程相关。目前用于免疫接种的水痘减毒活疫苗由完整的病毒颗粒组成，疫苗带有全部病毒表面抗原，理论上，接种后可以产生能与所有表面糖蛋白结合的抗体，从而阻断水痘病毒的感染过程。虽然水痘全病毒疫苗可以帮助防止水痘的大规模暴发，但即使在水痘疫苗普及使用的美国，水痘爆发和传播在小学和幼儿园儿童中仍然较为普遍，达到11–17％(最高为40％，one shot)；在水痘疫苗没有列入免疫规划的中国，这个数据也是惊人的，有文献表明，即使在接种了水痘疫苗的人群中，出现突破病例的比例与国外报道类似。

水痘持续小规模暴发表明目前应用的水痘疫苗仍有缺陷，原发性免疫失败和继发性免疫失败的比例较高，需要进一步完善以提高免疫成功率和免疫持久性。病毒疫苗的保护效果与疫苗的免疫原性和机体的状态密切相关，改进疫苗的免疫效力应当从这两个方面开始，即构建具有高度特异性和免疫原性的中和抗原疫苗，同时建立特异性的快速中和抗体检测方法，即时监控免疫效果和免疫状况，釆取补救措施，加強免疫，防止病毒感染和疾病的发生。

水痘中和抗体的检测目前主要方法为膜抗原荧光抗体试验(FAMA)，采用全病毒颗粒，可以检测机体内所有抗水痘病毒表面糖蛋白的抗体，但是并非所有外膜糖蛋白都是中和抗原。FAMA法是目前进行血清中抗体检测的金标准，是检测人群VZV抗体水平最佳的方法，可以较准确的确定免疫效果，已经成为评价其他方法的标准。但这种方法操作繁琐，需专业人士在专门的实验室完成，这使FAMA法不适合大批量的检测血清，无法广泛使用。

商业化的检测水痘病毒抗体ELISA法试剂盒操作简单、快速，并且可进行大批量检测，因此它是目前使用最为广泛的方法。ELISA检测特异性IgG抗体水平应用广，ELISA间接法具有方法简单、准确度高、无需特殊仪器等特点。但目前市售的ELISA试剂盒采用的是全病毒抗原包被，因此敏感性较差。血清学方法检测水痘-带状疱疹病毒中和抗体对于易感人群的确定和鉴别、水痘疫苗免疫策略的研究以及疫苗免疫效果的评价具有重要意义。

发明内容

本发明为了克服现有技术的上述不足，提供了一种水痘-带状疱疹病毒中和抗体的检测试剂盒及其检测方法，该试剂盒所使用的抗原为重组表达水痘-带状疱疹病毒糖蛋白E抗原，重组蛋白为非全病毒抗原，安全性好，不含无关杂蛋白，只与水痘-带状疱疹病毒阳性血清特异结合，不与其它病毒阳性血清发生交叉反应，具有良好抗原性，因此具有很高的特异性和敏感性。本试剂盒所使用抗原蛋白包被量较少，所用蛋白浓度仅为3.0-4.0μg/mL。该试剂盒所使用的抗原具有纯度好、免疫原性好、安全性好等优点。

本发明的第一个目的在于提供一种水痘-带状疱疹病毒中和抗体的检测试剂盒，所述试剂盒包括重组表达水痘-带状疱疹病毒糖蛋白E抗原、样品稀释液、20倍浓缩洗涤液、酶标二抗、底物、终止液、标准血清和阴性对照；所述重组表达水痘-带状疱疹病毒糖蛋白E抗原为优化为大肠杆菌偏爱密码子的VZV-gE基因与重组表达载体pET-32a(+)载体连接构建的重组表达质粒转化大肠杆菌，克隆培养并诱导表达的重组蛋白。

进一步地，所述重组表达水痘-带状疱疹病毒糖蛋白E抗原的制备方法为：

(1)根据水痘-带状疱疹病毒糖蛋白E基因序列设计一对扩增引物SEQ ID NO.1和SEID NO.2，通过RT-PCR方法对水痘-带状疱疹病毒糖蛋白E基因进行扩增，以EcoR I和HindⅢ同时对水痘-带状疱疹病毒糖蛋白E基因RT-PCR产物和pET-32a(+)载体进行酶切，把所述的基因片段克隆入大肠杆菌DH5a，筛选阳性菌；

(2)提取阳性菌质粒转化感受态表达菌BL21(DE3)，得到重组表达菌株；

(3)培养所述的重组表达菌株，加入IPTG进行诱导表达，经亲和柱纯化获得所述的重组蛋白。

本发明的第二个目的在于提供一种基于上述试剂盒的水痘-带状疱疹病毒中和抗体的检测方法，其操作步骤如下：

(1)制备重组表达水痘-带状疱疹病毒糖蛋白E抗原；

(2)将步骤(1)中制备的重组表达水痘-带状疱疹病毒糖蛋白E抗原稀释为20pg/mL，按20ul/孔加入96孔板的孔中，每孔再加入5～10微升2％～5％的戊二醛溶液，水平震荡96孔板，混匀，室温反应10分钟后孔内溶液凝固，待用；用0.5％牛血清白蛋白30℃封闭2h，洗涤液洗涤，拍干；

(3)用样品稀释液将待测样本稀释到合适的浓度，同时用样品稀释液将标准样品进行系列倍比稀释，用于制作标准曲线；所述标准样品来自水痘愈后患者，效价经过VZVIgG国际标准品标定的人抗VZV血清；

(4)将稀释好的待测样本与标准样品分别加入96孔板的孔中，1孔加入样品稀释液作为空白对照，2孔加入阴样对照品，所述阴性对照品来自不含抗体的血清；每孔加样100微升，37℃孵育30分钟；

(5)用洗涤液清洗96孔板3次，甩干残余洗涤液；

(6)每孔加入100微升酶标二抗，振荡混匀，37℃孵育30分钟；

(7)重复步骤(5)；

(8)每孔加入100微升底物，振荡混匀，37℃孵育10分钟；

(9)每孔加入100微升终止液，振荡混匀，使用酶标仪在405nm读取OD值；

(10)所有样品的OD值扣减空白对照孔的OD值；

(11)根据标准样品的效价和OD值制作标准曲线，将待测样品OD值带入回归方程即可计算出效价。

进一步地，所述步骤(1)中重组表达水痘-带状疱疹病毒糖蛋白E抗原的制备方法为：

进一步地，所述重组表达水痘-带状疱疹病毒糖蛋白E抗原如SEQ NO.3所示。

进一步地，所述步骤(3)样品稀释液为pH＝9.5的0.5mol/L碳酸盐缓冲液，其中添加质量浓度为1％的牛血清白蛋白。

进一步地，所述步骤(5)中洗涤液为含0.1％吐温-20、1％牛血清白蛋白、pH7.4的PBST洗涤液。

进一步地，所述步骤(6)中酶标二抗为含20mmol/L磷酸盐、牛血清白蛋白1％、辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG。

进一步地，所述步骤(8)中底物为：含2mg/ml 3，3'，5，5'-四甲基联苯胺的无水乙醇溶液1.56ml、50mmol/L磷酸氢二钠-25mmol/L枸橼酸缓冲液31.25ml、0.75％过氧化氢溶液0.1ml，混匀。

进一步地，所述步骤(9)中终止液为2mol/L硫酸。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

(1)本发明的试剂盒所使用的抗原为重组表达水痘-带状疱疹病毒糖蛋白E抗原，重组蛋白为非全病毒抗原，安全性好，不会对环境造成污染；

(2)由基因工程做出来的抗原，专一性强，品质纯，成本相对低廉；

(3)抗原位点选择准确，耦合性好，能有效的排除非特异性结合，减小测量误差，降低假阴假阳的出现；

(4)新抗原的配方及生产工艺能高效利用本抗原，减少效价的流失和浪费，优化生产工艺，节约生产成本。本试剂盒所使用抗原蛋白包被量较少，所用蛋白浓度仅为3.0-4.0μg/mL。

具体实施方式

展示一下实例来具体说明本发明的某些实施例，且不应解释为限制本发明的范围。对本发明公开的内容可以同时从材料、方法和反应条件进行改进，所有这些改进，均应落入本发明的的精神和范围之内。

实施例1：制备重组表达水痘-带状疱疹病毒糖蛋白E抗原

1、目的基因扩增

(1)引物设计

根据Genbank上公布的水痘-带状疱疹病毒糖蛋白E基因序列，选取氨基酸序列25-537对应的核酸序列设计两端带有Nhe I和EcoR I酶切位点(斜体标出)的引物：

SEQID NO.1：正向引物为(5'-3')：tactaactagcatgaccaatccagttcgaaccagcgtac；

SEQID NO.2：反向引物为(5'-3')：

ttccggaattcttaatgatgatgagacagatgacgcagcagagaccttgtaaccggat；

(2)PCR扩增

通过RT-PCR方法对水痘-带状疱疹病毒糖蛋白E基因进行扩增，以EcoR I和HindⅢ同时对水痘-带状疱疹病毒糖蛋白E基因RT-PCR产物和pET-32a(+)载体进行酶切，回收目的片段，将目的基因和载体酶切回收产物定量后，分别取10ul和2ul，加入10×T4连接酶buffer2ul，T4连接酶1ul，室温连接6h，得到连接产物pET-32a-gE₅₃₇；

(3)转化与筛选

将连接产物10ul转化到100ul E.coli DH5α感受态细胞中，涂板，37℃培养过夜。挑选单克隆菌落，提取质粒进行双酶切鉴定，选择阳性克隆；

2、转化体的构建及目的基因的表达鉴定

(1)将测序正确的表达质粒转化到E.coli BL21(DE3)表达菌株中；

(2)重组蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中的诱导表达

在LB固体培养平板(Amp+)上挑选单克隆，接种到4ml LB液体培养基(Amp+)中，37℃/220rpm摇菌4h；在每组4ml菌液中取出2ml，加入另一中试管中，按1:1000加入IPTG(诱导后)，并和原管(诱导前)一起继续培养4h；在每组诱导前和诱导后试管中各取200ul菌液，加入到1.5mlEP管中，12000rpm离心10min，弃净上清；用80ul 1×SDS上样缓冲液悬起菌体进行SDS-PAGE分析；

3、重组蛋白的纯化

(1)目的蛋白的纯化

将菌体用20ml溶解液(20mMtris+8MUrea+2mMEDTA，pH8.0)悬起，室温溶解2h以上。将菌体溶解液10000rpm，离心1h，取上清；将上清液配制成上样样品(20mMtris+300mMNaCl+2mMEDTA+8MUrea+50mMNaH₂PO₄，pH8.0)。取GE公司Ni-sepharose fast flow 6FF 1ml，加入到上样样品中，室温混合2h；将样品加入到回收柱中，并依次用含有50mM、100mM、200mM、300mM、500mM咪唑的洗脱缓冲液洗脱(咪唑+20mMtris+8Murea+300mMNaCl+50mMNaH₂PO₄，pH8.0)，回收洗脱样品，进行SDS-PAGE；

(2)蛋白复性

将(1)中含300mM咪唑洗脱液洗脱的蛋白依次在含有6M、4M、2M、0M尿素的20mMPBS缓冲液中4℃透析过夜，将透析样品8000rpm离心30min，收取上清，即为目的蛋白，其核苷酸序列如SEQID NO.3所示。

实施例2：检测水痘-带状疱疹病毒中和抗体的检测试剂盒的制备

ELISA板的制备为：将实施例1中制备的重组表达水痘-带状疱疹病毒糖蛋白E抗原稀释为20pg/mL，按20ul/孔加入96孔板的孔中，每孔再加入5～10微升2％～5％的戊二醛溶液，水平震荡96孔板，混匀，室温反应10分钟后孔内溶液凝固，待用；用0.5％牛血清白蛋白30℃封闭2h，洗涤液洗涤，拍干。

实施例3：样本检测

1、用样品稀释液(pH＝9.5的0.5mol/L碳酸盐缓冲液，其中添加质量浓度为1％的牛血清白蛋白)将待测样本稀释到合适的浓度，同时用样品稀释液将标准样品人抗VZV血清进行系列倍比稀释，用于制作标准曲线；所述标准样品来自水痘愈后患者，效价经过VZVIgG国际标准品标定的人抗VZV血清。

人抗VZV血清(来自水痘愈后患者，其效价经过VZV IgG国际标准品标定)，用上述样本稀释液分别稀释到2IU/ml、1.8IU/ml、1.6IU/ml、1.4IU/ml、1.2IU/ml、1.0IU/ml、0.8IU/ml、0.6IU/ml、0.4IU/ml、0.2IU/ml共10个浓度。每个浓度再用R1稀释100倍，待用。每种细胞密度的孔中，都分别加入上述稀释后的10种浓度的人抗VZV血清50微升，37℃孵育30分钟，用含0.1％吐温-20、1％牛血清白蛋白、pH7.4的PBST洗涤液洗涤2次，每孔加入0.1ml含有辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG的磷酸盐缓冲液，37℃孵育30分钟，用上述洗涤液洗涤2次，每孔加入反应底物溶液0.1ml，37℃孵育10分钟，每孔加入终止液0.1ml，使用酶标仪在405nm读取OD值。以OD值不再随人抗VZV血清效价升高的血清稀释度作为检测上限。

2、血浆样品VZV中和抗体效价测定

(1)标准品稀释：标准血清用样本稀释液进行系列倍比稀释，分别为1IU/ml、0.5IU/ml、0.25IU/ml、0.125IU/ml、0.0625IU/ml。

(2)加样：抗凝血浆10份(已知VZV中和效价)，以及步骤(1)中准备好的标准品(5个)，分别用样本稀释液进行100倍(1：99)稀释，分别加入96孔板的95个孔中(每份血浆做6孔重复测定)，每孔100微升；剩余1孔加100微升样本稀释液，作为空白对照。从上述制备的96孔板中随机抽取3个孔板进行重复测定。

(3)温育、洗涤：将96孔板放入洗板机，用洗涤液洗涤2次，甩干残余洗涤液。

(4)加酶标二抗、温育、洗涤：每孔加入100微升酶标二抗(含20mmol/L磷酸盐、牛血清白蛋白1％、辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG)，37℃恒温30min，用洗涤液洗涤2次，甩干残余洗涤液。

(5)加底物、终止、酶标仪测定：每孔加入100微升底物，37℃恒温10min，每孔加入100微升2mol/L硫酸终止液，振荡15秒，立即使用酶标仪在405nm读数。

(6)结果计算：所有样品的OD值扣减空白对照。根据标准样品的效价和OD值制作标准曲线，得到线性回归方程，将待测样品OD值带入回归方程即可计算出效价。将每块板中每个血浆样品检测结果计算平均值，计算每一个96孔板内同一个样品测定结果的变异系数，三个96孔板间的变异系数，以及测定结果平均值与中和效价的相关性，如下表所示：

表1检测结果对比

实施例3：用实施例2的试剂盒进行临床样本检测

1、分别以实施例2的试剂盒及检测方法、膜抗原荧光抗体试验(FAMA)对收集的样本共计368份血清进行水痘-带状疱疹病毒IgG中和抗体检测，结果见表2：

表2

2、结果分析

(1)一致性百分比评价

通过计算金标准(FAMA)和试剂样品的一致性百分比来判定两者的等效性。

阳性一致性百分比＝A/(A+C)×100％＝268/270*100％＝99.26％

即(98.24％，100％)

阴性一致性百分比＝D/(B+D)×100％＝95/98*100％＝96.94％

即(93.53％，100％)

总一致性百分比＝(A+D)/(A+B+C+D)×100％＝363/368*100％＝98.64％

即(97.46％，99.82％)

(2)配对卡方检验

以SPSS统计软件对两组结果进行配对卡方检验，P＞0.05表明两检测方法检测结果差异无统计学意义，P＜0.05表明两检测方法检测结果差异有统计学意义。

表3

由以上配对卡方检验分析结果显示：P＝1.000＞0.05，表明两种检测方法总体检验符合率相同。

(3)Kappa一致性检验

根据实际资料计算的K值只是一个样本的统计量，存在着抽样误差，因而，所计算的K值是否来自K值为“0”的总体(即两者之间的一致程度是由于机遇造成的)，应当经过假设检验(u检验)，检验公式为：

式中，u为标准正态分位数，Se(K)为K的标准误。

一致性强度的参考判断指标：Landis和Koch将Kappa系数的大小划分了六个区段，分别代表一致性的强弱程度。当K<0，一致性强度极差；0.0～0.2，微弱；0.21～0.40，弱；0.41～0.60，中度；0.61～0.80，高度；0.81～1.00，极强。

表4

观测一致率P<sub>0</sub>	0.9864	标准误Se(K)	0.015
				期望一致率P<sub>e</sub>	0.5975	Kappa值	0.965
		u检验	64.33

综合以上结果，假设：

H0：武汉生命试剂和金标准的诊断结果无明显一致性

H1：武汉生命试剂和金标准的诊断结果有明显一致性

α＝0.05

u检验结果为64.33大于95％标准正态分位数1.96，故P＜0.05，拒绝H0，接受H1，支持“两种检测方法的检测结果的一致性好””的结论。

Kappa值为0.965，根据方案中设定的判断标准，被测试剂同金标准的检测一致性极强。

综合以上结果分析，本发明的试剂盒具有较高的准确度和灵敏度，在水痘-带状疱疹病毒中和抗体的检测和水痘疫苗的疗效评价中具有实用价值。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 武汉生命科技股份有限公司

<120> 水痘-带状疱疹病毒中和抗体的检测试剂盒及其检测方法

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tactaactag catgaccaat ccagttcgaa ccagcgtac 39

<210> 2

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ttccggaatt cttaatgatg atgagacaga tgacgcagca gagaccttgt aaccggat 58

<210> 3

<211> 1043

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gcacggagct agcccaggtc ataaggggca tgatgatttg acgtcatccc caccttcctc 60

cggtttgtca ccggcagtca ccttagagtg cccaactgaa tgctggcaac taagatcaag 120

ggttgcgctc gttgcgggac ttaacccaac atctcacgac acgagctgac gacaaccatg 180

caccacctgt cactctgccc ccgaagggga cgtcctatct ccaggattgt cagaggatgt 240

caagacctgg taaggttctt cgcgttgctt cgaattaaac cacatgctcc accgcttgtg 300

cgggcccccg tcaattcctt tgagtttcag tcttgcgacc gtactccaca tggagtgctt 360

aatgcgttag ctgcagcact aaggggcgga aaccccctaa cacttagcac tcatcgttta 420

cggcgtggac taccagggta tctaatcctg ttcgctcccc acgctttcgc tcctcagcgt 480

cagttacaga ccagagagtc gccttcgcca ctggtgttcc tccacatctc tacgcatttc 540

accgctacac gtggaattcc actctcctct tctgcactca agttccccag tttccaatga 600

cccaaaggag ccgggggctt tcacatcaga cttaagaaac cgcctgcgag ccctttacgc 660

ccaataattc cggacaacgc ttgccaccta cgtattaccg cggctgctgg cacgtagtta 720

gccgtggctt tctggttagg taccgtcaag gtgccgccct atttgaacgg cacttgttct 780

tccctaacaa cagagcttta cgatccgaaa accttcatca ctcacgcggc gttgctccgt 840

cagactttcg tccattgcgg aagattccct actgccgtag gagtctgggc cgtgtctcag 900

tcccagcaca ggtctcaggt cggctacgca tcgtcgcctt ggtgagccgt tacctcacca 960

actaatgcgc cgcgggtcca tctgtaagtg gtagcggaag ccacctttta tgtctgaatc 1020

atgcggttca aacacccaag acc 1043

Claims

1.一种水痘-带状疱疹病毒中和抗体的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括重组表达水痘-带状疱疹病毒糖蛋白E抗原、样品稀释液、20倍浓缩洗涤液、酶标二抗、底物、终止液、标准血清和阴性对照；所述重组表达水痘-带状疱疹病毒糖蛋白E抗原为优化为大肠杆菌偏爱密码子的VZV-gE 基因与重组表达载体pET-32a(+)载体连接构建的重组表达质粒转化大肠杆菌，克隆培养并诱导表达的重组蛋白；所述重组表达水痘-带状疱疹病毒糖蛋白E抗原如SEQ ID NO.3所示；包被所述蛋白E抗原的方法为：将所述蛋白E抗原稀释为20pg/mL，按20μL/孔加入96孔板的孔中，每孔再加入5～10微升2％～5％的戊二醛溶液，水平震荡96孔板，混匀，室温反应10分钟后孔内溶液凝固，待用；用0.5％牛血清白蛋白30℃封闭2h，洗涤液洗涤，拍干。

2.权利要求1所述试剂盒在制备检测水痘-带状疱疹病毒中和抗体产品中的应用。