CN105669838A - 来自水痘-带状疱疹病毒gE蛋白的中和表位及针对其的抗体 - Google Patents

来自水痘-带状疱疹病毒gE蛋白的中和表位及针对其的抗体 Download PDF

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Abstract

本发明涉及来自水痘-带状疱疹病毒gE蛋白的中和表位肽(或其变体)，包含此类中和表位肽(或其变体)和载体蛋白的重组蛋白，以及此类中和表位肽(或其变体)和重组蛋白的用途。本发明还涉及针对此类中和表位肽的抗体，产生所述抗体的细胞株，以及它们的用途。本发明还涉及包含所述中和表位肽或重组蛋白的疫苗，包含所述抗体的药物组合物，以及它们的用途，例如，它们可用于预防和/或治疗水痘-带状疱疹病毒感染或与所述感染相关的一种或多种疾病或症状。

Description

来自水痘-带状疱疹病毒gE蛋白的中和表位及针对其的抗体
技术领域
本发明涉及分子病毒学和免疫学领域。具体而言，本发明涉及来自水痘-带状疱疹病毒gE蛋白的中和表位肽(或其变体)，包含此类中和表位肽(或其变体)和载体蛋白的重组蛋白，以及此类中和表位肽(或其变体)和重组蛋白的用途。本发明还涉及针对此类中和表位肽的抗体，产生所述抗体的细胞株，以及它们的用途。本发明还涉及包含所述中和表位肽或重组蛋白的疫苗，包含所述抗体的药物组合物，以及它们的用途，例如，它们可用于预防和/或治疗水痘-带状疱疹病毒感染或与所述感染相关的一种或多种疾病或症状。
背景技术
水痘-带状疱疹病毒(Varicella-ZosterVirus，VZV)属于疱疹病毒科(Herpesviridae)，α-疱疹病毒亚科(alpha-herpesviridae)，水痘病毒属(Varicellovirus)。VZV病毒的基因组为大小约125kb的双链DNA，其含有70个开放阅读框；基因组外为衣壳，衣壳与病毒包膜之间为皮层结构，其间含有许多皮层蛋白；病毒最外围为病毒包膜，其上至少含有9种膜蛋白(Zhang,Z.等人,2010.PLoSPathog6:e1000971)。
VZV病毒感染可表现出两种不同的临床症状。初次感染主要发生于儿童，临床症状一般表现为水痘。在初次感染期间，病毒在皮肤上进行复制并扩散侵染皮肤的神经末梢，其后病毒将延神经轴逆行至背根神经节并建立潜伏。在年老、免疫力衰退或因疾病、药物导致免疫抑制等情况下，潜伏的病毒将被重新激活，病毒延神经轴顺行至该神经支配的皮肤，进行大量复制形成病灶，而表现为带状疱疹(Zerboni,L.等人,2014.NatRevMicrobiol12(3):197-210)。带状疱疹常伴随疱疹后神经痛。疱疹后神经痛疼痛剧烈，可持续数年之久，极大影响患者生活质量。带状疱疹及疱疹后神经痛的发生概率随年龄增大而增大，这给老龄化社会造成了较大的社会负担。
当前对于VZV病毒感染最主要的预防措施为注射疫苗。当前市面上有水痘疫苗和带状疱疹疫苗来分别针对VZV病毒感染引起的两种临床症状(Brisson,M.等人,2003.JMedVirol70Suppl1:S31-37；Oxman,M.N.等人,2005.NEnglJMed352(22):2271-2284)。对于已经发病的个体，当前并没有有效的、特异的治疗手段，而只是通过抗病毒药物来进行治疗。对于部分因病或因药物导致的免疫抑制者，迅速、特异、有效地控制病情十分重要。
VZV病毒包膜蛋白gE是病毒表面含量最多的一种糖蛋白，它对于病毒的复制是必需的，它与细胞表面的受体胰岛素降解酶的结合被认为在病毒入胞中起着重要作用，并且，它在VZV病毒的T细胞、皮肤和神经嗜性上发挥重要作用(Berarducci,B.等人,2010.ProcNatlAcadSciUSA107(1):282-287；Moffat,J.等人,2004.JVirol78(22):12406-12415)。此外，gE还是VZV病毒上免疫原性很强的蛋白，其可激起对病毒的体液及细胞免疫反应(Dendouga,N.等人,2012.Vaccine30(20):3126-3135)。当前以gE为主要成分的亚单位疫苗已处于临床试验中，是一种极具有潜力的安全性高的疫苗形式。
当前以病毒中和性抗体为基础的抗体治疗已经应用在许多疾病的治疗上。对于VZV病毒感染的治疗而言，已尝试使用人多抗来进行治疗。然而，多抗特异性不及单克隆抗体，其治疗效果不能令人满意。因此，发现有效的中和表位和针对其的抗体对于VZV病毒的治疗(特别是紧急干预)具有重大意义。
发明概述
为了发现有效的中和表位和针对其的抗体以实现对VZV病毒感染的有效预防和治疗，本发明人进行了深入的研究。
特别地，本发明人通过设计的引物，从VZV病毒(Oka株)基因组中调取了gE蛋白胞外区段的基因序列，并将其克隆到杆状病毒基因组上；然后，借助昆虫-杆状病毒表达系统成功表达了重组蛋白rgE。该蛋白可以成功分泌到被感染细胞的培养上清，具有较完整的翻译后修饰。
进一步，本发明人使用亲和层析的方式纯化出了纯度在95％以上的rgE蛋白。随后，本发明人使用弗氏佐剂对纯化后的rgE蛋白进行乳化，将其用于免疫小鼠，并从免疫的小鼠制备单克隆抗体。本发明人总共获得70株杂交瘤细胞株，其均能够产生对rgE有特异性反应的单抗(单克隆抗体)。
进一步，本发明人使用基于酶联免疫检测的中和方法对这些单克隆抗体中和病毒的能力进行检测。结果显示，其中的一株抗体(命名为4A2)能够有效中和病毒，其中和滴度达到1:2560。该单抗在WesternBlot及免疫荧光上可以与病毒感染的细胞特异性反应，而对未感染的细胞无反应。
进一步，本发明人合成了涵盖gE蛋白全长的多个肽段，并测定这些肽段与4A2抗体的反应性。结果显示，氨基酸序列为SEQIDNO:1-8的表位肽能够与4A2抗体特异性反应。在将这些肽段与网上数据库中的序列进行比对发现后，这些肽段在100个VZV病毒临床分离株序列中具有高度保守性(100％)。
这些结果显示，本发明人所鉴定到的表位在各种VZV病毒株中是高度保守的，其可用于制备抗各种VZV病毒株的广谱中和性抗体，可用于诱发机体产生抗VZV的中和抗体，从而可用作预防和治疗VZV病毒的有效疫苗；并且，所制备的4A2抗体是针对保守表位的补体依赖的中和抗体，其可用作预防和治疗VZV病毒的药物组合物。
因此，在一个方面，本发明提供了来源于水痘-带状疱疹病毒(VZV)的gE蛋白的表位肽或其变体，包含所述表位肽或其变体以及载体蛋白的重组蛋白，包含所述表位肽或其变体以及偶联部分的表位肽偶联物，包含它们的各种形式的组合物，以及它们的用途和使用方法。
此外，本发明还提供了编码所述表位肽或其变体或所述重组蛋白的核酸分子，包含所述核酸分子的载体，包含所述核酸分子或载体的宿主细胞，以及制备所述表位肽或其变体或所述重组蛋白的方法。
在另一个方面，本发明提供了特异性结合本发明表位肽的单克隆抗体或其抗原结合片段，包含所述单克隆抗体或其抗原结合片段以及偶联部分的抗体偶联物，包含所述单克隆抗体或其抗原结合片段的试剂盒和药物组合物，以及它们的用途和使用方法。
此外，本发明还提供了编码所述单克隆抗体或其抗原结合片段的核酸分子，包含所述核酸分子的载体，包含所述核酸分子或载体的宿主细胞，以及制备所述单克隆抗体或其抗原结合片段的方法。
下面将结合附图、发明详述和实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将理解，下列附图、发明详述和实施例仅用于说明本发明，而不是对本发明的范围的限定。根据附图和优选实施方案的下列详细描述，本发明的各种目的和有利方面对于本领域技术人员来说将变得显然。
附图说明
图1显示了重组蛋白rgE的SDS-PAGE的检测结果，以及使用4A2抗体来检测重组蛋白rgE的Westernblot的结果。泳道1显示的是蛋白marker，每一个条带对应的分子量标示于左边；泳道2显示的是纯化后的重组蛋白rgE的SDS-PAGE的检测结果；泳道3显示的是使用4A2单抗来检测重组蛋白rgE的Westernblot的检测结果。结果显示，抗VZVgE单克隆抗体4A2可与重组rgE抗原产生特异性反应，可用于检测重组rgE抗原。
图2显示了单抗4A2的中和实验结果。将4A2单抗进行两倍倍比稀释(从1:40开始)，然后进行中和实验。结果显示，当单抗稀释度为1:2560时，蓝色斑点数仍然小于阳性对照斑点数的50％。因此，单抗4A2的中和滴度为1:2560。
图3显示了使用4A2单抗来检测用VZV的Oka病毒株感染的(a)和未经感染的(b)ARPE-19的免疫荧光测定的结果。其中，图3a显示的是单抗4A2与VZV感染后的ARPE-19细胞的免疫荧光反应的结果；图3b显示的是单抗4A2与未感染的ARPE-19细胞的免疫荧光反应的结果。结果显示，单抗4A2能够有效识别分布于被感染细胞的细胞膜上的gE蛋白，并且不与未感染VZV病毒的ARPE-19细胞发生反应。
图4显示了使用单抗4A2来检测病毒感染细胞的Elispot测定的结果。结果显示，在Elispot检测中，感染VZV的病变细胞显出肉眼清晰可见的蓝色斑点(图4的A1-A3)，而未感染VZV的细胞则不显现蓝色斑点(图4的B1-B3)。这些结果表明，抗VZVgE中和性单克隆抗体4A2可用于检测VZV病毒的滴度。
图5显示了使用单抗4A2来检测VZV病毒感染的皮肤组织的免疫组化测定的结果。图5A:VZV病毒感染的皮肤组织，其中显示的棕色区域为VZV感染的阳性信号区域；图5B:未感染的皮肤组织，其中，4A2不与未感染的皮肤组织发生反应(无棕色区域)。这些结果说明，针对VZVgE的中和性单抗4A2能特异性检测出被VZV病毒感染的皮肤组织，能够应用于VZV病毒感染的免疫组织化学检测。
图6显示，单抗4A2能够捕获和分离杆状病毒表达的重组蛋白rgE。泳道1：无关单抗；该泳道的结果显示，无关单抗不能捕获分泌到培养上清中的rgE。泳道2:单抗4A2；该泳道的结果显示，4A2单抗能够捕获分泌到培养上清中的rgE。
图7显示，单抗4A2能够捕获病毒上的天然gE蛋白。在图7A和7B中，泳道1：未感染病毒的细胞的裂解上清；泳道2：感染VZV病毒的细胞的裂解上清。图7A的SDS-PAGE结果显示，4A2不能捕获未感染VZV病毒的细胞的裂解上清中的任何蛋白(泳道1)，但能够捕获VZV感染的细胞的裂解上清中的蛋白(泳道2)。并且，图7B的Westernblot检测结果显示，4A2所捕获的蛋白为天然gE蛋白(泳道2)。
图8显示了检测单抗4A2与合成的肽之间的反应性的ELISA测定的结果。结果显示，在所合成的54条肽段中，4A2单抗仅与肽段13具有强反应，而与其他肽段基本上不反应。这表明，肽段13含有4A2单抗识别的表位。
图9显示了表达包含本发明的表位肽和载体蛋白C149的重组蛋白的质粒的构建流程图。其中，将表位肽的两端连接至接头(linker)，然后替换载体蛋白C149的第79-80位氨基酸。
图10显示了纯化后的载体蛋白C149以及含有表位肽和C149蛋白的重组蛋白所形成的颗粒的电镜图。其中，图10中，小图HBc显示的是纯化后的载体蛋白C149所形成的颗粒的电镜图；小图F1至F8显示的是含有表位肽(SEQIDNO:1至SEQIDNO：8)和C149蛋白的重组蛋白所形成的颗粒的电镜图。结果显示，所获得的经纯化的蛋白均能够组装成类病毒颗粒，其呈均匀的空心球体结构。
图11显示了检测含有表位肽的8个融合蛋白(VZV-gE-F1、VZV-gE-F2、VZV-gE-F3、VZV-gE-F4、VZV-gE-F5、VZV-gE-F6、VZV-gE-F7、VZV-gE-F8)和不含表位肽的载体蛋白(HBcAg)与4A2单抗之间的反应性的WesternBlot测定的结果。图11显示的结果为，用ImageJ软件对印迹条带的灰度值进行定量分析的结果。结果显示，8个含有表位肽的融合蛋白都能够被4A2单抗特异性识别和结合，而不含表位肽的载体蛋白(HBcAg)不能够与4A2单抗发生特异性反应。
图12显示了使用多抗血清来检测用v-Oka病毒感染的和未经感染的ARPE-19的免疫荧光测定的结果。结果显示，使用本发明融合蛋白所制备的8种多抗血清都能够结合VZVOka毒株感染的ARPE-19细胞，并显示出绿色荧光；而不能识别或结合未感染VZV病毒的ARPE-19细胞(作为阴性对照)。这些结果说明，抗本发明融合蛋白的多抗血清能够特异性结合VZV病毒，并因此能够特异性识别VZV病毒感染的细胞。
发明详述
在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的细胞培养、分子遗传学、核酸化学、免疫学实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。
如本文中所使用的，术语“gE蛋白”是指，水痘-带状疱疹病毒(VZV)的gE蛋白，其是本领域技术人员公知的(参见，例如NCBIGENBANK数据库登录号：Q9J3M8)。
如本文中所使用的，当提及gE蛋白(或者其胞外区段)的氨基酸序列时，其使用SEQIDNO：121所示的序列来进行描述。例如，表述“gE蛋白的第121-135位氨基酸残基”是指，SEQIDNO：121所示的多肽的第121-135位氨基酸残基。然而，本领域技术人员理解，在gE蛋白的氨基酸序列中，可天然产生或人工引入突变或变异(包括但不限于，置换，缺失和/或添加，例如不同基因型或基因亚型的gE蛋白)，而不影响其生物学功能。因此，在本发明中，术语“gE蛋白”应包括所有此类序列，包括例如SEQIDNO：121所示的序列以及其天然或人工的变体。并且，当描述gE蛋白的序列片段时，其不仅包括SEQIDNO：121的序列片段，还包括其天然或人工变体中的相应序列片段。例如，表述“gE蛋白的第121-135位氨基酸残基”包括，SEQIDNO：121的第121-135位氨基酸残基，以及其变体(天然或人工)中的相应片段。根据本发明，表述“相应序列片段”或“相应片段”是指，当对序列进行最优比对时，即当序列进行比对以获得最高百分数同一性时，进行比较的序列中位于等同位置的片段。
如本文中所使用的，术语“HBcAg”是指，乙型肝炎病毒(HBV)的核心抗原蛋白，其是本领域技术人员公知的(参见，例如NCBIGENBANK数据库登录号：AGA95670.1)。
如本文中所使用的，当提及HBcAg的氨基酸序列时，其使用SEQIDNO：122所示的序列来进行描述。例如，表述“HBcAg的第79-80位氨基酸残基是指，SEQIDNO：122所示的多肽的第79-80位氨基酸残基。然而，本领域技术人员理解，在HBcAg的氨基酸序列中，可天然产生或人工引入突变或变异(包括但不限于，置换，缺失和/或添加，例如不同基因型或基因亚型的HBcAg)，而不影响其生物学功能。因此，在本发明中，术语“HBcAg”应包括所有此类序列，包括例如SEQIDNO：122所示的序列以及其天然或人工的变体。并且，当描述HBcAg的序列片段时，其不仅包括SEQIDNO：122的序列片段，还包括其天然或人工变体中的相应序列片段。例如，表述“HBcAg的第79-80位氨基酸残基”包括，SEQIDNO：122的第79-80位氨基酸残基，以及其变体(天然或人工)中的相应片段。根据本发明，表述“相应序列片段”或“相应片段”是指，当对序列进行最优比对时，即当序列进行比对以获得最高百分数同一性时，进行比较的序列中位于等同位置的片段。
如本文中所使用的，术语“抗体”是指，通常由两对多肽链(每对具有一条“轻”(L)链和一条“重”(H)链)组成的免疫球蛋白分子。抗体轻链可分类为κ和λ轻链。重链可分类为μ、δ、γ、α或ε，并且分别将抗体的同种型定义为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。在轻链和重链内，可变区和恒定区通过大约12或更多个氨基酸的“J”区连接，重链还包含大约3个或更多个氨基酸的“D”区。各重链由重链可变区(VH)和重链恒定区(CH)组成。重链恒定区由3个结构域(CH1、CH2和CH3)组成。各轻链由轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。抗体的恒定区可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子，包括免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一组分(C1q)的结合。VH和VL区还可被细分为具有高变性的区域(称为互补决定区(CDR))，其间散布有较保守的称为构架区(FR)的区域。各VH和VL由按下列顺序：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4从氨基末端至羧基末端排列的3个CDR和4个FR组成。各重链/轻链对的可变区(VH和VL)分别形成抗体结合部位。氨基酸至各区域或结构域的分配遵循KabatSequencesofProteinsofImmunologicalInterest(NationalInstitutesofHealth,Bethesda,Md.(1987and1991))，或Chothia&Lesk(1987)J.Mol.Biol.196:901-917；Chothia等人(1989)Nature342:878-883的定义。术语“抗体”不受任何特定的产生抗体的方法限制。例如，其包括，特别地，重组抗体、单克隆抗体和多克隆抗体。抗体可以是不同同种型的抗体，例如，IgG(例如，IgG1，IgG2，IgG3或IgG4亚型)，IgA1，IgA2，IgD，IgE或IgM抗体。
如本文中所使用的，术语抗体的“抗原结合片段”是指包含全长抗体的片段的多肽，其保持特异性结合全长抗体所结合的相同抗原的能力，和/或与全长抗体竞争对抗原的特异性结合，其也被称为“抗原结合部分”。通常参见，FundamentalImmunology,Ch.7(Paul,W.,ed.,第2版，RavenPress,N.Y.(1989)，其以其全文通过引用合并入本文，用于所有目的。可通过重组DNA技术或通过完整抗体的酶促或化学断裂产生抗体的抗原结合片段。在一些情况下，抗原结合片段包括Fab、Fab'、F(ab')2、Fd、Fv、dAb和互补决定区(CDR)片段、单链抗体(例如，scFv)、嵌合抗体、双抗体(diabody)和这样的多肽，其包含足以赋予多肽特异性抗原结合能力的抗体的至少一部分。
如本文中所使用的，术语“Fd片段”意指由VH和CH1结构域组成的抗体片段；术语“Fv片段”意指由抗体的单臂的VL和VH结构域组成的抗体片段；术语“dAb片段”意指由VH结构域组成的抗体片段(Ward等人,Nature341:544-546(1989))；术语“Fab片段”意指由VL、VH、CL和CH1结构域组成的抗体片段；术语“F(ab')2片段”意指包含通过铰链区上的二硫桥连接的两个Fab片段的抗体片段。
在一些情况下，抗体的抗原结合片段是单链抗体(例如,scFv)，其中VL和VH结构域通过使其能够产生为单个多肽链的连接体配对形成单价分子(参见，例如,Bird等人,Science242:423-426(1988)和Huston等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:5879-5883(1988))。此类scFv分子可具有一般结构：NH2-VL-接头-VH-COOH或NH2-VH-接头-VL-COOH。合适的现有技术接头由重复的GGGGS氨基酸序列或其变体组成。例如，可使用具有氨基酸序列(GGGGS)4的接头，但也可使用其变体(Holliger等人(1993)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:6444-6448)。可用于本发明的其他接头由Alfthan等人(1995)，ProteinEng.8:725-731，Choi等人(2001)，Eur.J.Immunol.31:94-106，Hu等人(1996)，CancerRes.56:3055-3061，Kipriyanov等人(1999)，J.Mol.Biol.293:41-56和Roovers等人(2001)，CancerImmunol.描述。
在一些情况下，抗体的抗原结合片段是双抗体，即，双价抗体，其中VH和VL结构域在单个多肽链上表达，但使用太短的连接体以致不允许在相同链的两个结构域之间配对，从而迫使结构域与另一条链的互补结构域配对并且产生两个抗原结合部位(参见，例如,HolligerP.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:6444-6448(1993)，和PoljakR.J.等人,Structure2:1121-1123(1994))。
可使用本领域技术人员已知的常规技术(例如，重组DNA技术或酶促或化学断裂法)从给定的抗体(例如本发明提供的单克隆抗体4A2)获得抗体的抗原结合片段(例如，上述抗体片段)，并且以与用于完整抗体的方式相同的方式就特异性筛选抗体的抗原结合片段。
在本文中，除非上下文明确指出，否则当提及术语“抗体”时，其不仅包括完整抗体，而且包括抗体的抗原结合片段。
如本文中所使用的，术语“单抗”和“单克隆抗体”是指，来自一群高度同源的抗体分子中的一个抗体或抗体的一个片段，也即除可能自发出现的自然突变外，一群完全相同的抗体分子。单抗对抗原上的单一表位具有高特异性。多克隆抗体是相对于单克隆抗体而言的，其通常包含至少2种或更多种的不同抗体，这些不同的抗体通常识别抗原上的不同表位。单克隆抗体通常可采用Kohler等首次报道的杂交瘤技术获得(Nature,256:495,1975)，但也可采用重组DNA技术获得(如参见U.S.P4,816,567)。
如本文中所使用的，以编号提及的单克隆抗体与从相同编号的杂交瘤细胞株获得的单克隆抗体相同。例如，单克隆抗体4A2是与从杂交瘤细胞株4A2(简称4A2)或其亚克隆或后代细胞获得的抗体相同的抗体。
如本文中所使用的，术语“嵌合抗体”是指这样的抗体，其轻链或/和重链的一部分源自一个抗体(其可以源自某一特定物种或属于某一特定抗体类或亚类)，且轻链或/和重链的另一部分源自另一个抗体(其可以源自相同或不同的物种或属于相同或不同的抗体类或亚类)，但无论如何，其仍保留对目标抗原的结合活性(U.S.P4,816,567toCabillyetal.；Morrisonetal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:68516855(1984))。
如本文中所使用的，术语“人源化抗体”是指，人源免疫球蛋白(受体抗体)的全部或部分CDR区被一非人源抗体(供体抗体)的CDR区替换后得到的抗体或抗体片段，其中的供体抗体可以是具有预期特异性、亲和性或反应性的非人源(例如，小鼠、大鼠或兔)抗体。此外，受体抗体的构架区(FR)的一些氨基酸残基也可被相应的非人源抗体的氨基酸残基替换，或被其他抗体的氨基酸残基替换，以进一步完善或优化抗体的性能。关于人源化抗体的更多详细内容，可参见例如，Jonesetal.,Nature,321:522525(1986)；Reichmannetal.,Nature,332:323329(1988)；Presta,Curr.Op.Struct.Biol.,2:593596(1992)；和Clark,Immunol.Today21:397402(2000)。
如本文中所使用的，“中和抗体”是指，能清除或显著降低目标病毒的毒力(例如，感染细胞的能力)的抗体或抗体片段。此类中和抗体通常在杀灭细胞外游离病毒中起主要作用，其作用机制通常是：使病毒裂解或改变病毒膜蛋白结构，阻止病毒吸附于易感细胞，使病毒不能穿入胞内进行增殖。
如本文中所使用的，术语“表位”是指，抗原上被免疫球蛋白或抗体特异性结合的部位。“表位”在本领域内也称为“抗原决定簇”。表位或抗原决定簇通常由分子的化学活性表面基团例如氨基酸或碳水化合物或糖侧链组成并且通常具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。例如，表位通常以独特的空间构象包括至少3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14或15个连续或非连续的氨基酸，其可以是“线性的”或“构象的”。参见，例如，EpitopeMappingProtocolsinMethodsinMolecularBiology，第66卷，G.E.Morris，Ed.(1996)。在线性表位中，蛋白质与相互作用分子(例如抗体)之间的所有相互作用的点沿着蛋白质的一级氨基酸序列线性存在。在构象表位中，相互作用的点跨越彼此分开的蛋白质氨基酸残基而存在。
如本文中所使用的，术语“中和表位”是指这样的表位：识别该表位的单抗或多抗血清具有中和能力，能够与病毒结合并清除或显著降低目标病毒的毒力(例如，感染细胞的能力)。
如本文中所使用的，术语“补体依赖的中和表位”是指这样的表位：识别该表位的单抗或多抗血清能够与病毒结合并介导补体作用消除病毒感染，其中所述单抗或多抗血清在杀灭细胞外的游离病毒中起主要作用，其作用机制是使病毒裂解或改变病毒膜蛋白结构，阻止病毒吸附于易感细胞，使病毒不能穿入胞内进行增殖。通常情况下，识别普通抗原表位(即，非中和表位)的单抗或多抗血清只能识别结合病毒，而不具有消除病毒感染的能力。
如本文中所使用的，术语“表位肽”是指，抗原上能够用作表位的肽段。在一些情况下，单独的表位肽即能够被针对所述表位的抗体特异性识别/结合。在另一些情况下，可能需要将表位肽与载体蛋白融合，以便表位肽能够被特异性抗体识别。如本文中所使用的，术语“载体蛋白”是指这样的蛋白，其可以充当表位肽的载体，即，其可以在特定位置处(例如蛋白内部，N端或C端)插入表位肽，以便该表位肽能够呈现出来，从而该表位肽能够被抗体或免疫系统识别。此类载体蛋白是本领域技术人员熟知的，包括例如，HPVL1蛋白(可以将表位肽插入在所述蛋白的第130-131位氨基酸之间或在第426-427位氨基酸之间，参见Slupetzky,K.等Chimericpapillomavirus-likeparticlesexpressingaforeignepitopeoncapsidsurfaceloops[J].JGenVirol,2001,82:2799-2804；Varsani,A.等Chimerichumanpapillomavirustype16(HPV-16)L1particlespresentingthecommonneutralizingepitopefortheL2minorcapsidproteinofHPV-6andHPV-16[J].JVirol,2003,77:8386-8393)，HBV核心抗原(可以用表位肽替换所述蛋白的第79-80位氨基酸，参见Koletzki,D.,etal.HBVcoreparticlesallowtheinsertionandsurfaceexposureoftheentirepotentiallyprotectiveregionofPuumalahantavirusnucleocapsidprotein[J].BiolChem,1999,380:325-333)，土拨鼠肝炎病毒核心蛋白(可以用表位肽替换所述蛋白的第79-80位氨基酸，参见SabineGertrudBeteramsandMichaelNassal，J.Virol.1998,72(6):4997)，CRM197蛋白(可以将表位肽连接至该蛋白或其片段的N末端或C末端)。任选地，可以在表位肽与载体蛋白之间使用连接体(例如柔性或刚性连接体)，以促进二者各自的折叠。
可使用本领域技术人员已知的常规技术，就与相同表位的结合竞争性筛选抗体。例如，可进行竞争和交叉竞争研究，以获得彼此竞争或交叉竞争与抗原(例如，gE蛋白)的结合的抗体。基于它们的交叉竞争来获得结合相同表位的抗体的高通量方法描述于国际专利申请WO03/48731中。因此，可使用本领域技术人员已知的常规技术，获得与本发明的单克隆抗体(例如，单克隆抗体4A2)竞争结合gE蛋白上的相同表位的抗体及其抗原结合片段(即，抗原结合部分)。
如本文中所使用的，术语“分离的”或“被分离的”指的是，从天然状态下经人工手段获得的。如果自然界中出现某一种“分离”的物质或成分，那么可能是其所处的天然环境发生了改变，或从天然环境下分离出该物质，或二者情况均有发生。例如，某一活体动物体内天然存在某种未被分离的多聚核苷酸或多肽，而从这种天然状态下分离出来的高纯度的相同的多聚核苷酸或多肽即称之为分离的。术语“分离的”或“被分离的”不排除混有人工或合成的物质，也不排除存在不影响物质活性的其它不纯物质。
如本文中所使用的，术语“大肠杆菌表达系统”是指由大肠杆菌(菌株)与载体组成的表达系统，其中大肠杆菌(菌株)来源于市场上可得到的菌株，例如但不限于：GI698,ER2566,BL21(DE3),B834(DE3),BLR(DE3)。
如本文中所使用的，术语“载体(vector)”是指，可将多聚核苷酸插入其中的一种核酸运载工具。当载体能使插入的多核苷酸编码的蛋白获得表达时，载体称为表达载体。载体可以通过转化，转导或者转染导入宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获得表达。载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒；噬菌粒；柯斯质粒；人工染色体，例如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1来源的人工染色体(PAC)；噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体及动物病毒等。可用作载体的动物病毒包括但不限于，逆转录酶病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳头多瘤空泡病毒(如SV40)。一种载体可以含有多种控制表达的元件，包括但不限于，启动子序列、转录起始序列、增强子序列、选择元件及报告基因。另外，载体还可含有复制起始位点。
如本文中所使用的，术语“宿主细胞”是指，可用于导入载体的细胞，其包括但不限于，如大肠杆菌或枯草菌等的原核细胞，如酵母细胞或曲霉菌等的真菌细胞，如S2果蝇细胞或Sf9等的昆虫细胞，或者如纤维原细胞，CHO细胞，COS细胞，NSO细胞，HeLa细胞，BHK细胞，HEK293细胞或人细胞等的动物细胞。
如本文中所使用的，术语“同一性”用于指两个多肽之间或两个核酸之间序列的匹配情况。当两个进行比较的序列中的某个位置都被相同的碱基或氨基酸单体亚单元占据时(例如，两个DNA分子的每一个中的某个位置都被腺嘌呤占据，或两个多肽的每一个中的某个位置都被赖氨酸占据)，那么各分子在该位置上是同一的。两个序列之间的“百分数同一性”是由这两个序列共有的匹配位置数目除以进行比较的位置数目×100的函数。例如，如果两个序列的10个位置中有6个匹配，那么这两个序列具有60％的同一性。例如，DNA序列CTGACT和CAGGTT共有50％的同一性(总共6个位置中有3个位置匹配)。通常，在将两个序列比对以产生最大同一性时进行比较。这样的比对可通过使用，例如，可通过计算机程序例如Align程序(DNAstar,Inc)方便地进行的Needleman等人(1970)J.Mol.Biol.48：443-453的方法来实现。还可使用已整合入ALIGN程序(版本2.0)的E.Meyers和W.Miller(Comput.ApplBiosci.，4:11-17(1988))的算法，使用PAM120权重残基表(weightresiduetable)、12的缺口长度罚分和4的缺口罚分来测定两个氨基酸序列之间的百分数同一性。此外，可使用已整合入GCG软件包(可在www.gcg.com上获得)的GAP程序中的Needleman和Wunsch(JMoIBiol.48:444-453(1970))算法，使用Blossum62矩阵或PAM250矩阵以及16、14、12、10、8、6或4的缺口权重(gapweight)和1、2、3、4、5或6的长度权重来测定两个氨基酸序列之间的百分数同一性。
如本文中使用的，术语“保守置换”意指不会不利地影响或改变包含氨基酸序列的蛋白/多肽的必要特性的氨基酸置换。例如，可通过本领域内已知的标准技术例如定点诱变和PCR介导的诱变引入保守置换。保守氨基酸置换包括用具有相似侧链的氨基酸残基替代氨基酸残基的置换，例如用在物理学上或功能上与相应的氨基酸残基相似(例如具有相似大小、形状、电荷、化学性质，包括形成共价键或氢键的能力等)的残基进行的置换。已在本领域内定义了具有相似侧链的氨基酸残基的家族。这些家族包括具有碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸和组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β分支侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。因此，优选用来自相同侧链家族的另一个氨基酸残基替代相应的氨基酸残基。鉴定氨基酸保守置换的方法在本领域内是熟知的(参见，例如，Brummell等人，Biochem.32:1180-1187(1993)；Kobayashi等人ProteinEng.12(10):879-884(1999)；和Burks等人Proc.NatlAcad.SetUSA94:412-417(1997)，其通过引用并入本文)。
如本文中使用的，术语“免疫原性(immunogenicity)”是指，能够刺激机体形成特异抗体或致敏淋巴细胞的能力。其既指，抗原能刺激特定的免疫细胞，使免疫细胞活化、增殖、分化，最终产生免疫效应物质如抗体和致敏淋巴细胞的特性，也指抗原刺激机体后，机体免疫系统能形成抗体或致敏T淋巴细胞的特异性免疫应答。免疫原性是抗原最重要的性质，一种抗原能否成功地诱导宿主产生免疫应答取决于三方面的因素：抗原的性质、宿主的反应性和免疫方式。
如本文中使用的，术语“特异性结合”是指，两分子间的非随机的结合反应，如抗体和其所针对的抗原之间的反应。在某些实施方式中，特异性结合某抗原的抗体(或对某抗原具有特异性的抗体)是指，抗体以小于大约10-5M，例如小于大约10-6M、10-7M、10-8M、10-9M或10-10M或更小的亲和力(KD)结合该抗原。
如本文中所使用的，术语“KD”是指特定抗体-抗原相互作用的解离平衡常数，其用于描述抗体与抗原之间的结合亲和力。平衡解离常数越小，抗体-抗原结合越紧密，抗体与抗原之间的亲和力越高。通常，抗体(例如，本发明的单克隆抗体4A2)以小于大约10-5M，例如小于大约10-6M、10-7M、10-8M、10-9M或10-10M或更小的解离平衡常数(KD)结合抗原(例如，gE蛋白)，例如，如使用表面等离子体共振术(SPR)在BIACORE仪中测定的。
如本文中所使用的，术语“单克隆抗体”和“单抗”具有相同的含义且可互换使用；术语“多克隆抗体”和“多抗”具有相同的含义且可互换使用；术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”具有相同的含义且可互换使用。并且在本发明中，氨基酸通常用本领域公知的单字母和三字母缩写来表示。例如，丙氨酸可用A或Ala表示。
如本文中所使用的，术语“杂交瘤”和“杂交瘤细胞株”可互换使用，并且当提及术语“杂交瘤”和“杂交瘤细胞株”时，其还包括杂交瘤的亚克隆和后代细胞。例如，当提及杂交瘤细胞株4A2时，其还指杂交瘤细胞株4A2的亚克隆和后代细胞。
如本文中所使用的，术语“药学上可接受的载体和/或赋形剂”是指在药理学和/或生理学上与受试者和活性成分相容的载体和/或赋形剂，其是本领域公知的(参见例如Remington'sPharmaceuticalSciences.EditedbyGennaroAR,19thed.Pennsylvania:MackPublishingCompany,1995)，并且包括但不限于：pH调节剂，表面活性剂，佐剂，离子强度增强剂。例如，pH调节剂包括但不限于磷酸盐缓冲液；表面活性剂包括但不限于阳离子，阴离子或者非离子型表面活性剂，例如Tween-80；离子强度增强剂包括但不限于氯化钠。
如本文中所使用的，术语“佐剂”是指非特异性免疫增强剂，当其与抗原一起或预先递送入机体时，其可增强机体对抗原的免疫应答或改变免疫应答类型。佐剂有很多种，包括但不限于铝佐剂(例如氢氧化铝)、弗氏佐剂(例如完全弗氏佐剂和不完全弗氏佐剂)、短小棒状杆菌、脂多糖、细胞因子等。弗氏佐剂是目前动物试验中最常用的佐剂。氢氧化铝佐剂则在临床实验中使用较多。
如本文中所使用的，术语“蛋白疫苗”是指，基于多肽/蛋白的疫苗，其任选地还包含佐剂。疫苗中的多肽可以是通过基因工程技术获得的，也可以是通过化学合成方法获得的。如本文中所使用的，术语“核酸疫苗”是指，基于DNA或RNA(例如质粒，如表达质粒)的疫苗，其任选地还包含佐剂。
如本文中所使用的，术语“有效量”是指足以获得或至少部分获得期望的效果的量。例如，预防疾病(例如VZV感染或与VZV感染相关的疾病)有效量是指，足以预防，阻止，或延迟疾病(例如VZV感染或与VZV感染相关的疾病)的发生的量；治疗疾病有效量是指，足以治愈或至少部分阻止已患有疾病的患者的疾病和其并发症的量。测定这样的有效量完全在本领域技术人员的能力范围之内。例如，对于治疗用途有效的量将取决于待治疗的疾病的严重度、患者自己的免疫系统的总体状态、患者的一般情况例如年龄，体重和性别，药物的施用方式，以及同时施用的其他治疗等等。
如本文中所使用的，术语“水痘”是指，水痘带状疱疹病毒(VZV)初次感染而引发的急性传染病，其以发热及成批出现周身性红色斑丘疹、疱疹、痂疹为主要特征。
如本文中所使用的，术语“带状疱疹”是指，潜伏在神经节的VZV病毒重新激活并延神经轴顺行至神经支配的皮肤上增殖而产生的病症。
如本文中所使用的，术语“受试者”是指任何动物，特别是哺乳动物，例如人、狗、猴、牛、马等。
如本文中所使用的，本发明的表位肽的生物学功能包括但不限于选自下列的一种或多种：
1)与抗体4A2的特异性结合；
2)诱发机体产生具有中和作用的、能够抑制VZV感染的中和抗体的能力(任选地，在将所述表位肽与载体蛋白融合后)；
3)治疗受试者的VZV感染或与VZV感染相关的疾病的能力(任选地，在将所述表位肽与载体蛋白融合后)。
因此，在一个方面，本发明提供了一种分离的表位肽或其变体，所述表位肽是来源于水痘-带状疱疹病毒(VZV)的gE蛋白的片段，且至少包含gE蛋白的第121-135位氨基酸残基，且所述变体与其所源自的表位肽相异仅在于1个或几个(例如，1个，2个，3个、4个或5个)氨基酸残基的保守置换，且保留了其所源自的表位肽的生物学功能。
在一个优选的实施方案中，所述表位肽由gE蛋白的15-30个(例如，15个，16个，17个，18个，19个，20个，21个，22个，23个，24个，25个，26个，27个，28个，29个，30个)连续氨基酸残基组成，且包含gE蛋白的第121-135位氨基酸残基。在一个优选的实施方案中，所述gE蛋白的第121-135位氨基酸残基如SEQIDNO:1所示。
在一个优选的实施方案中，所述表位肽具有选自下列的氨基酸序列：gE蛋白的第121-135位氨基酸残基；gE蛋白的第120-136位氨基酸残基；gE蛋白的第119-137位氨基酸残基；gE蛋白的第118-138位氨基酸残基；gE蛋白的第117-139位氨基酸残基；gE蛋白的第116-140位氨基酸残基；gE蛋白的第114-140位氨基酸残基；和gE蛋白的第111-140位氨基酸残基。在一个优选的实施方案中，所述表位肽具有选自SEQIDNO:1-8的氨基酸序列。
在一个优选的实施方案中，所述表位肽为中和表位肽，例如补体依赖的中和表位肽。
本发明的表位肽可以通过人工化学合成的方式得到，也可以使用本领域技术人员知悉的其它生物化学或者分子生物学的方法得到。例如，可通过基因重组手段，将编码本发明的表位肽的核苷酸序列(例如SEQIDNO：9-16)克隆到表达载体中，然后转染宿主细胞进行蛋白表达，从而获得本发明的表位肽。例如，可以在合适的培养基中，在允许多肽表达和/或分离的条件下，通过摇瓶培养、实验室或工业发酵罐中小规模或大规模发酵(包括连续、分批、分批加料或固态发酵)来培养宿主细胞，以表达本发明的表位肽。如果多肽被分泌到培养基中，则可以直接从培养基中回收本发明的表位肽。如果多肽不被分泌，则可以从宿主细胞的裂解物中回收本发明的表位肽。
可以将本发明的表位肽或其变体与载体蛋白融合，以增强表位肽或其变体的免疫原性，使得表位肽或其变体能够被机体的免疫系统识别，并诱发有效清除体内病毒和被病毒感染的细胞的抗体应答。
因此，在一个方面，本发明还提供了一种重组蛋白，其包含本发明的表位肽或其变体，以及载体蛋白，并且所述重组蛋白不是天然存在的蛋白或其片段。在所述重组蛋白中，所述表位肽或其变体可以连接至载体蛋白的N末端或C末端，插入载体蛋白的内部，或替换载体蛋白的部分氨基酸序列，视所使用的具体载体蛋白而定。因此，在本发明中，表述“表位肽与载体蛋白相连接”意欲包括所有的连接方式，例如但不限于，至载体蛋白的N末端或C末端，插入载体蛋白的内部，或替换载体蛋白的部分氨基酸序列。此外，任选地，所述表位肽或其变体通过连接体(刚性或柔性连接体，例如(GGGGS)3)与载体蛋白相连接。本发明的重组蛋白不受其产生方式的限定，例如，其可以通过基因工程方法(重组技术)产生，也可以通过化学合成方法产生。
在一个优选的实施方案中，所述载体蛋白为HBcAg或其片段。在一个优选的实施方案中，所述HBcAg的片段包含或者由HBcAg的第1-149位氨基酸残基组成，并且用本发明的表位肽替换HBcAg的第79-80位氨基酸(aa79-80；在本发明中，aa表示氨基酸，其置于数字n前面时，表示第n位氨基酸(例如，aa79-80表示第79-80位氨基酸)；置于数字n之后时，表示多肽长度为n个氨基酸(下同))。在一个优选的实施方案中，所述载体蛋白具有如SEQIDNO:80所示的氨基酸序列。
在一个优选的实施方案中，所述表位肽与HBcAg或其片段通过连接体连接。在一个优选的实施方案中，所述连接体的氨基酸序列如SEQIDNO:82所示。在一个优选的实施方案中，所述重组蛋白具有选自下列的氨基酸序列：SEQIDNO：99-106。
在另一个方面，本发明还提供了一种类病毒颗粒，其包含或者由本发明的重组蛋白组成。本发明的表位肽在与载体蛋白融合且经过蛋白纯化和组装后，可形成类病毒颗粒，并将所述表位肽展示在类病毒颗粒的表面，使其仍保持诱导亲和抗体产生的能力。在一个优选的实施方案中，使用HBcAg蛋白的片段作为载体蛋白来构建本发明的重组蛋白，以形成HBV类病毒颗粒，并将本发明的表位肽展示在类病毒颗粒的表面。在一个优选的实施方案中，所述HBcAg的片段包含或者由HBcAg的第1-149位氨基酸残基组成，并且用本发明的表位肽替换HBcAg的第79-80位氨基酸。
在另一个方面，本发明还提供了一种表位肽偶联物，其包含本发明的表位肽和与之偶联的偶联部分。
在一个优选的实施方案中，所述偶联部分选自放射性核素、药物、毒素、细胞因子、酶、荧光素、载体、脂类、和生物素中的一种或多种。在一个优选的实施方案中，所述载体选自人血清白蛋白、牛血清白蛋白、牛甲状腺球蛋白、钥孔血白蛋白及其他γ球蛋白。另外，载体还可以为多聚赖氨酸、二软脂酰赖氨酸、三软脂酸2S甘油半胱氨酰2丝氨酰基丝氨酸、多聚谷氨酸及多聚混合氨基酸等。
在一个优选的实施方案中，所述偶联部分通过选自下述的偶联方法偶联至表位肽：MBS法、戊二醛法、活泼酯法、碳二亚胺法、卤代硝基苯法及亚胺酸脂法。
在另一个方面，本发明还提供了一种分离的核酸分子，其包含编码本发明的表位肽或其变体或本发明的重组蛋白的核苷酸序列。在一个优选的实施方案中，编码本发明的表位肽或其变体的核苷酸序列具有选自SEQIDNO:9-16的核苷酸序列。在一个优选的实施方案中，优选地，编码本发明重组蛋白的核苷酸序列具有选自SEQIDNO:107-114的核苷酸序列。
在另一个方面，本发明还提供了一种载体，其包含如上所述的分离的核酸分子。本发明的载体可以是克隆载体，也可以是表达载体。在一个优选实施方案中，本发明的载体是例如质粒(线性或闭环)，粘粒，噬菌体，柯斯质粒，或病毒载体等等。在一个优选实施方案中，所述载体能够在受试者(例如哺乳动物，例如人)体内表达本发明的表位肽或其变体或本发明的重组蛋白。载体的选择通常取决于载体与它将要导入的宿主细胞的相容性。
可以将本发明的核苷酸序列和表达调控序列连接在一起，用于制备表达载体。此类表达载体可以包括1或多个限制性位点，以便在这些位点插入编码多肽的核酸序列。或者，可以通过将核苷酸序列或包含核苷酸序列的核酸构建体插入适当的表达载体而表达本发明的核苷酸序列。制备表达载体时，可使编码序列位于载体中，且与适当的表达调控序列可操作连接。术语“表达调控序列”是指，表达本发明的核苷酸序列所必需或有利的任何元件。每个调控序列对于编码多肽的核酸序列可以是天然的或外源的。此类调控序列包括，但不限于，前导序列、多聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号序列和转录终止子。术语“可操作连接”是指这样一种连接方式，其中调控序列位于目的核苷酸序列的适当位置，以使得调控序列能够发挥其预期的作用，指导目的核苷酸序列表达为多肽。
在另一个方面，还提供了包含本发明的分离的核酸分子或载体的宿主细胞。此类宿主细胞包括但不限于，原核细胞例如大肠杆菌细胞，以及真核细胞例如酵母细胞，昆虫细胞，植物细胞和动物细胞(如哺乳动物细胞，例如小鼠细胞、人细胞等)。本发明的细胞还可以是细胞系，例如293T细胞。可以通过本领域技术人员熟知的技术将载体导入宿主细胞。
在另一个方面，还提供了制备本发明的表位肽或其变体或者重组蛋白的方法，其包括，在合适的条件下培养本发明的宿主细胞，和从细胞培养物中回收本发明的表位肽或其变体或者重组蛋白。
在另一个方面，本发明提供了一种组合物，其包含本发明的表位肽或其变体、或重组蛋白、或类病毒颗粒、或表位肽偶联物，或核酸分子、或载体、或宿主细胞；以及，任选的药学上可接受的载体和/或赋形剂(例如佐剂)。
在一个优选实施方案中，所述组合物为疫苗组合物，且还包含药学上可接受的载体和/或赋形剂(例如佐剂)。
在一个优选实施方案中，所述疫苗组合物为蛋白疫苗，其包含一种或多种所述表位肽、一种或多种所述重组蛋白、一种或多种所述类病毒颗粒、和/或一种或多种所述表位肽偶联物。优选地，所述表位肽可以是单独的或串联的、修饰的或未经修饰的、偶联至其他蛋白的或不偶联至其他蛋白的。
在一个优选实施方案中，所述疫苗组合物为基因疫苗，其包含一个或多个所述核酸分子或载体。在一个优选实施方案中，所述基因疫苗包含DNA或RNA。在此类实施方案中，所述DNA或RNA可以是裸露的或可以包裹于具有传递或/和保护功能的外壳内。在一个进一步优选的实施方案中，所述外壳可以是腺病毒、腺相关病毒、慢病毒、逆转录病毒等的外壳，也可以是采用化学方法合成的能行使相似功能的其他材料。
在一个优选实施方案中，所述疫苗组合物用于治疗和/或预防VZV感染或与所述感染相关的一种或多种疾病或症状，例如水痘或带状疱疹。
在另一个优选实施方案中，所述组合物为检测用组合物，其用于检测VZV病毒抗体(特别是中和抗体)的效价。
在另一个优选实施方案中，所述组合物为用于制备抗VZV的抗血清或抗体的组合物。
在另一个方面，提供了本发明的表位肽或其变体、或重组蛋白、或类病毒颗粒、或表位肽偶联物，或核酸分子、或载体在制备疫苗组合物中的用途，所述疫苗组合物用于治疗和/或预防VZV感染或与所述感染相关的一种或多种疾病或症状，例如水痘或带状疱疹。
在一个优选实施方案中，所述疫苗组合物为蛋白疫苗，其包含一种或多种所述表位肽、一种或多种所述重组蛋白、一种或多种所述类病毒颗粒、和/或一种或多种所述表位肽偶联物。优选地，所述表位肽可以是单独的或串联的、修饰的或未经修饰的、偶联至其他蛋白的或不偶联至其他蛋白的。
在一个优选实施方案中，所述疫苗组合物为基因疫苗，其包含一个或多个所述核酸分子或载体。在一个优选实施方案中，所述基因疫苗包含DNA或RNA。在此类实施方案中，所述DNA或RNA可以是裸露的或可以包裹于具有传递或/和保护功能的外壳内。在一个进一步优选的实施方案中，所述外壳可以是腺病毒、腺相关病毒、慢病毒、逆转录病毒等的外壳，也可以是采用化学方法合成的能行使相似功能的其他材料。
在另一个方面，提供了本发明的表位肽或其变体、或重组蛋白、或类病毒颗粒、或表位肽偶联物，或核酸分子、或载体在制备组合物中的用途，所述组合物用于检测VZV病毒滴度和/或检测VZV病毒抗体(特别是中和抗体)的效价，或用于制备抗VZV的抗血清或抗体(特别是中和性抗血清或抗体)。
在另一个方面，用于在受试者(优选哺乳动物，例如人)中治疗和/或预防VZV感染或与所述感染相关的一种或多种疾病或症状，例如水痘或带状疱疹的方法，其包括，给有此需要的受试者施用治疗和/或预防有效量的本发明的表位肽或其变体、或重组蛋白、或类病毒颗粒、或表位肽偶联物，或核酸分子、或载体。
在另一个方面，本发明提供了制备抗VZV的抗血清或抗体(特别是中和性抗血清或抗体)的方法，所述方法包括：
给非人动物(优选非人哺乳动物，例如大鼠，小鼠，兔)施用有效量的本发明的表位肽或其变体、或重组蛋白、或类病毒颗粒、或表位肽偶联物，或核酸分子、或载体，以在所述动物体内诱发抗VZV的免疫应答；
从所述动物分离抗VZV的抗血清；和，
任选地，从所述抗血清中分离抗体。
备选地，所述方法可包括下述步骤：
给非人动物(优选非人哺乳动物，例如大鼠，小鼠，兔)施用有效量的本发明的表位肽或其变体、或重组蛋白、或类病毒颗粒、或表位肽偶联物，或核酸分子、或载体，以在所述动物体内诱发抗VZV的免疫应答；
从所述动物分离能够产生抗VZV抗体的B细胞；
将所述B细胞与骨髓瘤细胞融合，以产生能够分泌抗VZV抗体的杂交瘤细胞；
分离和培养所述杂交瘤细胞；和
从所述杂交瘤细胞的培养物中分离抗VZV抗体。
在一个方面，本发明提供了一种单克隆抗体或其抗原结合片段，其中，所述单克隆抗体能够特异性结合本发明的表位肽。
在一个优选的实施方案中，所述的单克隆抗体与下述抗体竞争结合VZV的gE蛋白上的相同表位：杂交瘤细胞株4A2所产生的单克隆抗体，其中，杂交瘤细胞株4A2保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，且具有保藏号CCTCCNO：C2014192。
在一个优选的实施方案中，所述的单克隆抗体具有选自下列的一个或多个CDR：
如SEQIDNO:115所示的重链CDR1；
如SEQIDNO:116所示的重链CDR2；
如SEQIDNO:117所示的重链CDR3；
如SEQIDNO:118所示的轻链CDR1；
如SEQIDNO:119所示的轻链CDR2；以及，
如SEQIDNO:120所示的轻链CDR3；
在一个优选的实施方案中，所述的单克隆抗体具有所述的6个CDR。在一个优选的实施方案中，所述的单克隆抗体具有如SEQIDNO:24所示的轻链可变区，和/或，如SEQIDNO:26所示的重链可变区。
在一个优选的实施方案中，所述的单克隆抗体衍生自下述单克隆抗体，或是下述单克隆抗体：杂交瘤细胞株4A2所产生的单克隆抗体，其中，杂交瘤细胞株4A2保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，且具有保藏号CCTCCNO：C2014192。
在一个优选的实施方案中，所述单克隆抗体或其抗原结合片段选自Fab、Fab'、F(ab')2、Fd、Fv、dAb、互补决定区片段、单链抗体(例如，scFv)、小鼠抗体、兔抗体、羊抗体、人源化抗体、全人抗体、嵌合抗体(例如，人鼠嵌合抗体)或双特异或多特异抗体。
在一个优选的实施方案中，所述的单克隆抗体以小于大约10-5M，例如小于大约10-6M、10-7M、10-8M、10-9M或10-10M或更小的KD结合所述表位肽或VZV的gE蛋白。
在一个优选的实施方案中，所述的单克隆抗体包括非-CDR区，且所述非-CDR区来自不是鼠类的物种，例如来自人抗体。
在一个优选的实施方案中，所述的单克隆抗体为中和性单克隆抗体。
在一个优选的实施方案中，所述的单克隆抗体能够在受试者体内治疗和/或预防VZV感染或与所述感染相关的一种或多种疾病或症状，例如水痘或带状疱疹。
在另一个优选的实施方案中，本发明的单克隆抗体能够阻断本发明的表位肽或gE蛋白与由杂交瘤细胞株4A2所产生的抗体的结合至少50％，优选至少60％，优选至少70％，优选至少80％，优选至少90％，优选至少95％或优选至少99％，其中，所述杂交瘤细胞株4A2保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，且具有保藏号CCTCCNO：C2014192。
此类单抗所识别的表位与单抗4A2识别的表位相同，或者在空间上存在重叠，从而此类单抗能够降低单抗4A2与本发明的表位肽或gE蛋白的结合至少50％，优选至少60％，优选至少70％，优选至少80％，优选至少90％，优选至少95％或优选至少99％。
可以采用常规方法如Antibodies:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratory,EdHarlowandDavidLane(1988)中描述的方法，测定某一待测单抗降低某一已知单抗结合gE蛋白的能力。一个示例性的方法包括：先把抗原预包被在微孔板上，然后把系列稀释的未标记的待测抗体以及特定浓度的经标记的已知单抗共同加入上述预包被后的微孔板中进行孵育，然后在洗涤后测定在不同稀释度的待测抗体下，已知抗体结合到板上的数量。待测抗体竞争已知抗体结合抗原的能力越强，已知抗体结合抗原的能力就越弱，结合到板上的已知抗体就越少。通常，将抗原预包被在96孔微孔板上，并利用放射标记法或酶标记法测定待测单抗阻断经标记的已知单抗的能力。
可以采用Kohler等在Nature256:495(1975)中报道的杂交瘤制备方法来制备单抗。首先用免疫原(必要时候添加佐剂)免疫注射小鼠或其它合适的宿主动物。免疫原或佐剂的注射方式通常为皮下多点注射或腹腔注射。将免疫原预先偶联到某些已知蛋白(如血清白蛋白)上，可能会有助于增强抗原在宿主内的免疫原性。佐剂可以利用弗氏佐剂或MPL-TDM等。动物在接受免疫后，体内会产生分泌特异性结合免疫原的抗体的淋巴细胞。收集目的淋巴细胞，并用合适的融合剂(如PEG)将其与骨髓瘤细胞融合，从而获得杂交瘤细胞(Goding,MonoclonalAntibodies:PrinciplesandPractice,pp.59-103,AcademicPress,1996)。
将上述制备的杂交瘤细胞接种到合适的培养基中进行生长，所述培养基中含有一种或多种能够抑制未融合的、母体骨髓瘤细胞生长的物质。例如，对于缺乏次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸转移酶(HGPRT或HPRT)的母体骨髓瘤细胞，在培养基中添加次黄嘌呤、氨基喋呤和胸腺嘧啶(HAT培养基)等物质将可以抑制HGPRT-缺陷细胞的生长。
优选的骨髓瘤细胞应该具有融合率高，抗体分泌能力稳定，对HAT培养基敏感等能力。其中，骨髓瘤细胞首选鼠源骨髓瘤，如MOP-21和MC-11小鼠肿瘤衍生株(THESalkInstituteCellDistributionCenter,SanDiego,Calif.USA)，以及SP-2/0或X63-Ag8-653细胞株(AmericanTypeCμltureCollection,Rockville,Md.USA)。另外，还可以利用人骨髓瘤和人鼠异源骨髓瘤细胞株制备人单抗(Kozbor,J.Immunol.,133:3001(1984)；Brodeuretal.,MonoclonalAntibodyProductionTechniquesandApplications,pp.51-63,MarcelDekker,Inc.,NewYork,1987)。
杂交瘤细胞生长的培养基用于检测针对特异抗原的单抗的产生。可以使用下列方法来测定杂交瘤细胞产生的单抗的结合特异性：免疫沉淀或体外结合试验，如放射免疫试验(RIA)、酶联免疫吸附试验(ELISA)。例如，利用Munson等在Anal.Biochem.107:220(1980)中描述的Scatchard分析法可测定单抗的亲和力。
在确定杂交瘤产生的抗体的特异性、亲和力和反应性之后，目的细胞株可以通过Goding,MonoclonalAntibodies:PrinciplesandPractice,pp.59-103,AcademicPress,1996描述的有限稀释法进行亚克隆化。合适的培养基可以是DMEM或RPMI-1640等。另外，杂交瘤细胞还可以腹水瘤的形式在动物体内生长。
利用传统的免疫球蛋白纯化方法，如蛋白A琼脂糖凝胶、羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析或亲和层析等，可以将亚克隆细胞分泌的单抗从细胞培养液、腹水或血清中分离出来。
还可以通过基因工程重组技术获得单克隆抗体。利用特异性结合单抗重链和轻链基因的核酸引物进行PCR扩增，可以从杂交瘤细胞中分离得到编码单抗重链和轻链基因的DNA分子。将所得的DNA分子插入表达载体内，然后转染宿主细胞(如E.coli细胞、COS细胞、CHO细胞、或其它不产生免疫球蛋白的骨髓瘤细胞)，并在合适的条件下进行培养，可以获得重组表达的目标抗体。
本发明还提供了分离的核酸分子，其编码本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段。此类核酸分子可以从杂交瘤细胞中分离得到，也可以利用基因工程重组技术或化学合成方法获得。
在一个方面，本发明提供了分离的核酸分子，其包含能够编码本发明的单克隆抗体的重链可变区的核酸序列。在另一个方面，本发明提供了分离的核酸分子，其包含能够编码本发明的单克隆抗体的轻链可变区的核酸序列。
在一个优选实施方案中，编码所述单克隆抗体的轻链可变区的核苷酸序列如SEQIDNO:23所示。在一个优选实施方案中，编码所述单克隆抗体的重链可变区的核苷酸序列如SEQIDNO:25所示。
在另一个方面，本发明提供了一种载体，其包含本发明的分离的核酸分子。本发明的载体可以是克隆载体，也可以是表达载体。在一个优选实施方案中，本发明的载体是例如质粒(线性或闭环)，粘粒，噬菌体，柯斯质粒，或病毒载体等等。在一个优选实施方案中，所述载体能够在受试者(例如哺乳动物，例如人)体内表达本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段。载体的选择通常取决于载体与它将要导入的宿主细胞的相容性。
在另一个方面，还提供了包含本发明的分离的核酸分子或载体的宿主细胞。此类宿主细胞包括但不限于，原核细胞例如大肠杆菌细胞，以及真核细胞例如酵母细胞，昆虫细胞，植物细胞和动物细胞(如哺乳动物细胞，例如小鼠细胞、人细胞等)。本发明的细胞还可以是细胞系，例如293T细胞。可以通过本领域技术人员熟知的技术将载体导入宿主细胞。
在另一个方面，还提供了制备本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段的方法，其包括，在合适的条件下培养本发明的宿主细胞，和从细胞培养物中回收本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段。
在另一个方面，本发明提供了一种杂交瘤细胞株4A2，其保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，且具有保藏号CCTCCNO：C2014192。
可通过常规方法，从单克隆抗体4A2中获得各个抗体各自所包含的重链可变区、轻链可变区、重链可变区CDR和轻链可变区CDR的氨基酸序列和/或核苷酸序列。
在另一个方面，本发明提供了一种抗体偶联物，其包含本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段，以及与之偶联的偶联部分。在一个优选的实施方案中，所述偶联部分选自放射性核素、药物、毒素、细胞因子、酶、荧光素、载体、脂类、和生物素中的一种或多种。在一个优选的实施方案中，所述偶联部分通过选自下述的偶联方法偶联至表位肽：MBS法、戊二醛法、活泼酯法、碳二亚胺法、卤代硝基苯法及亚胺酸脂法。
在另一个方面，本发明提供了一种试剂盒，其包括本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段。在一个优选的实施方案中，本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段还包括可检测的标记。在一个优选的实施方案中，所述试剂盒还包括第二抗体，其特异性识别本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段。优选地，所述第二抗体还包括可检测的标记。此类可检测的标记是本领域技术人员熟知的，包括但不限于，放射性同位素，荧光物质，发光物质，有色物质和酶(例如辣根过氧化物酶)等。
在另一个方面，提供了本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于检测gE蛋白在样品中的存在或其水平，或用于诊断受试者是否感染了VZV。
在另一个方面，本发明提供了检测gE蛋白在样品中的存在或其水平的方法，其包括使用本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段。在一个优选的实施方案中，本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段还包括可检测的标记。在另一个优选的实施方案中，所述方法还包括，使用携带可检测的标记的第二抗体来检测本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段。此类可检测的标记是本领域技术人员熟知的，包括但不限于，放射性同位素，荧光物质，发光物质，有色物质和酶(例如辣根过氧化物酶)等。所述方法可以用于诊断目的，或者非诊断目的(例如，所述样品是细胞样品，而非来自患者的样品)。
在另一个方面，本发明提供了诊断受试者(优选哺乳动物，例如人)是否感染了VZV的方法，其包括：使用本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段来检测来自受试者的样品中gE蛋白的存在或其水平。在一个优选的实施方案中，本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段还包括可检测的标记。在另一个优选的实施方案中，所述方法还包括，使用携带可检测的标记的第二抗体来检测本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段。此类可检测的标记是本领域技术人员熟知的，包括但不限于，放射性同位素，荧光物质，发光物质，有色物质和酶(例如辣根过氧化物酶)等。
在另一个方面，本发明提供了一种药物组合物，其包含本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段，以及药学上可接受的载体和/或赋形剂。在一个优选的实施方案中，所述单克隆抗体或其抗原结合片段偶联至偶联部分。在一个优选的实施方案中，所述偶联部分选自放射性核素、药物、毒素、细胞因子、酶、荧光素、载体、脂类、和生物素中的一种或多种。
在另一个方面，提供了本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段在制备药物组合物中的用途，所述药物组合物用于抵抗、治疗和/或预防VZV感染或与所述感染相关的一种或多种疾病或症状，例如水痘或带状疱疹。在一个优选的实施方案中，所述单克隆抗体或其抗原结合片段偶联至偶联部分。在一个优选的实施方案中，所述偶联部分选自放射性核素、药物、毒素、细胞因子、酶、荧光素、载体、脂类、和生物素中的一种或多种。
在另一个方面，本发明提供了用于在受试者(优选哺乳动物，例如人)中治疗和/或预防VZV感染或与所述感染相关的一种或多种疾病或症状，例如水痘或带状疱疹的方法，其包括，给有此需要的受试者施用预防或治疗有效量的本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段，或者本发明的药物组合物。在一个优选的实施方案中，所述单克隆抗体或其抗原结合片段偶联至偶联部分。在一个优选的实施方案中，所述偶联部分选自放射性核素、药物、毒素、细胞因子、酶、荧光素、载体、脂类、和生物素中的一种或多种。
在另一个方面，提供了本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段，用于在受试者(优选哺乳动物，例如人)中治疗和/或预防VZV感染或与所述感染相关的一种或多种疾病或症状，例如水痘或带状疱疹。
本发明所提供的疫苗(例如蛋白疫苗和基因疫苗)、药物和药物组合物可以单独使用或联合使用，也可以与其他药学活性剂(例如抗VZV的试剂)联合使用。
发明的有益效果
与现有技术相比，本发明的表位肽和含有所述表位肽的重组蛋白具有显著的有利方面。特别地，本发明的表位肽和重组蛋白能够诱发机体产生具有中和作用的、能够抑制VZV感染的中和抗体，能够用于治疗受试者的VZV感染或与所述感染相关的一种或多种疾病或症状，例如水痘或带状疱疹。
此外，本发明还提供了能够特异性识别/结合本发明的表位肽的单克隆抗体及其抗原结合片段。此类单克隆抗体及其抗原结合片段是具有中和作用的、能够抑制VZV感染的中和抗体，能够用于治疗受试者的VZV感染或与所述感染相关的一种或多种疾病或症状，例如水痘或带状疱疹。
本发明的表位肽的优势还在于，针对该表位肽的单克隆抗体及多克隆抗体(例如多抗血清)能够在受试者体内显著抑制抑制VZV感染，能够用于治疗受试者的VZV感染或与所述感染相关的一种或多种疾病或症状，例如水痘或带状疱疹。
此外，本发明的表位肽的优势还在于，其是高度保守的。已显示，本发明的表位肽在100个VZV病毒临床分离株序列中具有高度保守性(100％)。因此，本发明的表位肽可用于诱发机体产生抗各种VZV病毒株的广谱中和性抗体，从而可用作预防和治疗VZV病毒感染的有效疫苗。与此同时，由于本发明的单抗直接识别该高度保守的表位肽，因此，本发明的单抗可用作抗各种VZV病毒株的广谱中和性抗体，用于预防和治疗VZV病毒的感染和与VZV病毒感染相关的疾病。
序列信息
本发明涉及的部分序列的信息提供于下面的表1中，而其他序列的信息则提供于实施例中。
表1：SEQIDNO：1-16的信息
关于生物材料保藏的说明
杂交瘤细胞株VZV-gE-4A2(简称为杂交瘤细胞株4A2)已在中国典型培养物保藏中心(CCTCC,中国，武汉，武汉大学)进行了保藏，其具有保藏号CCTCCNO：C2014192，且保藏时间为2014年10月16日。
具体实施方式
现参照下列意在举例说明本发明(而非限定本发明)的实施例来描述本发明。
除非特别指明，本发明中所使用的分子生物学实验方法和免疫检测法，基本上参照J.Sambrook等人，分子克隆：实验室手册，第2版，冷泉港实验室出版社，1989，以及F.M.Ausubel等人，精编分子生物学实验指南，第3版，JohnWiley&Sons，Inc.，1995中所述的方法进行；限制性内切酶的使用依照产品制造商推荐的条件。实施例中未注明来源的试剂均是本领域的常规试剂或市售可得的试剂。本领域技术人员知晓，实施例以举例方式描述本发明，且不意欲限制本发明所要求保护的范围。
实施例1：重组VZV蛋白rgE的制备
本发明应用昆虫-杆状病毒表达系统表达、纯化VZVgE糖蛋白的胞外区段。具体步骤如下：
1.重组杆状病毒的构建
本发明以p-Oka病毒基因组为模板，使用表2所示的引物进行PCR，从而获得了编码gE糖蛋白胞外区段(1-538aa)的基因。扩增出的PCR产物和pFastBac(pFB)载体分别使用BamHI和HindIII(均购自日本TAKARA公司)进行双酶切，然后回收经酶切的PCR产物和载体，并进行连接。用连接产物转化DH5α感受态菌株，然后挑取克隆株进行PCR、酶切和测序鉴定，获得包含正确序列的阳性克隆，将其命名为pFB-rgE。
将pFB-rgE用于转化DH10Bac，并进行蓝白斑筛选。挑取白斑进行PCR鉴定，以获得重组的杆状病毒载体。提取重组杆状病毒载体，将其转染入sf21细胞株，待出现明显病变后收集培养上清，即获得有活性的重组杆状病毒。
表2.用于扩增gE胞外区段基因的引物
2.重组蛋白rgE的表达
Sf21细胞是一种半贴壁细胞。在小量表达和生产病毒时使用病毒来感染贴壁状态的细胞，使用WesternBlotting来验证重组蛋白rgE在培养上清中的表达。在需要大量表达时，将贴壁细胞驯化成悬浮培养，感染病毒时细胞密度为2*106个/mL，以MOI＝3-5的感染系数加入病毒，在感染后3天收获培养上清即可获得重组蛋白rgE。
3.重组蛋白rgE的纯化
在病毒感染后3天将细胞沉淀离心获得含重组蛋白rgE的上清，将其透析至PBS中后使用镍柱进行纯化并透析至PBS中即可获得纯化后的重组蛋白rgE。
实施例2：抗VZVgE蛋白单克隆抗体的制备
小鼠免疫
1、免疫原的准备：参照实施例1的重组蛋白的制备方法获得重组蛋白rgE(rgE)抗原。用经过纯化的rgE蛋白对6周龄BALB/c雌鼠进行免疫，免疫5只雌鼠(编号为：鼠1到鼠5)，免疫剂量为100μg/只。初次免疫所用的抗原与弗氏完全佐剂(购自Sigma)混合。初次免疫以后，每隔两周加强免疫一次，加强免疫所用的抗原与弗氏不完全佐剂(购自Sigma)混合，共加强免疫三次。在第三次加强免疫后的第11天，采血。融合前72h进行最后一次加强免疫，此次加强免疫不使用佐剂。
2、小鼠的基础免疫：使用上述重组rgE抗原对6-8周龄BALB/c雌鼠进行多点注射，包括背部皮下注射、腹股沟皮下注射、足垫注射、四肢肌肉注射等，注射剂量为500μL/只/次。每隔2周加强免疫一次，每次免疫前采集200μL眼框静脉血或20μL尾静脉血以备滴度测定。当小鼠血清滴度达到平台期后，停止免疫，休息两个月后进行融合。
3、单抗融合前72h的加强免疫对激发抗体应答十分重要，需在融合前72h对小鼠进行加强免疫。直接用100μL0.5mg/mL的重组蛋白对小鼠进行尾静脉注射或脾脏免疫。脾脏免疫前，需先用乙醚麻醉小鼠，剖开腹腔外皮取出脾脏，沿脾脏纵向注射100μL抗原，迅速手术缝合腹皮切口
融合杂交瘤的制备和筛选
1、小鼠巨噬细胞的制备：(1)将一只6周龄左右的BALB/c小鼠处死，自来水冲洗后，浸泡于75％乙醇溶液中5min。将小鼠放入超净工作台，腹部朝上。用镊子提起小鼠腹部皮肤，剪一小口，并用大镊子向上下方向撕拉开皮肤，充分暴露腹部。(2)用无菌镊子提起腹膜，换一把剪刀将腹膜中央处剪一小口，用1mL吸管通过小口向腹腔内注入适量培养液，用吸管小心在腹腔内搅动，最后吸出培养液于离心管中。(3)将腹腔细胞液溶解于HAT培养液或HT培养液中，使终浓度为2×105/mL。(4)将细胞加入96孔细胞培养板，置培养箱培养，也可直接与融合细胞混合后添加到96孔细胞培养板中。
2、小鼠胸腺细胞的制备：(1)将一只13天龄左右的BALB/c小鼠引颈处死，自来水冲洗，浸泡于75％乙醇溶液中5min。将小鼠放入超净工作台，腹部朝上。(2)用镊子提起小鼠腹部皮肤，将腹部和胸部的外皮剪开。(3)用另一把干净的剪刀剪开胸腔，用镊子取出乳白色的胸腺。将胸腺研磨后通过200目细胞筛，得到胸腺饲养细胞液。
3、小鼠骨髓瘤细胞的制备：(1)小鼠骨髓瘤细胞株Sp2/0-Ag14(Sp2/0)易培养，融合率高，是目前最理想的融合细胞，但要注意该细胞在过度稀释(密度低于3×105/mL)和pH碱性(pH>7.3)条件时会生长不良。(2)用20％FBSRPMI-1640培养液培养骨髓瘤细胞。当细胞数在104-106/mL时，细胞呈对数生长，此时细胞浑圆透亮、大小均一、边缘清晰、排列整齐、呈半致密分布。一般在细胞处于对数生长中期时(约1×105-5×105/mL)，可按1:5–1:10的比例进行稀释传代。选处于生长旺盛、形态良好的对数生长期细胞供融合用。融合骨髓瘤细胞的活细胞数应达95％以上。(3)融合前将骨髓瘤细胞从培养瓶移入离心管，用RPMI-1640培养液洗3次(1000rpm，5min)。用RPMI-1640培养液重悬细胞，计数。(4)一般从融合前5天开始复苏小鼠骨髓瘤细胞，每次融合约需6瓶35cm2Sp2/0细胞。
4、免疫脾细胞的制备：(1)取待融合的BALB/c小鼠，摘除眼球放血致其死亡，收集血液制成抗血清，可作为抗体检测的阳性对照。自来水冲洗小鼠并浸泡于75％乙醇溶液中5min，随即放入超净台内解剖板上，右侧卧位。(2)打开腹腔取出脾脏，用剪刀将其剪成小块放于200目细胞筛网上，再用研磨棒(注射器内芯)挤压研磨。用吹管滴加RPMI-1640培养液。(3)补加适量的RPM-1640培养液，静置3-5min，取上2/3部分悬液移入50mL塑料离心管中。上述过程反复2-3次。(4)用RPMI-1640培养液洗细胞3次(1000rpm离心10min)。(5)用RPMI-1640培养液重悬细胞并计数。
5、使用PEG促融剂融合制备杂交瘤：(1)融合前先将1mL的PEG-1500、10mL的RPMI-1640无血清培养基和200mL完全培养基平衡至37℃。(2)将制备的骨髓瘤细胞与脾细胞混合于50mL离心管内(1×108脾细胞和1×107骨髓瘤细胞，约10:1)，1500rpm离心8min，轻轻弹击管底，使细胞疏松成糊状。(3)吸取0.8mLPEG加入离心管内，在60s内加完，边加边轻轻搅拌。随即加入10mL预温至37℃的RPM-1640完全培养液，温和搅拌。最后补加RPMI-1640培养液至40mL，1000rpm离心5min。(4)弃上清，取少量HT培养液将细胞吹散，之后将准备好的HT培养液加入。将细胞加入96孔细胞培养板，每孔100μL，放入CO2培养箱中培养。(5)12h后，配置HAT完全培养基，每个孔中滴加100μL。5天后，用HT完全培养基给孔中的细胞上清进行50-100％的换液。9-14天后，吸取上清进行检测。
6、杂交瘤的筛选：使用间接ELISA筛选，包被重组蛋白rgE抗原100ng/孔，加入细胞上清50μL检测，并挑选出阳性克隆孔。
7、杂交瘤细胞的克隆化：在筛选出的含阳性上清的培养孔中通常是二个以上的杂交瘤集落。其中有的集落可能不分泌抗体或分泌非实验所要的抗体，只有其中某一个集落才是分泌特异抗体的杂交瘤细胞。因此，须利用克隆培养方法把它们分开，选出所需的杂交瘤细胞。最常用的克隆培养方法是有限稀释法。先把细胞按一定浓度进行梯度稀释，然后接种到96孔细胞培养板中，尽可能使孔内只有一个细胞生长。一般杂交瘤单克隆阳性细胞株需要重复克隆2-3次，直到100％阳性后才算是稳定克隆株。
单抗腹水的诱导
1、取BALB/c小鼠2-3只，腹腔注入0.5mL液体石蜡油。
2、1周后，处理对数生长期的杂交瘤细胞，1000rpm离心5min，弃上清液。用无血清培养液悬浮杂交瘤细胞，并将细胞数调至(1-2)×106/mL，每只小鼠腹腔注射0.5mL。
3、7-10天，小鼠腹部明显膨大后，引颈处死小鼠。将小鼠用自来水冲洗，浸泡于75％乙醇中5min。使小鼠腹部朝上，用注射针头将小鼠四肢固定于解剖台板。用镊子提起小鼠腹部皮肤，剪一小口，然后从两边向小鼠背部方向剪开，用大镊子撕开皮肤，充分暴露腹部。用无菌眼科镊子提起腹膜，在腹膜中央处剪一小口，然后用1mL吸管通过小口吸出腹腔内全部腹水。将所有腹水混合放入离心管中，3000rpm离心20min，之后收集上清。
单抗腹水的纯化
将腹水用辛酸-饱和硫酸铵沉淀和ProteinA亲和层析纯化(购自美国GE公司)，获得纯化的单克隆抗体。其中一株杂交瘤细胞株及其产生的单克隆抗体命名为4A2，经鉴定为IgG1型(表3)。
表3.单抗信息
使用抗VZVgE单克隆抗体4A2检测重组rgE抗原的Westernblot测定的结果
配置两块12％浓度的聚丙烯酰胺凝胶，将纯化后的重组rgE抗原进行SDS-PAGE电泳，其中一块使用考马斯亮蓝进行染色30分钟后使用0.25mol/LKCl溶液进行脱色。另外一块使用电转移技术将蛋白从聚丙烯酰胺凝胶转移至硝酸纤维素膜上，35mA恒流转移30min。将膜用水稍做漂洗，按每平方厘米膜0.1ml加入封闭液，密封于洁净的塑料小袋中，室温缓摇温育1h。按每平方厘米膜0.1ml加入用封闭液稀释至2μg/ml的4A2单克隆抗体，密封于洁净的塑料小袋中，室温缓摇温育1h，取出膜用TNT漂洗3次，每次5min。按每平方厘米膜0.1ml加入用封闭液稀释的酶标二抗(GAM-HRP)，密封于干净的塑料小袋中，室温缓摇温育1h，取出膜用TNT漂洗3次，每次5min。按每平方厘米膜0.01ml加入预先混合均匀的底物溶液(SuperSignalELISAPicoChemiluminescentSubstrate，Thermo)，使用仪器(ImageQuantLAS4000mini，GE)收集发光信号。检测结果如图1所示。结果显示，抗VZVgE单克隆抗体4A2可与重组rgE抗原产生特异性反应，可用于检测重组rgE抗原。
实施例3：抗VZVgE中和性单克隆抗体的鉴定
利用基于ELISPOT的VZV病毒高通量中和实验方法(Chen,L.等,2014.JVirolMethods200C:10-14.)，对制备的抗VZVgE单克隆抗体4A2的中和活性进行鉴定，中和活性鉴定的方法步骤如下：
(1)将培养在含10％FBS(PAA)的DMEM/F12(GIBCO)培养基中的ARPE-19细胞以1.2×105/mL的密度铺于24孔细胞培养板(NUNC)中，2.4×105/孔；
(2)10小时后用病毒保护液(9％蔗糖，25mM组氨酸，150mMNaCl；pH7.4)对单克隆抗体样品(原液1mg/mL)首先进行4倍比稀释，然后进行2倍比稀释，共稀释10个梯度。
(3)各取100μL稀释后的单克隆抗体样品，与50μl稀释于病毒保护液的VZV(Oka)病毒(2000pfu/mL)混合，加入1/10体积的新鲜豚鼠补体，补加病毒保护液至0.5mL，37℃混合孵育1小时；
(4)吸去预铺有ARPE-19细胞的24孔细胞培养液，加入孵育后的病毒、单抗和补体混合液，37度孵育1小时；孵育后换成新鲜培养基置于37度培养箱进行培养。
(5)培养2-3天后进行酶联免疫斑点反应：吸去各孔中的培养基，每孔中加入0.3mL固定液(含有0.2％戊二醛的PBS溶液)，室温避光静置5分钟；5分钟后吸去固定液，每孔中加入0.3mL1％TritonX-100溶液通透细胞，室温静置0.5小时；0.5小时后吸去通透液，每孔中加入PBS溶液洗细胞一次，再将PBS溶液吸弃；在每个孔中加入0.3mL酶标试剂，放置于37℃中反应1h，其中VZV病毒单抗标记物为18A10-HRP(2mg/mL)，用酶稀稀释200倍使用；1h后吸去反应液，每孔中加入PBST溶液洗细胞三次，再将PBST溶液吸弃；在每个孔中加入0.3mLTMB显色液(SIGMA)，放置在室温进行反应至出现清晰斑点，同时背景干净；启动斑点检测仪器Elispot，将进行显色反应后的细胞培养板放在取样板上，检测每个孔中的蓝色细胞数即被感染细胞数。Elispot的详细操作步骤见该仪器(美国CTL公司)的操作说明书；
(6)实验对照设置为未进行感染实验的ARPE-19细胞(称为阴性孔，设置3孔重复)和只进行VZV病毒感染的ARPE-19细胞(称为阳性孔，设置3孔重复)；
(7)中和效价的判定方法：抗体中和效价的定义为：以达到50％感染抑制率以上的最大稀释倍数作为该单克隆抗体样品的中和效价；
(8)感染抑制率的计算方法：各样品的感染抑制率＝(1-样品孔被感染细胞数/(阳性孔显色细胞数总和/3-阴性孔显色细胞数总和/3))×100％，其中，样品孔被感染细胞数＝样品孔平均显色细胞数-阴性孔显色细胞数总和/3。)。
单抗4A2的中和实验结果如图2所示。结果显示，当单抗稀释度为1:2560时，蓝色斑点数仍然小于阳性对照斑点数的50％。由此可见，单克隆抗体4A2能够起到中和病毒的作用，且中和效价为1:2560。
实施例4：抗VZVgE中和性单抗4A2与VZV病毒的结合活性
用抗VZVgE中和性单克隆抗体4A2对Oka病毒株感染的和未感染的ARPE-19细胞进行免疫荧光检测，免疫荧光方法步骤如下：
将培养在含10％FBS(PAA)的DMEM/F12(GIBCO)培养基中的ARPE-19细胞以4.8×105个/mL的密度铺于24孔细胞培养板(NUNC)中，2.4×105/孔；12h后，每孔感染100PFU的VZV病毒；72h后吸去培养基，用固定液(含有4％多聚甲醛的PBS溶液)固定，室温避光静置30min；30min后吸去固定液，加入1％TritonX-100溶液通透细胞，室温静置10min；10min后吸去通透液，加入PBS溶液洗细胞三次，再将PBS溶液吸弃；加入封闭液(含有4％胎牛血清的PBS溶液)封闭，置于37℃中反应1h；1h后吸去封闭液，加入以1:200稀释的4A2单抗(初始浓度为1mg/mL)，放置于37℃中反应1h；1h后吸去抗体溶液，加入PBS溶液洗细胞三次，再将PBS溶液吸弃；加入FITC偶联的羊抗鼠抗体，以1:500稀释，放置于37℃中反应0.5h；0.5h后吸去抗体，加入PBS溶液洗细胞三次，再将PBS溶液吸弃；加入DAPI，以1:2000稀释，室温避光静置5min；5min后吸去DAPI，加入PBS溶液洗细胞三次，再将PBS溶液吸弃；封片后在荧光显微镜下进行结果观察。
实验结果示于图3中。结果显示，单克隆抗体4A2能够结合VZVOka毒株感染的ARPE-19细胞，显示出绿色荧光；而未感染VZV病毒的ARPE-19细胞作为阴性对照则没有任何反应。这些结果说明，抗VZVgE中和性单克隆抗体4A2能够特异性结合VZV病毒，并因此能够特异性识别VZV病毒感染的细胞。
实施例5：抗VZVgE中和性单克隆抗体4A2用于检测VZV病毒的 感染和滴度
在稀释度足够的情况下，在VZV病毒感染细胞后，通过酶联免疫斑点法可以使被感染的细胞带有能够被Elispot检测的信号。带有信号的阳性细胞数即被感染细胞数可以被认为是在该次感染实验中使用了多少感染单位的VZV病毒。我们以梯度稀释斑点计数方法检测VZV病毒的滴度。在本实施例中，我们选择抗VZVgE中和性单克隆抗体4A2作为检测抗体来建立基于ELISPOT的病毒滴度检测方法。
1.单抗的HRP标记
操作均在避光条件下进行：
(1)称取xmgHRP干粉溶于x/20mLddH2O中。
(2)称取ymg(y>x)NaIO4，溶于y/20mL的ddH2O中。取x/20mL的NaIO4溶液与x/20mL的HRP缓慢混合，4℃下静置30min。
(3)加入xμL乙二醇，室温避光静置30min。
(4)加入等量体积即(x/20+x/20+0.05)mLCB(pH9.6，50mM)，使溶液的pH值在碱性条件下。
(5)将离心管中的反应液移至含抗体的透析袋中，4℃CB透析4h，换液1次。
(6)x/5mgNaBH4溶于10xμL的ddH2O中并加进透析袋，4℃静置2h，每30min摇动1次。
(7)用50％的SAS离心，取沉淀(注意将SAS倒扣干净,以免残留的SAS影响抗体)。加入500μL的缓冲液(50％甘油和10％NBS)，-20℃保存。
2.ELISPOT法测病毒滴度具体步骤如下：
将ARPE-19细胞铺于24孔细胞培养板中，2.4×105个/孔，培养基为DMEM/F12培养基。37℃培养72小时。取病毒培养原液一份，用病毒保护液10倍连续稀释4个梯度，最终使每1mL保护液中分别含有100μL、10μL、1μL、0.1μL4个浓度梯度的病毒稀释液。将各梯度的病毒稀释液取1mL加入预铺于24孔细胞培养板中的ARPE-19细胞中，每个梯度采取3孔重复。将24孔板放入37℃孵育1小时，1小时后换成新鲜培养基，置于37度培养72小时后，酶联免疫斑点法检测：
(1)吸去各孔中的培养基，每孔中加入0.3mL固定液(含有0.2％戊二醛的PBS溶液)，室温避光静置5分钟。
(2)5分钟后吸去固定液，每孔中加入0.3mL1％TritonX-100溶液通透细胞，室温静置0.5小时。
(3)0.5小时后吸去通透液，每孔中加入PBS溶液洗细胞一次，再将PBS溶液吸弃。
(4)在每个孔中加入0.3mL稀释后的4A2-HRP(1:1000)，置于37℃中反应1h。
(5)每孔中加入PBST溶液洗细胞3次，再将PBST溶液吸弃。在每个孔中加入0.3mLTMB显色液，放置在室温显色至斑点清晰，背景干净。弃板中显色液终止显色。
(6)启动斑点检测仪器ELISPOT(型号：Series3B)，将进行显色反应后的细胞培养板放在仪器的取样板上，用仪器检测每个孔中的蓝色细胞数即被感染细胞数。ELISPOT的详细操作步骤见该仪器的操作说明书。
(7)实验对照为未进行感染实验的ARPE-19细胞。
VZV病毒滴度计算方法：病毒滴度(PFU/mL)＝检测孔被感染细胞数/检测孔病毒原液用量(mL)。其中，检测孔被感染细胞数＝检测孔平均显色细胞数-阴性孔平均显色细胞数。上述公式中“检测孔被感染细胞数”和“检测孔病毒原液用量”选择被感染细胞数最接近于50且不低于50的检测孔的被感染细胞数与其对应的VZV病毒原液的用量。
本实施选择v-Oka(VZV)病毒进行效价检测，结果如图4所示，其中，上排3孔(A1-A3)为将10μL病毒稀释于1mL保护液后感染细胞的结果，这3孔的斑点数计数分别为55、49和54；下排3孔为未加病毒的阴性对照孔结果，这3孔的斑点数计数皆为0。根据上述公式，即可计算并且确定，该病毒的滴度为5266(PFU/mL)。本实施例的结果表明，抗VZVgE中和性单克隆抗体4A2可用于检测VZV病毒的滴度。
实施例6：抗VZVgE中和性单克隆抗体4A2用于检测VZV病毒中 和抗体的效价
本实施例中我们将4A2用于酶联免疫斑点法，检测VZV病毒中和抗体效价。该方法具有高效、准确的优点，同时更有利于提高工作效率，更适合于高通量VZV病毒中和实验的检测。具体方法描述如下：
(1)将ARPE-19细胞铺于24孔细胞培养板中(2.4×105/孔)。
(2)10小时后将待检测的样品(单克隆抗体样品、血清样品、腹水样品、细胞培养上清液样品、细胞裂解液样品等)用病毒保护液进行梯度稀释。
(3)各取100μL稀释后待检测样品与50μL稀释于病毒保护液的VZV(Oka)病毒(2000pfu/mL)混合(加或不加入1/10终体积的新鲜豚鼠补体)，补加病毒保护液至1mL，37℃混合孵育1小时；
(4)吸去预铺有ARPE-19细胞的24孔细胞培养液，加入孵育后的病毒和单抗(含或不含补体)混合液，37℃孵育1小时；
(5)孵育后换成新鲜培养基置于37℃培养箱进行培养，培养72小时后进行酶联免疫斑点反应。
(6)吸去各孔中的培养基，每孔加入0.3mL固定液(含有0.2％戊二醛的PBS溶液)，室温避光静置5分钟。
(7)吸去固定液，每孔中加入0.3mL1％TritonX-100溶液通透细胞，室温静置0.5小时。
(8)吸去通透液，每孔中加入PBS溶液洗细胞一次，再将PBS溶液吸弃。
(9)在每个孔中加入0.3mL稀释后的4A2-HRP(1:1000)，置于37℃中反应1h。
(10)吸去反应液，每孔中加入PBST溶液洗细胞三次，再将PBST溶液吸弃。在每个孔中加入0.3mLTMB显色液，放置在室温中显色直至斑点清晰，背景干净。
(11)吸弃板中的显色液，终止显色。
(12)启动斑点检测仪器ELISPOT，检测每个孔中的蓝色细胞数即被感染细胞数。详细操作步骤见ELISPOT仪器的操作说明书。
(13)未进行感染实验的ARPE-19细胞作为阴性孔，只进行VZV病毒感染的ARPE-19细胞为阳性孔，每组各设置3个孔。
(14)以达到50％感染抑制率以上的最大稀释倍数作为该样品的中和效价。
(15)各样品的感染抑制率＝(1-样品孔被感染细胞数/(阳性孔显色细胞数总和/3-阴性孔显色细胞数总和/3))×100％。样品孔被感染细胞数＝样品孔平均显色细胞数-阴性孔显色细胞数总和/3。
在本实施例的实验中，随机选取了6份厦门市疾病预防控制中心(CDC)收集的水痘疫苗免疫完成者的血清，然后分别进行血清中的VZV病毒中和抗体的检测。各血清样品中的中和抗体滴度的检测结果示于表4中。结果显示，疫苗免疫完成者的血清能够中和VZV。
表4：水痘疫苗免疫完成者的背景资料及其血清中的中和抗体滴度的检测结果
实施例7：抗VZVgE中和性单克隆抗体用于检测VZV病毒感染的 动物组织
将实施例2中获得的抗VZVgE中和性单克隆抗体4A2用于VZV病毒感染的皮肤的免疫组织化学检测，本实施例选择对VZVOka株感染的皮肤样品进行检测，方法步骤如下：
将新鲜皮肤异体移植到NOD/SCID小鼠肾囊膜下(Moffat,J.F.等,1998.ProcNatlAcadSciUSA95(20):11969-11974)。待皮肤正常生长后使用VZVOka株对人皮肤进行感染，感染后3周处死小鼠，分离皮肤将其浸泡于福尔马林溶液中室温静置72小时。将固定后的组织进行脱水，包埋于蜡块后进行切片(4μm厚)。检测用免疫组织化学超敏试剂盒及生物素-链霉素DAB染色试剂均购自福州迈新生物科技有限公司，免疫组织化学检测步骤按照试剂盒说明书进行。检测用一抗为抗VZVgE中和性单克隆抗体4A2，检测用浓度为1mg/mL，稀释度为1：1000。
结果如图5所示。结果显示，在感染VZV病毒的皮肤组织中发现了阳性染色信号，而未感染VZV病毒的皮肤组织检测结果为阴性。这些结果说明，针对VZVgE的中和性单抗4A2能特异性检测出被VZV病毒感染的皮肤组织，能够应用于VZV病毒感染的免疫组织化学检测。
实施例8：抗VZVgE中和性单抗4A2用于重组蛋白rgE的捕获
本实施例鉴定了抗VZVgE中和性单克隆抗体4A2对重组蛋白rgE的捕获能力，具体步骤如下：
1.取10ml本实施例1中分泌表达于培养上清的重组蛋白rgE样品，加入5μg4A2单克隆抗体，37℃孵育1小时。
2.加入50μL偶联proteinA的微球(GE产品)，室温旋转孵育2小时。
3.3000rpm离心1分钟，弃上清，用PBS清洗微球沉淀，再离心去除上清，如此反复共洗5次。
4.使用50μLPBS吹悬微球，加入10μL非还原型蛋白电泳样品处理液(6X)，100℃煮2分钟，离心吸取上清进行SDS-PAGE及Westernblot测定。
SDS-PAGE及Westernblot的测定结果示于图6。结果显示，中和性单克隆抗体4A2能够捕获重组蛋白rgE。
实施例9：抗VZVgE中和性单抗4A2用于天然gE蛋白的捕获
本实施例鉴定了抗VZVgE中和性单克隆抗体4A2对天然gE蛋白的捕获能力，具体步骤如下：
1.使用VZVOka感染ARPE-19细胞(10cm2板)；感染后3天使用1mL细胞裂解液(20mMTris(pH7.5)，150mMNaCl，1％TritonX-100以及蛋白酶抑制剂)裂解ARPE-19细胞；用同样方式处理一板未感染的ARPE-19细胞。
2.使用13000rpm离心10分钟使样品完全澄清，加入5μg4A2单克隆抗体，4℃旋转孵育过夜。
3.往裂解液中加入50μLproteinA/G琼脂微球，4℃孵育1-4小时。
4.将免疫沉淀后的溶液于4℃3000rpm离心1分钟，弃上清，加入1mLPBS洗涤琼脂微球，于冷冻离心机4℃3000rpm离心1分钟，反复洗涤5次。
5.最后一次洗涤完毕，弃上清，加入50μLPBS，再加入10μL还原型蛋白电泳样品处理液，混合震荡，于100℃煮沸10min，离心后进行SDS-PAGE及WesternBlot测定。
SDS-PAGE及Westernblot的测定结果示于图7。结果显示，中和性单克隆抗体4A2能够捕获天然gE抗原。
实施例10：抗VZVgE中和性单克隆抗体的轻链及重链可变区的 序列测定
半贴壁培养107个4A2鼠源杂交瘤细胞，吹管吹起贴壁细胞使之悬浮，转移到新的4mL离心管中，1500rpm离心3min，收集沉淀的细胞，重悬于100μL无菌PBS(pH7.45)中，转移到一新的1.5ml离心管中，加入800μLTrizol(Roche，Germany)，轻轻颠倒混匀，静置10min。加入200μL氯仿，剧烈振荡15s，静置10min，4℃12000rpm离心15min，转移上层液体至一新的1.5mL离心管中，加入等体积的异丙醇，混匀，静置10min。4℃12000rpm离心5min，弃上清，沉淀于60℃真空抽干5min。透明的沉淀溶于70μLDEPCH2O中，加入1μL反转录引物Oligo(dT)(12-18)(Promega)，1μLdNTP(上海生工)，置于72℃水浴10min，立即放到冰浴中置5min，加入20μL5X反转录缓冲液，2μLAMV(10U/μL,Promega)，1μLRnasin(40U/μL,Promega)，混匀后于42℃将RNA反转录成cDNA。
轻链基因的分离使用上述cDNA为模板，以MVkF-F4(SEQIDNO：19)为上游引物，以MVkR-M13(SEQIDNO：20)为下游引物，进行PCR扩增，获得一条大小约500bp的DNA片段，PCR条件为：95℃3min，23个循环的(95℃15s，56℃30s，72℃30s)，72℃5min。回收后进行测序。序列经blast比对后确定为4A2的轻链序列，其中可变区的编码基因如SEQIDNO：23所示，其编码的氨基酸序列如SEQIDNO：24所示。
重链基因的分离使用上述cDNA为模板，以MVhF-E3(SEQIDNO：21)为上游引物，以MVhR-M13(SEQIDNO：22)为下游引物，进行PCR扩增，获得一条大小约为500bp的DNA片段，PCR条件为：95℃3min，23个循环的(95℃15s，56℃30s，72℃30s)，72℃5min。回收后进行测序。序列经blast比对后确定为4A2的重链序列，其中可变区的编码基因如SEQIDNO：25所示，其编码的氨基酸序列如SEQIDNO：26所示。
表5.单抗测序使用的引物及单抗4A2的轻链及重链的可变区序列
另外，还使用Kabat编号系统确定了单抗4A2的轻链及重链的CDR序列，示于表6中。
表6.单抗4A2的轻链及重链的CDR序列
名称 序列 SEQ ID NO：
重链CDR1 GFTFSSYA 115
重链CDR2 ISSGGSYT 116
重链CDR3 ARHEAKNAWFAY 117
轻链CDR1 QTLAYSDGNTY 118
轻链CDR2 KVS 119
轻链CDR3 SQSTHVLT 120
实施例11：抗VZVgE中和性单克隆抗体表位肽的鉴定
为了考察抗VZVgE中和性单克隆抗体4A2表位的定位，本发明人根据VZVgE蛋白胞外区段(1-538aa)的氨基酸序列(SEQIDNO:121)，合成步移肽进行鉴定。合成肽的长度为15个氨基酸，相邻的两个肽段重叠5个氨基酸，共合成54个肽段(由上海生工生物工程股份有限公司进行合成)，合成肽的序列如表7所示。
SEQIDNO:121：gE蛋白胞外区段(1-538aa)的示例性氨基酸序列
MGTVNKPVVGVLMGFGIITGTLRITNPVRASVLRYDDFHIDEDKLDTNSVYEPYYHSDHAESSWVNRGESSRKAYDHNSPYIWPRNDYDGFLENAHEHHGVYNQGRGIDSGERLMQPTQMSAQEDLGDDTGIHVIPTLNGDDRHKIVNVDQRQYGDVFKGDLNPKPQGQRLIEVSVEENHPFTLRAPIQRIYGVRYTETWSFLPSLTCTGDAAPAIQHICLKHTTCFQDVVVDVDCAENTKEDQLAEISYRFQGKKEADQPWIVVNTSTLFDELELDPPEIEPGVLKVLRTEKQYLGVYIWNMRGSDGTSTYATFLVTWKGDEKTRNPTPAVTPQPRGAEFHMWNYHSHVFSVGDTFSLAMHLQYKIHEAPFDLLLEWLYVPIDPTCQPMRLYSTCLYHPNAPQCLSHMNSGCTFTSPHLAQRVASTVYQNCEHADNYTAYCLGISHMEPSFGLILHDGGTTLKFVDTPESLSGLYVFVVYFNGHVEAVAYTVVSTVDHFVNAIEERGFPPTAGQPPATTKPKEITPVNPGTSPLLRY
表7.合成肽的序列
将上述54条合成肽分别以1μg/孔的浓度包被96孔板，4℃包被过夜。洗板1次，用封闭液(20mMPB7.4，含150mMNaCl，0.5％酪蛋白，0.002％明胶)封闭非特异性结合位点。37℃封闭2h后抽干。按首孔5μg/100μL/孔(其后以2倍连续倍比稀释4个稀释度)加入用封闭液稀释好的4A2单抗，37℃孵育1h。PBST洗板5次后加入用封闭液稀释好的GAM-HRP(1:5000)，37℃孵育30min后加入显色液显色15min，终止液终止，酶标仪读值。
实验结果示于图8。结果显示，在所有肽段中，仅VZV-gE-13能识别中和单抗4A2。这一结果说明，4A2单抗所识别的表位存在于gE蛋白的aa121-135区段，该区段序列如下：SAQEDLGDDTGIHVI(SEQIDNO：1)。
进一步，还将该区段与公共数据库中的序列进行比对。序列比对的结果(表8)显示，该区段在100个VZV病毒临床分离株序列中具有高度保守性(100％)。这一结果表明，本发明人所鉴定到的表位肽在各种VZV病毒株中是高度保守的，可用于诱发机体产生抗各种VZV病毒株的广谱中和性抗体，从而可用作预防和治疗VZV病毒感染的有效疫苗。与此同时，这一结果还表明，本发明的4A2单抗所识别的表位是高度保守的，从而其是抗各种VZV病毒株的广谱中和性抗体，可用于预防和治疗VZV病毒的感染和与VZV病毒感染相关的疾病。
表8.表位肽(SEQIDNO：1)的序列保守性分析
序号 Genbank No. 同源性 序号 Genbank No. 同源性
1 KJ767491.1 100％ 51 JN704703.1 100％
2 KJ767492.1 100％ 52 JN704702.1 100％
3 KJ808816.1 100％ 53 JN704701.1 100％
4 KF853235.1 100％ 54 JN704700.1 100％
5 KF853234.1 100％ 55 JN704699.1 100％
6 KF853233.1 100％ 56 JN704698.1 100％
7 KF853232.1 100％ 57 JN704697.1 100％
8 KF853231.1 100％ 58 JN704696.1 100％
9 KF853230.1 100％ 59 JN704695.1 100％
10 KF853229.1 100％ 60 JN704694.1 100％
11 KF853228.1 100％ 61 JN704693.1 100％
12 KF853227.1 100％ 62 JN704692.1 100％
13 KF853226.1 100％ 63 JN704691.1 100％
14 KF853225.1 100％ 64 JN704690.1 100％
15 KF811485.1 100％ 65 DQ457052.1 100％
16 KF558391.1 100％ 66 EU154348.1 100％
17 KF558390.1 100％ 67 DQ674250.1 100％
18 KF558389.1 100％ 68 DQ452050.1 100％
19 KF558388.1 100％ 69 DQ479963.1 100％
20 KF558387.1 100％ 70 DQ479962.1 100％
21 KF558386.1 100％ 71 DQ479961.1 100％
22 KF558385.1 100％ 72 DQ479960.1 100％
23 KF558384.1 100％ 73 DQ479959.1 100％
24 KF558383.1 100％ 74 DQ479958.1 100％
25 KF558382.1 100％ 75 DQ479957.1 100％
26 KF558381.1 100％ 76 DQ479956.1 100％
27 KF558380.1 100％ 77 DQ479955.1 100％
28 KF558379.1 100％ 78 DQ479954.1 100％
29 KF558378.1 100％ 79 DQ479953.1 100％
30 KF558377.1 100％ 80 AY548171.1 100％
31 KF558376.1 100％ 81 AY548170.1 100％
32 KF558375.1 100％ 82 DQ008354.1 100％
33 KF558374.1 100％ 83 DQ008355.1 100％
34 KF558373.1 100％ 84 AY253710.1 100％
35 KF558372.1 100％ 85 AY253715.1 100％
36 KF558371.1 100％ 86 AF322640.1 100％
37 KF056799.1 100％ 87 AY253674.1 100％
38 KC847290.1 100％ 88 AY253680.1 100％
39 KC112914.1 100％ 89 AY253686.1 100％
40 JF306641.2 100％ 90 AY253692.1 100％
41 JQ972914.1 100％ 91 AY253698.1 100％
42 JQ972913.1 100％ 92 AY016467.1 100％
43 JN704710.1 100％ 93 AY016456.1 100％
44 JN704709.1 100％ 94 AY016450.1 100％
45 JQ911599.1 100％ 95 AF314221.1 100％
46 JN704708.1 100％ 96 AF325441.1 100％
47 JN704707.1 100％ 97 AY013752.1 100％
48 JN704706.1 100％ 98 AJ871403.1 100％
49 JN704705.1 100％ 99 AB097933.1 100％
50 JN704704.1 100％ 100 AB097932.1 100％
实施例12：中和表位肽与HBcAg蛋白的融合表达、活性鉴定及多 抗血清的制备
1.pTO-T7-C149表达载体的构建
本领域人员知悉，HBcAg有着很强的T细胞免疫原性，外源多肽在HBcAg内部MIR(mayorimmunodominantregion，78-83aa)的融合不会改变其颗粒的多聚特性、抗原活性和免疫原性，且可使外源表位暴露于颗粒表面(Fu,T.M.等,2009.Vaccine27(9):1440-1447；Jin,H.等,2007.ViralImmunol20(3):429-440；和Yin,Y.等,2010.ShengWuGongChengXueBao26(4):431-438)。HBcAg的示例性氨基酸序列如SEQIDNO:122所示。
SEQIDNO:122：HBcAg的示例性氨基酸序列(下划线标示的为HBcAg的第79-80位氨基酸残基，PA)
MDIDPYKEFGASVELLSFLPSDFFPSIRDLLDTASALYREALESPEHCSPHHTALRQAILCWGELMNLATWVGSNLEDPASRELVVSYVNVNMGKIRQLLWFHISCLTFGRETVLEYLVSFGVWIRTPPAYRPQNAPILSTLPETTVVRRRGRSPRRRTPSPRRQRSQSPRRRRSQSRESQC
HBcAg的aa1-149在大肠杆菌中能以类病毒颗粒形式表达，其示例性氨基酸序列可参见GenBankNo.AF233235，且示于SEQIDNO：80中。其示例性核苷酸序列示于SEQIDNO：81中。
SEQIDNO：80：HBcAg的aa1-149的示例性氨基酸序列(下划线标示的为，替换HBcAg的第79-80位氨基酸残基PA的接头序列)
MDIDPYKEFGASVELLSFLPSDFFPSIRDLLDTASALYREALESPEHCSPHHTALRQAILCWGELMNLATWVGSNLEDGGGGSG GGGTGSFEFGGGGSGGGGSRELVVSYVNVNMGLKIRQLLWFHISCLTLGRETVLEYLVSFGVWIRTPPAYRPQNAPILSTLPETTVV
SEQIDNO：81：HBcAg的aa1-149的示例性核苷酸序列
ATGGACATTGACCCATATAAAGAATTTGGAGCTTCTGTGGAGTTACTCTCTTTTTTGCCTTCCGACTTCTTTCCTTCTATTCGAGATCTCCTCGACACCGCCTCTGCTCTGTATCGGGAGGCCTTAGAGTCTCCGGAACATTGTTCACCTCACCATACGGCACTCAGGCAAGCTATTCTGTGTTGGGGTGAGTTGATGAATCTAGCCACCTGGGTGGGAAGTAATTTGGAAGATGGTGGAGGTGGTTCTGGAGGTGGTGGTACTGGATCCTTTGAATTCGGTGGTGGAGGTTCAGGAGGAGGTGGTTCCAGGGAACTAGTAGTCAGCTATGTCAACGTTAATATGGGCCTAAAAATCAGACAACTATTGTGGTTTCACATTTCCTGTCTTACTTTGGGGAGAGAAACTGTTCTTGAATATTTGGTGTCTTTTGGAGTGTGGATTCGCACTCCTCCTGCATATAGACCACAAAATGCCCCTATCTTATCAACACTTCCGGAAACTACTGTTGTTTAA
利用HBcAg的aa1-149在大肠杆菌中能以类病毒颗粒形式表达的性质，本发明人将其作为载体蛋白，插入大肠杆菌表达载体pTO-T7(此载体的制备步骤见参考文献罗文新，张军，杨海杰等.一种带增强子的原核高效表达载体的构建及初步应用[J].生物工程学报，2000，16(5):578-581)(也可以使用其它本领域常用的大肠杆菌表达载体)中，并以连接子(GGGGSGGGGTGSFEFGGGGSGGGG，SEQIDNO：82)替代HBcAg的B细胞优势表位区段的第79-80位氨基酸参见(其对应氨基酸为PA)，并在265nt－270nt处引入GGATCC，274nt－279nt处引入GAATTC(相对pTO-T7-C149)，以引入限制性内切酶识别位点BamHI和EcoRI，从而构建了突变型HBc表达质粒pTO-T7-C149。然后将外源蛋白插入在C149的第93个氨基酸处。
2.中和表位肽与HBcAg蛋白的融合表达
以VZVgE的核心区段121-135aa(SEQIDNO：1)为核心区段，分别从N端和C端递增氨基酸，设计了8条多肽(表9)，用以鉴定中和表位的活性序列。用于扩增该8条多肽的编码序列的引物示于表10中。
表9：VZV-gE-F1、F2、F3、F4、F5、F6、F7、F8融合蛋白在载体蛋白C149中插入的目的肽段的氨基酸序列
融合蛋白 包含的肽区段 肽区段的氨基酸序列 SEQ ID NO：
VZV-gE-F1 aa 121-135 SAQEDLGDDTGIHVI 1
VZV-gE-F2 aa 120-136 MSAQEDLGDDTGIHVIP 2
VZV-gE-F3 aa 119-137 QMSAQEDLGDDTGIHVIPT 3
VZV-gE-F4 aa 118-138 TQMSAQEDLGDDTGIHVIPTL 4
VZV-gE-F5 aa 117-139 PTQMSAQEDLGDDTGIHVIPTLN 5
VZV-gE-F6 aa 116-140 QPTQMSAQEDLGDDTGIHVIPTLNG 6
VZV-gE-F7 aa 114-140 LMQPTQMSAQEDLGDDTGIHVIPTLNG 7
VZV-gE-F8 aa 111-140 GERLMQPTQMSAQEDLGDDTGIHVIPTLNG 8
表10.用于扩增目的肽区段的编码序列的引物
使用上述用于合成gE区段(121-135aa、120-136aa、119-137aa、118-138aa、117-139aa、116-140aa、114-140aa、111-140aa)的上下游引物，通过退火获得具有BamHⅠ和EcoRⅠ粘性末端的片段，具体做法如下：各取1μL的上下游引物，同时加入48μL的结合缓冲液(100mMNaCland50mMHEPESpH7.4)，混合后于90℃中反应4min，然后置于70℃反应10min，缓慢地降到室温。同时以BamHI和EcoRI双酶切载体pTO-T7-C149，将酶切产物回收并与所获得的具有BamHⅠ和EcoRⅠ粘性末端的片段连接。用连接产物转化大肠杆菌ER2566，进行测序鉴定及表达鉴定(同时以pTO-T7-C149为阴性对照)。鉴定正确的质粒即含有所需的目的片段，其所编码的融合蛋白分别称为VZV-gE-F1、VZV-gE-F2、VZV-gE-F3、VZV-gE-F4、VZV-gE-F5、VZV-gE-F6、VZV-gE-F7和VZV-gE-F8。质粒构建流程如图9所示。
融合蛋白VZV-gE-F1、VZV-gE-F2、VZV-gE-F3、VZV-gE-F4、VZV-gE-F5、VZV-gE-F6、VZV-gE-F7或VZV-gE-F8的氨基酸序列分别示于SEQIDNO:99-106，对应的核苷酸序列分别示于SEQIDNO:107-114中。
SEQIDNO：99，融合蛋白VZV-gE-F1的氨基酸序列，其中，以双下划线标示插入的片段，以单下划线标示接头序列；且，插入的片段和接头序列二者共同替换了HBcAg的第79-80位氨基酸残基PA。
MDIDPYKEFGASVELLSFLPSDFFPSIRDLLDTASALYREALESPEHCSPHHTALRQAILCWGELMNLATWVGSNLEDGGGGSG GGGTGS EFGGGGSGGGGSRELVVSYVNVNMGLKIRQLLWFHISCLTLGRETVLEYLVSFGVWIRTPPAYRPQNAPILSTLPETTVV
SEQIDNO：100，融合蛋白VZV-gE-F2的氨基酸序列，其中以下划线标示插入的片段
MDIDPYKEFGASVELLSFLPSDFFPSIRDLLDTASALYREALESPEHCSPHHTALRQAILCWGELMNLATWVGSNLEDGGGGSGGGGTGSMSAQEDLGDDTGIHVIPEFGGGGSGGGGSRELVVSYVNVNMGLKIRQLLWFHISCLTLGRETVLEYLVSFGVWIRTPPAYRPQNAPILSTLPETTVV
SEQIDNO：101，融合蛋白VZV-gE-F3的氨基酸序列，其中以下划线标示插入的片段
MDIDPYKEFGASVELLSFLPSDFFPSIRDLLDTASALYREALESPEHCSPHHTALRQAILCWGELMNLATWVGSNLEDGGGGSGGGGTGSQMSAQEDLGDDTGIHVIPTEFGGGGSGGGGSRELVVSYVNVNMGLKIRQLLWFHISCLTLGRETVLEYLVSFGVWIRTPPAYRPQNAPILSTLPETTVV
SEQIDNO：102，融合蛋白VZV-gE-F4的氨基酸序列，其中以下划线标示插入的片段
MDIDPYKEFGASVELLSFLPSDFFPSIRDLLDTASALYREALESPEHCSPHHTALRQAILCWGELMNLATWVGSNLEDGGGGSGGGGTGSTQMSAQEDLGDDTGIHVIPTLEFGGGGSGGGGSRELVVSYVNVNMGLKIRQLLWFHISCLTLGRETVLEYLVSFGVWIRTPPAYRPQNAPILSTLPETTVV
SEQIDNO：103，融合蛋白VZV-gE-F5的氨基酸序列，其中以下划线标示插入的片段
MDIDPYKEFGASVELLSFLPSDFFPSIRDLLDTASALYREALESPEHCSPHHTALRQAILCWGELMNLATWVGSNLEDGGGGSGGGGTGSPTQMSAQEDLGDDTGIHVIPTLNEFGGGGSGGGGSRELVVSYVNVNMGLKIRQLLWFHISCLTLGRETVLEYLVSFGVWIRTPPAYRPQNAPILSTLPETTVV
SEQIDNO：104，融合蛋白VZV-gE-F6的氨基酸序列，其中以下划线标示插入的片段
MDIDPYKEFGASVELLSFLPSDFFPSIRDLLDTASALYREALESPEHCSPHHTALRQAILCWGELMNLATWVGSNLEDGGGGSGGGGTGSQPTQMSAQEDLGDDTGIHVIPTLNGEFGGGGSGGGGSRELVVSYVNVNMGLKIRQLLWFHISCLTLGRETVLEYLVSFGVWIRTPPAYRPQNAPILSTLPETTVV
SEQIDNO：105，融合蛋白VZV-gE-F7的氨基酸序列，其中以下划线标示插入的片段
MDIDPYKEFGASVELLSFLPSDFFPSIRDLLDTASALYREALESPEHCSPHHTALRQAILCWGELMNLATWVGSNLEDGGGGSGGGGTGSLMQPTQMSAQEDLGDDTGIHVIPTLNGEFGGGGSGGGGSRELVVSYVNVNMGLKIRQLLWFHISCLTLGRETVLEYLVSFGVWIRTPPAYRPQNAPILSTLPETTVV
SEQIDNO：106，融合蛋白VZV-gE-F8的氨基酸序列，其中以下划线标示插入的片段
MDIDPYKEFGASVELLSFLPSDFFPSIRDLLDTASALYREALESPEHCSPHHTALRQAILCWGELMNLATWVGSNLEDGGGGSGGGGTGSGERLMQPTQMSAQEDLGDDTGIHVIPTLNGEFGGGGSGGGGSRELVVSYVNVNMGLKIRQLLWFHISCLTLGRETVLEYLVSFGVWIRTPPAYRPQNAPILSTLPETTVV
SEQIDNO：107，编码融合蛋白VZV-gE-F1的核苷酸序列，其中以下划线标示插入的片段
ATGGACATTGACCCATATAAAGAATTTGGAGCTTCTGTGGAGTTACTCTCTTTTTTGCCTTCCGACTTCTTTCCTTCTATTCGAGATCTCCTCGACACCGCCTCTGCTCTGTATCGGGAGGCCTTAGAGTCTCCGGAACATTGTTCACCTCACCATACGGCACTCAGGCAAGCTATTCTGTGTTGGGGTGAGTTGATGAATCTAGCCACCTGGGTGGGAAGTAATTTGGAAGATGGTGGAGGTGGTTCTGGAGGTGGTGGTACTGGATCCTCTGCACAGGAGGATCTTGGGGACGATACGGGCATCCACGTTATCGAATTCGGTGGTGGAGGTTCAGGAGGAGGTGGTTCCAGGGAACTAGTAGTCAGCTATGTCAACGTTAATATGGGCCTAAAAATCAGACAACTATTGTGGTTTCACATTTCCTGTCTTACTTTGGGGAGAGAAACTGTTCTTGAATATTTGGTGTCTTTTGGAGTGTGGATTCGCACTCCTCCTGCATATAGACCACAAAATGCCCCTATCTTATCAACACTTCCGGAAACTACTGTTGTTTAA
SEQIDNO：108，编码融合蛋白VZV-gE-F2的核苷酸序列，其中以下划线标示插入的片段
ATGGACATTGACCCATATAAAGAATTTGGAGCTTCTGTGGAGTTACTCTCTTTTTTGCCTTCCGACTTCTTTCCTTCTATTCGAGATCTCCTCGACACCGCCTCTGCTCTGTATCGGGAGGCCTTAGAGTCTCCGGAACATTGTTCACCTCACCATACGGCACTCAGGCAAGCTATTCTGTGTTGGGGTGAGTTGATGAATCTAGCCACCTGGGTGGGAAGTAATTTGGAAGATGGTGGAGGTGGTTCTGGAGGTGGTGGTACTGGATCCATGTCTGCACAGGAGGATCTTGGGGACGATACGGGCATCCACGTTATCCCTGAATTCGGTGGTGGAGGTTCAGGAGGAGGTGGTTCCAGGGAACTAGTAGTCAGCTATGTCAACGTTAATATGGGCCTAAAAATCAGACAACTATTGTGGTTTCACATTTCCTGTCTTACTTTGGGGAGAGAAACTGTTCTTGAATATTTGGTGTCTTTTGGAGTGTGGATTCGCACTCCTCCTGCATATAGACCACAAAATGCCCCTATCTTATCAACACTTCCGGAAACTACTGTTGTTTAA
SEQIDNO：109，编码融合蛋白VZV-gE-F3的核苷酸序列，其中以下划线标示插入的片段
ATGGACATTGACCCATATAAAGAATTTGGAGCTTCTGTGGAGTTACTCTCTTTTTTGCCTTCCGACTTCTTTCCTTCTATTCGAGATCTCCTCGACACCGCCTCTGCTCTGTATCGGGAGGCCTTAGAGTCTCCGGAACATTGTTCACCTCACCATACGGCACTCAGGCAAGCTATTCTGTGTTGGGGTGAGTTGATGAATCTAGCCACCTGGGTGGGAAGTAATTTGGAAGATGGTGGAGGTGGTTCTGGAGGTGGTGGTACTGGATCCCAAATGTCTGCACAGGAGGATCTTGGGGACGATACGGGCATCCACGTTATCCCTACGGAATTCGGTGGTGGAGGTTCAGGAGGAGGTGGTTCCAGGGAACTAGTAGTCAGCTATGTCAACGTTAATATGGGCCTAAAAATCAGACAACTATTGTGGTTTCACATTTCCTGTCTTACTTTGGGGAGAGAAACTGTTCTTGAATATTTGGTGTCTTTTGGAGTGTGGATTCGCACTCCTCCTGCATATAGACCACAAAATGCCCCTATCTTATCAACACTTCCGGAAACTACTGTTGTTTAA
SEQIDNO：110，编码融合蛋白VZV-gE-F4的核苷酸序列，其中以下划线标示插入的片段
ATGGACATTGACCCATATAAAGAATTTGGAGCTTCTGTGGAGTTACTCTCTTTTTTGCCTTCCGACTTCTTTCCTTCTATTCGAGATCTCCTCGACACCGCCTCTGCTCTGTATCGGGAGGCCTTAGAGTCTCCGGAACATTGTTCACCTCACCATACGGCACTCAGGCAAGCTATTCTGTGTTGGGGTGAGTTGATGAATCTAGCCACCTGGGTGGGAAGTAATTTGGAAGATGGTGGAGGTGGTTCTGGAGGTGGTGGTACTGGATCCACACAAATGTCTGCACAGGAGGATCTTGGGGACGATACGGGCATCCACGTTATCCCTACGTTAGAATTCGGTGGTGGAGGTTCAGGAGGAGGTGGTTCCAGGGAACTAGTAGTCAGCTATGTCAACGTTAATATGGGCCTAAAAATCAGACAACTATTGTGGTTTCACATTTCCTGTCTTACTTTGGGGAGAGAAACTGTTCTTGAATATTTGGTGTCTTTTGGAGTGTGGATTCGCACTCCTCCTGCATATAGACCACAAAATGCCCCTATCTTATCAACACTTCCGGAAACTACTGTTGTTTAA
SEQIDNO：111，编码融合蛋白VZV-gE-F5的核苷酸序列，其中以下划线标示插入的片段
ATGGACATTGACCCATATAAAGAATTTGGAGCTTCTGTGGAGTTACTCTCTTTTTTGCCTTCCGACTTCTTTCCTTCTATTCGAGATCTCCTCGACACCGCCTCTGCTCTGTATCGGGAGGCCTTAGAGTCTCCGGAACATTGTTCACCTCACCATACGGCACTCAGGCAAGCTATTCTGTGTTGGGGTGAGTTGATGAATCTAGCCACCTGGGTGGGAAGTAATTTGGAAGATGGTGGAGGTGGTTCTGGAGGTGGTGGTACTGGATCCCCCACACAAATGTCTGCACAGGAGGATCTTGGGGACGATACGGGCATCCACGTTATCCCTACGTTA AACGAATTCGGTGGTGGAGGTTCAGGAGGAGGTGGTTCCAGGGAACTAGTAGTCAGCTATGTCAACGTTAATATGGGCCTAAAAATCAGACAACTATTGTGGTTTCACATTTCCTGTCTTACTTTGGGGAGAGAAACTGTTCTTGAATATTTGGTGTCTTTTGGAGTGTGGATTCGCACTCCTCCTGCATATAGACCACAAAATGCCCCTATCTTATCAACACTTCCGGAAACTACTGTTGTTTAA
SEQIDNO：112，编码融合蛋白VZV-gE-F6的核苷酸序列，其中以下划线标示插入的片段
ATGGACATTGACCCATATAAAGAATTTGGAGCTTCTGTGGAGTTACTCTCTTTTTTGCCTTCCGACTTCTTTCCTTCTATTCGAGATCTCCTCGACACCGCCTCTGCTCTGTATCGGGAGGCCTTAGAGTCTCCGGAACATTGTTCACCTCACCATACGGCACTCAGGCAAGCTATTCTGTGTTGGGGTGAGTTGATGAATCTAGCCACCTGGGTGGGAAGTAATTTGGAAGATGGTGGAGGTGGTTCTGGAGGTGGTGGTACTGGATCCCAACCCACACAAATGTCTGCACAGGAGGATCTTGGGGACGATACGGGCATCCACGTTATCCCTACG TTAAACGGCGAATTCGGTGGTGGAGGTTCAGGAGGAGGTGGTTCCAGGGAACTAGTAGTCAGCTATGTCAACGTTAATATGGGCCTAAAAATCAGACAACTATTGTGGTTTCACATTTCCTGTCTTACTTTGGGGAGAGAAACTGTTCTTGAATATTTGGTGTCTTTTGGAGTGTGGATTCGCACTCCTCCTGCATATAGACCACAAAATGCCCCTATCTTATCAACACTTCCGGAAACTACTGTTGTTTAA
SEQIDNO：113，编码融合蛋白VZV-gE-F7的核苷酸序列，其中以下划线标示插入的片段
ATGGACATTGACCCATATAAAGAATTTGGAGCTTCTGTGGAGTTACTCTCTTTTTTGCCTTCCGACTTCTTTCCTTCTATTCGAGATCTCCTCGACACCGCCTCTGCTCTGTATCGGGAGGCCTTAGAGTCTCCGGAACATTGTTCACCTCACCATACGGCACTCAGGCAAGCTATTCTGTGTTGGGGTGAGTTGATGAATCTAGCCACCTGGGTGGGAAGTAATTTGGAAGATGGTGGAGGTGGTTCTGGAGGTGGTGGTACTGGATCCTTAATGCAACCCACACAAATGTCTGCACAGGAGGATCTTGGGGACGATACGGGCATCCACGT TATCCCTACGTTAAACGGCGAATTCGGTGGTGGAGGTTCAGGAGGAGGTGGTTCCAGGGAACTAGTAGTCAGCTATGTCAACGTTAATATGGGCCTAAAAATCAGACAACTATTGTGGTTTCACATTTCCTGTCTTACTTTGGGGAGAGAAACTGTTCTTGAATATTTGGTGTCTTTTGGAGTGTGGATTCGCACTCCTCCTGCATATAGACCACAAAATGCCCCTATCTTATCAACACTTCCGGAAACTACTGTTGTTTAA
SEQIDNO：114，编码融合蛋白VZV-gE-F8的核苷酸序列，其中以下划线标示插入的片段
ATGGACATTGACCCATATAAAGAATTTGGAGCTTCTGTGGAGTTACTCTCTTTTTTGCCTTCCGACTTCTTTCCTTCTATTCGAGATCTCCTCGACACCGCCTCTGCTCTGTATCGGGAGGCCTTAGAGTCTCCGGAACATTGTTCACCTCACCATACGGCACTCAGGCAAGCTATTCTGTGTTGGGGTGAGTTGATGAATCTAGCCACCTGGGTGGGAAGTAATTTGGAAGATGGTGGAGGTGGTTCTGGAGGTGGTGGTACTGGATCCGGGGAACGGTTAATGCAACCCACACAAATGTCTGCACAGGAGGATCTTGGGGACGATACGGGCATC CACGTTATCCCTACGTTAAACGGCGAATTCGGTGGTGGAGGTTCAGGAGGAGGTGGTTCCAGGGAACTAGTAGTCAGCTATGTCAACGTTAATATGGGCCTAAAAATCAGACAACTATTGTGGTTTCACATTTCCTGTCTTACTTTGGGGAGAGAAACTGTTCTTGAATATTTGGTGTCTTTTGGAGTGTGGATTCGCACTCCTCCTGCATATAGACCACAAAATGCCCCTATCTTATCAACACTTCCGGAAACTACTGTTGTTTAA
将上述包含目的表达质粒的ER2566菌以及含pTO-T7-C149空质粒的ER2566菌，37℃震荡培养至OD600约0.5，然后按1:1000的比例转接扩大培养至500mLLB(含有硫酸卡那霉素)中。培养至OD600约0.8时，加入IPTG500μL，25℃诱导6h。4℃下收集菌体，8000rpm离心10min。弃上清，菌体沉淀用10mL/瓶的裂解液重悬。冰水浴，采用超声破碎仪处理破碎细胞。超声条件：工作时间：3min/瓶；脉冲：打2sec，停5sec；输出功率：60％。12000rpm离心10min，保留上清。经SDS-PAGE鉴定，所有融合蛋白均为上清表达。
由于表达上清中含有很多杂蛋白，本发明人采用以下方式进行纯化并促进蛋白自发组装形成颗粒：将超声离心后得到的上清置于65℃水浴中热变性30min，12000rpm离心10min。然后将纯化后的蛋白在20mMPB6.0(含0.3MNaCl)的条件下促进蛋白自发组装形成颗粒。随后，进行电镜观察。电镜结果如图10所示。结果显示，所获得的经纯化的蛋白均能够组装成类病毒颗粒，其呈均匀的空心球体结构。
3.融合蛋白VZV-gE-F1、F2、F3、F4、F5、F6、F7、F8的活性鉴定
将上面制得的八种融合蛋白样品(VZV-gE-F1、F2、F3、F4、F5、F6、F7、F8)进行SDS-PAGE电泳，将蛋白从聚丙烯酰胺凝胶转移至硝酸纤维膜上，35mA恒流转移30min。将膜用水稍做漂洗，按每平方厘米膜0.1mL的量加入封闭液，密封于洁净的塑料小袋中，室温缓摇温育1h。按每平方厘米膜0.1mL的量加入用封闭液稀释的4A2单克隆抗体(2μg/mL)，密封于洁净的塑料小袋中，室温缓摇温育1h。温育后，取出膜用TNT漂洗3次，每次5min。按每平方厘米膜0.1mL的量加入用封闭液稀释的酶标二抗(GAM-HRP)，密封于干净的塑料小袋中，室温缓摇温育1h。温育后，取出膜用TNT漂洗3次，每次5min。按每平方厘米膜0.01mL的量加入预先混合均匀的底物溶液(SuperSignalELISAPicoChemiluminescentSubstrate，Thermo)，使用仪器(ImageQuantLAS4000mini，GE)收集发光信号，并使用ImageJ图像处理软件对印迹条带进行定量分析。结果如图11所示。结果显示，融合蛋白VZV-gE-F1、VZV-gE-F2、VZV-gE-F3、VZV-gE-F4、VZV-gE-F5、VZV-gE-F6、VZV-gE-F7和VZV-gE-F8都能够被4A2单抗特异性识别和结合，与单抗4A2具有良好的反应性；而不含表位肽的载体蛋白(HBcAg)不能够与4A2单抗发生特异性反应。
4.抗融合蛋白的多抗血清制备
将经过纯化并组装成类病毒颗粒的融合蛋白用于免疫6周龄BALB/c雌鼠，每种融合蛋白平行免疫5只小鼠(编号为：鼠1到鼠5)，免疫剂量为100μg/只。初次免疫使用弗氏完全佐剂(购自Sigma)。初次免疫后每隔两周加强免疫一次，加强免疫时使用弗氏不完全佐剂(购自Sigma)，共加强免疫三次。在第三次加强免疫后的第11天采血。
实施例13：抗融合蛋白的多抗血清与VZV病毒的结合活性
采用免疫荧光法，将实施例12制备的多抗血清用于检测VZV病毒。免疫荧光方法的步骤参照实施例4。
结果如图12所示。结果显示，使用本发明融合蛋白所制备的8种多抗血清都能够结合VZVOka毒株感染的ARPE-19细胞，并显示出绿色荧光；而不能识别或结合未感染VZV病毒的ARPE-19细胞(作为阴性对照)。这些结果说明，抗本发明融合蛋白的多抗血清能够特异性结合VZV病毒，并因此能够特异性识别VZV病毒感染的细胞。
实施例14：抗融合蛋白的多抗血清用于检测VZV病毒的感染和滴 度
利用ELISPOT法，将实施例12制备的8种多抗血清用于检测VZV病毒的滴度。ELISPOT法的具体实验方案基本上如实施例5所述，除了在步骤(4)中，每个孔先用实施例12制备的多抗血清(作为一抗)温育1h，然后用PBST洗涤三次，随后再用HRP标记的羊抗鼠抗体(作为二抗)温育1h。
在本实施例中，使用所述多抗血清，对五批VZV病毒的感染滴度进行了测定。测定结果如表11所示。结果显示，抗本发明融合蛋白的多抗血清都能够用于测定VZV病毒的感染滴度。
表11.使用8种多抗血清(作为一抗)所测定的5个批次的VZV病毒的感染滴度
实施例15：抗融合蛋白的多抗血清用于检测VZV病毒中和抗体的 效价
利用酶联免疫斑点法，将实施例12制备的多抗血清用于检测VZV病毒中和抗体的效价。具体实验方案基本上如实施例6所述，除了在步骤(9)中，每个孔先用实施例12制备的多抗血清(作为一抗)温育1h，然后用PBST洗涤三次，随后再用HRP标记的羊抗鼠抗体(作为二抗)温育1h。
在本实施例中，随机挑选了5份厦门市疾病预防控制中心(CDC)收集的水痘疫苗免疫完成者的血清，并分别进行血清中的VZV病毒中和抗体的检测。各血清样品中的中和抗体滴度的检测结果示于表12中。结果显示，抗本发明融合蛋白的多抗血清能够用于检测VZV病毒中和抗体并评估其效价。
表12.使用8种多抗血清(作为一抗)所测定的5份血清样品的中和抗体的效价
实施例16：抗融合蛋白的多抗血清的中和活性的鉴定
在本实施例中，利用酶联免疫斑点法，对实施例12制备的多抗血清的中和能力进行了测定。测定方法的具体步骤如实施例3所述。中和实验的测定结果如表13所示：
表13.融合蛋白诱发的多抗血清的中和滴度
这一结果表明，抗本发明融合蛋白的多抗血清具有中和VZV病毒的能力，能够用于抵抗、预防和治疗VZV病毒感染或与所述感染相关的一种或多种疾病或症状，例如水痘或带状疱疹。
尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，但本领域技术人员将理解：根据已经公开的所有教导，可以对细节进行各种修改和变动，并且这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。

Claims (27)

1.一种分离的表位肽或其变体，所述表位肽是来源于水痘-带状疱疹病毒(VZV)的gE蛋白的片段，且至少包含gE蛋白的第121-135位氨基酸残基，且所述变体与其所源自的表位肽相异仅在于1个或几个(例如，1个，2个，3个、4个或5个)氨基酸残基的保守置换，且保留了其所源自的表位肽的生物学功能，
优选地，所述表位肽由gE蛋白的15-30个(例如，15个，16个，17个，18个，19个，20个，21个，22个，23个，24个，25个，26个，27个，28个，29个，30个)连续氨基酸残基组成，且包含gE蛋白的第121-135位氨基酸残基，
优选地，所述gE蛋白的第121-135位氨基酸残基如SEQIDNO:1所示；
优选地，所述表位肽具有选自下列的氨基酸序列：gE蛋白的第121-135位氨基酸残基；gE蛋白的第120-136位氨基酸残基；gE蛋白的第119-137位氨基酸残基；gE蛋白的第118-138位氨基酸残基；gE蛋白的第117-139位氨基酸残基；gE蛋白的第116-140位氨基酸残基；gE蛋白的第114-140位氨基酸残基；和，gE蛋白的第111-140位氨基酸残基；
优选地，所述表位肽具有选自SEQIDNO:1-8的氨基酸序列；
优选地，所述表位肽为中和表位肽，例如补体依赖的中和表位肽。
2.一种重组蛋白，其包含权利要求1的表位肽或其变体，以及载体蛋白，并且所述重组蛋白不是天然存在的蛋白或其片段，
例如，所述表位肽或其变体任选地通过连接体(刚性或柔性连接体，例如(GGGGS)3)与载体蛋白相连接；
优选地，所述载体蛋白为HBcAg的片段，例如，其包含或者由HBcAg的第1-149位氨基酸残基组成，并且用所述表位肽替换HBcAg的第79-80位氨基酸；
优选地，所述载体蛋白具有如SEQIDNO:80所示的氨基酸序列；
优选地，所述重组蛋白具有选自下列的氨基酸序列：SEQIDNO：99-106。
3.一种类病毒颗粒，其包含或者由权利要求2的重组蛋白组成。
4.一种表位肽偶联物，其包含权利要求1的表位肽和与之偶联的偶联部分，
优选地，所述偶联部分选自放射性核素、药物、毒素、细胞因子、酶、荧光素、载体、脂类、和生物素中的一种或多种；
优选地，所述载体选自人血清白蛋白、牛血清白蛋白、牛甲状腺球蛋白、钥孔血白蛋白及其他γ球蛋白；
优选地，所述偶联部分通过选自下述的偶联方法偶联至表位肽：MBS法、戊二醛法、活泼酯法、碳二亚胺法、卤代硝基苯法及亚胺酸脂法。
5.一种分离的核酸分子，其包含编码权利要求1的表位肽或其变体，或权利要求2的重组蛋白的核苷酸序列；
优选地，编码权利要求1的表位肽或其变体的核苷酸序列具有选自SEQIDNO:9-16的核苷酸序列；
优选地，编码权利要求2的重组蛋白的核苷酸序列具有选自SEQIDNO:107-114的核苷酸序列。
6.一种载体，其包含权利要求5的核酸分子。
7.一种宿主细胞，其包含权利要求5的核酸分子或权利要求6的载体。
8.制备权利要求1的表位肽或其变体或者权利要求2的重组蛋白的方法，其包括，在合适的条件下培养权利要求7的宿主细胞，和从细胞培养物中回收所述表位肽或其变体或者重组蛋白。
9.一种组合物，其包含权利要求1的表位肽或其变体、或权利要求2的重组蛋白、或权利要求3的类病毒颗粒、或权利要求4的表位肽偶联物，或权利要求5的核酸分子、或权利要求6的载体、或权利要求7的宿主细胞；以及，任选的药学上可接受的载体和/或赋形剂(例如佐剂)；
优选地，所述组合物为疫苗组合物，且还包含药学上可接受的载体和/或赋形剂(例如佐剂)；
优选地，所述疫苗组合物为蛋白疫苗，其包含一种或多种所述表位肽、一种或多种所述重组蛋白、一种或多种所述类病毒颗粒、和/或一种或多种所述表位肽偶联物；优选地，所述表位肽可以是单独的或串联的、修饰的或未经修饰的、偶联至其他蛋白的或不偶联至其他蛋白的；
优选地，所述疫苗组合物为基因疫苗，其包含一个或多个所述核酸分子或载体；优选地，所述基因疫苗包含DNA或RNA；优选地，所述DNA或RNA可以是裸露的或可以包裹于具有传递或/和保护功能的外壳内；优选地，所述外壳可以是腺病毒、腺相关病毒、慢病毒、逆转录病毒等的外壳，或者采用化学方法合成的能行使相似功能的其他材料；
优选地，所述疫苗组合物用于治疗和/或预防VZV感染或与所述感染相关的一种或多种疾病或症状，例如水痘或带状疱疹；
或者，
优选地，所述组合物为检测用组合物，其用于检测VZV病毒抗体(特别是中和抗体)的效价；
或者，
优选地，所述组合物为用于制备抗VZV的抗血清或抗体的组合物。
10.权利要求1的表位肽或其变体、或权利要求2的重组蛋白、或权利要求3的类病毒颗粒、或权利要求4的表位肽偶联物，或权利要求5的核酸分子、或权利要求6的载体在制备疫苗组合物中的用途，所述疫苗组合物用于治疗和/或预防VZV感染或与所述感染相关的一种或多种疾病或症状，例如水痘或带状疱疹；
优选地，所述疫苗组合物为蛋白疫苗，其包含一种或多种所述表位肽、一种或多种所述重组蛋白、一种或多种所述类病毒颗粒、和/或一种或多种所述表位肽偶联物；优选地，所述表位肽可以是单独的或串联的、修饰的或未经修饰的、偶联至其他蛋白的或不偶联至其他蛋白的；
优选地，所述疫苗组合物为基因疫苗，其包含一个或多个所述核酸分子或载体；优选地，所述基因疫苗包含DNA或RNA；优选地，所述DNA或RNA可以是裸露的或可以包裹于具有传递或/和保护功能的外壳内；优选地，所述外壳可以是腺病毒、腺相关病毒、慢病毒、逆转录病毒等的外壳，或者采用化学方法合成的能行使相似功能的其他材料。
11.权利要求1的表位肽或其变体、或权利要求2的重组蛋白、或权利要求3的类病毒颗粒、或权利要求4的表位肽偶联物，或权利要求5的核酸分子、或权利要求6的载体在制备组合物中的用途，所述组合物用于检测VZV病毒滴度和/或检测VZV病毒抗体(特别是中和抗体)的效价，或用于制备抗VZV的抗血清或抗体(特别是中和性抗血清或抗体)。
12.用于在受试者(优选哺乳动物，例如人)中治疗和/或预防VZV感染或与所述感染相关的一种或多种疾病或症状，例如水痘或带状疱疹的方法，其包括，给有此需要的受试者施用治疗和/或预防有效量的权利要求1的表位肽或其变体、或权利要求2的重组蛋白、或权利要求3的类病毒颗粒、或权利要求4的表位肽偶联物，或权利要求5的核酸分子、或权利要求6的载体。
13.制备抗VZV的抗血清或抗体(特别是中和性抗血清或抗体)的方法，所述方法包括：
给非人动物(优选非人哺乳动物，例如大鼠，小鼠，兔)施用有效量的权利要求1的表位肽或其变体、或权利要求2的重组蛋白、或权利要求3的类病毒颗粒、或权利要求4的表位肽偶联物，或权利要求5的核酸分子、或权利要求6的载体，以在所述动物体内诱发抗VZV的免疫应答；
从所述动物分离抗VZV的抗血清；和，
任选地，从所述抗血清中分离抗体；
或者，所述方法包括：
给非人动物(优选非人哺乳动物，例如大鼠，小鼠，兔)施用有效量的权利要求1的表位肽或其变体、或权利要求2的重组蛋白、或权利要求3的类病毒颗粒、或权利要求4的表位肽偶联物，或权利要求5的核酸分子、或权利要求6的载体，以在所述动物体内诱发抗VZV的免疫应答；
从所述动物分离能够产生抗VZV抗体的B细胞；
将所述B细胞与骨髓瘤细胞融合，以产生能够分泌抗VZV抗体的杂交瘤细胞；
分离和培养所述杂交瘤细胞；和
从所述杂交瘤细胞的培养物中分离抗VZV抗体。
14.一种单克隆抗体或其抗原结合片段，其中，所述单克隆抗体能够特异性结合权利要求1的表位肽；
优选地，所述的单克隆抗体与下述抗体竞争结合VZV的gE蛋白上的相同表位：杂交瘤细胞株4A2所产生的单克隆抗体，其中，杂交瘤细胞株4A2保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，且具有保藏号CCTCCNO：C2014192；
优选地，所述的单克隆抗体能够阻断权利要求1的表位肽或gE蛋白与由杂交瘤细胞株4A2所产生的抗体的结合至少50％，优选至少60％，优选至少70％，优选至少80％，优选至少90％，优选至少95％或优选至少99％，其中，所述杂交瘤细胞株4A2保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，且具有保藏号CCTCCNO：C2014192；
优选地，所述的单克隆抗体具有选自下列的一个或多个CDR：如SEQIDNO:115所示的重链CDR1；如SEQIDNO:116所示的重链CDR2；如SEQIDNO:117所示的重链CDR3；如SEQIDNO:118所示的轻链CDR1；如SEQIDNO:119所示的轻链CDR2；以及，如SEQIDNO:120所示的轻链CDR3；
优选地，所述的单克隆抗体具有所述的6个CDR；
优选地，所述的单克隆抗体具有如SEQIDNO:24所示的轻链可变区，和/或，如SEQIDNO:26所示的重链可变区；
优选地，所述的单克隆抗体衍生自下述单克隆抗体，或是下述单克隆抗体：杂交瘤细胞株4A2所产生的单克隆抗体，其中，杂交瘤细胞株4A2保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，且具有保藏号CCTCCNO：C2014192；
优选地，所述单克隆抗体或其抗原结合片段选自Fab、Fab'、F(ab')2、Fd、Fv、dAb、互补决定区片段、单链抗体(例如，scFv)、小鼠抗体、兔抗体、羊抗体、人源化抗体、全人抗体、嵌合抗体(例如，人鼠嵌合抗体)或双特异或多特异抗体；
优选地，所述的单克隆抗体以小于大约10-5M，例如小于大约10-6M、10-7M、10-8M、10-9M或10-10M或更小的KD结合所述表位肽或VZV的gE蛋白；
优选地，所述的单克隆抗体包括非-CDR区，且所述非-CDR区来自不是鼠类的物种，例如来自人抗体；
优选地，所述的单克隆抗体为中和性单克隆抗体。
15.杂交瘤细胞株4A2，其保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，且具有保藏号CCTCCNO：C2014192。
16.一种抗体偶联物，其包含权利要求14的单克隆抗体或其抗原结合片段，以及与之偶联的偶联部分，
优选地，所述偶联部分选自放射性核素、药物、毒素、细胞因子、酶、荧光素、载体、脂类、和生物素中的一种或多种；
优选地，所述偶联部分通过选自下述的偶联方法偶联至表位肽：MBS法、戊二醛法、活泼酯法、碳二亚胺法、卤代硝基苯法及亚胺酸脂法。
17.一种试剂盒，其包括权利要求14的单克隆抗体或其抗原结合片段；
例如，所述单克隆抗体或其抗原结合片段还包括可检测的标记，例如放射性同位素，荧光物质，发光物质，有色物质和酶；
例如，所述试剂盒还包括第二抗体，其特异性识别所述单克隆抗体或其抗原结合片段；任选地，所述第二抗体还包括可检测的标记，例如放射性同位素，荧光物质，发光物质，有色物质和酶。
18.权利要求14的单克隆抗体或其抗原结合片段在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于检测gE蛋白在样品中的存在或其水平，或用于诊断受试者是否感染了VZV。
19.检测gE蛋白在样品中的存在或其水平的方法，其包括使用权利要求14的单克隆抗体或其抗原结合片段；
例如，所述单克隆抗体或其抗原结合片段还包括可检测的标记，例如放射性同位素，荧光物质，发光物质，有色物质和酶；
例如，所述试剂盒还包括第二抗体，其特异性识别所述单克隆抗体或其抗原结合片段；任选地，所述第二抗体还包括可检测的标记，例如放射性同位素，荧光物质，发光物质，有色物质和酶。
20.诊断受试者(优选哺乳动物，例如人)是否感染了VZV的方法，其包括，使用权利要求14的单克隆抗体或其抗原结合片段来检测来自受试者的样品中gE蛋白的存在或其水平；
例如，所述单克隆抗体或其抗原结合片段还包括可检测的标记，例如放射性同位素，荧光物质，发光物质，有色物质和酶；
例如，所述试剂盒还包括第二抗体，其特异性识别所述单克隆抗体或其抗原结合片段；任选地，所述第二抗体还包括可检测的标记，例如放射性同位素，荧光物质，发光物质，有色物质和酶。
21.一种药物组合物，其包含权利要求14的单克隆抗体或其抗原结合片段，以及药学上可接受的载体和/或赋形剂；
优选地，所述单克隆抗体或其抗原结合片段偶联至偶联部分，
优选地，所述偶联部分选自放射性核素、药物、毒素、细胞因子、酶、荧光素、载体、脂类、和生物素中的一种或多种。
22.权利要求14的单克隆抗体或其抗原结合片段在制备药物组合物中的用途，所述药物组合物用于抵抗、治疗和/或预防VZV感染或与所述感染相关的一种或多种疾病或症状，例如水痘或带状疱疹；
优选地，所述单克隆抗体或其抗原结合片段偶联至偶联部分，
优选地，所述偶联部分选自放射性核素、药物、毒素、细胞因子、酶、荧光素、载体、脂类、和生物素中的一种或多种。
23.用于在受试者(优选哺乳动物，例如人)中治疗和/或预防VZV感染或与所述感染相关的一种或多种疾病或症状，例如水痘或带状疱疹的方法，其包括，给有此需要的受试者施用治疗和/或预防有效量的权利要求14的单克隆抗体或其抗原结合片段；
优选地，所述单克隆抗体或其抗原结合片段偶联至偶联部分，
优选地，所述偶联部分选自放射性核素、药物、毒素、细胞因子、酶、荧光素、载体、脂类、和生物素中的一种或多种。
24.一种分离的核酸分子，其包含编码权利要求14的单克隆抗体或其抗原结合片段的核苷酸序列；
优选地，编码所述单克隆抗体的轻链可变区的核苷酸序列如SEQIDNO:23所示；
优选地，编码所述单克隆抗体的重链可变区的核苷酸序列如SEQIDNO:25所示。
25.一种载体，其包含权利要求24的核酸分子。
26.一种宿主细胞，其包含权利要求24的核酸分子或权利要求25的载体。
27.制备权利要求14的单克隆抗体或其抗原结合片段的方法，其包括，在合适的条件下培养权利要求26的宿主细胞，和从细胞培养物中回收所述单克隆抗体或其抗原结合片段。
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