CN116655748A - 一种截短型水痘-带状疱疹病毒gE蛋白及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种截短型水痘‑带状疱疹病毒gE蛋白、编码其的核酸分子、载体，包含其的药物组合物，以及所述药物组合物用于预防或减轻带状疱疹和相关疾病的用途。

Description

一种截短型水痘-带状疱疹病毒gE蛋白及其应用

技术领域

本发明涉及病毒疫苗领域，更具体地说，涉及一种截短型水痘-带状疱疹病毒gE蛋白和包含该蛋白的药物组合物，其用于制备带状疱疹疫苗的用途，以及其在治疗带状疱疹病毒感染相关的疾病或病症中的应用。

背景技术

带状疱疹(Herpes zoster，HZ)是一类急性感染性皮肤病，其主要由潜伏在体内的水痘－带状疱疹病毒(Varicella-zoster virus，VZV)的再激活而引起。人类是水痘带状疱疹病毒的唯一宿主。其潜伏期约为14天。原发感染为水痘，潜伏在感觉神经节的VZV再激活引起带状疱疹。带状疱疹主要特点为呈带状分布的簇集水泡，并伴有明显神经痛，该病常见于高龄、免疫缺陷、使用免疫抑制剂等患者。带状疱疹患病后易患并发症，疼痛程度可达7级以上，严重影响生活质量，且存在一定复发率。

带状疱疹的发病率和严重程度随年龄增长而增高，50岁以后明显升高，这与老年人相关细胞介导免疫下降有关。据估计，85岁以上老年人约有一半发生过至少一次带状疱疹。在加拿大、以色列、日本、中国台湾和美国开展的研究显示，总的人群带状疱疹发病率为3.4-5.0/1000人/年，65岁以上人群则为8-11/1000人/年。在欧洲27个国家开展的一项研究发现，带状疱疹发病率在不同国家自2.0-4.6/1000人/年不等，但未显示出明显的地域差异。

水痘-带状疱疹病毒基因组为线性双链DNA，全长125kbp，含有71个ORF，能编码68种蛋白，其中含12种糖蛋白。糖蛋白对于病毒生命周期尤为重要，其中gE(glycoprotein E)蛋白是VZV感染期内表达量最多的糖蛋白，在介导病毒复制和扩散方面发挥重要作用。另一方面，gE蛋白含有中和抗体、T细胞表位，可诱导机体产生特异性的体液免疫和细胞免疫，是设计带状疱疹疫苗的重要候选抗原。

带状疱疹到目前为止无特效治疗方法，接种疫苗也是唯一有效的预防控制手段。现有技术中已经开发了一些针对带状疱疹的疫苗，但存在蛋白表达效率低、蛋白活性差、免疫效果不理想等问题。因此本领域中有必要开发改进的VZV疫苗。

发明概述

本发明提供了一种截短型水痘-带状疱疹病毒gE蛋白，及其用作制备预防或减轻带状疱疹和相关疾病的疫苗组合物的应用。本公开提供的益处广泛地适用于生物医药领域。

本发明的一个方面提供了一种截短型水痘-带状疱疹病毒gE蛋白，其包含如下的氨基酸序列：

(a)天然gE蛋白全长氨基酸序列的1-496或31-496位氨基酸的片段；

(b)天然gE蛋白全长氨基酸序列的31-537位氨基酸在C末端截短1-50个(例如10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个，以及该范围的任何子范围或单个值)氨基酸的片段；或

(c)与SEQ ID NO：1编码的氨基酸序列或如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列具有至少90％、95％或99％(例如91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％)同一性的氨基酸序列。

在一些实施方案中，所述截短型水痘-带状疱疹病毒gE蛋白由SEQ ID NO：1编码的氨基酸序列或如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列组成。

本发明的又一个方面提供了一种载体，其包含编码截短型水痘-带状疱疹病毒gE蛋白的多核苷酸序列。

本发明的再一个方面提供了一种宿主细胞，其包含含有截短型水痘-带状疱疹病毒gE蛋白的载体。

本发明的另一个方面提供了一种疫苗组合物，其包含截短型水痘-带状疱疹病毒gE蛋白或编码其的核酸分子，以及药学上可接受的载剂或佐剂。

所述佐剂可以是本领域中通常所有的佐剂，或者是其他带状疱疹疫苗组合物中使用的佐剂。所述佐剂可选自铝佐剂、AS0佐剂、角鲨烯水包油佐剂、皂苷佐剂、α-半乳糖基神经酰胺衍生佐剂、多糖佐剂、诱导机体产生免疫应答的激动剂(例如TLR激动剂、NOD激动剂、CLR激动剂、RLR激动剂)及其任意组合。

在一些实施方案中，所述佐剂是角鲨烯水包油佐剂与TLR激动剂例如CpG ODN的组合。具体地，所述含角鲨烯水包油佐剂是MF59或MF59类似物，和/或所述CpG ODN是CpG1018。

在一些实施方案中，所述佐剂是铝佐剂例如氢氧化铝与TLR激动剂例如CpG ODN的组合。所述CpG ODN可以是CpG1018。

本发明的另一个方面提供了一种制备截短型水痘-带状疱疹病毒gE蛋白的方法，其包括以下步骤：

-在宿主细胞中表达截短型水痘-带状疱疹病毒gE蛋白；和

-从所述宿主细胞分离所述截短型水痘-带状疱疹病毒gE蛋白。

本发明的另一个方面提供了截短型水痘-带状疱疹病毒gE蛋白或编码其的核酸分子在制备用于预防或减轻受试者中的水痘-带状疱疹病毒感染的疫苗组合物中的用途。

本发明的另一个方面提供了截短型水痘-带状疱疹病毒gE蛋白或编码其的核酸分子在制备用于预防或治疗受试者中与水痘-带状疱疹病毒相关的疾病或病症的药物中的用途。所述疾病或病症可选自水痘、带状疱疹和带状疱疹后遗神经痛。

在一些实施方案中，所述受试者为人或非人哺乳动物，优选为人。

本发明的另一个方面提供了一种试剂盒，其包含容器，所述容器包含本文公开的截短型水痘-带状疱疹病毒gE蛋白或编码其的核酸分子。

本发明的另一个方面提供了角鲨烯水包油佐剂与CpG ODN的组合，其用作带状疱疹疫苗组合物中的佐剂。在一些实施方案中，所述角鲨烯水包油佐剂是MF59或MF59类似物，和/或所述CpG ODN是CpG1018。

本发明的另一个方面提供了所述组合在制备用于预防或减轻受试者中的水痘-带状疱疹病毒感染和与水痘-带状疱疹病毒相关的疾病或病症的疫苗组合物中的用途。所述疫苗组合物还包含作为抗原的天然gE蛋白、其片段(例如胞外区片段如天然gE蛋白全长氨基酸序列的1-537或31-537位氨基酸)或变体或编码其的核酸分子。

在一些实施方案中，所述疫苗组合物包含本文公开的截短型gE蛋白。

附图简述

包括以下附图来进一步说明本发明的某些方面和特征。参照这些附图中的一个或多个并结合具体实施方案(包括实施例)的详细描述，可以更好地理解本发明。

图1A是构建Pee12.4-VZV-gE重组载体质粒图谱。

图1B是0.8％的琼脂糖电泳鉴定PCR扩增gE基因，其中gE表示水痘-带状疱疹病毒gE31-496基因的表达构建体(还包含部分载体序列和信号肽序列)，M表示5000bp DNA分子量标准。

具体实施方式

除非另外定义，否则本申请中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。此外，除非上下文另有要求，单数形式的术语应包括复数形式，复数形式的术语应包括单数形式。更具体地，如在本说明书和所附权利要求中所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式“一”、“一个”和“该”包括复数指示物。因此，例如，提及“一种蛋白质”包括多种蛋白质；提及“一个细胞”包括细胞的混合物等。在本申请中，除非另有说明，否则使用“或”意指“和/或”。此外，术语“包含”以及其他形式(诸如“包括”和“含有”)的使用不是限制性的。此外，说明书和所附权利要求中提供的范围包括端点和端点之间的所有值。

如本文中所用，术语“有效量”是指能够实现预期结果的化合物、治疗剂、病毒或药物的量。如本领域所理解的，有效量可以变化，取决于患者病史以及其他因素，诸如所用治疗剂的类型和/或剂量等。

如本文所用，术语“受试者”和“患者”可交换使用，是指任何活的生物体，包括人和动物。

如本文所用，术语“约”在与数字数值联合使用时意为涵盖具有比指定数字数值小5％的下限和比指定数字数值大5％的上限的范围内的数字数值。本文所用的范围包括范围指定的端点值以及其间的任何子范围或单个值。

相对于参比多肽序列的“百分比(％)氨基酸序列同一性”定义为在将所述序列进行比对(并在必要时导入空位)以获取最大百分比序列同一性，且不将任何保守取代视为序列同一性的部分之后，候选序列中的氨基酸残基与参比多肽序列中的相同氨基酸残基的百分比。可使用本领域各种方法进行序列比对以便测定百分比氨基酸序列同一性，例如，使用公众可得到的计算机软件如BLAST、BLAST-2、ALIGN或MEGALIGN(DNASTAR)软件。本领域技术人员可以决定测量比对的适宜参数，包括对所比较的序列全长获得最大比对所需的任何算法。当在本申请中提到序列同一性的百分比时，若未另外特别指出，这些百分比相对于较长序列的全长计算。相对于较长序列的全长计算适用于核酸序列和多肽序列两者。

术语“宿主细胞”、“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”可交换地使用且是指其中引入外源核酸的细胞，包括这种细胞的后代。宿主细胞包括“转化体”和“转化的细胞”，其包括初级转化的细胞和来源于其的后代，而不考虑传代的数目。后代在核酸含量上可能与亲本细胞不完全相同，而是可以包含突变。

术语“载体”当在本文中使用时是指能够增殖与其相连的另一个核酸的核酸分子。该术语包括作为自我复制核酸结构的载体以及结合到已经引入其的宿主细胞的基因组中的载体。一些载体能够指导与其可操作相连的核酸的表达。

水痘－带状疱疹病毒(VZV)和gE抗原

水痘－带状疱疹病毒是属于人疱疹病毒科的病毒，是表现出两种不同临床表象疾病(水痘和带状疱疹)的病因。这种病毒的初期感染引起水痘(水疱疮)，其后，此种病毒潜伏感染神经节，经年累月后由于某种诱因重新活化引发带状疱疹(形成病毒颗粒，通过神经传导，达到表皮细胞，在神经分布的区域形成水痘症状)。

VZV基因组是双链DNA，包含约125,000个碱基，已知该基因组中至少存在着72个基因。VZV病毒表面主要有四种糖蛋白或复合物，分别是gB、gC、gE/I和gH/gL。gE蛋白是VZV感染期内表达量最多的糖蛋白也是最重要的表面抗原，在介导病毒复制和扩散方面发挥重要作用。天然gE蛋白(例如如NCBI ID Q9J3M8.1、AQT34120.1、AGY33616.1、AEW88548.1所示)通常全长623个氨基酸，由疏水跨膜区、胞内区、胞外区组成，其中胞外区含537个氨基酸，包含N端30个氨基酸的信号肽区域。gE蛋白的抗原表位主要分布在胞外区，Vafai等和Forghani等人的研究显示，gE蛋白至少含有3个不同抗原表位，分别位于氨基酸109-123，160-316，101-161位。

在一些方面，本发明提供了一种截短型gE蛋白，其是天然gE蛋白(1-623)的片段，优选天然gE蛋白的胞外区(1-537)的片段，更优选去除了信号肽区域的天然gE蛋白胞外区(31-537)的片段。在一些实施方案中，所述截短型gE蛋白不包含天然gE蛋白的跨膜区和胞内区。在一些实施方案中，所述截短型gE蛋白是天然gE蛋白的胞外区。在一些实施方案中，所述截短型gE蛋白是天然gE蛋白的胞外区进一步截短的片段。在一些实施方案中，所述截短型gE蛋白不包含天然gE蛋白的N末端的信号肽序列。

在一些实施方案中，所述截短型gE蛋白是天然gE蛋白(1-623)从C末端截短后的片段，例如从C末端截短1-130个(例如10个、20个、30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个、100个、110个、120个或更多个)氨基酸后得到的片段，任选地还从N末端截短1-50个(例如40个、30个、25个、20个、15个、10个、9个、8个、7个、6个、5个、4个或更少个)氨基酸。在一些实施方案中，所述截短型gE蛋白是去除了信号肽区域的天然gE蛋白胞外区(31-537)从C末端截短1-100个(例如10个、20个、30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个或更多个)氨基酸后得到的片段，任选地还从N末端截短1-30个(例如25个、20个、15个、10个、9个、8个、7个、6个、5个、4个或更少个)氨基酸。在一些实施方案中，所述截短型gE蛋白是从天然gE蛋白(1-623)的C末端截短127个氨基酸后得到的片段，即1-496位片段。在一些实施方案中，所述截短型gE蛋白由天然gE蛋白的第31-496位氨基酸组成(如SEQ ID NO:2所示)。

本发明人惊讶地发现，当采用胞外区第31-496位氨基酸制备截短型gE蛋白时，表达产量与使用其他gE蛋白胞外区(例如第31-537位氨基酸)相比显著提高，能够实现更高的抗原表达量和细胞产率。

针对VZV病毒的疫苗

目前使用的疫苗主要有三种类型：减毒活疫苗、灭活疫苗、基因工程疫苗。减毒活疫苗是利用低毒性为代价诱导机体形成抗体，免疫效果不理想并有安全隐患。灭活疫苗只是在使用阶段使病毒灭活，要生产过程中仍是使用有感染性的病毒，生产环节存在风险。基因工程疫苗通过异源表达病毒的包膜蛋白诱导人体形成抗体，过程中不使用活性病毒，过程安全。

已上市的VZV减毒活疫苗包括有水痘疫苗和带状疱疹疫苗，减毒水痘疫苗当前均为Oka株制备，免疫1针或者两针后可获得较好的免疫原性；减毒带状疱疹疫苗的免疫效果很差，只有50～60％的有效性，有逐渐被重组蛋白疫苗取代之势。无论是减毒活水痘疫苗和带状疱疹疫苗在使用过程中均存在着风险。Merck公司生产的带状疱疹减毒活疫苗(Zostavax)即采用Oka减毒株生产。GSK公司生产的Shingrix是一种含有重组糖蛋白E和新型佐剂(AS01B)的带状疱疹亚单位疫苗。Shingrix于2017年10月获得FDA批准用于预防≥50岁成人带状疱疹。

疫苗组合物的制备

VZV gE蛋白的制备通常是通过在培养细胞中表达或通过化学合成来实现。本公开中的宿主细胞可以是适合于表达本公开的抗原的任何细胞，例如经常使用并且适合用于产生蛋白质的宿主细胞包括大肠杆菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞。哺乳动物宿主细胞包括中国仓鼠卵巢(CHO细胞)、COS细胞和SP2细胞等。在真核细胞中表达蛋白一般将使得获得的蛋白序列缺少信号肽部分。

表达载体和宿主细胞是可商购获得的，表达载体包含启动子和编码目的蛋白的序列的克隆位点，使得启动子和序列可操作地连接。可存在其它元件，诸如信号肽序列(有时称为前导序列)、标签序列(例如6-His)、转录终止信号、复制起点以及编码产物的序列。用于转染宿主细胞的方法和程序也是熟知的。如前所述，合适的VZV gE抗原是C末端和/或N末端被截短的VZV gE蛋白。

当将编码目的蛋白的重组表达载体引入宿主细胞中时，通过将宿主细胞培养一段时间从而允许目的蛋白在宿主细胞中表达或将目的蛋白分泌到培养宿主细胞的培养基中来产生目的蛋白。可以使用标准蛋白质纯化方法从培养基中回收目的蛋白。

优选地，将gE截短蛋白抗原与特定的佐剂组合来制备疫苗组合物。疫苗组合物的形式可以有水溶液、水包油、油包水、脂质体等。良好的佐剂能促进激发体内产生足够的细胞免疫和体液免疫应答，达到保护效果。目前获批使用的佐剂大致可以分为两种：一种是刺激免疫应答的佐剂，通过与先天性免疫细胞上的受体连接，增强抗原的免疫原性，如CpG1018；另一种是配合疫苗递送的佐剂，将必要量的疫苗抗原和免疫刺激剂呈递给免疫系统以诱导免疫，如铝佐剂、乳剂。

本发明的疫苗组合物可通过将截短gE蛋白与各种本领域已知的佐剂按一定比例混合来制备。所述佐剂包括但不限于，TLR(Toll样受体)激动剂、NOD激动剂、CLR(C型凝集素受体)激动剂、RLR激动剂、铝佐剂(例如氢氧化铝、磷酸铝)、含角鲨烯水包油乳剂(例如MF59)、AS0佐剂(例如AS01、AS03、AS04)、皂苷佐剂、α-半乳糖基神经酰胺衍生的佐剂、多糖佐剂。

在一些实施方案中，所述佐剂包含铝佐剂、含角鲨烯水包油乳剂或脂质体运载的佐剂。进一步地，所述佐剂还包含激动剂佐剂，例如TLR激动剂佐剂如CpG ODN，优选CpG1018。CpG1018属于CpG寡聚体脱氧核糖核苷酸(CpG ODN)类别，是22-mer未甲基化的CpG-B类寡核苷酸。CpG ODN作为Toll样受体9(TLR9)的激动剂，可以刺激表达TLR9的细胞并激活下游天然免疫反应通路，一方面诱导I型干扰素和炎症因子表达，另一方面使浆细胞样树突状细胞成熟，从而增强体液免疫和细胞免疫反应。可被内吞体摄取，引起干扰素分泌增多，并通过促进抗原的交叉提呈，有效活化抗原特异性T细胞。

MF59或MF59类似物是早批准使用的临床佐剂之一，是一种水油乳剂佐剂，主要由角鲨烯、吐温80和Span85组成，其水包油设计明显降低了粘度，增强了人体耐受性。角鲨烯属于油相成分，广泛分布于动植物及人体内，兼具生物兼容性和可降解性的特点。吐温80和Span85是表面活性剂，增强了乳剂的稳定性。MF59是病毒类疫苗的理想佐剂，当其在与流感、HIV等疫苗联合使用时，可明显增强抗体滴度，且在不同人群中耐受性均良好。其能促进抗原摄取、招募大量免疫细胞进入注射部位，并且能招募单核细胞和中性粒细胞提呈抗原并将其转运入淋巴结。当其与CpG联合使用时，其诱导了高于单独佐剂的抗体滴度和Th1型应答。

在一方面，本发明提供了MF59和CpG的组合用于制备疱疹病毒疫苗组合物。本发明人发现，当MF59和CpG组合使用时，能显著提高抗原的免疫原性，具有很好的协同作用。同时采用MF59(或MF59类似物)与CpG ODN两种佐剂能够协同性地诱导抗原特异性的细胞免疫应答，所产生的疫苗组合物具有强的诱导特异性体液免疫和细胞免疫应答的能力。

带状疱疹感染引起的疾病或症状

带状疱疹是由水痘-带状疱疹病毒(VZV)在原发性水痘感染期间获得再激活引起的，主要特征为皮区疼痛和丘疹；疼痛通常先于皮疹几天出现，且在皮疹消退后可持续数月；皮疹往往在单个皮区出现，通常在4-5周内消退，常见并发症包括带状疱疹后遗神经痛(PHN)以及VZV肺炎。

在老年人中，与年龄相关的VZV特异性功能性T细胞介导免疫的丧失与HZ发病率的增加相一致。VZV特异性T细胞介导的免疫对带状疱疹(HZ)的最佳恢复也至关重要。在HZ皮疹发生后的第一周，VZV特异性T细胞介导的免疫反应的大小与HZ疾病的严重程度和出现疱疹后神经痛的风险呈负相关。

在一方面，本发明提供了疫苗组合物在制备预防或改善带状疱疹和/或带状疱疹后遗症的药物中的用途。

包含截短型gE蛋白的组合物的应用

在一个方面，本发明提供利用将有效量的截短型gE蛋白或编码的多核苷酸，或者包含它们的药物组合物作为治疗剂或预防剂施用、接种于受试者。

对于预防剂和治疗剂，应考虑到不同患者的临床状态(特别是预防剂和治疗剂单独使用时的副作用)、送达部位、施用方法、施用计划以及本领域技术人员所知的其它因素进行施用本领域技术人员将会理解，合适的剂量可因受试者而异。确定最佳剂量通常涉及治疗益处水平与任何风险或有害副作用的平衡。所选择的剂量水平将取决于多种因素，包括但不限于特定施用物的活性，施用路径，施用时间，以及患者的种类、性别、年龄、体重、一般健康状况和以前的病史。施用物的量和施用途径最终由医生、兽医或临床医师决定，但通常选择剂量以达到实现所需效果的作用部位处的局部浓度，而不会导致实质性的有害或不利副作用。

本发明的截短型gE蛋白以及使用其制备的疫苗组合物或疫苗制品可以通过各种途径体内施用至有需要的受试者，所述途径为疫苗施用的常见途径，包括但不限于皮下、肌肉、鼻内、口服施用。优选地，施用以皮下或肌内注射进行。

本发明中要施用的截短型gE蛋白通常以液体形式(例如注射剂)施用，在使用前可通过缓冲液稀释到期望的浓度。

本发明的截短型gE蛋白可以与药学上可接受的载剂一起配制成药物组合物。所谓“药学上可接受的载剂”指非毒性的固体、半固体或液体的填充剂、稀释剂、包被材料或任意形式的制剂辅剂。

载剂可适当含有微量添加剂，如等渗性和化学稳定性高的物质。这些物质在所用的给药量和浓度下对受体无毒性，这种物质如：磷酸盐、柠檬酸盐、琥珀酸盐、乙酸，及其他有机酸或其盐的缓冲剂；抗氧化剂比如抗坏血酸，低分子量(少于10个残基)的多肽、例如、聚精氨酸或三肽；蛋白、如血清白蛋白、明胶，或免疫球蛋白；亲水聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸、如甘氨酸、谷氨酸、天冬氨酸，或精氨酸；单糖、二糖，及其他碳水化合物包括纤维素或其衍生物、葡萄糖、甘露糖，或糊精；螯合剂如乙二胺四乙酸；糖醇如甘露醇或山梨糖醇；平衡离子如钠；和/或非离子型表面活性剂如聚山梨酸酯、泊洛沙姆、或PEG。

治疗上可施用的任何药剂可以是不含作为有效成分病毒之外的生物或病毒的状态，即无菌状态。通过灭菌过滤膜(例如0.2micron的膜)过滤可以容易地实现无菌状态。一般而言，治疗剂/预防剂均置于具有无菌入口的容器中，例如，可以用皮下注射针刺穿的带有瓶塞的静脉内用溶液袋，或带有瓶塞的小瓶中。

治疗剂/预防剂通常储存于单位用量或多用量容器，例如密封的安瓿瓶或小瓶中，作为水溶液或需要再构建的冷冻干燥制剂储存。作为冷冻干燥配置物的例子，如10-ml的小瓶中填充5ml经灭菌过滤的1％(w/v)治疗剂/预防剂水溶液，将所得的混合物冷冻干燥。冷冻干燥的治疗剂/预防剂用注射用无菌水再构建可以制备注入的溶液。

可与本发明的疫苗组合物联合施用的治疗剂/预防剂例如但不限于：化学治疗剂，抗生素，固醇或非固醇类抗炎药，现有的免疫治疗剂/预防剂，其它细胞因子和/或增殖因子等。所谓组合，例如作为组合物同时施用，分别地但同时或并行施用，或按时间顺序施用。

试剂盒

本发明提供具有充满本发明治疗剂/预防剂的一种或以上成分的一个或多个容器制药包装或试剂盒。上述容器还附有规范药物或生物制品的制备、使用或销售的政府机关所规定形式的通知，所述通知标明有关政府机关对于施用于人的制造、使用或销售予以认可。

本发明的有益效果

本发明惊讶地发现，当采用胞外区N端31-496氨基酸制备截短型gE蛋白，在保留其抗原表位的同时，其表达产量明显提高，与佐剂配合使用，具有强的诱导特异性体液免疫和细胞免疫应答的能力。

本发明所述含新型佐剂重组带状疱疹病毒疫苗与当前市场已有的进口重组带状疱疹病毒疫苗(Shingrix,GSK)相比，其在动物水平上表现出安全性与免疫原性结果相当，其主要优点在于：

可以帮助免疫接种人群有效预防水痘-带状疱疹病毒感染；

该新型佐剂重组带状疱疹病毒疫苗含有新的佐剂系统；

该新型佐剂重组带状疱疹病毒疫苗较国外进口疫苗(Shingrix)价格低廉，可及性高。

实施例

给出以下实施例仅用于举例说明本发明的各种实施方案的目的，它们不意味着限制本发明。

实施例1：稳定细胞株构建、蛋白表达与纯化

1.gE31-496蛋白选择及基因合成

通过数据检索，选择NCBI数据库中的gE蛋白保守区域氨基酸序列来进行基因序列优化，选择CHO细胞偏爱密码子，进行密码子优化及全基因合成，同时为了促进蛋白的分泌表达，提高哺乳动物细胞蛋白表达水平，引入IL10信号肽序列。在目的基因的5’和3’端分别引入限制性内切酶HindIII和EcorI的识别位点，利用PCR扩增技术扩增合成的单链DNA引物连接得到目标片段；再利用PCR扩增技术将目标片段拼接成全长序列。核苷酸序列如SEQ IDNO:1所示，该序列中包含了信号肽和gE胞外区成熟蛋白的第31-496位截短蛋白的编码序列。

以同样的方法构建连接有IL-10信号肽序列的gE蛋白31-537位的截短蛋白的编码序列。

2.gE蛋白表达载体构建

本发明中使用的真核表达载体PEE12.4，携带AmpR抗性基因以及GS筛选基因，该载体使用巨细胞病毒(CMV)启动子/增强子序列来进行目的基因的表达。

利用限制性内切酶HindIII和EcoRI对载体PEE12.4进行双酶切，最后将回收纯化后的PEE12.4载体DNA与目的基因DNA片段进行重组连接，将重组连接产物加入到感受态细胞中，得到若干单克隆阳性菌落，从中分别挑取部分进行PCR扩增及验证鉴定(图1)，从而获得大量抽提的质粒。

3.稳定转染细胞株筛选及蛋白的表达与纯化

将上述2得到的质粒转染至宿主细胞CHO-K1，对迷你细胞群进行筛选，对表达量较高的细胞群进行亚克隆筛选。筛选到的克隆进行补料培养，收集上清检测目的蛋白，综合细胞生长情况、蛋白表达量、终末乳酸含量以及相关产品质量，选择最优克隆3株。将细胞株经补料培养扩大培养，收获的培养上清中目的蛋白。gE31-496截短蛋白(其氨基酸序列如SEQID NO:2所示)的含量平均值在4-5g/L，远高于同样方法构建的gE31-537稳定转染细胞株的目的蛋白表达量(1.5-2g/L)。

表1：gE截短蛋白的产率

实施例2：对含gE蛋白疫苗组合物的免疫原性评价

将实施例1产生的截短型gE31-496蛋白纯化后与MF 59+CpG佐剂(MF59：供应商Invivogen，货号vac-adx-10；CpG1018：供应商Novus，货号：NBP2-31142)混合均匀，从而制备成含新型佐剂重组带状疱疹疫苗。进行动物实验。同样地制备截短型gE31-537蛋白与MF59+CpG佐剂混合的疫苗作为对照。

动物实验步骤如下：

选择6-8周龄的C57BL/6小鼠随机分组，每组6只。采用减毒水痘疫苗(上海生物制品研究所有限责任公司)对C57BL/6小鼠进行预免疫并采血，35天后分别对各组小鼠进行第一针免疫，28天后进行第二次免疫，具体免疫程序见表2。其中，每只小鼠的MF59使用量是25μl。第56-58天对各组C57BL/6小鼠进行取血后运用ELISA法检测诱导产生的特异性gE蛋白总IgG抗体滴度。同时采集脾脏，分离脾淋巴细胞运用ELISPOT法检测INF-γ、IL-2的表达。具体结果如表3所示。

从结果可以看出，本发明的截短体gE蛋白(31-496)及其疫苗组合物具有良好的免疫原性，与成熟gE31-537胞外区蛋白比较，免疫原性相当。MF59+CpG具有非常好的协同作用，可以作为带状疱疹疫苗候选。

表2.动物实验疫苗编号及其组合物组成信息

表3.免疫原性评价结果汇总

*与gE31-537(5μg)+MF59+CpG1018(10μg)比较具有显著性差异(p＜0.05)

在相同的条件下，测试了使用氢氧化铝(供应商Invivogen，货号vac-alu-250)代替MF59制备的截短gE蛋白(31-496)疫苗组合物的免疫原性结果。

表4.免疫原性评价结果汇总

*与gE31-537(5μg)+氢氧化铝(50μg)+CpG1018(10μg)比较具有显著性差异(p＜0.05)

结果表明，不管是使用MF59+CpG1018还是氢氧化铝+CpG1018作为佐剂，gE31-496疫苗组合物的免疫原性效果均显著优于gE31-537截短蛋白疫苗组合物。在使用MF59+CpG1018作为佐剂的情况下，相比于氢氧化铝+CpG1018作为佐剂，两种截短蛋白的疫苗组合物在IgG产生、IFN-γ和IL-2方面均显著提高，表明MF59+CpG1018相比于氢氧化铝+CpG1018的优势。而在单独使用MF59或氢氧化铝作为佐剂时，MF59在产生IgG方面是不如氢氧化铝的，因此MF59+CpG1018的组合产生了协同作用。

本发明涉及的序列如下：

SEQ ID No:1编码重组水痘-带状疱疹病毒gE31-496截短蛋白的核苷酸序列，其中方框内为起始密码子，下划线部分为信号肽序列，其余部分为gE31-496序列

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SEQ ID No:2重组水痘-带状疱疹病毒gE31-496截短蛋白的氨基酸序列(不含信号肽)：

SVLRYDDFHIDEDKLDTNSVYEPYYHSDHAESSWVNRGESSRKAYDHNSPYIWPRNDYDGFLENAHEHHGVYNQGRGIDSGERLMQPTQMSAQEDLGDDTGIHVIPTLNGDDRHKIVNVDQRQYGDVFKGDLNPKPQGQRLIEVSVEENHPFTLRAPIQRIYGVRYTETWSFLPSLTCTGDAAPAIQHICLKHTTCFQDVVVDVDCAENTKEDQLAEISYRFQGKKEADQPWIVVNTSTLFDELELDPPEIEPGVLKVLRTEKQYLGVYIWNMRGSDGTSTYATFLVTWKGDEKTRNPTPAVTPQPRGAEFHMWNYHSHVFSVGDTFSLAMHLQYKIHEAPFDLLLEWLYVPIDPTCQPMRLYSTCLYHPNAPQCLSHMNSGCTFTSPHLAQRVASTVYQNCEHADNYTAYCLGISHMEPSFGLILHDGGTTLKFVDTPESLSGLYVFVVYFNGHVEAVAYTVVST

SEQ ID NO:3全长gE蛋白

mgtvnkpvvg vlmgfgiitg tlritnpvra svlryddfhi dedkldtnsv yepyyhsdhaesswvnrges srkaydhnsp yiwprndydg flenahehhg vynqgrgids gerlmqptqm saqedlgddtgihviptlng ddrhkivnvd qrqygdvfkg dlnpkpqgqr lievsveenh pftlrapiqr iygvrytetwsflpsltctg daapaiqhic lkhttcfqdv vvdvdcaent kedqlaeisy rfqgkkeadq pwivvntstlfdeleldppe iepgvlkvlr tekqylgvyi wnmrgsdgts tyatflvtwk gdektrnptp avtpqprgaefhmwnyhshv fsvgdtfsla mhlqykihea pfdlllewly vpidptcqpm rlystclyhp napqclshmnsgctftsphl aqrvastvyq ncehadnyta yclgishmep sfglilhdgg ttlkfvdtpe slsglyvfvvyfnghveava ytvvstvdhf vnaieergfp ptagqppatt kpkeitpvnp gtspllryaa wtgglaavvllcfviflict akrmrvkayr vdkspynqsm yyaglpvddf edsestdtee efgnaiggsh ggssytvyidktr

本领域技术人员将进一步认识到，在不脱离其精神或中心特征的情况下，本发明可以以其他具体形式来实施。由于本发明的前述描述仅公开了其示例性实施方案，应该理解的是，其他变化被认为是在本发明的范围内。因此，本发明不限于在此详细描述的特定实施方案。相反，应当参考所附权利要求来指示本发明的范围和内容。

Claims (21)

1.一种截短的gE蛋白，其由以下组成：

(a)天然gE蛋白全长氨基酸序列的31-496位氨基酸的片段；

(b)天然gE蛋白全长氨基酸序列的31-537位氨基酸在C末端截短1-50个氨基酸的片段；或

(c)与SEQ ID NO：1编码的氨基酸序列或如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列具有至少90％、95％或99％同一性的氨基酸序列。

2.权利要求1的截短的gE蛋白，其由SEQ ID NO：1编码的氨基酸序列或如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列组成。

3.一种核酸分子，其编码权利要求1或2的截短的gE蛋白。

4.一种载体，其包含权利要求3的核酸分子。

5.一种宿主细胞，其包含权利要求3的核酸分子或权利要求4的载体。

6.一种药物组合物(如疫苗组合物)，其包含如权利要求1或2所述的截短的gE蛋白或者权利要求3的核酸分子，以及药学上可接受的载剂和/或佐剂。

7.权利要求6的药物组合物，其中所述佐剂选自铝佐剂、AS0佐剂、角鲨烯水包油佐剂、皂苷佐剂、α-半乳糖基神经酰胺衍生佐剂、多糖佐剂、诱导机体产生免疫应答的激动剂(例如TLR激动剂、NOD激动剂、CLR激动剂、RLR激动剂)及其任意组合。

8.权利要求7的药物组合物，其中所述佐剂是角鲨烯水包油佐剂与TLR激动剂例如CpGODN的组合。

9.权利要求8的药物组合物，其中所述含角鲨烯水包油佐剂是MF59或MF59类似物，和/或所述CpG ODN是CpG1018。

10.权利要求7的药物组合物，其中所述佐剂是铝佐剂例如氢氧化铝与TLR激动剂例如CpG ODN的组合。

11.一种制备如权利要求1或2所述的截短的gE蛋白的方法，其包括以下步骤：

-在合适的条件下培养转染有权利要求4的载体的宿主细胞；和

-从所述宿主细胞的上清液中分离所述截短的gE蛋白。

12.根据权利要求1或2所述的截短的gE蛋白或权利要求3的核酸分子在制备用于预防或减轻受试者中的水痘-带状疱疹病毒感染的疫苗组合物中的用途。

13.根据权利要求1或2所述的截短的gE蛋白或权利要求3的核酸分子在制备用于预防或治疗受试者中与水痘-带状疱疹病毒相关的疾病或病症的药物中的用途。

14.根据权利要求12或13所述的用途，其中所述受试者为人或非人哺乳动物，优选为人。

15.根据权利要求14所述的用途，其中所述与水痘-带状疱疹病毒相关的疾病选自水痘、带状疱疹和带状疱疹后遗神经痛。

16.一种试剂盒，其包含容器，所述容器包含如权利要求1所述的截短的gE蛋白或者权利要求3的核酸分子。

17.角鲨烯水包油佐剂与CpG ODN的组合，其用作带状疱疹疫苗组合物中的佐剂。

18.权利要求17的组合，其中所述角鲨烯水包油佐剂是MF59或MF59类似物，和/或所述CpG ODN是CpG1018。

19.根据权利要求17或18所述的组合在制备用于预防或减轻受试者中的水痘-带状疱疹病毒感染和与水痘-带状疱疹病毒相关的疾病或病症的疫苗组合物中的用途。

20.根据权利要求19所述的用途，其中所述疫苗组合物包含天然gE蛋白、其片段(例如胞外区片段如天然gE蛋白全长氨基酸序列的31-537位氨基酸)或变体。

21.根据权利要求20所述的用途，其中所述疫苗组合物包含如权利要求1或2所示的截短的gE蛋白。