CN117074673A - 一种定量检测重组带状疱疹疫苗或/和原液比活性的方法 - Google Patents
一种定量检测重组带状疱疹疫苗或/和原液比活性的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN117074673A CN117074673A CN202311345008.7A CN202311345008A CN117074673A CN 117074673 A CN117074673 A CN 117074673A CN 202311345008 A CN202311345008 A CN 202311345008A CN 117074673 A CN117074673 A CN 117074673A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- specific activity
- vzv
- herpes zoster
- stock solution
- inhibition
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 230000000694 effects Effects 0.000 title claims abstract description 58
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 50
- 208000007514 Herpes zoster Diseases 0.000 title claims abstract description 42
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 title claims abstract description 37
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 title claims abstract description 36
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 claims description 43
- 239000012895 dilution Substances 0.000 claims description 28
- 238000010790 dilution Methods 0.000 claims description 28
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 claims description 24
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 claims description 24
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 22
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 22
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 22
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 claims description 20
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 17
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 15
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 15
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 14
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 14
- 238000011161 development Methods 0.000 claims description 11
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 10
- 230000002745 absorbent Effects 0.000 claims description 9
- 239000002250 absorbent Substances 0.000 claims description 9
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 9
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 8
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 8
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 claims description 8
- 238000000576 coating method Methods 0.000 claims description 8
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 claims description 6
- 238000007865 diluting Methods 0.000 claims description 6
- 238000011068 loading method Methods 0.000 claims description 6
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 4
- UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine Chemical compound CC1=C(N)C(C)=CC(C=2C=C(C)C(N)=C(C)C=2)=C1 UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 238000007789 sealing Methods 0.000 claims description 2
- 239000012089 stop solution Substances 0.000 claims description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 abstract description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 2
- 241000701085 Human alphaherpesvirus 3 Species 0.000 description 42
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 24
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 10
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 9
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 7
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 6
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 6
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 4
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 3
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 3
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 3
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 210000005036 nerve Anatomy 0.000 description 2
- 239000012898 sample dilution Substances 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 206010015150 Erythema Diseases 0.000 description 1
- 208000003098 Ganglion Cysts Diseases 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 101000807236 Human cytomegalovirus (strain AD169) Membrane glycoprotein US3 Proteins 0.000 description 1
- 208000005400 Synovial Cyst Diseases 0.000 description 1
- 238000010009 beating Methods 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 1
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 231100000321 erythema Toxicity 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 208000004296 neuralgia Diseases 0.000 description 1
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 1
- 230000001953 sensory effect Effects 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012086 standard solution Substances 0.000 description 1
- 230000009897 systematic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 1
- 239000012224 working solution Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
- G01N33/56983—Viruses
- G01N33/56994—Herpetoviridae, e.g. cytomegalovirus, Epstein-Barr virus
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/531—Production of immunochemical test materials
- G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
- G01N33/535—Production of labelled immunochemicals with enzyme label or co-enzymes, co-factors, enzyme inhibitors or enzyme substrates
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Virology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明属于生物医药技术领域，尤其涉及一种定量检测重组带状疱疹疫苗或/和原液比活性的方法，包括准备待检样品和VZV免疫球蛋白抗体、包被抗原和抑制、封闭加样、加二抗及显色和确定比活性值步骤。本发明中方法能够定量的准确检测出比活性，操作简单，有良好的稳定性和重现性，适用于带状疱疹疫苗及其原液比活性的检测。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，尤其涉及一种定量检测重组带状疱疹疫苗或/和原液比活性的方法。
背景技术
水痘-带状疱疹病毒(varicella zoster virus，VZV)属疱疹病毒亚科，即人疱疹病毒3型，是双链DNA病毒，病毒颗粒150~200nm，病毒糖蛋白E(gE)是宿主免疫系统识别的最主要糖蛋白。VZV的初次感染一般发生在幼儿期，以水痘为其主要临床表现。该病毒有极高的自然感染率，据报道全世界＞50岁人群中约99%的血清VZV呈阳性反应。病毒感染人体后潜伏于机体神经节的神经元内，呈隐匿性感染。当机体免疫力下降时，病毒再次活化并大量复制，可在周围感觉神经及该神经所支配的单侧皮节发生免疫反应，引起以红斑、簇集分布的水疱以及神经痛为主要特征的带状疱疹，接种带状疱疹疫苗能有效的预防带状疱疹发病率。
目前，国内尚无自主研发的重组带状疱疹疫苗上市，且并未收录于《中国药典》中。通过对中英文专利检索，并未发现明确地应用竞争ELISA法测定重组带状疱疹疫苗及其原液的比活性专利，因此在重组带状疱疹疫苗的研制过程中，急需建立一种有效测定带状疱疹疫苗及原液的比活性检测方法，适用于产品比活性的放行。
中国专利CN 110231481的说明书中记载了一种水痘-带状疱疹病毒病毒滴度的快速检
测方法，在传统的VZV抗原的双抗体夹心ELISA检测方法的基础上，通过增加已知滴度的VZV样品进行定量标定，绘制VZV抗原含量滴度曲线，来测定水痘-带状疱疹病毒的病毒滴度，该检测方法操作简单快捷，相对传统的pfu测定方法，极大提高了水痘带状疱疹病毒滴度的检测效率，特别适用于的病毒快速测定。但这个专利中检测方法不能定量准确测定比活性值，无法确定性的确定重组带状疱疹疫苗产品是否放行。
发明内容
为了解决以上技术问题，本发明提供一种定量检测重组带状疱疹疫苗或/和原液比活性的方法，能够定量的准确检测出比活性，操作简单，有良好的稳定性和重现性，适用于带状疱疹疫苗及其原液比活性的检测。
解决以上技术问题的本发明中的一种定量检测重组带状疱疹疫苗或/和原液比活性的方法，包括以下步骤：
（1）准备待检样品和VZV免疫球蛋白抗体；
（2）包被抗原和抑制：用稀释的gE蛋白包被酶标板，同时将不同稀释倍数的待检样品与VZV免疫球蛋白等体积混合形成抑制混合物；
（3）封闭加样：将经过包被好的酶标板进行封闭，再向封闭好的酶标孔中加入抑制混合物进行反应；
（4）加二抗及显色：将经过HRP标记的二抗加入所述步骤（3）中反应完成的酶标板，再加入TMB底物显色液，终止后用酶标仪读OD450-630值；
（5）确定比活性值：
以已知浓度梯度的标准品做四参数拟合曲线，计算待检样品的IC50值；根据此时VZV国际标准品浓度及稀释倍数，计算待检样品比活性（IU/mg），公式（Ⅰ）如下：
，
其中，CVZV为VZV抗体起始浓度，VVZV为VZV加样体积，DVZV为VZV抗体稀释倍数，IC50为抑制VZV抗体50%时gE抗原浓度，VIC50为IC50处蛋白加样体积。
IC50值为比活性计算中的一个指标，其计算过程为：Excel计算抑制率，不添加抑制物质（此对照孔中混合物中不含游离的gE蛋白，即VZV免疫球蛋白直接与固相上的gE抗原结合）的对照孔的OD值为B0，添加抑制物质的孔的OD值为B，B/B0称为抑制率IC，当抑制率为50%时，此时抑制物与50%的VZV抗体完全结合；再用GraphPad Prism软件分析IC50，得IC50值。
所述人水痘-带状疱疹免疫球蛋白为WHO国际标准品W1044。
所述步骤（5）中标准品也为“人水痘-带状疱疹免疫球蛋白”，来自于WHO国际标准品，货号为W1044。
所述步骤（2）中包被过程包括：用稀释至2μg/mL的gE蛋白按100μL/孔加入酶标板中，2-8℃过夜；
所述抑制过程包括：待检品的起始浓度为2μg/mL，按2倍系列稀释至10个梯度，人水痘-带状疱疹免疫球蛋白稀释度为1000倍或5000倍，两者等体积混合后，2-8℃过夜。
所述步骤（3）中封闭过程包括：用洗涤液洗板5次后，在吸水纸上排干，用2%BSA封闭，300μL/孔，37℃封闭2h。
所述步骤（3）中加样过程包括：用洗涤液洗板5次后，在吸水纸上排干，将抑制混合物按100μL/孔，室温孵育1h。
所述步骤（4）中加二抗过程包括：用洗涤液洗板5次后，在吸水纸上排干，用含0.05%BSA的二抗稀释液，将二抗稀释至5000倍、10000倍或20000倍，100μL/孔，室温孵育1h；
所述步骤（4）中显色过程包括：用洗涤液洗板5次后，在吸水纸上排干，加入TMB显色液，100μL/孔，室温避光显色15min，然后按50μL/孔加入终止液终止反应，用酶标仪读取OD450-630值。
本发明的有益效果是：
本发明首先提供了一种适用于重组带状疱疹疫苗及原液的比活性检测方法，对建立的方法进行专属性、重复性、准确性、中间精密性、线性和范围等系统性验证，结果说明建立的检测方法能定量准确检测出重组带状疱疹疫苗及原液的比活性，为重组带状疱疹疫苗的质量标准提供依据。
附图说明
图1为本发明实施例9中成品标准曲线情况图；
图2为本发明实施例9中原液标准曲线情况图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明中做进一步的阐述，其中gE蛋白、人水痘-带状疱疹免疫球蛋白可从市场购买，羊抗人IgG二抗为北京华诺泰医药科技有限公司生产的市场产品：
实施例1
以梯度稀释的HZ/su标准品（或内标品或样品）中gE蛋白为游离抗原，与VZV免疫球蛋白（NIBSC，编号：W1044）结合，加入包被gE抗原的酶标板中，游离的gE抗原与固相gE抗原相互竞争VZV免疫球蛋白，随着游离gE抗原的减少，抗体与游离gE抗原结合减少，反之与固相gE抗原结合增多，反应平衡后，用酶标记二抗结合并使之显色，检测吸光值。
以已知浓度梯度的标准品做四参数拟合曲线，计算待检品的IC50值，根据此时VZV国际标准品浓度及稀释倍数，计算待检样品比活性值（IU/mg），公式如下：
，
其中，CVZV：VZV抗体起始浓度，VVZV：IC50处抗体加样体积，DVZV：VZV抗体稀释倍数，IC50：抑制VZV抗体50%时gE抗原浓度，VIC50：IC50处蛋白加样体积。
本实施例中所用标准品为VZV国际标准品，也为WHO带状疱疹阳性血清标准品，购自NIBSC，NIBSC代码为W1044。
IC50值为比活性计算中的一个指标，其计算过程为：Excel计算抑制率，不添加抑制物质（此对照孔中混合物中不含游离的gE蛋白，即VZV免疫球蛋白直接与固相上的gE抗原结合）的对照孔的OD值为B0，添加抑制物质的孔的OD值为B，B/B0称为抑制率IC，当抑制率为50%时，此时抑制物与50%的VZV抗体完全结合；再用GraphPad Prism软件分析IC50，得IC50值，以及相应得到IC50处抗体加样体积和IC50处蛋白加样体积。
抑制率（IC）计算公式为IC=B/B0，用Excel计算不同梯度的抑制率，采用Exce处理数据方便。用GraphPad Prism软件分析IC50，前面过程中已经用Excel表格计算出不同梯度的标准品抑制率，而标准品的各个梯度所对应的浓度是已知，将标准品的抑制率和对应浓度输入GraphPad Prism软件中，即可自动生成四参数拟合曲线，同时也自动得到IC50值。
实施例2
比活性检测方法的建立步骤具体如下：
（1）待检样品的准备：
①将重组带状疱疹疫苗和原液稀释至2μg/ml，作为待检品的起始浓度；
②取2μg/ml标准溶液160μl加入酶标板第1列孔中，其余各孔补加样品稀释液80μl，从第1列孔中取80μl加入第2列孔，依此按2倍系列稀释至第10列孔，混匀后吸出80μl弃掉；同时设不含抑制物孔和阴性孔。
酶标板中1~10列为待检品倍比稀释梯度，11列为不含抑制物孔，即不含游离gE蛋白；12列为阴性孔，以稀释液代替待检品；稀释液为含1%BSA的PBS缓冲液。
（2）结合抗体的准备：
将50IU/ml VZV免疫球蛋白（国际标准品）按1:1000稀释
（3）抑制：
将各稀释度VZV免疫球蛋白与抗原等体积混合，即80μl/孔，4℃孵育过夜。
（4）包被抗原：
用1×包被液将gE抗原稀释至2μg/ml作为包被抗原，混匀后，按100μl/孔加入酶标板中，2-8℃过夜。
（5）封闭：将包被好的酶标板甩干，用1×洗涤液300μL/孔，洗板5次，拍干，以300μL/孔封闭液（2%BSA）加至板内，37℃封闭2小时。
（6）加样：将封闭后的酶标板甩干，用1×洗涤液300μL/孔，洗板5次，拍干，样品从稀释板内以100μL/孔加至酶标板内，室温放置1.5h。
（7）加酶标工作液：用二抗稀释液稀释HRP标记山羊抗人IgG 1:5000倍；将酶标板甩干，用1×洗涤液300μL/孔，洗板5次，拍干，将稀释好的二抗以100μL/孔加至酶标板内，室温放置1h。
（8）显色：用1×洗涤液300μL/孔，洗板5次，甩干。用吸水纸擦拭底部。显色液提前30分钟从2-8℃冰箱移至室温避光保存，以100μL/孔加入显色液，室温避光显色15分钟。
（9）读数：450nm和630nm处检测吸光值。
（10）确定比活值：
结果分析如下：
（1）数据处理：
①计算检测值与阴性值（试验过程中，以含1%BSA的PBS缓冲液为稀释液代替待检品，以排除板底自身的干扰）的比值，以此判断数据的可靠性；
②计算检测值与阴性值（即为第12列孔的OD值）的差值，即为真实值；
③Excel计算抑制率，不添加抑制物质的对照孔的OD值为B0，添加了抑制物质的孔的OD值为B，B/B0称为抑制率（IC），当抑制率为50%时，此时抑制物与50%的VZV抗体完全结合；
④GraphPad Prism软件分析IC50，代入以下公式（Ⅰ）中，计算比活性：
，
其中，CVZV：VZV抗体起始浓度，VVZV：VZV加样体积，DVZV：VZV抗体稀释倍数，IC50：抑制VZV抗体50%时gE抗原浓度，VIC50：IC50处蛋白加样体积。
以上计算出来的结果就为确定数值的比活性值。
（2）结果判定：
①检测值（比活性值）与阴性值比值大于2，即S/N＞2，表明数据真实可靠；检测值与阴性值的比值、差值其意义在于排除酶标板自身的干扰，从而使结果更准确。
②同一待检品的10个稀释度所对应抑制率的范围在分散在50%两侧。
本实例中，重组带状疱疹疫苗（CHO细胞）比活性放行标准不低于500IU/mg；原液比活性放行标准不低于500IU/mg。
实施例3
检测条件的确定：
1、待检品浓度的确定
（1）成品：
分别将成品待检样品用一定体积样品稀释液复溶，制成浓度为100μg/ml溶液，用样品稀释液将其稀释至2μg/ml，作为成品待检品起始浓度，按2倍系列稀释，共稀释10个浓度，以此确定待检样品的最佳检测浓度。
（2）原液：
分别将原液用样品稀释液将其稀释至2μg/ml，作为原液的起始浓度，按2倍系列稀释，共稀释10个浓度，以此确定待检样品的最佳检测浓度。
2、人水痘-带状疱疹免疫球蛋白最佳稀释度的确定：
按照说明书将人水痘-带状疱疹免疫球蛋白复溶后，配制成50IU/ml溶液，用样品稀释液按1:1000、1:5000系列稀释，以确定免疫球蛋白的最佳浓度。
3、HRP标记二抗的最佳稀释度的确定：
将HRP标记山羊抗人IgG抗体用二抗稀释液稀释分别按1:5000、1:10000、1:20000稀释，以确定最佳二抗稀释倍数。确定比活值的过程的其它内容如实施例2。
表1
从表1中试验结果可知：
（1）同一样品10个稀释度的抑制率结果显示，1000倍VZV免疫球蛋白（国际标准品）的分散程度优于5000倍的分散程度，其抑制率分布在50%两侧，因此VZV免疫球蛋白的最佳稀释倍数为1:1000。
（2）样品的比活性随HRP标记的羊抗人IgG二抗稀释倍数增大而升高，二抗稀释10000倍时，检测结果较5000倍提升显著，20000倍稀释时，检测结果较10000倍有所提升，但不明显，优选1：10000作为HRP标记的羊抗人IgG二抗的最佳稀释倍数。
实施例4 专属性验证
为了评估所建立方法的交叉反应，采用PBS、空白制剂和供试品疫苗作为待检品，验证方法的专属性。
（1）取PBS、空白制剂和供试品疫苗作为待检品，按照实施例2建立步骤进行检测；
（2）读数：读取450nm和630nm处检测吸光值；
（3）结果分析
原始数据采用双波长数据，按实施例2进行数据处理和分析；
以成品疫苗（202112001）、空白制剂、PBS作为待检品，成品疫苗（202112001）IC50（ng/ml）为14.49±2.40，比活性（IU/mg）为1749.88±289.58，空白制剂和PBS的OD值均超出样品范围。
试验结果表明：
空白制剂和PBS的OD值均超出曲线最大值，说明待检品中不存在特异性抗原与包被的gE抗原竞争VZV免疫球蛋白，因此确定空白制剂和PBS在该方法中对成品疫苗无影响，专属性通过。
实施例5 重复性验证
按照实施例2建立步骤，同一样品，在相同人员及不同设备下，比活性的相对标准偏差（RSD）均在13%以内（RSD≤13%），重复性通过，如表2中所示。
表2
从表2中看出，用本发明中方法测定比活值的重复性好。
实施例6 中间精密性验证
按照实施例2建立步骤操作，同一样品，不同稀释倍数下抑制率的几何变异系数在12%以内（GCV≤12%），如表3中所示。
表3
从表3中看出，用本发明中方法测定比活值的有高的精密性。
实施例7 准确性验证
按照实施例2建立步骤操作，同一样品，经人员A和人员B、不同设备下检测结果的相对标准偏差在12%以内（RSD≤12%），如表4中所示。
表4
从以上表4中可看出，用本发明中方法测定比活值的准确性高。
实施例8 范围验证
按照实施例2建立步骤操作，计算同类待检品比活性范围，成品比活性检测范围在813~1024IU/mg，原液比活性检测范围在720.3~1188IU/mg之间，涵盖了比活性质量标准，范围通过。
实施例9 线性验证
按照实施例2建立步骤操作，分别以成品疫苗（批号：202112001）、原液（批号：20211102）作为待检品，重复检测9次，以gE抗原含量的对数为横坐标，抑制率为纵坐标绘制四参数拟合曲线，如图1所示，9条成品样品的R2分别为0.9933、0.9912、0.9979、0.9927、0.9909、0.9981、0.9930、0.9911、0.9983；如图2所示，9条原液样品R2分别为0.9953、0.9916、0.9950、0.9947、0.9911、0.9946、0.9950、0.9914、0.9949。成品和原液作为待检品，重复9条标准曲线的R2均大于0.990，线性通过。
实施例10 产品放行结果
按照实施例2建立步骤操作，对三批成品、三批稳定性成品以及三批原液进行比活性检测，结果显示，成品的比活性为：1036.44±206.13，放置热稳定性（25℃）6个月后比活性为：974.34±202.09，原液比活性为：936.40±196.84。考虑批间差、效期及ELISA方法检测精密度等影响因素，重组带状疱疹疫苗（CHO细胞）比活性放行标准不低于500IU/mg；原液比活性放行标准不低于500IU/mg。
上述实施/试验例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
Claims (10)
1.一种定量检测重组带状疱疹疫苗或/和原液比活性的方法，包括以下步骤：
（1）准备待检样品和VZV免疫球蛋白抗体；
（2）包被抗原和抑制：用稀释的gE蛋白包被酶标板，同时将不同稀释倍数的待检样品与VZV免疫球蛋白等体积混合形成抑制混合物；
（3）封闭加样：将经过包被好的酶标板进行封闭，再向封闭好的酶标孔中加入抑制混合物进行反应；
（4）加二抗及显色：将经过HRP标记的二抗加入反应完成的酶标板中，后加入TMB底物显色液，终止后用酶标仪读OD450-630值；
（5）确定比活性值：
以已知浓度梯度的标准品做四参数拟合曲线，计算待检样品的IC50值；根据此时VZV国际标准品浓度及稀释倍数，计算待检样品比活性（IU/mg），公式如下：
，
其中，CVZV为VZV抗体起始浓度，VVZV为VZV加样体积，DVZV为VZV抗体稀释倍数，IC50为抑制VZV抗体50%时gE抗原浓度，VIC50为IC50处蛋白加样体积。
2.根据权利要求1所述的一种定量检测重组带状疱疹疫苗或/和原液比活性的方法，其特征在于：所述步骤（5）中IC50计算过程为：计算抑制率，以不添加抑制物质的对照孔OD值为B0，添加抑制物质的孔OD值为B，B/B0即为抑制率IC，当抑制率为50%时，此时抑制物与50%的VZV抗体完全结合，再用GraphPad Prism软件分析IC50，得IC50值。
3.根据权利要求1所述的一种定量检测重组带状疱疹疫苗或/和原液比活性的方法，其特征在于：所述步骤（2）中包被过程包括：用稀释至2μg/mL的gE蛋白按100μL/孔加入酶标板中，2-8℃过夜。
4.根据权利要求1所述的一种定量检测重组带状疱疹疫苗及原液比活性的方法，其特征在于：所述抑制过程包括：待检品的起始浓度为2μg/mL，按2倍系列稀释至10个梯度，人水痘-带状疱疹免疫球蛋白稀释度为1000倍或5000倍，两者等体积混合后，2-8℃过夜。
5.根据权利要求4所述的一种定量检测重组带状疱疹疫苗或/和原液比活性的方法，其特征在于：所述人水痘-带状疱疹免疫球蛋白稀释度为1000倍。
6.根据权利要求1所述的一种定量检测重组带状疱疹疫苗或/和原液比活性的方法，其特征在于：根据权利要求1所述的一种检测重组带状疱疹疫苗比活性的方法，其特征在于：所述步骤（3）中封闭过程包括：用洗涤液洗板5次后，在吸水纸上排干，用2%BSA封闭，300μL/孔，37℃封闭2h。
7.根据权利要求1所述的一种定量检测重组带状疱疹疫苗或/和原液比活性的方法，其特征在于：所述步骤（3）中加样过程包括：用洗涤液洗板5次后，在吸水纸上排干，将抑制混合物按100μL/孔，室温孵育1h。
8.根据权利要求1所述的一种定量检测重组带状疱疹疫苗或/和原液比活性的方法，其特征在于：所述步骤（4）中加二抗过程包括：用洗涤液洗板5次后，在吸水纸上排干，用含0.05%BSA的二抗稀释液，将二抗稀释至5000倍、10000倍或20000倍，100μL/孔，室温孵育1h。
9.根据权利要求8所述的一种定量检测重组带状疱疹疫苗或/和原液比活性的方法，其特征在于：所述二抗稀释至10000倍。
10.根据权利要求1所述的一种定量检测重组带状疱疹疫苗或/和原液比活性的方法，其特征在于：所述步骤（4）中显色过程包括：用洗涤液洗板5次后，在吸水纸上排干，加入TMB显色液，100μL/孔，室温避光显色15min，然后按50μL/孔加入终止液终止反应，用酶标仪读取OD450-630值。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311345008.7A CN117074673B (zh) | 2023-10-18 | 2023-10-18 | 一种定量检测重组带状疱疹疫苗或/和原液比活性的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311345008.7A CN117074673B (zh) | 2023-10-18 | 2023-10-18 | 一种定量检测重组带状疱疹疫苗或/和原液比活性的方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN117074673A true CN117074673A (zh) | 2023-11-17 |
| CN117074673B CN117074673B (zh) | 2024-05-28 |
Family
ID=88706553
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202311345008.7A Active CN117074673B (zh) | 2023-10-18 | 2023-10-18 | 一种定量检测重组带状疱疹疫苗或/和原液比活性的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN117074673B (zh) |
Citations (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104360055A (zh) * | 2014-11-07 | 2015-02-18 | 山东泰邦生物制品有限公司 | 测定水痘-带状疱疹病毒中和抗体的试剂盒及生产方法 |
| JP2017096985A (ja) * | 2017-02-24 | 2017-06-01 | 田中貴金属工業株式会社 | 水痘帯状疱疹ウイルス検出用免疫クロマト分析装置 |
| CN107033226A (zh) * | 2017-06-27 | 2017-08-11 | 中国农业科学院兰州兽医研究所 | 一种小反刍兽疫病毒f蛋白抗原表位肽及其确定、制备方法和应用 |
| CN107632154A (zh) * | 2017-08-31 | 2018-01-26 | 王明丽 | 一种HCMV pp65抗原血症竞争抑制ELISA法检测试剂盒及其检测方法 |
| CN109085354A (zh) * | 2018-07-25 | 2018-12-25 | 武汉生命科技股份有限公司 | 水痘-带状疱疹病毒中和抗体的检测试剂盒及其检测方法 |
| CN110231481A (zh) * | 2019-07-22 | 2019-09-13 | 长春祈健生物制品有限公司 | 一种水痘-带状疱疹病毒病毒滴度的快速检测方法 |
| CN113943354A (zh) * | 2021-10-11 | 2022-01-18 | 中国农业科学院上海兽医研究所(中国动物卫生与流行病学中心上海分中心) | 一种重组猫疱疹病毒gB蛋白抗原及其在抗体诊断和疫苗制备中的应用 |
| CN115927755A (zh) * | 2022-11-22 | 2023-04-07 | 辽宁成大生物股份有限公司 | 一种微量水痘-带状疱疹病毒的检测方法和应用 |
| CN116041488A (zh) * | 2022-08-19 | 2023-05-02 | 成都华任康生物科技有限公司 | 检测重组水痘-带状疱疹病毒糖蛋白E(gE)的单克隆抗体及其应用 |
| CN116655748A (zh) * | 2023-02-28 | 2023-08-29 | 易慧生物技术(上海)有限公司 | 一种截短型水痘-带状疱疹病毒gE蛋白及其应用 |
-
2023
- 2023-10-18 CN CN202311345008.7A patent/CN117074673B/zh active Active
Patent Citations (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104360055A (zh) * | 2014-11-07 | 2015-02-18 | 山东泰邦生物制品有限公司 | 测定水痘-带状疱疹病毒中和抗体的试剂盒及生产方法 |
| JP2017096985A (ja) * | 2017-02-24 | 2017-06-01 | 田中貴金属工業株式会社 | 水痘帯状疱疹ウイルス検出用免疫クロマト分析装置 |
| CN107033226A (zh) * | 2017-06-27 | 2017-08-11 | 中国农业科学院兰州兽医研究所 | 一种小反刍兽疫病毒f蛋白抗原表位肽及其确定、制备方法和应用 |
| CN107632154A (zh) * | 2017-08-31 | 2018-01-26 | 王明丽 | 一种HCMV pp65抗原血症竞争抑制ELISA法检测试剂盒及其检测方法 |
| CN109085354A (zh) * | 2018-07-25 | 2018-12-25 | 武汉生命科技股份有限公司 | 水痘-带状疱疹病毒中和抗体的检测试剂盒及其检测方法 |
| CN110231481A (zh) * | 2019-07-22 | 2019-09-13 | 长春祈健生物制品有限公司 | 一种水痘-带状疱疹病毒病毒滴度的快速检测方法 |
| CN113943354A (zh) * | 2021-10-11 | 2022-01-18 | 中国农业科学院上海兽医研究所(中国动物卫生与流行病学中心上海分中心) | 一种重组猫疱疹病毒gB蛋白抗原及其在抗体诊断和疫苗制备中的应用 |
| CN116041488A (zh) * | 2022-08-19 | 2023-05-02 | 成都华任康生物科技有限公司 | 检测重组水痘-带状疱疹病毒糖蛋白E(gE)的单克隆抗体及其应用 |
| CN115927755A (zh) * | 2022-11-22 | 2023-04-07 | 辽宁成大生物股份有限公司 | 一种微量水痘-带状疱疹病毒的检测方法和应用 |
| CN116655748A (zh) * | 2023-02-28 | 2023-08-29 | 易慧生物技术(上海)有限公司 | 一种截短型水痘-带状疱疹病毒gE蛋白及其应用 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| YAN NIU等: "《Development of an Indirect ELISA Kit for Rapid Detection of Varicella-Zoster Virus Antibody by Glycoprotein E》", 《FRONT MICROBIOL .》, vol. 13, pages 897752 * |
| 周钦等: "水痘-带状疱疹病毒抗原的ELISA定量检测方法的建立", 《中国免疫学杂志》, vol. 29, no. 05, pages 542 - 545 * |
| 国家药典委员会: "《新药临床前评价教程》", 浙江科学技术出版社, pages: 361 - 364 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN117074673B (zh) | 2024-05-28 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Whiteman et al. | Virus reduction neutralization test: A single-cell imaging high-throughput virus neutralization assay for dengue | |
| CN110231481B (zh) | 一种水痘-带状疱疹病毒病毒滴度的快速检测方法 | |
| Chen et al. | A flow cytometry-based assay to assess RSV-specific neutralizing antibody is reproducible, efficient and accurate | |
| CN112409462B (zh) | 一种SARS-CoV-2特异性抗原和SARS-COV-2免疫球蛋白的检测试剂盒 | |
| CN103076455A (zh) | 快速定量检测血清淀粉样蛋白a试剂盒及其制备和应用 | |
| CN117074673B (zh) | 一种定量检测重组带状疱疹疫苗或/和原液比活性的方法 | |
| US11604192B2 (en) | Immunoassay for detecting Zika virus infection | |
| WO2023216517A1 (zh) | 计算样品的IgA免疫活动性指数的方法及装置 | |
| CN116836938A (zh) | 一株产生抗iii型鸭甲型肝炎病毒vp1蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用 | |
| CN108303533A (zh) | 一种脊髓灰质炎病毒ⅰ型d抗原预包被检测方法及其检测试剂盒和应用 | |
| CN113075405A (zh) | 一种乙肝病毒表面抗原检测试剂盒及其制备方法 | |
| CN105891497A (zh) | 一种降钙素原胶体金免疫比色法定量检测试剂盒及其制备方法 | |
| CN111190020B (zh) | 一种添加猴血清优化通用型生物分析的方法 | |
| CN113092775A (zh) | 一种乙肝病毒表面抗体检测试剂盒及其制备方法 | |
| CN117783524B (zh) | 一种双抗体夹心法间接定量检测柯萨奇a10型病毒抗原的建立与应用 | |
| CN106841606B (zh) | 检测pct的胶体金免疫层析试纸条、试剂盒及其制备方法 | |
| CN108287237A (zh) | 一种脊髓灰质炎病毒ⅱ型d抗原预包被检测方法及其检测试剂盒和应用 | |
| CN113721032B (zh) | 一种新型冠状病毒中和抗体定量检测试剂盒及其应用 | |
| CN116355079B (zh) | 检测重组人轮状病毒vp8抗原（vp8 p[8]）的单克隆抗体及其应用 | |
| CN116023485B (zh) | 检测重组人轮状病毒vp8抗原（vp8 p[6]）的单克隆抗体及其应用 | |
| CN114740201B (zh) | 猪伪狂犬病毒gE和gI抗体化学发光检测试剂盒及其应用 | |
| WO2024139640A1 (zh) | 新冠病毒IgA抗体检测免疫探针、其制备方法及应用 | |
| CN116284354B (zh) | 检测重组人轮状病毒vp8抗原（vp8 p[4]）的单克隆抗体及其应用 | |
| US20210293818A1 (en) | A virus neutralization assay utilizing imaging cytometry | |
| CN113933520B (zh) | 一种通用型抗体药血药浓度检测的单克隆抗体试剂组合、检测方法和试剂盒 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |