CN116041488A - 检测重组水痘-带状疱疹病毒糖蛋白E(gE)的单克隆抗体及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种检测重组水痘‑带状疱疹病毒糖蛋白E(gE)的单克隆抗体及其应用。所述的重组水痘‑带状疱疹病毒糖蛋白E(gE)的单克隆抗体,其重链可变区(VH)氨基酸序列为如SEQ ID NO.1所示,轻链可变区(VL)氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
Description
技术领域
本发明属于医药生物技术领域,具体的,涉及一种检测重组水痘-带状疱疹病毒糖蛋白E(gE)的单克隆抗体及其应用。
背景技术
水痘-带状疱疹病毒(Varicella zoster virus,VZV)属于α型的疱疹病毒,其基因组有124884个碱基对,约包含70个基因的双链线性DNA分子,病毒颗粒呈准圆球形,直径有180-200nm,由内及外分为四层,依次为病毒核心、核衣壳、皮层和囊膜。其囊膜上包含至少9种糖蛋白(Glycoprotein,gp),包括gE、gB、gH、gI、gC、gL、gK、gM和gN,其中gE是表达量最多的VZV糖蛋白之一,是VZV复制的必需蛋白,也是目前功能研究最多的VZV蛋白。
VZV具有嗜淋巴性和嗜神经性,主要由皮损部位疱液中的病毒颗粒通过空气传播。经上呼吸道黏膜或结膜感染后进入机体,在局部细胞内复制,约4-6天即出现原发性病毒血症和前驱症状,约2周出现水疱疹。初次感染水痘后,VZV会移行至感觉神经节背根及三叉神经节,通常终身潜伏,待机体细胞介导的免疫功能削弱或因各种原因导致免疫抑制时,VZV会再激活而引发带状疱疹(HZ)。
重组水痘-带状疱疹病毒苗研发生产过程中对疫苗主要有效成分的质量监控非常重要,以单克隆抗体为核心的酶联免疫吸附试验(ELISA)具有灵敏、快速、耐受性强的优点,可以用于重组水痘-带状疱疹病毒糖蛋白E(gE)抗原生产过程中的质量控制。
基于此,提出本发明。
发明内容
本发明首先涉及一种检测重组水痘-带状疱疹病毒糖蛋白E(gE)的单克隆抗体,
其重链可变区(VH)氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示:
SEQ ID NO.1:
EVQLQQSGPELVKTGASVKISCKASGYSFTGYYIHWVKQSHGKSLEWIGYISCYNGATSYNQKFKGKATFTVDTSSSTAYMLFNSLTSEDSAVYYCARKSNFDYWGQGTSLTVSS;
轻链可变区(VL)氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示,
SEQ ID NO.2:
YVLMTQTPLSLPVNIGDQASISCKSSKSLLNSDGFTYLDWFLQKPGQSPQLLISLVSSRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLNISRVEAEDLGVYYCFQNKYLPYTFGGGTKLEMK。
优选的,所述的单克隆抗体为IgG型抗体,Fc区为鼠源Fc。
本发明还涉及编码所述单克隆抗体的核酸片段。
本发明还涉及所述的单克隆抗体在制备检测试剂盒中的应用,所述的检测试剂盒为:检测重组水痘-带状疱疹病毒疫苗中的重组水痘-带状疱疹病毒糖蛋白E(gE)的浓度的检测试剂盒。
优选的,所述的检测试剂盒为基于双抗夹心法技术原理的检测试剂盒,所述的单克隆抗体为一抗。
一种检测重组水痘-带状疱疹病毒糖蛋白E(gE)的检测试剂盒,所述的试剂盒为基于双抗夹心法技术原理的ELISA检测试剂盒,其包括:
(1)做为包被抗体(一抗)的检测有效量的所述单克隆抗体;
(2)必要的二抗、显色试剂、缓冲试剂;所述的二抗可以是多抗或其他单抗。
所述单克隆抗体的重链可变区(VH)氨基酸序列为如SEQ ID NO.1所示,轻链可变区(VL)氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
优选的,所述的单克隆抗体的的Fc为鼠源Fc。
本发明的有益效果在于,
本发明所述的单克隆抗体1-10D5-10H2,具有灵敏、快速、耐受性强的优点,用于重组水痘-带状疱疹病毒糖蛋白E(gE)抗原生产过程中的质量控制,能够高效精准的定量疫苗中的抗原含量,对疫苗质量进行监控。
附图说明
图1、ELISA检测的标准曲线。
具体实施方式
单克隆抗体1-10D5-10H2由我司自制,其重链可变区(VH)氨基酸序列为:
EVQLQQSGPELVKTGASVKISCKASGYSFTGYYIHWVKQSHGKSLEWIGYISCYNGATSYNQKFKGKATFTVDTSSSTAYMLFNSLTSEDSAVYYCARKSNFDYWGQGTSLTVSS,
其轻链可变区(VL)氨基酸序列为:
YVLMTQTPLSLPVNIGDQASISCKSSKSLLNSDGFTYLDWFLQKPGQSPQLLISLVSSRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLNISRVEAEDLGVYYCFQNKYLPYTFGGGTKLEMK,
恒定区(Fc)区为鼠源Fc。
其他试剂若无特别说明,均为国产分析纯。
使用的gE蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示:
SEQ ID NO.3:
SVLRYDDFHTDEDKLDTNSVYEPYYHSDHAESSWVNRGESSRKAYDHNSPYIWPRNDYDGFLENAHEHHGVYNQGRGIDSGERLMQPTQMSAQEDLGDDTGIHVIPTLNGDDRHKIVNVDQRQYGDVFKGDLNPKPQGQRLIEVSVEENHPFTLRAPIQRIYGVRYTETWSFLPSLTCTGDAAPAIQHICLKHTTCFQDVVVDVDCAENTKEDQLAEISYRFQGKKEADQPWIVVNTSTLFDELELDPPEIEPGVLKVLRTEKQYLGVYIWNMRGSDGTSTYATFLVTWKGDEKTRNPTPAVTPQPRGAEFHMWNYHSHVFSVGDTFSLAMHLQYKIHEAPFDLLLEWLYVPIDPTCQPMRLYSTCLYHPNAPQCLSHMNSGCTFTSPHLAQRVASTVYQNCEHADNYTAYCLGISHMEPSFGLILHDGGTTLKFVDTPESLSGLYVFVVYFNGHVEAVAYTVVSTVDHFVNAIEERGFPPTAGQPPATTKPKEITPVNPGTSPLLRY
辣根过氧化物酶标记的兔多抗为申请人自制产品。
实施例1、ELISA检测方法的建立(定量检测线性范围的确定)
双抗体夹心法ELISA原理:连接于固相载体上的抗体和酶标抗体,与待检抗原上两个不同的抗原决定基结合,形成固相抗体一抗原一酶标抗体复合物。由于反应系统中固相抗体和酶标抗体的量相对于待检抗原是过量的,因此复合物的形成量与待检抗原的含量成正比。测定复合物中酶作用于加入的底物后生成的有色物质量,即可确定待检抗原含量。
1.1、线性范围与抗体工作浓度的确定
(1)按照常规包被条件,将包被的一抗1-10D5-10H2稀释至3μg/ml进行包被(2-8℃包被16-24小时);
(2)次日用PBST清洗掉未结合上的包被抗体,然后加入封闭液进行封闭(37℃封闭1小时),即制得包被了一抗的酶标板;
(3)使用时,依次加入系列稀释的gE蛋白标准品、适量稀释的辣根过氧化物酶标记的兔多抗(自制),37℃反应后加入辣根过氧化物酶显色体系的底物A/B液显色,最后用1M磷酸终止后读取特异性吸光值。
经过试验,我们最终得出在3.91-500ng/ml范围内,吸光值与检测浓度(ng/ml)呈高度线性相关(R2>0.98)。
实施例2、ELISA检测方法的验证(专属性验证)
实验设计:
供试品 | 样品稀释 |
gE蛋白 | gE蛋白+201蛋白,1:1等体积混合,再依次稀释8个梯度 |
说明:201蛋白为重组人轮状病毒VP8 P[8]抗原();
接受标准:复孔检测值RSD(相对标准偏差)≤20%;其他抗原存在的情况下,不干扰供试品抗原的检测。
专属性验证结果
蛋白 | RSD(%) |
gE蛋白与(gE蛋白+201蛋白) | 3.7% |
专属性验证结论:
在201蛋白存在的情况下,依然可以准确检测出gE蛋白的含量(抗原活性RSD小于10%),即本检测方法专属性/特异性良好。专属性验证合格。
实施例3、ELISA检测方法的验证(精密度及重复性验证)
1、重复性验证
实验设计:选取1批gE蛋白,重复稀释6次,按照双抗体夹心ELISA的操作规范进行试验,计算批内的RSD,以评估其重复性。
接受标准:同一批次的供试品重复稀释样本抗原含量RSD≤20%。
重复性验证结果
重复性验证结论:供试品重复稀释样本抗原含量RSD为1.9%,小于20%。重复性验证合格。
2、精密度验证
实验设计:选取3批gE蛋白,2名操作员在同一时间按照双抗体夹心ELISA的操作规范进行试验。
接受标准:不同操作人员同一批次的供试品抗原含量的RSD≤20%。
精密度(中间精密度)验证结果:
精密度(中间精密度)验证结论:不同操作人员同一批次的供试品检测结果的RSD≤20%,中间精密度验证合格。
3、准确度
实验设计:取gE蛋白标准品,稀释至高、中、低三个浓度,水平做2个复孔,按照双抗体夹心ELISA的操作规范进行试验,重复检测3次。分析3次检测的实际浓度与理论浓度进行比较,计算回收率(回收率=实际浓度/理论浓度×100%)。
接受标准:回收率应在80%~120%之间。
准确度验证结果
准确度验证结论:回收率在98%~112%之间,准确度验证合格。
实施例4、ELISA检测方法标准曲线的建立
总结精密度、准确度验证中的标准曲线数据,以得到标准曲线的线性及最佳检测范围。
接受标准:标准曲线(四参数拟合曲线)的相关系数均不小于0.98,各标准曲线的R2的RSD≤10%;标准曲线最佳检测范围一致。
标准曲线(线性和范围)验证结果
验证项目 | R2(四参数曲线) | 范围 |
专属性 | 0.995 | 3.91-500ng/ml |
精密度-重复性 | 0.999 | 3.91-500ng/ml |
精密度-中间精密度-1 | 0.999 | 3.91-500ng/ml |
精密度-中间精密度-2 | 0.997 | 3.91-500ng/ml |
精密度-中间精密度-3 | 0.999 | 3.91-500ng/ml |
准确度 | 0.999 | 3.91-500ng/ml |
标曲的R2平均值 | 0.998 | / |
标曲的R2的SD | 0.001673 | / |
标曲的R2的RSD% | 0.2% | / |
标准曲线(线性和范围)验证结论:
综合前几个验证可知,标准曲线线性良好,R2均大于0.98,R2的RSD小于10%,符合验证标准;标曲的线性范围一致,均为3.91-500ng/ml。
Claims (6)
1.一种检测重组水痘-带状疱疹病毒糖蛋白E(gE)的单克隆抗体,其特征在于,
所述抗体的重链可变区(VH)氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示:轻链可变区(VL)氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示;
所述的gE蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
2.根据权利要求1所述的,单克隆抗体,其特征在于,所述的单克隆抗体为IgG型抗体,Fc区为鼠源Fc。
3.编码所述单克隆抗体的核酸片段。
4.权利要求1或2所述的单克隆抗体在制备检测试剂盒中的应用,所述的检测试剂盒为:检测重组水痘-带状疱疹病毒疫苗中的重组水痘-带状疱疹病毒糖蛋白E(gE)的浓度的检测试剂盒;优选的,所述的检测试剂盒为基于双抗夹心法技术原理的检测试剂盒,所述的单克隆抗体为一抗。
5.一种检测重组水痘-带状疱疹病毒糖蛋白E(gE)的检测试剂盒,所述的试剂盒为基于双抗夹心法技术原理的ELISA检测试剂盒,其包括:
(1)作为包被抗体(一抗)的检测有效量的单克隆抗体;
(2)必要的二抗、显色试剂、缓冲试剂;所述的二抗可以是多抗或其他单抗。
所述单克隆抗体的重链可变区(VH)氨基酸序列为如SEQ ID NO.1所示,轻链可变区(VL)氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
6.根据权利要求5所述的检测试剂盒,其特征在于,所述的单克隆抗体的Fc为鼠源Fc。
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CN117074673B (zh) * | 2023-10-18 | 2024-05-28 | 北京华诺泰生物医药科技有限公司 | 一种定量检测重组带状疱疹疫苗或/和原液比活性的方法 |
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