CN114324864A - 一种水痘-带状疱疹病毒的IgM和IgG双检免疫层析试纸及应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种水痘‑带状疱疹病毒的IgM和IgG双检免疫层析试纸及应用。所述试纸包括支撑底板和固定在支撑底板上的吸附层，吸附层从测试端开始依次为样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫；硝酸纤维素膜上含有检测线T1、检测线T2及质控线印迹；结合垫上标记量子点标记的gE蛋白偶联物；检测线T1标记抗人IgG单克隆抗体；检测线T2标记抗人IgM单克隆抗体；质控线标记抗gE单克隆抗体。其中糖蛋白gE是利用慢病毒表达系统在CHO细胞中表达制得，VZV阳性血清可以特异性识别该gE糖蛋白。将纯化的gE糖蛋白作为免疫原，通过免疫学方法免疫BALB/c小鼠制备gE单克隆抗体，能够特异性的识别并结合gE蛋白。

Description

一种水痘-带状疱疹病毒的IgM和IgG双检免疫层析试纸及 应用

技术领域

本发明涉及一种水痘-带状疱疹病毒的IgM和IgG双检免疫层析试纸及应用，属于生物检测技术领域。

背景技术

水痘-带状疱疹病毒(varicella zoster virus，VZV)属疱疹病毒科、α-疱疹病毒亚科，水痘病毒属，感染局限于人类及部分高级灵长类动物，具有高度的种属特异性。VZV病毒颗粒呈椭圆形颗粒，直径150～200nm，是双链DNA病毒，病毒核衣壳是由162个壳微粒组成的对称20面体，病毒最外层有包膜。包膜上有至少8种糖蛋白，其中，糖蛋白gE在病毒包膜上含量最丰富，是病毒的主要抗原，也是制备病毒亚单位疫苗和检测试剂的主要候选抗原。

VZV能引起水痘和带状疱疹两种疾病。儿童时期感染VZV会引起水痘，水痘通常表现为轻症自限性疾病；水痘痊愈后，病毒长期潜伏于脊髓后跟或脑神经节的神经元中，到了成人时期可再次激活引起带状疱疹(Herpes Zoster,HZ)，其并发症包括疱疹后神经痛、脑膜炎、皮肤细菌感染等。HZ的发病率随着年龄逐渐增高，50岁以上人群的发病率高达80％。儿童期感染VZV，到成年后10％-20％的人可发生HZ。带状疱疹及疱疹后神经痛的发生概率随年龄增大而增大，这给老龄化社会造成了较大的社会负担。目前，对于水痘和带状疱疹的治疗尚无特效方法，接种疫苗是唯一有效且可靠的预防控制手段。

在水痘或带状疱疹患者中，血清中IgM和IgG特异性抗体都会出现。IgM出现在发疹1-4d后的血清中，检出IgM抗体有助于建立早期诊断；IgG出现略晚，在发疹4-8周后达到高峰。此外，IgG的检出可以对VZV易感人群进行排查以及对疫苗免疫效果进行评价。根据2021年9月16日国家药监局发布的《体外诊断试剂注册与备案管理办法》(国家市场监督管理总局令第48号)，水痘-带状疱疹病毒IgG抗体检测试剂属于免于临床试验体外诊断试剂。目前，抗体检测的常用方法主要有放免法、酶联免疫吸附实验，免疫荧光实验等，但是这些检测都需要昂贵的仪器，需要在实验室进行检测，检测手段复杂，检测时间长。因此急需一种快速、准确、灵敏、特异、低成本且对人员操作经验要求低的水痘-带状疱疹病毒抗体检测方法，提高诊断效率。

发明内容

针对现有技术的不足和市场的需求，本发明的目的是提供一种水痘-带状疱疹病毒的IgM和IgG双检免疫层析试纸及应用。

为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：

一种水痘-带状疱疹病毒的IgM和IgG双检免疫层析试纸，所述试纸包括支撑底板和固定在支撑底板上的吸附层，吸附层从测试端开始依次为样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫；硝酸纤维素膜上含有检测线T1、检测线T2及质控线印迹；所述结合垫上标记的是量子点标记的gE蛋白偶联物；检测线T1标记的是抗人IgG单克隆抗体；检测线T2标记的是抗人IgM单克隆抗体；质控线标记的为抗gE单克隆抗体。

所述量子点标记的gE蛋白偶联物中的gE蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

所述gE蛋白的表达载体为真核重组慢病毒表达载体pLVX-gE-IRES-ZsGreen1。

所述真核重组慢病毒表达载体pLVX-gE-IRES-ZsGreen1的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。

所述gE蛋白的制备方法包括以下步骤：

(1)将gE蛋白信号肽以及gE蛋白胞外区序列优化成CHO偏爱密码子，合成优化后的gE基因序列；所述优化后的gE基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；

(2)构建真核重组慢病毒表达载体pLVX-gE-IRES-ZsGreen1，简称pLVX-gE，pLVX-gE的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

(3)将pLVX-gE与慢病毒包装质粒PSPAX2及包膜质粒PMD2.G共转染293T细胞，收集慢病毒悬液后转导CHO细胞，筛选CHO-gE阳性细胞；

(4)将CHO-gE阳性细胞扩大培养，加入SMS CHO-SUPI培养基添加液，诱导表达水痘-带状疱疹病毒的gE蛋白；

(5)收集gE蛋白的培养上清，对gE蛋白进行纯化。

所述的抗gE单克隆抗体是利用gE蛋白作为抗原制备的。

所述的IgM和IgG双检免疫层析试纸在水痘-带状疱疹病毒的IgM和IgG抗体检测中的应用。

本发明的有益效果：

本发明提供的水痘-带状疱疹病毒糖蛋白gE，是利用慢病毒表达系统在CHO细胞中表达制得的，VZV阳性血清可以特异性识别该gE糖蛋白。将纯化的gE糖蛋白作为免疫原，通过免疫学方法免疫BALB/c小鼠制备出gE单克隆抗体，能够特异性的识别并结合gE蛋白。

在此过程中，我们利用量子点标记的gE蛋白制备同时检测VZV IgM和IgG抗体的荧光免疫层析检测试纸，该试纸可快速、准确、灵敏、特异性地对VZV抗体进行检测，为临床VZV的早期诊断以及VZV易感人群的筛选提供便利，也可用于VZV疫苗免疫效果的评价或疫苗接种后的检测。

附图说明

图1本发明实施例1纯化后的gE蛋白SDS-PAGE鉴定结果；

其中，M：蛋白Marker；1-2：纯化后的gE蛋白；

图2本发明实施例1纯化后的gE蛋白Western-blot鉴定结果；

其中，M：蛋白Marker；1-2：纯化后的gE蛋白；

图3本发明实施例3IFA鉴定结果；

其中，PC，阳性对照；NC，阴性对照；BC，空白对照；原图显示荧光信号，变为黑白图后效果不明显；

图4本发明实施例4检测试纸及检测结果示意图；

A，检测试纸示意图；其中，1，样品垫；2，结合垫；3，硝酸纤维素膜；4，吸水垫；5，支撑底板；

B，检测结果示意图。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明的具体实施方式作进一步详细说明，但本发明的保护范围并不仅限于此；以下实施例中所涉及的仪器设备如无特别说明，均为常规仪器设备；所涉及的试剂如无特别说明，均为市售常规试剂；所涉及的试验方法，如无特别说明，均为常规方法。

实施例1VZV gE蛋白的表达及纯化

VZV糖蛋白gE在病毒包膜上含量最丰富，是病毒的主要抗原，也是制备病毒亚单位疫苗和检测试剂的主要候选抗原。VZV gE蛋白的表达及其单克隆抗体的制备，对带状疱疹的亚单位疫苗及其检测试剂的研发具有重要意义。哺乳动物细胞具有帮助蛋白质正确折叠和翻译后修饰的能力，包括在人类蛋白质中发现的糖基化模式，是制造复杂生物药物最广泛的宿主。

因此，本发明选择在CHO细胞中表达gE糖蛋白。具体的，gE糖蛋白的制备包括如下步骤：

1、CHO-gE细胞的筛选：

参考GenBank上发表的Dumas标准毒株的序列信息，先将gE蛋白信号肽以及gE蛋白胞外区序列优化成CHO偏爱密码子，gE蛋白优化后的目的基因序列如SEQ ID NO.1所示，再将优化后的目的基因克隆到pLVX-IRES-ZsGreen1慢病毒载体中，构建真核重组慢病毒表达载体pLVX-gE-IRES-ZsGreen1，简称pLVX-gE，pLVX-gE的基因序列如SEQ ID NO.2所示。将pLVX-gE与PSPAX2质粒及PMD2.G质粒共转染293T细胞包装慢病毒，转染48h后收集慢病毒悬液，转导CHO细胞，经BD FACS AriaⅢ筛选出绿色荧光表达量高的CHO-gE阳性细胞。

(1)SEQ ID NO.1

ATGGGAACAGTGAATAAGCCTGTGGTGGGCGTGCTGATGGGCTTTGGCATCATCACAGGCACACTGAGAATCACAAACCCTGTGAGAGCCTCTGTGCTGAGATATGATGATTTTCACATCGATGAGGATAAGCTGGACACAAACTCTGTGTACGAGCCTTACTACCACTCTGATCACGCTGAGTCTAGCTGGGTGAATAGAGGAGAATCTTCTAGAAAGGCTTATGATCATAACTCTCCTTACATCTGGCCTAGAAACGATTACGATGGATTCCTGGAGAACGCCCACGAGCACCACGGCGTGTACAACCAGGGTAGAGGCATCGACAGCGGCGAGAGACTGATGCAGCCTACACAGATGTCTGCTCAGGAGGATCTGGGCGATGACACCGGCATTCACGTGATCCCAACACTGAACGGCGATGATAGACACAAGATCGTGAACGTGGACCAGAGACAGTACGGCGATGTGTTTAAGGGAGACCTGAACCCTAAGCCTCAGGGACAGAGACTGATTGAGGTGAGCGTGGAGGAGAACCACCCATTCACACTGAGAGCCCCTATCCAGAGGATCTACGGCGTGAGATACACTGAGACCTGGTCTTTCCTGCCTTCTCTGACCTGTACAGGCGACGCTGCTCCTGCTATCCAGCACATCTGTCTGAAGCACACAACATGTTTTCAGGATGTGGTGGTGGATGTGGATTGTGCCGAGAACACCAAGGAAGATCAGCTGGCTGAGATCTCTTACAGATTTCAGGGAAAGAAGGAGGCCGATCAGCCTTGGATCGTGGTGAACACCTCTACCCTGTTCGATGAGCTGGAGCTGGATCCTCCTGAAATCGAGCCAGGCGTGCTGAAGGTGCTGAGAACTGAGAAGCAGTATCTGGGCGTGTACATCTGGAACATGAGAGGTTCTGACGGCACTAGCACATACGCCACCTTTCTGGTGACCTGGAAGGGCGATGAAAAGACCAGGAATCCTACACCAGCTGTGACACCTCAGCCTAGAGGCGCCGAGTTTCACATGTGGAACTATCACTCTCACGTGTTCTCTGTGGGCGATACCTTCTCTCTGGCCATGCACCTGCAGTATAAGATCCACGAGGCCCCTTTCGACCTGCTGCTGGAGTGGCTGTACGTGCCTATCGACCCTACCTGTCAGCCTATGAGACTGTACAGCACCTGTCTGTACCACCCTAACGCCCCCCAGTGTCTGAGCCACATGAACAGCGGCTGTACTTTCACAAGCCCTCATCTGGCCCAGAGAGTGGCCAGCACCGTGTACCAGAACTGTGAGCACGCCGATAATTACACAGCCTATTGCCTGGGCATCAGCCACATGGAACCTAGCTTTGGCCTGATCCTGCATGACGGCGGCACAACCCTGAAGTTCGTGGATACCCCTGAGTCTCTGTCTGGACTGTATGTGTTCGTGGTGTACTTTAACGGACACGTGGAGGCTGTGGCCTACACCGTGGTGTCTACCGTGGACCACTTCGTGAACGCCATTGAGGAGAGAGGATTCCCTCCTACAGCTGGCCAGCCTCCTGCTACCACCAAGCCAAAGGAGATCACCCCTGTGAACCCTGGCACCTCTCCTCTGCTGAGATACGCCGCTTGGACCGGCGGCCTGGCCTGA

(2)SEQ ID NO.2

TGGAAGGGCTAATTCACTCCCAAAGAAGACAAGATATCCTTGATCTGTGGATCTACCACACACAAGGCTACTTCCCTGATTAGCAGAACTACACACCAGGGCCAGGGGTCAGATATCCACTGACCTTTGGATGGTGCTACAAGCTAGTACCAGTTGAGCCAGATAAGGTAGAAGAGGCCAATAAAGGAGAGAACACCAGCTTGTTACACCCTGTGAGCCTGCATGGGATGGATGACCCGGAGAGAGAAGTGTTAGAGTGGAGGTTTGACAGCCGCCTAGCATTTCATCACGTGGCCCGAGAGCTGCATCCGGAGTACTTCAAGAACTGCTGATATCGAGCTTGCTACAAGGGACTTTCCGCTGGGGACTTTCCAGGGAGGCGTGGCCTGGGCGGGACTGGGGAGTGGCGAGCCCTCAGATCCTGCATATAAGCAGCTGCTTTTTGCCTGTACTGGGTCTCTCTGGTTAGACCAGATCTGAGCCTGGGAGCTCTCTGGCTAACTAGGGAACCCACTGCTTAAGCCTCAATAAAGCTTGCCTTGAGTGCTTCAAGTAGTGTGTGCCCGTCTGTTGTGTGACTCTGGTAACTAGAGATCCCTCAGACCCTTTTAGTCAGTGTGGAAAATCTCTAGCAGTGGCGCCCGAACAGGGACTTGAAAGCGAAAGGGAAACCAGAGGAGCTCTCTCGACGCAGGACTCGGCTTGCTGAAGCGCGCACGGCAAGAGGCGAGGGGCGGCGACTGGTGAGTACGCCAAAAATTTTGACTAGCGGAGGCTAGAAGGAGAGAGATGGGTGCGAGAGCGTCAGTATTAAGCGGGGGAGAATTAGATCGCGATGGGAAAAAATTCGGTTAAGGCCAGGGGGAAAGAAAAAATATAAATTAAAACATATAGTATGGGCAAGCAGGGAGCTAGAACGATTCGCAGTTAATCCTGGCCTGTTAGAAACATCAGAAGGCTGTAGACAAATACTGGGACAGCTACAACCATCCCTTCAGACAGGATCAGAAGAACTTAGATCATTATATAATACAGTAGCAACCCTCTATTGTGTGCATCAAAGGATAGAGATAAAAGACACCAAGGAAGCTTTAGACAAGATAGAGGAAGAGCAAAACAAAAGTAAGACCACCGCACAGCAAGCGGCCGGCCGCTGATCTTCAGACCTGGAGGAGGAGATATGAGGGACAATTGGAGAAGTGAATTATATAAATATAAAGTAGTAAAAATTGAACCATTAGGAGTAGCACCCACCAAGGCAAAGAGAAGAGTGGTGCAGAGAGAAAAAAGAGCAGTGGGAATAGGAGCTTTGTTCCTTGGGTTCTTGGGAGCAGCAGGAAGCACTATGGGCGCAGCGTCAATGACGCTGACGGTACAGGCCAGACAATTATTGTCTGGTATAGTGCAGCAGCAGAACAATTTGCTGAGGGCTATTGAGGCGCAACAGCATCTGTTGCAACTCACAGTCTGGGGCATCAAGCAGCTCCAGGCAAGAATCCTGGCTGTGGAAAGATACCTAAAGGATCAACAGCTCCTGGGGATTTGGGGTTGCTCTGGAAAACTCATTTGCACCACTGCTGTGCCTTGGAATGCTAGTTGGAGTAATAAATCTCTGGAACAGATTTGGAATCACACGACCTGGATGGAGTGGGACAGAGAAATTAACAATTACACAAGCTTAATACACTCCTTAATTGAAGAATCGCAAAACCAGCAAGAAAAGAATGAACAAGAATTATTGGAATTAGATAAATGGGCAAGTTTGTGGAATTGGTTTAACATAACAAATTGGCTGTGGTATATAAAATTATTCATAATGATAGTAGGAGGCTTGGTAGGTTTAAGAATAGTTTTTGCTGTACTTTCTATAGTGAATAGAGTTAGGCAGGGATATTCACCATTATCGTTTCAGACCCACCTCCCAACCCCGAGGGGACCCGACAGGCCCGAAGGAATAGAAGAAGAAGGTGGAGAGAGAGACAGAGACAGATCCATTCGATTAGTGAACGGATCTCGACGGTATCGCCTTTAAAAGAAAAGGGGGGATTGGGGGGTACAGTGCAGGGGAAAGAATAGTAGACATAATAGCAACAGACATACAAACTAAAGAATTACAAAAACAAATTACAAAAATTCAAAATTTTCGGGTTTATTACAGGGACAGCAGAGATCCAGTTTATCGATAAGCTTGGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCGCCTGGAGACGCCATCCACGCTGTTTTGACCTCCATAGAAGACACCGACTCTACTAGAGGATCTATTTCCGGTGAATTCATGGGAACAGTGAATAAGCCTGTGGTGGGCGTGCTGATGGGCTTTGGCATCATCACAGGCACACTGAGAATCACAAACCCTGTGAGAGCCTCTGTGCTGAGATATGATGATTTTCACATCGATGAGGATAAGCTGGACACAAACTCTGTGTACGAGCCTTACTACCACTCTGATCACGCTGAGTCTAGCTGGGTGAATAGAGGAGAATCTTCTAGAAAGGCTTATGATCATAACTCTCCTTACATCTGGCCTAGAAACGATTACGATGGATTCCTGGAGAACGCCCACGAGCACCACGGCGTGTACAACCAGGGTAGAGGCATCGACAGCGGCGAGAGACTGATGCAGCCTACACAGATGTCTGCTCAGGAGGATCTGGGCGATGACACCGGCATTCACGTGATCCCAACACTGAACGGCGATGATAGACACAAGATCGTGAACGTGGACCAGAGACAGTACGGCGATGTGTTTAAGGGAGACCTGAACCCTAAGCCTCAGGGACAGAGACTGATTGAGGTGAGCGTGGAGGAGAACCACCCATTCACACTGAGAGCCCCTATCCAGAGGATCTACGGCGTGAGATACACTGAGACCTGGTCTTTCCTGCCTTCTCTGACCTGTACAGGCGACGCTGCTCCTGCTATCCAGCACATCTGTCTGAAGCACACAACATGTTTTCAGGATGTGGTGGTGGATGTGGATTGTGCCGAGAACACCAAGGAAGATCAGCTGGCTGAGATCTCTTACAGATTTCAGGGAAAGAAGGAGGCCGATCAGCCTTGGATCGTGGTGAACACCTCTACCCTGTTCGATGAGCTGGAGCTGGATCCTCCTGAAATCGAGCCAGGCGTGCTGAAGGTGCTGAGAACTGAGAAGCAGTATCTGGGCGTGTACATCTGGAACATGAGAGGTTCTGACGGCACTAGCACATACGCCACCTTTCTGGTGACCTGGAAGGGCGATGAAAAGACCAGGAATCCTACACCAGCTGTGACACCTCAGCCTAGAGGCGCCGAGTTTCACATGTGGAACTATCACTCTCACGTGTTCTCTGTGGGCGATACCTTCTCTCTGGCCATGCACCTGCAGTATAAGATCCACGAGGCCCCTTTCGACCTGCTGCTGGAGTGGCTGTACGTGCCTATCGACCCTACCTGTCAGCCTATGAGACTGTACAGCACCTGTCTGTACCACCCTAACGCCCCCCAGTGTCTGAGCCACATGAACAGCGGCTGTACTTTCACAAGCCCTCATCTGGCCCAGAGAGTGGCCAGCACCGTGTACCAGAACTGTGAGCACGCCGATAATTACACAGCCTATTGCCTGGGCATCAGCCACATGGAACCTAGCTTTGGCCTGATCCTGCATGACGGCGGCACAACCCTGAAGTTCGTGGATACCCCTGAGTCTCTGTCTGGACTGTATGTGTTCGTGGTGTACTTTAACGGACACGTGGAGGCTGTGGCCTACACCGTGGTGTCTACCGTGGACCACTTCGTGAACGCCATTGAGGAGAGAGGATTCCCTCCTACAGCTGGCCAGCCTCCTGCTACCACCAAGCCAAAGGAGATCACCCCTGTGAACCCTGGCACCTCTCCTCTGCTGAGATACGCCGCTTGGACCGGCGGCCTGGCCTGACTCGAGACTAGTTCTAGAGCGGCCGCGGATCCCGCCCCTCTCCCTCCCCCCCCCCTAACGTTACTGGCCGAAGCCGCTTGGAATAAGGCCGGTGTGCGTTTGTCTATATGTTATTTTCCACCATATTGCCGTCTTTTGGCAATGTGAGGGCCCGGAAACCTGGCCCTGTCTTCTTGACGAGCATTCCTAGGGGTCTTTCCCCTCTCGCCAAAGGAATGCAAGGTCTGTTGAATGTCGTGAAGGAAGCAGTTCCTCTGGAAGCTTCTTGAAGACAAACAACGTCTGTAGCGACCCTTTGCAGGCAGCGGAACCCCCCACCTGGCGACAGGTGCCTCTGCGGCCAAAAGCCACGTGTATAAGATACACCTGCAAAGGCGGCACAACCCCAGTGCCACGTTGTGAGTTGGATAGTTGTGGAAAGAGTCAAATGGCTCACCTCAAGCGTATTCAACAAGGGGCTGAAGGATGCCCAGAAGGTACCCCATTGTATGGGATCTGATCTGGGGCCTCGGTGCACATGCTTTACATGTGTTTAGTCGAGGTTAAAAAACGTCTAGGCCCCCCGAACCACGGGGACGTGGTTTTCCTTTGAAAAACACGATGATAATATGGCCCAGTCCAAGCACGGCCTGACCAAGGAGATGACCATGAAGTACCGCATGGAGGGCTGCGTGGACGGCCACAAGTTCGTGATCACCGGCGAGGGCATCGGCTACCCCTTCAAGGGCAAGCAGGCCATCAACCTGTGCGTGGTGGAGGGCGGCCCCTTGCCCTTCGCCGAGGACATCTTGTCCGCCGCCTTCATGTACGGCAACCGCGTGTTCACCGAGTACCCCCAGGACATCGTCGACTACTTCAAGAACTCCTGCCCCGCCGGCTACACCTGGGACCGCTCCTTCCTGTTCGAGGACGGCGCCGTGTGCATCTGCAACGCCGACATCACCGTGAGCGTGGAGGAGAACTGCATGTACCACGAGTCCAAGTTCTACGGCGTGAACTTCCCCGCCGACGGCCCCGTGATGAAGAAGATGACCGACAACTGGGAGCCCTCCTGCGAGAAGATCATCCCCGTGCCCAAGCAGGGCATCTTGAAGGGCGACGTGAGCATGTACCTGCTGCTGAAGGACGGTGGCCGCTTGCGCTGCCAGTTCGACACCGTGTACAAGGCCAAGTCCGTGCCCCGCAAGATGCCCGACTGGCACTTCATCCAGCACAAGCTGACCCGCGAGGACCGCAGCGACGCCAAGAACCAGAAGTGGCACCTGACCGAGCACGCCATCGCCTCCGGCTCCGCCTTGCCCTGAACGCGTCTGGAACAATCAACCTCTGGATTACAAAATTTGTGAAAGATTGACTGGTATTCTTAACTATGTTGCTCCTTTTACGCTATGTGGATACGCTGCTTTAATGCCTTTGTATCATGCTATTGCTTCCCGTATGGCTTTCATTTTCTCCTCCTTGTATAAATCCTGGTTGCTGTCTCTTTATGAGGAGTTGTGGCCCGTTGTCAGGCAACGTGGCGTGGTGTGCACTGTGTTTGCTGACGCAACCCCCACTGGTTGGGGCATTGCCACCACCTGTCAGCTCCTTTCCGGGACTTTCGCTTTCCCCCTCCCTATTGCCACGGCGGAACTCATCGCCGCCTGCCTTGCCCGCTGCTGGACAGGGGCTCGGCTGTTGGGCACTGACAATTCCGTGGTGTTGTCGGGGAAGCTGACGTCCTTTCCATGGCTGCTCGCCTGTGTTGCCACCTGGATTCTGCGCGGGACGTCCTTCTGCTACGTCCCTTCGGCCCTCAATCCAGCGGACCTTCCTTCCCGCGGCCTGCTGCCGGCTCTGCGGCCTCTTCCGCGTCTTCGCCTTCGCCCTCAGACGAGTCGGATCTCCCTTTGGGCCGCCTCCCCGCCTGGAATTAATTCTGCAGTCGAGACCTAGAAAAACATGGAGCAATCACAAGTAGCAATACAGCAGCTACCAATGCTGATTGTGCCTGGCTAGAAGCACAAGAGGAGGAGGAGGTGGGTTTTCCAGTCACACCTCAGGTACCTTTAAGACCAATGACTTACAAGGCAGCTGTAGATCTTAGCCACTTTTTAAAAGAAAAGAGGGGACTGGAAGGGCTAATTCACTCCCAACGAAGACAAGATATCCTTGATCTGTGGATCTACCACACACAAGGCTACTTCCCTGATTAGCAGAACTACACACCAGGGCCAGGGGTCAGATATCCACTGACCTTTGGATGGTGCTACAAGCTAGTACCAGTTGAGCCAGATAAGGTAGAAGAGGCCAATAAAGGAGAGAACACCAGCTTGTTACACCCTGTGAGCCTGCATGGGATGGATGACCCGGAGAGAGAAGTGTTAGAGTGGAGGTTTGACAGCCGCCTAGCATTTCATCACGTGGCCCGAGAGCTGCATCCGGAGTACTTCAAGAACTGCTGATATCGAGCTTGCTACAAGGGACTTTCCGCTGGGGACTTTCCAGGGAGGCGTGGCCTGGGCGGGACTGGGGAGTGGCGAGCCCTCAGATCCTGCATATAAGCAGCTGCTTTTTGCCTGTACTGGGTCTCTCTGGTTAGACCAGATCTGAGCCTGGGAGCTCTCTGGCTAACTAGGGAACCCACTGCTTAAGCCTCAATAAAGCTTGCCTTGAGTGCTTCAAGTAGTGTGTGCCCGTCTGTTGTGTGACTCTGGTAACTAGAGATCCCTCAGACCCTTTTAGTCAGTGTGGAAAATCTCTAGCAGTAGTAGTTCATGTCATCTTATTATTCAGTATTTATAACTTGCAAAGAAATGAATATCAGAGAGTGAGAGGCCTTGACATTGCTAGCGTTTACCGTCGACCTCTAGCTAGAGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGAACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGACGTCGACGGATCGGGAGATCAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTATCATGTCTGGATCAACTGGATAACTCAAGCTAACCAAAATCATCCCAAACTTCCCACCCCATACCCTATTACCACTGCCAATTACCTGTGGTTTCATTTACTCTAAACCTGTGATTCCTCTGAATTATTTTCATTTTAAAGAAATTGTATTTGTTAAATATGTACTACAAACTTAGTAGTTTTTAAAGAAATTGTATTTGTTAAATATGTACTACAAACTTAGTAGT

2、gE蛋白的表达及纯化

(1)细胞的大量培养：将CHO-gE阳性细胞接种到50mL的摇瓶中，120rpm摇瓶培养，通过细胞计数检测细胞的生长密度。当细胞培养密度保持不变时，将50mL摇瓶中的细胞扩大到500mL摇瓶中进行高密度培养，每天进行细胞计数，当细胞密度大于初始密度的1.5倍时开始加入SMS CHO-SUPI培养基添加液，每天加入1.5％(v/v％)的量，当细胞密度保持不变，或者细胞的死亡率开始升高时，停止加入SMS CHO-SUPI培养基添加液，收集细胞悬液，离心收取上清液体；

(2)收集表达gE蛋白的培养上清，12000r/min离心10min。将离心后的上清用0.45μm滤膜过滤后，放入冰盒中备用；

(3)用移液器吸取2mL Q-SepgEroseFF阴离子交换柱填料加入安装好的蛋白纯化柱上，待填料沉降后，小心加入上垫片；打开控制阀，使20％(v/v％)乙醇流出，并继续用10mL去离子水清洗柱子；

(4)调节蛋白纯化装置的控制阀使其流速稳定，流速调节完毕后用10mL及以上体积的平衡缓冲液以1mL/min的速度冲洗柱子；

(5)将滤膜过滤的细胞培养上清分批次滴加到上述平衡好的柱子中，每次5mL，调节控制阀使流速不超过1mL/min，迅速收集穿出液并重复上样2～3次，收集最后一次穿出液，放置-20℃备用。

(6)用含不同浓度NaCl的洗涤缓冲液冲洗柱子，除去杂蛋白；

(7)最后向柱子中加入10mL含500mMNaCl的洗脱缓冲液，洗脱目的蛋白；调节控制阀，尽量降低液体流穿的速度；将洗脱的液体收集到1.5mL的EP管中，每管1mL，用酶标仪测出每管蛋白的浓度并做好标记，得到纯化后的gE蛋白，放置-20℃备用；

(8)纯化结束后，用20mL的ddw清洗柱子，然后用NaOH溶液(1mol/L)再清洗一次柱子，用ddw又一次清洗柱子，最后将柱子存放在20％的乙醇中，4℃冰箱储存。

(9)向纯化后收集的洗脱液中加入5×Loading Buffer上样缓冲液，并煮沸10min，经12％SDS-PAGE分析纯化结果(如图1所示)，再用VZV阳性血清对纯化后的gE蛋白进行Western-blot鉴定(如图2所示)。

实施例2单克隆抗体的制备

1、动物免疫

(1)向免疫原gE蛋白(实施例1所得纯化gE蛋白)中加入弗氏完全佐剂，经乳化后用于首次免疫；

(2)通过背部皮下多点注射的方法，免疫4～8周龄的雌性BALB/c小鼠2只，免疫剂量10μg/只；

(3)每隔2周用弗氏不完全佐剂与免疫抗原(实施例1所得纯化gE蛋白)乳化后以相同的方法和剂量对BALB/c小鼠进行加强免疫，共免疫4次；

(4)4免后，尾静脉采血测定针对gE蛋白的特异性抗体效价，选择效价较高的小鼠，于细胞融合前3～4天，通过尾静脉注射的方法，用不含佐剂的免疫原对BALB/c小鼠进行超强免疫，免疫剂量是20μg/只。

2、细胞融合及单克隆抗体制备

采用聚乙二醇的方法，将免疫小鼠的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0按细胞数量8：1的比例进行细胞融合，融合后的细胞用HAT选择培养基进行筛选；于融合后12天，以gE蛋白作为包被抗原，通过间接ELISA法初步筛选阳性杂交瘤细胞；

间接ELISA法的具体步骤为：

(1)用CBS液将纯化后的gE蛋白稀释成浓度为3μg/mL的包被液包被酶标板，100μL/孔，37℃孵育2h；

(2)弃去包被液，用PBST洗板拍干后，用5％(w/v％)脱脂奶封闭酶标板，200μL/孔，37℃孵育2h；

(3)弃去封闭液，用PBST洗板拍干后，将杂交瘤上清(一抗)用5％(w/v％)的脱脂奶2倍稀释，依次加入酶标板中，100μL/孔，阳性对照为VZV阳性血清，37℃孵育30min；

(4)弃去一抗，用PBST洗板，洗干净，拍干；

(5)将稀释好的HRP标记的羊抗鼠IgG(二抗)加入反应孔中，100μL/孔，37℃孵育30min；

(6)弃去二抗，用PBST冲洗干净，拍干；

(7)每孔加入现配的TMB显色液100μL，暗室反应5min；

(8)每孔加入100μL2M H₂SO₄终止反应；

(9)酶标仪读取每孔的OD₄₅₀值。

3、通过有限稀释法对杂交瘤细胞进行亚克隆

用1640/10完全培养基稀释上述阳性杂交瘤细胞至约10cells/mL，每孔100μL加入到预铺有100μL饲养细胞的96孔板中，置于37℃，5％CO₂培养箱中培养6～8天；进一步通过间接ELISA法筛选阳性杂交瘤细胞；进行2～3次亚克隆，直至获得稳定分泌抗gE蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，将筛选得到的阳性单克隆扩大培养，细胞数按1～2×10⁶/管进行冻存。

4、单克隆杂交瘤细胞株稳定性鉴定

将所建立的单克隆杂交瘤细胞株连续培养3个月并反复液氮冻存复苏，从而鉴定杂交瘤细胞的稳定性；结果显示单克隆杂交瘤细胞株稳定性良好。

5、体内诱生腹水法制备单抗

选择经产的雌性BALB/c小鼠，腹腔内注射500μL灭菌石蜡，一周后，再次腹腔内注射获得的单克隆杂交瘤细胞(7E12)，注射量为2×10⁵个细胞，再过一周后，待小鼠腹部膨大后抽取腹水，离心后取上清，用辛酸硫酸铵法对腹水进行纯化。

实施例3抗体的纯化及鉴定

1、饱和硫酸铵沉淀法进行抗体纯化，操作方法如下：

(1)取5mL单抗腹水(实施例2所得)，加入5mLPBS缓冲液，再逐滴加入饱和硫酸铵溶液2.5mL，使成为终浓度为20％(wt％)的硫酸铵溶液，边加边搅拌，充分混匀后，静置30min。

(2)8000r/min，离心20min，弃去沉淀，以除去纤维蛋白。

(3)在上清液中加入12.5mL饱和硫酸铵溶液，充分混匀，静置30min。

(4)8000r/min，离心20min，弃去上清。

(5)于沉淀中加入10mLPBS缓冲液，使之溶解，再加入5mL饱和硫酸铵溶液，使之成为33％(wt％)硫酸铵溶液，充分混匀后，静置30min。

(6)8000r/min，离心20min，弃去上清，以除去白蛋白。

(7)重复步骤(5)，2～3次。

(8)用5mLPBS缓冲液溶解沉淀，装入透析袋，4℃下用PBS缓冲液透析，换液4次。

(9)8000r/min，离心20min，弃沉淀，上清即为纯化后的单抗7E12，测抗体浓度，分装后，-20℃保存。

2、单克隆抗体效价测定

间接ELISA测定方法参照实施例2进行，一抗略有不同：将纯化的单克隆抗体用PBS从1:1000开始进行倍比稀释，依次加入酶标板中，100μL/孔，阳性对照为VZV阳性血清，37℃孵育30min；其他步骤参照实施例2进行，ELISA检测结果显示单抗7E12效价为1:2.56×10⁵。

3、IFA鉴定单抗与gE蛋白的反应性的结果

重新构建pTrip-gE-IRES-puro重组载体转导HEK293T细胞，与单抗7E12孵育，再加入FITC(异硫氰酸荧光素)结合的山羊抗小鼠IgG抗体。所有的细胞核都被DAPI染色液染成了蓝色。其中，所有与单抗7E12孵育的细胞孔中均检测到荧光信号，在阴性对照(NC)与空白对照(BC)孔中未检测到荧光信号，结果如图3所示。IFA结果证实了本实验筛选的单抗7E12与293T细胞瞬时表达的VZV gE蛋白有较好的反应性。

实施例4gE蛋白及其单克隆抗体在制备水痘-带状疱疹病毒抗体检测试纸中的应用

该实施例提供了一种同时检测水痘-带状疱疹病毒的IgM和IgG抗体的试纸，该检测试纸包含本发明提供的水痘-带状疱疹病毒gE糖蛋白及其单抗。

1、量子点标记gE蛋白

采用EDC的方法，先将量子点(QDs)上的羧基活化，再与gE蛋白(实施例1纯化所得gE蛋白)的氨基偶联，得到量子点标记的QDs-gE偶联物。

2、试纸的组装

将QDs-gE偶联物喷涂到预处理过的结合垫上；NC膜(硝酸纤维素膜)经预处理后，在NC膜的检测线1(T1线)上喷涂抗人IgG单克隆抗体，在NC膜的检测线2(T2线)上喷涂抗人IgM单克隆抗体，在NC膜的质控线(C线)上喷涂7E12单抗(实施例3所得)；利用LM5000试纸装配仪或者手动组装将上述材料组装成试纸板。先将NC膜粘贴到支撑底板中央，然后分别将喷涂有QDs-gE的结合垫和样品垫依次粘贴到NC膜的样品端，各层重叠1-2mm，再将吸水垫粘贴到NC膜的另一端，与NC膜重叠1-2mm(如图4所示)。最后用切条仪切割成4mm宽的试纸条，干燥密封保存。

结果判读：将待测样品滴加到样品垫上，5-10min后，用手持紫外灯照射试纸，若仅C线和T1线显色，结果为IgG抗体阳性；若仅C线和T2线显色，结果为IgM抗体阳性；若C线、T1线和T2线都显色，结果为IgM和IgG抗体阳性；若C线显色，T线不显色，结果为阴性；若C线不显色，说明判读无效(如图4所示)。

3、检测临床样本

用制备的水痘-带状疱疹病毒的IgM和IgG抗体检测试纸，分别检测VZV阳性血清以及HSV-1、HSV-2、CMV、EBV和KSHV阳性血清，检测结果显示，本发明的水痘-带状疱疹病毒抗体检测荧光免疫层析试纸具有高的灵敏性和特异性。

该试纸可以检测出VZV阳性血清；特异性检测结果显示该试纸与疱疹病毒科其他病毒的阳性血清均不发生交叉反应。

上面结合附图和实施例对本发明作了详细的说明，但是，所属技术领域的技术人员能够理解，在不脱离本发明宗旨的前提下，还可以对上述实施例中的各个具体参数进行变更，形成多个具体的实施例，均为本发明的常见变化范围，在此不再一一详述。

序列表

<110> 郑州大学

<120> 一种水痘-带状疱疹病毒的IgM和IgG双检免疫层析试纸及应用

<130> gE蛋白

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1641

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 1

atgggaacag tgaataagcc tgtggtgggc gtgctgatgg gctttggcat catcacaggc 60

acactgagaa tcacaaaccc tgtgagagcc tctgtgctga gatatgatga ttttcacatc 120

gatgaggata agctggacac aaactctgtg tacgagcctt actaccactc tgatcacgct 180

gagtctagct gggtgaatag aggagaatct tctagaaagg cttatgatca taactctcct 240

tacatctggc ctagaaacga ttacgatgga ttcctggaga acgcccacga gcaccacggc 300

gtgtacaacc agggtagagg catcgacagc ggcgagagac tgatgcagcc tacacagatg 360

tctgctcagg aggatctggg cgatgacacc ggcattcacg tgatcccaac actgaacggc 420

gatgatagac acaagatcgt gaacgtggac cagagacagt acggcgatgt gtttaaggga 480

gacctgaacc ctaagcctca gggacagaga ctgattgagg tgagcgtgga ggagaaccac 540

ccattcacac tgagagcccc tatccagagg atctacggcg tgagatacac tgagacctgg 600

tctttcctgc cttctctgac ctgtacaggc gacgctgctc ctgctatcca gcacatctgt 660

ctgaagcaca caacatgttt tcaggatgtg gtggtggatg tggattgtgc cgagaacacc 720

aaggaagatc agctggctga gatctcttac agatttcagg gaaagaagga ggccgatcag 780

ccttggatcg tggtgaacac ctctaccctg ttcgatgagc tggagctgga tcctcctgaa 840

atcgagccag gcgtgctgaa ggtgctgaga actgagaagc agtatctggg cgtgtacatc 900

tggaacatga gaggttctga cggcactagc acatacgcca cctttctggt gacctggaag 960

ggcgatgaaa agaccaggaa tcctacacca gctgtgacac ctcagcctag aggcgccgag 1020

tttcacatgt ggaactatca ctctcacgtg ttctctgtgg gcgatacctt ctctctggcc 1080

atgcacctgc agtataagat ccacgaggcc cctttcgacc tgctgctgga gtggctgtac 1140

gtgcctatcg accctacctg tcagcctatg agactgtaca gcacctgtct gtaccaccct 1200

aacgcccccc agtgtctgag ccacatgaac agcggctgta ctttcacaag ccctcatctg 1260

gcccagagag tggccagcac cgtgtaccag aactgtgagc acgccgataa ttacacagcc 1320

tattgcctgg gcatcagcca catggaacct agctttggcc tgatcctgca tgacggcggc 1380

acaaccctga agttcgtgga tacccctgag tctctgtctg gactgtatgt gttcgtggtg 1440

tactttaacg gacacgtgga ggctgtggcc tacaccgtgg tgtctaccgt ggaccacttc 1500

gtgaacgcca ttgaggagag aggattccct cctacagctg gccagcctcc tgctaccacc 1560

aagccaaagg agatcacccc tgtgaaccct ggcacctctc ctctgctgag atacgccgct 1620

tggaccggcg gcctggcctg a 1641

<210> 2

<211> 9844

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 2

tggaagggct aattcactcc caaagaagac aagatatcct tgatctgtgg atctaccaca 60

cacaaggcta cttccctgat tagcagaact acacaccagg gccaggggtc agatatccac 120

tgacctttgg atggtgctac aagctagtac cagttgagcc agataaggta gaagaggcca 180

ataaaggaga gaacaccagc ttgttacacc ctgtgagcct gcatgggatg gatgacccgg 240

agagagaagt gttagagtgg aggtttgaca gccgcctagc atttcatcac gtggcccgag 300

agctgcatcc ggagtacttc aagaactgct gatatcgagc ttgctacaag ggactttccg 360

ctggggactt tccagggagg cgtggcctgg gcgggactgg ggagtggcga gccctcagat 420

cctgcatata agcagctgct ttttgcctgt actgggtctc tctggttaga ccagatctga 480

gcctgggagc tctctggcta actagggaac ccactgctta agcctcaata aagcttgcct 540

tgagtgcttc aagtagtgtg tgcccgtctg ttgtgtgact ctggtaacta gagatccctc 600

agaccctttt agtcagtgtg gaaaatctct agcagtggcg cccgaacagg gacttgaaag 660

cgaaagggaa accagaggag ctctctcgac gcaggactcg gcttgctgaa gcgcgcacgg 720

caagaggcga ggggcggcga ctggtgagta cgccaaaaat tttgactagc ggaggctaga 780

aggagagaga tgggtgcgag agcgtcagta ttaagcgggg gagaattaga tcgcgatggg 840

aaaaaattcg gttaaggcca gggggaaaga aaaaatataa attaaaacat atagtatggg 900

caagcaggga gctagaacga ttcgcagtta atcctggcct gttagaaaca tcagaaggct 960

gtagacaaat actgggacag ctacaaccat cccttcagac aggatcagaa gaacttagat 1020

cattatataa tacagtagca accctctatt gtgtgcatca aaggatagag ataaaagaca 1080

ccaaggaagc tttagacaag atagaggaag agcaaaacaa aagtaagacc accgcacagc 1140

aagcggccgg ccgctgatct tcagacctgg aggaggagat atgagggaca attggagaag 1200

tgaattatat aaatataaag tagtaaaaat tgaaccatta ggagtagcac ccaccaaggc 1260

aaagagaaga gtggtgcaga gagaaaaaag agcagtggga ataggagctt tgttccttgg 1320

gttcttggga gcagcaggaa gcactatggg cgcagcgtca atgacgctga cggtacaggc 1380

cagacaatta ttgtctggta tagtgcagca gcagaacaat ttgctgaggg ctattgaggc 1440

gcaacagcat ctgttgcaac tcacagtctg gggcatcaag cagctccagg caagaatcct 1500

ggctgtggaa agatacctaa aggatcaaca gctcctgggg atttggggtt gctctggaaa 1560

actcatttgc accactgctg tgccttggaa tgctagttgg agtaataaat ctctggaaca 1620

gatttggaat cacacgacct ggatggagtg ggacagagaa attaacaatt acacaagctt 1680

aatacactcc ttaattgaag aatcgcaaaa ccagcaagaa aagaatgaac aagaattatt 1740

ggaattagat aaatgggcaa gtttgtggaa ttggtttaac ataacaaatt ggctgtggta 1800

tataaaatta ttcataatga tagtaggagg cttggtaggt ttaagaatag tttttgctgt 1860

actttctata gtgaatagag ttaggcaggg atattcacca ttatcgtttc agacccacct 1920

cccaaccccg aggggacccg acaggcccga aggaatagaa gaagaaggtg gagagagaga 1980

cagagacaga tccattcgat tagtgaacgg atctcgacgg tatcgccttt aaaagaaaag 2040

gggggattgg ggggtacagt gcaggggaaa gaatagtaga cataatagca acagacatac 2100

aaactaaaga attacaaaaa caaattacaa aaattcaaaa ttttcgggtt tattacaggg 2160

acagcagaga tccagtttat cgataagctt gggagttccg cgttacataa cttacggtaa 2220

atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc cccgcccatt gacgtcaata atgacgtatg 2280

ttcccatagt aacgccaata gggactttcc attgacgtca atgggtggag tatttacggt 2340

aaactgccca cttggcagta catcaagtgt atcatatgcc aagtacgccc cctattgacg 2400

tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt atgcccagta catgacctta tgggactttc 2460

ctacttggca gtacatctac gtattagtca tcgctattac catggtgatg cggttttggc 2520

agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg actcacgggg atttccaagt ctccacccca 2580

ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc aaaatcaacg ggactttcca aaatgtcgta 2640

acaactccgc cccattgacg caaatgggcg gtaggcgtgt acggtgggag gtctatataa 2700

gcagagctcg tttagtgaac cgtcagatcg cctggagacg ccatccacgc tgttttgacc 2760

tccatagaag acaccgactc tactagagga tctatttccg gtgaattcat gggaacagtg 2820

aataagcctg tggtgggcgt gctgatgggc tttggcatca tcacaggcac actgagaatc 2880

acaaaccctg tgagagcctc tgtgctgaga tatgatgatt ttcacatcga tgaggataag 2940

ctggacacaa actctgtgta cgagccttac taccactctg atcacgctga gtctagctgg 3000

gtgaatagag gagaatcttc tagaaaggct tatgatcata actctcctta catctggcct 3060

agaaacgatt acgatggatt cctggagaac gcccacgagc accacggcgt gtacaaccag 3120

ggtagaggca tcgacagcgg cgagagactg atgcagccta cacagatgtc tgctcaggag 3180

gatctgggcg atgacaccgg cattcacgtg atcccaacac tgaacggcga tgatagacac 3240

aagatcgtga acgtggacca gagacagtac ggcgatgtgt ttaagggaga cctgaaccct 3300

aagcctcagg gacagagact gattgaggtg agcgtggagg agaaccaccc attcacactg 3360

agagccccta tccagaggat ctacggcgtg agatacactg agacctggtc tttcctgcct 3420

tctctgacct gtacaggcga cgctgctcct gctatccagc acatctgtct gaagcacaca 3480

acatgttttc aggatgtggt ggtggatgtg gattgtgccg agaacaccaa ggaagatcag 3540

ctggctgaga tctcttacag atttcaggga aagaaggagg ccgatcagcc ttggatcgtg 3600

gtgaacacct ctaccctgtt cgatgagctg gagctggatc ctcctgaaat cgagccaggc 3660

gtgctgaagg tgctgagaac tgagaagcag tatctgggcg tgtacatctg gaacatgaga 3720

ggttctgacg gcactagcac atacgccacc tttctggtga cctggaaggg cgatgaaaag 3780

accaggaatc ctacaccagc tgtgacacct cagcctagag gcgccgagtt tcacatgtgg 3840

aactatcact ctcacgtgtt ctctgtgggc gataccttct ctctggccat gcacctgcag 3900

tataagatcc acgaggcccc tttcgacctg ctgctggagt ggctgtacgt gcctatcgac 3960

cctacctgtc agcctatgag actgtacagc acctgtctgt accaccctaa cgccccccag 4020

tgtctgagcc acatgaacag cggctgtact ttcacaagcc ctcatctggc ccagagagtg 4080

gccagcaccg tgtaccagaa ctgtgagcac gccgataatt acacagccta ttgcctgggc 4140

atcagccaca tggaacctag ctttggcctg atcctgcatg acggcggcac aaccctgaag 4200

ttcgtggata cccctgagtc tctgtctgga ctgtatgtgt tcgtggtgta ctttaacgga 4260

cacgtggagg ctgtggccta caccgtggtg tctaccgtgg accacttcgt gaacgccatt 4320

gaggagagag gattccctcc tacagctggc cagcctcctg ctaccaccaa gccaaaggag 4380

atcacccctg tgaaccctgg cacctctcct ctgctgagat acgccgcttg gaccggcggc 4440

ctggcctgac tcgagactag ttctagagcg gccgcggatc ccgcccctct ccctcccccc 4500

cccctaacgt tactggccga agccgcttgg aataaggccg gtgtgcgttt gtctatatgt 4560

tattttccac catattgccg tcttttggca atgtgagggc ccggaaacct ggccctgtct 4620

tcttgacgag cattcctagg ggtctttccc ctctcgccaa aggaatgcaa ggtctgttga 4680

atgtcgtgaa ggaagcagtt cctctggaag cttcttgaag acaaacaacg tctgtagcga 4740

ccctttgcag gcagcggaac cccccacctg gcgacaggtg cctctgcggc caaaagccac 4800

gtgtataaga tacacctgca aaggcggcac aaccccagtg ccacgttgtg agttggatag 4860

ttgtggaaag agtcaaatgg ctcacctcaa gcgtattcaa caaggggctg aaggatgccc 4920

agaaggtacc ccattgtatg ggatctgatc tggggcctcg gtgcacatgc tttacatgtg 4980

tttagtcgag gttaaaaaac gtctaggccc cccgaaccac ggggacgtgg ttttcctttg 5040

aaaaacacga tgataatatg gcccagtcca agcacggcct gaccaaggag atgaccatga 5100

agtaccgcat ggagggctgc gtggacggcc acaagttcgt gatcaccggc gagggcatcg 5160

gctacccctt caagggcaag caggccatca acctgtgcgt ggtggagggc ggccccttgc 5220

ccttcgccga ggacatcttg tccgccgcct tcatgtacgg caaccgcgtg ttcaccgagt 5280

acccccagga catcgtcgac tacttcaaga actcctgccc cgccggctac acctgggacc 5340

gctccttcct gttcgaggac ggcgccgtgt gcatctgcaa cgccgacatc accgtgagcg 5400

tggaggagaa ctgcatgtac cacgagtcca agttctacgg cgtgaacttc cccgccgacg 5460

gccccgtgat gaagaagatg accgacaact gggagccctc ctgcgagaag atcatccccg 5520

tgcccaagca gggcatcttg aagggcgacg tgagcatgta cctgctgctg aaggacggtg 5580

gccgcttgcg ctgccagttc gacaccgtgt acaaggccaa gtccgtgccc cgcaagatgc 5640

ccgactggca cttcatccag cacaagctga cccgcgagga ccgcagcgac gccaagaacc 5700

agaagtggca cctgaccgag cacgccatcg cctccggctc cgccttgccc tgaacgcgtc 5760

tggaacaatc aacctctgga ttacaaaatt tgtgaaagat tgactggtat tcttaactat 5820

gttgctcctt ttacgctatg tggatacgct gctttaatgc ctttgtatca tgctattgct 5880

tcccgtatgg ctttcatttt ctcctccttg tataaatcct ggttgctgtc tctttatgag 5940

gagttgtggc ccgttgtcag gcaacgtggc gtggtgtgca ctgtgtttgc tgacgcaacc 6000

cccactggtt ggggcattgc caccacctgt cagctccttt ccgggacttt cgctttcccc 6060

ctccctattg ccacggcgga actcatcgcc gcctgccttg cccgctgctg gacaggggct 6120

cggctgttgg gcactgacaa ttccgtggtg ttgtcgggga agctgacgtc ctttccatgg 6180

ctgctcgcct gtgttgccac ctggattctg cgcgggacgt ccttctgcta cgtcccttcg 6240

gccctcaatc cagcggacct tccttcccgc ggcctgctgc cggctctgcg gcctcttccg 6300

cgtcttcgcc ttcgccctca gacgagtcgg atctcccttt gggccgcctc cccgcctgga 6360

attaattctg cagtcgagac ctagaaaaac atggagcaat cacaagtagc aatacagcag 6420

ctaccaatgc tgattgtgcc tggctagaag cacaagagga ggaggaggtg ggttttccag 6480

tcacacctca ggtaccttta agaccaatga cttacaaggc agctgtagat cttagccact 6540

ttttaaaaga aaagagggga ctggaagggc taattcactc ccaacgaaga caagatatcc 6600

ttgatctgtg gatctaccac acacaaggct acttccctga ttagcagaac tacacaccag 6660

ggccaggggt cagatatcca ctgacctttg gatggtgcta caagctagta ccagttgagc 6720

cagataaggt agaagaggcc aataaaggag agaacaccag cttgttacac cctgtgagcc 6780

tgcatgggat ggatgacccg gagagagaag tgttagagtg gaggtttgac agccgcctag 6840

catttcatca cgtggcccga gagctgcatc cggagtactt caagaactgc tgatatcgag 6900

cttgctacaa gggactttcc gctggggact ttccagggag gcgtggcctg ggcgggactg 6960

gggagtggcg agccctcaga tcctgcatat aagcagctgc tttttgcctg tactgggtct 7020

ctctggttag accagatctg agcctgggag ctctctggct aactagggaa cccactgctt 7080

aagcctcaat aaagcttgcc ttgagtgctt caagtagtgt gtgcccgtct gttgtgtgac 7140

tctggtaact agagatccct cagacccttt tagtcagtgt ggaaaatctc tagcagtagt 7200

agttcatgtc atcttattat tcagtattta taacttgcaa agaaatgaat atcagagagt 7260

gagaggcctt gacattgcta gcgtttaccg tcgacctcta gctagagctt ggcgtaatca 7320

tggtcatagc tgtttcctgt gtgaaattgt tatccgctca caattccaca caacatacga 7380

gccggaagca taaagtgtaa agcctggggt gcctaatgag tgagctaact cacattaatt 7440

gcgttgcgct cactgcccgc tttccagtcg ggaaacctgt cgtgccagct gcattaatga 7500

atcggccaac gcgcggggag aggcggtttg cgtattgggc gctcttccgc ttcctcgctc 7560

actgactcgc tgcgctcggt cgttcggctg cggcgagcgg tatcagctca ctcaaaggcg 7620

gtaatacggt tatccacaga atcaggggat aacgcaggaa agaacatgtg agcaaaaggc 7680

cagcaaaagg ccaggaaccg taaaaaggcc gcgttgctgg cgtttttcca taggctccgc 7740

ccccctgacg agcatcacaa aaatcgacgc tcaagtcaga ggtggcgaaa cccgacagga 7800

ctataaagat accaggcgtt tccccctgga agctccctcg tgcgctctcc tgttccgacc 7860

ctgccgctta ccggatacct gtccgccttt ctcccttcgg gaagcgtggc gctttctcat 7920

agctcacgct gtaggtatct cagttcggtg taggtcgttc gctccaagct gggctgtgtg 7980

cacgaacccc ccgttcagcc cgaccgcgcg ccttatccgg taactatcgt cttgagtcca 8040

acccggtaag acacgactta tcgccactgg cagcagccac tggtaacagg attagcagag 8100

cgaggtatgt aggcggtgct acagagttct tgaagtggtg gcctaactac ggctacacta 8160

gaagaacagt atttggtatc tgcgctctgc tgaagccagt taccttcgga aaaagagttg 8220

gtagctcttg atccggcaaa caaaccaccg ctggtagcgg tggttttttt gtttgcaagc 8280

agcagattac gcgcagaaaa aaaggatctc aagaagatcc tttgatcttt tctacggggt 8340

ctgacgctca gtggaacgaa aactcacgtt aagggatttt ggtcatgaga ttatcaaaaa 8400

ggatcttcac ctagatcctt ttaaattaaa aatgaagttt taaatcaatc taaagtatat 8460

atgagtaaac ttggtctgac agttaccaat gcttaatcag tgaggcacct atctcagcga 8520

tctgtctatt tcgttcatcc atagttgcct gactccccgt cgtgtagata actacgatac 8580

gggagggctt accatctggc cccagtgctg caatgatacc gcgagaccca cgctcaccgg 8640

ctccagattt atcagcaata aaccagccag ccggaagggc cgagcgcaga agtggtcctg 8700

caactttatc cgcctccatc cagtctatta attgttgccg ggaagctaga gtaagtagtt 8760

cgccagttaa tagtttgcgc aacgttgttg ccattgctac aggcatcgtg gtgtcacgct 8820

cgtcgtttgg tatggcttca ttcagctccg gttcccaacg atcaaggcga gttacatgat 8880

cccccatgtt gtgcaaaaaa gcggttagct ccttcggtcc tccgatcgtt gtcagaagta 8940

agttggccgc agtgttatca ctcatggtta tggcagcact gcataattct cttactgtca 9000

tgccatccgt aagatgcttt tctgtgactg gtgagtactc aaccaagtca ttctgagaat 9060

agtgtatgcg gcgaccgagt tgctcttgcc cggcgtcaat acgggataat accgcgccac 9120

atagcagaac tttaaaagtg ctcatcattg gaaaacgttc ttcggggcga aaactctcaa 9180

ggatcttacc gctgttgaga tccagttcga tgtaacccac tcgtgcaccc aactgatctt 9240

cagcatcttt tactttcacc agcgtttctg ggtgagcaaa aacaggaagg caaaatgccg 9300

caaaaaaggg aataagggcg acacggaaat gttgaatact catactcttc ctttttcaat 9360

attattgaag catttatcag ggttattgtc tcatgagcgg atacatattt gaatgtattt 9420

agaaaaataa acaaataggg gttccgcgca catttccccg aaaagtgcca cctgacgtcg 9480

acggatcggg agatcaactt gtttattgca gcttataatg gttacaaata aagcaatagc 9540

atcacaaatt tcacaaataa agcatttttt tcactgcatt ctagttgtgg tttgtccaaa 9600

ctcatcaatg tatcttatca tgtctggatc aactggataa ctcaagctaa ccaaaatcat 9660

cccaaacttc ccaccccata ccctattacc actgccaatt acctgtggtt tcatttactc 9720

taaacctgtg attcctctga attattttca ttttaaagaa attgtatttg ttaaatatgt 9780

actacaaact tagtagtttt taaagaaatt gtatttgtta aatatgtact acaaacttag 9840

tagt 9844

Claims (7)

1.一种水痘-带状疱疹病毒的IgM和IgG双检免疫层析试纸，其特征在于，所述试纸包括支撑底板和固定在支撑底板上的吸附层，吸附层从测试端开始依次为样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫；硝酸纤维素膜上含有检测线T1、检测线T2及质控线印迹；所述结合垫上标记的是量子点标记的gE蛋白偶联物；检测线T1标记的是抗人IgG单克隆抗体；检测线T2标记的是抗人IgM单克隆抗体；质控线标记的为抗gE单克隆抗体。

2.如权利要求1所述的水痘-带状疱疹病毒的IgM和IgG双检免疫层析试纸，其特征在于，所述量子点标记的gE蛋白偶联物中的gE蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

3.如权利要求2所述的水痘-带状疱疹病毒的IgM和IgG双检免疫层析试纸，其特征在于，所述gE蛋白的表达载体为真核重组慢病毒表达载体pLVX-gE-IRES-ZsGreen1。

4.如权利要求3所述的水痘-带状疱疹病毒的IgM和IgG双检免疫层析试纸，其特征在于，所述真核重组慢病毒表达载体pLVX-gE-IRES-ZsGreen1的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

5.如权利要求2所述的水痘-带状疱疹病毒的IgM和IgG双检免疫层析试纸，其特征在于，所述gE蛋白的制备方法包括以下步骤：

(1)将gE蛋白信号肽以及gE蛋白胞外区序列优化成CHO偏爱密码子，合成优化后的gE基因序列；所述优化后的gE基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；

(2)构建真核重组慢病毒表达载体pLVX-gE-IRES-ZsGreen1，简称pLVX-gE，pLVX-gE的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

(3)将pLVX-gE与慢病毒包装质粒PSPAX2及包膜质粒PMD2.G共转染293T细胞，收集慢病毒悬液后转导CHO细胞，筛选CHO-gE阳性细胞；

(4)将CHO-gE阳性细胞扩大培养，加入SMS CHO-SUPI培养基添加液，诱导表达水痘-带状疱疹病毒的gE蛋白；

(5)收集gE蛋白的培养上清，对gE蛋白进行纯化。

6.如权利要求1所述的水痘-带状疱疹病毒的IgM和IgG双检免疫层析试纸，其特征在于，所述的抗gE单克隆抗体是利用权利要求5的gE蛋白作为抗原制备的。

7.如权利要求1所述的IgM和IgG双检免疫层析试纸在水痘-带状疱疹病毒的IgM和IgG抗体检测中的应用。

Images