KR20210049133A - 무혈청 배지에서 벡터 제조 - Google Patents

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KR20210049133A
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치린 리
제프리 에스. 바틀렛
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씨에스엘 베링 진 테라피, 인크.
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Abstract

본원 개시내용의 하나의 양상에서, 안정한 생산자 세포주 세포의 유도 후 약 40시간 마다 내지 약 56시간 마다 바이러스 역가를 수거하는 방법이 제공되고, 여기서, 상기 바이러스 역가는 무혈청 배지에서 적어도 부분적으로 수거된다. 본원 개시내용의 또 다른 양상에서, 벡터 상등액을 수거하는 방법이 제공되고, 상기 방법은 안정한 생산자 세포주 세포를 생성하는 단계; 생성된 안정한 생산자 세포주 세포로부터 바이러스 벡터 생성을 유도하는 단계; 및 바이러스 벡터의 초기 수거 후 약 40 내지 약 56시간 마다 무혈청 배지에서 유도된 생성된 안정한 생산자 세포주 세포로부터 바이러스 벡터를 반복적으로 수거하는 단계를 포함한다.

Description

무혈청 배지에서 벡터 제조
관련 출원에 대한 상호 참조
[0001] 본 출원은 2018년 8월 24일자로 출원된 미국 가특허 출원 번호 제62/722,784호의 출원일의 우선권을 주장하고 이의 개시내용은 전문이 본원에 참조로 인용된다.
[0002] 본원의 개시내용은 일반적으로 바이오-제조 방법 및 바이러스 역가를 수득하는 방법에 관한 것이다.
[0003] 시험관내 배양 조건하에서 성장한 세포주 및 1차 세포는 (i) 대수기에서 세포 복제 및 (ii) 세포가 더 이상 분열하지 않으면, 즉 세포가 정체기에 있는 경우 세포 유지를 지지할 수 있는 특수 성장 및 유지 배지를 필요로 한다. 통상적으로 사용되는 세포 배양 배지는 비타민, 아미노산, 필수 미량 원소 및 당을 함유하는 풍부한 염 용액을 포함한다. 세포 성장 및 유지를 지지하기 위해 요구되는 성장 호르몬, 효소 및 생물학적 활성 단백질은 일반적으로 동물 혈액 유래된 혈청 생성물 형태로 배지에 보충제로서 첨가된다. 동물 혈액 유래된 혈청 생성물의 예는 태아 송아지 혈청, 닭 혈청, 말 혈청 및 돼지 혈청이다. 이들 혈청은 분획화된 혈액으로부터 유래하고, 상기 혈액으로부터 적혈구 세포 및 백혈구 세포는 제거되었다.
[0004] 동물 혈청은 세포의 성장을 위해 요구되는 인자들 뿐만 아니라, 천연적으로 접착 세포로서 성장하는 세포가 배양 용기의 세포 고체 표면에 접착하기 위해 요구되는 인자들을 포함한다. 따라서, 접착 세포를 위해서는 충분한 혈청이 배지에 첨가되어 이들이 성장하여 단일층을 형성하도록 할 수 있게 하기 위해 중요하다.
[0005] 불행하게도, 소/태아 송아지 혈청, 및 다른 동물 기원의 혈청은 바이러스 또는 프리온 단백질과 같은 후천성 병원성 제제를 함유할 수 있다. 이들 병원성 제제는 백신 또는 세포 배양 중에 생성된 임의의 다른 약제학적 생성물로 치료되거나 백신접종될 동물/사람으로 전달될 수 있다는 잠재적 위험이 있다. 이것은 특히 세포 배양 생성물이 면역 손상된 사람으로 투여되는 경우 해당된다. 세포 배양 중에 동물 혈청의 사용과 관련된 가능한 위험의 관점에서, 동물 생성물을 사용하지 않는 제조 공정이 매우 요구될 수 있다는 것은 명백해졌다.
[0006] 임상 시험을 지지하기 위한 스케일로 자가-불활성화-벡터 (“SIN-벡터”)의 생성은 당해 기술 분야에서 중요한 과제이다. 감마-레트로바이러스 벡터는 안정한 생산자 세포주의 일시적 형질감염 또는 생성에 의해 생성될 수 있지만, 렌티바이러스는 다수의 세포독성 악세서리 유전자의 발현을 필요로 하여 이는 생산자 세포의 생성을 보다 복잡하게 한다(문헌참조: Greene et al., Transduction of Human CD34+ Repopulating Cells with a Self - Inactivating Lentiviral Vector for SCID-Xl Produced at Clinical Scale by a Stable Cell Line, HGTM, 23, 297-308 (October 2012), 이의 개시내용은 이의 전문이 본원에 참조로 인용된다). 일시적 형질감염은 대신 렌티바이러스의 시험 생산을 위한 현재 기술이고, 이는 안전성, 비용 및 재현성 견지하에 매우 규모가 큰 응용에서는 비현실적이다. 사실, 상기 기술은 고가이고 표준화하고 스케일-업하기가 어려우며 배치 마다의 변동성 및 낮은 역전사 효소 정확도의 문제점을 갖고 있다(문헌참조: Stornaiuolo et al., RD2-MolPack-Chim3, a Packaging Cell Line for Stable Production of Lentiviral Vectors for Anti-HIV Gene Therapy, HGTM, 24:228-240 (August 2013), 이의 개시내용은 이의 전문이 본원에 참조로 인용된다).
발명의 간단한 요약
[0007] 매일 수거 (예를 들어, 24시간 마다 수거)를 사용한 제조 프로토콜을 사용하여 소규모로 다양한 시험 벡터를 제조할 수 있지만 매일 수거 및 배지 교환은 흔히 경제적이지 못하다. 매일 수거에 대한 대안으로서, 출원인은 “2일 수거” 프로토콜을 개발하였고, 여기서, 바이러스 벡터는 바이러스 벡터의 초기 수거 후 약 40시간 내지 약 56시간 마다 무혈청 배지에서 반복적으로 수거한다. 출원인은 예상치 않게 무혈청 배지를 사용한 상기 “2일 수거” 프로토콜이 보다 통상적인 매일 수거와 거의 동일한 양의 바이러스 벡터를 생성시킬 수 있고 또한 적은 배양 배지를 요구한다는 이득을 제공함을 발견하였다. 기재된 “2일 수거” 과정과 함께 무혈청 배지의 사용이 무혈청 배지와 비교하여 혈청 함유 배지와 관련된 높인 비용을 고려하면, 대규모 바이오-제조를 위해 특히 중요한 것으로 사료된다. 추가로, 혈청-함유 배지에 잠재적으로 존재하는 병원성 제제의 수거된 바이러스 벡터로 처리된 대상체로의 전달 위험이 무혈청 배지를 사용하는 경우 최소화되거나 제거된다. 이들 이득은 산업 분야에서 대규모 바이오 제조 비용을 감소시키고 안전성을 증진시키고 동시에 높은 양의 바이러스 벡터 역가가 회수될 수 있는 바이오-제조 공정을 제공하는데 있어서 충족되지 않았던 필요성을 만족시킨다.
[0008] 본원 개시내용의 제1 양상에서, 벡터 상등액을 수거하는 방법이 제공되고, 상기 방법은 안정한 생산자 세포주 세포를 생성하는 단계; 생성된 안정한 생산자 세포주 세포로부터 바이러스 벡터 생성을 유도하는 단계; 및 바이러스 벡터의 초기 수거 후 약 40 내지 약 56시간 마다 무혈청 배지에서 유도된 생성된 안정한 생산자 세포주 세포로부터 바이러스 벡터를 반복적으로 수거하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 반복적인 수거는 새로운 무혈청 배지를 추가로 생성된 안정한 생산자 세포주 세포를 도입하는 것 없이 유도된 생성된 안정한 생산자 세포주 세포에 첨가함을 포함한다.
[0009] 일부 구현예에서, 수거를 위해 사용되는 무혈청 배지는 각각의 반복적인 수거 후 대체한다. 일부 구현예에서, 어떠한 추가의 무혈청 배지는 각각의 개별 수거 동안에 생성된 안정한 생산자 세포주 세포에 도입되지 않는다. 일부 구현예에서, 무혈청 배지는 하나 이상의 성장 인자를 포함한다. 일부 구현예에서, 무혈청 배지는 하나 이상의 지질을 포함한다. 일부 구현예에서, 무혈청 배지는 성장 인자 및 지질 둘다를 포함한다. 일부 구현예에서, 지질은 콜레스테롤, 인지질 및 지방산을 포함한다.
[0010] 일부 구현예에서, 바이러스 벡터의 초기 수거는 유도 후 (즉, 바이러스 벡터 생산 유도 후) 약 40시간 내지 약 56시간에 수행한다. 일부 구현예에서, 바이러스 벡터의 초기 수거는 유도 후 48시간 미만에 수행한다. 일부 구현예에서, 바이러스 벡터의 반복적인 수거는 약 44 내지 약 52시간 마다 수행한다. 일부 구현예에서, 바이러스 벡터의 반복적인 수거는 약 46 내지 약 50시간 마다 수행한다. 일부 구현예에서, 바이러스 벡터의 반복적인 수거는 약 48시간 마다 수행한다.
[0011] 일부 구현예에서, 반복적인 수거의 각각의 개별 수거 동안에 약 0.5 x 106 TU/mL 내지 약 4 x 106 TU/mL 범위의 바이러스 역가 생성을 위한 방법이 제공된다. 일부 구현예에서, 바이러스 역가는 반복적인 수거의 각각의 개별 수거 동안에 약 0.5 x 106 TU/mL 내지 약 2 x 106 TU/mL 범위이다. 일부 구현예에서, 바이러스 역가는 반복적인 수거의 각각의 개별 수거 동안에 약 0.5 x 106 TU/mL 내지 약 1.5 x 106 TU/mL 범위이다. 일부 구현예에서, 바이러스 벡터의 반복적인 수거는 적어도 2회 수행한다. 일부 구현예에서, 바이러스 벡터의 반복적인 수거는 적어도 3회 수행한다. 일부 구현예에서, 바이러스 벡터의 반복적인 수거는 적어도 4회 수행한다. 일부 구현예에서, 바이러스 벡터의 반복적인 수거는 적어도 5회 수행한다. 일부 구현예에서, 바이러스 벡터의 반복적인 수거는 적어도 10회 수행한다. 일부 구현예에서, 바이러스 벡터의 반복적인 수거는 적어도 20회 수행한다. 일부 구현예에서, 반복적인 수거는 약 10일 내지 약 90일 범위의 기간 동안 수행한다. 일부 구현예에서, 반복적인 수거는 약 20일 내지 약 70일 범위의 기간 동안 수행한다.
[0012] 일부 구현예에서, 안정한 생산자 세포주 세포는 팩키징 세포주 세포로부터 유래한다. 일부 구현예에서, 팩키징 세포주 세포는 CHO 세포, BHK 세포, MDCK 세포, C3H 10T1/2 세포, FLY 세포, Psi-2 세포, BOSC 23 세포, PA317 세포, WEHI 세포, COS 세포, BSC 1 세포, BSC 40 세포, BMT 10 세포, VERO 세포, W138 세포, MRC5 세포, A549 세포, HT1080 세포, 293 세포, 293T 세포, B-50 세포, 3T3 세포, NIH3T3 세포, HepG2 세포, Saos-2 세포, Huh7 세포, HeLa 세포, W163 세포, 211 세포, 및 211 A 세포로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 세포로부터 유래한다. 일부 구현예에서, 팩키징 세포주 세포는 GPR, GPRG, GPRT, GPRGT, 및 GPRT-G 세포주 세포로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
[0013] 일부 구현예에서, 안정한 생산자 세포주 세포는 (a) 하나 이상의 유전자를 재조합 플라스미드로 클로닝함에 의해 벡터를 합성하는 단계; (b) (i) 상기 합성된 벡터로부터 절단된 발현 카세트 및 (ii) 항생제 내성 카세트 플라스미드로부터 수득된 발현 카세트로부터 콘카타머 어레이를 형성하는 단계; (c) GPR, GPRG, GPRT, GPRGT, 또는 GPRT-G 팩키징 세포주 세포를 형성된 콘카타머 어레이로 형질감염시키는 단계; 및 (d) 안정한 생산자 세포주 세포를 단리하는 단계에 의해 생성된다. 일부 구현예에서, 합성된 벡터는 렌티바이러스 벡터, 예를 들어, 자가-불활성화 렌티바이러스 벡터이다. 일부 구현예에서, 항생제 내성 카세트 플라스미드는 블레오마이신 항생제 내성 카세트이다. 일부 구현예에서, 합성된 벡터로부터 절단된 발현 카세트 및 블레오마이신 항생제 내성 카세트로부터 수득된 발현 카세트의 몰비는 약 50:1 내지 약 1:50의 범위이다. 일부 구현예에서, 상기 몰비는 약 25:1 내지 약 1:25 범위이다. 일부 구현예에서, 상기 몰비는 약 15:1 내지 약 1:15 범위이다. 일부 구현예에서, 상기 몰비는 약 10:1 내지 약 1:10 범위이다.
[0014] 일부 구현예에서, 재조합 플라스미드는 서열번호 1의 것과 적어도 약 90% 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 재조합 플라스미드는 서열번호 1의 것과 적어도 약 95% 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 재조합 플라스미드는 서열번호 1의 것과 적어도 약 99% 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 재조합 플라스미드는 서열번호 2의 것과 적어도 약 90% 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 재조합 플라스미드는 서열번호 2의 것과 적어도 약 95% 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 재조합 플라스미드는 서열번호 2의 것과 적어도 약 99% 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 재조합 플라스미드는 BstBI, MluI, NotI, 및/또는 ClaI 제한 엔도뉴클레아제 부위를 갖는 다중 클로닝 부위를 포함한다. 일부 구현예에서, 다중 클로닝 부위를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 7의 것과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는다. 일부 구현예에서, 다중 클로닝 부위를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 7의 것과 적어도 약 95% 서열 동일성을 갖는다. 일부 구현예에서, 재조합 플라스미드는 추가로 팩키징 신호를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열; 중심 폴리퓨린 트랙을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열; Rev 반응 요소를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열; 및 자가-불활성화 긴 말단 반복체를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 벡터 카세트는 적어도 2개의 추가의 제한 엔도뉴클레아제 부위에 의해 플랭킹되어 있고, 상기 적어도 2개의 추가의 제한 엔도뉴클레아제 부위는 독립적으로 sfiI 및 Bsu36I로부터 선택된다.
[0015] 일부 구현예에서, 합성된 벡터는 치료학적 유전자 (본원에 열거된 임의의 유전자들을 포함하는)를 암호화하는 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 치료학적 유전자는 겸상 적혈구 질환을 보정하거나 적어도 겸상 적혈구 질환 중 하나의 증상을 경감시킨다. 일부 구현예에서, 치료학적 유전자는 감마-글로빈 유전자이다. 일부 구현예에서, 치료학적 유전자는 위스콧-알드리치 (Wiskott-Aldrich) 증후군 단백질이다. 일부 구현예에서, 치료학적 유전자는 C1 에스테라제 억제제 단백질이다. 일부 구현예에서, 치료학적 유전자는 브루톤 (Bruton)의 티로신 키나제이다. 일부 구현예에서, 합성된 벡터는 하이포크산틴 포스포리보실트랜스퍼라제 (“HPRT”)를 녹다운시키는 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 합성된 벡터는 (i) HPRT를 녹다운시키는 제1 핵산 서열, 및 (ii) 치료학적 유전자(본원에 열거되거나 상기 언급된 임의의 치료학적 유전자를 포함하는)를 암호화하는 제2 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 합성된 벡터는 (i) HPRT를 녹다운시키는 제1 핵산 서열, 및 (ii) 감마-글로빈 유전자를 암호화하는 제2 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 합성된 벡터는 (i) HPRT를 녹다운시키는 제1 핵산 서열, 및 (ii) 위스콧-알드리치 증후군 단백질을 암호화하는 제2 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 합성된 벡터는 CCR5를 녹다운시키는 핵산 서열을 포함한다.
[0016] 일부 구현예에서, 바이러스 벡터 생산 유도는 혈청 함유 배지에서 수행한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 유도 후 약 18시간 내지 약 28시간의 혈청-함유 배지를 추가의 혈청-함유 배지로 대체함을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 유도 후 약 24시간의 혈청-함유 배지를 추가의 혈청-함유 배지로 대체함을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 유도 후 약 18시간 내지 약 28시간의 혈청-함유 배지를 무혈청 배지로 대체함을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 유도 후 약 24시간의 혈청-함유 배지를 무혈청 배지로 대체함을 포함한다. 일부 구현예에서, 무혈청 배지는 지질 및/또는 성장 인자를 포함할 수 있다.
[0017] 본원 개시내용의 제2 양상에서 안정한 생산자 세포주 세포로부터 바이러스 벡터를 생산하는 방법이 제공되고, 상기 방법은 (a) 하나 이상의 핵산 서열을 재조합 플라스미드에 삽입함에 의해 벡터를 합성하는 단계; (b) 합성된 벡터로부터 절단된 발현 카세트 및 항생제 내성 카세트 플라스미드로부터 수득된 DNA 단편으로부터 콘카타머 어레이를 형성하는 단계; (c) GPR, GPRG, GPRT, GPRGT, GPRT-G 팩킹 세포주 또는 이의 유도체 중 하나를 형성된 콘카타머 어레이로 형질감염시켜 안정한 생산자 세포주 세포를 제공하는 단계; (d) 안정한 생산자 세포주 세포로부터 바이러스 벡터 생성을 유도하는 단계; 및 (e) 바이러스 벡터의 초기 수거 후 약 40시간 내지 약 56시간 마다 무혈청 배지 중에서 바이러스 벡터를 반복적으로 수거하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 초기 수거는 유도 후 약 40시간 내지 약 56시간에 수행한다. 일부 구현예에서, 바이러스 벡터는 약 44시간 내지 약 52시간 마다 반복적으로 수거한다. 일부 구현예에서, 바이러스 벡터는 약 48시간 마다 반복적으로 수거한다. 일부 구현예에서, 무혈청 배지는 하나 이상의 성장 인자를 포함한다. 일부 구현예에서, 무혈청 배지는 하나 이상의 지질을 포함한다. 일부 구현예에서, 무혈청 배지는 성장 인자 및 지질 둘다, 예를 들어, 하나 이상의 성장 인자 및/또는 하나 이상의 지질을 포함하는 혼합물을 포함한다. 일부 구현예에서, 반복적인 수거는 새로운 무혈청 배지를 추가로 생성된 안정한 생산자 세포주 세포를 도입하는 것 없이 유도된 생성된 안정한 생산자 세포주 세포에 첨가함을 포함한다.
[0018] 일부 구현예에서, 안정한 생산자 세포주는 GPRG 팩키징 세포주를 기반으로 한다. 일부 구현예에서, 안정한 생산자 세포주는 GPRT 팩키징 세포주를 기반으로 한다. 일부 구현예에서, 안정한 생산자 세포주는 GPR 팩키징 세포주를 기반으로 한다. 일부 구현예에서, 합성된 벡터로부터의 DNA 단편과 항생제 내성 카세트로부터의 DNA 단편의 비율은 약 25:1 내지 약 1:25의 범위이다. 일부 구현예에서, 항생제 내성 카세트 플라스미드는 블레오마이신 항생제 내성 카세트이다.
[0019] 일부 구현예에서, 재조합 플라스미드는 서열번호 1의 것과 적어도 약 90% 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 재조합 플라스미드는 서열번호 1의 것과 적어도 약 95% 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 재조합 플라스미드는 서열번호 2의 것과 적어도 약 90% 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 재조합 플라스미드는 서열번호 2의 것과 적어도 약 95% 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
[0020] 일부 구현예에서, 바이러스 벡터 생산 유도는 혈청 함유 배지에서 수행한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 유도 후 약 24시간의 혈청-함유 배지를 추가의 혈청-함유 배지로 대체함을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 유도 후 약 24시간의 혈청-함유 배지를 무혈청 배지로 대체함을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 무혈청 배지는 지질 및/또는 성장 인자를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 지질은 콜레스테롤, 인지질 및 지방산을 포함한다.
[0021] 일부 구현예에서, 재조합 플라스미드에 삽입된 하나 이상의 핵산 서열은 치료학적 유전자이다. 적합한 치료학적 유전자의 예는 본원에 열거된다. 일부 구현예에서, 재조합 플라스미드에 삽입된 하나 이상의 핵산 서열은 감마-글로빈 유전자이다. 일부 구현예에서, 재조합 플라스미드에 삽입된 하나 이상의 핵산 서열은 HPRT를 녹다운시키는 RNA 간섭 제제 (“RNAi 제제”)를 포함한다. 일부 구현예에서, RNAi 제제는 shRNA, 마이크로RNA, 또는 이의 하이브리드이다. 일부 구현예에서, 재조합 플라스미드에 삽입된 하나 이상의 핵산 서열은 CCR5를 녹다운시키는 RNAi를 포함한다.
[0022] 일부 구현예에서, 반복적인 수거의 각각의 개별 수거 동안에 약 0.5 x 106 TU/mL 내지 약 4 x 106 TU/mL 범위의 바이러스 역가 생성을 위한 방법이 제공된다. 일부 구현예에서, 바이러스 역가는 반복적인 수거의 각각의 개별 수거 동안에 약 0.5 x 106 TU/mL 내지 약 2 x 106 TU/mL 범위이다. 일부 구현예에서, 바이러스 역가는 반복적인 수거의 각각의 개별 수거 동안에 약 0.5 x 106 TU/mL 내지 약 1.5 x 106 TU/mL 범위이다. 일부 구현예에서, 바이러스 벡터는 적어도 5회 수거한다. 일부 구현예에서, 바이러스 벡터는 적어도 10회 수거한다. 일부 구현예에서, 바이러스 벡터는 적어도 20회 수거한다. 일부 구현예에서, 바이러스 벡터는 적어도 20회 수거한다. 일부 구현예에서, 반복적인 수거는 약 10일 내지 약 90일 범위의 기간 동안 수행한다. 일부 구현예에서, 반복적인 수거는 약 20일 내지 약 70일 범위의 기간 동안 수행한다.
[0023] 본원 개시내용의 제3 양상에서, 안정한 생산자 세포주 세포로부터 벡터 상등액을 수거하는 방법이 제공되고, 상기 방법은 안정한 생산자 세포주 세포로부터 바이러스 벡터 생성을 유도하는 단계; 및 바이러스 벡터의 초기 수거 후 약 40 내지 약 56시간 마다 무혈청 배지에서 유도된 안정한 생산자 세포주 세포로부터 바이러스 벡터를 반복적으로 수거하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 반복적인 수거는 새로운 무혈청 배지를 추가로 생성된 안정한 생산자 세포주 세포를 도입하는 것 없이 유도된 생성된 안정한 생산자 세포주 세포에 첨가함을 포함한다. 일부 구현예에서, 바이러스 벡터는 먼저 유도 후 약 40시간에 수거한다. 일부 구현예에서, 바이러스 벡터는 바이러스 벡터의 초기 수거 후 약 48시간 마다 반복적으로 수거한다. 일부 구현예에서, 반복적인 수거의 각각의 개별 수거 동안에 약 0.5 x 106 TU/mL 내지 약 4 x 106 TU/mL 범위의 바이러스 역가 생성을 위한 방법이 제공된다. 일부 구현예에서, 바이러스 벡터는 적어도 5회 수거한다. 일부 구현예에서, 바이러스 벡터는 적어도 10회 수거한다. 일부 구현예에서, 바이러스 벡터는 적어도 20회 수거한다. 일부 구현예에서, 반복적인 수거는 약 10일 내지 약 90일 범위의 기간 동안 수행한다. 일부 구현예에서, 반복적인 수거는 약 20일 내지 약 70일 범위의 기간 동안 수행한다.
[0024] 일부 구현예에서, 무혈청 배지는 하나 이상의 첨가제를 포함한다. 일부 구현예에서, 첨가제는 하나 이상의 성장 인자를 포함한다. 일부 구현예에서, 첨가제는 하나 이상의 지질을 포함한다. 일부 구현예에서, 지질은 콜레스테롤, 인지질 및 지방산을 포함한다.
[0025] 일부 구현예에서, 안정한 생산자 세포주 세포는 혈청-함유 배지에서 계대하고 여기서, 상기 세포는 무혈청 배지에서 배양한다. 일부 구현예에서, 안정한 생산자 세포주 세포는 혈청-함유 배지에 팩키징하고 여기서, 상기 세포는 혈청 함유 배지에서 배양한다.
[0026] 일부 구현예에서, 바이러스 벡터는 치료학적 유전자를 암호화하는 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 치료학적 유전자는 겸상 적혈구 질환을 보정하거나 적어도 겸상 적혈구 질환 중 하나의 증상을 경감시킨다. 일부 구현예에서, 바이러스 벡터는 감마-글로빈 유전자를 암호화하는 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 바이러스 벡터는 HPRT를 녹다운시키는 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 바이러스 벡터는 (i) HPRT를 녹다운시키는 제1 핵산 서열, 및 (ii) 치료학적 유전자를 암호화하는 제2 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 바이러스 벡터는 CCR5를 녹다운시키는 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 바이러스 벡터는 CRISPR/Cas 성분들을 암호화하는 핵산 서열을 포함한다.
[0027] 본원 개시내용의 제4 양상에서, HPPRT를 녹다운시키는 RNAi를 암호화하는 제1 핵산 서열을 포함하는 바이러스 벡터를 포함하는 조성물이 제공되고, 상기 바이러스 벡터는 생성된 안정한 생산자 세포주 세포로부터 바이러스 벡터 생성을 유도하는 단계; 및 바이러스 벡터의 초기 수거 후 약 40 내지 약 56시간 마다 유도된 생성된 안정한 생산자 세포주 세포로부터 바이러스 벡터를 반복적으로 수거하는 단계에 의해 생성된다. 일부 구현예에서, 바이러스 벡터의 반복적인 수거는 새로운 배지를 추가로 생성된 안정한 생산자 세포주 세포를 도입하는 것 없이 유도된 생성된 안정한 생산자 세포주 세포에 첨가함을 포함한다. 일부 구현예에서, 반복되는 수거는 무혈청 배지에서 수행된다.
[0028] 일부 구현예에서, 바이러스 벡터는 제2 핵산 서열을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 핵산 서열은 본원에 열거된 임의의 것들을 포함하는 치료학적 유전자를 암호화한다. 일부 구현예에서, 치료학적 유전자는 감마 글로빈 유전자이다. 일부 구현예에서, 치료학적 유전자는 위스콧-알드리치 (Wiskott-Aldrich) 증후군 단백질이다. 일부 구현예에서, 치료학적 유전자는 C1 에스테라제 억제제 단백질이다. 일부 구현예에서, 치료학적 유전자는 브루톤 (Bruton)의 티로신 키나제이다. 일부 구현예에서, 제2 핵산은 뉴클레아제를 암호화한다. 일부 구현예에서, 뉴클레아제는 호밍 엔도뉴클레아제, 전사 활성화인자 유사 이펙터 뉴클레아제, 아연 핑거 뉴클레아제, II형 클러스터링된 규칙적으로 이격된 짧은 팔린드롬 반복체 및 메가TAL 뉴클레아제로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 제2 핵산 서열은 CRISPR/Cas 성분들을 암호화한다. 일부 구현예에서, CRISPR/Cas 성분들은 Cas9 단백질 및 Cas12 단백질로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 바이러스 벡터는 레트로바이러스 벡터이다. 일부 구현예에서, 바이러스 벡터는 렌티바이러스 벡터이다.
[0029] 본원 개시내용의 제5 양상에서, 숙주 세포를 형질도입하는데 있어서 본원 개시내용의 제4 양상의 바이러스 벡터를 포함하는 조성물의 용도가 제공된다. 적합한 숙주 세포는 사람 세포, 뮤린 세포, 비-사람 영장류 세포(예를 들어, 레서스 몽키 세포), 사람 전구 세포 또는 줄기 세포, 293 세포, HeLa 세포, D17 세포, MDCK 세포, BHK 세포, 및 Cf2Th 세포를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 숙주 세포는 조혈 세포, 예를 들어, 조혈 전구 세포/줄기 세포(예를 들어, CD34-양성 조혈 전구 세포/줄기 세포(HPSC)), 단핵구, 대식세포, 말초 혈액 단핵 세포, CD4+ T 림프구, CD8+ T 림프구 또는 수지상 세포이다. 일부 구현예에서, 숙주 세포는 형질도입 후 실질적으로 HPRT 결핍이되게 하고, 예를 들어, HPRT 발현에서 적어도 50% 감소를 갖는다.
[0030] 본원의 개시내용의 제6 양상에서 바이러스 역가를 반복적으로 수거하는 방법이 제공되고, 상기 방법은 하기의 단계를 포함한다: (a) 안정한 생산자 세포주 세포가 혈청-함유 배지에서 계대되는 계대 단계, (b) 상기 안정한 생산자 세포주 세포가 제1 무혈청 배지에서 처리되는 배양 단계, 및 (c) 상기 생산자 세포주 세포가 제2 무혈청 배지에서 처리되는 제조 단계. 일부 구현예에서, 바이러스 벡터는 유도된 안정한 생산자 세포주 세포로부터 반복적으로 수거하였고, 여기서, 상기 반복되는 수거는 무혈청 배지에서 수행한다. 일부 구현예에서, 반복되는 수거는 바이러스 벡터의 초기 수거 후 약 40시간 내지 약 56시간 마다 수행한다. 일부 구현예에서, 반복되는 수거는 새로운 무혈청 배지를 추가의 안정한 생산자 세포주 세포를 도입하는 것 없이 유도된 안정한 생산자 세포주 세포에 첨가하는 단계를 포함한다.
[0031] 일부 구현예에서, 제1 무혈청 배지는 하나 이상의 첨가제를 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 무혈청 배지는 하나 이상의 첨가제를 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 무혈청 배지는 동일하다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 무혈청 배지는 상이하고, 예를 들어, 각각은 상이한 첨가 성분을 포함한다. 예를 들어, 제1 무혈청 배지는 하나 유형의 성장 인자를 포함할 수 있고 제2 무혈청 배지는 상이한 유형의 성장 인자를 포함할 수 있다. 또한, 제1 무혈청 배지는 하나 이상의 성장 인자를 포함할 수 있고 제2 무혈청 배지는 하나 이상의 지질을 포함한다. 일부 구현예에서, 임의의 무혈청 배지에서 첨가제의 양은 배지의 약 0.05% 내지 약 10용적% 범위이다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 반복적인 수거의 각각의 개별 수거 동안에 약 0.5 x 106 TU/mL 내지 약 4 x 106 TU/mL 범위의 양으로 바이러스 역가 수거를 위한 방법이 제공된다. 일부 구현예에서, 바이러스 벡터는 적어도 5회 수거한다. 일부 구현예에서, 바이러스 벡터는 적어도 10회 수거한다. 일부 구현예에서, 바이러스 벡터는 적어도 20회 수거한다. 일부 구현예에서, 바이러스 벡터는 적어도 20회 수거한다. 일부 구현예에서, 반복적인 수거는 약 10일 내지 약 90일 범위의 기간 동안 수행한다. 일부 구현예에서, 반복적인 수거는 약 20일 내지 약 70일 범위의 기간 동안 수행한다.
[0032] 일부 구현예에서, 안정한 생산자 세포주 세포는 (a) 하나 이상의 유전자를 재조합 플라스미드에 클로닝함에 의해 벡터를 합성하는 단계; (b) (i) 상기 합성된 벡터로부터 절단된 발현 카세트 및 (ii) 항생제 내성 카세트 플라스미드로부터 수득된 발현 카세트로부터 콘카타머 어레이를 형성하는 단계; (c) GPR, GPRG, GPRT, GPRGT, 또는 GPRT-G 팩키징 세포주 중 하나를 형성된 콘카타머 어레이로 형질감염시키는 단계; 및 (d) 안정한 생산자 세포주를 단리하는 단계에 의해 생성된다.
[0033] 일부 구현예에서, 합성된 벡터는 치료학적 유전자를 암호화하는 핵산 서열을 포함한다. 적합한 치료학적 유전자의 예는 본원에 열거된다. 일부 구현예에서, 치료학적 유전자는 겸상 적혈구 질환을 보정하거나 적어도 겸상 적혈구 질환 중 하나의 증상을 경감시킨다. 일부 구현예에서, 합성된 벡터는 감마-글로빈 유전자를 암호화하는 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 합성된 벡터는 하이포크산틴 포스포리보실트랜스퍼라제 (“HPRT”)를 녹다운시키는 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 합성된 벡터는 (i) HPRT를 녹다운시키는 제1 핵산 서열, 및 (ii) 치료학적 유전자(감마-글로빈 유전자)를 암호화하는 제2 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 합성된 벡터는 CCR5를 녹다운시키는 핵산 서열을 포함한다.
[0034] 본원 개시내용의 제7 양상에서, 벡터 상등액을 수거하는 방법이 제공되고, 상기 방법은 안정한 생산자 세포주 세포를 생성하는 단계로서, 여기서, 상기 안정한 생산자 세포주 세포는 GPR, GPRG, GPRT, GPRGT, 또는 GPRT-G 팩키징 세포주 또는 이의 유도체 중 하나로 부터 유래하는, 단계; 상기 생성된 안정한 생산자 세포주 세포로부터 바이러스 벡터 생성을 유도하는 단계; 및 바이러스 벡터의 초기 수거 후 약 40 내지 약 56시간 마다 무혈청 배지에서 상기 유도된 생성된 안정한 생산자 세포주 세포로부터 바이러스 벡터를 반복적으로 수거하는 단계로서, 여기서, 상기 반복적인 수거가 추가의 생성된 안정한 생산자 세포주 세포를 도입하는 것 없이 새로운 무혈청 배지를 상기 유도된 생성된 안정한 세포주 세포에 첨가함을 포함하는, 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 무혈청 배지는 하나 이상의 성장 인자를 포함한다. 일부 구현예에서, 무혈청 배지는 하나 이상의 지질을 포함한다. 일부 구현예에서, 바이러스 벡터의 초기 수거는 유도 후 약 40시간 내지 약 56시간에 수행한다. 일부 구현예에서, 바이러스 벡터의 초기 수거는 유도 후 48시간 미만에 수행한다. 일부 구현예에서, 반복적인 수거는 적어도 2회 수행한다. 일부 구현예에서, 반복적인 수거는 약 44 내지 약 52시간 마다 수행한다. 일부 구현예에서, 반복적인 수거는 약 48시간 마다 수행한다.
[0035] 일부 구현예에서, 무혈청 배지는 각각의 반복적인 수거 후 대체한다. 일부 구현예에서, 반복적인 수거의 각각의 개별 수거 동안에 약 0.5 x 106 TU/mL 내지 약 4 x 106 TU/mL 범위의 바이러스 역가 생성을 위한 방법이 제공된다. 일부 구현예에서, 바이러스 역가는 반복적인 수거의 각각의 개별 수거 동안에 약 0.5 x 106 TU/mL 내지 약 2 x 106 TU/mL 범위이다. 일부 구현예에서, 바이러스 벡터는 적어도 5회 수거한다. 일부 구현예에서, 바이러스 벡터는 적어도 10회 수거한다. 일부 구현예에서, 바이러스 벡터는 적어도 20회 수거한다. 일부 구현예에서, 반복적인 수거는 약 10일 내지 약 90일 범위의 기간 동안 수행한다. 일부 구현예에서, 반복적인 수거는 약 20일 내지 약 70일 범위의 기간 동안 수행한다.
[0036] 도 1은 동일한 렌티바이러스 벡터가 확립된 과정에 따라 HEK293T/17 세포 상에 일시적 형질감염에 의해 또는 GPRG-기반 안정한 생산자 세포주를 사용함에 의해 반복적으로 생성됨을 도시한다. 벡터 함유 배지(VCM)는 초원심분리에 의해 100x 농축시키고 렌티바이러스 (LV) 역가는 유전자 형질도입 검정에 의해 결정하였다.
[0037] 도 2는 안정한 생산자 세포주를 생성하고, 상기 생성된 안정한 생산자 세포주로부터 생성된 렌티바이러스 벡터를 수거하기 위한 방법을 도시하는 흐름도이다.
[0038] 도 3은 3개월 기간의 연속 계대 동안에 2개의 상이한 세포주 MWCB에 대한 생산자 세포주 안정성의 평가를 도시한다. 규칙적 간격으로, 렌티바이러스 벡터는 테트라사이클린 (TET) 제거에 의해 유도되었고 VCM은 유전자 형질도입 검정에 의한 렌티바이러스 벡터 역가에 대해 평가하였다. 세포주 둘다는 안정하였고 3개월 기간 (약 90일) 동안 및 약 25회 초과의 계대 동안 1 x 106 TU / mL 초과로 렌티바이러스 벡터를 생성할 수 있다.
[0039] 도 4는 TET 제거에 의한 유도 후 렌티바이러스 벡터 생성의 동력학을 도시한다. 벡터 역가는 유전자 형질도입 검정에 의해 VCM에서 평가하였다. 모든 경우에, GPRG-기반 안정한 생산자 세포주는 유도 후 적어도 약 5일 동안 약 1 x 106 TU / mL 초과의 수준 (농축되지 않은)에서 렌티바이러스 벡터 생성을 유지할 수 있다.
[0040] 도 5a 및 5b는 안정한 세포주로부터의 렌티바이러스 벡터 생성의 동력학을 도시한다. (도 5 a) 벡터 생성 동안에, 배지는 매일 기준 (■) 또는 2일 마다(□) 새로운 배지로 대체하였다. (도 5b) 상기 수거된 배지에서 렌티바이러스 벡터의 총양은 293T 세포 상에서 적정하였다. 나타낸 데이터는 평균 값 ± SD (N = 2)이다. TU, 형질도입 유닛.
[0041] 도 6a는 GPRG 및 293T 세포가 데옥시사이클린 (Dox)이 없는 배지에서 유도됨을 도시한다. 상기 유도된 세포는 항-VSVG 항체로 염색하여 VSVG 발현을 검출하고 유동 세포측정에 의해 측정하였다.
[0042] 도 6B는 연장된 배양 후에도 렌티바이러스 벡터를 생성하는 GPRG 팩키징 세포주의 능력을 도시한다.
[0043] 도 7a 및 b는 상이한 배양 조건에서 렌티바이러스 생성을 도시한다. (A) 혈청 함유 배지에서 배양된/생성된. (B, 좌측) 혈청 함유 배지에서 배양된/무혈청 배지에서 생성된; (B, 우측) 무혈청 배지에서 배양된/생성된. D10: 500 mL DMEM/GlutaMAX™ (ThermoFisher로부터 시판되는); 50 mL FBS (10% w/v); 5 mL Pen/Strep; SFM: 무혈청 배지.
[0044] 도 8은 새로운 배지(벡터 부재) 또는 LVsh5/C46 벡터로 항온처리된 293T 또는 TF-1a 세포의 FACS 분석을 제시한다.
[0045] 도 9는 감염된 세포에서 렌티바이러스 벡터 카피수의 정량을 도시한다. C46 qPCR을 사용하여 2개 용량 (MOI = 1 또는 0.3)에서 형질도입 후 숙주 게놈 당 벡터 카피수를 결정하였다.
[0046] 도 10은 고스트(ghost)-CCR5 세포가 LVsh5/C46 벡터로 형질도입됨을 도시한다. CCR5 발현의 감소된 수준은 FACS로 측정하였다.
[0047] 도 11은 pUC57-TL20의 도식적 다이아그램을 제시한다.
[0048] 도 12는 본원 개시내용의 일부 구현예에 따라 HIV-1 기반 렌티바이러스 전달 벡터를 도시한다. 상기 특정 전달 벡터는 HIV-1 융합 억제제 (C46)와 조합된, HIV-1 공동-수용체 CCR5의 하향 조절을 위한 짧은 헤어핀 RNA (shRNA)를 암호화한다.
[0049] 도 13은 혈청과 함께 및 혈청 없이 본원에 기재된 방법을 사용함에 의한 렌티바이러스 유도를 도시한다. 무혈청 배지에서 배양된 세포는 10% PBS로 배양된 것들 만큼 거의 많은 바이러스를 생성하였다. 본원에 기재된 방법은 무혈청 배양 환경에 적응할 수 있는 것으로 사료된다.
[0050] 도 14는 DNA 단편을 생성하는 방법을 도시하는 흐름도이다.
[0051] 도 15는 콘카타머 어레이를 합성하는 방법을 도시하는 흐름도이다.
[0052] 도 16은 콘카타머 어레이를 팩키징 세포주에 도입하는 방법을 도시하는 흐름도이다.
[0053] 도 17은 형질감염된 클론에 대한 선택 방법을 도시하는 흐름도이다.
[0054] 도 18은 단일 콜로니 단리를 수행하는 방법을 도시하는 흐름도이다.
[0055] 도 19는 바이러스 생산을 평가하는 방법을 도시하는 흐름도이다.
[0056] 도 20a, 20b, 및 20c는 일반적으로 TL20-Cal1-wpre 및 TL20-Unc-GFP 벡터를 합성하기 위한 생산자 세포를 기재한다. 도 20a는 새로운 배지 (좌측: 벡터 부재) 또는 가장 강력한 생산자 클론으로부터 수거된 TL20-Cal1-WPRE (우측)로 항온처리된 293T 세포의 유동 세포측정 분석을 도시한다. 도 20b는 새로운 배지 (암회색 막대: 벡터 부재) 또는 가장 강력한 생산자 클론으로부터 수거된 TL20-UbcGFP (담회색 막대)로 항온처리된 293T 세포의 유동 세포측정 분석을 도시한다. 도 20c는 TL20-Cal1-WPRE (좌측) 또는 TL20-UbcGFP (우측) 벡터를 제조하기 위한 독립적 생산자 클론으로부터의 상등액의 측정된 벡터 역가의 분포를 도시한다. 벡터는 293T 세포 상에서 적정하고 유동 세포측정에 의해 분석하였다. 폴리클로날 생산자 세포(단일 클론 선택 전)를 사용하여 제조된 벡터에 대해 성취된 최고 역가는 점선으로 나타낸다. 범례: Ubc: 유비퀴틴 C 프로모터; GFP: 증진된 녹색 형광성 단백질.
[0057] 도 21a 및 21b는 생산자 세포주가 무혈청 배지에서 바이러스를 생성할 수 있음을 도시한다. 도 21a는 동력학 연구 동안 (유도 후 7일까지 연속적으로 수거하는) GFP 바이러스의 감염성 역가를 도시한다. 도 21b는 LVsh5/C46 벡터 (유도 후 3일째 수거하는)의 형질도입 효율을 도시한다.
서열 목록
[0058] 본원에 제공된 핵산 및 아미노산 서열은 37 C.F.R. 1.822에 정의된 바와 같이, 뉴클레오타이드 염기에 대한 표준 문자 약어 및 아미노산에 대한 3문자 코드를 사용하여 나타낸다. 서열 목록은 2016년 5월 9일자로 작성된 "2016-05-09 Cal-0013WO ST25.txt”란 명칭의 5KB의 ASCII 텍스트 파일로서 제출되었고, 이는 본원에 참조로 인용된다.
[0059] 정의
[0060] 본원에서 사용된 바와 같은 "a", "an" 및 "the"라는 단수 용어는 문맥이 명백히 달리 명시하지 않는다면 복수의 지시대상을 포함한다. 유사하게, "또는"이라는 단어는 문맥이 명백히 달리 명시하지 않는다면 "및"을 포함하도록 의도된다.
[0061] 용어 "포함하는(comprising)", "포함하는(including)", "갖는(having)" 등은 상호교환적으로 사용되고 동일한 의미를 갖는다. 유사하게, 용어 "포함한다(comprises)", "포함한다(includes)", "갖는다(has)" 등은 상호교환적으로 사용되고 동일한 의미를 갖는다. 구체적으로, 용어 각각은 “포함하는”의 통상의 미국 특허법 정의에 일치하는 것으로 정의되고 따라서 “적어도 하기”를 의미하는 개방적 용어인 것으로 해석되고 또한 추가의 특성, 제한, 양상 등을 배제하지 않는 것으로 해석된다. 따라서, 예를 들어, "성분들 a, b 및 c를 갖는 장치"는 장치가 적어도 성분들 a. b 및 c를 포함함을 의미한다. 유사하게, 용어 "단계 a, b 및 c를 포함하는 방법"은 상기 방법이 적어도 단계 a, b 및 c를 포함함을 의미한다. 더욱이, 상기 단계 및 공정은 특정 순서로 본원에 명시될 수 있고, 당업자는 단계 및 공정의 순서가 다양할 수 있음을 인지할 것이다.
[0062] 본원 명세서 및 청구항에서 사용된 바와 같은, "또는"은 상기 정의된 바와 같은 “및/또는”과 동일한 의미를 갖는 것으로 이해되어야만 한다. 예를 들어, 목록에서 항목들을 분리하는 경우, "또는" 또는 "및/또는"은 포괄적, 즉, 적어도 하나의 내포, 또한 다수의 요소들 또는 목록 중 하나 초과 및 임의로 열거되지 않은 추가의 용어들을 포함하는 것으로 해석된다. 단지 용어가 명백히 다르게 지적되지 않은 경우, 예를 들어, “이 중 단지 하나” 또는 정확하게 이의 하나" 또는 청구항에사용되는 경우, "로 이루어진"은 다수의 요소들 또는 목록의 정확하게 하나의 요소의 내포를 언급한다. 일반적으로, 본원에 사용된 바와 같은 용어 "또는"은 단지 “어느 하나”, “이중 하나”, “이중 단지 하나” 또는 “이중 정확히 하나”와 같은 배타적 용어에 선행하는 경우 배타적 대안 (즉, “하나 또는 다른 하나이지만 둘다는 아닌”)을 지적하는 것으로서 해석된다. 청구항에 사용되는 경우 "필수적으로 이루어진"은 특허법 분야에서 사용된 바와 같은 통상의 의미를 갖는다.
[0063] 본원 명세서 및 청구항에 사용된 바와 같이 하나 이상의 요소들의 목록을 참조로 용어 ”적어도 하나"는 요소들의 목록에서 임의의 하나 이상의 요소들로부터 선택되는 적어도 하나의 요소를 의미하지만 필연적으로 요소들의 목록내에 구체적으로 열거된 각각 및 모든 요소 중의 적어도 하나를 포함하지 않고 요소들 목록에서 요소들의 임의의 조합을 배제하지 않음을 의미하는 것으로 이해되어야만 한다. 상기 정의는 또한 용어 “적어도 하나”가 구체적으로 동정된 요소들과 관련되거나 관련되지 않든 간에 상관 없이 언급하는 요소들의 목록 내에 구체적으로 공지된 요소들 이외의 요소들이 임의로 존재할 수 있음을 허용한다. 따라서, 비제한적인 예로서, "A 및 B의 적어도 하나" (또는, 균등하게, "A 또는 B의 적어도 하나" 또는 균등하게 "A 및/또는 B의 적어도 하나")는 하나의 구현예에서 B가 존재하지 않는 (및 임의로 B이외의 다른 요소를 포함하는) 하나 초과의 A를 임의로 포함하는 적어도 하나를 언급할 있고; 또 다른 구현예에서, A가 존재하지 않는 (및 임의로 A 이외의 요소들을 포함하는) 하나 초과의 B를 임의로 포함하는 적어도 하나를 언급할 수 있고; 여전히 또 다른 구현예에서, 하나 초과의 A를 임의로 포함하는 적어도 하나, 및 하나 초과의 B (및 임의로 다른 요소를 포함하는)를 임의로 포함하는 적어도 하나 등을 언급할 수 있다.
[0064] 본원에 사용된 바와 같은 용어 "클로닝"은 핵산 분자를 플라스미드에 연결하고 이를 숙주의 번식 동안에 복제를 위해 적당한 숙주 세포에 전달하는 공정을 언급한다.
[0065] 본원에 사용된 바와 같은 용어 "단편"은 폴리펩타이드를 언급하고 상기 폴리펩타이드에 특유하거나 이를 특징으로 하는 소정의 폴리펩타이드의 임의의 별개의 부분으로서 정의된다. 본원에 사용된 바와 같은 용어는 또한 전장 폴리펩타이드의 활성의 적어도 일부를 보유하는 소정의 폴리펩타이드의 임의의 별개의 부분을 언급한다.
[0066] 본원에 사용된 바와 같은 용어 "유전자"는 적어도 일부가 별개의 최종 생성물, 전형적으로 이에 제한되지 않지만 세포 공정의 일부 양상에서 기능하는 폴리펩타이드를 암호화하는 임의의 뉴클레오타이드 서열, DNA 또는 RNA를 언급한다. 상기 용어는 폴리펩타이드 또는 다른 별개의 최종 생성물을 암호화하는 암호화 서열만을 언급하는 것으로 의미되지 않고 또한 개별 암호화 분절 (“엑손”) 사이의 개입 서열(“인트론”) 뿐만 아니라 기본 발현 수준을 조절하는 암호화 서열의 전방 또는 후방 영역을 포괄할 수 있다. 일부 구현예에서, 유전자는 조절 서열 (예를 들어, 프로모터, 인핸서, 폴리아데닐화 서열, 종결 서열, 코작(Kozak) 서열, TATA 박스 등) 및/또는 변형 서열을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 유전자는 단백질을 암호화하지 않지만 tRNA, RNAi-유도제 등과 같은 기능성 RNA 분자를 암호화하는 핵산에 대한 참조물을 포함할 수 있다.
[0067] 본원에 사용된 바와 같은 용어 "HIV"는 HIV-1 뿐만 아니라, 다양한 종의 HIV-1 (예를 들어, BaL 종 또는 SF162 종) 및 다양한 서브타입의 HIV-1 (예를 들어. 서브타입 A, B, C, D, F, G H, J, 및 K)를 포함한다.
[0068] 본원에 사용된 바와 같은 용어 "동일성" 이란, 중합체성 분자들 사이, 예를 들면, 핵산 분자들 (예를 들면, DNA 분자들 및/또는 RNA 분자들) 사이 및/또는 폴리펩타이드 분자들 사이의 전반적인 관련성을 언급한다. 예를 들면, 2개의 핵산 서열의 퍼센트 동일성의 계산은 최적의 비교 목적을 위해 2개의 서열을 정렬함으로써 수행될 수 있다 (예를 들면, 갭이 최적 정렬을 위해 제1 및 제2 핵산 서열 중 하나 또는 둘 다에 도입될 수 있으며, 비-동일성 서열은 비교 목적을 위해 무시될 수 있다). 특정 구현예에서, 비교 목적을 위해 정렬되는 서열의 길이는 참조 서열의 길이의 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 실질적으로 100% 이다. 이어서, 상응하는 뉴클레오타이드 위치에서의 뉴클레오타이드가 비교된다. 제1 서열의 위치가 제 2 서열의 상응하는 위치와 동일한 뉴클레오타이드에 의해 점유될 때, 분자들은 그 위치에서 동일하다. 2개의 서열 사이의 퍼센트 동일성은 2개의 서열의 최적 정렬을 도입하기 위해 필요한, 갭의 수 및 각각의 갭의 길이를 고려하여 서열에 의해 공유되는 동일한 위치의 수의 함수이다.
[0069] 본원에 사용된 바와 같은 용어 "렌티바이러스"는 분열 및 비-분열 세포를 감염시킬 수 있는 레트로바이러스 속을 언급한다. 렌티바이러스의 여러 예는 사람 후천성 면역결핍 증후군 (AIDS)의 병인인 HIV (사람 면역결핍 바이러스: HIV 1형, 및 HIV 2형을 포함하는); 양에서 뇌염 (비스나) 또는 폐렴 (마에디)를 유발하는 비스나-마에디, 염소에서 면역 결핍, 관절염 및 뇌증을 유발하는 염소 관절염-뇌염 바이러스; 말에서 자가면역 용혈성 빈혈, 및 뇌증을 유발하는 말 감염성 빈혈 바이러스; 고양이에서 면역 결핍을 유발하는 고양이 면역결핍 바이러스(FIV); 소에서 임파선염, 림프구증 및 능히 중추 신경계 감염을 유발하는, 소 면역 결핍 바이러스 (BIV); 및 준-사람 영장류에서 면역 결핍 및 뇌증을 유발하는 시미안 면역결핍 바이러스 (SIV)를 포함한다.
[0070] 본원에 사용된 바와 같은 용어 "렌티바이러스 벡터"는 렌티바이러스로부터 유래된 임의의 형태의 핵산을 나타내기 위해 사용되고 유전자 물질을 형질도입을 통해 세포로 전달하기 위해 사용된다. 상기 용어는 렌티바이러스 벡터 핵산, 예를 들어, DNA 및 RNA, 이들 핵산의 캡슐화된 형태, 및 바이러스 벡터 핵산이 팩키징되는 바이러스 입자를 포괄한다.
[0071] 본원에 사용된 바와 같은 용어 "다중 클로닝 부위" 또는 "MCS"는 핵산 단편을 클로닝 벡터 플라스미드에 클로닝하기 위해 제한 부위를 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 언급한다. 또한 폴리링커 또는 폴리클로닝 부위로서 언급되는 MCS는 많은 제한 효소가 상기 부위내에서 작동할 수 있도록 하는 클로닝 부위 클러스터이다. 일부 구현예에서 클로닝 부위는 제한 효소가 작동하여 플라스미드를 선형화하거나 절단하는 공지된 서열이다.
[0072] 본원에 사용된 바와 같은 용어 "생산자 세포"는 렌티바이러스 벡터 입자의 생성을 위해 필요한 모든 요소들을 함유하는 세포를 언급한다.
[0073] 본원에 사용된 바와 같은 용어 "팩키징 세포"는 재조합 바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 또는 렌티바이러스 전달 벡터 플라스미드에 없는, 감염성 재조합 바이러스의 생성을 위해 필요한 요소들을 함유하는 세포를 언급한다. 전형적으로, 상기 팩키징 세포는 바이러스 구조적 단백질 (예를 들어, gag, pol 및 env)을 발현할 수 있는 하나 이상의 발현 카세트를 함유하지만 이들은 팩키징 신호를 함유하지 않는다. 팩키징 세포주 세포는 전형적으로 포유동물 세포주이고, 이는 RNA를 팩키징하고 복제-적격 헬퍼-바이러스를 생성하는 능력이 없는 바이러스 입자를 생성하기 위해 필요한 암호화 서열을 함유한다. 팩키징 기능이 세포주 (예를 들어, 트랜스로) 내에 제공되는 경우, 팩키징 세포주는 재조합 레트로바이러스 (또는 렌티바이러스)를 생성함으로써 “생산자 세포주”가 된다.
[0074] 본원에 사용된 바와 같은 용어 "제한 엔도뉴클레아제" 또는 "제한 효소"는 핵산 분자 (예를 들어, DNA)의 동족 서열에 결합하고 상기 서열 내 정확한 위치에서 이를 절단하는 한 부류의 촉매 분자의 구성원 또는 구성원들을 언급한다.
[0075] 본원에 사용된 바와 같은 용어 "레트로바이러스"는 레트로바이러스 역전사효소에 의해, 숙주 세포 게놈내로 통합되는 cDNA 카피로 역전사되는 RNA 게놈을 갖는 바이러스를 언급한다. 레트로바이러스 벡터 및 레트로바이러스 벡터를 제조하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 간략하게, 레트로바이러스 벡터를 작제하기 위해, 관심 대상의 유전자를 암호화하는 핵산은 특정 바이러스 서열 대신 바이러스 게놈에 삽입되어 복제-결함인 바이러스를 생성한다. 비리온을 생성하기 위해, gag, pol 및 env 유전자를 함유하지만 LTR이 없는 팩키징 세포주 및 팩키징 성분들이 작제된다(문헌참조: Mann et al., Cell, Vol. 33:153-159, 1983). 레트로바이러스 LTR 및 팩키징 서열과 함께 cDNA를 함유하는 재조합 플라스미드가 상기 세포주로 도입되는 경우, 팩키징 서열은 재조합 플라스미드의 RNA 전사체가 바이러스 입자로 팩키징되도록 하고 이어서 이는 배양 배지로 분비된다. 재조합 레트로바이러스를 함유하는 배지를 이어서 수거하고, 임의로 농축시키고 유전자 전달을 위해 사용한다. 일부 구현예에서, 용어 "레트로바이러스"는 임의의 공지된 레트로바이러스 (예를 들어, c형 레트로바이러스, 예를 들어, 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스(MoMuLV), 하베이 뮤린 육종 바이러스(HaMuSV), 뮤린 유방 종양 바이러스(MuMTV), 기본 에이프 백혈병 바이러스 (gibbon ape leukemia virus)(GaLV), 고양이 백혈병 바이러스(FLV) 및 라우스 육종 바이러스(RSV))를 언급한다. 본 발명의 “레트로바이러스”는 또한 인간 T 세포 백혈병 바이러스, HTLV-1 및 HTLV-2, 및 렌티바이러스 계열의 레트로바이러스, 예를 들어, 인간 면역결핍 바이러스, HIV-1, HIV-2, 시미안 면역결핍 바이러스 (SIV), 고양이 면역결핍 바이러스 (FIV), 말 면역결핍 바이러스 (EIV), 및 다른 부류의 레트로바이러스를 포함한다.
[0076] 본원에 사용된 바와 같은 "RNA 간섭 제제" 또는 "RNAi 제제"는 억제성 또는 사일런싱 핵산이다. 본원에 사용된 바와 같은 "사일런싱 핵산"은 유전자 발현을 억제하기 위해 특정 서열과 상호작용할 수 있는 임의의 폴리뉴클레오타이드를 언급한다. 사일런싱 핵산의 예는 RNA 듀플렉스 (예를 들어, siRNA, shRNA), 잠금(locked) 핵산(“LNA”), 안티센스 RNA, siRNA 또는 shRNA의 센스 및/또는 안티센스 서열, DNA자임 또는 리보자임을 암호화하는 DNA 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 당업자는 유전자 발현의 억제가 필수적으로 특정 열거된 서열로부터의 유전자 발현일 필요는 없고 예를 들어, 상기 특정 서열에 의해 조절되는 서열로부터의 유전자 발현일 수 있음을 인지할 것이다.
[0077] 본원에 사용된 바와 같은 용어 "씨딩"은 세포 배양물을 세포 또는 벡터 배양 생성을 위한 생물반응기 또는 또 다른 용기로 제공하는 공정을 언급한다.
[0078] 본원에 사용된 바와 같은 용어 "무혈청 배지(serum-free media)" 또는 “무혈청 배지 (serum-free medium)"는 어떠한 혈청을 함유하지 않는 배지, 즉, 동물 또는 사람 기원의 혈청을 함유하지 않는 세포 배양 배지를 언급한다. 일부 구현예에서, 무혈청 배지는 단백질 부재이고 또한 미지의 조성의 가수분해물 또는 성분들이 부재이다. 적합한 세포 배양 배지는 당업자에게 공지되어 있다. 이들 배지는 임의로 염, 비타민, 완충제, 에너지 공급원, 아미노산 및 다른 물질을 포함할 수 있다. 세포의 무혈청 배양을 위해 적합한 배지의 예는 배지 199 (문헌참조: Morgan, Morton and Parker; Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1950, 73, 1; obtainable inter alia from 10 Life Technologies)이다.
[0079] 본원에 사용된 바와 같은 용어 "shRNA"는 안티센스 영역, 루프 부분 및 센스 영역을 포함하는 RNA 분자를 언급하고, 여기서, 상기 센스 영역은 안티센스 영역과 염기 쌍을 이루어 듀플렉스 줄기를 형성하는 상보성 뉴클레오타이드를 갖는다. 전사 후(Following post-transcriptional)
[0080] 본원에 사용된 바와 같은 용어 "치료학적 유전자"는 질환을 치료하거나 예방하기 위해 대상체에게 투여될 수 있는 유전자를 언급한다. “치료학적 유전자”의 정의에 포함되는 것은 "생물학적 기능성 등가"의 치료학적 유전자이다. 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 용어 "치료학적 유전자"는 단백질, 폴리펩타이드, 도메인, 융합 단백질, 및 치료학적 유전자에 의해 암호화된 전장 폴리펩타이드의 치료학적 기능의 일부 또는 전부를 유지하는 돌연변이체를 발현하거나 이들을 발현하도록 조정될 수 있는 게놈 서열, cDNA 서열 및 보다 작은 가공된 유전자 분절을 포함한다. 따라서, 약 70% 서열 상동성 내지 약 99% 서열 상동성 및 여기에서 유래할 수 있는 서열 상동성의 임의의 범위 또는 양, 예를 들어, 치료학적 유전자의 아미노산과 동일하거나 기능적으로 균등한 아미노산의 약 70% 내지 약 80%, 및 보다 바람직하게 약 85% 및 약 90%; 또는 보다 더 바람직하게 약 95% 내지 99%의 서열 상동성을 갖는 서열은 생물학적 기능성 등가물인 서열이고, 단 상기 폴리펩타이드의 생물학적 활성은 유지되어야 한다.
[0081] 본원에 사용된 바와 같은 용어 "형질도입한다" 또는 "형질도입"은 형질감염에 의한 것 보다는 차라리 감염을 수단으로 바이러스 또는 레트로바이러스 벡터를 사용한 유전자(들)의 전달을 언급한다. 예를 들어, 레트로바이러스 벡터 (핵산의 세포로의 도입을 위한 벡터로서 사용되는 변형된 레트로바이러스)에 의해 운반되는 항-HPRT 유전자는 감염 및 프로바이러스 통합을 통해 세포에 형질도입될 수 있다. 따라서, "형질도입된 유전자"는 렌티바이러스 또는 벡터 감염 및 프로바이러스 통합을 통해 세포에 형질도입된 유전자이다. 바이러스 벡터 (예를 들어, "형질도입 벡터")는 유전자를 “표적 세포” 또는 숙주 세포로 형질도입한다.
[0082] 본원에 사용된 바와 같은 용어 "벡터"는 또 다른 핵산 분자의 세포로의 진입을 매개할 수 있는, 예를 들어, 세포로 전달 또는 수송 등을 할 수 있는 핵산 분자를 언급한다. 전달된 핵산은 일반적으로 벡터 핵산 분자에 연결되고, 예를 들어, 삽입된다. 벡터는 자율 복제를 지시하는 서열을 포함할 수 있거나 숙주 세포 DNA로의 통합을 가능하게 하기에 충분한 서열을 포함할 수 있다. 당업자에 의해 자명한 바와 같이, 바이러스 벡터는 전달된 핵산의 진입을 매개하는 핵산 (들)에 추가로 다양한 바이러스 성분들을 포함할 수 있다. 다수의 벡터는 당업계에 공지되어 있고 이는 선형 폴리뉴클레오타이드, 이온 또는 양친매성 화합물과 연합된 폴리뉴클레오타이드, 플라스미드 및 바이러스 벡터를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 바이러스 벡터의 예는 아데노바이러스 벡터, 아데노-관련 바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 (렌티바이러스 벡터를 포함하는) 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
[0083] 본원에 사용된 바와 같은 용어 "벡터 카피수" 또는 "VCN"은 세포의 게놈 내 벡터 또는 이의 일부의 카피수를 언급한다. 평균 VCN은 세포 집단으로부터 또는 개별 세포 콜로니로부터 결정될 수 있다. VCN을 결정하기 위한 예시적 방법은 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR) 및 유동 세포측정을 포함한다.
[0084] 본원에 상호교환적으로 사용되는 본원에 사용된 바와 같은 용어 "바이러스 역가" 또는 "역가"는 감염된 개체로부터의 체액 (예를 들어, 혈액, 혈청, 혈장, 타액, 뇨)의 샘플 중에 감염성 바이러스 입자의 수를 언급한다.
[0085] 렌티바이러스 게놈은 일반적으로 5' 긴 말단 반복체 (LTR), gag 유전자, pol 유전자, env 유전자, 악세서리 유전자(nef, vif, vpr, vpu) 및 3' LTR로 구성된다. 바이러스 LTR은 U3, R 및 U5로 불리우는 3개 영역으로 나누어진다. U3 영역은 인핸서 및 프로모터 요소들을 함유한다. U5 영역은 폴리아데닐화 신호를 함유한다. R (반복체) 영역은 U3 및 U5 영역을 분리하고 R 영역의 전사된 서열은 바이러스 RNA의 5’ 및 3’ 말단 둘다에서 나타난다. 예를 들어, 문헌("RNA Viruses: A Practical Approach" (Alan J. Cann, Ed., Oxford University Press, (2000)); O Narayan and Clements (1989) J. Gen. Virology, Vol. 70:1617-1639; Fields et al. (1990) Fundamental Virology Raven Press.; Miyoshi H, Blamer U, Takahashi M, Gage F H, Verma I M. (1998) J Virol., Vol. 72(10):8150 7, 및 미국 특허 제6,013,516호)을 참조한다.
[0086] 렌티바이러스 벡터는 당업계에 공지되어 있고, 이것은 조혈 전구세포/줄기 세포(HPSC)를 감염시키기 위해 사용되는 여러개의 것들을 포함한다. 상기 벡터는 예를 들어, 본원에 참조로 인용된 하기의 간행물에서 찾을 수 있다: Evans et al., Hum Gene Ther., Vol. 10:1479-1489, 1999; Case et al., Proc Natl Acad Sci USA, Vol. 96:2988-2993, 1999; Uchida et al., Proc Natl Acad Sci USA, Vol. 95:11939-11944, 1998; Miyoshi et al., Science, Vol. 283:682-686, 1999; 및 Sutton et al., J. Virol., Vol. 72:5781-5788, 1998. 하나의 구현예에서, 발현 벡터는 변형된 렌티바이러스이고 따라서 분열 및 비분열 세포 둘다를 감염시킬 수 있다. 추가로, 상기 변형된 렌티바이러스 게놈은 바람직하게 바이러스 복제를 위해 요구되는 렌티바이러스 단백질에 대한 유전자가 없고 따라서 표적 세포에서의 복제와 같은 목적하지 않은 복제를 예방한다. 변형된 게놈의 복제를 위해 요구되는 단백질은 바람직하게 재조합 레트로바이러스 (또는 구체적으로 렌티바이러스)의 생성 동안에 팩키징 세포주에서 트랜스로 제공된다. 하나의 구현예에서, 팩키징 세포주는 293T 세포주이다. 렌티바이러스 벡터는 바람직하게 렌티바이러스의 5' 및 3' 긴 말단 반복체(LTR)로부터의 서열을 포함한다. 하나의 구현예에서, 상기 바이러스 작제물은 렌티바이러스의 5' LTR 및 렌티바이러스 기원의 불활성화되거나 자가-불활성화 3’ LTR로부터의 R 및 U5 서열을 포함한다. 상기 LTR 서열은 임의의 종 또는 스트레인으로부터의 것을 포함하는 임의의 렌티바이러스 기원의 LTR 서열일 수 있다. 예를 들어, LTR은 HIV, 시미안 면역결핍 바이러스 (SIV), 고양이 면역결핍 바이러스 (FIV) 또는 소 면역결핍 바이러스(BIV)로부터의 LTR 서열일 수 있다. 바람직하게, LTR 서열은 HIV LTR 서열이다.
[0087] 안정한 생산자 세포주 세포를 생성하는 방법
[0088] 렌티바이러스 벡터 (LV)는 분열 및 비분열 세포 둘다를 안정하게 형질도입하는 이들의 효율 및 능력으로 인해 유전자 전달을 위해 중요한 도구이다. 결과로서, 연구자들은 이들을 광범위한 임상적 적용에서 유전자 전달 비히클로서 사용하고 있다. 그럼에도 불구하고, 현재 양호한 제조 관행 (cGMP) 방법을 사용한 대규모 임상적 생산은 렌티바이러스 벡터를 사용한 보다 많은 임상적 시험이 규제 승인을 받아야함으로 고려될 수 있는 일련의 해결 과제들이 있다. cGMP-상용성 공정을 디자인하는데 있어서 한가지 중요한 고려사항은 규제 고려 사항을 다중 cGMP 생산을 위해 일관된 렌티바이러스를 생산할 수 있는 제조 공정으로 통합할 필요성이다. 임상적으로 사용되는 대다수의 렌티바이러스 벡터는 일시적 형질감염에 의해 생산되었다. 일시적 형질감염 기반 생산은 그러나 흔히 노동 집약적이고 변화될 수 있다. 이러한 이유 때문에, 여러 안정한 팩키징 세포주 시스템이 최근에 개발되었다. 레트로바이러스 및 렌티바이러스 벡터의 바이오-제조를 위한 이들 세포주의 사용이 특히 규모 및 일관성 둘다를 위해 매력적이지만, 상기 세포주의 개발은 시간 소모적이고 이들 세포주의 cGMP 사용을 위한 규제 경로는 확고히 확립되어 있지 않다.
[0089] 이전 기재내용의 관점에서, 본원의 개시내용은 자가-불활성화 렌티바이러스 벡터 (SIN-LV)를 포함하는, 레트로바이러스 벡터의 임상적 생산을 위한 공정을 제시한다. 팩키징 세포주 (예를 들어, GPR, GPRG, GPRT, GPRGT 또는 GPRT-G 또는 이로부터 유래된 유도체 또는 유사체 팩키징 세포주)와 함께 신규 렌티바이러스 전달 벡터 플라스미드의 사용을 통해 안정한 생산자 세포주 세포가 생성될 수 있어 자가-불활성화 렌티바이러스 벡터 (예를 들어, LVgGsh7; 하이포크산틴-구아닌 포스포리보실트랜스퍼라제 (HPRT)의 발현을 녹다운시키도록 디자인된 성분을 포함하는 벡터; HPRT 발현을 녹다운시키도록 디자인된 제1 성분을 포함하고 또한 감마-글로빈 유전자와 같은 치료학적 유전자의 발현을 위한 제2 성분을 포함하는 벡터)를 포함하는 레트로바이러스 벡터의 생산을 가능하게 하는 것으로 사료된다. 본원에 기재된 특정 구현예 및 실시예는 HIV-1 융합 억제제 (즉, C46)와 조합된, HIV-1 공동-수용체 CCR5의 하향 조절을 위한 짧은 헤어핀 RNA (shRNA)를 암호화하는 자가-불활성화 렌티바이러스 벡터인 LVsh5/C46의 생산을 언급하고, 당업자는 본원에 기재된 방법이 임의의 목적하거나 클라이언트 공급된 유전자 또는 서열을 포함하는 임의의 SIN-LV (예를 들어, 이의 개시내용의 전문이 본원에 참조로 인용된 미국 특허 출원 공개 공보 제2017/0145077호에 기재된 핵산 서열과 같은 감마-글로빈 유전자를 암호화하는 핵산 서열을 발현하도록 디자인된 SIN-LIV; 또는 위스콧-알드리치 증후군 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 발현하도록 디자인된 SIN-LIV)을 생성할 수 있는 안정한 생산자 세포주 세포의 생성을 위해 적합함을 인지할 것이다.
[0090] 출원인은 일시적 형질감염에 의해 생산된 SIN-LV와 비교하여 본원에 기재된 방법이 (i) 유사한 질 및 양의 SIN-LV를 생성할 수 있고; (ii) 보다 양호한 효능을 가질 수 있는 SIN-LV를 생성할 수 있으며; (iii) 일시적 형질감염과 함께 나타나는 프렙 대 프렙 변동성을 크게 감소시키면서 수율을 유지하는 공정을 가능하게 함을 입증하였다.
[0091] pUC57-TL20c
[0092] 본원의 개시내용은 일부 구현예에서, 사람 면역결핍 바이러스 1형 (HIV-1) 기반 제3 세대로서, 신규 다능성 다중 클로닝 부위 (MCS)를 포함하는 자가-불활성화 (SIN) 렌티바이러스 전달 벡터 플라스미드 (이후 "pUC57-TL20"으로서 언급됨)를 제공한다(도 11을 참조한다).
[0093] 일부 구현예에서, 렌티바이러스 벡터 전달 플라스미드는 그 자체가 내부 프로모터를 포함하지 않는 (따라서, 이는 “프로모터 부재”이다) 벡터 골격 ("TL20c")을 포함한다. 일부 구현예에서, 렌티바이러스 벡터 전달 플라스미드는 하나의 프로모터, 예를 들어, 벡터 골격의 업스트림에 테트라사이클린 억제성 프로모터를 포함한다(도 12 참조). 임의의 특정 이론에 국한시키고자 하는 것 없이, 벡터 골격의 프로모터가 부재인 디자인은 사용자가 결정한 프로모터로부터 관심 대상의 유전자의 전달 및 후속적 발현을 가능하게 하는 렌티바이러스 전달 벡터 플라스미드의 생산을 가능하게 하는 것으로 사료된다.
[0094] 도 11은 렌티바이러스 벡터 전달 플라스미드의 구성 요소들을 도해하는 유전자 맵을 제시한다. 일부 구현예에서, 렌티바이러스 벡터 전달 플라스미드는 약 6500개 뉴클레오타이드 내지 약 6750개 뉴클레오타이드를 포함한다. 다른 구현예에서, 렌티바이러스 벡터 전달 플라스미드는 약 6600개 뉴클레오타이드 내지 약 6700개 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 렌티바이러스 전달 벡터 플라스미드의 벡터 골격은 약 3850개 뉴클레오타이드 내지 약 3950개 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 렌티바이러스 전달 벡터 플라스미드의 벡터 골격은 약 3901개 뉴클레오타이드를 포함한다.
[0095] 도 11에 나타낸 바와 같이, 플라스미드는 5' 플랭킹 HIV LTR, 팩키징 신호 또는 ψ+, 중앙 폴리퓨린 트랙 (cPPT), Rev-반응 요소(RRE), 다중 클로닝 부위 (MCS), 및 3' 플랭킹 HIV LTR을 포함한다. LTR 영역은 R 영역 뿐만 아니라 U3 및 U5 영역을 추가로 포함한다.
[0096] 본원 개시내용의 특정 구현예에 따라, 전달 플라스미드는 자가-불활성화 (SIN) LTR을 포함한다. 당업계에 공지된 바와 같이, 레트로바이러스 생활 사이클 동안에, 3’ UTR의 U3 영역은 복제되어 역전사 및 바이러스 DNA 합성 과정에서 5’ LTR의 상응하는 영역을 형성한다. SIN LTR의 생성은 3’ LTR의 U3 영역을 불활성화시킴에 의해 (바람직하게 이의 일부를 결실시킴에 의해, 예를 들어, TATA 서열을 제거함에 의해) 성취된다. 상기 변경은 역전사 후 5’ LTR에 전달되고 따라서 프로바이러스에서 LTR의 전사 유닛이 제거되어 복제 적격 바이러스가 이동하는 것을 차단하는 것으로 사료된다. 추가의 안전성 증진은 5’ UTR의 U3 영역을 이종성 프로모터로 대체하여 바이러스 입자 생산 동안에 바이러스 게놈의 전사를 구동시킴에 의해 제공된다.
[0097] 일부 구현예에서, 팩키징 신호는 야생형 HIV의 약 361개 염기쌍의 Gag 서열 및 약 448개 염기쌍의 Pol 서열을 포함한다(예를 들어, HIV01 HXB2_LAI_IIIB). 일부 구현예에서, cPPT는 야생형 HIV의 약 85개 염기쌍의 Vif 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, HIV 폴리퓨린 트랙 (pPu)은 야생형 HIV의 약 106개 염기쌍의 Nef 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, RRE는 야생형 HIV의 약 26개 염기쌍의 Rev 서열, 약 25개 염기쌍의 tat 서열 및 약 769개 염기쌍의 Env 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 전달 플라스미드는 염색질 인설레이터 (insulator) 및/또는 베타-글로불린 폴리아데닐화 신호를 포함한다.
[0098] 일부 구현예에서, 팩킹 신호를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 3의 서열, 또는 서열번호 3의 서열과 적어도 85% 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 팩킹 신호를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 3의 서열, 또는 서열번호 3의 서열과 적어도 90% 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 팩킹 신호를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 3의 서열, 또는 서열번호 3의 서열과 적어도 95% 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
[0099] 일부 구현예에서, 중앙 폴리퓨린 트랙 (cPPT)을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 4의 서열, 또는 서열번호 4의 서열과 적어도 85% 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 중앙 폴리퓨린 트랙 (cPPT)을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 4의 서열, 또는 서열번호 4의 서열과 적어도 90% 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 중앙 폴리퓨린 트랙 (cPPT)을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 4의 서열, 또는 서열번호 4의 서열과 적어도 95% 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
[0100] 일부 구현예에서, Rev 반응 요소를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 5의 서열, 또는 서열번호 5의 서열과 적어도 85% 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, Rev 반응 요소를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 5의 서열, 또는 서열번호 5의 서열과 적어도 90% 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, Rev 반응 요소를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 5의 서열, 또는 서열번호 5의 서열과 적어도 95% 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
[0101] 일부 구현예에서, 자가 불활성화 긴 말단 반복체를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 6의 서열, 또는 서열번호 6의 서열과 적어도 85% 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 자가 불활성화 긴 말단 반복체를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 6의 서열, 또는 서열번호 6의 서열과 적어도 90% 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 자가 불활성화 긴 말단 반복체를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 6의 서열, 또는 서열번호 6의 서열과 적어도 95% 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
[0102] 일부 구현예에서, 플라스미드는 서열번호 10의 서열과 적어도 85% 동일성을 갖는 데옥시사이클린 억제성 프로모터를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 플라스미드는 서열번호 10의 서열과 적어도 90% 동일성을 갖는 데옥시사이클린 억제성 프로모터를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 플라스미드는 서열번호 10의 서열과 적어도 95% 동일성을 갖는 데옥시사이클린 억제성 프로모터를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
[0103] 일부 구현예에서, 플라스미드는 서열번호 11의 서열과 적어도 85% 동일성을 갖는 HIV LTR R5 영역을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 플라스미드는 서열번호 11의 서열과 적어도 90% 동일성을 갖는 HIV LTR R5 영역을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 플라스미드는 서열번호 11의 서열과 적어도 95% 동일성을 갖는 HIV LTR R5 영역을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
[0104] 일부 구현예에서, 플라스미드는 서열번호 12의 서열과 적어도 85% 동일성을 갖는 HIV LTR U5 영역을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 플라스미드는 서열번호 12의 서열과 적어도 90% 동일성을 갖는 HIV LTR U5 영역을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 플라스미드는 서열번호 12의 서열과 적어도 95% 동일성을 갖는 HIV LTR U5 영역을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
[0105] 일부 구현예에서, 플라스미드는 서열번호 13의 서열과 적어도 85% 동일성을 갖는 염색질 인설레이터를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 플라스미드는 서열번호 13의 서열과 적어도 90% 동일성을 갖는 염색질 인설레이터를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 플라스미드는 서열번호 13의 서열과 적어도 95% 동일성을 갖는 염색질 인설레이터를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
[0106] 일부 구현예에서, 플라스미드는 서열번호 14의 서열과 적어도 85% 동일성을 갖는 베타-글로빈 폴리아데닐화 신호를 암호화하는 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 플라스미드는 서열번호 14의 서열과 적어도 90% 동일성을 갖는 베타-글로빈 폴리아데닐화 신호를 암호화하는 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 플라스미드는 서열번호 14의 서열과 적어도 95% 동일성을 갖는 베타-글로빈 폴리아데닐화 신호를 암호화하는 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
[0107] 일부 구현예에서, 플라스미드는 서열번호 15의 서열과 적어도 85% 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 플라스미드는 서열번호 15의 서열과 적어도 90% 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 플라스미드는 서열번호 15의 서열과 적어도 95% 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
[0108] 본원 개시내용은 다양한 상이한 제한 효소를 위해 MCS가 혼입된 렌티바이러스 전달 벡터 플라스미드를 제공한다. 본원 개시내용의 특정 구현예에 따라, MCS는 약 20 내지 40개 뉴클레오타이드를 갖는 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 플라스미드의 MCS는 적어도 2개의 제한 효소 절단 부위를 포함한다. 다른 구현예에서, 본원에 기재된 플라스미드의 MCS는 적어도 3개의 제한 효소 절단 부위를 포함한다. 다른 구현예에서, 본원에 기재된 플라스미드의 MCS는 적어도 4개의 제한 효소 절단 부위를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 본원에 기재된 플라스미드의 MCS는 약 2 내지 약 10개의 제한 부위를 포함한다. 여전히 추가의 구현예에서, 본원에 기재된 플라스미드의 MCS는 약 3 내지 약 8개의 제한 부위를 포함한다. 일부 구현예에서, MCS 내 제한 부위는 BstBI, MluI, NotI, ClaI, ApaI, XhoI, XbaI, HpaI, NheI, PacI, NsiI, SphI, Sma/Xma, AccI, BamHI, 및 SphI, 또는 이의 임의의 유도체 또는 유사체로부터 선택된다.
[0109] 일부 구현예에서, 렌티바이러스 전달 벡터 플라스미드의 MCS 영역은 4개의 유일한 제한 효소 절단 부위를 갖고 이들은 목적하는 전이유전자 카세트의 용이한 서브-클로닝을 촉진시키는 것으로 사료된다. 일부 구현예에서, 다중 클로닝 부위는 BstBI, MluI, NotI, 및 ClaI 제한 엔도뉴클레아제 부위를 포함한다. 일부 구현예에서, 다중 클로닝 부위를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 7의 서열, 또는 서열번호 7의 서열과 적어도 90% 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 거기에 제한 부위는 임의의 순서로 정렬될 수 있다.
[0110] 일부 구현예에서, 전달 플라스미드는 벡터 골격을 플랭킹하는 하나 이상의 추가의 효소 절단 부위를 포함한다(도 11을 참조한다). 일부 구현예에서, 전달 플라스미드는 벡터 골격을 플랭킹하는 2개의 추가의 제한 효소 절단 부위를 포함한다. 임의의 특정 이론에 국한시키고자 하는 것 없이, 추가의 플랭킹 제한 효소 부위가 방향성 (“헤드에서 테일로”) 콘카타머 어레이의 생성을 가능하게 하는 것으로 사료된다. 일부 구현예에서, 제한 효소 절단 부위는 Sfil 및 Bsu36I로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 유전자를 포함하는 렌티바이러스 벡터는 상기 플라스미드로부터 유래한다.
[0111] 일부 구현예에서, 렌티바이러스 벡터 전달 플라스미드는 서열번호 1의 서열과 적어도 80% 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 다른 구현예에서, 렌티바이러스 벡터 전달 플라스미드는 서열번호 1의 서열과 적어도 85% 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 여전히 다른 구현예에서, 렌티바이러스 벡터 전달 플라스미드는 서열번호 1의 서열과 적어도 90% 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 추가의 구현예에서, 렌티바이러스 벡터 전달 플라스미드는 서열번호 1의 서열과 적어도 95% 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 추가의 구현예에서, 렌티바이러스 벡터 전달 플라스미드는 서열번호 1의 서열과 적어도 96% 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 여전히 추가의 구현예에서, 렌티바이러스 벡터 전달 플라스미드는 서열번호 1의 서열과 적어도 97% 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 여전히 추가의 구현예에서, 렌티바이러스 벡터 전달 플라스미드는 서열번호 1의 서열과 적어도 98% 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 여전히 추가의 구현예에서, 렌티바이러스 벡터 전달 플라스미드는 서열번호 1의 서열과 적어도 99% 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 렌티바이러스 벡터 전달 플라스미드는 서열번호 1의 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 렌티바이러스 벡터 전달 플라스미드는 서열번호 1에 제시된 서열과 100개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한 서열을 갖는다.
[0112] 일부 구현예에서, 렌티바이러스 전달 벡터 플라스미드는 서열번호 2의 서열과 적어도 80% 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 다른 구현예에서, 렌티바이러스 벡터 전달 플라스미드는 서열번호 2의 서열과 적어도 85% 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 여전히 다른 구현예에서, 렌티바이러스 벡터 전달 플라스미드는 서열번호 2의 서열과 적어도 90% 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 추가의 구현예에서, 렌티바이러스 벡터 전달 플라스미드는 서열번호 2의 서열과 적어도 95% 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 추가의 구현예에서, 렌티바이러스 벡터 전달 플라스미드는 서열번호 2의 서열과 적어도 96% 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 여전히 추가의 구현예에서, 렌티바이러스 벡터 전달 플라스미드는 서열번호 2의 서열과 적어도 97% 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 여전히 추가의 구현예에서, 렌티바이러스 벡터 전달 플라스미드는 서열번호 2의 서열과 적어도 98% 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 여전히 추가의 구현예에서, 렌티바이러스 벡터 전달 플라스미드는 서열번호 2의 서열과 적어도 99% 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 렌티바이러스 벡터 전달 플라스미드는 서열번호 2의 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 렌티바이러스 벡터 전달 플라스미드는 서열번호 2에 제시된 서열과 100개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한 서열을 갖는다.
[0113] 일부 구현예에서, 렌티바이러스 전달 벡터 플라스미드는 당업자에게 공지된 방법에 따라 합성한다. 예를 들어, 플라스미드는 당업자에게 공지된 통상적인 제한 분해 및 연결 기술을 사용하여 합성될 수 있다. 예를 들어, TL20c 벡터 골격을 포함하는 공여자 플라스미드는 당업자에게 공지된 표준 분해 및 연결 과정을 사용하여 pU57C 수용자 플라스미드(예를 들어, 제조원 (Genescript)으로부터 시판되는 것들)에 서브클로닝될 수 있다(문헌참조:, 예를 들어, Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed. Cold Spring Harbor, N.Y., 이의 개시내용은 이의 전문이 본원에 참조로 인용된다).
[0114] 본원의 개시내용은 또한 렌티바이러스 벡터, 예를 들어, HPRT를 녹다운시키도록 디자인된 성분을 포함하는 렌티바이러스 벡터인 LVgGsh7, 또는 HPRT를 녹다운시키도록 디자인된 제1 성분 및 감마 글로빈 유전자와 같은 치료학적 유전자를 암호화하는 제2 성분을 포함하는 렌티바이러스 벡터(문헌참조: 예를 들어, 개시내용의 전문이 본원에 참조로 인용되는 WO/2019/018383에 기재된 벡터 및 핵산 서열)를 포함하는 레트로바이러스 벡터를 제조하는 방법을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 유전자(본원에 기재된 임의의 유전자를 포함하는)의 cDNA를 합성하고 상기 합성된 cDNA를 pUC57-TL20c와 같은 재조합 플라스미드의 제한 부위에 클로닝함을 포함한다. 임의의 치료학적 유전자는 당업자에게 공지된 기술을 사용하여 적당한 클로닝 부위에 삽입될 수 있다. 일부 구현예에서, 유전자는 폴리머라제 연쇄 반응 (“PCR”)에 의해 증폭됨에 이어서 목적하는 프로모터 또는 유전자-발현 제어 요소를 포함하는 재조합 플라스미드에 클로닝될 수 있다(적합한 프로모터의 예는 이의 개시내용의 전문이 본원에 참조로 인용되는 WO/2019/018383 내에 기재되어 있다).
[0115] 일부 구현예에서, 및 단지 예를 들어, 상기 방법은 HIV의 세포로의 융합 또는 HIV 복제를 차단할 수 있는 단백질을 발현하는 유전자의 cDNA를 합성함에 이어서 상기 합성된 cDNA를 본원에 기재된 바와 같은 플라스미드 내 제한 부위로 클로닝함을 포함한다.
[0116] 안정한 생산자 세포주 세포의 생성 및 이로부터 생성된 렌티바이러스 벡터의 반복적인 수거
[0117] 일부 구현예에서, 본원 개시내용은 안정한 생산자 세포주 세포를 형성하고 상기 생성된 안정한 생산자 세포주 세포로부터 생성된 레트로바이러스 벡터 (렌티바이러스 벡터를 포함하는)를 수거하는 방법이다. 일부 구현예에서, 상기 생성된 생산자 세포주 세포로부터 생성된 렌티바이러스 벡터는 반복적으로 수거되고, 예를 들어, 약 40 내지 약 56시간 마다 반복적으로 수거된다. 도 2를 참조로, 안정한 생산자 세포주를 제조하는데 있어서 제1 단계는 제1 및 제2 플라스미드로부터 DNA 단편 (10)을 생성함을 포함하고, 여기서, 플라스미드 중 하나는 항생제 내성 카세트 플라스미드이다. 예를 들어, DNA 단편은 렌티바이러스 벡터 전달 플라스미드 및 항생제 내성 카세트 플라스미드로부터 생성될 수 있다. DNA 단편 생성 (10) 후, DNA는 이어서 콘카타머 어레이 (20)를 형성하기 위해 사용된다.
[0118] 후속적으로, 이어서 콘카타머 어레이는 예를 들어, 형질감염에 의해 팩키징 세포주 (30) (예를 들어, GPR, GPRG, GPRT, GPRG, GPRT-G 또는 이의 유도체 팩키징 세포주)로 도입된다. 어레이 (30)의 도입 및 후속 형질감염 후, 클론을 선택하고(40) 단리하여(50) 안정한 생산자 세포주 (60)를 생성한다. 렌티바이러스 벡터를 포함하는 벡터 상등액을 이어서 수거하고, 예를 들어, 무혈청 배지에서 약 40 내지 약 56 시간 마다 반복적으로 수거할 수 있다.
[0119] 콘카타머 어레이 형성 및 정제
[0120] 본원에서 상호교환적으로 사용되는 "콘카타머" 또는 "콘카타머 어레이"는 일렬로 직접적으로 또는 간접적으로 연결된 동일한 DNA 서열의 다중 카피물을 함유하는 긴 연속 DNA 분자를 언급한다. 일부 구현예에서, 콘카타머 어레이를 생성하고 팩키징 세포주 세포의 형질감염에 사용한다. 일부 구현예에서, 콘카타머 어레이는 항생제 내성 카세트가 여기 사이에 배치된 연결된 벡터 게놈 발현 카세트의 대형 어레이이다.
[0121] 도 14를 참조로, 렌티바이러스 전달 벡터 플라스미드 및 항생제 내성 카세트 플라스미드로부터 DNA 단편(단계 100)을 생성하여 (단계 110) 콘카타머 어레이를 형성한다. 일부 구현예에서, DNA 단편은 당업자에게 공지된 프로토콜에 따라 플라스미드 각각을 분해시킴에 이어서 상기 분해된 단편을 연결시킴에 의해 제조될 수 있다. 일부 구현예에서, 전기영동 및 아가로스 겔을 사용하여 목적하는 DNA 단편을 획득한다(단계 120). 일부 구현예에서, DNA 단편 농도는 NanoDrop 분광측정기를 사용하여 결정할 수 있다(단계 130). 다양한 전략은 DNA의 단편들을 연결시키기 위해 가용하고 상기 DNA 단편의 선택은 DNA 단편의 말단의 특성에 의존하고 이의 선택은 당업자에 의해 용이하게 수행될 수 있다.
[0122] 일부 구현예에서, 렌티바이러스 전달 벡터 플라스미드는 pUC57-TL20c를 기반으로 한다. 일부 구현예에서, 항생제 내성 카세트 플라스미드는 PGK 프로모터에 의해 구동된다. 일부 구현예에서, 항생제 내성 카세트 플라스미드는 렌티바이러스 전달 벡터 플라스미드 내 렌티바이러스 카세트로 콘카타머화하기 위한 플랭킹 부위를 포함한다. 일부 구현예에서, 항생제 내성 카세트 플라스미드는 PGK-ble (블레오마이신 내성)이다. 일부 구현예에서, PGK-ble 플라스미드는 서열번호 9의 서열과 적어도 90% 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 다른 구현예에서, PGK-ble 플라스미드는 서열번호 9의 서열과 적어도 95% 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 다른 구현예에서, PGK-ble 플라스미드는 서열번호 9의 뉴클레오타이드 서열을 갖는다. 일부 구현예에서, 콘카타머 어레이는 렌티바이러스 전달 벡터 플라스미드 및 PGK-ble 플라스미드로부터 유래된 생성된 DNA 단편의 시험관내 연결을 통해 형성된다.
[0123] 도 15는 콘카타머 어레이를 형성하는데 사용되는 일반 단계를 보여준다. 단계 200에서, 생성된 DNA 단편을 혼합하고 연결 반응에서 단편의 용적을 최대화하여 목적하는 비율을 유지한다(단계 210). 일부 구현예에서, 항생제 내성 카세트 플라스미드 DNA의 양에 대한 렌티바이러스 전달 벡터 플라스미드 DNA의 양의 비율은 약 100:1 내지 약 1:100 범위이다. 일부 구현예에서, 항생제 내성 카세트 플라스미드 DNA의 양에 대한 렌티바이러스 전달 벡터 플라스미드 DNA의 양의 비율은 약 75:1 내지 약 1:75 범위이다. 다른 구현예에서, 항생제 내성 카세트 플라스미드 DNA의 양에 대한 렌티바이러스 전달 벡터 플라스미드 DNA의 양의 비율은 약 50:1 내지 약 1:50 범위이다. 여전히 다른 구현예에서, 항생제 내성 카세트 플라스미드 DNA의 양에 대한 렌티바이러스 전달 벡터 플라스미드 DNA 양의 비율은 약 25:1 내지 약 1:25의 범위이다. 추가의 구현예에서, 항생제 내성 카세트 플라스미드 DNA의 양에 대한 렌티바이러스 전달 벡터 플라스미드 DNA의 양의 비율은 약 10:1 내지 약 1:10 범위이다.
[0124] 일부 구현예에서, 콘카타머 반응 혼합물은 실온 (단계 220)에서, 예를 들어, 약 20℃ 내지 약 25 ℃ 범위의 온도에서 밤새 항온처리한다 . 후속적으로, 각각의 샘플에 대한 DNA 단편 농도는 이어서 NanoDrop 분광측정기(제조원(ThermoFisher Scientific)으로부터 가용한)를 사용하여 측정될 수 있다(단계 230).
[0125] 일부 구현예에서, 방향성 콘카타머 어레이가 형성되고 팩키징 세포주의 형질감염에 사용된다. 일부 구현예에서, 방향성 어레이의 형성은 렌티바이러스 벡터 골격을 플랭킹하는 렌티바이러스 전달 벡터 플라스미드 내 하나 이상의 제한 효소 부위를 사용함에 의해 성취된다. 일부 구현예에서, 제한 분해는 TL20c 벡터 카세트를 플랭킹하는 제한 효소 부위를 사용하고 헤드에서 테일로 연결하기 위해 유일하게 사용될 수 있는 뉴클레오타이드 비팔린드롬 (nonpalindromic) 오버행의 형성을 가능하게 한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 방법에 따른 방향성 연결은 주로 헤드에서 테일로의 DNA 생성물을 포함하는 콘카타머 어레이의 생성을 가능하게 한다.
[0126] 일부 구현예에서, 콘카타머 어레이는 본원의 실시예 3에 제시된 방법에 따라 형성된다. 물론, 당업자는 실시예 3에 제공된 과정이 제2 플라스미드에 대한 제1 플라스미드의 상이한 비율을 갖는 콘카타머 어레이의 형성, 및 LVsh5/C46이외의 다른 전달 플라스미드, 예를 들어, 감마-글로빈 유전자 또는 임의의 다른 관심 대상의 유전자를 발현하도록 디자인된 전달 플라스미드를 위해 조정될 수 있다.
[0127] 일부 구현예에서, 콘카타머 어레이는 팩키징 세포주로의 형질감염 전 페놀-추출 및 에탄올 침전에 의해 정제된다. 상기 통상적인 기술은 저렴하고 효과적이지만, 상기 절차는 시간 소모적이고 재현가능한 수율을 산출할 수 없다. 이것은 또한 상기 특정 방법을 사용하는 경우 페놀/클로로포름이 최종 샘플로 이월될 위험이 있을 수 있는 것으로 사료된다. 더욱이, 상기 공정은 추가의 해로운 화학물질이 관여하는 것으로 사료되고 독성 폐기물을 생성할 수 있고 이는 주의 깊게 해로운 폐기물 지침에 따라 처분되어야 한다.
[0128] 대안적으로, 다른 구현예에서, 실리카 기반 방법을 사용하여 연결 후 새롭게 합성된 콘카타머 어레이를 정제한다. 상기 방법은 고품질의 형질감염 등급의 콘카타머 어레이의 단리를 위해 단순하고, 신뢰할 수 있고, 신속하고 간편한 방법을 제공하는 것으로 사료된다. 일부 구현예에서, 콘카타머 어레이는 예를 들어, 실시예 6에 제시된 절차를 사용하여, 제조원 (Qiagen)으로부터 가용한 Dneasy 소형 스핀 컬럼을 사용하여 정제한다.
[0129] 형질감염/단일 클론 단리
[0130] 콘카타머 어레이의 정제 후, 이어서 어레이를 사용하여 팩키징 세포주 세포를 형질감염시킨다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "형질전환" 및 "형질감염"은 외래 핵산 (예를 들어, DNA 또는 RNA)을 세포에 도입하기 위한 다양한 당업계 인지된 기술을 언급하는 것으로 의도된다. 본원에 제공된 실시예로부터 자명한 바와 같이, 렌티바이러스 입자의 생산을 위해 허용되는 숙주 세포가 생성된 콘카타머 어레이로 형질감염되는 경우, 세포는 생산자 세포, 즉, 감염성 렌티바이러스 입자를 생성하는 세포가 된다.
[0131] 일반적으로, 상기 형성된 콘카타머 어레이 또는 형성된 방향성 콘카타머 어레이는 통상적인 형질감염 기술을 통해 세포에 도입될 수 있다. 예를 들어, 및 도 16을 참조로, 일부 구현예에서, 세포를 형질감염 약 20 내지 약 24시간 전에 수거하여 씨딩하고 (단계 300) 이어서 합성된 콘카타머 어레이 (단계 310)로 형질감염시켰다(단계 320). 팩키징 세포주 세포를 위한 절차는 본원의 실시예 4에 제공된다.
[0132] 형성된 콘카타머 또는 방향성 콘카타머 어레이를 사용한 형질감염을 위해 적합한 하나의 팩키징 세포주는 GPR 팩키징 세포주이다. GPR 주는 gappol 및 rev를 포함하는 필수 바이러스 성분들을 갖는 293T/17 세포로부터 유래된 HIV-1-기반 팩키징 세포주이다(문헌참조: Throm et al., Efficient construction of producer cell lines for a SIN lentiviral vector for SCID-X1 gene therapy by concatemeric array transfection. Blood 113: 5104-5110, 이의 개시내용은 이의 전문이 본원에 참조로 인용된다).
[0133] 형성된 콘카타머 또는 방향성 콘카타머 어레이를 사용한 형질감염을 위해 적합한 또 다른 팩키징 세포주는 GPRG 팩키징 세포주이다. 일부 구현예에서, GPRG 팩킹 세포주는 gagpol, rev, 및 VSV-G을 포함한다.
[0134] 형성된 콘카타머 또는 방향성 콘카타머 어레이를 사용한 형질감염을 위해 적합한 또 다른 팩키징 세포주는 GPRT 팩키징 세포주(gagpol, rev, 및 tat)이다. GPRG 및 GPRT 팩키징 세포주 및 이를 형성하는 방법은 또한 문헌(참조: Throm et. al, 이의 개시내용은 이의 전문이 참조로 본원에 인용된다)에 기재되어 있다. 다른 적합한 팩키징 세포주(예를 들어, GPRT-G)는 문헌(참조: Wielgosz et al."Generation of a lentiviral vector producer cell clone for human Wiskott-Aldrich syndrome gene therapy," Molecular Therapy―Methods & Clinical Development 2, Article number: 14063 (2015), 이의 개시내용은 이의 전문이 본원에 참조로 인용된다)에 기재되어 있다.
[0135] 당업자는 본원에 기재된 방법과 함께 사용하기 위해 적합한 다른 팩키징 세포주가 또한 사용될 수 있음을 인지할 것이다. 일부 구현예에서, 다른 팩키징 세포주는 임의의 GPR, GPRG, GPRT, 또는 GPRT-G 팩키징 세포주로부터 유래할 수 있다. 임의의 특정 이론에 국한시키고자 하는 것 없이, GPRT-G 세포주는 CD34+ 세포에서 보다 높은 형질도입 효율을 갖는 것으로 사료된다(문헌참조: Wielgosz). 본원에 사용된 바와 같은 용어 "로부터 유래된"은 개별 세포로부터 클론적으로 유래되고 소정의 역가로 활성 단백질을 생산하는 능력 또는 특정 밀도로 증식하는 능력과 같은 일부 선택된 질을 갖는 세포 집단을 언급한다.
[0136] 일부 구현예에서, 팩키징 세포주 세포는 293T 세포이다. 293T 세포 (또는 HEK 293T)는 돌연변이 버전의 SV40 대형 T 항원을 발현하는 HEK 293 세포주로부터 유래된 사람 세포주 세포이다. 여전히 다른 적합한 팩키징 세포주는 이의 개시내용의 전문이 본원에 참조로 인용된, 미국 특허 출원 공개 공보 제2009/0187997호, PCT 공개 공보 제WO/2012/170431호, 및 미국 특허 제8,034,620호에 기재되어 있다. PCT 공개 공보 제WO/2012/170431호는 CHO 세포, BHK 세포, MDCK 세포, C3H 10T1/2 세포, FLY 세포, Psi-2 세포, BOSC 23 세포, PA317 세포, WEHI 세포, COS 세포, BSC 1 세포, BSC 40 세포, BMT 10 세포, VERO 세포, W138 세포, MRC5 세포, A549 세포, HT1080 세포, 293 세포, 293T 세포, B-50 세포, 3T3 세포, NIH3T3 세포, HepG2 세포, Saos-2 세포, Huh7 세포, HeLa 세포, W163 세포, 211 세포, 및 211 A 세포로부터 제조될 수 있는 팩키징 세포를 기재한다.
[0137] 도 17은 형질감염된 세포를 선택하는 일반적인 공정을 도해한다. 일부 구현예에서, 및 형질감염 후 약 72시간 후, GPRG 세포는 선택 배지 (제오신 및 데옥시사이클린)로 배양한다(단계 400). 이어서 세포에 세포 병소가 동정될때까지 약 3 내지 약 4일 마다 선택 배지 (제오신 및 데옥시사이클린)를 공급한다(단계 410). 후속적으로, 세포주는 확장시키고 평가한다(단계 420).
[0138] 일부 구현예에서, 및 형질감염 후, 단일 병소 선택/스크리닝 공정을 사용하여 양호한 제조 잠재력을 갖는 단일 세포 클론을 동정하였다. 상기 방법에 따라, 일부 구현예에서, 선택된 세포는 150 x 25 mm 디쉬에서 드문드문 씨딩하고 약 2 내지 약 3주 동안 확장시키고 식별가능한 콜로니를 형성하도록 방치하였다. 개별 콜로니는 이어서 모노클로날 확장을 위해 또 다른 작은 배양 용기로 이전시킬 수 있다. 이러한 방법은 저렴하고 빈번하게 채택되는 기술인 것으로 사료되지만; 그러나, 단일 병소 선택 기술에서 자연적 제한으로 인해, 높은 가능성의 양호한 생산 세포주의 모노클로날능(monoclonality)의 성취가 과제일 수 있다.
[0139] 도 18은 단일 콜로니 단리를 도해한다. 단계 500에서, 유동 세포측정기를 사용하여 단일 세포 분류를 준비한다. 이어서 상기 세포를 조건화된 배양 배지에 분주 (단계 510)하고 확장시켰다(단계 520).
[0140] 다른 구현예에서, 고역가의 렌티바이러스 벡터 안정한 생산자 세포주를 생성하기 위해, 형광성 활성화된 세포 분류기 (FACS)를 사용하여 단일 클론을 단리하였다(예를 들어, 도 8을 참조한다). 조건화된 배지, 예를 들어, 제오신 (50 μg/mL) 및 독시사이클린 (1ng/mL)은 또한 분류 공정 동안에 첨가하여 세포 접착 및 생존률을 증가시키고 콜로니 형성을 촉진시킬 수 있다. 조건화된 성장 배지 및 고속처리능의 FACS 시스템의 사용은 다수의 클론의 스크리닝을 가능하게 하는 것으로 사료되고 따라서 고역가의 렌티바이러스 벡터 생산자 클론을 발견할 가능성을 증가시키는 것으로 사료된다.
[0141] 일부 구현예에서, 양호한 성장 속도 및 바이러스 생산능을 갖는 클론은 약 20회 계대 동안 안정성에 대해 시험한다.
[0142] 바이러스 벡터를 생성하기 위한 생산자 세포주의 유도 및 “2-일 수거”
[0143] 선택된 클론의 선택 및 확장 후, 선택된 클론은 바이러스 벡터, 예를 들어, 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터를 생산하도록 유도한다. 일부 구현예에서, 유도는 당업자에게 공지된 절차에 따라 수행할 수 있다.
[0144] 도 19는 유도 및 평가 공정을 도해한다. 단계 600에서, 바이러스 벡터를 유도하고 이어서 세포, 예를 들어, 293T 세포의 스핀접종(spinoculation)을 수행하여 형질도입 효율을 결정한다(단계 610). 일부 구현예에서, 상부 3개의 클론을 스크리닝하고 (단계 620) 확장시킨다(단계 630). 일부 구현예에서, 클론을 이어서 저장 (예를 들어, 액체 질소 하에)한다(단계 640). 일부 구현예에서, 저장된 세포 뱅크를 이어서 본원에 기재된 바와 같이 바이러스 상등액의 반복적인 수거에 사용할 수 있다.
[0145] 매일 수거 (예를 들어, 약 24시간 마다 수거)를 사용한 생산 프로토콜은 소규모로 다양한 시험 벡터를 생산하기 위해 사용될 수 있지만, 매일 수거 및 배지 교환은 바이오 제조가 대규모로 수행되는 경우 경제적이지 못하다. 상기 비용은 무혈청 배지 보다 더 고가인 혈청-함유 배지를 사용하는 경우 증가된다. 매일 수거에 대한 대안으로서, "2일 수거' 프로토콜은 본원에 기재된 바와 같이 고안되었다. 출원인은 예상치 않게 “2일 수거”가 보다 통상적인 매일 수거와 거의 동일한 양의 바이러스 벡터를 생성시킬 수 있고 또한 적은 배양 배지를 요구한다는 이득을 제공함을 발견하였다. 매일 수거와 “2일 수거” 프로토콜에 따른 바이러스 역가 수율의 비교는 도 5a 및 5b에 도해된다. 일부 구현예에서, "2일 수거" 절차는 통상적인 매일 수거 방법과 비교하여 적어도 약 30% 적은 배양 배지를 사용한다. 다른 구현예에서, "2일 수거" 절차는 통상적인 매일 수거 방법과 비교하여 적어도 약 35% 적은 배양 배지를 사용한다. 다른 구현예에서, "2일 수거" 절차는 통상적인 매일 수거 방법과 비교하여 적어도 약 40% 적은 배양 배지를 사용한다. 다른 구현예에서, "2일 수거" 절차는 통상적인 매일 수거 방법과 비교하여 적어도 약 45% 적은 배양 배지를 사용한다. 여전히 다른 구현예에서, "2일 수거" 절차는 통상적인 매일 수거 방법과 비교하여 적어도 약 50% 적은 배양 배지를 사용한다. 여전히 다른 구현예에서, "2일 수거" 절차는 통상적인 매일 수거 방법과 비교하여 적어도 약 55% 적은 배양 배지를 사용한다.
[0146] 출원인은 추가로 바이러스 벡터 역가가 무혈청 배지에서 반복적으로 수거하는 경우 (배양 및/또는 생산 단계 중 어느 하나 및 둘다에서) 혈청-함유 배지의 사용과 비교하여 감소될 수 있지만 바이러스 벡터 역가에서의 감소가 특히, 무혈청 배지의 사용이 혈청-함유 배지에서 능히 존재하는 병원성 제제로부터의 오염 위험을 완화시키거나 예방함을 고려할때 유의적이지 않은 것으로 사료됨을 입증하였다(도 21a 및 21b 참조). 추가로, 출원인은 “2일 수거” 프로토콜이 혈청 함유 배지가 무혈청 배지로 전환되는 경우 바이러스 역가에서의 감소를 완화시킴을 입증하였다. 사실, 출원인은 세포가 무혈청 배지내에서 매일 수거와 비교하여 무혈청 배지에서 “2일 수거”에 보다 양호한 관용성을 나타냄을 발견하였다. 최종적으로, 무혈청 배지를 사용한 바이오 제조 작동을 수행하는 것과 관련된 비용은 혈청 함유 배지를 사용하는 바이오 제조 작동을 수행하는 경우 보다 비교적 훨씬 적었고 따라서 무혈청 배지로 전환되는 경우 바이러스 벡터 역가에서의 임의의 손실은 인지된 비용 절감을 고려할때 감수할 수 있다(본원에서 표 A 및 B를 비교한다).
[0147] 상기된 바와 같이, 본원 개시내용의 공정은 “2일 수거”를 사용하고, 여기서, 바이러스 벡터는 바이러스 벡터의 초기 수거 후 약 2일 마다 반복적으로 수거한다. 일부 구현예에서, 바이러스 벡터의 초기 수거는 유도 후 (즉, 바이러스 벡터 생산 유도 후) 약 24시간 내지 약 56시간에 수행한다. 일부 구현예에서, 바이러스 벡터의 초기 수거는 유도 후 (즉, 바이러스 벡터 생산 유도 후) 약 30시간 내지 약 56시간에 수행한다. 일부 구현예에서, 바이러스 벡터의 초기 수거는 유도 후 (즉, 바이러스 벡터 생산 유도 후) 약 40시간 내지 약 56시간에 수행한다. 다른 구현예에서, 바이러스 벡터의 초기 수거는 유도 후 약 42시간 내지 약 54시간에 수행한다. 또 다른 구현예에서, 바이러스 벡터의 초기 수거는 유도 후 약 44시간 내지 약 52시간에 수행한다. 추가의 구현예에서, 바이러스 벡터의 초기 수거는 유도 후 약 46시간 내지 약 50시간에 수행한다. 추가의 구현예에서, 바이러스 벡터의 초기 수거는 유도 후 약 47시간 내지 약 49시간에 수행한다. 여전히 추가의 구현예에서, 바이러스 벡터의 초기 수거는 유도 후 약 48시간에 수행한다. 일부 구현예에서, 초기 수거는 유도 후 적어도 30시간에 수행한다. 일부 구현예에서, 초기 수거는 유도 후 적어도 35시간에 수행한다. 일부 구현예에서, 초기 수거는 유도 후 적어도 40시간에 수행한다. 일부 구현예에서, 초기 수거는 유도 후 적어도 45시간에 수행한다.
[0148] 일부 구현예에서, 본원에 기재된 “2일 수거” 프로토콜에 따른 반복 수거는 바이러스 벡터의 초기 수확 후 약 40시간 내지 약 56시간 마다 바이러스 벡터를 반복적으로 수거함을 포함한다. 다른 구현예에서, 초기 수거는 안정한 생산자 세포주 세포의 유도 후 약 40 내지 약 56시간에 수행되고 이어서 수거는 이후 약 42 내지 약 55시간 마다 반복한다. 여전히 다른 구현예에서, 초기 수거는 안정한 생산자 세포주 세포의 유도 후 약 40 내지 약 56시간에 수행되고 이어서 수거는 이후 약 44 내지 약 52시간 마다 반복한다. 추가의 구현예에서, 초기 수거는 안정한 생산자 세포주 세포의 유도 후 약 40 내지 약 56시간에 수행되고 이어서 수거는 이후 약 46 내지 약 50시간 마다 반복한다. 심지어 추가의 구현예에서, 초기 수거는 안정한 생산자 세포주 세포의 유도 후 약 40 내지 약 56시간에 수행되고 이어서 수거는 이후 약 48시간 마다 반복한다. 출원인은 바이러스 벡터가 유도 후 약 48시간에 수거될 수 있고 바이러스 역가의 최대 양이 유도 후 약 72시간에 수득될 수 있음을 발견하였다. 출원인은 또한 반복적인 바이러스 수거 프로토콜이 또한 바이러스 벡터의 최종 수율을 증가시킬 수 있음을 발견하였다.
[0149] 일부 구현예에서, 초기 수거는 안정한 생산자 세포주 세포의 유도 후 약 40 내지 약 56시간에 수행되고 이어서 수거는 이후 적어도 약 40시간 마다 반복한다. 일부 구현예에서, 초기 수거는 안정한 생산자 세포주 세포의 유도 후 약 40 내지 약 56시간에 수행되고 이어서 수거는 이후 적어도 약 42시간 마다 반복한다. 일부 구현예에서, 초기 수거는 안정한 생산자 세포주 세포의 유도 후 약 44 내지 약 56시간에 수행되고 이어서 수거는 이후 적어도 약 40시간 마다 반복한다. 일부 구현예에서, 초기 수거는 안정한 생산자 세포주 세포의 유도 후 약 46 내지 약 56시간에 수행되고 이어서 수거는 이후 적어도 약 40시간 마다 반복한다.
[0150] 일부 구현예에서, 수거를 위해 사용되는 무혈청 배지는 각각의 반복적인 수거 후 대체한다. 일부 구현예에서, 어떠한 추가의 무혈청 배지는 각각의 개별 수거 동안에 생성된 안정한 생산자 세포주 세포에 도입되지 않는다. 일부 구현예에서, 반복되는 수거는 새로운 배지를 추가의 안정한 생산자 세포주 세포를 도입하는 것 없이 안정한 생산자 세포주 세포에 첨가하는 단계를 포함한다.
[0151] 일부 구현예에서, 본원의 개시내용에 따른 방법 (무혈청 배지에서 “2일 수거”)은 반복적인 수거의 각각의 개별 수거 동안에 약 0.5 x 106 TU/mL 내지 약 5 x 106 TU/mL 범위의 수거될 생존 바이러스 역가를 가능하게 한다. 다른 구현예에서, 본원의 개시내용에 따른 방법 (무혈청 배지에서 “2일 수거”)은 반복적인 수거의 각각의 개별 수거 동안에 약 0.5 x 106 TU/mL 내지 약 4 x 106 TU/mL 범위의 수거될 생존 바이러스 역가를 가능하게 한다. 여전히 다른 구현예에서, 본원의 개시내용에 따른 방법 (무혈청 배지에서 “2일 수거”)은 반복적인 수거의 각각의 개별 수거 동안에 약 0.5 x 106 TU/mL 내지 약 3.5 x 106 TU/mL 범위의 수거될 생존 바이러스 역가를 가능하게 한다. 추가의 구현예에서, 본원의 개시내용에 따른 방법 (무혈청 배지에서 “2일 수거”)은 반복적인 수거의 각각의 개별 수거 동안에 약 0.5 x 106 TU/mL 내지 약 3 x 106 TU/mL 범위의 수거될 생존 바이러스 역가를 가능하게 한다. 심지어 추가의 구현예에서, 본원의 개시내용에 따른 방법 (무혈청 배지에서 “2일 수거”)은 반복적인 수거의 각각의 개별 수거 동안에 약 0.5 x 106 TU/mL 내지 약 2.5 x 106 TU/mL 범위의 수거될 생존 바이러스 역가를 가능하게 한다. 여전히 다른 구현예에서, 본원의 개시내용에 따른 방법 (무혈청 배지에서 “2일 수거”)은 반복적인 수거의 각각의 개별 수거 동안에 약 0.5 x 106 TU/mL 내지 약 2 x 106 TU/mL 범위의 수거될 생존 바이러스 역가를 가능하게 한다. 여전히 다른 구현예에서, 본원의 개시내용에 따른 방법 (무혈청 배지에서 “2일 수거”)은 반복적인 수거의 각각의 개별 수거 동안에 약 0.5 x 106 TU/mL 내지 약 1.7 x 106 TU/mL 범위의 수거될 생존 바이러스 역가를 가능하게 한다. 여전히 추가의 구현예에서, 본원의 개시내용에 따른 방법 (무혈청 배지에서 “2일 수거”)은 반복적인 수거의 각각의 개별 수거 동안에 약 0.5 x 106 TU/mL 내지 약 1.6 x 106 TU/mL 범위의 수거될 생존 바이러스 역가를 가능하게 한다. 여전히 다른 구현예에서, 본원의 개시내용에 따른 방법 (무혈청 배지에서 “2일 수거”)은 반복적인 수거의 각각의 개별 수거 동안에 약 0.5 x 106 TU/mL 내지 약 1.4 x 106 TU/mL 범위의 수거될 생존 바이러스 역가를 가능하게 한다. 여전히 다른 구현예에서, 본원의 개시내용에 따른 방법 (무혈청 배지에서 “2일 수거”)은 반복적인 수거의 각각의 개별 수거 동안에 약 0.5 x 106 TU/mL 내지 약 1.3 x 106 TU/mL 범위의 수거될 생존 바이러스 역가를 가능하게 한다. 여전히 추가의 구현예에서, 본원의 개시내용에 따른 방법 (무혈청 배지에서 “2일 수거”)은 반복적인 수거의 각각의 개별 수거 동안에 약 0.5 x 106 TU/mL 내지 약 1.2 x 106 TU/mL 범위의 수거될 생존 바이러스 역가를 가능하게 한다. 심지어 추가의 구현예에서, 본원의 개시내용에 따른 방법 (무혈청 배지에서 “2일 수거”)은 반복적인 수거의 각각의 개별 수거 동안에 약 0.5 x 106 TU/mL 내지 약 1.1 x 106 TU/mL 범위의 수거될 생존 바이러스 역가를 가능하게 한다. 심지어 추가의 구현예에서, 본원의 개시내용에 따른 방법 (무혈청 배지에서 “2일 수거”)은 반복적인 수거의 각각의 개별 수거 동안에 약 0.5 x 106 TU/mL 내지 약 1 x 106 TU/mL 범위의 수거될 생존 바이러스 역가를 가능하게 한다.
[0152] 일부 구현예에서, 본원의 개시내용에 따른 방법 (무혈청 배지에서 “2일 수거”)은 반복적인 수거의 각각의 개별 수거 동안에 수거될 적어도 약 0.5 x 106 TU/mL의 생존 바이러스 역가를 가능하게 한다. 일부 구현예에서, 본원의 개시내용에 따른 방법 (무혈청 배지에서 “2일 수거”)은 반복적인 수거의 각각의 개별 수거 동안에 수거될 적어도 약 1 x 106 TU/mL의 생존 바이러스 역가를 가능하게 한다. 일부 구현예에서, 본원의 개시내용에 따른 방법 (무혈청 배지에서 “2일 수거”)은 반복적인 수거의 각각의 개별 수거 동안에 수거될 적어도 약 1.5 x 106 TU/mL의 생존 바이러스 역가를 가능하게 한다. 일부 구현예에서, 본원의 개시내용에 따른 방법 (무혈청 배지에서 “2일 수거”)은 반복적인 수거의 각각의 개별 수거 동안에 수거될 적어도 약 2 x 106 TU/mL의 생존 바이러스 역가를 가능하게 한다. 일부 구현예에서, 본원의 개시내용에 따른 방법 (무혈청 배지에서 “2일 수거”)은 반복적인 수거의 각각의 개별 수거 동안에 수거될 적어도 약 2.5 x 106 TU/mL의 생존 바이러스 역가를 가능하게 한다. 일부 구현예에서, 본원의 개시내용에 따른 방법 (무혈청 배지에서 “2일 수거”)은 반복적인 수거의 각각의 개별 수거 동안에 수거될 적어도 약 3 x 106 TU/mL의 생존 바이러스 역가를 가능하게 한다. 일부 구현예에서, 본원의 개시내용에 따른 방법 (무혈청 배지에서 “2일 수거”)은 반복적인 수거의 각각의 개별 수거 동안에 수거될 적어도 약 3.5 x 106 TU/mL의 생존 바이러스 역가를 가능하게 한다. 일부 구현예에서, 본원의 개시내용에 따른 방법 (무혈청 배지에서 “2일 수거”)은 반복적인 수거의 각각의 개별 수거 동안에 수거될 적어도 약 4 x 106 TU/mL의 생존 바이러스 역가를 가능하게 한다. 일부 구현예에서, 본원의 개시내용에 따른 방법 (무혈청 배지에서 “2일 수거”)은 반복적인 수거의 각각의 개별 수거 동안에 수거될 적어도 약 4.5 x 106 TU/mL의 생존 바이러스 역가를 가능하게 한다. 일부 구현예에서, 본원의 개시내용에 따른 방법 (무혈청 배지에서 “2일 수거”)은 반복적인 수거의 각각의 개별 수거 동안에 수거될 적어도 약 5 x 106 TU/mL의 생존 바이러스 역가를 가능하게 한다.
[0153] 일부 구현예에서, 생산 단계는 약 5일 내지 약 90일 동안 지속한다. 일부 구현예에서, 생산 단계는 약 5일 내지 약 80일 동안 지속한다. 일부 구현예에서, 생산 단계는 약 5일 내지 약 70일 동안 지속한다. 일부 구현예에서, 생산 단계는 약 5일 내지 약 60일 동안 지속한다. 일부 구현예에서, 생산 단계는 약 5일 내지 약 50일 동안 지속한다. 일부 구현예에서, 생산 단계는 약 5일 내지 약 40일 동안 지속한다. 일부 구현예에서, 생산 단계는 약 5일 내지 약 30일 동안 지속한다. 일부 구현예에서, 생산 단계는 약 5일 내지 약 20일 동안 지속한다. 일부 구현예에서, 생산 단계는 약 10일 내지 약 90일 동안 지속한다. 일부 구현예에서, 생산 단계는 약 10일 내지 약 60일 동안 지속한다. 일부 구현예에서, 생산 단계는 약 10일 내지 약 45일 동안 지속한다. 일부 구현예에서, 생산 단계는 적어도 약 5, 적어도 약 10, 적어도 약 15, 적어도 약 20, 적어도 약 25, 적어도 약 30, 적어도 약 35, 적어도 약 40, 적어도 약 45, 적어도 약 50, 적어도 약 55, 적어도 약 60, 적어도 약 65, 적어도 약 70, 적어도 약 75, 적어도 약 80, 적어도 약 85, 또는 적어도 약 90일 동안 지속한다. 일부 구현예에서, 생산 단계는 약 5, 약 10, 약 15, 약 20, 약 25, 약 30, 약 35, 약 40, 약 45, 약 50, 약 55, 약 60, 약 65, 약 70, 약 75, 약 80, 약 85, 또는 약 90일 동안 지속한다.
[0154] 일부 구현예에서, 수거는 적어도 2회 수행한다. 다른 구현예에서, 수거는 적어도 3회 수행한다. 다른 구현예에서, 수거는 적어도 4회 수행한다. 다른 구현예에서, 반복 수거는 적어도 5회 수행한다. 다른 구현예에서, 수거는 적어도 6회 수행한다. 다른 구현예에서, 수거는 적어도 7회 수행한다. 다른 구현예에서, 수거는 적어도 8회 수행한다. 다른 구현예에서, 수거는 적어도 9회 수행한다. 다른 구현예에서, 수거는 적어도 10회 수행한다. 일부 구현예에서, 수거는 적어도 11회 수행한다. 다른 구현예에서, 수거는 적어도 12회 수행한다. 다른 구현예에서, 수거는 적어도 13회 수행한다. 다른 구현예에서, 수거는 적어도 14회 수행한다. 다른 구현예에서, 수거는 적어도 15회 수행한다. 다른 구현예에서, 수거는 적어도 16회 수행한다. 다른 구현예에서, 수거는 적어도 17회 수행한다. 다른 구현예에서, 수거는 적어도 18회 수행한다. 다른 구현예에서, 수거는 적어도 19회 수행한다. 다른 구현예에서, 수거는 적어도 20회 수행한다. 다른 구현예에서, 수거는 적어도 25회 수행한다.
[0155] 출원인은 또한 무혈청 배지에서 약 2일 마다 반복 수거 바이러스 벡터가 동일한 수거 프로토콜을 사용하지만 혈청-함유 배지에서 사용하는 경우 회수되는 바이러스 벡터 역가의 양과 비교하여 수거될 바이러스 벡터 역가의 실질적으로 동일한 양을 가능하게 한다(예를 들어, 표 A 및 B; 또한 도 21a 및 21b 참조). 일부 구현예에서, (“2일 수거” 스케줄에 따라) 무혈청 배지에서 생성되는 감염성 입자의 양은 (“2일 수거” 스케줄에 따라) 혈청-함유 배지에서 생성되는 감염성 입자 총양의 적어도 약 65% 내에 있다. 일부 구현예에서, (“2일 수거” 스케줄을 사용하여) 무혈청 배지에서 생성되는 감염성 입자의 양은 (“2일 수거” 스케줄을 사용하여) 혈청-함유 배지에서 생성되는 감염성 입자 총양의 적어도 약 70% 내에 있다. 일부 구현예에서, (“2일 수거” 스케줄을 사용하여) 무혈청 배지에서 생성되는 감염성 입자의 양은 (“2일 수거” 스케줄을 사용하여) 혈청-함유 배지에서 생성되는 감염성 입자의 총양의 적어도 약 75% 내에 있다. 일부 구현예에서, (“2일 수거” 스케줄을 사용하여) 무혈청 배지에서 생성되는 감염성 입자의 양은 (“2일 수거” 스케줄을 사용하여) 혈청-함유 배지에서 생성되는 감염성 입자의 총양의 적어도 약 80% 내에 있다. 일부 구현예에서, (“2일 수거” 스케줄을 사용하여) 무혈청 배지에서 생성되는 감염성 입자의 양은 (“2일 수거” 스케줄을 사용하여) 혈청-함유 배지에서 생성되는 감염성 입자의 총양의 적어도 약 85% 내에 있다. 일부 구현예에서, (“2일 수거” 스케줄을 사용하여) 무혈청 배지에서 생성되는 감염성 입자의 양은 (“2일 수거” 스케줄을 사용하여) 혈청-함유 배지에서 생성되는 감염성 입자의 총양의 적어도 약 90% 내에 있다. 일부 구현예에서, (“2일 수거” 스케줄을 사용하여) 무혈청 배지에서 생성되는 감염성 입자의 양은 (“2일 수거” 스케줄을 사용하여) 혈청-함유 배지에서 생성되는 감염성 입자의 총양의 적어도 약 95% 내에 있다.
[0156] 일부 구현예에서, 및 각각의 반복 수거 단계의 결론에 따라, 수거된 바이러스 벡터는 여과를 통해 정제될 수 있다. 일부 구현예에서, 수거된 벡터는 바이러스 역가, 세포 게놈 당 바이러스 카피 및/또는 p24 농도 중 하나 이상을 결정함에 의해 특징 분석된다.
[0157] 혈청-함유 배지를 사용한 반복 수거의 예
[0158] 제1의 예시적 방법
[0159] 제1의 예시적 방법에서, 혈청 함유 배지는 각각의 단계에서, 즉, 배양 단계, 생산 단계 및 세포의 계대 동안에 사용된다. 일부 구현예에서, 혈청을 함유하는 배지는 D10 혈청-함유 배지이다. 일부 구현예에서, D10 혈청-함유 배지는 듈베코 변형 이글 배지 (DMEM) 및 열 불활성화된 (10%) 태아 소 혈청(즉, 사용전에 이미 열 불활성화된 태아 소 혈청)을 포함한다.
[0160] 하나의 구현예에서 본원 개시내용에 따라 2일 수거를 사용하여 바이러스 벡터를 생성하는 제1 방법이 제공되고, 제1 방법은 하기의 단계를 포함한다:
[0161] (1) 생산자 세포주 배양 디쉬의 구배양 배지를 가능한한 완전히 제거하고 상기 세포를 1 x PBS로 세척하는 단계.
[0162] (2) TrypLE™ Express 효소 (1×)를 배양 디쉬 (제조원(ThermoFisher Scientific)으로부터 가용한)에 첨가하는 단계.
[0163] (3) 약 2분동안 약 37°C에서 배양기에 위치시키는 단계.
[0164] (4) D10 배지 (임의의 약물이 부재인)를 첨가함에 의해 세포를 세척 제거하고 세포 클러스터를 상하 피펫팅함에 의해 단일 세포로 해리시키는 단계(D10 배지: 고농도 글루코스, GlutaMAX™ 보충물 및 10% (w/v) FBS 및 1% (w/v) Pen/Strep을 갖는 듈베코 변형 이글 배지).
[0165] (5) 약 1200 rpm (또는 125 x g)에서 약 4°C에서 약 5분 동안 세포를 원심분리하는 단계.
[0166] (6) 배지를 흡인 제거하고 형성된 펠렛을 새로운 D10 배지 (약물 부재)에 약하게 현탁시키는 단계.
[0167] (7) 세포를 배양 디쉬에서 약 95% 컨플루언트로 씨딩하는 단계(대략 4 × 106 세포/60-mm 배양 디쉬로 분주함에 의해, 벡터 유도(Vectors Induction)).
[0168] (8) 이어서 상기 씨딩된 세포에 약 24시간 후 (유도 후 1일) 새로운-예비 가온 D10 배지를 보충하는 단계.
[0169] (9) 최초 배지 변화 후 처음으로 약 48시간 (유도 후 3일)에 바이러스 벡터를 수거하는 단계.
[0170] (10) 새로운 예비-가온 배지를 배양 디쉬에 첨가하는 단계.
[0171] (11) 2번째 배지 변화 후 약 48시간 (유도 후 5일)에 2번째 바이러스 벡터의 수거를 수행하는 단계.
[0172] (12) 새로운 예비-가온 배지를 배양 디쉬에 첨가하는 단계.
[0173] (13) 3번째 배지 변화 후 약 48시간 (유도 후 7일)에 3번째 바이러스 벡터의 수거를 수행하는 단계.
[0174] 제2의 예시적 방법
[0175] 제2의 예시적 방법에서, 혈청 함유 배지는 각각의 단계에서, 즉, 세포의 계대 동안에, 배양 단계에서 및 생산 단계에서 사용된다. 일부 구현예에서, 혈청 함유 배지는 D10이다.
[0176] (1) 생산자 세포주 배양 디쉬의 배지를 가능한한 완전히 제거하고 상기 세포를 1 x PBS로 세척하는 단계.
[0177] (2) 1×TrypLE Express를 100mm 배양 디쉬에 대해 3mL을 사용하여 세척된 세포 단일층 상에 약하게 피펫팅하는 단계.
[0178] (3) 상기 단일층을 TrypLE Express로 커버하기 위해 플라스크를 회전시키는 단계.
[0179] (4) 플라스크를 배양기에 복귀시키고 약 2분 동안 방치하는 단계.
[0180] (5) 플라스크의 측면을 가볍게 두들겨서 임의의 잔류하는 부착된 세포를 방출시키는 단계.
[0181] (6) 세포를 약 2mL의 새로운 D10 배지(항생제 부재)에 재현탁시키고 15 mL의 원뿔형 원심분리 튜브에 전달하는 단계.
[0182] (7) 약 1200 rpm (또는 125 x g)에서 약 5분 동안 세포를 원심분리하는 단계.
[0183] (8) 배지를 흡인 제거하고 펠렛을 약 5mL의 새로운 D10 배양 배지 (항생제 부재)에 약하게 현탁시키는 단계.
[0184] (9) TC10™ 자동화 세포 계수기에 의해 세포 수를 결정하는 단계.
[0185] (10) 약 95% 초과의 컨플루언트 세포를 배양 디쉬에 씨딩하는 단계(약 4×106 생존 세포를 60-mm 배양 디쉬에 분주함에 의해).
[0186] (11) 씨딩된 세포에 매일(약 24시간 마다) 새로운 가온 D10 배지를 보충하는 단계.
[0187] 출원인은 바이러스 벡터가 유도 후 약 48시간에 세포로부터 수거될 수 있고 상기 최고 바이러스 역가가 유도 후 72시간에 수득될 수 있음을 발견하였다. 출원인은 다시 예상치 않게 바이러스 벡터가 유도 후 약 2 내지 약 4일로부터 수거될 수 있음을 발견하였다.
[0188] 일부 구현예에서, 수거된 벡터는 여과를 통해 정제한다. 일부 구현예에서, 수거된 벡터는 바이러스 역가, 세포 게놈 당 바이러스 카피 및/또는 p24 농도를 결정함에 의해 특징 분석된다.
[0189] 무혈청 배지를 사용한 반복 수거의 예
[0190] 본원의 개시내용은 또한 무혈청 배지를 사용한 2일 수거를 수행하는 방법을 제공한다. 하기된 제3 및 제4 구현예에 상세히 기재된 바와 같이, 무혈청 배지는 배양 단계 또는 생산 단계 중 적어도 하나에서 사용될 수 있다.
[0191] 출원인은 “2일 수거” 절차를 무혈청 배지의 사용과 조합함에 의해, 역가에서 단지 최소의 감소와 함께 바이러스 벡터를 반복적으로 수거하는 저렴한 방법을 발견하였다. "2일 수거" 프로토콜과 함께 무혈청 배지의 사용이 특히 혈청 함유 배지의 비용이 매우 높을 수 있는 대규모 바이오 제조를 위해 특히 중요한 것으로 사료된다. 따라서, 일부 구현예에서, 수거는 무혈청 배지에서 적어도 부분적으로 수행된다. 예를 들어, 배양 단계 또는 생산 단계의 적어도 하나는 무혈청 배지를 사용한다. 또 다른 예로서, 배양 단계 및 생산 단계 둘다는 무혈청 배지를 사용한다.
[표 A]
Figure pct00001
[표 B]
Figure pct00002
[0192] 제3의 예시적 방법
[0193] 제3의 예시적 방법에서, 무혈청 배지는 일부 단계에서 (예를 들어, 배양 및 생산 단계 둘다에서) 사용되고 혈청 함유 배지는 다른 단계 (예를 들어, 세포의 계대 동안에)에서 사용된다. 일부 구현예에서, 혈청 함유 배지는 D10 혈청 함유 배지이고; 무혈청 배지는 UltraCULTURE™ 배지(제조원(Lonza)으로부터 가용한)이다. 일부 구현예에서, 무혈청 배지는 임의로 하나 이상의 성장 인자 및/또는 지질, 예를 들어, 제조원(Sigma L5145)으로부터 가용한 “지질 혼합 보충물”을 포함한다. UltraCULTURETM 배지 및 Sigma L5145 배지 둘다는 벡터 생산 동안에 세포를 안정화시켰다. 비교 데이터는 표 A 및 B (상기)에서 및 도 21a 및 21b에서 제공된다.
[0194] 따라서, 본원의 개시내용은 2일 수거를 사용한 바이러스 벡터를 생성하는 제3의 방법을 제공하고, 제3의 방법은 하기의 단계를 포함한다:
[0195] (1) 세포를 바이러스 벡터 생산에 사용하기 전에 해동 후 (예를 들어, 동결로부터 회복시키기 위해) 적어도 4회 세포를 계대하는 단계.
[0196] (2) 상기 세포를 목적하는 양으로 배양하는 단계 (격일로 세포를 계대하는)
[0197] (3) 생산자 세포주 배양 디쉬의 배지를 가능한한 완전히 제거하고 상기 세포를 1 x PBS로 세척하는 단계.
[0198] (4) 1×TrypLE Express를 세척된 세포 단일층 상으로 약하게 피펫팅하는 단계
[0199] (5) 상기 단일층을 TrypLE Express로 커버하기 위해 플라스크를 회전시키는 단계.
[0200] (6) 플라스크를 배양기에 복귀시키고 약 2분 동안 방치하는 단계.
[0201] (7) 플라스크의 측면을 가볍게 두들겨서 임의의 잔류하는 부착된 세포를 방출시키는 단계.
[0202] (8) 세포를 새로운 D10 배지(항생제 부재)에 재현탁시키고 원뿔형 원심분리 튜브에 전달하는 단계.
[0203] (9) 세포를 약 1200 rpm에서 약 5분동안 원심분리하는 단계.
[0204] (10) 배지를 흡인 제거하고 펠렛을 새로운 D10 배양 배지 (항생제 부재)에 약하게 현탁시키는 단계.
[0205] (11) TC10TM 자동화 세포 계수기를 사용하여 세포수를 결정하는 단계.
[0206] (12) 배양 디쉬에서 > 95% 컨플루언트한 세포를 UltraCULTURE™ 무혈청 배지 (항생제 부재)에 씨딩하는 단계.
[0207] (13) 유도 후 약 24시간에, 구배양 배지를 새로운 예비-가온 UltraCULTURE™ 무혈청 배지로 대체하는 단계.
[0208] (14) 바이러스 벡터는 유도 후 약 72시간에 유도된 세포로부터 수거하는 단계.
[0209] 제4의 예시적 방법
[0210] 제4의 예시적 방법에서, 무혈청 배지는 생산 단계에서 사용되고; 혈청 함유 배지는 배양 단계 및 세포의 계대 동안 둘다에서 사용된다. 일부 구현예에서, 혈청 함유 배지는 D10 혈청 함유 배지이고; 무혈청 배지는 UltraCULTURE™ 배지 (제조원(Lonza)으로부터 가용한) (추가 성장 인자, 예를 들어, EX-CYTE®을 임의로 포함하는)이다. EX-CYTE® 보충물은 콜레스테롤, 지질단백질 및 지방산의 수용성 농축물이고, 이는 다양한 포유동물 세포에서 세포 성장 및 단백질 생성을 증진시키는 것으로 입증된 대사적 인자들의 균형된 프로파일을 제공한다. 일부 구현예에서, 약 1%의 v/v의 EX-CYTE는 배양 배지에 첨가하였다. 생산 단계예서 무혈청 배지를 사용하는 경우, 세포는 적응 절차를 통해 진행할 필요가 없는 것으로 사료된다. 한편, 세포는 상기 배지가 배양 단계에서 사용되는 경우, 무혈청 배지의 용도에 적응하기 위해 일부 시간을 필요로 하는 것으로 사료된다.
[0211] 또 다른 구현예에서 본원 개시내용에 따라 2일 수거를 사용하여 바이러스 벡터를 생성하는 제4 방법이 제공되고, 제4 방법은 하기의 단계를 포함한다:
[0212] (1) 세포를 바이러스 벡터 생산에 사용하기 전에 해동 후 적어도 약 4회 세포를 계대하는 단계.
[0213] (2) 벡터 유도 적어도 2일 전에 매일 세포를 계대하는 단계(대수기 성장을 유지하기 위해).
[0214] (3) 생산자 세포주 배양 디쉬의 배지를 가능한한 완전히 제거하고 상기 세포를 1 x PBS로 세척하는 단계.
[0215] (4) 1×TrypLE Express를 세척된 세포 단일층 상으로 약하게 피펫팅하는 단계.
[0216] (5) 상기 단일층을 TrypLE Express로 커버하기 위해 플라스크를 회전시키는 단계.
[0217] (6) 플라스크를 배양기에 복귀시키고 약 2분 동안 방치하는 단계.
[0218] (7) 플라스크의 측면을 가볍게 두들겨서 임의의 잔류하는 부착된 세포를 방출시키는 단계.
[0219] (8) 세포를 새로운 D10 배지(항생제 부재)에 재현탁시키고 원뿔형 원심분리 튜브에 전달하는 단계.
[0220] (9) 약 1200 rpm (또는 125 x g)에서 약 5분 동안 세포를 원심분리하는 단계.
[0221] (10) 배지를 흡인 제거하고 펠렛을 새로운 D10 배양 배지 (항생제 부재)에 약하게 현탁시키는 단계.
[0222] (11) TC10™ 자동화 세포 계수기에 의해 세포 수를 결정하는 단계.
[0223] (12) > 95% 컨플루언트인 세포를 새로운 D10 배양 배지 (항생제 부재) 중 배양 디쉬에 씨딩하는 단계.
[0224] (13) 유도 후 약 24시간에, D10 배양 배지를 새로운 예비-가온 UltraCULTURE™ 무혈청 배지로 대체하는 단계.
[0225] (14) 바이러스 벡터를 유도 후 약 72시간, 약 120시간 및 약 168시간에 유도된 세포로부터 수거하는 단계.
[0226] 실시예
[0227] 실시예 1 - 일시적 형질감염에 의해 생성된 자가-불활성화 렌티바이러스 벡터 및 기재된 안정한 세포주 방법에 의해 생성된 벡터의 상세한 비교
[0228] 본원에 기재된 방법을 사용하여, HIV-1 융합 억제제 C46과 조합하여 HIV-1 공동-수용체 CCR5의 하향 조절을 위해 짧은 헤어핀 RNA(shRNA)를 암호화하는 자가-불활성화 렌티바이러스 벡터(SIN-LV)인 LVsh5/C46의 생성을 위해 안정한 세포주를 생성하였다. 일시적 형질감염에 의해 생성된 상기 렌티바이러스 벡터는 현재 HIV-감염된 개체에서 임상 시험으로 현재 평가 중에 있다. 여기서, 일시적 형질감염에 의해 생성된 LVsh5/C46과 LVsh5/C46 및 다른 SIN-LV의 임상 제조를 위한 상기 시스템의 적용을 지지하기 위해 본원에 기재된 방법을 사용하여 제조된 LVsh5/C46의 비교 분석을 수행하였다.
[0229] 당업자는 본원에 기재된 방법이 다른 자가-불활성화 렌티바이러스 벡터의 생성으로 연장될 수 있음을 인지할 것이다. 예를 들어, SIN-LV는 (i) RNAi, 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 또는 HPRT 유전자를 표적화하는 엑손 스키핑 제제를 암호화하는 제1 핵산 서열; 및 (ii) 치료학적 유전자를 암호화하는 제2 핵산 서열을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 치료학적 유전자를 암호화하는 제2 핵산은 겸상 적혈구 질환 또는 β-지중해빈혈을 유전학적으로 보정할 수 있거나 이의 증상(중증의 겸상 적혈구 질환의 증상을 포함하는)을 감소시킬 수 있는 것이다. 다른 구현예에서, 치료학적 유전자를 암호화하는 핵산은 면역 결핍, 유전성 질환, 혈액 질환(예를 들어, 혈우병, 헤모글로빈 장애), 신경학적 질환 및/또는 리소좀 저장 질환을 유전학적으로 보정할 수 있거나; 이의 증상을 감소시킬 수 있는 것이다. 일부 구현예에서, 치료학적 유전자는 감마 글로빈 유전자이다. 일부 구현예에서, 감마 글로빈 유전자를 암호화하는 제2 핵산 서열은 HbS에 대한 사량체 HbF의 형성을 피하면서, 알파-글로빈 쇄에 대한 경쟁적 이점을 부여하는 점 돌연변이를 포함하는 하이브리드 감마 글로빈 유전자이다.
[0230] 렌티바이러스 벡터(LV)는 4-플라스미드 시스템(하나의 전달 벡터, 2개의 팩키징 벡터 및 하나의 외피 벡터)를 사용하여 293T 세포에서 인산칼슘 형질감염에 의해 생산되었다. 바이러스-함유 배지 (VCM)는 형질감염 후 48시간에 수거하고 20% 슈크로스 쿠션을 통한 초원심분리에 의해 농축시켰다.
[0231] 세포주 생성을 위해, 생산자 세포주 세포를 독시사이클린 (Dox)가 없는 배지에서 유도시키고 VCM은 약 72시간에 수거하고 유사하게 초원심분리에 의해 농축시켰다. 표 1 및 도 8 및 9를 참조로, 각각의 방법에 의해 생성된 렌티바이러스 벡터는 입자 역가를 기준으로 및 293T 및 Tf-1a T 세포주에 대한 유전자 형질도입 효능을 위해 3개의 독립적 검정을 사용하여 비교하였다. 이들은 숙주 세포 게놈 당 벡터 카피수 (VCN)에 대한 qPCR 검정 뿐만 아니라 세포 표면 C46 발현 및 CCR5 발현의 shRNA-매개된 녹다운에 대한 FACS 검정을 포함하였다. 모든 검정을 위해, 역가는 벡터 희석 범위 상에서 결정하여 선형 관계를 한정하였다. qPCR 검정은 형질도입된 세포로부터 추출된 게놈 DNA를 사용하였고 C46 전이유전자, 및 내인성 β-글로빈 유전자로부터의 서열을 검출하였다. 이와 같이, C46 VCN은 세포 게놈으로 정규화될 수 있다.
[표 1]
Figure pct00003
[0232] 보다 높은 농도의 p24는 일시적 형질감염 방법에 상대적으로, 생산자 세포주에 의해 생성된 VCM에서 관찰되었다. 그러나, 2개의 상이한 시스템을 사용하여 생성된 LVsh5/C46의 수율 및 효능은 유사하였다. 벡터는 먼저 VCM의 동일한 용적을 사용하여 FACS에 의한 C46 역가에 대해 평가하였다. 일시적 형질감염에 의해 생성된 벡터는 온건하게 증가된 역가를 갖지만, C46 역가가 정규화되고 벡터 제제가 qPCR 검정을 사용하거나 CCR5의 기능적 녹다운을 통한 유전자 형질도입에 대해 평가되는 경우, 안정한 생산자 세포주에 의해 생성된 벡터는 보다 큰 효능을 보여주었다(표 2 참조). CCR5 발현 및 게놈 C46 전이유전자 (VCN)의 하향조절은 각각 본원에 기재된 방법에 의해 생성된 LVsh5/C46으로 처리된 표적 세포에서 일시적 형질감염에 의해 생성된 벡터로 처리된 것 보다 유의적으로 높았다(표 3 및 도 10 참조).
[표 2]
Figure pct00004
[표 3]
Figure pct00005
[0233] 3개의 독립적 검정을 기준으로, 본원에 기재된 방법이 일시적 형질감염 방법과 비교하여 유사한 질 및 양의 SIN-LV를 생성할 수 있는 안정한 렌티바이러스 벡터 생성 시스템을 제공함이 입증되었다. 보다 높은 CCR5 하향조절 효능 및 형질도입된 세포(C46 역가로 정규화된)에서 C46 VCN은 생산자 세포에 의해 생성된 LVsh5/C46이 통상적인 4-플라스미드 일시적 형질감염 방법을 사용하여 생성된 벡터 보다 양호한 효능을 가짐을 지적하였다. 어떠한 특정 이론에 의해 국한하고자 하는 것 없이, 단조로운 일시적 형질감염 단계를 제거함에 의해, 상기 생산 시스템이 사람용 임상적 등급 재료의 제조를 위한 cGMP 조건으로 용이하게 조정될 수 있는 것으로 사료된다.
[0234] 실시예 2 - HIV 유전자 치료요법을 위한 렌티바이러스 벡터의 바이오 생산을 위한 GPRG-기반 생산자 세포주의 개발 및 특징 분석
[0235] GPRG 세포주 시스템은 이전에 자가-불활성화 렌티바이러스 벡터 (SIN-LV)의 임상적 생산을 위해 확립되었다. 여기서, LVsh5/C46의 생성을 위한 GPRG 기반의 생산자 세포주가 개발되었다(LVsh5/C46은 HIV 감염된 개체의 치료를 위한 임상에서 현재 평가되고 있는 SIN-LV이다). 이러한 벡터는 2개의 바이러스 진입 억제제; HIV 공동-수용체 CCR5에 대한 짧은 헤어핀 RNA인 sh5, 및 바이러스 융합 억제제인 C46을 암호화한다. 추가로, LVsh5/C46의 바이오-생산을 위한 GPRG 시스템의 조절 완수 및 임상적 적용을 위해 요구되는 바와 같이 테트라사이클인의 유도 후 GPRG 팩키징 세포주, GRPG-기반 LVsh5/C46 생산자 세포주 및 LVsh5/C46 생산의 안정성은 상기 실험 전반에 걸쳐 한정되었다.
[0236] GPRG 세포는 독시사이클린 (Dox) 및 푸로마이신 (Puro)을 갖는 D10 배지에서 배양하였다. LVsh5/C46 생산자 세포를 생성하기 위해, GPRG 세포는 콘카타머 어레이로서, 전달 플라스미드 TL20-LVsh5/C46 및 제오신-내성 플라스미드로 형질감염시켰다. 개별 클론은 LVsh5/C46 벡터를 생성하는 이들의 능력에 대해 평가하였고 Dox, Puro, 및 제오신을 갖는 D10 배지에 유지하였다. 렌티바이러스 (LV) 생성을 위한 모 GPRG 세포주의 안정성을 평가하기 위해, GPRG 세포는 3개월 기간 동안 10회 계대 마다 (총 50+ 계대) 전달 벡터로 형질감염시켰다(도 3a 및 3b 참조). 바이러스-함유 배지(VCM)는 혈질감염 후 48h에 수거하고 벡터 역가는 상보성 유전자 형질도입 검정에 의해 평가하였다. 안정한 생산자 세포 클론으로부터의 LV 생성의 안정성을 평가하기 위해, 세포는 Dox가 부재인 D10 배지에서 유도하였다. VCM은 유도 후 72h에 수거하였고 역가는 벡터 희석 범위 상에서 유사하게 평가하였다. 장기 계대 후에 유도 후 VSV-G 발현의 안정성을 분석하기 위해, GPRG 세포는 Dox 철회에 의해 유도하였고 이어서 비오틴-접합된 항-VSV-G 항체를 사용하여 염색하고 이어서 스트렙타비딘-피코에리트린으로 2차 염색하였다.
[0237] GPRG 세포는 VSV-G의 엄중 테트라사이클린-조절된 발현을 입증하였다. 상기 팩키징 세포주는 LV 전달 벡터로 형질감염 후 최대 107 LV 형질도입 유닛 (TU)/mL을 생성할 수 있고 연속 배양에서 50회 초과의 계대 동안 고수준의 LV 생성을 유지하였다(도 6a 및 6b 참조). 콘카타머 어레이 형질감염을 사용함에 의해, LVsh5C46의 생성을 위한 GPRG를 기반으로 하는 생산자 세포주의 효율적인 작제가 입증되었다. 이러한 세포주는 일관되게 106 TU/mL 초과의 역가를 생성하였다. 역가에서 추가의 증가는 2차 생산자 세포주의 재클로닝 및 선택에 의해 성취될 수 있다. 역가는 유도 후 2 내지 5일에 정점에 도달하였다. 확립된 안정한 생산자 세포주는 25회 계대를 초과하는 연속 배양 동안에 106 TU/mL을 초과하는 역가로 LVsh5/C46 생성을 유지하는 것으로 나타났다.
[0238] GPRG 세포주는 Dox의 제거 시 세포 표면 상에 VSV-G를 효율적으로 발현하였다. 또한, 이들 세포주가 전달 벡터 플라스미드의 형질감염 후 높은 LV 역가를 생성할 수 있는 것으로 사료된다. 더우기, 상기 세포주는 SIN-LV에 대한 고역가 생산자 세포주의 유도를 가능하게 하였다. 생산자 세포주는 연장된 배양 동안에 안정한 벡터 생산을 입증하였고, 벡터 생성을 무혈청 및 현탁 배양 시스템에 적응시키는 능력의 평가가 분석되었다(도 7a 및 7b 참조).
[0239] 실시예 3 - 콘카타머 어레이의 생성을 위한 프로토콜
[0240] 단계 1
[0241] 490mL의 탈이온수를 10mL 50×TAE ((Tris-아세테이트-EDTA) 완충액)와 조합함에 의해 500mL의 1 x TAE 전개 완충액을 제조한다.
[0242] 1g의 아가로스 및 100 mL의 1×TAE 완충액(98 mL의 오토클레이빙된 물과 함께 2 mL 50×TAE 를 첨가한다)을 비이커에 첨가하고 어떠한 고체 입자 또는 기포가 없을 때까지 (약 2.5분) 혼합물을 마이크로웨이브하여 1g의 아가로스 겔을 제조하였다.
[0243] 혼합물을 3분동안 냉각시킨다.
[0244] 10 μL의 GelRedTM을 아가로스 겔 혼합물에 첨가하고 교반한다(Biotium으로부터 가용함).
[0245] 겔 캐스터 및 겔 콤브를 어샘블리한다. 혼합물을 겔 몰드에 붓고 30분동안 냉각되도록 방치하였다(용량: 큰 콤브에 대해 60 μL)
[0246] 겔이 냉각되면, 박스를 겔이 완전히 잠길때까지 1×TAE 완충액으로 채운다.
[0247] DNA를 선형화시키는 실온에서 분해 반응 혼합물을 제조한다
[0248] 25 μg의 벡터 플라스미드를 제한 효소 Sfil로 분해시킨다. 별도의 반응에서, 내성 카세트 플라스미드 플라스미드 PGK-ble를 PflMI로 분해시킨다(10 μg이면 충분하다).
Figure pct00006
[0249] 약하게 혼합하고 15분 동안 열에서 37°C에서 항온처리한다.
[0250] 10 μL의 GeneRuler 1kb + DNA 래더 혼합물(2 μL DNA 래더 + 8 μL 뉴클레아제 부재 물) 및 50 μL의 샘플 혼합물을 가용한 슬롯에 첨가한다.
[0251] 전기영동 기기를 가동시키고 1시간동안 150V 전압으로 전개한다.
[0252] 겔을 "UVP PhotoDoc-It" 이미지화 시스템으로 전달하고 상기 결과의 이미지를 수득한다.
[0253] Eye-Fi 웹사이트로부터 겔 사진을 다운로드한다.
[0254] NanoDrop 2000 분광측정기를 사용하여 각각의 샘플의 DNA 농도를 결정한다.
[0255] 단계 2
[0256] DNA 밴드를 아가로스 겔로부터 절단 제거한다.
[0257] 3용적의 완충액 QG를 1용적의 겔에 첨가한다(일반적으로 500 μL QG를 첨가한다).
[0258] 겔 슬라이스를 완전히 용해시킨 후 10분동안 50°C에서 항온처리한다.
[0259] 샘플을 QIAquick 컬럼에 적용하고 17,900 rpm에서 1분동안 원심분리한다(제조사(Qiagen)로부터 가용함).
[0260] 통류물을 버리고 QIAquick 컬럼을 다시 동일한 수거 튜브에 위치시킨다.
[0261] 0.5 mL의 완충액 QG를 QIAquick 컬럼에 첨가하고 1min 동안 원심분리한다.
[0262] 0.75 mL의 완충액 PE를 QIAquick 컬럼에 첨가하고 1min동안 원심분리한다.
[0263] 통류물을 버리고 QIAquick 컬럼을 17,900 rpm에서 추가로 1분동안 원심분리한다.
[0264] QIAquick 컬럼을 투명한 1.5 mL의 마이크로원심분리 튜브에 위치시킨다.
[0265] DNA를 용출시키기 위해, 35 μL의 완충액 EB를 QIAquick 막의 중앙에 첨가하고 상기 컬럼을 17,900 rpm에서 1분동안 원심분리한다(완충액 EB는 10mM Tris-cl, pH 8.5이다).
[0266] NanoDrop 2000 분광측정기를 사용하여(블랭크 측정을 위해 EB 완충액을 사용하여) DNA 단편 농도를 측정한다.
[0267] 단계 3
[0268] 빙상에서 1.7mL 에펜도르프 마이크로원심분리기 튜브에서 연결 반응을 셋업한다.
[0269] 사전에 작성된 스프레드시트 (Concatemeric Ligations.xlsx)를 사용하여 약 25:1 몰비의 벡터 대 PGK-ble의 비율을 생성하기 위해 혼합될 필요가 있는 각각의 단편의 용적을 계산하였다.
[0270] 연결 반응에서 단편의 용적을 최대화하여 목적하는 몰비를 유지한다.
[0271] T4 DNA 리가제 완충액은 실온에서 해동시키고 재현탁시켜야 한다(T4 DNA 리가제 완충액은 하기의 성분을 포함한다: 50mM Tris-HCl, 10mM MgCl2, 1mM ATP, 10mM DTT, pH 7.5).
[0272] 연결 반응물을 피펫팅한다. 상기 실시예에서, 90 μL의 DNA 혼합물은 10 μL의 10X 연결 완충액 (NEB Quick 연결 키트) 및 0.5 μL의 리가제 효소(제조사(New England BioLabs)로부터 가용한)를 첨가함에 의해 사용하였다.
[0273] 실온에서 하기의 성분들을 함유하는 반응 혼합물을 제조한다:
Figure pct00007
[0274] 상하 피펫팅에 의해 약하게 혼합한다.
[0275] 밤새 실온에서 항온처리한다
[0276] 단계 4
[0277] 콘카타머 어레이를 수거하고 실리카계 막 (DNeasy Blood & Tissue Kit)에 의한 GPRG 세포로의 형질감염 전 정제하였다.
[0278] 콘카타머 어레이 혼합물을 2mL 수거 튜브에 위치한 Dneasy 소형 스핀 컬럼으로 피펫팅한다.
[0279] 1분동안 8000 × g에서 원심분리한다. 통류물 및 수거 튜브를 버린다.
[0280] Dneasy 소형 스핀 컬럼을 새로운 2mL의 수거 튜브(제공된)에 위치시킨다(제조사(Qiagen)로부터 가용한).
[0281] 500 μL의 완충액 Aw1을 첨가하고, 8000 x g에서 1분동안 원심분리한다.
[0282] 통류물 및 수거 튜브를 버린다.
[0283] Dneasy 소형 스핀 컬럼을 새로운 2mL의 수거 튜브(제공된)에 위치시킨다.
[0284] 500 μL의 완충액 AW2를 첨가하고, 20,000 × g에서 3분동안 원심분리하여 DNeasy 막을 건조시킨다.
[0285] 통류물 및 수거 튜브를 버린다.
[0286] Dneasy 소형 스핀 컬럼을 투명한 1.7mL의 에펜도르프 마이크로원심분리 튜브에 위치시킨다.
[0287] 200 μL의 완충액 AE를 Dneasy 막 상에 첨가한다.
[0288] 4분동안 실온에서 항온처리한다.
[0289] 8000 x g에서 1분동안 원심분리하여 DNA 혼합물을 용출시킨다.
[0290] 용출을 1회 반복한다.
[0291] NanoDrop Lite 분광측정기에 의해 콘카타머 DNA 농도를 측정한다.
[0292] 실시예 4 - 콘카타머 어레이를 사용한 생산자 세포주를 생성하기 위한 프로토콜
[0293] 세포를 바이러스 벡터 생산에 사용하기 전에 해동 후 적어도 약 4회 세포를 계대한다.
[0294] 세포는 트립판 블루 방법(Trypan Blue method)을 사용한 벡터 유도 전에 건강하고 95% 초과가 생존함을 보장한다(트립판 블루는 생존가능한 세포 계수를 위한 염료 배제 절차에 통상적으로 사용된다. 상기 방법은 생존 (생존가능한) 세포가 특정 염료를 흡수하지 않는 반면 죽은 (생존가능하지 않은) 세포는 흡수한다는 원리를 기초로 한다. 염색은 세포 형태의 가시화를 촉진시킨다).
[0295] 목적하는 양의 GPRG 세포를 배양한다.
[0296] 세포를 씨딩하기 전에 매일 적어도 2회 계대배양한다.
[0297] 첫번째 날에, GPRG 세포주 배양 디쉬의 배지를 제거하고 세포를 1×PBS로 세척한다.
[0298] T75 플라스크에 대한 3ml 또는 T25 플라스크에 대한 1mL을 사용하여 세척된 세포 단일층상으로 1×TrypLE Express를 약하게 피펫팅한다.
[0299] 상기 단일층을 TrypLE Express로 커버하기 위해 플라스크를 회전시킨다.
[0300] 플라스크를 배양기에 복귀시키고 2분 동안 방치한다.
[0301] 플라스크의 측면을 가볍게 두들겨서 임의의 잔류하는 부착된 세포를 방출시킨다.
[0302] 세포를 약 2mL의 새로운 D10 배지에 재현탁시키고 15 mL의 원뿔형 원심분리 튜브에 전달한다.
[0303] 세포를 약 1200 rpm에서 약 5분동안 원심분리한다.
[0304] 배지를 흡인 제거하고 펠렛을 독시사이클린 (1ng/mL)을 갖는, 5mL의 새로운 D10 배양 배지중에 펠렛을 현탁시킨다.
[0305] TC10™ 자동화 세포 계수기에 의해 세포 수를 결정한다.
[0306] 배양 디쉬에 80%가 컨플루언트하는 형질감염 20-24시간 전에 세포를 씨딩한다(3.2×106 생존 세포를 독시사이클린을 갖는 60-mm 배양 디쉬에 분주함에 의해).
[0307] 콘카타머 어레이 형성을 준비한다(예를 들어, 실시예 3을 참조한다).
[0308] 두번째 날에, CalPhosTM 포유동물 형질감염 키트를 형질감염시키기 전에 실온이 되게한다(제조사(ClonTech)로부터 가용함).
[0309] 콘카타머 DNA를 정제하고 농도를 측정한다(콘카타머 어레이는 본원에 기재된 방법에 따라 정제될 수 있다).
[0310] 형질감염 플라스미드 DNA (4 mL, 60 mm 배양 다쉬)를 제조한다.
[0311] 각각의 형질감염을 위해, 용액 A 및 용액 B를 별도의 15 mL 원뿔형 원심분리 튜브에 제조한다.
[0312] 피펫-도움으로 용액 B (2 × HBS)를 버블링하고 용액 A (DNA 혼합물)을 한 방울씩 적가한다.
[0313] 실온에서 15분동안 형질감염 용액을 항온처리한다.
[0314] 형질감염 용액을 배양 디쉬에 부드럽게 첨가한다.
[0315] 플레이트를 앞뒤로 부드럽게 움직여서 형질감염 용액이 고르게 분포되도록 한다.
[0316] 플레이트를 CO2 항온처리기에서 4시간동안 37°C에서 항온처리한다.
[0317] 37°C CO2 항온처리기에서 60mm 배양 디쉬 당 5mL의 새로운 D10 배지를 가온시킨다.
[0318] 4시간 후, 1 mL의 예비 가온된 D10으로 세척하고 4 mL 예비-가온된 새로운 D10 배지로 갈아준다.
[0319] 5% CO2 37°C 항온처리기에서 항온처리한다.
[0320] 콘카타머 형질감염 48시간 후, 형질감염된 GPRG 세포를 수거한다(세포의 계대 배양을 수행한다).
[0321] 세포를 제오신 (50μg/mL) 및 독시사이클린 (1ng/mL)을 함유한 새로운 D10 배지를 갖는 T150 플라스크 또는 30 mL의 150mm 배양 디쉬에 재분주한다.
[0322] 세포 병소가 동정될 때까지 (통상적으로 1 내지 2주 이내 관찰됨) 3 내지 4일 마다 독시사이클린 (1ng/mL)을 갖는 선택 배지 (제오신, 50μg/mL)를 세포에 공급한다.
[0323] 실시예 5 - GPRG 팩키징 세포주를 생성하기 위해 사용되는 세포주 및 서열의 기재
[0324] HEK-293T/17은 HEK-293T의 서브클론이다. 이들 세포는 안정적으로 SV-40 T 항원을 발현하고 특정 클론은 특이적으로 이의 높은 형질감염성에 대해 선택되었다. HEK-293T/17을 기반으로 하는 마스터 세포 뱅크를 생성하였다(HEK-293T/17 MCB).
[0325] SFG-IC-HIVgp-Ppac2는 푸로마이신 내성과 함께, CMV 프로모터의 제어 하에 코돈-최적화된 HIV gagpol을 발현하는 감마 레트로바이러스 벡터이다. 상기 벡터를 제조하기 위해 사용된 플라스미드(pSFG-IC-HIVgp-Ppac2)는 하기의 성분들을 사용하여 작제하였다:
[0326] (1) 테트라사이클린-조절된 프로모터 시스템을 사용하여 조절된 유전자 발현을 위해 조정된 레트로바이러스 벡터 골격 플라스미드 (SFG)의 유도체인, pSFG tcLuc ECT3(문헌참조: Lindemann, D., Patriquin, E., Feng, S., & Mulligan, R.C. Versatile retrovirus vector systems for regulated gene expression in vitro and in vivo. Mol. Med. 3, 466-476 (1997));
[0327] (2) CMV 인핸서/프로모터 구동되는 코돈 최적화된 HIV NL4-3 gagpol 유전자;
[0328] (3) PGK 프로모터 구동되는, pMSCVpac로부터 유래된 푸로마이신 내성 유전자 (문헌참조: Hawley, R.G., Lieu, F.H., Fong, A.Z., & Hawley, T.S. Versatile retroviral vectors for potential use in gene therapy. Gene Ther. 1, 136-138 (1994)).
[0329] HEK-293T/17 MCB의 SFG-IC-HIVgp-Ppac2 레트로바이러스 벡터로의 감염은 GP 세포주를 생성하였다.
[0330] SFG-tc-revco는 테트라사이클린 반응성 프로모터의 제어 하에 코돈-최적화된 HIV rev를 발현하는 감마 레트로바이러스 벡터이다. 이러한 벡터 (pSFG-tc-revco)를 생성하기 위해 사용되는 플라스미드는 하기의 성분을 사용하여 작제하였다:
[0331] (1) 상기된 바와 같은 NL4-3 종 서열을 기반으로 하는 HIV rev 유전자, 및
[0332] (2) pSFG tcLuc ECT3 (상기된 바와 같은)
[0333] SFG-tTA는 레트로바이러스 LTR의 제어하에 키메라 전사 트랜스활성화인자를 발현하는 감마 레트로바이러스 벡터이다(문헌참조: Lindemann, D., Patriquin, E., Feng, S., and Mulligan, R.C. Versatile retrovirus vector systems for regulated gene expression in vitro and in vivo. Mol. Med. 3, 466-476 (1997)). 이것은 플라스미드 pUHD15-1로부터의 Tet 프로모터 요소가 혼입된 SFG 레트로바이러스 벡터를 기반으로 한다(문헌참조: Gossen M, and Bujard, H. (1992) PNAS 89 12:5547-5551).
[0334] GP 세포주의 SFG-tc-revco 및 SFG-tTA로의 감염은 GPR 세포주를 생성하였다.
[0335] SFG-tc-VSVG는 테트라사이클린-조절된 프로모터의 제어하에 VSV 당단백질 G를 발현하는 감마 레트로바이러스 벡터이다. 상기 벡터 (pSFG-tc-VSVG)를 제조하기 위해 사용되는 플라스미드는 다른 벡터로와 동일한 pSFGtcLucECT3 골격 및 VSVG 외피 단백질의 공급원으로서 플라스미드 pMD.G를 사용하여 생성하였다(문헌참조: Ory, D.S., Neugeboren, B.A., and Mulligan, R.C. A stable human-derived packaging cell line for production of high titer retrovirus/vesicular stomatitis virus G pseudotypes. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 93, 11400-11406 (1996) and Rose, J. K. & Gallione, C. (1981) J. Virol. 39, 519-528).
[0336] GPR 세포주의 SFG-tc-VSVG로의 감염은 GPRG 세포주를 생성하였다.
[0337] GPRS 세포주를 생성하기 위한 GPR 세포주의 Retro-SVGmu으로의 감염은 문헌(참조: Lee, Chi-Lin et al. “Construction of Stable Producer Cells to Make High-Titer Lentiviral Vectors for Dendritic Cell-Based Vaccination.” Biotechnology and Bioengineering 109.6 (2012): 1551-1560. PMC. Web. 14 Apr. 2016)에 기재된다.
[0338] 실시예 6 - 콘카타머 어레이 정제
[0339] 콘카타머를 수거하고 실리카계 막 (DNeasy Blood & Tissue Kit)에 의한 GPRG 세포로의 형질감염 전 정제하였다.
[0340] 콘카타머 어레이 혼합물을 2mL 수거 튜브에 위치한 Dneasy 소형 스핀 컬럼으로 피펫팅한다.
[0341] 1분동안 6000 × g에서 원심분리한다. 통류물 및 수거 튜브를 버린다.
[0342] DNeasy 소형 스핀 컬럼을 새로운 2mL의 수거 튜브(제공된)에 위치시킨다.
[0343] 500 μL의 완충액 Aw1을 첨가하고, 6000 x g에서 1분동안 원심분리한다.
[0344] 통류물 및 수거 튜브를 버린다.
[0345] DNeasy 소형 스핀 컬럼을 새로운 2mL의 수거 튜브(제공된)에 위치시킨다.
[0346] 500 μL의 완충액 AW2를 첨가하고, 20,000 × g에서 3분동안 원심분리하여 DNeasy 막을 건조시킨다.
[0347] 통류물 및 수거 튜브를 버린다.
[0348] DNeasy 소형 스핀 컬럼을 투명한 1.7mL의 에펜도르프 마이크로원심분리 튜브에 위치시킨다.
[0349] 200 μL의 완충액 AE를 DNeasy 막 상에 첨가한다.
[0350] 4분동안 실온에서 항온처리한다.
[0351] 6000 x g에서 1분동안 원심분리하여 DNA 혼합물을 용출시킨다.
[0352] 1회 용출을 반복한다(새로운 용출 완충액을 첨가한다).
[0353] NanoDrop Lite 분광측정기에 의해 콘카타머 DNA 농도를 측정한다
[0354] 실시예 7 - TL20-UbcGFP & Cal1-WPRE 생산자 세포주
[0355] 하기의 표 4는 본원에 기재된 방법에 따라 합성된 2개의 안정한 생산자 세포주 세포를 요약한다. TL20-Cal1-wpre 및 TL20-Unc-GFP 벡터와 관한 데이터는 도 20a, 20b, 및 20c에서 설명한다.
[표 4]
Figure pct00008
[0356] 다른 치료학적 유전자
[0357] 일부 구현예에서, 합성된 벡터는 하기 열거된 임의의 치료학적 유전자를 포함할 수 있다. 예를 들어, 하기의 열거된 임의의 유전자를 암호화하는 핵산은 본원에 기재된 바와 같이 재조합 플라스미드에 삽입될 수 있다. 일부 구현예에서, 치료학적 유전자는 단일 유전자 장애를 보정한다. 일부 구현예에서, 치료학적 유전자는 면역 결핍, 유전성 질환, 혈액 질환(예를 들어, 혈우병, 헤모글로빈 장애), 리소좀 저장 질환, 신경학적 질환, 혈관형성 장애 또는 암을 치료하기 위해 사용된다.
[0358] 일부 구현예에서, 치료학적 유전자는 효소 아데노신 데아미나제를 암호화하는 유전자, 알파-1-안티트립신을 암호화하는 유전자, 낭성 섬유증 막관통 전도도 조절인자를 암호화하는 유전자, 효소 갈락토스-1-포스페이트 우리딜릴트랜스퍼라제를 암호화하는 유전자, 응고 인자 (예를 들어, 사람 인자 IX)를 암호화하는 유전자, 지질단백질 리파제 유전자를 암호화하는 유전자, 도파민 합성을 위해 요구되는 효소를 암호화하는 하나 이상의 유전자, 교질 세포주 유래된 신경영양 인자 (GDNF)를 암호화하는 유전자, 인터류킨-2 수용체 서브유닛 감마(IL-2RG)를 암호화하는 유전자, Gp91phox를 암호화하는 유전자, 위스콧-알드리치 증후군 단백질을 암호화하는 유전자, 글로빈 단백질을 암호화하는 유전자, 돌연변이된 글로빈 단백질 (예를 들어, 항겸상 성질을 갖는 것)을 암호화하는 유전자, 돌변변이된 베타-글로빈를 암호화하는 유전자, 감마-글로빈을 암호화하는 유전자, 항-CD19 항체를 암호화하는 유전자 등이다. 다른 구현예에서, 치료학적 유전자는 글로빈 유전자, 스핑고마이엘리나제 유전자, 알파-L-이두로누다제 유전자, 헌팅틴 유전자, 뉴로피브로민 1 유전자, MLH1 유전자, MSH2 유전자, MSH6 유전자, PMS2 유전자, 낭성 섬유증 막관통 전도도 조절인자 유전자, 헥소사미니다제 A 유전자, 디스트로핀 유전자, FMRl 유전자, 페닐알라닌 하이드록실라제 유전자 및 저밀도 지질단백질 유전자로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
[0359] 치료학적 유전자 부류의 예는 종양 서프레서 유전자, 아폽토시스를 유도하거나 예방하는 유전자, 효소를 암호화하는 유전자, 항체를 암호화하는 유전자, 호르몬을 암호화하는 유전자, 수용체를 암호화하는 유전자, 및 사이토킨, 케모킨 또는 혈관형성 인자를 암호화하는 유전자를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 치료학적 유전자의 특정 예는 Rb, CFTR, pl6, p21, p27, p57, p73, C-CAM, APC, CTS-I, zacl, scFV, ras, DCC, NF-I, NF-2, WT-I, MEN-I, MEN-II, BRCAl, VHL, MMACl, FCC, MCC, BRCA2, IL-I, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-IO, IL-11 IL-12, IL-15Rα, IL-15, IL-21, GM- CSF, G-CSF, 티미딘 키나제, mda7, FUSl, 인터페론 알파, 인터페론 베타, 인터페론 감마, ADP, p53, ABLI, BLCl, BLC6, CBFAl, CBL, CSFIR, ERBA, ERBB, EBRB2, ETSl, ETS2, ETV6, FGR, FOX, FYN, HCR, HRAS, JUN, KRAS, LCK, LYN, MDM2, MLL, MYB, MYC, MYCLl, MYCN, NRAS, PIMl, PML, RET, SRC, TALI, TCL3, YES, MADH4, RBl, TP53, WTl, TNF, BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF, aFGF, bFGF, NT3, NT5, ApoAI, ApoATV, ApoE, RaplA, 시토신 데아미나제, Fab, ScFv, BRCA2, zacl, ATM, HIC-I, DPC-4, FHIT, PTEN, INGl, NOEYl, NOEY2, OVCAl, MADR2, 53BP2, IRF-I, zacl, DBCCR-I, rks-3, COX-I, TFPI, PGS, Dp, E2F, ras, myc, neu, raf, erb, fins, trk, ret, gsp, hst, abl, ElA, p300, VEGF, FGF, 트롬보스폰딘, BAI-I, GDAIF, MCC, 41BBL, CD80, CD86, 또는 Ox40을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
[0360] 치료학적 유전자의 다른 예는 FUSl, 유전자 26 (CACNA2D2), PL6, LUCA-I (HYALl), LUCA-2 (HYAL2), 123F2 (RASSFl), 101F6, 유전자 21 (NPRL2), SEM A3, NFl, NF2, 및 p53을 포함하지만 이에 제한되지 않는 종양 서프레서 유전자이다.
[0361] 치료학적 유전자의 또 다른 예는 ACP 데사투라제, ACP 하이드록실라제, ADP-글루코스 피로포릴라제, PDE8A (캠프 포스포디에스테라제(camp Phosphodiesterase)), ATPase, 알콜 데하이드로게나제, 아밀라제, 아밀로글루코시다제, 카탈라제, 셀룰라제, 사이클로옥시게나제, 데카복실라제, 덱스트리나제, 에스테라제, DNA 폴리머라제, RNA 폴리머라제, 하이알루론 신타제, 갈락토시다제, 글루카나제, 글루코스 옥시다제, GTPase, 헬리카제, 헤미셀룰라제, 하이알루로니다제, 인테그라제, 인버타제, 이소머라제, 키나제, 락타제, 리파제, 리폭시게나제, 리아제, 리소자임, 펙틴에스테라제, 퍼옥시다제, 포스파타제, 포스포리파제, 포스포릴라제, 폴리갈락투로나제, 프로테이나제, 펩티다제, 풀라나제, 리컴비나제, 역전사효소, 토포이소머라제 또는 크실라나제를 포함하지만 이에 제한되지 않는 효소를 암호화하는 유전자이다. 치료학적 유전자의 추가의 예는 카바모일 신테타제 I, 오르니틴 트랜스카바밀라제, 아르기노숙시네이트 신테타제, 아르기노숙시네이트 리아제, 아르기나제, 푸마릴아세토아세테이트 하이드롤라제, 페닐알라닌 하이드록실라제, 알파-1 안티트립신, 글루코스-6-포스파타제, 저밀도-지질단백질 수용체, 포르포빌리노겐 데아미나제, 인자 VIII, 인자 IX, 시스타티온 베타-신타제, 분기쇄 케토산 데카복실라제, 알부민, 이소발레릴-CoA 데하이드로게나제, 프로피오닐 CoA 카복실라제, 메틸 말로닐 CoA 뮤타제, 글루타릴 CoA 데하이드로게나제, 인슐린, 베타.-글루코시다제, 피루베이트 카복실라제, 간 포스포릴라제, 포스포릴라제 키나제, 글라이신 데카복실라제, H-단백질, T-단백질, 멘케스 질환 구리-수송 ATPase, 윌슨 질환 구리-수송 ATPase, 시토신 데아미나제, 하이포크산틴-구아닌 포스포리보실트랜스퍼라제, 갈락토스-1-포스페이트 우리딜트랜스퍼라제, 페닐알라닌 하이드록실라제, 글루코세르브로시다제, 스핑고미엘리나제, 알파- L-이두롬’ 다제, 글루코스-6-포스페이트 데하이드로게나제, HSV 티미딘 키나제 또는 사람 티미딘 키나제를 암호화하는 유전자를 포함한다.
[0362] 치료학적 유전자의 추가의 예는 성장 호르몬, 프롤락틴, 태반 락토겐, 황체형성 호르몬, 여포-자극 호르몬, 융모막 고나도트로핀, 우이로이드-자극 호흐몬, 렙틴, 아드레노코르티코트로핀, 안지오텐신 I, 안지오텐신 II, 알파-엔도르핀, 베타-멜라노사이트 자극 호르몬, 콜레시스토키닌, 엔도텔린 I, 갈라닌, 위 억제 펩타이드, 글루카곤, 인슐린, 리포트로핀, 뉴로피신, 소마토스타틴, 칼시토닌, 칼시토닌 유전자 관련 펩타이드, 베타-칼시토닌 유전자 관련 펩타이드, 악성 인자의 고칼슘혈증, 부갑상선 호르몬-관련 단백질, 부갑상선 호르몬-관련 단백질, 글루카곤-유사 펩타이드, 판크레아스타틴, 췌장 펩타이드, 펩타이드 YY, PHM, 세크레틴, 혈관 활성 장 펩타이드, 옥시토신, 바소프레신, 바소토신, 엔케팔린아미드, 메토르핀아미드, 알파 멜라노사이트 자극 호르몬, 심방 나트륨이뇨 인자, 아밀린, 아밀로이드 P 성분, 코르티코트로핀 방출 호르몬, 성장 호르몬 방출 인자, 황체형성 호르몬-방출 호르몬, 신경펩타이드 Y, 물질 K, 물질 P, 또는 티로트로핀 방출 호르몬을 포함하지만 이에 제한되지 않는 호르몬을 암호화하는 유전자를 포함한다.
[0363] 하기된 상기 유전자를 포함하는 또 다른 치료학적 유전자는 발현에 혼입될 수 있다.
[0364] 아데노신 데아미나제-중증 조합 면역결핍(ADA-SCID)은 면역계를 파괴하여 흔히 “버블 보이” 질환으로서 언급되는 중증 조합 면역결핍을 유발하는 독성 대사물의 축적을 유도한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 발현 벡터의 제2 핵산은 사람 ADA cDNA 서열을 암호화한다.
[0365] 중증의 조합 면역결핍(SCID-X1) 질환은 가장 통상적인 형태의 SCID이고, 이는 전세계적으로 보고된 SCID사례의 40 내지 50%를 차지한다. IL2RG 유전자 내 돌연변이는 림프구 발달 및 기능에 주요 역할을 수행하는 인터류킨 (IL)-2, 4, 7, 9, 15, 및 21 수용체 복합체를 포함하는 다수의 사이토킨 수용체에 의해 공유되는 서브유닛인 통상의 감마 쇄(γc)의 발현에 결함을 유도한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 발현 벡터의 제2 핵산은 사람 γc cDNA 서열을 암호화한다.
[0366] 만성 육아종증 질환(CGD)은 식세포-유래된 NADPH 옥시다제의 서브유닛(gp91phox, p22phox, p47phox, p40phox 또는 p67phox)에 결함에 의해 유발된다. Gp91phox 서브유닛을 암호화하는 CYBB 유전자 내 돌연변이는 환자의 대략 70%를 차지하는 X-연관 형태의 CGD에 관여한다. X-연관 CGD는 호중구, 호산구, 단핵구 및 대식세포에 의한 슈퍼옥사이드 음이온 및 다른 반응성 산소 중간체의 손상된 생성으로 인해 중증의 생명을 위협하는 세균 및 진균류 감염을 특징으로 한다. 질환의 또 다른 양상은 기관, 예를 들어, 주로 염증 촉진 사이토킨의 증가된 생성, 염증 세포의 지연 아폽토시스 및 활성화된 호중구에 의해 항-염증 매개인자의 분비 결핍에 의해 유발되는, 소화관 또는 폐에 영향을 미치는 멸균성 만성 육아종성 염증이다. 불량한 결과는 침입성 진균류 감염, 간 농양 및 만성 육아종성 염증의 병력과 연관된다. 가용한 치료학적 전략은 항생제 장수 예방, IFN-γ 투여, 및 HCT를 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 발현 벡터의 제2 핵산은 사람 서브유닛 cDNA 서열을 암호화한다.
[0367] 변색성 백혈구 이영양증(MLD)은 중추신경계 및 말초 신경계에서 신경 및 신경교 세포에서 효소 결핍 및 분해되지 않는 기질 세레브로사이드 3-설페이트 (설파티드)의 축적를 유도하는 아릴설파타제 A (ARSA) 유전자 내 돌연변이에 의해 유발된 희귀 상염색체 열성 리소좀 저장 질환이다. 상기 설파티드의 축적은 진행성 탈수초 및 신경변성을 유도한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 발현 벡터의 제2 핵산은 사람 ARSA cDNA 서열을 암호화한다.
[0368] 점액다당류증 I (MPS-I) 또는 헐러 증후군은 알파-L-이두로니다제 효소 (IDUA)의 결핍에 의해 유발되는 리소좀 저장 장애이다. 질환은 글리코사미노글리칸 (GAG)의 부적절한 저장을 특징으로 하고 기관 비대 및 손상, 뇨에서 비정상적 양의 GAG의 분비 및 특히 연결 조직에 영향을 미치는 붕괴된 GAG 턴오버를 수반한다. 임상적 증상은 골격 이상, 간 비장 비대, 정신 지체, 심혈관 및 호흡 기능부전을 포함한다. IDUA 결핍은 광범위한 표현형의 제공을 초래할 수 있고, MPS I 헐러 (MPS IH)는 다중 기관 및 중추 신경계를 포함하는 만성, 진행성 및 장애 질환 과정을 특징으로하는 상기 스펙트럼 내에서 가장 중증의 질환 변종을 나타낸다. 상기 질환은 치료되지 않는 경우 어린시절에 치명적이고, 통상적으로 심장호흡 부전증 때문에 처음 생후 10년 이내 사망한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 발현 벡터의 제2 핵산은 알파-이두로니다제 (IDUA)의 사람 cDNA를 암호화한다.
[0369] 고처(Gaucher)의 질환은 가장 통상적인 리소좀 저장 질환이다. 이것은 글리코스핑고지질의 분해를 위해 요구되는 효소 글루코세레브로시다제 (GBA)의 결핍에 의해 유발되는 상염색체 열성 리소좀 저장 질환이다. 임상 증상에는 간 비장 비대, 혈소판 감소증, 골 질환 및 출혈 체질이 포함되고, 이는 종종 혈액 전문의에게 제시된다. 유전자 치료요법은 효소 대체 치료요법에 환자와 적합한 골수 공여자가 없는 자들에 대한 치료학적 대안이다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 발현 벡터의 제2 핵산은 GBA 유전자의 사람 cDNA를 암호화한다.
[0370] 리소좀 저장 질환(LSD)은 리소좀 내 기능부전을 특징으로 하는 희귀 유전 대사 장애이다. LSD는 대략적으로 70개의 유전적으로 구별되는 질환이고 총체적 발생률은 1:5000의 출생이다. 이의 예는 파브리 질환 (알파-갈락토시다제 A 결핍), 폼페 질환(Pompe disease) (α-글루코시다제 [GAA] 결핍), 헌터 증후군(Hunter syndrome) (이두로네이트-2-설파타제 [I2S] 결핍), 산필리포 증후군(Sanfilippo syndrome) (글리코사미노글리칸 헤파란 설페이트를 분해시키기 위해 요구되는 효소 중 하나에서의 결핍) 및 크라베 질환(Krabbe disease) (gal-악토세레브로시다제 결핍)을 포함한다. 또한, 유전 대사 장애는 대사 장애의 하나의 원인이고, 결함 유전자가 효소 결핍을 유발하는 경우 발생한다. 본원 개시내용의 발현 벡터는 상기된 병태 중 어느 하나를 치료하는데 사용하기 위해 적합한 유전자를 암호화하는 제2 핵산 서열을 혼입하기 위해 조정될 수 있는 것으로 사료된다.
[0371] 피루베이트 키나제 결핍(PKD)은 다양한 증상의 용혈 빈혈을 유도하고 신생아 시기 동안에 치명적일 수 있는 PKLR 유전자 내 돌연변이에 의해 유발되는 단일유전자성 대사 질환이다. PKD 열성 유전 성질, 및 동종이계 골수 이식에 의한 이의 치유적 치료는 유전자 치료요법 접근법을 개발하기 위해 이상적인 시나리오를 제공한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 발현 벡터의 제2 핵산은 사람 PKLR cDNA를 암호화한다.
[0372] 부신백질이영양증 (ALD)은 부신백질이영양증 단백질 (ALDP)에서의 결핍 및 후속적 매우 긴 쇄의 지방산(VLCFA)의 축적을 유도하는 ABCD1 유전자내 돌연변이에 의해 유발되는 희귀 X-연관 대사 장애이다. VLCFA 축적은 혈장 및 모든 조직 유형에서 일어나지만 주로 부신 피질 및 뇌 및 척수의 백질에 영향을 주어 특정 범위의 임상적 결과를 유도한다. 대뇌 ALD (CALD)로서 공지된 염증성 대뇌 표현형인 가장 중증 형태의 ALD는 사고 및 근육 조절에 관여하는 뇌에서의 신경 세포의 보호 시스(sheath)인 미엘린의 진행성 파괴를 포함한다. CALD의 증상은 통상적으로 조기 어린시절에서 일어나고 치료받지 않는 경우 신속하게 진행하여 신경학적 기능의 중증 상실 및 대부분의 환자에서 궁극적인 사망을 유도한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 발현 벡터의 제2 핵산은 부신백질이영양증 단백질(ALDP)을 암호화한다.
[0373] 판코니 빈혈(Fanconi anemia) (FA)은 유전성 골수 부전증 증후군이다. 적어도 16개 DNA 복구 유전자들에서의 결함은 무형성증 및 악성 종양, 특히 AML 및 MDS에 대한 증진된 위험을 유도한다. 추가로, 선종, 선암종 및 편평 세포 암종에 대한 위험은 증가된다. 대부분의 환자들은 또한 키가 작고, 다양한 형태학적 비정상 및 발달 장애를 갖는다. 지원 치료는 FA 환자에서 수반되는 내분비병으로 인한 혈액 제품의 정기적 수혈 및 성장 호르몬 대체를 포함한다. 공여자-매칭된 세팅에서 HSCT는 단지 치유적 옵션이었고 따라서 유전자 치료요법을 위해 매력적인 옵션이다. 영향을 받은 유전자의 이질성에도 불구하고 60% 초과의 환자들은 FANCA 유전자에 돌연변이를 갖는다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 발현 벡터의 제2 핵산은 사람 FANCA cDNA를 암호화한다.
[0374] 일부 구현예에서, 합성된 벡터는 C1 에스테라제 억제제 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. C1 에스테라제 억제제 단백질은 미국 특허 제10,214,731호 및 미국 특허 제2018/0334493호에 기재되어 있고, 이의 개시내용은 이들의 전문이 본원에 참조로 인용된다.
[0375] 일부 구현예에서, 합성된 벡터는 X-연계된 무감마글로불린혈증 (XLA)을 치료하기 위한 브루톤의 티로신 키나제 (BTK)를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. BTK는 사람에서 BTK 유전자에 의해 암호화된 효소이다. BTK는 B-세포 발달에서 주요 역할을 수행하는 키나제이다. 예를 들어, BTK는 고친화성 IgE 수용체를 통한 비만 세포 활성화 뿐만 아니라 B 세포 성숙화에서 주요 역할을 수행한다. BTK 유전자 내 돌연변이는 원발성 면역결핍 질환 X-연계 무감마 글로불린혈증 (브루톤의 무감마글로불린혈증)과 관련이 있다. XLA를 갖는 환자는 골수에 정상적인 전구-B 세포 집단을 갖지만 이러한 세포는 성숙화하여 순환계로 진입하는데 실패한다. 일부 구현예에서, 합성된 벡터는 BTK 발현을 복구시키는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 적합한 벡터는 PCT 공개 공보 WO/2018/195297에 기재되어 있고, 이의 개시내용은 이의 전문이 본원에 참조로 인용된다.
[0376] 일부 구현예에서, 합성된 벡터는 1차 면역결핍을 보정하기 위한 유전자 또는 성분들을 암호화하는 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다(문헌참조: Farinelli G., et al. (2014) Lentiviral vectors for the treatment of primary immunodeficiencies. J Inherit Metab Dis. 37:525-33, 이의 개시내용은 이의 전문이 본원에 참조로 인용된다).
[0377] 일부 구현예에서, 합성된 벡터는 뉴클레아제를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 합성된 벡터는 이의 개시내용이 이들의 전문으로 참조로 인용되는 PCT 공개 공보 WO/2018/034523, WO/2017/156484, WO/2017/106528, 및 WO/2015/089046 또는 미국 특허 공개 공보 US/2019/0169597에 기재된 임의의 것들을 포함하는, 호밍 엔도뉴클레아제 (예를 들어, l-Scel, l-Ceul, Fl-Pspl, Fl-Sce, l-SceTV, I- Csml, l-Panl, l-Scell, l-Ppol, l-Scelll, l-Crel, l-Tevl, 및 l-Tevll), 전사 활성화인자-유사 이펙터 뉴클레아제(TALEN), 아연 핑거 뉴클레아제(ZFN), II형 클러스터링된 규칙적으로 분산되어 있는 짧은 팔린드롬 반복체 (CRISPR) 연관된 (Cas) 뉴클레아제, 또는 메가 TAL 뉴클레아제를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다.
[0378] 일부 구현예에서, 합성된 벡터는 적어도 엔도뉴클레아제 활성을 나타낼 수 있는 효소를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 합성된 벡터는 CRISPR/Cas 성분, 예를 들어, Cas 단백질 또는 CRISPR-연관된 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, Cas 단백질은 Cas9 단백질, Cas9 동원체에 의해 암호화된 Cas9-유사 단백질, Cas9-유사 합성 단백질, Cpf1 단백질, Cpf1 동원체에 의해 암호화된 단백질, Cpf1-유사 합성 단백질, C2c1 단백질, C2c2 단백질, C2c3 단백질, Cas12 단백질 (예를 들어, Cas12a, Cas12b, Cas12c, Cas12d, Cas12e와 같은), 및 이의 변이체 및 변형체를 포함한다. 일부 구현예에서, Cas 9 단백질은 예를 들어, 원색 생물 공급원, 예를 들어, 세균 및 고세균을 포함하는, 임의의 다양한 생물학적 공급원으로부터의 Cas9 폴리펩타이드를 포함한다. 세균 Cas9는 악티노박테리아 (예를 들어, 악티노마이세스 나에슬런디(Actinomyces naeslundii)) Cas9, 아쿠이피카에(Aquificae) Cas9, 박테로이데테스(Bacteroidetes) Cas 9, 클라미디아(Chlamydiae) Cas9, 클로로플렉시(Chloroflexi) Cas9, 시아노박테리아(Cyanobacteria) Cas9, 엘루시마이크로비아(Elusimicrobia) Cas9, 피브로박테레스(Fibrobacteres) Cas9, 피르쿠테스(Firmicutes) Cas9 (예를 들어, 스트렙토코커스 피오게네스(Streptococcus pyogenes) Cas9, 스트렙토코커스 써모필러스(Streptococcus thermophilus) Cas9, 리스테리아 이노쿠아(Listeria innocua) Cas9, 스트렙토코커스 아갈락티아(Streptococcus agalactiae) Cas9, 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans) Cas9, 및 엔테로코커스 파에시움(Enterococcus faecium) Cas9), 푸소박테리아(Fusobacteria) Cas9, 프로테오박테리아(Proteobacteria) (예를 들어, 나이세리아 메닝기티데스(Neisseria meningitides), 캄필로박터 이에우니 및 라리(Campylobacter jejuni and lari)) Cas9, 스피로카에테스(Spirochaetes) (예를 들어, 트레포네마 덴티콜라(Treponema denticola)) Cas9 등을 포함한다. 아케아 (Archaea) Cas 9는 유리아케오타(Euryarchaeota) Cas9 (예를 들어, 메타노코커스 마리팔루디스(Methanococcus maripaludis) Cas9) 등을 포함한다.
[0379] 일부 구현예에서, 합성된 벡터는 포유동물 β 글로빈 유전자 (HBB), 감마 글로빈 유전자 (HBG1), B-세포 림프종/백혈병 11A (BCL1 1A) 유전자, 크루펠-유사 인자 1 (KLF1) 유전자, CXCR4 유전자, PPP1R12C (AAVS 1) 유전자, 알부민 유전자 및 류신-풍부 반복체 키나제 2 (LRRK2) 유전자를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
[0380] 본 명세서에서 언급된 모든 간행물들은 그 내용 전체가 본원에 참고로 포함된다. 당업자는 광범위하게 설명된 바와 같은 본원 개시 내용의 사상 또는 범위를 벗어나지 않고 특정 실시예에 도시된 바와 같이 본 개시 내용에 대해 다수의 변화 및/또는 변형이 이루어질 수 있다는 것을 이해할 것이다. 본 발명의 구현예는 따라서 모든 측면에서 설명을 위한 것이고 제한적이지 않은 것으로 고려되어야 한다.
[0381] 본원의 개시내용은 특정 구현예를 참조로 기재되었지만, 이들 구현예는 단지 원리 및 응용을 설명하기 위한 것으로 이해되어야 한다. 따라서 수많은 변형이 설명적인 구현예에 가해질 수 있고 다른 정렬은 첨부된 청구항에 의해 한정된 바와 같이 본원 개시내용의 취지 및 범위로부터 벗어나는 것 없이 고안될 수 있는 것으로 이해되어야 한다.
<110> LEE, Chi-Lin BARTLETT, Jeffrey <120> BIO-PRODUCTION OF LENTIVIRAL VECTORS <130> Cal-0013WO <150> US 62/161,133 <151> 2015-05-13 <150> US 62/161,152 <151> 2015-05-13 <160> 15 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 6565 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: PUC57-TL20C <400> 1 ggccgcctcg gccaaacagc ccttgagttt accactccct atcagtgata gagaaaagtg 60 aaagtcgagt ttaccactcc ctatcagtga tagagaaaag tgaaagtcga gtttaccact 120 ccctatcagt gatagagaaa agtgaaagtc gagtttacca ctccctatca gtgatagaga 180 aaagtgaaag tcgagtttac cagtccctat cagtgataga gaaaagtgaa agtcgagttt 240 accactccct atcagtgata gagaaaagtg aaagtcgagt ttaccactcc ctatcagtga 300 tagagaaaag tgaaagtcga gctcgccatg ggaggcgtgg cctgggcggg actggggagt 360 ggcgagccct cagatcctgc atataagcag ctgctttttg cctgtactgg gtctctctgg 420 ttagaccaga tctgagcctg ggagctctct ggctaactag ggaacccact gcttaagcct 480 caataaagct tgccttgagt gcttcaagta gtgtgtgccc gtctgttgtg tgactctggt 540 aactagagat ccctcagacc cttttagtca gtgtggaaaa tctctagcag tggcgcccga 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gctgttgaga 1920 tccagttcga tgtaacccac tcgtgcaccc aactgatctt cagcatcttt tactttcacc 1980 agcgtttctg ggtgagcaaa aacaggaagg caaaatgccg caaaaaaggg aataagggcg 2040 acacggaaat gttgaatact catactcttc ctttttcaat attattgaag catttatcag 2100 ggttattgtc tcatgagcgg atacatattt gaatgtattt agaaaaataa acaaataggg 2160 gttccgcgca catttccccg aaaagtgcca cctgacgtct aagaaaccat tattatcatg 2220 acattaacct ataaaaatag gcgtatcacg aggccctttc gtctcgcgcg tttcggtgat 2280 gacggtgaaa acctctgaca catgcagctc ccggagacgg tcacagcttg tctgtaagcg 2340 gatgccggga gcagacaagc ccgtcagggc gcgtcagcgg gtgttggcgg gtgtcggggc 2400 tggcttaact atgcggcatc agagcagatt gtactgagag tgcaccatat gcggtgtgaa 2460 ataccgcaca gatgcgtaag gagaaaatac cgcatcaggc gccattcgcc attcaggctg 2520 cgcaactgtt gggaagggcg atcggtgcgg gcctcttcgc tattacgcca gctggcgaaa 2580 gggggatgtg ctgcaaggcg attaagttgg gtaacgccag ggttttccca gtcacgacgt 2640 tgtaaaacga cggccagtga attc 2664

Claims (112)

  1. 벡터 상등액을 수거하는 방법으로서, 상기 방법이 안정한 생산자 세포주 세포를 생성하는 단계; 상기 생성된 안정한 생산자 세포주 세포로부터 바이러스 벡터 생성을 유도하는 단계; 및 상기 바이러스 벡터의 초기 수거 후 약 40 내지 약 56시간 마다 무혈청 배지에서 상기 유도된 생성된 안정한 생산자 세포주 세포로부터 상기 바이러스 벡터를 반복적으로 수거하는 단계를 포함하는, 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 무혈청 배지가 하나 이상의 성장 인자를 포함하는, 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 무혈청 배지가 하나 이상의 지질을 포함하는, 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 바이러스 벡터의 초기 수거가 바이러스 벡터 생성을 유도한 후 약 40시간 내지 약 56시간에 수행되는, 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 바이러스 벡터의 초기 수거가 바이러스 벡터 생성을 유도한 후 약 48시간 미만에 수행되는, 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 바이러스 벡터의 반복적인 수거가 약 44 내지 약 52시간 마다 수행되는, 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 바이러스 벡터의 반복적인 수거가 약 48시간 마다 수행되는, 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 무혈청 배지가 각각의 반복적인 수거 후 대체되는, 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이 상기 반복적인 수거의 각각의 개별 수거 동안에 약 0.5 x 106 TU/mL 내지 약 4 x 106 TU/mL 범위의 바이러스 역가 생성을 제공하는, 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이 상기 반복적인 수거의 각각의 개별 수거 동안에 약 0.5 x 106 TU/mL 내지 약 2 x 106 TU/mL 범위의 바이러스 역가 생성을 제공하는, 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이 상기 반복적인 수거의 각각의 개별 수거 동안에 약 0.5 x 106 TU/mL 내지 약 1.5 x 106 TU/mL 범위의 바이러스 역가 생성을 제공하는, 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 바이러스 벡터가 적어도 5회 수거되는, 방법.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 바이러스 벡터가 적어도 10회 수거되는, 방법.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 바이러스 벡터가 적어도 20회 수거되는, 방법.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 반복적인 수거가 약 10일 내지 약 90일 범위의 기간 동안 수행되는, 방법.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 반복적인 수거가 약 20일 내지 약 70일 범위의 기간 동안 수행되는, 방법.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 안정한 생산자 세포주 세포가 팩키징 세포주 세포로부터 유래되는, 방법.
  18. 제17항에 있어서, 상기 팩키징 세포주 세포가 CHO 세포, BHK 세포, MDCK 세포, C3H 10T1/2 세포, FLY 세포, Psi-2 세포, BOSC 23 세포, PA317 세포, WEHI 세포, COS 세포, BSC 1 세포, BSC 40 세포, BMT 10 세포, VERO 세포, W138 세포, MRC5 세포, A549 세포, HT1080 세포, 293 세포, 293T 세포, B-50 세포, 3T3 세포, NIH3T3 세포, HepG2 세포, Saos-2 세포, Huh7 세포, HeLa 세포, W163 세포, 211 세포, 및 211 A 세포로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 세포로부터 유래하는, 방법.
  19. 제17항에 있어서, 상기 팩키징 세포주 세포가 GPR, GPRG, GPRT, GPRGT, 및 GPRT-G 세포주 세포로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 반복적인 수거가 새로운 무혈청 배지를 추가로 생성된 안정한 생산자 세포주 세포를 도입하는 것 없이 유도된 생성된 안정한 생산자 세포주 세포에 첨가함을 포함하는, 방법.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 안정한 생산자 세포주 세포가 (a) 하나 이상의 유전자를 재조합 플라스미드로 클로닝함에 의해 벡터를 합성하는 단계; (b) (i) 상기 합성된 벡터로부터 절단된 발현 카세트 및 (ii) 항생제 내성 카세트 플라스미드로부터 수득된 발현 카세트로부터 콘카타머(concatemeric) 어레이를 형성하는 단계; (c) GPR, GPRG, GPRT, GPRGT, 및 GPRT-G로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 팩킹 세포주 세포를 형성된 콘카타머 어레이로 형질감염시키는 단계; 및 (d) 상기 안정한 생산자 세포주 세포를 단리하는 단계에 의해 생성되는, 방법.
  22. 제21항에 있어서, 상기 항생제 내성 카세트 플라스미드가 블레오마이신 항생제 내성 카세트인, 방법.
  23. 제21항에 있어서, 상기 합성된 벡터로부터 절단된 발현 카세트와, 상기 항생제 내성 카세트 플라스미드로부터 수득된 발현 카세트의 몰비가 약 50:1 내지 약 1:50의 범위인, 방법.
  24. 제23항에 있어서, 상기 몰비가 약 25:1 내지 약 1:25 범위인, 방법.
  25. 제23항에 있어서, 상기 몰비가 약 15:1 내지 약 1:15 범위인, 방법.
  26. 제21항에 있어서, 상기 재조합 플라스미드가 서열번호 1의 것과 적어도 약 90% 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 방법.
  27. 제21항에 있어서, 상기 재조합 플라스미드가 서열번호 2의 것과 적어도 약 90% 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 방법.
  28. 제21항에 있어서, 상기 재조합 플라스미드가 BstBI, MluI, NotI, 및 ClaI로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 제한 엔도뉴클레아제 부위를 갖는 다중 클로닝 부위를 포함하는, 방법.
  29. 제28항에 있어서, 상기 다중 클로닝 부위를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열이 서열번호 7의 것과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는, 방법.
  30. 제21항에 있어서, 상기 재조합 플라스미드가 팩키징 신호를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열; 중심 폴리퓨린 트랙을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열; Rev 반응 요소를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열; 및 자가-불활성화 긴 말단 반복체를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 방법.
  31. 제30항에 있어서, 상기 재조합 플라스미드가 서열번호 2의 것과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 벡터 카세트를 포함하는, 방법.
  32. 제31항에 있어서, 상기 벡터 카세트가 적어도 2개의 제한 엔도뉴클레아제 부위에 의해 플랭킹되고, 상기 적어도 2개의 제한 엔도뉴클레아제 부위가 sfiI 및 Bsu36I로 이루어진 그룹으로부터 독립적으로 선택되는, 방법.
  33. 제21항에 있어서, 상기 합성된 벡터가 하이포크산틴 포스포리보실트랜스퍼라제 ("HPRT")를 녹다운시키기 위해 shRNA를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는, 방법.
  34. 제21항에 있어서, 상기 합성된 벡터가 치료학적 유전자를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는, 방법.
  35. 제34항에 있어서, 상기 치료학적 유전자가 감마-글로빈 유전자, C1 에스테라제 억제제 단백질, 브루톤 티로신 키나제(Bruton's tyrosine kinase), 및 위스콧-알드리치 증후군 단백질(Wiskott-Aldrich Syndrome protein)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
  36. 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 바이러스 벡터 생산 유도가 혈청-함유 배지에서 수행되는, 방법.
  37. 제36항에 있어서, 유도 후 약 24시간에 상기 혈청-함유 배지를 추가의 혈청-함유 배지로 대체함을 추가로 포함하는, 방법.
  38. 제36항에 있어서, 유도 후 약 24시간에 상기 혈청-함유 배지를 무혈청 배지로 대체함을 추가로 포함하는, 방법.
  39. 안정한 생산자 세포주 세포로부터 바이러스 벡터를 생산하는 방법으로서, 상기 방법이 (a) 하나 이상의 핵산 서열을 재조합 플라스미드에 삽입함에 의해 상기 벡터를 합성하는 단계; (b) 상기 합성된 바이러스 벡터로부터 절단된 발현 카세트 및 항생제 내성 카세트 플라스미드로부터 수득된 DNA 단편으로부터 콘카타머 어레이를 형성하는 단계; (c) GPR, GPRG, GPRT, GPRGT, GPRT-G 팩킹 세포주 또는 이의 유도체 중 하나를 상기 형성된 콘카타머 어레이로 형질감염시켜 상기 안정한 생산자 세포주 세포를 제공하는 단계; (d) 상기 안정한 생산자 세포주 세포로부터 바이러스 벡터 생성을 유도하는 단계; 및 (e) 상기 바이러스 벡터의 초기 수거 후 약 40시간 내지 약 56시간 마다 무혈청 배지 중에서 상기 바이러스 벡터를 반복적으로 수거하는 단계를 포함하는, 방법.
  40. 제39항에 있어서, 상기 바이러스 벡터의 초기 수거가 유도 후 약 40시간 내지 약 56시간에 수행되는, 방법.
  41. 제39항 또는 제40항에 있어서, 상기 바이러스 벡터가 약 48시간 마다 반복적으로 수거되는, 방법.
  42. 제39항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 무혈청 배지가 하나 이상의 성장 인자를 포함하는, 방법.
  43. 제39항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 무혈청 배지가 하나 이상의 지질을 포함하는, 방법.
  44. 제39항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 플라스미드가 서열번호 1의 것과 적어도 약 90% 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 방법.
  45. 제39항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 플라스미드가 서열번호 2의 것과 적어도 약 90% 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 방법.
  46. 제39항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 형질감염된 팩키징 세포주가 GPRG인, 방법.
  47. 제39항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 형질감염된 팩키징 세포주가 GPRT인, 방법.
  48. 제39항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 형질감염된 팩키징 세포주가 GPR인, 방법.
  49. 제39항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항생제 내성 카세트 플라스미드가 블레오마이신 항생제 내성 카세트이고; 상기 합성된 벡터로부터의 DNA 단편과 상기 블레오마이신 항생제 내성 카세트로부터의 DNA 단편의 비율이 약 25:1 내지 약 1:25 범위인, 방법.
  50. 제39항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 바이러스 벡터 생산 유도가 혈청-함유 배지에서 수행되는, 방법.
  51. 제50항에 있어서, 유도 후 약 24시간에 상기 혈청-함유 배지를 추가의 혈청-함유 배지로 대체함을 추가로 포함하는, 방법.
  52. 제51항에 있어서, 유도 후 약 24시간에 상기 혈청-함유 배지를 무혈청 배지로 대체함을 추가로 포함하는, 방법.
  53. 제52항에 있어서, 상기 무혈청 배지가 하나 이상의 지질 및/또는 하나 이상의 성장 인자를 추가로 포함하는, 방법.
  54. 제39항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 플라스미드에 삽입된 상기 하나 이상의 핵산 서열이 치료학적 유전자를 암호화하는, 방법.
  55. 제39항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이 상기 반복적인 수거의 각각의 개별 수거 동안에 약 0.5 x 106 TU/mL 내지 약 4 x 106 TU/mL 범위의 바이러스 역가 생성을 제공하는, 방법.
  56. 제39항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이 상기 반복적인 수거의 각각의 개별 수거 동안에 약 0.5 x 106 TU/mL 내지 약 2 x 106 TU/mL 범위의 바이러스 역가 생성을 제공하는, 방법.
  57. 제39항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이 상기 반복적인 수거의 각각의 개별 수거 동안에 약 0.5 x 106 TU/mL 내지 약 1.5 x 106 TU/mL 범위의 바이러스 역가 생성을 제공하는, 방법.
  58. 제39항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 바이러스 벡터가 적어도 5회 수거되는, 방법.
  59. 제39항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 바이러스 벡터가 적어도 10회 수거되는, 방법.
  60. 제39항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 바이러스 벡터가 적어도 20회 수거되는, 방법.
  61. 제39항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 반복적인 수거가 약 10일 내지 약 90일 범위의 기간 동안 수행되는, 방법.
  62. 제39항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 반복적인 수거가 약 20일 내지 약 70일 범위의 기간 동안 수행되는, 방법.
  63. 안정한 생산자 세포주 세포로부터 벡터 상등액을 수거하는 방법으로서, 상기 방법이 상기 안정한 생산자 세포주 세포로부터 바이러스 벡터 생성을 유도하는 단계; 및 상기 바이러스 벡터의 초기 수거 후 약 40 내지 약 56시간 마다 무혈청 배지에서 상기 유도된 안정한 생산자 세포주 세포로부터 상기 바이러스 벡터를 반복적으로 수거하는 단계를 포함하는, 방법.
  64. 제63항에 있어서, 상기 방법이 상기 반복적인 수거의 각각의 개별 수거 동안에 약 0.5 x 106 TU/mL 내지 약 4 x 106 TU/mL 범위의 바이러스 역가 생성을 제공하는, 방법.
  65. 제64항에 있어서, 상기 바이러스 역가가 상기 반복적인 수거의 각각의 개별 수거 동안에 약 0.5 x 106 TU/mL 내지 약 2 x 106 TU/mL 범위인, 방법.
  66. 제64항에 있어서, 상기 바이러스 역가가 상기 반복적인 수거의 각각의 개별 수거 동안에 약 0.5 x 106 TU/mL 내지 약 1.5 x 106 TU/mL 범위인, 방법.
  67. 제63항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 바이러스 벡터가 적어도 5회 수거되는, 방법.
  68. 제63항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 바이러스 벡터가 적어도 10회 수거되는, 방법.
  69. 제63항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 바이러스 벡터가 적어도 20회 수거되는, 방법.
  70. 제63항 내지 제69항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 반복적인 수거가 약 10일 내지 약 90일 범위의 기간 동안 수행되는, 방법.
  71. 제63항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 반복적인 수거가 약 20일 내지 약 70일 범위의 기간 동안 수행되는, 방법.
  72. 제63항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 안정한 생산자 세포주 세포가 혈청-함유 배지에서 계대되고, 상기 세포가 무혈청 배지에서 배양되는, 방법.
  73. 제63항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 안정한 생산자 세포주 세포가 혈청-함유 배지에서 계대되고, 상기 세포가 혈청-함유 배지에서 배양되는, 방법.
  74. 제63항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 바이러스 벡터의 초기 수거가 유도 후 적어도 약 40시간에 수행되는, 방법.
  75. 제63항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 바이러스 벡터가 약 48시간 마다 반복적으로 수거되는, 방법.
  76. 제63항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 무혈청 배지가 하나 이상의 첨가제를 포함하는, 방법.
  77. 제63항 내지 제76항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 바이러스 벡터가 치료학적 유전자를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는, 방법.
  78. 제77항에 있어서, 상기 치료학적 유전자가 겸상 적혈구 질환(sickle cell disease)을 보정하거나 겸상 적혈구 질환의 하나의 증상을 적어도 경감시키는, 방법.
  79. 제77항에 있어서, 상기 치료학적 유전자가 감마-글로빈 유전자, C1 에스테라제 억제제 단백질, 브루톤 티로신 키나제, 및 위스콧-알드리치 증후군 단백질로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
  80. 제63항 내지 제79항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 바이러스 벡터가 HPRT 또는 CCR5를 녹다운시키기 위해 RNAi를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는, 방법.
  81. 제63항 내지 제80항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 바이러스 벡터가 (i) HPRT를 녹다운시키는 RNAi를 암호화하는 제1 핵산 서열, 및 (ii) 치료학적 유전자를 암호화하는 제2 핵산 서열을 포함하는, 방법.
  82. 벡터 상등액을 수거하는 방법으로서, 상기 방법이 안정한 생산자 세포주 세포를 생성하는 단계로서, 여기서, 상기 안정한 생산자 세포주 세포는 GPR, GPRG, GPRT, GPRGT, 또는 GPRT-G 팩킹 세포주 또는 이의 유도체 중 하나로 부터 유래하는 단계; 상기 생성된 안정한 생산자 세포주 세포로부터 바이러스 벡터 생성을 유도하는 단계; 및 바이러스 벡터의 초기 수거 후 약 40 내지 약 56시간 마다 무혈청 배지에서 상기 유도된 생성된 안정한 생산자 세포주 세포로부터 상기 바이러스 벡터를 반복적으로 수거하는 단계로서, 여기서, 상기 반복적인 수거가 추가의 생성된 안정한 생산자 세포주 세포를 도입하는 것 없이 새로운 무혈청 배지를 상기 유도된 생성된 안정한 세포주 세포에 첨가함을 포함하는 단계를 포함하는, 방법.
  83. 제82항에 있어서, 상기 무혈청 배지가 하나 이상의 성장 인자를 포함하는, 방법.
  84. 제82항 또는 제83항에 있어서, 상기 무혈청 배지가 하나 이상의 지질을 포함하는, 방법.
  85. 제82항 내지 제84항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 바이러스 벡터의 초기 수거가 유도 후 약 40시간 내지 약 56시간에 수행되는, 방법.
  86. 제82항 내지 제85항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 바이러스 벡터의 초기 수거가 유도 후 48시간 미만에 수행되는, 방법.
  87. 제82항 내지 제86항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 반복적인 수거가 적어도 2회 수행되는, 방법.
  88. 제82항 내지 제87항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 반복적인 수거가 약 44 내지 약 52시간 마다 수행되는, 방법.
  89. 제82항 내지 제88항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 반복적인 수거가 약 48시간 마다 수행되는, 방법.
  90. 제82항 내지 제89항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 무혈청 배지가 각각의 반복 수거 후 대체되는, 방법.
  91. 제82항 내지 제90항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이 상기 반복적인 수거의 각각의 개별 수거 동안에 약 0.5 x 106 TU/mL 내지 약 4 x 106 TU/mL 범위의 바이러스 역가 생성을 제공하는, 방법.
  92. 제91항에 있어서, 상기 바이러스 역가가 상기 반복적인 수거의 각각의 개별 수거 동안에 약 0.5 x 106 TU/mL 내지 약 2 x 106 TU/mL 범위인, 방법.
  93. 제82항 내지 제92항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 바이러스 벡터가 적어도 5회 수거되는, 방법.
  94. 제82항 내지 제93항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 바이러스 벡터가 적어도 10회 수거되는, 방법.
  95. 제82항 내지 제94항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 바이러스 벡터가 적어도 20회 수거되는, 방법.
  96. 제82항 내지 제95항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 반복적인 수거가 약 10일 내지 약 90일 범위의 기간 동안 수행되는, 방법.
  97. 제82항 내지 제96항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 반복적인 수거가 약 20일 내지 약 70일 범위의 기간 동안 수행되는, 방법.
  98. HPPRT를 녹다운시키는 RNAi를 암호화하는 제1 핵산 서열을 갖는 바이러스 벡터를 포함하는 조성물로서, 상기 바이러스 벡터가 생성된 안정한 생산자 세포주 세포로부터 바이러스 벡터 생성을 유도하는 단계; 및 상기 바이러스 벡터의 초기 수거 후 약 40 내지 약 56시간 마다 상기 유도된 생성된 안정한 생산자 세포주 세포로부터 상기 바이러스 벡터를 반복적으로 수거하는 단계에 의해 생성되는, 조성물.
  99. 제98항에 있어서, 상기 바이러스 벡터의 반복적인 수거가 새로운 배지를 추가로 생성된 안정한 생산자 세포주 세포를 도입하는 것 없이 상기 유도된 생성된 안정한 생산자 세포주 세포에 첨가함을 포함하는, 조성물.
  100. 제98항에 있어서, 상기 반복적인 수거가 무혈청 배지에서 수행되는, 조성물.
  101. 제98항에 있어서, 상기 바이러스 벡터가 제2 핵산 서열을 추가로 포함하는, 조성물.
  102. 제101항에 있어서, 상기 제2 핵산 서열이 치료학적 유전자를 암호화하는, 조성물.
  103. 제102항에 있어서, 상기 치료학적 유전자가 감마-글로빈 유전자인, 조성물.
  104. 제102항에 있어서, 상기 치료학적 유전자가 C1 에스테라제 억제제 단백질인, 조성물.
  105. 제102항에 있어서, 상기 치료학적 유전자가 브루톤 티로신 키나제인, 조성물.
  106. 제102항에 있어서, 상기 치료학적 유전자가 위스콧-알드리치 증후군 단백질인, 조성물.
  107. 제101항에 있어서, 상기 제2 핵산 서열이 뉴클레아제를 암호화하는, 조성물.
  108. 제107항에 있어서, 상기 뉴클레아제가 호밍 엔도뉴클레아제, 전사 활성화인자 유사 이펙터 뉴클레아제, 아연 핑거 뉴클레아제, II형 클러스터링된 규칙적으로 산재된 짧은 팔린드롬 반복체 및 메가TAL 뉴클레아제로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 조성물.
  109. 제101항에 있어서, 상기 제2 핵산 서열이 CRISPR/Cas 성분을 암호화하는, 조성물.
  110. 제109항에 있어서, 상기 CRISPR/Cas 성분들이 Cas9 단백질 및 Cas12 단백질로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 조성물.
  111. 숙주 세포를 형질도입하는데 있어서 제98항 내지 제110항 중 어느 한 항의 조성물의 용도.
  112. 제111항에 있어서, 상기 숙주 세포가 조혈 세포인, 용도.
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