KR20220031000A - 핵산 봉입aav 중공입자의 제조방법 - Google Patents

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타카시 오카다
준이치 미네노
히데토 쵸노
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각꼬호우징 닛뽄 이까다이가꾸
다카라 바이오 가부시키가이샤
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Abstract

이하의 공정을 포함하는 아데노 연관 바이러스(AAV)의 핵산 봉입 중공입자의 제조방법; (1) AAV 역위 말단 반복 서열(ITR)의 A 영역의 서열 및 D’영역의 서열(AD 서열) 또는 AD 서열의 상보 서열, 및 목적의 유전자 서열을 포함하는 직쇄상 핵산 단편을 조제하는 공정, (2) AAV의 중공입자를 생산하는 세포에 (1)의 핵산 단편을 도입하는 공정, 및 (3) (2)의 세포를 배양하는 공정.

Description

핵산 봉입AAV 중공입자의 제조방법
본 발명은 핵산이 봉입된 AAV 중공입자를 제조하는 방법에 관한 것이다.
인간을 포함하는 포유동물세포, 조직 또는 개체에 목적의 유전자를 도입하고, 발현시키기 위해서 여러 가지 유전자 도입기술이 개발되고 있다. 바이러스 벡터도 그 하나이고, 렌티 바이러스, 온코레트로 바이러스, 아데노 바이러스, 아데노 연관 바이러스 등에 유래하는 여러 벡터가 알려져 있다.
그 중에서도, 아데노 연관 바이러스(AAV: Adeno-Associated Virus) 벡터는 최근, 유전자 치료에서 유용한 유전자 도입 벡터로서 기대되고 있다. AAV는 파르보바이러스에 속하는 비병원성의 바이러스이고, 자기복제능을 결손하고 있기 때문에 자율적 증식을 할 수 없고, 증식에는 아데노 바이러스나 헤르페스 바이러스의 동시감염을 필요로 하기 때문에 전파성이 낮은 것으로 알려져 있다. 또 숙주에서 면역원성이 낮은 성질도 갖는다. 그러한 특징으로부터 유전자 도입 벡터로서 안전성이 높다는 이점을 가지고 있다. 부가해서, 숙주 영역이 넓기 때문에 여러 가지의 세포에 감염 가능하고, 각 혈청형 AAV(예를 들면, AAV1∼AAV9)에 유래하는 벡터도 개발되고 있기 때문에, 각각의 혈청형에서의 감염 표적 세포의 특이성을 응용해서 신경 세포, 근육 세포, 간 세포 등, 특정한 세포, 조직 및 기관으로의 유전자 도입에 이용되고 있다. 그러나, AAV를 비롯하는 종래의 바이러스 벡터는 자기복제능의 획득이나, 야생형 바이러스 혼입 등의 다양한 문제점이 있었다.
상기 문제점을 해결하기 위해서, Samulski들은 AAV의 외각 단백질을 구성하는 캡시드를 조제하고, 이것을 약제의 전달 담체로서 이용하는 것을 제창했다(특허문헌 1). 캡시드로 형성되고, 내부에 AAV 바이러스 게놈을 포함하지 않는 AAV 중공입자는 표적세포의 특이적 인식, 세포로의 흡착과 침입, 탈각 등의 바이러스 초기 감염 활성은 가지지만, 자기복제에 필요한 바이러스 유래의 유전자를 가지지 않기 때문에 바이러스의 증식 활성은 없다. 따라서 중공입자는 단백질이나 핵산 등의 약제를 표적세포에 특이적으로 전달시키는 것이 가능하고, 투여 개체에 대한 안전성을 겸비한 이상적인 약제 전달계 (DDS: Drug Delivery System)의 담체이다.
Samulski들은 중공입자를 요소, 열이나 pH의 조건에 따라서 일단 변성시키고, 약제를 내부에 통합시킨 후에 재구성시키는 도입방법을 제시하고 있다(특허문헌 1). 그러나, 요소 등의 변성제를 중공입자에 작용시키면, 캡시드가 가지는 초기 감염 활성이 저하되고, 전달 담체로서의 기능이 손상되는 문제가 있었다. 또, Okada들은 계면 활성제를 사용해서 중공입자에 단백질이나 핵산을 도입하는 방법을 개시하고 있다(특허문헌 2).
AAV의 복제 과정에서, DNA 게놈이 환상의 더블-스트랜드 DNA(cAAV)의 형태를 취할 수 있음이 알려져 있다. 이 더블-스트랜드 DNA는 말단 반복(ITR)서열을 1개 가지고 있다. Musatov들은 AAV의 게놈 DNA의 복제 및 봉입에는 ITR의 A 영역의 서열 및 D’영역의 서열로 이루어지는 서열(AD 서열)이 필요한 것을 보고하고 있다(비특허문헌 1). Musatov들은 AD 서열을 포함하는 환상 더블-스트랜드 DNA를 세포에 도입시켜서, DNA가 봉입된 AAV 중공입자를 제조하는 것을 개시한다. 또, Okada들은 AD 서열 및 그 상보적인 서열(A’영역의 서열 및 D 영역의 서열)을 포함하는 핵산 단편을 세포에 도입시켜서, 핵산이 봉입된 AAV 중공입자를 제조하는 것을 개시하고 있다(특허문헌 3).
미국특허 제5, 863, 541호 국제공개 제2012/144446호 팸플릿 국제공개 제2018/139637호 팸플릿
Musatov, et al., 2002, vol.76, No.24, p.12792-12802
본 발명은 보다 간편하고 효율적인 중공입자 내로의 핵산 봉입방법을 개발하고, 그것을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명자는 예의 연구를 거듭한 결과, 보다 간편한 동시에, 효율적인 방법으로, 바이러스의 초기 감염 활성을 유지한 채 핵산이 봉입된 중공입자를 제조하는 것에 성공했다. 또, 이 핵산 봉입 중공입자와 표적세포를 혼합하는 것에　의해, 중공입자에 내포된 핵산을 그 표적세포 내로 효과적으로 도입할 수 있는 것도 확인했다. 본 발명은 이것들의 지견과 결과에 의거하는 것으로 이하를 제공하는 것이다.
즉, 본 발명은 이하에 관한 것이다.
[1] 이하의 공정을 포함하는 아데노 연관 바이러스(AAV)의 핵산 봉입 중공입자의 제조방법;
(1) AAV 역위 말단 반복 서열(ITR)의 A 영역의 서열 및 D’영역의 서열(AD 서열) 및/또는 AD 서열의 상보 서열, 및 목적의 유전자 서열을 포함하는 직쇄상 핵산 단편을 조제하는 공정,
(2) AAV의 중공입자를 생산하는 세포에 (1)의 핵산 단편을 도입하는 공정, 및
(3) (2)의 세포를 배양하는 공정.
[2] 상기 [1]에서, 핵산 단편이 5’말단으로부터 3’말단을 향해서, AD 서열 및/또는 AD 서열의 상보 서열, 및 목적의 유전자 서열을 포함하는 방법.
[3] 상기 [1]에서, 핵산 단편이, 5’말단으로부터 3’말단을 향해서, 목적의 유전자 서열, 및 AD 서열 및/또는 AD 서열의 상보 서열을 포함하는 방법.
[4] 상기 [1]에서, 핵산 단편이 AAV ITR의 A’영역의 서열을 포함하지 않는 [방법.
[5] 상기 [1]에서, 핵산 단편을 조제하는 공정이 핵산 증폭 반응에 의한 핵산 단편의 증폭을 포함하는 공정인 방법.
[6] 상기 [1]에서, 중공입자를 생산하는 세포가 AAV의 Cap 유전자, Rep 유전자 및 AAV의 헬퍼 기능이 도입된 세포인 방법.
[7] 상기 [1]에서, 핵산 단편이 더블-스트랜드의 핵산 또는 싱글-스트랜드의 핵산인 방법.
[8] 상기 [1]에서, 핵산 단편의 AD 서열 영역이 더블-스트랜드이고, 목적의 유전자 서열 영역이 싱글-스트랜드의 핵산인 방법.
[9] AAV 역위 말단 반복 서열(ITR)의 A 영역의 서열 및 D’영역의 서열(AD 서열) 또는 AD 서열의 상보 서열, 및 목적의 유전자 서열을 포함하는 직쇄상 핵산 단편.
[10] 상기 [9]에서, 5’말단으로부터 3’말단을 향해서, AD 서열 또는 AD 서열의 상보 서열, 및 목적의 유전자 서열을 포함하는 핵산 단편.
[11] 상기 [9]에서, 5’말단으로부터 3’말단을 향해서, 목적의 유전자 서열 및, AD 서열 또는 AD 서열의 상보 서열을 포함하는 한 핵산 단편.
[12] 상기 [9]에서, AAV ITR의 A’영역의 서열을 포함하지 않는 핵산 단편.
[13] 상기 [9]에서, 더블-스트랜드의 핵산 또는 싱글-스트랜드의 핵산인 핵산 단편.
[14] 상기 [9]에서, 핵산 단편의 AD 서열 영역이 더블-스트랜드이고, 목적의 유전자 서열 영역이 싱글-스트랜드의 핵산인 핵산 단편.
[15] 상기 [9] 내지 [14] 중 어느 하나에 기재된 직쇄상 핵산 단편을 포함하는 AAV의 핵산 봉입 중공입자.
본 발명에 의해, 보다 간편하고 효율적으로, 핵산이 봉입된 중공입자를 제조하는 방법이 제공된다. 본 발명에서의 「핵산이 봉입된 AAV 중공입자」는 직쇄상의 핵산 단편이 봉입된 완전한 AAV 게놈을 보유하고 있지 않은 AAV 유사 입자이고, 통상의 AAV와는 다르다.
본 발명의 중공입자 제조방법에 의하면, 바이러스에 유래하는 서열을 적게 해서 안전성 및 세포독성을 저감시키고, 종래의 방법에 비해서 간편하고, 동시에 고효율로 목적의 핵산을 중공입자에 봉입할 수 있다. 그것에 의해서 안전성이 높고, 동시에 표적 세포 특이성을 가지는 중공입자를 제공할 수 있다.
도 1은 AD 서열을 포함하는 직쇄상 핵산 단편을 사용해서 조제한 AAV 중공입자의 역가를 측정한 결과를 나타내는 도면이다.
도 2는 AD 서열을 포함하는 직쇄상 핵산 단편을 사용해서 조제한 AAV 중공입자의 역가를 측정한 결과를 나타내는 도면이다.
도 3은 AD 서열을 포함하는 직쇄상 핵산 단편을 사용해서 조제한 AAV 중공입자에 의한 유전자 도입을 측정한 결과를 나타내는 도면이다.
도 4는 AAV의 ITR의 영역을 나타내는 도면이다.
도 5는 실시예 1∼3의 개요를 나타내는 도면이다.
도 6은 실시예 4에서 AAV 중공입자에 봉입한 직쇄상 핵산 단편을 나타내는 도면이다.
도 7은 AD 서열을 포함하는 직쇄상 핵산 단편을 사용해서 조제한 AAV 중공입자에 의한 유전자 도입을 측정한 결과를 나타내는 도면이다.
도 8은 실시예 5에서 AAV 중공입자에 봉입한 직쇄상 핵산 단편을 나타내는 도면이다.
본 명세서에서 「역 방향 말단 반복(ITR: inverted terminal repeat)」은 AAV의 게놈 DNA의 양단에 존재하는 시스 요소를 의미한다. ITR은 AAV 게놈 DNA의 복제, 증폭, 봉입에 필수적이다. ITR에는 Rep 결합부위(RBS, RBE라고도 기재된다) 및 말단 분리부위(TRS) 및 헤어핀 형성을 가능하게 하는 회문서열이 포함된다. ITR은 말단으로부터 차례로, A 영역, B 영역, B’영역, C 영역, C’영역, A’영역을 포함한다. A 영역과 A’영역, B영역과 B’영역, C 영역과 C’영역은 각각 역방향의 상보 서열이고, 각각의 영역이 어닐링해서 더블-스트랜드가 되어 도 4에 나타내 바와 같은 해머 헤드 구조를 형성한다. A’영역의 말단 가운데, C’영역의 반대측(3’말단측 또는 5’말단측)에 D 영역이 존재한다.
본 명세서에서 「3’말단측」이란 어떤 서열(영역)의 3’말단 부분의, 더욱 3’말단의 방향에 위치하는 것을 의미한다. 동일하게, 「5’말단측」이란 어떤 서열(영역)의 5’말단 부분의, 더욱 5’말단의 방향에 위치하는 것을 의미한다. 따라서 본 명세서에서 「3’말단측」 또는 「5’말단측」이라고 기재되어 있는 경우, 어떤 서열(영역)의 3’말단 부분 또는 5’말단 부분에 접해서 목적의 서열 등이 배치되는 것, 및 어떤 서열(영역)의 3’말단 부분 또는 5’말단 부분에 접하지 않고 목적의 서열 등이 배치되는(즉, 어떤 서열(영역)의 3’말단 부분 또는 5’말단 부분과 목적의 서열 등의 사이에 임의의 서열이 개재한다) 것의 양쪽을 포함한다.
본 발명에서 「캡시드(capsid)」는 바이러스 입자(virion)를 구성하는 요소에 하나이고, 게놈 DNA 또는 코어를 둘러싸는 복수의 단위 단백질(캡소미어: capsomere)로 이루어지는 외피(coat) 또는 쉘(shell)을 의미한다. 캡시드의 내부에 바이러스 핵산, 코어 또는 다른 물질을 아무것도 포함하지 않는 캡시드 단백질만으로터 구성된 입자를 본 명세서에서는 「중공입자(empty particle)」라고 칭하고, 「중공 캡시드 입자(empty capsid particle)」라고 칭하는 경우도 있다.
본 발명에서 「목적의 유전자」는 중공입자에 봉입되어 표적세포에 도입되는 것이 소망되는 임의의 유전자를 의미한다. 목적의 유전자는 구조 유전자(예를 들면, 효소, 전사 인자, 리포터 분자, 증식 인자, 항원 단백질 등의 기능성 단백질의 유전자 및 그 단편) 및 조절 유전자(예를 들면, 안티센스 DNA, 기능성 RNA(안티센스 RNA, siRNA, miRNA, 리보자임 등)을 코딩하는 유전자 등)을 포함한다. 또, 목적의 유전자는 전사나 번역을 제어하는 조절 엘리먼트, 예를 들면 프로모터 서열, 인핸서 서열, 폴리 A 부가 시그널 서열, 터미네이터 서열 등을 포함할 수 있다. 즉, 세포 내에서 단백질이나 기능성 핵산을 발현할 수 있는 서열을 목적의 유전자로 할 수 있다.
이하에 본 발명에 대해서 상세하게 설명한다.
하나의의 태양으로서, 본 발명은 이하의 공정을 포함하는 AAV의 핵산 봉입 중공입자의 제조방법이다;
(1) AAV 역위 말단 반복 서열(ITR)의 A 영역의 서열 및 D’영역의 서열(AD 서열) 또는 AD 서열의 상보 서열, 및 목적의 유전자 서열을 포함하는 직쇄상 핵산 단편을 조제하는 공정,
(2) AAV의 중공입자를 생산하는 세포에 (1)의 핵산 단편을 도입하는 공정, 및
(3) (2)의 세포를 배양하는 공정.
(A) 핵산을 조제하는 공정
상기 (1)공정의 직쇄상 핵산 단편은 AD 서열 또는 AD 서열의 상보 서열, 및 목적의 유전자 서열을 포함한다. AD 서열은 공지의 천연 AAV 혈청형의 게놈 DNA 서열(예를 들면, 혈청형 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 11)을 사용할 수 있다. 각 혈청형의 ITR에서, A 영역, B 영역, B’영역, C 영역, C’영역, A’영역이 특정되고 있다. D 영역은 ITR의 A’영역의 말단 중, C’영역의 반대측(3’말단측 또는 5’말단측)에 존재한다. 각 혈청형의 D 영역의 서열 및 그 D 영역의 서열에 상보적으로 역방향의 서열인 D’영역의 서열도 특정되어 있다. A 영역, A’영역, D 영역, 및 D’영역은 다른 혈청형에 유래할 수도 있다. 또, Rep와의 결합능 및 헤어핀 형성능을 보유하는 범위 내에서, 천연의 A 영역의 서열 변이체도 사용할 수 있고, 그 경우의 A’영역의 서열은 변이체의 A 영역의 서열과 상보적이다. 또, 본 발명은 천연의 D 영역의 서열 변이체도 사용할 수 있고, 그 경우의 D’영역의 서열은 변이체의 D 영역의 서열과 상보적이다.
본 발명에서 사용하는 직쇄상 핵산 단편은 A’영역의 서열(서열번호 8)을 포함하지 않는다. 즉, 직쇄상 핵산 단편에 포함되는 A 영역의 서열과의 분자 내의 어닐링은 발생하지 않고, A 영역의 서열 2차 구조를 형성하지 않는다. 또, 직쇄상 핵산 단편은 5’말단으로부터 3’말단을 향해서, D 영역의 서열-A’영역의 서열인 서열을 포함하지 않는다. 즉, 직쇄상 핵산 단편에 포함되는 AD 서열과의 분자 내의 어닐링은 발생하지 않고, AD 서열에 2차 구조를 형성하지 않는다. 또 상기 핵산 단편은, B 영역, B’영역, C 영역 및 C’영역으로 이루어지는 그룹에서 선택되는 적어도 1개의 영역의 서열을 결손하고 있다. 더 적합하게는, 상기 핵산 단편은 B 영역, B’영역, C 영역 및 C’영역의 서열을 결손하고 있다.
본 발명에 1태양으로서, 상기 (1)공정의 직쇄상 핵산 단편은 5’말단으로부터 3’말단을 향해서, AD 서열 또는 AD 서열의 상보 서열, 및 목적의 유전자 서열을 포함한다. 또, 별도의 태양의 직쇄상 핵산 단편은 5’말단으로부터 3’말단을 향해서, 목적의 유전자 서열 및, AD 서열 또는 AD 서열의 상보 서열을 포함한다.
상기(1)공정의 직쇄상 핵산 단편은, 목적의 유전자 서열을 포함한다. 목적의 유전자는 AAV에 대하여 외래성일 수 있다.
상기 (1)공정의 직쇄상 핵산 단편은 적어도 1개의 AD 서열 또는 AD 서열의 상보 서열을 포함한다. 본 발명은 AD 서열 또는 AD 서열의 상보 서열을 1개 포함하는 핵산 단편, 2개 포함하는 핵산 단편, 3개 포함하는 핵산 단편, 4개 포함하는 핵산 단편 또는 5개 이상 포함하는 핵산 단편, 예를 들면, 1∼3개 포함하는 핵산 단편을 사용할 수 있다.
상기 (1)공정의 직쇄상 핵산 단편은 DNA 또는 RNA이고, 바람직하게는 DNA이다. 또한 당해 핵산 단편은 상보적인 2분자의 핵산이 아닐링한 더블-스트랜드의 핵산일 수도, 1분자의 싱글-스트랜드 핵산일 수도 있다. 또, 직쇄상의 핵산이란 핵산의 양단이 공유 결합에 의해 결합하고 있지 않은 것을 의미한다. 또, 핵산 단편은 모든 서열이 더블-스트랜드의 핵산일 수도, 서열의 일부가 싱글-스트랜드이고, 잔부가 더블-스트랜드의 핵산일 수도 있다. 예를 들면, 핵산 단편은 AD 서열의 영역이 더블-스트랜드이고, 목적의 유전자 서열의 영역이 싱글-스트랜드의 핵산으로할 수도 있다. 또, 핵산 단편의 더블-스트랜드 부분에서, 1개소, 2개소 또는 복수 개소에 인산 결합(뉴클레오티드 결합)을 가지지 않는 핵산 단편일 수도 있다. 본 발명에 1태양으로서, 직쇄상 핵산 단편은 목적의 유전자 서열을 포함하는 싱글-스트랜드의 핵산, AD 서열을 포함하는 싱글-스트랜드의 핵산, 및 목적의 유전자 서열과 AD 서열에 상보적인 싱글-스트랜드의 핵산 3분자를 아닐링한 더블-스트랜드의 핵산이다. 또, AD 서열을 포함하는 더블-스트랜드의 핵산이 AD 서열의 상보 체인을 포함하고, 또, AD 서열의 상보 체인을 포함하는 더블-스트랜드 핵산이 AD 서열을 포함하는 것은 당연하다.
상기 (1)공정의 직쇄상 핵산 단편은 공지의 핵산조제 방법에 의해 조제할 수 있다. 당해 핵산 단편은 PCR 등의 핵산 증폭 반응, 화학합성에 의해 인 비트로에서 조제할 수 있다. 또 당해 핵산은 진핵세포 내, 원핵세포 내 등의 인 비보에서, 폴리머라아제 반응, 복제 및/또는 전사에 의해 생성한 핵산을 세포로부터 정제해서 조제할 수 있다. 또, 이 직쇄상 핵산 단편도 하나의 태양으로서 본 발명에 포함된다.
본 발명에 1태양으로서, 상기 (1)공정의 직쇄상 핵산 단편에 포함되는 AD 서열은 AAV2 유래의 서열이고, 그 A 영역의 서열을 서열번호 9에, D’영역의 서열을 서열번호 10에 나타낸다. 또, AAV2의 A’영역의 서열을 서열번호 8에, D 영역의 서열을 서열번호 11에 나타낸다. 또, AAV2의 AD 서열을 서열번호 1에, AD 서열의 상보 서열을 서열번호 18에 나타낸다.
상기 (1)공정의 핵산 단편은 천연형 핵산, 화학 변형 핵산, 인공 핵산, 핵산 유사체 및 그것들의 조합을 포함한다. 천연형 핵산은 자연계에 존재하는 천연형 뉴클레오티드만이 연결해서 이루어지는 DNA 및 RNA이다. 화학 변형 핵산은 인공적으로 화학 변한한 핵산이고, 예를 들면, 메틸포스포네이트형 DNA/RNA, 포스포로티오에이트형 DNA/RNA(PS화 DNA/RNA), 포스포라미데이트형 DNA/RNA, 2’-O-메틸형 DNA/RNA 등이 예시된다. 인공 핵산은 천연형 핵산의 일부에 비천연형 뉴클레오티드를 포함하는 핵산 또는 비천연형 뉴클레오티드만이 연결해서 이루어지는 핵산이다. 여기에서 말하는 「비천연형 뉴클레오티드」란 상기 천연형 뉴클레오티드에 유사한 성질 및/또는 구조를 가지는 인공적으로 구축된 또는 인공적으로 화학 변형된 자연계에 존재하지 않는 뉴클레오티드를 말한다. 핵산 유사체는 천연형 핵산에 유사한 구조 및/또는 성질을 가지는 인공적으로 구축된 고분자 화합물이다. 예를 들면, 펩티드 핵산(PNA: Peptide Nucleic Acid), 포스페이트 기를 가지는 펩티드 핵산(PHONA), 2’-F, 2’-O-메틸(2’-OMe), 2’-O-메턱시에틸(2’-MOE), 가교화 핵산, 모르폴리노 핵산(모르폴리노올리고를 포함한다) 등이 예시된다. 가교화 핵산은 BNA/LNA(Bridged Nucleic Acid/Locked Nucleic Acid), ENA(2’-O, 4’-C-에틸렌-BNA)이 예시된다. 본 발명에 1태양으로서, 핵산 단편은 AD 서열 또는 AD 서열의 상보 서열의 영역이 천연형 핵산이고, 목적의 유전자 서열의 영역이 인공 핵산이다.
상기 핵산은 필요에 따라서 인산기, 당 및/또는 염기가 표지되어 있을 수 있다. 표지에는 당해 분야에서 공지의 표지물질을 이용할 수 있다. 예를 들면, 방사성 동위원소(예를 들면, 32P, 3H, 14C), DIG, 비오틴, 형광색소(예를 들면, FITC, Texas, cy3, cy5, cy7, FAM, HEX, VIC, JOE, Rox, TET, Bodipy493, NBD, TAMRA), 또는 발광물질(예를 들면, 아크리디늄 에스테르)을 들 수 있다.
상기 (1)공정의 핵산 단편은 공지의 정제 방법이나 시판하고 있는 제품을 사용해서 정제ㆍ추출한 핵산을 사용할 수 있다. 공지의 정제 방법으로서는 페놀/클로로폼 혼합액에 의한 추출, 알코올 침전, 칼럼 정제, 필터 여과, 아가로오스겔 전기 영동 등에 의한 정제 방법이 예시된다.
상기 핵산 단편의 사이즈는 AAV 중공입자에 포함 가능한 사이즈라면 한정은 되지 않지만, 통상은 5kb 이하이다. 또, 상기 (1)공정의 핵산 단편은 천연의 완전한 AAV 게놈의 서열을 포함하지 않고, AAV의 Rep 유전자 및/또는 AAV의 Cap 유전자의 서열을 결손하고 있다. 또, 상기 핵산 단편은 천연의 완전한 ITR의 서열을 보유하고 있지 않다.
(B) 핵산을 세포에 도입하는 공정
상기 (1)공정의 핵산 단편을 AAV의 중공입자를 생산하는 세포에 도입한다. 핵산 단편을 도입하는 세포는 예를 들면, 마우스 세포, 및 영장류 세포(예를 들면, 인간 세포) 등을 포함하는 포유류 세포, 곤충 세포 등의 다양한 진핵 세포를 사용할 수 있다. 본 명세서에서, AAV나 핵산 봉입 중공입자를 생산하는 세포를 패키징 세포 또는 프로듀서 세포라고도 언급하는 경우가 있다. 적당한 포유류 세포는, 초대세포 및 세포주를 포함하지만 이들에 한정되는 것은 아니고, 적당한 세포주로서 HEK293 세포, 293EB 세포, COS 세포, HeLa 세포, Vero 세포, 3T3 마우스 섬유아 세포, C3H10T1/2 섬유아 세포, CHO 세포나 이것들의 세포로부터 파생한 세포 등을 들 수 있다. 적당한 곤충세포는 초대세포 및 세포주를 포함하지만 이들에 한정되는 것은 아니다. 적당한 세포주로서, Sf9 세포나 이것들의 세포로부터 파생한 세포 등을 들 수 있다.
중공입자를 생산하는 세포는 AAV Rep 유전자 산물 및 Cap 유전자 산물을 발현하는 세포가 사용된다. 이것들의 유전자 산물은 세포의 게놈에 안정적으로 편입된 AAV Rep 유전자 및 Cap 유전자에 의해 코딩되어 있을 수도 있고, 상기 핵산 단편의 도입 전, 도입과 동시에, 또는 도입 후에 세포 중에 도입되는 벡터에 의해 코딩되어 있을 수도 있다. Rep 유전자 및 Cap 유전자가 벡터에 의해 코딩되어 있는 경우, Rep 유전자 및 Cap 유전자는 동일한 벡터에 코딩될 수도 있다. 각각이 다른 벡터에 코딩되어 있을 수도 있다. Rep 유전자 및 Cap 유전자는 어느 쪽의 혈청형의 AAV의 서열(예를 들면, 혈청형 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10또는 11)이라도 사용할 수 있다. 또한, Rep 유전자 및 Cap 유전자는 같은 혈청형 유래의 서열일 수도, 다른 혈청형 유래의 서열일 수도 있다.
Rep 유전자 및 Cap 유전자를 코딩하는 벡터에는 중공입자를 생산할 수 있는 한, 도입하는 세포에 적합한 발현 벡터를 사용할 수 있고, 바이러스 벡터, 플라스미드 벡터, 코스미드 벡터, 및 인공 염색체가 예시된다. 플라스미드 벡터는 필요에 따라서 에피소말(Episomal)로 유지될 수 있는 것을 사용할 수 있다. 또, 벡터는, Rep 유전자 및 Cap 유전자가 세포 내에서 발현 가능하도록, 적당한 발현 시스템 내의 프로모터와 터미네이터의 제어 하에 배치할 수도 있다. 핵산발현 시스템이란 유전자의 발현에 필요한 발현 조절 엘리먼트를 기능 가능한 상태에서 적어도 1세트 가지는 계이다. 발현 조절 엘리먼트에는 프로모터 및 터미네이터 이외에, 필요에 따라서 인핸서 및 폴리 A 부가 시그널이 포함된다.
중공입자를 생산하는 세포에는 추가로 헬퍼 기능이 도입될 수 있다. 헬퍼 기능은 헬퍼 바이러스 기능, 악세사리 기능이라고도 불린다. 헬퍼 기능의 도입에는 일반적으로 아데노 바이러스가 사용되지만, 예를 들면 1형 또는 2형 단순 헤르페스 바이러스, 백시니어 바이러스 등의 바이러스도 사용할 수 있다. 바이러스를 사용하는 경우에는 세포에 바이러스를 헬퍼 바이러스로서 감염시킨다. 예를 들면, 아데노 바이러스의 초기 유전자 발현만이 AAV 입자의 패키징에 필요하므로, 후기 유전자 발현을 나타내지 않는 아데노 바이러스를 사용할 수도 있다. 후기 유전자 발현을 결손하는 아데노 바이러스 변이체(예를 들면 ts100K 또는 ts149 아데노 바이러스 변이체)를 사용할 수 있다. 혹은, 헬퍼 바이러스로부터 단리한 헬퍼 바이러스 기능에 필요한 핵산을 사용하고, 헬퍼 바이러스 기능을 제공하는 핵산 구축물을 제작해서 세포에 도입할 수 있다. 헬퍼 바이러스 기능을 제공하는 구축물은 E1유전자 영역, E2A 유전자 영역, E4orf6 유전자 및 VA RNA를 코딩하는 유전자를 포함하는, 1종 또는 복수 종의 헬퍼 바이러스 기능을 제공하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 플라스미드, 파지, 트랜스포존, 코스미드 또는 다른 바이러스의 형태로 숙주세포에 제공된다.
상기 (1)공정의 핵산 단편을 세포에 도입하는 방법으로서는, 예를 들면 칼슘 인산염법, 리포펙션법, DEAE 덱스트란법, 폴리에틸렌이민법, 일렉트로포레이션법, 직접적 미량 주입법, 고속 미립자총 등이 사용 가능라다. 또한 시판하고 있는 시약, 예를 들면 TransIT(등록상표)-293 Reagent, TransIT(등록상표)-2020 (이상, Mirus사), Lipofectamine 2000 Reagent, Lipofectamine 2000CD Reagent (이상, Life Technologies Corporation.), FuGene(등록상표) Transfection Reagent(Promega Corporation.), PEImax(코스모바이오사) 등을 사용할 수 있다.
상기 (1)공정의 핵산 단편은 106세포당, 1ng∼10㎍, 바람직하게는 5ng∼1㎍, 더 바람직하게는 10ng∼500ng 도입한다.
(C) 세포를 배양하는 공정
상기 (B)에서 핵산 단편을 도입한 세포의 배양은 세포의 종류에 따라서 공지의 배양조건으로 실시할 수 있다. 예를 들면 온도 30∼37℃, 습도 95%, CO2 농도 5∼10%에서의 배양이 예시되지만, 본 발명은 이러한 조건에 한정되는 것은 아니다. 소망의 세포 증식, 핵산 봉입 중공입자의 생산을 달성할 수 있는 것이라면 상기의 범위이외의 온도, 습도, CO2 농도로 실시할 수 있다.
배양용 배지는 공지의 배지를 사용할 수 있고, 예를 들면 DMEM, IMDM, HAM F12, RPMI-1640 등을 사용할 수도 있고, 이것들은 Lonza, Thermo Fisher사, Sigma-Aldrich사 등으로부터 시판품으로서 입수할 수 있다. 배지는 무혈청 배지일 수도, 소 태아 혈청(FBS)이나 인간 혈청 유래의 알부민 등을 첨가한 배지일 수도 있다.
배양 기재로서 배양접시, 플라스크, 백, 대형 배양조 또는 바이오리액터 등의 세포 배양용 기재(용기)를 사용할 수 있다. 또, 백으로서는 세포 배양용 CO2 가스 투과성 백이 호적하다. 대량의 세포를 필요로 하는 경우에는 대형 배양조를 사용할 수 있다.
배양기간은 특별하게 한정은 없고, 예를 들면 12시간∼10일간, 적합하게는 24시간∼7일간이 바람직하다. 배양 중에, 세포 내 및/또는 배양 상청에 핵산 봉입 중공입자, 즉 내부에 핵산을 보유하는 AAV 유사 입자가 생산된다.
또 본 발명에서는 세포의 배양 상청이나 회수한 세포를 적당한 완충액에 재현탁해서 파쇄한 것(세포 파쇄액)의 원심 상청으로부터 핵산이 봉입된 중공입자를 취득하는 공정을 실시할 수 있다. 본 발명에서는 이렇게 해서 수득된 배양 상청이나 세포 파쇄액 상청은 그대로, 혹은 추가로, 예를 들면 필터 여과, CsCl 밀도구배 원심분리 등 공지 방법이나 시판하고 있는 제품에 의해 중공입자의 농축, 정제 등을 실시한 후, 적절한 방법, 예를 들면 동결해서 소망하는 용도로 사용할 때까지 보존할 수 있다.
(D) 핵산 봉입 중공입자 및 조성물
본 발명은, 상기 (1)공정의 핵산 단편이 봉입된 중공입자(AAV 유사 입자)를 제공한다. 본 발명의 핵산 봉입 중공입자는 천연의 완전한 AAV 게놈을 보유하고 있지 않고, AAV의 Rep 유전자 및/또는 AAV의 Cap 유전자의 서열을 포함하는 핵산을 보유하지 않고 있다. 적합하게는, 본 발명의 핵산 봉입 중공입자는 추가로, 천연의 완전한 ITR을 보유하고 있지 않고, A’영역 및 D 영역을 보유하고 있지 않다. 또한 B영역, B’영역, C 영역, C’영역으로 이루어지는 그룹에서 선택되는 적어도 1개의 영역의 서열을 보유하고 있지 않을 수도 있다. 또, 본 발명은 상기의 핵산 봉입 중공입자를 포함하는 조성물을 제공한다. 본 발명의 조성물은 본 발명의 방법으로 수득되는 핵산 봉입 중공입자의 적어도 하나를 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 조성물은 핵산 봉입 중공입자를 유효성분으로서 포함하는 이외에, 담체, 및/또는 다른 약제를 포함할 수 있다. 조성물 중에 포함되는 핵산 봉입 중공입자는 서로 다른 2 이상이 것일 수도 있다. 이 경우, 다른 2 이상의 핵산 봉입 중공입자는 캡시드 등이 서로 다른 바이러스 유래일 수도 있고, 및/또는 봉입된 핵산이 서로 다른 종류일 수도 있다. 예를 들면, 표적세포의 서로 다른 복수의 핵산 봉입 중공입자를 포함하고 있을 수도 있다. 담체는 조성물의 제제화나 생체로의 적용을 쉽게 하고, 그 작용을 저해 또는 억제하지 않는 범위에서 첨가되는 물질이다. 예를 들면, 부형제, 결합제, 붕해제, 충전제, 유화제, 유동 첨가 조절제 또는 윤활택제를 들 수 있지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 적합하게는 본 발명의 조성물에는 약학적으로 허용되는 담체가 사용된다.
본 발명의 조성물에서의 핵산 봉입 중공입자의 함유량에는 특별하게 한정은 없다. 그 입자에 포함되는 핵산의 종류 및/또는 그 유효량, 적용되는 세포 또는 개체, 적용 방법ㆍ경로, 적용의 목적, 조성물의 형태(형태, 크기를 포함한다), 및 상기의 담체의 종류 등을 감안해서 적당하게 정해진다.
상기의 본 발명의 핵산 봉입 중공입자 및 당해 중공입자를 포함하는 조성물을 사용하는 것에　의해, 세포나 동물개체에 유전자를 도입할 수 있다. 이러한 유전자 도입방법도 본 발명에 1태양이다. 세포에의 유전자 도입은 인비트로에서 조성물과 세포를 접촉하는 것에 의해 실시할 수 있다. 또, 인간을 포함하는 동물개체로의 유전자 도입은 본 발명의 조성물을, 조직 내(예를 들면 근육 내), 정맥 내, 피하 및 복강 내 투여 등의 경로로 투여하는 것에 의해 실시된다.
실시예
이하에 본 발명을 실시예에 더 구체적으로 설명하지만, 본 발명의 범위는 이것들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: DNA 단편의 도입에 의한 AAV 중공입자로의 패키징1
(1) AD 서열을 포함하는 DNA 단편의 조제
목적의 유전자로서, 인간 ATP5b 유전자를 표적으로 하는 shRNA를 코딩하는 서열번호 2에 기재하는 싱글-스트랜드의 DNA 올리고뉴클레오타이드와, 그 상보쇄를 화학합성했다. 각각 어닐링시키는 것에 의해 더블-스트랜드 DNA 올리고뉴클레오타이드를 조제했다. 상기 더블-스트랜드 DNA 올리고뉴클레오타이드를 pENTR(상표)/U6벡터(Thermo Fisher사)의 클로닝 사이트에 클로닝해서 재조합 플라스미드를 제작했다. 또, AAV2 게놈 DNA의 ITR에 존재하는 AD 서열(A 영역-D’영역에 걸치는 61bp: 서열번호 1)을 포함하고, 그 양단에 제한효소 SalI 및 KpnI의 인식 서열을 가지는 더블-스트랜드 DNA 올리고뉴클레오타이드를, 각각 화학 합성한 양쇄를 어닐링시키는 것에 의해 조제했다. 이 더블-스트랜드 DNA 단편을 상기의 재조합 플라스미드의 U6 프로모터 상류의 SalI 사이트-KpnI 사이트 사이에 삽입하고, ATP5b shRNA 플라스미드 DNA(플라스미드 AD+)를 조제했다. 이 플라스미드는 5’말단으로부터 차례로, AD 서열, U6 프로모터 서열, shRNA 서열, Pol III 터미네이터 서열을 포함한다. 또, AD 서열을 포함하지 않는 컨트롤 플라스미드 DNA(플라스미드 AD-)도 조제했다. 이것들의 플라스미드 DNA를 시퀀스 해석하고, 의도한 서열임을 확인했다.
상기 플라스미드 DNA를 주형으로, M13 Forward(-20) 프라이머 및 M13 Reverse 프라이머(ThermoFisher사)를 사용한 PCR을 각각 실시하고, DNA 단편(PCR 산물 AD+) 및 DNA 단편(PCR 산물 AD-)의 증폭을 실시했다. PCR 반응액을 PCR Purification kit(QIAGEN)로 정제하고, 시퀀스 해석으로 서열을 확인했다.
(2) 293EB 세포로의 도입
실시예 1-(1)에서 얻은 각각의 플라스미드 DNA 및 DNA 단편을, AAV9의 Cap와 AAV2의 Rep를 발현하는 플라스미드인 pAAV2/9(서열번호 3) 및 헬퍼 플라스미드인 pAd5N(Agilent Technologies)과 함께, 폴리에틸렌이민 "Max"(코스모바이오사)을 사용해서 293EB 세포(국제공개 제2012/144446호 팸플릿) 1×108 Cells에 트랜스펙션했다. 트랜스펙션한 플라스미드 DNA의 중량은 44.8㎍, DNA 단편의 중량은 몰비로 10.9㎍으로 맞추었다. 트랜스펙션 시의 배지는 DMEM(무혈청)에, 1/100 용량의 GlutaMax를 첨가한 것으로, 트랜스펙션 후는 37℃, 5% CO2로 5일간 배양했다.
(3) AAV 유사 입자의 회수
실시예 1-(2)에서 배양한 293EB 세포의 배양 상청을 회수 후, 상청에 DNaseI를 첨가하고, 유리 DNA의 분해를 실시했다. 분해 후, 핵산 봉입 AAV 중공입자(AAV유사 입자)를 포함하는 상기의 상청에 AL buffer(Qiagen사)를 첨가하고, AAV 캡시드를 용해하고, 패키징된 DNA의 추출을 실시했다. AAV유사 입자에 포함되는 플라스미드 DNA와 DNA 단편의 카피 수를, U6-F 프라이머(서열번호 4)와 U6-R 프라이머(서열번호 5)를 사용한 정량 PCR에 의해 해석했다(도 1). 도 1에 나타내는 바와 같이 AD 서열을 포함하는 DNA 단편에서는 AD 서열을 포함하는 플라스미드 DNA보다도 AAV 중공입자로의 패키징이 고효율로 일어나는 것이 나타났다(약 15.2배). 이러한 DNA 단편은 PCR에 의해 대량으로 조제할 수 있고, AAV 유사 입자를 보다 간편하게 조제할 수 있음이 나타났다.
실시예 2: DNA 단편의 도입에 의한 AAV 중공입자로의 패키징2
(1) 293EB 세포로의 도입
실시예 1-(1)에서 조제한 플라스미드 DNA 및 DNA 단편을, 몰 농도를 맞추어서 293EB 세포에 도입했다. 즉, ATP5b shRNA 플라스미드 DNA(2974bp)와 DNA 단편(PCR 산물 AD+) (724bp)의 염기 길이에서, 플라스미드 DNA에 1/4.1중량(724/2074)의 DNA 단편을 사용한 이외는, 실시예 1-(2)와 동일한 방법으로 293EB 세포에 트랜스펙션하고, 세포를 배양했다.
(3) AAV 유사 입자의 회수
실시예 2-(1)에서 배양한 293EB 세포의 배양 상청을 회수 후, 상청에 Benzonase를 첨가하고, 유리 DNA의 분해를 실시했다. 그 후에 상청을 50℃로 20분간 가열처리한 후, 원심분리해서 침전을 제거했다. 또 염화세슘 밀도 기울기 원심법으로 상청 중의 AAV 유사 입자를 정제했다. 실시예 1-(3)과 동일한 방법에 의해, 수득된 AAV 유사 입자에 포함되는 플라스미드 DNA와 DNA 단편의 카피 수를, 정량 PCR에 의해 해석했다(도 2). 도 2에 나타내는 바와 같이 몰 농도를 맞추어서 트랜스펙션한 경우에도, AD 서열을 포함하는 DNA 단편에서는 AD 서열을 포함하는 플라스미드 DNA보다 높은 효율로 AAV 중공입자로의 패키징이 일어나는 것이 나타났다(약 4.6배).
실시예 3: AAV 유사 입자에 의한 세포로의 트랜스펙션
실시예 1-(3)에서 조제한 플라스미드(AD+) 또는 DNA 단편(PCR 산물 AD+)를 포함하는 AAV 유사 입자를, HEK293 세포에 1.0×106 v.g./세포로 감염시켰다. 감염 3일 후에 HEK293 세포로부터 RNeasy Mini Kit(QIAGEN사)를 사용해서 RNA를 추출했다. 프라이머 hATP5b-F(서열번호 6) 및 프라이머 hATP5b-R(서열번호 7)을 사용해서 ATP5b의 발현량을 RT-PCR법에 의해 해석했다(도 3). 도 3에 나타내는 바와 같이 DNA 단편을 포함하는 AAV 유사 입자를 감염시킨 세포는 플라스미드 DNA를 포함하는 AAV 유사 입자를 감염시킨 세포보다, ATP5b 유전자의 발현의 높은 녹다운이 확인되었다.
실시예 4: AD 서열을 부가한 변형 핵산의 패키징1
(1) 올리고뉴클레오타이드의 제작
형광 단백질 ZsGreen 유전자 서열을 표적으로 하고, 변형 핵산을 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 패키징을 실시했다. 우선, ZsGreen 유전자의 안티센스 서열 AO(서열번호12)의 3’말단에 AD 서열(서열번호 1)을 결합시킨 올리고뉴클레오타이드를 합성했다. 안티센스 서열의 각 염기 사이의 각각 및 안티센스 서열과 AD 서열의 사이의 결합은 포스포로티오에이트 결합으로 하고(PS화), 1, 2, 3, 13 및 14번 위치의 뉴클레오티드는 LNA로 했다. 이 올리고뉴클레오타이드에 별도로 합성한 AD 서열에 상보적이고 천연형의 뉴클레오티드로 이루어지는 올리고뉴클레오타이드(Complement-AD, 서열번호 18)을 아닐링시키고, 변형 올리고뉴클레오타이드(No.1)를 제작했다. 또, 안티센스 서열의 5’말단에 AD 서열을 결합시킨 변형 올리고뉴클레오타이드(No. 2)를 제작했다. 또, 올리고뉴클레오타이드 No. 1 및 2의 안티센스 서열을 음성 컨트롤 서열 AO-c (서열번호 13)로 바꾼 안티센스 올리고뉴클레오타이드(No. 3 및 4), AD 서열을 스크램블 AD 서열(서열번호 14)로 바꾼 안티센스 올리고뉴클레오타이드(No. 5 및 6)을 제작했다. 또, 안티센스 서열 AO만의 서열로 이루어지는 싱글-스트랜드 올리고뉴클레오타이드(No. 7) 및 음성 컨트롤 서열 AO-c만의 서열로 이루어지는 싱글-스트랜드 올리고뉴클레오타이드(No. 8)을 제작했다. 이것들의 올리고뉴클레오타이드의 구조를 도 6에 나타낸다.
(2) 293EB 세포로의 도입과 AAV 유사 입자의 회수
실시예 4-(1)에서 얻은 올리고뉴클레오타이드 No. 1∼8을 실시예 1-(2)와 동일하게 플라스미드 pAAV2/9 및 플라스미드 pAd5N과 함께, 폴리에틸렌이민 "Max"를 사용해서 293EB 세포 1×108 Cells에 트랜스펙션했다. 트랜스펙션한 올리고뉴클레오타이드는 0.1, 1 및 10nM의 농도로 했다. 트랜스펙션 시의 배지는 DMEM(무혈청)에, 1/100 용량의 GlutaMax를 첨가한 것으로, 트랜스펙션 후는 37℃, 5% CO2로 5일간 배양했다.
293EB 세포의 배양 상청을 회수 후, 상청에 DNaseI를 첨가하고, 유리 DNA의 분해를 실시했다. 분해 후, 핵산 봉입 AAV 중공입자(AAV 유사 입자)를 포함하는 상기의 상청에 AL buffer(Qiagen사)를 첨가하고, AAV 캡시드를 용해하고, 패키징된 DNA의 추출을 실시했다. AAV 유사 입자에 포함되는 올리고뉴클레오타이드의 카피 수를, ITR-F 프라이머(서열번호 15)와 ITR-R프라이머(서열번호 16)를 사용한 정량 PCR에 의해 해석했다(도 7). 도 7에 나타내는 바와 같이 AD 서열을 포함하는 올리고뉴클레오타이드는 올리고뉴클레오타이드의 농도 의존적으로 AAV 중공입자에 패키징되는 것이 확인되었다. 또, AD 서열은 올리고뉴클레오타이드의 3’에 결합시킨 것이 고효율임이 확인되었다.
실시예 5: DNA 단편의 도입에 의한 AAV 중공입자로의 패키징3
(1) 올리고뉴클레오타이드의 제작
뒤센형 근디스트로피(DMD)의 엑손 스킵핑 치료를 상정하고, DMD 모델 마우스의 지스트로핀 유전자 엑슨 23의 엑손 스킵핑을 유도하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 AAV 중공입자로의 패키징을 실시했다. 우선, 마우스 지스트로핀 유전자의 안티센스 서열 AO4(서열번호 17)의 3’말단에 AD 서열(서열번호 1)을 결합시킨 싱글-스트랜드의 올리고뉴클레오타이드를 합성했다(SeqA-AD-F). 또, 안티센스 서열 AO4(서열번호17)의 3’말단에 AD 서열에 상보적인 서열(Complement-AD, 서열번호 18)을 결합시킨 싱글-스트랜드의 올리고뉴클레오타이드(SeqA-asAD)을 합성했다. 안티센스 서열 AO4(서열번호 17)의 3’말단에 스크램블 AD 서열(서열번호 14)을 결합시킨 싱글-스트랜드의 올리고뉴클레오타이드(SeqA-scrAD)를 합성했다. 추가로, 별도로 합성한 AD 서열에 상보적 올리고뉴클레오타이드(Complement-AD, 서열번호 18)를 올리고뉴클레오타이드 SeqA-AD-F에 아닐링시키고, AD 서열의 영역이 더블-스트랜드이고 안티센스 서열의 영역이 싱글-스트랜드의 올리고뉴클레오타이드를 조제했다 (AD). 이것들의 올리고뉴클레오타이드의 구조를 도 8에 나타낸다.
(2) 293EB 세포로의 도입과 AAV 유사 입자의 회수
실시예 5-(1)에서 얻은 올리고뉴클레오타이드를, 실시예 1-(2)와 동일하게 플라스미드 pAAV2/9 및 플라스미드 pAd5N과 함께,폴리에틸렌이민 "Max"를 사용해서 293EB 세포 1.25×108 Cells에 트랜스펙션했다. 트랜스펙션한 올리고뉴클레오타이드는 30nM의 농도로 했다. 트랜스펙션 시의 배지는 DMEM(무혈청)에, 1/100용량의 GlutaMax를 첨가한 것으로, 트랜스펙션 후는 37℃, 5% CO2로 5일간 배양했다.
293EB 세포의 배양 상청을 회수 후, AAVpro(등록상표) Concentrator(TAKARA BIO INC.)를 사용해서 AAV 유사 입자를 정제했다. AAV 유사 입자에 포함되는 올리고뉴클레오타이드의 카피 수를, ITR-F 프라이머(서열번호 15)와 ITR-R 프라이머(서열번호 16)를 사용한 정량 PCR에 의해 해석했다(도 8). 도 8에 나타내는 바와 같이 AD 서열 및/또는 AD 서열의 상보 서열을 포함하는 싱글-스트랜드의 올리고뉴클레오타이드가 AAV 중공입자에 패키징되는 것이 확인되었다.
(산업상 이용가능성)
본 발명에 의해, 보다 간편하고 효율적인 중공입자 내로의 핵산 봉입 방법이 제공된다. 본 발명의 방법을 사용해서 제조된 핵산 봉입 중공입자나 당해 핵산 봉입 중공입자를 유효성분으로 하는 조성물은 유전자 치료의 연구 또는 임상의 분야에서의 유전자 도입방법으로서 유용하다.
SEQ ID NO:1: AD’region sequence
SEQ ID NO: 2: ATP5b shRNA sequence
SEQ ID NO: 3: pAAV2/9 Vector sequence
SEQ ID NO: 4: U6-F primer
SEQ ID NO: 5: U6-R primer
SEQ ID NO: 6: hATP5b-F
SEQ ID NO: 7: hATP5b-R
SEQ ID NO:8: A’region sequence
SEQ ID NO: 9: A region sequence
SEQ ID NO:10: D’region sequence
SEQ ID NO: 11: D region sequence
SEQ ID NO: 12: Antisense sequence AO
SEQ ID NO: 13: Antisense sequence AO-c
SEQ ID NO: 14: Scrambled AD sequence
SEQ ID NO: 15: ITR primer-F
SEQ ID NO: 16: ITR primer-R
SEQ ID NO: 17: Antisense sequence AO4
SEQ ID NO: 18: Compliment AD sequence
SEQUENCE LISTING <110> NIPPON MEDICAL SCHOOL FOUNDATION TAKARA BIO INC. <120> Nucleic acid packaged AAV empty particles <130> 675588 <150> JP2019-124647 <151> 2019-07-03 <160> 18 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 61 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AD' region sequence <400> 1 gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggagtggcca actccatcac taggggttcc 60 t 61 <210> 2 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ATP5b shRNA sequence <400> 2 caccggctga ggctccagag ttcatggaaa cgaatttcca tgaactctgg agcctcagc 59 <210> 3 <211> 7389 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pAAV2/9 Vector <400> 3 tcgaggacaa ccttagtgaa ggaattcgcg agtggtgggc tttgaaacct ggagcccctc 60 aacccaaggc aaatcaacaa catcaagaca acgctcgagg tcttgtgctt ccgggttaca 120 aataccttgg acccggcaac ggactcgaca agggggagcc ggtcaacgca gcagacgcgg 180 cggccctcga gcacgacaag gcctacgacc agcagctcaa ggccggagac aacccgtacc 240 tcaagtacaa ccacgccgac gccgagttcc aggagcggct caaagaagat acgtcttttg 300 ggggcaacct cgggcgagca gtcttccagg ccaaaaagag gcttcttgaa cctcttggtc 360 tggttgagga agcggctaag acggctcctg gaaagaagag gcctgtagag cagtctcctc 420 aggaaccgga ctcctccgcg ggtattggca aatcgggtgc acagcccgct aaaaagagac 480 tcaatttcgg tcagactggc gacacagagt cagtcccaga ccctcaacca atcggagaac 540 ctcccgcagc cccctcaggt gtgggatctc ttacaatggc ttcaggtggt ggcgcaccag 600 tggcagacaa taacgaaggt gccgatggag tgggtagttc ctcgggaaat tggcattgcg 660 attcccaatg gctgggggac agagtcatca ccaccagcac ccgaacctgg gccctgccca 720 cctacaacaa tcacctctac aagcaaatct ccaacagcac atctggagga tcttcaaatg 780 acaacgccta cttcggctac agcaccccct gggggtattt tgacttcaac agattccact 840 gccacttctc accacgtgac tggcagcgac tcatcaacaa caactgggga ttccggccta 900 agcgactcaa cttcaagctc ttcaacattc aggtcaaaga ggttacggac aacaatggag 960 tcaagaccat cgccaataac cttaccagca cggtccaggt cttcacggac tcagactatc 1020 agctcccgta cgtgctcggg tcggctcacg agggctgcct cccgccgttc ccagcggacg 1080 ttttcatgat tcctcagtac gggtatctga cgcttaatga tggaagccag gccgtgggtc 1140 gttcgtcctt ttactgcctg gaatatttcc cgtcgcaaat gctaagaacg ggtaacaact 1200 tccagttcag ctacgagttt gagaacgtac ctttccatag cagctacgct cacagccaaa 1260 gcctggaccg actaatgaat ccactcatcg accaatactt gtactatctc tcaaagacta 1320 ttaacggttc tggacagaat caacaaacgc taaaattcag tgtggccgga cccagcaaca 1380 tggctgtcca gggaagaaac tacatacctg gacccagcta ccgacaacaa cgtgtctcaa 1440 ccactgtgac tcaaaacaac aacagcgaat ttgcttggcc tggagcttct tcttgggctc 1500 tcaatggacg taatagcttg atgaatcctg gacctgctat ggccagccac aaagaaggag 1560 aggaccgttt ctttcctttg tctggatctt taatttttgg caaacaagga actggaagag 1620 acaacgtgga tgcggacaaa gtcatgataa ccaacgaaga agaaattaaa actactaacc 1680 cggtagcaac ggagtcctat ggacaagtgg ccacaaacca ccagagtgcc caagcacagg 1740 cgcagaccgg ctgggttcaa aaccaaggaa tacttccggg tatggtttgg caggacagag 1800 atgtgtacct gcaaggaccc atttgggcca aaattcctca cacggacggc aactttcacc 1860 cttctccgct gatgggaggg tttggaatga agcacccgcc tcctcagatc ctcatcaaaa 1920 acacacctgt acctgcggat cctccaacgg ccttcaacaa ggacaagctg aactctttca 1980 tcacccagta ttctactggc caagtcagcg tggagatcga gtgggagctg cagaaggaaa 2040 acagcaagcg ctggaacccg gagatccagt acacttccaa ctattacaag tctaataatg 2100 ttgaatttgc tgttaatact gaaggtgtat atagtgaacc ccgccccatt ggcaccagat 2160 acctgactcg taatctgtaa ttgcttgtta atcaataaac cgtttaattc gtttcagttg 2220 aactttggtc tctgcgaagg gcgaattcgt ttaaacctgc aggactagag tcctgtatta 2280 gaggtcacgt gagtgttttg cgacattttg cgacaccatg tggtcacgct gggtatttaa 2340 gcccgagtga gcacgcaggg tctccatttt gaagcgggag gtttgaacgc gcagccgcca 2400 agccgaattc tgcagatatc catcacactg gcggccgctc gactagagcg gccgccaccg 2460 cggtggagct ccagcttttg ttccctttag tgagggttaa ttgcgcgctt ggcgtaatca 2520 tggtcatagc tgtttcctgt gtgaaattgt tatccgctca caattccaca caacatacga 2580 gccggaagca taaagtgtaa agcctggggt gcctaatgag tgagctaact cacattaatt 2640 gcgttgcgct cactgcccgc tttccagtcg ggaaacctgt cgtgccagct gcattaatga 2700 atcggccaac gcgcggggag aggcggtttg cgtattgggc gctcttccgc ttcctcgctc 2760 actgactcgc tgcgctcggt cgttcggctg cggcgagcgg tatcagctca ctcaaaggcg 2820 gtaatacggt tatccacaga atcaggggat aacgcaggaa agaacatgtg agcaaaaggc 2880 cagcaaaagg ccaggaaccg taaaaaggcc gcgttgctgg cgtttttcca taggctccgc 2940 ccccctgacg agcatcacaa aaatcgacgc tcaagtcaga ggtggcgaaa cccgacagga 3000 ctataaagat accaggcgtt tccccctgga agctccctcg tgcgctctcc tgttccgacc 3060 ctgccgctta ccggatacct gtccgccttt ctcccttcgg gaagcgtggc gctttctcat 3120 agctcacgct gtaggtatct cagttcggtg taggtcgttc gctccaagct gggctgtgtg 3180 cacgaacccc ccgttcagcc cgaccgctgc gccttatccg gtaactatcg tcttgagtcc 3240 aacccggtaa gacacgactt atcgccactg gcagcagcca ctggtaacag gattagcaga 3300 gcgaggtatg taggcggtgc tacagagttc ttgaagtggt ggcctaacta cggctacact 3360 agaaggacag tatttggtat ctgcgctctg ctgaagccag ttaccttcgg aaaaagagtt 3420 ggtagctctt gatccggcaa acaaaccacc gctggtagcg gtggtttttt tgtttgcaag 3480 cagcagatta cgcgcagaaa aaaaggatct caagaagatc ctttgatctt ttctacgggg 3540 tctgacgctc agtggaacga aaactcacgt taagggattt tggtcatgag attatcaaaa 3600 aggatcttca cctagatcct tttaaattaa aaatgaagtt ttaaatcaat ctaaagtata 3660 tatgagtaaa cttggtctga cagttaccaa tgcttaatca gtgaggcacc tatctcagcg 3720 atctgtctat ttcgttcatc catagttgcc tgactccccg tcgtgtagat aactacgata 3780 cgggagggct taccatctgg ccccagtgct gcaatgatac cgcgagaccc acgctcaccg 3840 gctccagatt tatcagcaat aaaccagcca gccggaaggg ccgagcgcag aagtggtcct 3900 gcaactttat ccgcctccat ccagtctatt aattgttgcc gggaagctag agtaagtagt 3960 tcgccagtta atagtttgcg caacgttgtt gccattgcta caggcatcgt ggtgtcacgc 4020 tcgtcgtttg gtatggcttc attcagctcc ggttcccaac gatcaaggcg agttacatga 4080 tcccccatgt tgtgcaaaaa agcggttagc tccttcggtc ctccgatcgt tgtcagaagt 4140 aagttggccg cagtgttatc actcatggtt atggcagcac tgcataattc tcttactgtc 4200 atgccatccg taagatgctt tctgtgactg gtgagtactc aaccaagtca ttctgagaat 4260 agtgtatgcg gcgaccgagt tgctcttgcc cggcgtcaat acgggataat accgcgccac 4320 atagcagaac tttaaaagtg ctcatcattg gaaaacgttc ttcggggcga aaactctcaa 4380 ggatcttacc gctgttgaga tccagttcga tgtaacccac tcgtgcaccc aactgatctt 4440 cagcatcttt tactttcacc agcgtttctg ggtgagcaaa aacaggaagg caaaatgccg 4500 caaaaaaggg aataagggcg acacggaaat gttgaatact catactcttc ctttttcaat 4560 attattgaag catttatcag ggttattgtc tcatgagcgg atacatattt gaatgtattt 4620 agaaaaataa acaaataggg gttccgcgca catttccccg aaaagtgcca cctaaattgt 4680 aagcgttaat attttgttaa aattcgcgtt aaatttttgt taaatcagct cattttttaa 4740 ccaataggcc gaaatcggca aaatccctta taaatcaaaa gaatagaccg agatagggtt 4800 gagtgttgtt ccagtttgga acaagagtcc actattaaag aacgtggact ccaacgtcaa 4860 agggcgaaaa accgtctatc agggcgatgg cccactacgt gaaccatcac cctaatcaag 4920 ttttttgggg tcgaggtgcc gtaaagcact aaatcggaac cctaaaggga gcccccgatt 4980 tagagcttga cggggaaagc cggcgaacgt ggcgagaaag gaagggaaga aagcgaaagg 5040 agcgggcgct agggcgctgg caagtgtagc ggtcacgctg cgcgtaacca ccacacccgc 5100 cgcgcttaat gcgccgctac agggcgcgtc ccattcgcca ttcaggctgc gcaactgttg 5160 ggaagggcga tcggtgcggg cctcttcgct attacgccag ctggcgaaag ggggatgtgc 5220 tgcaaggcga ttaagttggg taacgccagg gttttcccag tcacgacgtt gtaaaacgac 5280 ggccagtgag cgcgcgtaat acgactcact atagggcgaa ttgggtaccg ggccccccct 5340 cgatcgaggt cgacggtatc gggggagctc ggatccacta gtaacggccg ccagtgtgct 5400 ggattcggct ttatttaagc ccgagtgagc acgcagggtc tccattttga agcgggaggt 5460 ttgaacgcgc agccgccatg ccggggtttt acgagattgt gattaaggtc cccagcgacc 5520 ttgacgggca tctgcccggc atttctgaca gctttgtgaa ctgggtggcc gagaaggaat 5580 gggagttgcc gccagattct gacatggatc tgaatctgat tgagcaggca cccctgaccg 5640 tggccgagaa gctgcagcgc gactttctga cggaatggcg ccgtgtgagt aaggccccgg 5700 aggccctttt ctttgtgcaa tttgagaagg gagagagcta cttccacatg cacgtgctcg 5760 tggaaaccac cggggtgaaa tccatggttt tgggacgttt cctgagtcag attcgcgaaa 5820 aactgattca gagaatttac cgcgggatcg agccgacttt gccaaactgg ttcgcggtca 5880 caaagaccag aaatggcgcc ggaggcggga acaaggtggt ggatgagtgc tacatcccca 5940 attacttgct ccccaaaacc cagcctgagc tccagtgggc gtggactaat atggaacagt 6000 atttaagcgc ctgtttgaat ctcacggagc gtaaacggtt ggtggcgcag catctgacgc 6060 acgtgtcgca gacgcaggag cagaacaaag agaatcagaa tcccaattct gatgcgccgg 6120 tgatcagatc aaaaacttca gccaggtaca tggagctggt cgggtggctc gtggacaagg 6180 ggattacctc ggagaagcag tggatccagg aggaccaggc ctcatacatc tccttcaatg 6240 cggcctccaa ctcgcggtcc caaatcaagg tgccttggac aatgcgggaa agattatgag 6300 cctgactaaa accgcccccg actacctggt gggccagcag cccgtggagg acatttccag 6360 caatcggatt tataaaattt tggaactaaa cgggtacgat ccccaatatg cggcttccgt 6420 ctttctggga tgggccacga aaaagttcgg caagaggaac accatctggc tgtttgggcc 6480 tgcaactacc gggaagacca acatcgcgga ggccatagcc cacactgtgc ccttctacgg 6540 gtgcgtaaac tggaccaatg agaactttcc cttcaacgac tgtgtcgaca agatggtgat 6600 ctggtgggag gaggggaaga tgaccgccaa ggtcgtggag tcggccaaag ccattctcgg 6660 aggaagcaag gtgcgcgtgg accagaaatg caagtcctcg gcccagatag acccgactcc 6720 cgtgatcgtc acctccaaca ccaacatgtg cgccgtgatt gacgggaact caacgacctt 6780 cgaacaccag cagccgttgc aagaccggat gttcaaattt gaactcaccc gccgtctgga 6840 tcatgacttt gggaaggtca ccaagcagga agtcaaagac tttttccggt gggcaaagga 6900 tcacgtggtt gaggtggagc atgaattcta cgtcaaaaag ggtggagcca agaaaagacc 6960 cgcccccagt gacgcagata taagtgagcc caaacgggtg cgcgagtcag ttgcgcagcc 7020 atcgacgtca gacgcggaag cttcgatcaa ctacgcggac aggtaccaaa acaaatgttc 7080 tcgtcacgtg ggcatgaatc tgatgctgtt tccctgcaga caatgcgaga gactgaatca 7140 gaattcaaat atctgcttca ctcacggtgt caaagactgt ttagagtgct ttcccgtgtc 7200 agaatctcaa cccgtttctg tcgtcaaaaa ggcgtatcag aaactgtgct acattcatca 7260 catcatggga aaggtgccag acgcttgcac tgcttgcgac ctggtcaatg tggacttgga 7320 tgactgtgtt tctgaacaat aaatgactta aaccaggtat ggctgccgat ggttatcttc 7380 cagattggc 7389 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> U6-F primer <400> 4 ggactatcat atgcttaccg 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> U6-R primer <400> 5 gtttcgtcct ttccacaaga 20 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hATP5b-F primer <400> 6 ggtcctgaga ctttgggcag aa 22 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hATP5b-R primer <400> 7 cctcagcatg aatgggagca 20 <210> 8 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A' region sequence <400> 8 ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg c 41 <210> 9 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A region sequence <400> 9 gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggagtggcca a 41 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> D' region sequence <400> 10 ctccatcact aggggttcct 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> D region sequence <400> 11 aggaacccct agtgatggag 20 <210> 12 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Antisense sequence AO <220> <221> modified_base <222> (1)..(3) <223> LNA <220> <221> modified_base <222> (1)^(2) <223> Phosphorothioate linkage <220> <221> modified_base <222> (2)^(3) <223> Phosphorothioate linkage <220> <221> modified_base <222> (3)^(4) <223> Phosphorothioate linkage <220> <221> modified_base <222> (4)^(5) <223> Phosphorothioate linkage <220> <221> modified_base <222> (5)^(6) <223> Phosphorothioate linkage <220> <221> modified_base <222> (6)^(7) <223> Phosphorothioate linkage <220> <221> modified_base <222> (7)^(8) <223> Phosphorothioate linkage <220> <221> modified_base <222> (8)^(9) <223> Phosphorothioate linkage <220> <221> modified_base <222> (9)^(10) <223> Phosphorothioate linkage <220> <221> modified_base <222> (10)^(11) <223> Phosphorothioate linkage <220> <221> modified_base <222> (11)^(12) <223> Phosphorothioate linkage <220> <221> modified_base <222> (12)^(13) <223> Phosphorothioate linkage <220> <221> modified_base <222> (13)^(14) <223> Phosphorothioate linkage <220> <221> modified_base <222> (13)..(14) <223> LNA <220> <221> modified_base <222> (14)^(15) <223> Phosphorothioate linkage <400> 12 ttgatggcct gcttg 15 <210> 13 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Antisense sequence AO-c <220> <221> modified_base <222> (1)..(3) <223> LNA <220> <221> modified_base <222> (1)^(2) <223> Phosphorothioate linkage <220> <221> modified_base <222> (2)^(3) <223> Phosphorothioate linkage <220> <221> modified_base <222> (3)^(4) <223> Phosphorothioate linkage <220> <221> modified_base <222> (4)^(5) <223> Phosphorothioate linkage <220> <221> modified_base <222> (5)^(6) <223> Phosphorothioate linkage <220> <221> modified_base <222> (6)^(7) <223> Phosphorothioate linkage <220> <221> modified_base <222> (7)^(8) <223> Phosphorothioate linkage <220> <221> modified_base <222> (8)^(9) <223> Phosphorothioate linkage <220> <221> modified_base <222> (9)^(10) <223> Phosphorothioate linkage <220> <221> modified_base <222> (10)^(11) <223> Phosphorothioate linkage <220> <221> modified_base <222> (11)^(12) <223> Phosphorothioate linkage <220> <221> modified_base <222> (12)^(13) <223> Phosphorothioate linkage <220> <221> modified_base <222> (14)..(16) <223> LNA <220> <221> modified_base <222> (14)..(14) <223> m5c <220> <221> modified_base <222> (14)^(15) <223> Phosphorothioate linkage <220> <221> modified_base <222> (15)^(16) <223> Phosphorothioate linkage <220> <221> modified_base <222> (16)..(16) <223> m5c <400> 13 tagcttgtcc catctc 16 <210> 14 <211> 61 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Scrambled AD sequence <400> 14 atggcggcac ggcgtgctag cgatcacagt gccagacgtg ctctgtgaga gcggcaacag 60 c 61 <210> 15 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> ITR primer-F <400> 15 ggaaccccta gtgatggagt t 21 <210> 16 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> ITR primer-R <400> 16 gcctcagtga gcgagcgagc g 21 <210> 17 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Antisense sequence AO4 <400> 17 gccaaacctc ggcttacc 18 <210> 18 <211> 61 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Compliment AD sequence <400> 18 aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 60 c 61

Claims (15)

  1. 이하의 공정을 포함하는 아데노 연관 바이러스(AAV)의 핵산 봉입 중공입자의 제조방법;
    (1) AAV 역위 말단 반복 서열(ITR)의 A 영역의 서열 및 D’영역의 서열(AD 서열) 또는 AD 서열의 상보 서열, 및 목적의 유전자 서열을 포함하는 직쇄상 핵산 단편을 조제하는 공정,
    (2) AAV의 중공입자를 생산하는 세포에 (1)의 핵산 단편을 도입하는 공정, 및
    (3) (2)의 세포를 배양하는 공정.
  2. 제1 항에 있어서,
    핵산 단편이 5’말단으로부터 3’말단을 향해서, AD 서열 또는 AD 서열의 상보 서열, 및 목적의 유전자 서열을 포함하는 방법.
  3. 제1 항에 있어서,
    핵산 단편이 5’말단으로부터 3’말단을 향해서, 목적의 유전자 서열 및, AD 서열 또는 AD 서열의 상보 서열을 포함하는 방법.
  4. 제1 항에 있어서,
    핵산 단편이 AAV ITR의 A’영역의 서열을 포함하지 않는 방법.
  5. 제1 항에 있어서,
    핵산 단편을 조제하는 공정이 핵산 증폭 반응에 의한 핵산 단편의 증폭을 포함하는 공정인 방법.
  6. 제1 항에 있어서,
    중공입자를 생산하는 세포가 AAV의 Cap 유전자, Rep 유전자 및 AAV의 헬퍼 기능이 도입된 세포인 방법.
  7. 제1 항에 있어서,
    핵산 단편이 더블-스트랜드의 핵산 또는 싱글-스트랜드의 핵산인 방법.
  8. 제1 항에 있어서,
    핵산 단편의 AD 서열 영역이 더블-스트랜드이고, 목적의 유전자 서열 영역이 싱글-스트랜드의 핵산인 방법.
  9. AAV 역위 말단 반복 서열(ITR)의 A 영역의 서열 및 D’영역의 서열(AD 서열) 또는 AD 서열의 상보 서열, 및 목적의 유전자 서열을 포함하는 직쇄상 핵산 단편.
  10. 제9 항에 있어서,
    5’말단으로부터 3’말단을 향해서, AD 서열 또는 AD 서열의 상보 서열, 및 목적의 유전자 서열을 포함하는 핵산 단편.
  11. 제9 항에 있어서,
    5’말단으로부터 3’말단을 향해서, 목적의 유전자 서열 및, AD 서열 또는 AD 서열의 상보 서열을 포함하는 핵산 단편.
  12. 제9 항에 있어서,
    AAV ITR의 A’영역의 서열을 포함하지 않는 핵산 단편.
  13. 제9 항에 있어서,
    더블-스트랜드의 핵산 또는 싱글-스트랜드의 핵산인 핵산 단편.
  14. 제9 항에 있어서,
    핵산 단편의 AD 서열 영역이 더블-스트랜드이고, 목적의 유전자 서열 영역이 싱글-스트랜드의 핵산인 핵산 단편.
  15. 제9 항 내지 제14 항 중 어느 한 항에 기재된 직쇄상 핵산 단편을 포함하는 AAV의 핵산 봉입 중공입자.
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